JP2022179623A - 抗ｏｘ４０抗体及びその用途 - Google Patents

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Abstract

【課題】抗ＯＸ４０（ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＴＮＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ ４）又はＴＮＦＲＳＦ４）抗体及びその用途を提供する。【解決手段】本開示は、抗ＯＸ４０（ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４又はＴＮＦＲＳＦ４）抗体、抗原結合フラグメント、及びその用途を提供する。【選択図】なし

Description

本開示は、抗ＯＸ４０（ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＴＮＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ ４）又はＴＮＦＲＳＦ４）抗体及びその用途に関する。
現在、がんはヒトの死亡率が最も高い疾患の１つである。世界保健機関（ＷＨＯ）の統計データによると、２０１２年の世界的ながんの発生数と死亡例はそれぞれ１４００万ヒトと８２０万ヒトに達する。中国では、新たに診断された癌症例は３０７万ヒトであり、死亡者数は２２０万ヒトである。
抗癌抗体の最近の臨床的および商業的成功は、抗体による治療法に大きな注目を引き起こしている。癌を治療するための、様々な抗体による治療法に用いられる抗癌抗体を開発する必要がある。
本開示は、抗ＯＸ４０抗体、その抗原結合フラグメント、及びその用途に関する。
一つの側面では、本開示は、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）１、２及び３（ここで、ＶＨ ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、ＶＨ ＣＤＲ３領域は、包含選択されたＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、ＣＤＲｓ １、２及び３（ここで、ＶＬ ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つＶＬ ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む、ＯＸ４０（ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４）に結合できる抗体又はその抗原結合フラグメントにおいて、
ここで、選択されたＶＨ ＣＤＲｓ １、２及び３アミノ酸配列、並びに選択されたＶＬ ＣＤＲｓ １、２及び３アミノ酸配列は、以下のいずれの１つである、ＯＸ４０（ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４）に結合できる抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
（１）選択されたＶＨ ＣＤＲｓ １、２、３アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １、２、３に示され、且つ、選択されたＶＬ ＣＤＲｓ １、２、３アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ４、５、６に示されること、
（２）選択されたＶＨ ＣＤＲｓ １、２、３アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ７、８、９に示され、且つ、選択されたＶＬ ＣＤＲｓ １、２、３アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １０、１１、１２に示されること、
（３）選択されたＶＨ ＣＤＲｓ １、２、３アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １３、１４、１５に示され、且つ、選択されたＶＬ ＣＤＲｓ １、２、３アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １６、１７、１８に示されること、
（４）選択されたＶＨ ＣＤＲｓ １、２、３アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １９、２０、２１に示され、且つ、選択されたＶＬ ＣＤＲｓ １、２、３アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ２２、２３、２４に示されること。
幾つかの実施態様において、ＶＨは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １、２及び３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲｓ １、２、３を含み、且つ、ＶＬは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ４、５及び６に示されるアミノ酸配列的ＣＤＲｓ １、２、３。幾つかの実施態様において、ＶＨは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １３、１４及び１５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲｓ １、２、３を含み、且つ、ＶＬは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １６、１７及び１８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲｓ １、２、３を含む。
幾つかの実施態様において、前記抗体又は抗原結合フラグメンは、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する。
幾つかの実施態様において、前記抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントである。幾つかの実施態様において、前記抗体又は抗原結合フラグメントは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）である。
一つの側面では、本開示は、さらに、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸において、前記ポリペプチドは、
（１）重鎖可変領域（ＶＨ）を含む免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントにおいて、前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １、２及び３に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲｓ）１、２及び３を含み、且つ前記ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５６、５７、５８又は８０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とペアリングする場合に、ＯＸ４０に結合する免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメント；
（２）ＶＬを含む免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントにおいて、前記ＶＬは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ４、５及び６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲｓ １、２及び３を含み、且つ前記ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３、５４、５５又は７９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨとペアリングする場合に、ＯＸ４０に結合する免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメント；
（３）重鎖可変領域（ＶＨ）を含む免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントにおいて、前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ７、８及び９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲｓ １、２及び３を含み、且つ前記ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６２、６３、６４、６５又は８２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とペアリングする場合に、ＯＸ４０に結合する免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメント；又は
（４）ＶＬを含む免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントにおいて、前記ＶＬは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １０、１１及び１２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲｓ １、２及び３を含み、且つ前記ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５９、６０、６１又は８１に示されるアミノ酸配列を含むＶＨとペアリングする場合に、ＯＸ４０に結合する免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメント；
（５）重鎖可変領域（ＶＨ）を含む免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントにおいて、前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １３、１４及び１５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲｓ １、２及び３を含み、且つ前記ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ６９、７０、７１、７２又は８４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とペアリングする場合に、ＯＸ４０に結合する免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメント；
（６）ＶＬを含む免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントにおいて、前記ＶＬは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １６、１７及び１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲｓ １、２及び３を含み、且つ前記ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ６６、６７、６８又は８３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨとペアリングする場合に、ＯＸ４０に結合する免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメント；
（７）重鎖可変領域（ＶＨ）を含む免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントにおいて、前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １９、２０及び２１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲｓ １、２及び３を含み、且つ前記ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ７６、７７、７８又は８６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とペアリングする場合に、ＯＸ４０に結合する免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメント；
（８）ＶＬを含む免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントにおいて、前記ＶＬは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ２２、２３及び２４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲｓ １、２及び３を含み、且つ前記ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７３、７４、７５又は８５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨとペアリングする場合に、ＯＸ４０に結合する免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメント；を含む核酸を提供する。
幾つかの実施態様において、前記核酸は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリペプチドは、ＶＨを含有する免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントを含み、前記ＶＨは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １、２及び３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲｓ １、２及び３を含む。
幾つかの実施態様において、前記核酸は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリペプチドは、ＶＬを含有する免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントを含み、前記ＶＬは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ４、５及び６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲｓ １、２及び３を含む。
幾つかの実施態様において、前記核酸は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリペプチドは、ＶＨを含有する免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントを含み、前記ＶＨは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １３、１４及び１５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲｓ １、２及び３を含む。
幾つかの実施態様において、前記核酸は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリペプチドは、ＶＬを含有する免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントを含み、前記ＶＬは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １６、１７及び１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲｓ １、２及び３を含む。
幾つかの実施態様において、前記ＶＨは、ＶＬとペアリングする場合に、ヒトＯＸ４０に特異的に結合し、或いは、前記ＶＬは、ＶＨとペアリングする場合に、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する。
幾つかの実施態様において、前記免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントは、ヒト化免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントである、且つ前記免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントは、ヒト化免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントである。
幾つかの実施態様において、前記核酸は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードする。幾つかの実施態様において、前記核酸は、ｃＤＮＡである。
一つの側面では、本開示は、さらに、本明細書に記載の核酸の１種又は複数種を含むベクターを提供する。幾つかの実施態様において、前記ベクターは、ＯＸ４０に一緒に結合するＶＬ領域及びＶＨ領域をコードする。
一つの側面では、本開示は、各ベクターが本明細書に記載の核酸の１種を含むベクターのペアにおいて、ＯＸ４０に一緒に結合するＶＬ領域及びＶＨ領域を一緒にコードするベクターのペアに関する。
他の側面では、本開示は、さらに、本明細書に記載のベクター又はベクターのペアを含む細胞を提供する。幾つかの実施態様において、前記細胞は、ＣＨＯ細胞である。
一つの側面では、本開示は、さらに、本明細書に記載の核酸の１種又は複数種を含む細胞、又は本明細書に記載の核酸の２種を含む細胞に関する。幾つかの実施態様において、前記の２種の核酸は、ＯＸ４０に一緒に結合するＶＬ領域及びＶＨ領域を一緒にコードする。
他の側面では、本開示は、抗体又はその抗原結合フラグメントを産生する方法に関する。前記方法は、本明細書に記載の細胞に抗体又は抗原結合フラグメントを産生させるために十分な条件下で細胞培養するステップと、細胞によって産生された抗体又は抗原結合フラグメントを収集するステップと、を含む。
一つの側面では、本開示は、選択されたＶＨ配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び選択されたＶＬ配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＯＸ４０に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントにおいて、選択されたＶＨ配列及び選択されたＶＬ配列は、以下のいずれの１つである、ＯＸ４０に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。
（１）選択されたＶＨ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３、５４、５５又は７９であり、且つ選択されたＶＬ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５６、５７、５８又は８０であり；
（２）選択されたＶＨ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５９、６０、６１又は８１であり、且つ選択されたＶＬ配列是ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６２、６３、６４、６５又は８２であり；
（３）選択されたＶＨ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６６、６７、６８又は８３であり、且つ選択されたＶＬ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６９、７０、７１、７２又は８４であり；
（４）選択されたＶＨ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７３、７４、７５又は８５であり、且つ選択されたＶＬ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７６、７７、７８又は８６である。
