CN102676531A - 人淋巴细胞抑制性受体基因ctla-4和pd-1的6条序列及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制药领域。将人淋巴细胞抑制性受体基因CTLA-4(Cytotoxic T lymphocyte antigen 4，细胞毒性T淋巴细胞抗原4)和PD-1(Programmed cell death-1，程序性死亡受体1)的6条核酸序列，应用于核酸类药物设计，以研发药物，治疗免疫疾病中消除免疫抑制、调节免疫、和消除肿瘤免疫逃逸进行肿瘤治疗。
Description
技术领域：
本发明涉及生物制药领域，6个基因靶点序列具有能特异结合核酸药物的功能，对核酸类药物先导物的设计在肿瘤治疗、和在免疫相关疾病调节治疗中基因干预应用。
背景技术：
淋巴细胞增殖失能直接导致免疫低下，而CTLA-4抑制性受体表达是增殖失能的直接原因。因此降低CTLA-4的表达可提高T免疫细胞增殖因而提高细胞免疫功能。
淋巴细胞凋亡也导致免疫低下，T淋巴细胞PD-1的表达引起T淋巴细胞凋亡造成免疫失能，引起感染和肿瘤细胞发生。因此抑制T淋巴细胞的PD-1，可以强化免疫细胞识别杀灭新生感染原和肿瘤细胞，保持机体正常。
因此，以CTLA-4和PD-1两个抑制性受体为靶进行药物研发，对免疫调节和肿瘤治疗具有很好的临床治疗意义和前景。
发明内容：
本发明采用实验室专用技术(在申请专利)，从人CTLA-4和PD-1两个基因筛选出6个序列，这些序列经过验证能高效结合寡核苷酸药物，可以用作药物研发设计候选结构应用。
附图说明：
图1：靶点1-3的结合能力图(#1，#2，#3分别表示1，2，3靶点处的切割反应)
图2：靶点1-3的细胞内作用结果(流式细胞仪分析CTLA-4受体表达)
图3：4-6号靶点(即PD-1靶点1-3)的结合能力图
(AS1#，2#，3#分别表示PD-1的1，2，3靶点切割效果，AS对照为非靶点处的切割效果)
图4：PD-1靶点1-3的细胞内作用结果(RT-PCR分析PD-1受体表达)
(1-4分别表示PD-1未处理细胞mRNA的RT PCR扩增的分别扩增35、33、31、28循环产物，5表示PD-1经非靶点对照表达Ribozyme慢病毒处理细胞mRNA的RT PCR扩增25循环的产物，6-8分别表示PD-1经靶点1、2、3构建表达Ribozyme慢病毒处理细胞mRNA的RT PCR扩增25循环的产物。6-8表明与5号对照组相比靶点均有效抑制并降低了基因的表达，3号抑制效果最强，2号其次，1号尚可。图中M表示DNA分子量标准，最小带型为1000bp)
具体实施方式：
本发明实施的实验步骤及结果(结合附图阐述)
1.1-3号靶点对CTLA-4 mRNA作用及性能
【1】、1-3靶点对CTLA-4基因mRNA分子的作用：经过液相固定mRNA和文库杂交筛选，经过设计相关反义核酸结合RNase H切割验证，与对照反义核酸相比3个靶点的反义核酸均能诱导RNase H对基因mRNA发生切割；同时经过设计DNAzyme直接切割验证，结果对照DNAzyme相比3个靶点的DNAzyme均能对基因mRNA发生切割。因此获得CTLA-4基因3条靶点序列为有效靶点(如图1)。
【2】、靶点1-3设计的Ribozyme通过制备慢病毒表达质粒，生产包装了质粒的病毒，分别感染CTLL-2细胞，对照组和1，2，3号慢病毒表达Ribozyme对荧光素标记CTLA-4抗体标记细胞计数，结果1，2，3靶点在作用48hr细胞CTLA-4表达水平均有效降低，分别达对照组的38％，33％和36％水平。因此获得1-3靶点序列为有效(如图2)。
2.4-6号靶点对PD-1 mRNA作用及性能
【3】、4-6靶点对基因PD-1的mRNA分子作用：经过液相固定mRNA和文库杂交筛选，经过设计相关反义核酸结合RNase H切割验证，与对照反义核酸相比3个靶点的反义核酸均能诱导RNase H对基因mRNA发生切割。因此获得PD-1基因3条靶点序列为有效靶点(如图3)。
【4】、4-6靶点(即PD-1靶点1-3)设计的Ribozyme通过制备慢病毒表达质粒，生产包装了质粒的病毒，分别在24孔培养板中感染Jurket淋巴细胞(每孔细胞数为30000个)，培养72小时，收集细胞、提取总RNA，用反转录PCR鉴定PD-1的表达，对照组和PD-1的1，2，3号慢病毒表达Ribozyme对Jurket细胞PD-1表达水平均有效降低。因此获得4-6靶点序列为有效(如图4)。
Claims (3)
1.人CTLA-4 mRNA从起始AUG处算起的184-213nt处、261-290nt处、和349-378nt处序列，即：
(1)TTCACCATCACACAACACTGATGAGGTCCGGGT
(2)CACGACATTCACAGAGAAGAATACAGTGGGCTT
(3)ATCCAAGGACTGAGAGCTGTTGACACGGGACTG
人PD-1基因mRNA从起始AUG处算起的208-240nt处、275-305nt处、和248-280nt处序列。
(4)GGCCAGCTTGTCCGTCTGGTTGCTGGGGCTCAT
(5)CGTTGGGCAGTTGTGTGACACGGAAGCGGCAGT
(6)GGCAGTCCTGGCCGGGCTGGCTGCGGTCCTCGG
2.根据权力要求1和2，在(1)至(6)序列上单处的连续10个碱基或以上序列的DNA分子作为核酸药物候选结构分子、和(1)至(6)序列上两处的各6个连续序列以上的DNA分子(即脱氧核酶)作为核酸药物候选脱氧核糖核酸结构分子。
3.根据权力要求1和2，在(1)至(6)序列上单处的连续10个碱基或以上序列的RNA分子作为核酸药物候选结构分子、和(1)至(6)序列上两处的各6个连续序列以上的RNA分子(即核酶)作为核酸药物候选核糖核酸结构分子。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017128534A1 (zh) * | 2016-01-29 | 2017-08-03 | 杨世成 | 一种pd-1/ctla-4双特异性抗体的制备方法及其应用 |
| CN115261384A (zh) * | 2022-04-28 | 2022-11-01 | 吉林大学 | 一种靶向pd-l1基因的脱氧核酶、靶向递送载体、肿瘤靶向型纳米复合物及其应用 |
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2011
- 2011-03-08 CN CN 201110054244 patent/CN102676531A/zh active Pending
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|---|---|---|---|---|
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| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120919 |