幾つかの実施態様において、ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３の配列を含み、且つＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５６の配列を含む。
幾つかの実施態様において、ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５５の配列を含み、且つＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５８の配列を含む。
幾つかの実施態様において、ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５５の配列を含み、且つＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５６の配列を含む。
幾つかの実施態様において、ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７３の配列を含み、且つＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７７の配列を含む。
幾つかの実施態様において、前記抗体又は抗原結合フラグメンは、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する。
幾つかの実施態様において、前記抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントである。幾つかの実施態様において、前記抗体又は抗原結合フラグメントは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）である。
一つの側面では、本開示は、治療剤に共有結合または非共有結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを含む抗体－薬物複合体も提供する。幾つかの実施態様において、治療剤は、細胞傷害性薬又は細胞増殖抑制薬（例えば、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン（ｅｍｅｔｉｎｅ）、マイトマイシン、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン、マイタンシノイド類（例えば、ＤＭ－１ 及びＤＭ－４）、ジオン類、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ミトラマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アクチノマイシンＤ、１－ジヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン（ｐｒｏｃａｉｎｅ）、テトラカイン（ｔｅｔｒａｃａｉｎｅ）、リドカイン（ｌｉｄｏｃａｉｎｅ）、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、シクロホスファミドおよび類似体）である。
一つの側面では、本開示は、さらに、癌を有する対象を治療する方法を提供する。前記方法は、対象に、治療有効量の、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメント、或いは本明細書に記載の抗体－薬物複合体を含む組成物を投与するステップを含む。
幾つかの実施態様において、前記対象は、固形腫瘍を有する。幾つかの実施態様において、前記癌症は、切除不能な黒色腫又は転移性黒色腫である。
幾つかの実施態様において、前記癌症は、非小細胞肺がん（ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ、ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮がん（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ、ＳＣＣＨＮ）、腎細胞がん（ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＲＣＣ）、黒色腫、膀胱がん、トリプルネガティブ乳がん（ｔｒｉｐｌｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ、ＴＮＢＣ）又は大腸がんである。
一つの側面では、本開示は、腫瘍増殖速度を低下させる方法を提供する。前記方法は、有効量の、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物を腫瘍細胞に接触させるステップを含む。
他の側面では、本開示は、腫瘍細胞を殺す方法において、有効量の、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、或いは本明細書に記載の抗体－薬物複合体を含む組成物を腫瘍細胞に接触させるステップを含む方法に関する。
一つの側面では、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
他の側面では、本開示は、本明細書に記載の抗体薬物複合体、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
本明細書で使用されるように、「癌」という用語とは、自律的増殖能力を有する細胞である。そのような細胞の実例は、急激な細胞増殖によって特徴づけられる異常な状態又は状況を含む。その用語は、腫瘍などの癌性増殖、発癌プロセス、転移組織、および悪性に形質転換された細胞、組織、または臓器を、組織病理学的タイプまたは浸潤の程度に関係なく含むことを意味する。また、呼吸器系、心臓血管系、腎臓系、生殖器系、血液系、神経系、肝臓系、胃腸系及び内分泌系のような様々な臓器系の悪性腫瘍；および、ほとんどの結腸がん、腎細胞がん、前立腺がん及び／又は精巣腫瘍、肺の非小細胞がん、及び小腸がんのような悪性腫瘍を含む腺癌も含む。「自然発生」のがんは、対象へのがん細胞の移植によって実験的に誘発されない任意のがんも含み、且つ、例えば、自然発生がん、発がん物質への患者の曝露によるがん、癌遺伝子の挿入または腫瘍抑制遺伝子のノックアウトによるがん、並びに感染（例えば、ウイルス感染）による癌を含む。「カルシノーマ（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）」という用語は、当分野で認められており、上皮組織または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。この用語は、癌腫と肉腫組織からなる悪性腫瘍を含む癌肉腫も含む。「腺癌」とは、腺組織に由来する、または腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成する癌腫を指す。「肉腫」という用語は、当分野で認められており、間葉由来の悪性腫瘍を指す。「造血性新生物障害（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」という用語は、造血起源の過形成／腫瘍細胞が関与する疾患を含む。造血性腫瘍性障害は、骨髄系、リンパ系、または赤血球系、またはその前駆細胞に引き起こされることができる。
本明細書で使用される「抗体」という用語とは、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、免疫グロブリン軽鎖からの３つのＣＤＲｓのいずれか又は免疫グロブリン重鎖からの３つのＣＤＲのいずれか）を含み、且つエピトープに特異的に結合できる任意の抗原結合分子を指す。抗体の非限定的な例は：モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、一本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、およびヒト化抗体が含まれる。幾つかの実施態様において、抗体は、ヒト抗体のＦｃ区領域を含むことができる。抗体という用語は、誘導体、例えば、抗体フラグメントからなる二重特異性抗体、一本鎖抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、線状抗体及び多重特異性抗体も含む。
本明細書で使用される「抗原結合フラグメント」という用語とは、全長抗体の一部を指し、前記抗体のこの一部が抗原に特異的に結合できるものである。幾つかの実施態様において、抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの可変ドメイン（例えば、重鎖の可変ドメイン又は軽鎖の可変ドメイン）を含む。抗体フラグメントの非限定的な実例は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメントを含む。
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語とは、ヒトに存在する内因性核酸（例えば、再配列されたヒト免疫グロブリン重鎖または軽鎖遺伝子座）によってコードされる抗体を指す。幾つかの実施態様において、ヒト抗体は、ヒトから収集されるか、ヒト細胞培養物（例えば、ヒトハイブリドーマ細胞）で産生される。幾つかの実施態様において、ヒト抗体は非ヒト細胞（例えば、マウスまたはハムスター細胞株）で産生される。幾つかの実施態様において、ヒト抗体は、細菌または酵母細胞で産生される。幾つかの実施態様において、ヒト抗体は、未再構成または再構成されたヒト免疫グロブリン遺伝子座（例えば、重鎖または軽鎖ヒト免疫グロブリン遺伝子座）を含むトランスジェニック非ヒト動物（例えば、ウシ）で産生される。
本明細書で使用される「キメラ抗体」という用語とは、少なくとも２つの異なる抗体（例えば、ヒトおよびマウス抗体などの２つの異なる哺乳動物種由来の抗体）に存在する配列を含む抗体を指す。キメラ抗体の非限定的な実例は、非ヒト（例えば、マウス）抗体の可変ドメイン配列（例えば、軽鎖及び/又は重鎖可変ドメイン配列の全部又は一部）およびヒト抗体の定常領域を含む抗体である。キメラ抗体の他の実例は、本明細書に記載され、当分野で知られている。
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語とは、非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリンに由来する最小配列を含み、ヒト免疫グロブリンに由来する配列を含む非ヒト抗体を指す。幾つかの非限定的な例では、ヒト化抗体は、ヒト抗体（レシピエント抗体）であり、ここで、レシピエント抗体の超可変（ＣＤＲ）領域残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト抗体（例えば、ドナー抗体）（例えば、マウス、ラット、またはウサギ抗体）の超可変（ＣＤＲ）領域残基で置き換えられる。 幾つかの実施態様において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリン残基で置き換えられる。幾つかの実施態様において、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体に存在しない残基を含むことができる。抗体の性能をさらに改善するために、これらの修飾を行うことができる。幾つかの実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、ここで、全部又はほとんど全部の超可変ループ（ＣＤＲ）は、非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリンのものに対応し、且つ全部又はほとんど全部のフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリンのものである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含んでも良く、通常、ヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）である。ヒト化抗体は、当該分野で公知の分子生物学的方法を使用して産生され得る。ヒト化抗体を産生する方法の非限定的な例は、本明細書に記載されている。
本明細書で使用される「一本鎖抗体」という用語とは、抗原に特異的に結合することができる少なくとも２つの免疫グロブリン可変ドメイン（例えば、哺乳類免疫グロブリン重鎖または軽鎖の可変ドメイン）を含む単一のポリペプチドを指す。一本鎖抗体の非限定的な例は、本明細書に記載されている。
本明細書で使用される「多量体化抗体」という用語とは、４つ又はそれ以上（例えば、６つ、８つ又は１０つ）の免疫グロブリン可変ドメインを含む抗体を指す。幾つかの実施態様において、多量体化抗体は、１つの標的分子（例えば、ＯＸ４０）を哺乳動物細胞（例えば、ヒトＴ細胞）の表面上での少なくとも１つの第２の標的分子（例えば、ＰＤ１）に架橋させることができる。
本明細書で使用される「対象」及び「患者」という用語は、本明細書全体にわたって互換的に使用され、本発明の方法による治療が与えるヒト又は非ヒト動物を表す。本発明は、獣医学的および非獣医学的用途を考慮している。ヒト患者は、成人または若年の人間（例、１８歳未満のヒト）であってもよい。患者は、ヒトに加えて、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、フェレット、ネコ、及び霊長類も含むが、これらに限定されない。例えば、非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジー、ゴリラなど）、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、アレチネズミ、ハムスター、フェレット、ウサギ）、ウサギ類（ｌａｇｏｍｏｒｐｈ）、ブタ類（例えば、ブタ、ミニチュアブタ（ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｐｉｇ））、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、その他の家畜、農場、動物園の動物を含む。
本明細書で使用するように、抗体に言及する場合には、「～に特異的に結合する」及び「～を特異的に結合する」という語句は、相互作用が標的分子での特定の構造（即ち、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存するため、他の分子抗体に対して優位にその標的分子（例えば、ＯＸ４０）と相互作用することであり、言い換えれば、該試薬は、一般にすべての分子ではなく、特定の構造を含む分子を認識して結合する。標的分子に特異的に結合する抗体は、標的特異的抗体と呼ばれることができる。例えば、ＯＸ４０分子に特異的に結合する抗体は、ＯＸ４０特異的抗体又は抗ＯＸ４０抗体と呼ばれことができる。
本明細書で使用される「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、互換的に使用されることができ、少なくとも２つのアミノ酸の任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」及び「核酸配列」という用語は、本明細書に互換的に使用されることができ、少なくとも２つのヌクレオチドの任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、及びその修飾物を含むが、これらに限定されない。
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書では、本発明で使用される方法および材料を説明するが、当技術分野で知られている他の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法及び実例は、例として説明されるものであり、これらに限定されない。本明細書で言及されるすべての出版物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、および他の参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、本明細書（定義を含む）を基準とする。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになる。
図１は、抗ＯＸ４０抗体を作製する例示的な態様の第１の部分を示すフローチャートである。 図２は、抗ＯＸ４０抗体を作製する例示的な態様の第２の部分を示すフローチャートである。 図３は、抗ＯＸ４０抗体がＯＸ４０とＯＸ４０Ｌの間の結合を遮断することを示す一連のフローサイトメトリーグラフである。 図４は、抗ＯＸ４０抗体がヒトＯＸ４０に結合できることを示す一連のフローサイトメトリーグラフである。 図５は、サルＯＸ４０（ｒｍＯＸ４０）、マウスＯＸ４０（ｍＯＸ４０）及びヒト－マウスキメラＯＸ４０（ｃｈｉＯＸ４０）に対する抗ＯＸ４０抗体の交差反応性のフローサイトメトリーの結果を示す一連のグラフである。 図６は、キメラ抗ｈＯＸ４０抗体（９Ｈ３－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ１）とヒトＯＸ４０の結合速度及び解離速度を示すグラフである。 図７は、マウス抗ｈＯＸ４０抗体０７－９Ｈ３、０７－９Ａ４、１１－５Ｃ１、１７－５Ｄ１０、０８－６Ａ１１及び１４－７Ｆ１１で処置されたＭＣ－３８腫瘍細胞を有するＯＸ４０ヒト化マウス（Ｂ－ｈＯＸ４０）の経時的な体重を示すグラフである。 図８は、マウス抗ｈＯＸ４０抗体０７－９Ｈ３、０７－９Ａ４、１１－５Ｃ１、１７－５Ｄ１０、０８－６Ａ１１及び１４－７Ｆ１１で処置されたＭＣ－３８腫瘍細胞を有するＯＸ４０ヒト化マウス（Ｂ－ｈＯＸ４０）の経時的な体重の変化率を示すグラフである。 図９は、マウス抗ｈＯＸ４０抗体０７－９Ｈ３、０７－９Ａ４、１１－５Ｃ１、１７－５Ｄ１０、０８－６Ａ１１及び１４－７Ｆ１１で処置されたＭＣ－３８腫瘍細胞を有するＯＸ４０ヒト化マウス（Ｂ－ｈＯＸ４０）での経時的な腫瘍体積を示すグラフである。 図１０は、キメラ抗ｈＯＸ４０抗体で処置されたＭＣ－３８腫瘍細胞を有するＯＸ４０ヒト化マウス（Ｂ－ｈＯＸ４０）の経時的な体重を示すグラフである。 図１１は、キメラ抗ｈＯＸ４０抗体で処置されたＭＣ－３８腫瘍細胞を有するＯＸ４０ヒト化マウス（Ｂ－ｈＯＸ４０）の経時的な体重の変化率を示すグラフである。 図１２は、キメラ抗ｈＯＸ４０抗体で処置されたＭＣ－３８腫瘍細胞を有するＯＸ４０ヒト化マウス（Ｂ－ｈＯＸ４０）での経時的な腫瘍体積を示すグラフである。 図１３は、ヒト化抗ｈＯＸ４０抗体で処置されたＭＣ－３８腫瘍細胞を有するＯＸ４０ヒト化マウス（Ｂ－ｈＯＸ４０）の経時的な体重を示すグラフである。 図１４は、ヒト化抗ｈＯＸ４０抗体で処置されたＭＣ－３８腫瘍細胞を有するＯＸ４０ヒト化マウス（Ｂ－ｈＯＸ４０）の経時的な体重の変化率を示すグラフである。 図１５は、ヒト化抗ｈＯＸ４０抗体で処置されたＭＣ－３８腫瘍細胞を有するＯＸ４０ヒト化マウス（Ｂ－ｈＯＸ４０）での経時的な腫瘍体積を示すグラフである。 図１６は、肝臓組織病理学のＨ＆Ｅ染色の一連の画像（４００×）である。 図１７は、腎組織病理学のＨ＆Ｅ染色の一連の画像（４００×）である。 図１８は、腸組織病理学のＨ＆Ｅ染色の一連の画像（４００×）である。 図１９は、９Ｈ３及びキイトルーダ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）で処置されたＭＣ－３８腫瘍細胞を有するＯＸ４０ヒト化マウス（Ｂ－ｈＯＸ４０）経時的な体重を示すグラフである。 図２０は、９Ｈ３及びキイトルーダで処置されたＭＣ－３８腫瘍細胞を有するＯＸ４０ヒト化マウス（Ｂ－ｈＯＸ４０）経時的な体重の変化率を示すグラフである。 図２１は、９Ｈ３及びキイトルーダで処置されたＭＣ－３８腫瘍細胞を有するＯＸ４０ヒト化マウス（Ｂ－ｈＯＸ４０）での経時的な腫瘍体積を示すグラフである。 図２２は、９Ｈ３及びキイトルーダで処置されたＥＬ４がん細胞を有するＯＸ４０ヒト化マウス（Ｂ－ｈＯＸ４０）の経時的な体重を示すグラフである。 図２３は、９Ｈ３及びキイトルーダで処置されたＥＬ４がん細胞を有するＯＸ４０ヒト化マウス（Ｂ－ｈＯＸ４０）の経時的な体重の変化率を示すグラフである。 図２４は、９Ｈ３及びキイトルーダで処置されたＥＬ４がん細胞を有するＯＸ４０ヒト化マウス（Ｂ－ｈＯＸ４０）での経時的な腫瘍体積を示すグラフである。 図２５は、９Ｈ３、抗ＰＤ１抗体及び／又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体で処置されたＭＣ－３８腫瘍細胞を有するＯＸ４０ヒト化マウス（Ｂ－ｈＯＸ４０）の経時的な体重を示すグラフである。 図２６は、９Ｈ３、抗ＰＤ１抗体及び／又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体で処置されたＭＣ－３８腫瘍細胞を有するＯＸ４０ヒト化マウス（Ｂ－ｈＯＸ４０）の経時的な体重の変化率を示すグラフである。 図２７は、９Ｈ３、抗ＰＤ１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体で処置されたＭＣ－３８腫瘍細胞を有するＯＸ４０ヒト化マウス（Ｂ－ｈＯＸ４０）における経時的な腫瘍体積を示すグラフである。 図２８は、９Ｈ３、抗ＬＡＧ－３、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＢＴＬＡ、抗ＣＴＬＡ－４及び／又は抗ＧＩＴＲ抗体で処置されたＭＣ－３８腫瘍細胞を有するＯＸ４０ヒト化マウス（Ｂ－ｈＯＸ４０）の経時的な体重を示すグラフである。 図２９は、９Ｈ３、抗ＬＡＧ－３、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＢＴＬＡ、抗ＣＴＬＡ－４及び／又は抗ＧＩＴＲ抗体で処置されたＭＣ－３８腫瘍細胞を有するＯＸ４０ヒト化マウス（Ｂ－ｈＯＸ４０）の経時的な体重の変化率を示すグラフである。 図３０は、９Ｈ３、抗ＬＡＧ－３、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＢＴＬＡ、抗ＣＴＬＡ－４及び／又は抗ＧＩＴＲ抗体で処置されたＭＣ－３８腫瘍細胞を有するＯＸ４０ヒト化マウス（Ｂ－ｈＯＸ４０）における経時的な腫瘍体積を示すグラフである。 図３１は、Ｋａｂａｔ番号により定義される抗ＯＸ４０抗体９Ｈ３、９Ａ４、５Ｃ１、５Ｄ１０、及びそのヒト化抗体のＣＤＲ配列を示す。 図３２は、Ｃｈｏｔｈｉａ番号により定義される抗ＯＸ４０抗体９Ｈ３、９Ａ４、５Ｃ１、５Ｄ１０、及びそのヒト化抗体のＣＤＲ配列を示す。 図３３は、ヒトＯＸ４０、マウスＯＸ４０、サルＯＸ４０及びキメラＯＸ４０のアミノ酸配列を示す。 図３４は、ヒト化抗ＯＸ４０抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。 図３４の続き。 図３４の続き。 図３５は、マウス抗ｈＯＸ４０抗体９Ｈ３、９Ａ４、５Ｃ１及び５Ｄ１０の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
本開示は、ＯＸ４０（ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４又はＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ１３４とも称される）に結合する抗体、その抗原結合フラグメントの実例を提供する。
Ｔ細胞活性化の過程では、ＭＨＣ－ペプチド複合体を第１シグナルとして認識するためにＴＣＲが必要である。また、共刺激シグナルも必要がある。ＯＸ４０は、Ｔ細胞に作用する共刺激因子であり、腫瘍壊死因子受容体（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーであり、且つＩ型膜貫通タンパク質である。ＯＸ４０は、細胞内のＰＩ３Ｋ－ＡＫＴシグナル及びＮＦＡＴシグナルを活性化できる。これらのシグナルは、Ｔ細胞の増殖及び生存に積極的な影響を与える。また、ＯＸ４０は、Ｔ細胞の機能及び分化方向を調節することもできる。
今まで、ＯＸ４０は、末梢性寛容をを確立できる唯一の共刺激分子である。それは、腫瘍の免疫寛容を破壊しながら、免疫監視を回復することができる。腫瘍免疫療法のための新たなターゲットとしてＯＸ４０を使用するのは、既にある積極的な作用を奏している。ただし、抗体の活性化は、下流のシグナル伝達経路を活性化するために、その結合エピトープ及び状態を対応するリガンドと完全に整列させる必要があるため、ロックと特異的に一致するキーに類似するため、このタイプの抗体の開発は、困難である。本開示は、腫瘍増殖を効果的に阻害することができ、且つ癌を治療するために使用することができる複数の抗ＯＸ４０抗体及びヒト化抗ＯＸ４０抗体を提供する。
ＯＸ４０及び癌
免疫系は、体内の正常な細胞と「外来」とみなされる細胞とを区別することができる。これにより、免疫系は、正常な細胞に影響を与えずに、外来細胞を攻撃できる。このメカニズムには、免疫チェックポイントと呼ばれるタンパク質が関与する場合がある。免疫チェックポイントは、免疫システムの内、シグナルを増幅したり（共刺激分子）、シグナルを抑制する分子である。
チェックポイント阻害剤は、正常な組織への免疫系の攻撃を防止できるので、自己免疫疾患を防止する。多くの腫瘍細胞は、チェックポイント阻害剤も発現する。これらの腫瘍細胞は、特に腫瘍抗原に特異的なＴ細胞において、特定の免疫チェックポイント経路を選択することにより免疫監視を回避する。（Ｃｒｅｅｌａｎ、 Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｃ． 「Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．」 Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ ２１．１ （２０１４）： ８０－８９）。多くの免疫チェックポイントは、リガンドと受容体の相互作用によって引き起こされるため、リガンド及び／又はその受容体に対する抗体によって容易にブロックされる。
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ、 ｍｅｍｂｅｒ ４、ＴＮＦＲＳＦ４）は、ＣＤ１３４及びＯＸ４０とも称され、受容体のＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーであり、休止期のＴ細胞には構成的に発現していないものである。ＯＸ４０は、活性化から２４～７２時間後に発現する二次共刺激免疫チェックポイント分子であり、そのリガンドであるＯＸ４０Ｌは、休止中の抗原提示細胞にも発現しなく、活性化後に発現する。
マウスＴ細胞の表面でのＯＸ４０の発現は、通常、相同抗原認識後２４時間～９６時間に発生する。抗ＯＸ４０アゴニスト抗体（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）を使用してＴ細胞上のＯＸ４０受容体に結合して、さまざまなエフェクターT細胞サブセットの生存率を直接促進する。さらに、ＣＤ４＋ Ｔ細胞のうちの調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）と呼ばれる免疫抑制サブセットも、高レベルのＯＸ４０を発現する。なお、マウスのＴｒｅｇは、ＯＸ４０を構成的に発現しているが、ヒトのＴｒｅｇは活性化後にＯＸ４０をアップレギュレートすることが注意すべきである。Ｔｒｅｇは、免疫抑制サイトカイン（例えば、トランスフォーミング増殖因子β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ、ＴＧＦｂ）及びインターロイキン－１０（ＩＬ－１０））を分泌することにより、エフェクターＴ細胞を抑制することができる。これらの負の調節因子は、エフェクターＴ細胞上のＯＸ４０、他のＴＮＦＲＳＦ共刺激受容体、例えば、４１ＢＢ（ＣＤ１３７）及びグルココルチコイド誘発腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）（ＣＤ３５７）の刺激によって相殺される。
ＯＸ４０シグナル伝達は、Ｔｒｅｇの機能に影響を与え、その阻害能力を弱め、これは、ＦｏｘＰ３の発現を直接阻害することで達成可能である。ＯＸ４０シグナル伝達はＴｒｅｇの発生にも作用し、ＴＧＦｂ及び抗原によるＦｏｘＰ３ｐ（ソーン） ＴｒｅｇへのナイーブＴ細胞の変換を強く拮抗する。
ＯＸ４０シグナル伝達は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の生物活性を強力に促進し、Ｔｒｅｇの機能を打ち消すため、ＯＸ４０は、癌免疫療法のための免疫調節標的として機能し、例えば、ＯＸ４０シグナル伝達は、ＯＸ４０特異的アゴニスト抗体によって誘導される。ＯＸ４０及びその癌免疫療法の免疫調節標として機能する詳細は、例えば、Ａｓｐｅｓｌａｇｈ、 ｅｔ ａｌ． 「Ｒａｔｉｏｎａｌｅ ｆｏｒ ａｎｔｉ－ＯＸ４０ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．」 Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ５２ （２０１６）： ５０－６６；Ｃｕｒｔｉ、 ｅｔ ａｌ． 「ＯＸ４０ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｅ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｌａｔｅ－ｓｔａｇｅ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ．」 Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ７３．２４ （２０１３）： ７１８９－７１９８に記載され、その全体が援引により本明細書に組み込まれる。
本開示は、幾つかの抗ＯＸ４０抗体、その抗原結合フラグメント、並びにこれらの抗ＯＸ４０抗体及び抗原結合フラグメントを使用して腫瘍増殖を抑制し癌を治療する方法を提供する。
抗体及び抗原結合フラグメント
本開示は、抗ＯＸ４０抗体及その抗原結合フラグメントを提供する。一般的に、抗体（免疫グロブリンとも呼ばれる）は、軽鎖及び重鎖の両方のポリペプチド鎖からなる。本開示に係る非限定的な抗体は、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む無傷の４本の免疫グロブリン鎖抗体である。抗体の重鎖は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ又はＩｇＤを含む任意のアイソタイプ、或いはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ１、ＩｇＥ２などを含むサブアイソタイプであってもよい。軽鎖はκ軽鎖又はλ軽鎖であってもよい。抗体は、軽鎖の２つの同一コピー及び重鎖の２つの同一コピーを含んでもよい。それぞれ１つの可変ドメイン（又は可変領域、ＶＨ）及び複数の定常ドメイン（又は定常領域）を含む重鎖は、その定常領域内のジスルフィド結合を介して互いに結合し、抗体の「幹」を形成する。それぞれ１つの可変ドメイン（又は可変領域、ＶＬ）及び１つの定常ドメイン（又は定常領域）を含む軽鎖は、それぞれジスルフィド結合を介して１本の重鎖に結合する。各軽鎖の可変領域は、それが結合する重鎖の可変領域とペアリングしている。軽鎖と重鎖の両方の可変領域は、いずれもより保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）の間にある３つの超可変領域を含む。
これらの超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称され、抗体の主要な抗原結合表面を含むループを形成する。４つのフレームワーク領域は、主にβ－シート構造を採用し、且つ、ＣＤＲはループを形成し、前記ループはβ－シート構造と連結し、ある場合にはβ－シート構造の一部を形成する。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によって近接して保持され、且つ、他の鎖に由来するＣＤＲとともに抗原結合領域の形成に寄与する。
抗体のアミノ酸配列を分析することにより抗体のＣＤＲ領域を同定する方法は周知であり、且つＣＤＲの多くの定義は一般的に使用されているものである。Ｋａｂａｔの定義は、抗体配列の可変性に基づくものであり、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、構造ループ領域の位置に基づくものである。これらの方法及び定義は、例えば、Ｍａｒｔｉｎ、 「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ、」 Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、 ２００１． ４２２－４３９；Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ、 ｅｔ ａｌ． 「Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｋａｂａｔ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｃｏｒｒｅｃｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ、」 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４５．１４ （２００８）： ３８３２－３８３９；Ｗｕ、 Ｔ．Ｔ． ａｎｄ Ｋａｂａｔ、 Ｅ．Ａ． （１９７０） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １３２： ２１１－２５０；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．、 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０３：１２１－５３ （１９９１）；Ｍｏｒｅａ ｅｔ ａｌ．、 Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ． ６８（１－３）：９－１６ （Ｏｃｔ． １９９７）；Ｍｏｒｅａ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２７５（２）：２６９－９４ （Ｊａｎ ．１９９８）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．、 Ｎａｔｕｒｅ ３４２（６２５２）：８７７－８３ （Ｄｅｃ． １９８９）；Ｐｏｎｏｍａｒｅｎｋｏ ａｎｄ Ｂｏｕｒｎｅ、 ＢＭＣ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：６４ （２００７）に記載され、それぞれその全体が援引により本明細書に組み込まれる。本開示では、特に言及されていない限り、Ｋａｂａｔ番号が使用される。
ＣＤＲは、抗原エピトープを認識するために重要である。本明細書で使用される「エピトープ」とは、抗体の抗原結合部位によって特異的に結合することができる、標的分子の最小部分である。エピトープの最小サイズは、約３、４、５、６又は７個のアミノ酸であってもよいが、これらのアミノ酸は必ずしも抗原の一次構造の連続的な線状配列にある必要がない。これは、エピトープが抗原の二次および三次構造に基づく抗原の３次元構造に依存するためである。
幾つかの実施態様において、抗体は、無傷の免疫グロブリン分子（例えば、、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ）である。ＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）は、高度に保存されたものであり、相違点は、その定常領域、特にそのヒンジ及び上部ＣＨ２ドメインにある。ＩｇＧサブクラスの配列及び相違は、当技術分野で知られており、例えば、Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ、 ｅｔ ａｌ、 「ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ａｎｄ ａｌｌｏｔｙｐｅｓ： ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．」 Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５ （２０１４）；Ｉｒａｎｉ、 ｅｔ ａｌ． 「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ．」 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７．２ （２０１５）： １７１－１８２；Ｓｈａｋｉｂ、 Ｆａｒｏｕｋ、 ｅｄ． Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ： ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、 ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、 ２０１６に記載されており、それぞれその全体が援引により本明細書に組み込まれる。
抗体は、また、任意の種（例えば、ヒト、げっ歯類動物、マウス、ラクダ科）に由来する免疫グロブリン分子であってもよい。本明細書に開示される抗体は、ポリクローナル、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体、及び別のポリペプチドに融合した免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ抗体も含むが、これらに限定されない。「抗原結合部位」又は「抗原結合フラグメント」という用語は、無傷の抗体の特異的結合活性を保持する抗体の一部、即ち、抗体のうち、無傷の抗体の標的分子でのエピトープに特異的に結合できる任意の部分である。それは、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びこれらのフラグメントの変異体を含む。よって、幾つかの実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、抗体フラグメントからなるｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、二重特異性抗体、二重特異性ｓｃＦｖ、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子、多重特異性抗体、及び抗体結合ドメインであるまたは抗体結合ドメインと相同性を有する結合ドメインを含む任意のポリペプチドであってもよい。抗原結合部位の非限定的な例は、例えば、無傷の抗体的重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲ、無傷の抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域、無傷の抗体の全長重鎖又は軽鎖、又は無傷の抗体の重鎖又は軽鎖に由来する単一のＣＤＲを含む。
幾つかの実施態様において、抗原結合フラグメントは、キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＡＲ）の一部を形成することができる。幾つかの実施態様において、キメラ抗原受容体は、ＣＤ３－ゼータ膜貫通及び細胞内ドメインに融合する本明細書に記載の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の融合体である。幾つかの実施態様において、キメラ抗原受容体は、複数種の共刺激タンパク質受容体（例えば、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳ）に由来する細胞内シグナル伝達ドメインも含む。幾つかの実施態様において、キメラ抗原受容体は、効力を増強するために、複数のシグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ｚ－ＣＤ２８－４１ＢＢ又はＣＤ３ｚ－ＣＤ２８－ＯＸ４０を含む。従って、一つの側面では、本開示は、さらに、発現本明細書に記載のキメラ抗原受容体を発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）を提供する。
幾つかの実施態様において、ｓｃＦＶは、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインを持つ。
抗ＯＸ４０抗体及び抗原結合フラグメント
本開示は、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体及その抗原結合フラグメントを提供する。本明細書に記載の抗体及び抗原結合フラグメントは、ＯＸ４０に結合でき、ＯＸ４０シグナル伝達経路を促進できるため、免疫応答を増強させる。本開示は、例えば、マウス抗ＯＸ４０抗体０７－９Ｈ３（「９Ｈ３」）、０７－９Ａ４（「９Ａ４」）、１１－５Ｃ１（「５Ｃ１」）、１７－５Ｄ１０（「５Ｄ１０」）、及びキメラ抗体、そのヒト化抗体（例えば、表３に示される抗体）を提供する。
Ｋａｂａｔ番号により定義されるように、９Ｈ３及び９Ｈ３に由来する抗体（例えば、ヒト化抗体）のＣＤＲ配列は、重鎖可変ドメインのＣＤＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １～３）、及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ４～６）を含む。ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａシステムによっても定義されてもよい。Ｃｈｏｔｈｉａ番号では、重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ２５～２７に示され、且つ軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ２８～３０に示される。
類似しては、Ｋａｂａｔ番号によって定義されるように、９Ａ４及び９Ａ４に由来する抗体のＣＤＲ配列は、重鎖可変ドメインのＣＤＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ７～９）、及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １０～１２）を含む。Ｃｈｏｔｈｉａ番号では、重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ３１～３３に示され、且つ軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ３４～３６に示される。
Ｋａｂａｔ番号によって定義されるように、５Ｃ１及び５Ｃ１に由来する抗体のＣＤＲ配列は、重鎖可変ドメインのＣＤＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １３～１５）、及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １６～１８）を含む。Ｃｈｏｔｈｉａ番号では、重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ３７～３９に示され、且つ軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ４０～４２に示される。
Ｋａｂａｔ番号によって定義されるように、５Ｄ１０及び５Ｄ１０に由来する抗体のＣＤＲ配列は、重鎖可変ドメインのＣＤＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １９～２１）、及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ２２～２４）を含む。Ｃｈｏｔｈｉａ番号では、重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ４３～４５に示され、且つ軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ４６～４８に示される。
さらに、ヒト化抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を提供する。マウス抗体をヒト化するには様々な方法があるため（例えば、配列が異なるアミノ酸によって置き換えることができる）、抗体の重鎖及び軽鎖は、１つ以上の態様のヒト化抗体配列を有することができる。ヒト化９Ｈ３抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ５３～５５に示される。ヒト化９Ｈ３抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ５６～５８に示される。これらの重鎖可変領域配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３～５５）のいずれか１つは、これらの軽鎖可変領域配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５６～５８）のいずれか１つとペアリングすることができる。
類似しては、ヒト化９Ａ４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ５９～６１に示される。ヒト化９Ａ４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ６２～６５に示される。これらの重鎖可変領域配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５９～６１）のいずれか１つは、これらの軽鎖可変領域配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６２－６５）のいずれか１つとペアリングすることができる。
ヒト化５Ｃ１抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ６６～６８に示される。ヒト化５Ｃ１抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ６９～７２に示される。これらの重鎖可変領域配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ６６－６８）のいずれか１つは、これらの軽鎖可変領域配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ６９－７２）のいずれか１つとペアリングすることができる。
ヒト化５Ｄ１０抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ７３～７５に示される。ヒト化５Ｄ１０抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ７６～７８に示される。これらの重鎖可変領域配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ７３－７５）のいずれか１つは、これらの軽鎖可変領域配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ７６－７８）のいずれか１つとペアリングすることができる。
図３４に示すように、ヒト化率とは、国際免疫遺伝情報システム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、ＩＭＧＴ）データベース中のヒト抗体配列と比較する重鎖又は軽鎖可変領域配列の同一性パーセントを意味する。トップヒット（ｔｏｐ ｈｉｔ）とは、重鎖又は軽鎖の可変領域配列が他の種よりも特定の種に近いことを意味する。例えば、ヒトへのトップヒットとは、配列が他の種よりもヒトに近いことを意味する。ヒト及びカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）へのトップヒットとは、その配列がヒト配列及びカニクイザル配列と同じ割合の同一性を有し、且つこれらの割合の同一性が他の種の配列と比較して最も高いであることを意味する。幾つかの実施態様において、ヒト化率は、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％又は９５％を超える。ヒト化率を決定する方法及びトップヒットを決定する方法に関する詳細は、当技術分野で知られており、Ｊｏｎｅｓ、 Ｔｉｍ Ｄ．、 ｅｔ ａｌ． “Ｔｈｅ ＩＮＮｓ ａｎｄ ｏｕｔｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｎｏｎｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ ｎａｍｅｓ．” ＭＡｂｓ． Ｖｏｌ． ８． Ｎｏ． １． Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ、 ２０１６に記載され、その全体が援引により本明細書に組み込まれている。高ヒト化率は、通常、さまざまな利点があり、例えば、ヒトにとっては安全で効果的であり、ヒトの被験者によってより容易に許容され、及び／又は副作用が発生する可能性がほとんどない。
また、幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントは、さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １～３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ７～９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １３～１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １９～２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ２５～２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ３１～３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ３７～３９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ４３～４５から選ばれる１つ、２つ又は３つの重鎖可変領域ＣＤＲ、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ４～６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ １０～１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １６～１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ ２２～２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ ２８～３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ ３４～３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ ４０～４２及び ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ ４６～４８から選ばれる１つ、２つ又は３つの軽鎖可変領域ＣＤＲ、を含む。
幾つかの実施態様において、抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）１、２、３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）（ここで、ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、且つＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる）と、ＣＤＲ １、２、３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）（ここで、ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、且つＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる）とを持つ。選択されたＶＨ ＣＤＲ １、２、３アミノ酸配列及び選択されたＶＬ ＣＤＲ １、２、３アミノ酸配列は、図３１（Ｋａｂａｔ ＣＤＲ）及び図３２（Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ）に示される。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む、重鎖可変ドメインを含むことができる。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む、重鎖可変ドメインを含むことができる。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む、重鎖可変ドメインを含むことができる。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む、重鎖可変ドメインを含むことができる。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む、重鎖可変ドメインを含むことができる。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む、重鎖可変ドメインを含むことができる。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む、重鎖可変ドメインを含むことができる。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４４；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む、重鎖可変ドメインを含むことができる。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む、軽鎖可変ドメインを含むことができる。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む、軽鎖可変ドメインを含むことができる。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む、軽鎖可変ドメインを含むことができる。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む、軽鎖可変ドメインを含むことができる。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む、軽鎖可変ドメインを含むことができる。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３５；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３６というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む、軽鎖可変ドメインを含むことができる。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４０；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４１；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む、軽鎖可変ドメインを含むことができる。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４６；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４７；０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４８というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む、軽鎖可変ドメインを含むことができる。
挿入、欠失及び置換は、ＣＤＲ配列内、又は在ＣＤＲ配列の片方や両方の末端で行うことができる。
本開示は、さらに、ＯＸ４０に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。抗体又はその抗原結合フラグメントは、選択されたＶＨ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる重鎖可変領域（ＶＨ）と、選択されたＶＬ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。幾つかの実施態様において、選択されたＶＨ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ５３、５４、５５又は７９であり、且つ選択されたＶＬ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ５６、５７、５８又は８０である。幾つかの実施態様において、選択されたＶＨ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ５９、６０、６１又は８１であり、且つ選択されたＶＬ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ６２、６３、６４、６５又は８２である。幾つかの実施態様において、選択されたＶＨ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ６６、６７、６８又は８３であり、且つ選択されたＶＬ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ６９、７０、７１、７２又は８４である。幾つかの実施態様において、選択されたＶＨ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ７３、７４、７５又は８５であり、且つ選択されたＶＬ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ７６、７７、７８又は８６である。
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、最適比較目的のために整列される（例えば、最適整列のために第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の１つ又は２つにギャップを導入し、比較目的のために、非相同性配列が無視されることができる）。比較目的のために整列されている参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも８０％であり、幾つかの実施態様において、少なくとも９０％、９５％又は１００％である。その後、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置でのアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置及び第２の配列中の対応する位置は、同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められると、分子がその位置で同一である。２つの配列の間でのパーセント同一性は、２つの配列の最適整列のために導入されるギャップ数及び各ギャップの長さを考慮する場合には、配列が共有する同一位置の数の関数である。本開示の目的のために、配列の比較及び２つの配列の間での同一性パーセントの決定は、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリングマトリックスにより達成し、ここで、ギャップペナルティを１２とし、ギャップ伸長ペナルティを４とし、フレームシフト・ギャップ・ペナルティを５とする。
本開示は、さらに、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を提供し、前記ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖又は免疫グロブリン重鎖を含む。免疫グロブリン重鎖又は免疫グロブリン軽鎖は、図３１又は図３２に示されるＣＤＲを含むか、又は図３４又は図３５に示される配列を有する。ポリペプチドが対応するポリペプチド（例えば、対応する重鎖可変領域又は対応する軽鎖可変領域）とペアリングする場合に、ペアリングしたポリペプチドは、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に結合する。
抗ＯＸ４０抗体及び抗原結合フラグメントは、抗体又は抗体フラグメントの抗体変異体（誘導体及び複合体を含む）、及び多重特異性（例えば、二重特異性）抗体又は抗体フラグメントであってもよい。本明細書で提供される他の抗体は、ポリクローナル、モノクローナル抗体、多重特異性抗体（多量体化抗体、例えば、二重特異性抗体）、ヒト抗体、キメラ抗体（例えば、ヒト－マウスキメラ体）、一本鎖抗体、細胞内で産生する抗体（即ち、細胞内抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ））、及その抗原結合フラグメントであってもよい。抗体又はその抗原結合フラグメントは、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであってもよい。幾つかの実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントである。
抗体のフラグメントは、全長抗体の望ましい親和性及び特異性を保持する限り、提供される方法に適合する。従って、ＯＸ４０に結合する抗体のフラグメントは、ＯＸ４０に結合する能力を保持する。Ｆｖフラグメントは、無傷の抗原認識及び結合部位を含む抗体フラグメントである。該領域は、強固に会合する１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなり、前記結合は、本質的に共有結合であり、例えば、ｓｃＦｖである。この構成では、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用し、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面での抗原結合部位を限定する。６つのＣＤＲ又はそのサブセットは、一緒に抗原結合特異性を抗体に与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（又はＦｖのうち、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含む半分）でも、抗原を認識して結合する能力を持つが、通常、結合部位全体よりも低い親和性である。
一本鎖Ｆｖ又は（ｓｃＦｖ）抗体フラグメントは、抗体のＶＨ及びＶＬドメイン（又は領域）を含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含むため、ｓｃＦｖは抗原結合のための所望の構造を形成できる。
Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の可変ドメイン及び定常ドメインと、重鎖の可変ドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、一対のＦａｂフラグメントを含み、それらは、通常に、そのカルボキシ末端近くでそれらの間のヒンジシステインを介して共有結合される。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも当技術分野で知られている。
ダイアボディは、２つの抗原結合部位を持つ小さな抗体フラグメントであり、そのフラグメントは、同一のポリペプチド鎖のＶＬに連結されるＶＨ（ＶＨ及びＶＬ）を含む。同一の鎖上の２つのドメイン間をペアリングするには短すぎるリンカーを使用することにより、これらのドメインは、他の鎖の相補ドメインとペアリングされ、２つの抗原結合部位を発生する。
線状抗体は、一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含み、相補性軽鎖ポリペプチドと一緒になって一対の抗原結合領域を形成する。線状抗体は、二重特異性であってもよく又は単特異性であってもよい。
本開示に係る抗体及び抗体フラグメントは、所望のエフェクター機能又は血清半減期を提供するためにＦｃ領域で修飾することができる。
抗体の多量体化は、抗体の自然凝集、又は当技術分野で知られている化学的や組換え連結技術により達成されることができる。例えば、ある程度の割合の精製された抗体製剤（例えば、精製されたＩｇＧ１分子）は、抗体ホモ二量体及び他の高次抗体多量体を含むタンパク質凝集体を自発的に形成する。
また、抗体ホモ二量体は、当技術分野で知られている化学的な連結技術により形成することができる。例えば、ヘテロ二官能性架橋剤を使用して抗体多量体を形成でき、前記架橋剤は、ＳＭＣＣ（４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸Ｎ－スクシンイミジル）及びＳＡＴＡ（Ｓ－アセチルチオ酢酸スクシンイミジル）を含むが、これらに限定されない。Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４： ７５０９－７５１４、 １９９７）には、抗体ホモ二量体を形成するための例示的な態様が記載されている。ペプシンの消化により抗体ホモ二量体をＦａｂ’２ホモ二量体に変換することができる。抗体ホモ二量体を形成する別の方法は、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５：３９６－４０４、 ２００２）に記載されている自己好性（ａｕｔｏｐｈｉｌｉｃ）Ｔ１５ペプチドの使用によるものである。
幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大化するために、一対の抗体分子間の界面を設計することにより作成することができる。例えば、界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含むことができる。該方法では、第１抗体分子の界面に由来する１つ又は複数の小さなアミノ酸側鎖が、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）に置き換えられる。大きな側鎖と同一又は類似するサイズの代償的な「空洞」は、第２抗体分子の界面で大きなアミノ酸側鎖を、小さな側鎖（例えば、アラニン又はスレオニン）に置換することにより発生する。これは、他の不要ない最終生成物（例えば、ホモ二量体）よりもヘテロ二量体の収率を高めるメカニズムを提供する。例えば、ＷＯ９６／２７０１１には該方法が記載され、その全体が援引により組み込まれている。
二重特異性抗体は、架橋抗体又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の１つは、アビジンにカップリングし、また、もう１つはビオチンにカップリングすることができる。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の便利な架橋法により作製されることができる。適合な架橋剤及び架橋技術は、当分野で周知されているものであり、米国特許Ｎｏ．４，６７６，９８０に開示されており、その全体が援引により本明細書に組み込まれている。
抗体フラグメントから二重特異性抗体を産生させる技術も当技術分野で知られている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を使用し調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１、 １９８５）は、無傷の抗体をタンパク質分解により開裂してＦ（ａｂ’）２フラグメントを発生させる方法を記載している。これらのフラグメントは、ジチオール複合化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下に還元して隣接するジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。次いで、発生したＦａｂ’フラグメントをチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に転換する。次いで、メルカプトエチルアミンでＦａｂ’ＴＮＢ誘導体の１つを還元してＦａｂ’－チオールに再転換し、等モル量の他のＦａｂ’ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成させる。
本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントのいずれかは、安定化分子（例えば、対象のｉｎ ｖｉｖｏ又は溶液中の抗体又はその抗原結合フラグメントの半減期を増加させる分子）に結合されることができる。安定化分子の非限定的な例は、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）又はタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン）が含まれる。安定化分子の複合化は、抗体又は抗原結合フラグメントのｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、組織培養物中又は医薬組成物として保存される場合）又はｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、ヒト中）での半減期を延長したり、生物学的活性を高めることができる。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、治療剤と複合されることができる。抗体又はその抗原結合フラグメントを含む抗体－薬物複合体は、治療剤に共有結合または非共有結合することができる。幾つかの実施態様において、治療剤は、細胞傷害性薬又は細胞増殖抑制薬（例えば、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン（ｅｍｅｔｉｎｅ）、マイトマイシン、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン、マイタンシノイド類（例えば、ＤＭ－１ 及びＤＭ－４）、ジオン、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ミトラマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン（ｐｒｏｃａｉｎｅ）、テトラカイン（ｔｅｔｒａｃａｉｎｅ）、リドカイン（ｌｉｄｏｃａｉｎｅ）、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、シクロホスファミドおよび類似体）。
抗体特性
本明細書に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＯＸ４０とＯＸ４０Ｌの結合を遮断することができる。
幾つかの実施態様において、抗体は、ＯＸ４０に結合することにより、ＯＸ４０シグナル伝達経路を促進し、免疫応答をアップレギュレートすることができる。従って、幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＯＸ４０アゴニストである。幾つかの実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＯＸ４０拮抗剤である。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントは、免疫応答、ＯＸ４０の活性、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋細胞）の活性又は数を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、５倍、１０倍又は２０倍向上させることができる。幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｔｒｅｇの活性又は数を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、５倍、１０倍又は２０倍低減させることができる。
幾つかの実施態様において、抗体（又はその抗原結合フラグメント）は、０．１ ｓ－１未満、０．０１ ｓ－１未満、０．００１ ｓ－１未満、０．０００１ ｓ－１未満又は小于０．０００１ ｓ－１未満という解離速度（ｋｏｆｆ）でＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０、サルＯＸ４０、マウスＯＸ４０及び／又はキメラＯＸ４０）に特異的に結合する。幾つかの実施態様において、解離速度（ｋｏｆｆ）は、０．０１ ｓ－１超え、０．００１ ｓ－１超え、０．０００１ ｓ－１超え、０．０００１ ｓ－１超え又は０．００００１ ｓ－１超えである。
幾つかの実施態様において、動力学的結合速度（ｋｏｎ）は、１ ｘ １０２／Ｍｓ超え、１ ｘ １０３／Ｍｓ超え、１ ｘ １０４／Ｍｓ超え、１ ｘ １０５／Ｍｓ超え又は１ ｘ １０６／Ｍｓ超えである。幾つかの実施態様において、動力学的結合速度（ｋｏｎ）は、１ ｘ １０５／Ｍｓ未満、１ ｘ １０６／Ｍｓ未満又は１ ｘ １０７／Ｍｓ未満である。
親和性は、動力学的速度定数の商（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）から導出されることができる。幾つかの実施態様において、ＫＤは、１ ｘ １０－６ Ｍ未満、１ ｘ １０－７ Ｍ未満、１ ｘ １０－８ Ｍ未満、１ ｘ １０－９ Ｍ未満又は１ ｘ １０－１０ Ｍ未満である。幾つかの実施態様において、ＫＤは、３０ ｎＭ未満、２０ ｎＭ未満、１５ ｎＭ未満、１０ ｎＭ未満、９ ｎＭ未満、８ ｎＭ未満、７ ｎＭ未満、６ ｎＭ未満、５ ｎＭ未満、４ ｎＭ未満、３ ｎＭ未満、２ ｎＭ未満又は１ ｎＭ未満である。幾つかの実施態様において、ＫＤは、１ ｘ １０－７ Ｍ超え、１ ｘ １０－８ Ｍ超え、１ ｘ １０－９ Ｍ超え、１ ｘ １０－１０ Ｍ超え、１ ｘ １０－１１ Ｍ超え又は１ ｘ １０－１２ Ｍ超えである。幾つかの実施態様において、抗体は約１．５ ｎＭ以上のＫＤでヒトＯＸ４０に結合する。
抗原に対する抗体の親和性を測定するための一般的な技術は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、結合ヒトＯＸ４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４９）、サルＯＸ４０（例えば、アカゲザルＯＸ４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５１）、キメラＯＸ４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５２）及び／又はマウスＯＸ４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５０）に結合する。幾つかの実施態様において、抗体は、ヒトＯＸ４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４９）、サルＯＸ４０（例えば、アカゲザルＯＸ４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５１；カニクイザＯＸ４０）、キメラＯＸ４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５２）及び／又はマウスＯＸ４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５０）に結合しない。
幾つかの実施態様において、熱安定性が決定される。本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントのＴｍは、６０℃超え、６１℃超え、６２℃超え、６３℃超え、６４℃超え、６５℃超え、６６℃超え、６７℃超え、６８℃超え、６９℃超え、７０℃超え、７１℃超え、７２℃超え、７３℃超え、７４℃超え、７５℃超え、７６℃超え、７７℃超え、７８℃超え、７９℃超え、８０℃超え、８１℃超え、８２℃超え、８３℃超え、８４℃超え、８５℃超え、８６℃超え、８７℃超え、８８℃超え、８９℃超え、９０℃超え、９１℃超え、９２℃超え、９３℃超え、９４℃超え又は９５℃℃超えであってもよい。ＩｇＧはマルチドメインタンパク質として記載されるため、融解曲線には２つの遷移を示すことがあり、即ち、第１の変性温度Ｔｍ Ｄ１及び第２の変性温度Ｔｍ Ｄ２である。これらの２つのピークの存在は、通常、それぞれＦｃドメイン（Ｔｍ Ｄ１）及びＦａｂドメイン（Ｔｍ Ｄ２）の変性を示す。２つのピークがある場合には、Ｔｍは、通常、Ｔｍ Ｄ２を指す。
従って、幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントのＴｍ Ｄ１は、６０℃超え、６１℃超え、６２℃超え、６３℃超え、６４℃超え、６５℃超え、６６℃超え、６７℃超え、６８℃超え、６９℃超え、７０℃超え、７１℃超え、７２℃超え、７３℃超え、７４℃超え、７５℃超え、７６℃超え、７７℃超え、７８℃超え、７９℃超え、８０℃超え、８１℃超え、８２℃超え、８３℃超え、８４℃超え、８５℃超え、８６℃超え、８７℃超え、８８℃超え、８９℃超え、９０℃超え、９１℃超え、９２℃超え、９３℃超え、９４℃超え又は９５℃超えである。幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントのＴｍ Ｄ２は、６０℃超え、６１℃超え、６２℃超え、６３℃超え、６４℃超え、６５℃超え、６６℃超え、６７℃超え、６８℃超え、６９℃超え、７０℃超え、７１℃超え、７２℃超え、７３℃超え、７４℃超え、７５℃超え、７６℃超え、７７℃超え、７８℃超え、７９℃超え、８０℃超え、８１℃超え、８２℃超え、８３℃超え、８４℃超え、８５℃超え、８６℃超え、８７℃超え、８８℃超え、８９℃超え、９０℃超え、９１℃超え、９２℃超え、９３℃超え、９４℃超え又は９５℃超えである。
幾つかの実施態様において、Ｔｍ、Ｔｍ Ｄ１、Ｔｍ Ｄ２は、６０℃未満、６１℃未満、６２℃未満、６３℃未満、６４℃未満、６５℃未満、６６℃未満、６７℃未満、６８℃未満、６９℃未満、７０℃未満、７１℃未満、７２℃未満、７３℃未満、７４℃未満、７５℃未満、７６℃未満、７７℃未満、７８℃未満、７９℃未満、８０℃未満、８１℃未満、８２℃未満、８３℃未満、８４℃未満、８５℃未満、８６℃未満、８７℃未満、８８℃未満、８９℃未満、９０℃未満、９１℃未満、９２℃未満、９３℃未満、９４℃未満又は９５℃未満である。
幾つかの実施態様において、抗体の腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ％）は、１０％超え、２０％超え、３０％超え、４０％超え、５０％超え、６０％超え、７０％超え、８０％超え、９０％超え、１００％超え、１１０％超え、１２０％超え、１３０％超え、１４０％超え、１５０％超え、１６０％超え、１７０％超え、１８０％超え、１９０％超え又は２００％超えである。幾つかの実施態様において、抗体の腫瘍増殖阻害率は、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、１００％未満、１１０％未満、１２０％未満、１３０％未満、１４０％未満、１５０％未満、１６０％未満、１７０％未満、１８０％未満、１９０％未満又は２００％未満である。ＴＧＩ％は、例えば、治療開始後３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日又は治療開始後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２か月で特定されることができる。本明細書で使用されるように、腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ％）は、次の式を使用して計算する。
Figure 2022179623000001
Ｔｉは、ｉ日目の治療群の平均腫瘍体積である。Ｔ０は、０日目の治療群の平均腫瘍体積である。Ｖｉは、ｉ日目の対照群の平均腫瘍体積である。Ｖ０は、０日目の対照群の平均腫瘍体積である。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＯＸ４０アゴニストである。幾つかの実施態様において、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＯＸ４０を発現する標的細胞におけるＯＸ４０シグナル伝達を増加させる。幾つかの実施態様において、ＮＦｋＢ下流シグナル伝達をモニタリングすることによりＯＸ４０シグナル伝達を検出する。
幾つかの実施態様において、抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞増殖の増加及び／又はＣＤ４＋エフェクターＴ細胞でのγインターフェロン産生の増加（例えば、抗体又は抗原結合フラグメントで治療される前の増殖及び／又はサイトカイン産生と比較しては）によりＣＤ４＋エフェクターＴ細胞機能を増強させる。幾つかの実施態様において、サイトカインは、γインターフェロンである。幾つかの実施態様において、例えば、抗体又は抗原結合フラグメントで治療される前の腫瘍内（浸潤）ＣＤ４＋ Ｔ細胞の数と比較して、抗体又は抗原結合フラグメントは、腫瘍内（浸潤）ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の数（例えば、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の総数、又は、ＣＤ４５＋細胞中ＣＤ４＋細胞の割合）を増加させる。幾つかの実施態様において、例えば、治療前のγインターフェロンを発現する腫瘍内（浸潤）ＣＤ４＋ Ｔ細胞の数と比較して、抗体又は抗原結合フラグメントは、γインターフェロンを発現する腫瘍内（浸潤）ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の数（例えば、γインターフェロンを発現する総ＣＤ４＋細胞、又は、総ＣＤ４＋細胞におけるγインターフェロンを発現するＣＤ４＋細胞の割合）を増加させる。
幾つかの実施態様において、例えば、治療前の腫瘍内（浸潤）ＣＤ８＋ エフェクターＴ細胞の数と比較して、抗体又は抗原結合フラグメントは、腫瘍内（浸潤）ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の数（例えば、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の総数、又は、ＣＤ４５＋細胞中ＣＤ８＋細胞の割合）を増加させる。幾つかの実施態様において、例えば、抗ヒトＯＸ４０抗体で治療される前のγインターフェロンを発現する腫瘍内（浸潤）ＣＤ８＋ Ｔ細胞の数と比較して、抗体又は抗原結合フラグメントは、γインターフェロンを発現する腫瘍内（浸潤）ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の数（例えば、総ＣＤ８＋細胞にγインターフェロンを発現するＣＤ８＋細胞の割合）を増加させる。
幾つかの実施態様において、抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば、記憶Ｔ細胞増殖を増加させること及び／又は記憶細胞によるサイトカイン（例えば、γインターフェロン）産生を増加させることにより記憶Ｔ細胞の機能を増強させる。
幾つかの実施態様において、抗体又は抗原結合フラグメント例えば、エフェクターＴ細胞機能（例えば、エフェクターＴ細胞の増殖及び／又はエフェクターＴ細胞サイトカインの分泌）のＴｒｅｇ阻害を低減させることによりＴｒｅｇ機能を阻害する。幾つかの実施態様において、エフェクターＴ細胞は、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞である。幾つかの実施態様において、抗体又は抗原結合フラグメントは、腫瘍内（浸潤）Ｔｒｅｇの数（例えば、Ｔｒｅｇの総数、又は、ＣＤ４＋細胞におけるＦｏｘ３ｐ＋細胞の割合）を減少させる。
幾つかの実施態様において、抗体又は抗原結合フラグメントは、枯渇性抗ｈＯＸ４０抗体（例えば、ヒトＯＸ４０を発現する細胞を枯渇させる）である。幾つかの実施態様において、抗体又は抗原結合フラグメントは、インビトロでヒトＯＸ４０を発現する細胞を枯渇させる。幾つかの実施態様において、ヒトＯＸ４０発現細胞は、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞又はＴｒｅｇ細胞である。幾つかの実施態様において、枯渇は、ＡＤＣＣ及び／又は食作用によるものである。
幾つかの実施態様において、抗体又は抗原結合フラグメントは、機能性Ｆｃ領域を有する。幾つかの実施態様において、機能性Ｆｃ領域のエフェクター機能は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。幾つかの実施態様において、機能性Ｆｃ領域のエフェクター機能は、食作用である。幾つかの実施態様において、機能性Ｆｃ領域のエフェクター機能は、ＡＤＣＣ及び食作用である。幾つかの実施態様において、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３又はヒトＩｇＧ４である。
幾つかの実施態様において、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＯＸ４０を発現する細胞（例えば、Ｔｒｅｇ）においてアポトーシスを誘発しない。
幾つかの実施態様において、抗体又は抗原結合フラグメントは、機能性Ｆｃ領域を持っていない。例えば、抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメントである。
抗ＯＸ４０抗体の作製方法
ヒトＯＸ４０の単離フラグメントは、ポリクローナル及びモノクローナル抗体の作製のための標準的技術を使用して抗体を生成する免疫原として用いられる。ポリクローナルは、抗原性ペプチド又はタンパク質の複数回の注射（例えば、皮下又は腹腔内注射）により動物内で発生されることができる。幾つかの実施態様において、抗原性ペプチド又はタンパク質は、少なくとも１つのアジュバントとともに注射される。幾つかの実施態様において、抗原性ペプチド又はタンパク質は、予防接種を受ける種において免疫原性である試薬と複合化されることができる。動物に抗原性ペプチド又はタンパク質を１回超え（例えば、２回、３回又は４回）注射することができる。
全長ポリペプチド又はタンパク質を使用することができるか、又はその抗原性ペプチド断片を免疫原として使用することができる。タンパク質の抗原性ペプチドは、ペプチドに対して産生された抗体がタンパク質と特異性免疫複合体を形成するようにＯＸ４０のアミノ酸配列の少なくとも８個（例えば、少なくとも１０、１５、２０又は３０個）のアミノ酸残基を含み、且つタンパク質のエピトープを含む。上記のように、ヒトＯＸ４０的全長配列は当技術分野で知られている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４９）。
免疫原は、通常、適合な対象（例えば、ヒト、又は少なくとも１つのヒト免疫グロブリン遺伝子座を発現するトランスジェニック動物）を予防接種することにより抗体を調製する。適当な免疫原性製剤は、例えば、組換え発現又は化学合成されたポリペプチド（例えば、ヒトＯＸ４０のフラグメント）を含むことができる。該製剤は、さらに、アジュバント、例えば、フロインドの完全又は不完全アジュバント、又は類似する免疫増強薬を含む。
ポリクローナル抗体は、上記のように、ＯＸ４０ポリペプチド又はその抗原性ペプチド（例えば、ＯＸ４０の一部）を免疫原として適当な対象を予防接種することにより調製される。予防接種された対象の抗体力価は、例えば、固定化ＯＸ４０ポリペプチド又はペプチドを使用する酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの標準的な手法により経時的に監視することができる。必要に応じて、抗体分子を哺乳動物（例えば、血液）から単離し、周知の技術、例えば、プロテインＡ/Ｇクロマトグラフィーによりさらに精製してＩｇＧ画分を得る。予防接種後の適切な時間、例えば、特異性抗体力価が最も高い場合、抗体産生細胞を対象から取得し、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７、 １９７５）初回に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．、 Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ４：７２、 １９８３）、ＥＢＶ－ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．、 Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、 Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ、 Ｉｎｃ．、 ｐｐ． ７７－９６、 １９８５）又はトリオーマ技術などの標準的技術によりモノクローナル抗体を調製する。ハイブリドーマを産生する技術は、よく知られている（一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 １９９４、 Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｓ．）、 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、 Ｉｎｃ．、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ＮＹを参照）。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用し、目的のポリペプチドまたはエピトープに結合する抗体についてハイブリドーマ培養物上清液をスクリーニングすることにより検出される。
本明細書に記載のヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体、又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入することにより、又はペプチド合成により、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントの変異体を調製する。このような変異体は、例えば、抗体又は抗原結合ドメインを構成する抗原結合部位のアミノ酸配列中の残基の欠失、挿入又は置換を含む。このような変異体の集団では、一部の抗体又は抗原結合フラグメントは、標的タンパク質（例えば、ＯＸ４０）に対する親和性が増加する。欠失、挿入及び／又はそれらの任意の組み合わせを行って、標的に対する結合親和性が増加した抗体又はその抗原結合フラグメントを取得することができる。抗体又は抗原結合フラグメントに導入されるアミノ酸の変化は、抗体又は抗原結合フラグメントを変化させ、或いは、抗体又は抗原結合フラグメントに新たな翻訳後修飾を導入し、例えば、グリコシル化部位の数を変更（例えば、増加又は減少）し、グリコシル化部位のタイプを変更（例えば、異なる糖が細胞に存在する酵素によって結合するようにアミノ酸配列を変更）し、又は新たなグリコシル化部位を導入する。
本明細書に開示される抗体は、哺乳動物を含む動物のあらゆる種に由来し得る。天然抗体の非限定的な例は、ヒト、霊長類（例えば、サル及び猿）、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラクダ科（例えば、ラクダおよびラマ）、ニワトリ、ヤギ及びげっ歯類動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター及びウサギ）に由来する抗体を含み、ヒト抗体を産生するように遺伝子操作されたトランスジェニックげっ歯類動物を含む。
ヒト抗体及びヒト化抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する（又はそれに由来するものと同じアミノ酸配列を有する）可変領域及び定常領域を有する抗体を含む。ヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ内の、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダムや部位特異的突然変異誘発、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含むことができる。
ヒト化抗体は、通常、非ヒトＣＤＲが移植されたヒトフレームワーク（ＦＲ）を持つ。従って、ヒト化抗体は、ヒト以外の由来源からそれに導入された１つ以上のアミノ酸残基をもつ。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「インポート（ｉｍｐｏｒｔ）」残基と呼ばれることが多く、典型的には「インポート」可変ドメインから取られる。ヒト化は、本質的には、例えば、ヒト抗体の対応する配列の代わりにげっ歯類動物ＣＤＲ又はＣＤＲ配列を使用することにより行うことができる。これらの方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、 Ｎａｔｕｒｅ、 ３２１：５２２－５２５ （１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、 Ｎａｔｕｒｅ、 ３３２：３２３－３２７ （１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．、 Ｓｃｉｅｎｃｅ、 ２３９：１５３４－１５３６ （１９８８）に記載され、その全体がそれぞれ援引により本明細書に組み込まれる。従って、「ヒト化」抗体は、無傷のヒトＶドメインよりも少ないものが非ヒト生物種由来の対応する配列によって実質的に置換されているキメラ抗体である。実際には、ヒト化抗体は、通常、一部のＣＤＲ残基及び一部のＦＲ残基がヒト抗体中の類似する部位に由来する残基によって置換されているマウス抗体である。
ヒト化抗体を作製するためのヒトＶＨ及びＶＬドメインの選択は、免疫原性を低下させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」という方法によれば、既知のヒトドメイン配列のライブラリ全体に対してマウス抗体のＶドメインの配列をスクリーニングする。次に、マウスの配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のヒトＦＲとする（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、 １５１：２２９６ （１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、 １９６：９０１ （１９８７））
抗原に対する高特異性、親和性及び他の有利な生物学的特性を保持したまま抗体をヒト化することがさらに重要である。この目標を達成するために、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列および様々な概念的ヒト化製品の分析プロセスによりヒト化抗体を調製することができる。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体配座構造を図示し表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性がある役割を分析し、即ち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このように、レシピエント配列及びインポート配列からＦＲ残基を選択して組み合わせることにより、所望の抗体特性、例えば、標的抗原に対する親和性の増加を取得することができる。
通常、ヒト、ヒト化又はキメラ抗ＯＸ４０抗体のアミノ酸配列変異体は、元の抗体の軽鎖又は重鎖に存在する配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有るアミノ酸配列を含む。
元の配列に対する同一性又は相同性は、通常、配列を整列させて必要に応じてギャップを導入し、配列同一性の最大パーセントを達成しながら配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮しない場合には、候補配列内に存在する、ヒト、ヒト化又はキメラ抗ＯＸ４０抗体又はフラグメントに存在する配列と同じアミノ酸残基の百分率である。
抗ＯＸ４０抗体又は抗原結合フラグメントには、追加の修飾を加えることができる。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入することにより、該領域で鎖間ジスルフィド結合を形成することができる。これにより産生するホモ二量体抗体は、任意に延長される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を有し得る。また、ヘテロ二官能性架橋剤を使用することにより、延長されるｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を持つホモ二量体抗体を調製することができ、例えば、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３：２５６０－２５６５、 １９９３）に記載されている。また、２つのＦｃ領域を持つ抗体を改造することができる（例えば、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、 Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３：２１９－２３０、 １９８９を参照）。
幾つかの実施態様において、抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合フラグメントに対して共有結合修飾を行うことができる。これらの共有結合修飾は、化学的や酵素的合成、又は酵素的や化学的切断により行うことができる。抗体又は抗体フラグメントの他のタイプの共有結合修飾は、抗体又はフラグメントの標的とするアミノ酸残基を、選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることにより分子に導入される。
幾つかの実施態様において、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）結合したフコースを欠く、糖構造を持つ抗体変異体を提供する。例えば、そのような抗体におけるフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％又は２０％～４０％であってもよい。フコースの量は、例えば、ＷＯ ２００８／０７７５４６に記載のように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析で測定されたＡｓｎ２９７に結合した全部の糖構造（例えば、複雑、ハイブリッド及び高マンノース構造）の合計に対するＡｓｎ２９７での糖鎖内のフコースの平均量を計算することにより決定される。Ａｓｎ２９７とは、Ｆｃ領域の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥｕ番号付け、又はＫａｂａｔ番号付けの３１４位）にあるアスパラギン残基を指し、しかしながら、抗体での微小な配列変動のため、Ａｓｎ２９７は２９７位の上流又は下流の約±３つのアミノ酸、即ち、２９４位～３００位の間に位置してもよい。そのようなフコース化変異体は、改善したＡＤＣＣ機能を持つことができる。幾つかの実施態様において、グリカンの不均一性を低減させるために、さらに、抗体のＦｃ領域を変更して、２９７位のアスパラギンをアラニン（Ｎ２９７Ａ）で置換することができる。
組換えベクター
本開示は、本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチド（例えば、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を含む組換えベクター（例えば、発現ベクター）において、組換えベクターが導入される宿主細胞（即ち、宿主細胞はポリヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチド含有ベクターを含む）、及び組換え技術による組換え抗体ポリペプチド又はそのフラグメントの生産を提供する。
本明細書で使用される「ベクター」は、ベクターが宿主細胞に導入される場合に、１種又は複数種の目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に送達することができる任意の構築物である。「発現ベクター」は、１種又は複数種の目的のポリヌクレオチドを送達しながら、発現ベクターが導入された宿主細胞にコードされるポリペプチドとして１種又は複数種の目的ポリヌクレオチドを発現することができる。従って、発現ベクターにおいて、ベクター又は宿主細胞ゲノム中の調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー及び／又はポリＡ尾部と作動可能に連結することにより、目的のポリヌクレオチドをベクター中に発現し、前記調節エレメントは、目的のポリヌクレオチドが発現ベクターが導入された宿主細胞内で翻訳されるように、目的のポリヌクレオチドの組み込み部位又はその付近又は脇側にある。
ベクターは、当該分野で公知の方法、例えば、エレクトロポレーション、化学的トランスフェクション（例えば、ＤＥＡＥ－デキストラン）、形質転換、トランスフェクション、感染及び／又は形質導入（例えば、組換えウイルスによる）によって宿主細胞に導入される。従って、ベクターの非限定的な例は、ウイルスベクター（組換えウイルスを生成するために使用できる）、裸のＤＮＡ又はＲＮＡ、プラスミド、コスミド、ファージベクター及びカチオン性縮合剤に結び付けるＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクターを含む。
幾つかの実施態様において、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）は、ウイルス発現系（例えば、ワクシニアまたは他のポックスウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス）を使用して導入され、ここで、非病原性（欠陥）複製コンピテントウイルス、又は複製欠陥ウイルスの使用に関する。後者の場合には、ウイルスの増殖は、一般にウイルスパッケージング細胞を補完する場合にのみ発生する。適当な系は、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ－Ｈｏｃｈ ｅｔ ａｌ．、 １９８９、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：３１７－３２１；Ｆｌｅｘｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、 １９８９、 Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ５６９：８６－１０３；Ｆｌｅｘｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、 １９９０、 Ｖａｃｃｉｎｅ、 ８：１７－２１；Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ４、６０３、１１２、４、７６９、３３０及び５、０１７、４８７； ＷＯ ８９／０１９７３；Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ４、７７７、１２７；ＧＢ ２、２００、６５１；ＥＰ ０、３４５、２４２；ＷＯ ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ－Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、 ６：６１６－６２７、 １９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．、 １９９１、 Ｓｃｉｅｎｃｅ、 ２５２：４３１－４３４；Ｋｏｌｌｓ ｅｔ ａｌ．、 １９９４、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、 ９１：２１５－２１９；Ｋａｓｓ－Ｅｉｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、 １９９３、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、 ９０：１１４９８－１１５０２；Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．、 １９９３、 Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、 ８８：２８３８－２８４８；及び Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．、 １９９３、 Ｃｉｒ． Ｒｅｓ．、 ７３：１２０２－１２０７に開示されている。そのような発現系にＤＮＡを組み込むための技術は、当業者に周知である。ＤＮＡは、「裸」であってもよく、例えば、Ｕｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、 １９９３、 Ｓｃｉｅｎｃｅ、 ２５９：１７４５－１７４９及びＣｏｈｅｎ、 １９９３、 Ｓｃｉｅｎｃｅ、 ２５９：１６９１－１６９２に記載されている。ＤＮＡを、細胞内に効率的に輸送される生分解性ビーズ上にコーティングして裸のＤＮＡの取り込みを向上させることができる。
発現のために、本明細書に開示される抗体又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡインサートは、適当なプロモーター（例えば、異種プロモーター）、例えば、ファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃ、ｔｒｐ及びｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター及びレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどに有効的に連結する。他の適切なプロモーターは、当業者に知られている。発現構築物は、さらに、転写開始、終結のための部位、及び転写領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位を含むことができる。構築物により発現される成熟した転写物のコード領域は、開始位置にある翻訳開始点、及び翻訳されるポリペプチド末端に適切に位置する終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）を含むことができる。
上記のように、発現ベクターは、少なくとも１つの選択可能なマーカーを含むことができる。このようなマーカーは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性、および大腸菌および他の細菌での培養のためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子を含む。適切な宿主の代表例は、例えば、大腸菌、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の細胞などの細菌細胞；酵母細胞などの真菌細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２及びスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｂｏｗｅｓ黒色腫及びＨＫ ２９３細胞などの動物細胞；植物細胞を含むが、これらに限定されない。本明細書に記載の宿主細胞に適切な培地および条件は、当技術分野で公知である。
細菌で用いられる非限定的なベクターは、Ｑｉａｇｅｎから入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ－９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５を含む。非限定的な真核ベクターは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１及びｐＳＧ；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬを含む。他の適当なベクターは、当業者にとって容易に明らかになる。
適当に使用される非限定的な細菌プロモーターは、大腸菌ｌａｃＩ及びｌａｃＺプロモーター、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λＰＲ及びＰＬプロモーター及びｔｒｐプロモーターを含む。適当な真核プロモーターは、ＣＭＶ即時初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ、ＲＳＶ）のようなレトロウイルスＬＴＲのプロモーター、及びマウスメタロチオネイン－Ｉプロモーターのようなメタロチオネインプロモーターを含む。
醸造用酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、構成的または誘導性プロモーター（例えば、α因子、アルコールオキシダーゼ及びＰＧＨ）含む大きくのベクターを使用できる。レビューについては、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 Ｎ．Ｙ、 及びＧｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．、 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、 １５３： ５１６－５４４ （１９９７）を参照する。
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、カチオン性脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染又は他の方法により実現できる。多くの標準的な実験室マニュアルには、例えば、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．、 Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８６）という方法が記載される。
エンハンサー配列をベクターに挿入することにより、高等真核生物による本開示に係る抗体をコードするＤＮＡの転写を増加することができる。エンハンサーは、ＤＮＡのシスエレメントであり、通常、約１０～３００ｂｐであり、特定の宿主細胞タイプのプロモーターの転写活性を高める働きを奏する。エンハンサーの実例としては、塩基対１００～２７０に複製出発点の後側に位置するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製出発点の後側に位置するポリオーマウィルスエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔、ペリプラズム空間または細胞外環境に分泌するために、適切な分泌シグナルを発現されたポリペプチドに組み込むことができる。シグナルはポリペプチドに対して内因性であっても、異種シグナルであってもよい。
ポリペプチド（例えば、抗体）は、修飾された形（例えば、融合タンパク質（例えば、ＧＳＴ－融合タンパク質）又はヒスチジンタグを備え）で発現でき、分泌シグナルだけでなく、他の異種機能領域も含むことができる。例えば、ポリペプチドのＮ末端に別のアミノ酸（特に荷電アミノ酸）の領域を付加し、精製中又はその後の取り扱い及び保管中の宿主細胞における安定性及び持続性を改善することができる。また、精製を容易にするために、ペプチド部分をポリペプチドに付加することができる。そのような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去されることができる。ポリペプチドにペプチド部分を付加して分泌または排泄を引き起こすることで、安定性を改善し、精製を容易にすることは、当技術分野でよく知られた通常の技術である。
治療方法
本開示の抗体又はその抗原結合フラグメントは、多くの治療目的に用いられる。一つの側面では、本開示は、対象の癌を治療するための方法、対象の腫瘍体積の経時的増大の速率を低減させる方法、転移のリスクを低下させる方法、又は対象の一般以外の転移が発症するリスクを低下させる方法を提供する。幾つかの実施態様において、治療は、癌の進行を停止、退縮、遅延、または阻害することができる。幾つかの実施態様において、治療は、対象の癌の１種又は複数種の症状の数、重症度及び／又は持続期間の減少をもたらすことができる。
一つの側面では、本開示は、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合フラグメントの治療有効量を、それを必要とする対象（例えば、癌を有する、または癌を有すると同定または診断された対象）に投与することを含む方法を特徴とする。癌としては、例えば、乳がん（例えば、トリプルネガティブ乳がん）、カルチノイドがん、子宮頸がん、子宮内膜がん、神経膠腫、頭頸部がん、肝臓がん、肺がん、小細胞肺がん、リンパ腫、黒色腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、 腎がん、結腸直腸がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、膀胱がん、尿道がん、または血液悪性腫瘍が挙げられる。幾つかの実施態様において、癌は、切除不能な黒色腫または転移性黒色腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、膀胱がん又は転移性ホルモン不応性前立腺がんである。幾つかの実施態様において、対象は固形腫瘍を有する。幾つかの実施態様において、前記癌症は、頭頸部扁平上皮がん（ＳＣＣＨＮ）、腎細胞がん（ＲＣＣ）、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）又は大腸がんである。
幾つかの実施態様において、本明細書に開示される組成物および方法は、癌のリスクがある患者の治療に使用することができる。癌患者は、当技術分野で既知のさまざまな方法で特定できる。
本明細書で使用される「有効量」とは、有益または望ましい結果（疾患、例えば癌の進行の停止、退縮、遅延、または阻害を含む）をもたらすのに十分な量又は用量を意味する。有効量は、例えば、抗体、抗原結合断片、抗体をコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター、および/またはそれらの組成物が投与される個体の年齢および体重、重症度、投与経路に応じて変化する。したがって、各々患者の状況に応じて投与する。
有効量は、１回又はそれ以上の投与で投与することができる。例としては、抗体又は抗原結合フラグメントの有効量は、患者の癌の進行を改善、停止、安定化、逆転、阻害、退縮および/または遅延させるのに十分な量であるか、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞（例えば、生検細胞、本明細書に記載の癌細胞のいずれか、又は細胞株（例えば、癌細胞株））の増殖を改善、停止、安定化、逆転、阻害、退縮および/または遅延させるのに十分な量である。当技術分野で理解されているように、抗体又は抗原結合フラグメントの有効量は、変化してもよく、特に、患者の病歴及び他の因素、例えば、使用される抗体のタイプ（及び／又は投与量）に応じて決定する。
本明細書に開示される抗体、抗体をコードするポリヌクレオチド及び／又は組成物を投与するための有効量及びスケジュールは、経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは当業者の範囲内である。当業者は、投与される用量が、例えば、本明細書に開示される抗体、抗体をコードするポリヌクレオチド及び／又は組成物を投与する哺乳動物、投与経路、使用する本明細書に開示されている抗体、抗体をコードするポリヌクレオチド、抗原結合フラグメント及び／又は組成物の具体的なタイプ、及び哺乳動物が投与される他の薬物に応じて変化する。抗体又は抗原結合フラグメントの適切な用量のガイダンスは、抗体及び抗原結合フラグメントの治療用途に関する文献、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、 Ｆｅｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．、 ｅｄｓ．、 Ｎｏｇｅｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、 Ｐａｒｋ Ｒｉｄｇｅ、 Ｎ．Ｊ．、 １９８５、 ｃｈ． ２２ ａｎｄ ｐｐ． ３０３－３５７；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．、 Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、 Ｈａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．、 ｅｄｓ．、 Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 １９７７、 ｐｐ． ３６５－３８９に見つけられる。
抗体の有効量の典型的な１日量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇである。幾つかの実施態様において、用量は、１００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ又は０．１ｍｇ／ｋｇ未満であることできる。幾つかの実施態様において、用量は、１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ又は０．０１ｍｇ／ｋｇを超えることできる。幾つかの実施態様において、用量は、約１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ又は０．１ｍｇ／ｋｇである。
本明細書に記載の任意の方法において、少なくとも１種の抗体、その抗原結合フラグメント又は医薬組成物（例えば、本明細書に記載の任意の抗体、抗原結合フラグメント又は医薬組成物）、及び選択してもよい少なくとも１種の追加の治療剤は、対象に少なくとも週１回（例えば、週１回、週２回、週３回、週４回、１日１回、１日２回又は１日３回）投与することができる。幾つかの実施態様において、少なくとも２種の異なる抗体及び／又は抗原結合フラグメントが同じ組成物（例えば、液体組成物）で投与される。幾つかの実施態様において、少なくとも１種の抗体又は抗原結合フラグメント及び少なくとも１種の追加の治療剤が同じ組成物（例えば、液体組成物）で投与される。幾つかの実施態様において、少なくとも１種の抗体又は抗原結合フラグメント及び少なくとも１つの追加の治療剤は、２種の異なる組成物（例えば、少なくとも１種の抗体又は抗原結合フラグメントを含む液体組成物、及び少なくとも１つの追加の治療剤を含む経口固体組成物）で投与される。幾つかの実施態様において、前記少なくとも１種の追加の治療剤は、丸剤、錠剤又はカプセルとして投与される。幾つかの実施態様において、前記少なくとも１つの追加の治療剤は、徐放性経口製剤として投与される。
幾つかの実施態様において、少なくとも１種の抗体、抗原結合抗体フラグメント又は医薬組成物（例えば、本明細書に記載の任意の抗体、抗原結合抗体フラグメント又は医薬組成物）を投与する前又は後に、１種又は複数種の追加の治療剤を対象に投与する。幾つかの実施態様において、１種又は複数種の追加の治療剤及び少なくとも１種の抗体、抗原結合抗体フラグメント又は医薬組成物（例えば、本明細書に記載の任意の抗体、抗原結合抗体フラグメント又は医薬組成物）を対象に投与することができ、対象において１種又は複数種の追加の治療剤及び少なくとも１種の抗体又は抗原結合フラグメント（例えば、本明細書に記載の任意の抗体又は抗原結合フラグメント）の生物活性期間が重なり合うことになる。
幾つかの実施態様において、少なくとも１つの抗体、抗原結合抗体フラグメント又は医薬組成物（例えば、本明細書に記載の任意の抗体、抗原結合抗体フラグメント又は医薬組成物）を対象に長期間（例えば、在少なくとも１週間、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１年、２年、３年、４年又は５年の期間内）にわたって投与する。熟練した医療専門家は、本明細書に記載される、治療の有効性を診断または追跡するための任意の方法（例えば、癌の少なくとも1つの症状の観察）により治療期間の長さを決定することができる。本明細書に記載されるように、熟練した医療専門家は、治療の有効性の評価（例えば、本明細書に記載及び当技術分野で知られている任意の方法）に基づいて、対象に投与する抗体又は抗原結合抗体フラグメント（及び／又は１種又は複数種の追加の治療剤）の種類及び数量（例えば、増加又は減少）を変更することができ、さらに、対象に投与する少なくとも１種の抗体又は抗原結合抗体フラグメント（及び／又は１種又は複数種の追加の治療剤）の投与量又は投与頻度を調整（例えば、向上又は低減）することができる。
幾つかの実施態様において、１つ又は複数の追加の治療剤を対象に投与することができる。前記追加の治療剤は、Ｂ－Ｒａｆ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、Ｋ－Ｒａｓ阻害剤、ｃ－Ｍｅｔ阻害剤、未分化リンパ腫キナーゼ（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｋｉｎａｓｅ、ＡＬＫ）阻害剤、ホスファチジルイノシトール３-キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３－ｋｉｎａｓｅ、ＰＩ３Ｋ）阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ二重阻害剤、Ｂｒｕｔｏｎのチロシンキナーゼ（Ｂｒｕｔｏｎ’ｓ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ、ＢＴＫ）阻害剤、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １、ＩＤＨ１）及び／又はイソクエン酸デヒドロゲナーゼ２（Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２、ＩＤＨ２）阻害剤から選ばれる１つ又は複数を含むことができる。
幾つかの実施態様において、追加の治療剤は、ＨＥＲ３阻害剤、ＬＳＤ１阻害剤、ＭＤＭ２阻害剤、ＢＣＬ２阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、活性化ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤及びエストロゲン受容体を選択的に分解する薬剤から選ばれる１つ又は複数を含むことができる。
幾つかの実施態様において、追加の治療剤は、トラベクチン（Ｔｒａｂｅｃｔｅｄｉｎ）、ナブパクリタキセル（ｎａｂ－ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、トレバナニブ（Ｔｒｅｂａｎａｎｉｂ）、パゾパニブ（Ｐａｚｏｐａｎｉｂ）、セディラニブ（Ｃｅｄｉｒａｎｉｂ）、パルボシクリブ（Ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂ）、エベロリムス（ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）、フルオロピリミジン、ＩＦＬ、レゴラフェニブ（ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ）、レオリシン（Ｒｅｏｌｙｓｉｎ）、アリムタ（Ａｌｉｍｔａ）、ジカディア（Ｚｙｋａｄｉａ）、スーテント（Ｓｕｔｅｎｔ）、テムシロリムス（ｔｅｍｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）、アキシチニブ（ａｘｉｔｉｎｉｂ）、エベロリムス、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、ヴォトリエント（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ）、パゾパニブ、ＩＭＡ－９０１、ＡＧＳ－００３、カボザンチニブ（ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）、ビンフルニン（Ｖｉｎｆｌｕｎｉｎｅ）、Ｈｓｐ９０阻害剤、Ａｄ－ＧＭ－ＣＳＦ、テマゾロミド（Ｔｅｍａｚｏｌｏｍｉｄｅ）、ＩＬ－２、ＩＦＮａ、ビンブラスチン、タロミド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、レナリドマイド（ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、アザシチジン（ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）、レナリドマイド、ボルテゾミド（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｄ）、アムルビシン（ａｍｒｕｂｉｃｉｎｅ）、カーフィルゾミブ（ｃａｒｆｉｌｚｏｍｉｂ）、プララトレキサート（ｐｒａｌａｔｒｅｘａｔｅ）及びエンザスタウリン（ｅｎｚａｓｔａｕｒｉｎ）から選ばれる１つ又は複数を含むことができる。
幾つかの実施態様において、追加の治療剤は、アジュバント、ＴＬＲアゴニスト、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、ＩＬ－１、ＨＭＧＢ１、ＩＬ－１０拮抗剤、ＩＬ－４拮抗剤、ＩＬ－１３拮抗剤、ＩＬ－１７拮抗剤、ＨＶＥＭ拮抗剤、ＩＣＯＳアゴニスト、ＣＸ３ＣＬ１を標的とする治療、ＣＸＣＬ９を標的とする治療、ＣＸＣＬ１０を標的とする治療、ＣＣＬ５を標的とする治療、ＬＦＡ－１アゴニスト、ＩＣＡＭ１アゴニスト及びセレクチン（Ｓｅｌｅｃｔｉｎ）アゴニストから選ばれる１つ又は複数を含むことができる。
幾つかの実施態様において、カルボプラチン、ナブパクリタキセル、パクリタキセル、シスプラチン、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ＦＯＬＦＯＸ又はＦＯＬＦＩＲＩを対象に投与する。
幾つかの実施態様において、追加の治療剤は、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体又は抗ＧＩＴＲ抗体である。
修飾及び抗ＯＸ４０抗体を使用する方法は、例えば、ＵＳ ２０１５０３０７６１７に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
医薬組成物及び施用経路
本明細書には、さらに、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントの少なくとも１種（例えば、１種、２種、３種又は４種）を含む医薬組成物を提供する。本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントのいずれかの２種又はそれ以上（例えば、２種、３種又は４種）は、任意に組み合わせて医薬組成物に存在することができる。医薬組成物は、当技術分野で知られている任意の方法で製剤化することができる。
医薬組成物は、意図された投与経路（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下又は腹腔内）に適合するように調製される。組成物は、滅菌希釈剤（例えば、滅菌水又は生理食塩水）、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；ベンジルアルコール又はメチルパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン、チメロサールなどの抗菌剤又は抗真菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝液；及び糖（例えば、デキストロース）、多価アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）又は塩（例えば、塩化ナトリウム）などの等張化剤；又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。リポソーム懸濁液は、薬学的に許容される担体としても使用できる（例えば、米国特許第４，５２２，８１１号を参照）。組成物の製剤を調製し、アンプル、使い捨て注射器、または複数回投与用バイアルに製剤化し封入することができる。必要に応じて（例えば、注射用製剤など）、例えば、コーティング（例えば、レシチン）又は界面活性剤を使用することにより適切な流動性を維持することができる。吸収を遅延させる試薬（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含むことにより抗体又はその抗原結合フラグメントの吸収を延長させることができる。あるいは、制御された放出は、生分解性の生体適合性ポリマー（例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸；Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）を含むインプラント及びマイクロカプセル化送達システムによって実現できる。
本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントのいずれか１種又は複数種を含む組成物は、投与単位形態（即ち、投与を容易にし、投与量を均一にするための所定量の活性化合物を含む物理的分散ユニット）で非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下又は腹腔内）投与する。
組成物の毒性および治療効果は、細胞培養または実験動物（例えば、サル）において標準的な薬学的操作によって決定できる。例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）を特定できる。治療指数は、ＬＤ５０：ＥＤ５０の比率である。高い治療指数を示す薬剤が好ましい。薬剤が望ましくない副作用を示すと、潜在的なリスクを最小限に抑える（即ち、望ましくない副作用を減らす）ように注意する必要がある。毒性及び治療効果は、他の標準的な薬学的操作によって決定できる。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、対象（例えば、ヒト）で使用するための適当な用量の任意の所与の薬剤を調製するのに使用することができる。１種又は複数種（例えば、１種、２種、３種又は４種）の抗体又はその抗原結合フラグメント（例えば、本明細書に記載の任意の抗体又は抗体フラグメント）の治療有効量は、対象（例えば、癌を有すると判定されたヒト対象）、又は疾患を発症するリスクがあると判定された対象（例えば、以前に癌を発症したが現在に治癒された対象）において対象の疾患を治療し（例えば、癌細胞を殺す）、対象（例えば、ヒト）の疾患の１種又は複数種の症状の重症度、頻度及び／又は持続期間を減少させる量である。本明細書に記載の任意の抗体又は抗原結合フラグメントの有効性及び用量は、医療専門家または獣医専門家によって当該分野で既知の方法を使用し、対象（例えば、ヒト）における疾患の１種又は複数種の症状を観察することにより決定することができる。特定の要因は、対象を効果的に治療するために必要な用量及びタイミングに影響を与える可能性がある（例えば、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の一般的な健康および/または年齢、および他の疾患の存在）。
例示的な用量は、対象の体重１キログラム当たりの本明細書に記載の任意の抗体又は抗原結合フラグメントのミリグラムまたはマイクログラム（例えば、約１μｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ；約１００μｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ；約１００μｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ；約１０μｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ；約１０μｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ；又は約１μｇ／ｋｇ～約５０μｇ／ｋｇ）を含む。これらの用量は広い範囲をカバーするが、当業者は、抗体およびその抗原結合フラグメントを含む治療剤の効力が異なり、有効量は当技術分野で既知の方法により決定できることを理解すべきである。通常、最初は比較的低用量を投与し、担当の医療専門家または獣医専門家（治療的応用の場合）または研究者（まだ開発段階で働いている場合）は、適切な応答が得られるまで徐々に用量を増やすことができる。さらに、特定の対象の具体的用量レベルは、使用する特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、一般的な健康、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄率、および抗体または抗体フラグメントのｉｎ ｖｉｖｏでの半減期などのさまざまな要因に依存することが理解される。
医薬組成物は、投与のための説明書と共に容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。本開示は、さらに、本明細書に記載の複数用途のための抗体又はその抗原結合フラグメントを製造する方法を提供する。
以下、以下の実施例で本発明をさらに説明するが、これらの実施例は特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１． マウス抗ｈＯＸ４０抗体の産生
ヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４９）に対するマウス抗体を産生するために、６～８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスをヒトＯＸ４０で予防接種した。抗ｈＯＸ４０抗体は、以下に記載の方法により収集された（図１及び図２を参照）。
マウスの予防接種
６～８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを１００μｇ／ｍｌの濃度で２０μｇ／マウスでＨｉｓタグ付きヒトヒトＯＸ４０タンパク質で予防接種した。Ｈｉｓタグ付きヒトＯＸ４０タンパク質をアジュバントで乳化し、マウスの背中の４つの位置に注射した。１回目の皮下（ｓ．ｃ．）注射では、希釈された抗原を同体積の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で乳化した。次の皮下注射では、タンパク質を同体積の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）で乳化した。３回目の注射又は追加予防接種の３日後、血液（血清）を収集し、ＥＬＩＳＡを使用して抗体価を分析した。
別の実験では、ヒトＯＸ４０をコードする発現プラスミドをマウスに注入することにより６～８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを予防接種した。抗原をコードするプラスミドを、１０００μｇ／μｌの濃度でマウスあたり６０μｇにて遺伝子銃を使用することにより、マウスの前脛骨筋に注射（筋肉内注射；ｉ．ｍ．注射）した。各注射の間において少なくとも１４日間間隔をあけて、少なくとも４回の注射が行われた。最後の予防接種から７日後に血液（血清）を採取し、ＥＬＩＳＡにより抗体価について血清を検査した。
前の予防接種の少なくとも１４日後に、さらに、予防接種を強化するための手順も行われた（プラスミドの注射又はタンパク質の注射による）。表面にＯＸ４０抗原を発現するＣＨＯ細胞を尾静脈からマウスに静脈内注射した。次に、注射の４日後に脾臓を採取した。
ＳＰ２／０細胞と脾臓細胞の融合
脾臓組織を粉砕した。まず、ＣＤ３εマイクロビーズ及び抗マウスＩｇＭマイクロビーズにより脾臓細胞を選択し、次に、ＳＰ２／０細胞と融合させた。その後、細胞をヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン（ＨＡＴ）培地を含む９６ウェルプレートにプレーティングした。
ハイブリドーマの１次スクリーニング
標準的プロトコルに従って、蛍光活性化セルソーティング（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）を使用し、９６ウェルプレートでのハイブリドーマ上清の１次スクリーニングを行った。スクリーニングの前に、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ、ＣＨＯ）細胞を９６ウェルプレート（ウェルあたり２×１０４細胞）に加えた。上清５０μｌを使用した。実験で使用された抗体は、
（１）フルオレセイン（ＦＩＴＣ）複合化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的；及び
（２）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７複合化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的である。
サブクローン
ＣｌｏｎｅＰｉｘ２を使用してサブクローン化を施した。簡単的には、１次スクリーニング中に同定された陽性ウェルを半固体培地に移し、ＩｇＧ陽性クローンを同定してテストした。ＦＩＴＣ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体を使用した。
腹水抗体
１×１０６個の陽性ハイブリドーマ細胞をＢ－ＮＤＧ（登録商標）マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ、北京、中国）に腹腔内注射した。マウスの腹腔内でハイブリドーマ細胞を増殖させることによりモノクローナル抗体を産生した。ハイブリドーマ細胞は、マウスの腹部に増殖し腹水を産生した。腹水は、高濃度の抗体を含み、それを採取して後で使用するために用意した。
抗体の精製
腹水中の抗体は、ＧＥ ＡＫＴＡタンパク質液体クロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、 Ｃｈｉｃａｇｏ、 Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、 Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）を使用して精製した。０７－９Ｈ３（「９Ｈ３」）、０７－９Ａ４（「９Ａ４」）、１１－５Ｃ１（「５Ｃ１」）、１７－５Ｄ１０（「５Ｄ１０」）、０８－６Ａ１１（「６Ａ１１」）及び１４－７Ｆ１１（「７Ｆ１１」）は、上記の方法で産生されたマウス抗体に存在した。
幾つかの抗体のＶＨ、ＶＬ及びＣＤＲ領域は、決定された。９Ｈ３の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １～６（Ｋａｂａｔ番号）又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ２５～３０（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け）に示された。
９Ａ４の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ７～１２（Ｋａｂａｔ番号付け）又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ３１～３６（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け）に示された。
５Ｃ１の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １３～１８（Ｋａｂａｔ番号付け）又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ３７～４２（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け）に示された。
５Ｄ１０の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １９～２４（Ｋａｂａｔ番号付け）又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ４３～４８（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け）に示された。
実施例２． マウス抗体のヒト化
ヒト化の出発点は、マウス抗体（例えば、９Ｈ３、９Ａ４、５Ｃ１及び５Ｄ１０）である。これらのマウス抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を決定した。
９Ｈ３の３つのヒト化重鎖可変領域変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ５３～５５）及び３つのヒト化軽鎖可変領域変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ５６～５８）は、置換の異なる順列を含んで構築された。
９Ａ４の３つのヒト化重鎖可変領域変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ５９～６１）及び４つのヒト化軽鎖可変領域変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ６２～６５）は、置換の異なる順列を含んで構築された。
５Ｃ１の３つのヒト化重鎖可変領域変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ６６～６８）及び４つのヒト化軽鎖可変領域変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ６９～７２）は、置換の異なる順列を含んで構築された。。
５Ｄ１０の３つのヒト化重鎖可変領域変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ７３～７５）及び３つのヒト化軽鎖可変領域変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ７６～７８）は、置換の異なる順列を含んで構築された。。
これらのヒト化重鎖可変領域変異体は、任意の対応するヒト化軽鎖可変領域変異体と組み合わせることができる。例えば、９Ｈ３－Ｈ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３）を任意の９Ｈ３ヒト化軽鎖可変領域変異体（例えば、９Ｈ３－Ｋ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５７））と組み合わせ、それに応じて抗体が標識された（例えば、９Ｈ３－Ｈ１Ｋ２）。
そして、これらのヒト化抗体は、ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ １．０（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、中国上海）を使用して産生された。
実施例３． マウス抗ｈＯＸ４０抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験：ヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０）とヒトＯＸ４０Ｌ（ｈＯＸ４０Ｌ）の結合の遮断
ブロッキングアッセイを行って、抗ｈＯＸ４０抗体がｈＯＸ４０とｈＯＸ４０Ｌの間の結合を遮断できるかどうかを調べた。
抗ｈＯＸ４０抗体は、マウス腹水から収集され、クロマトグラフィーにより精製された。ヒトＯＸ４０で一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞２５μｌをプレートの各ウェルに加えた。精製された抗体を、最終濃度が５０、５、０．５、０．０５、０．００５ μｇ／ｍｌになるまで滴下した。滴下された抗体を、各ウェルにウェルあたり２５ μｌ４℃で添加し、３０分間インキュベートした。
ｈＯＸ４０Ｌ－Ｆｃを１：２００に希釈した。リガンド溶液５０ μｌを各ウェルに加えた。ｈＯＸ４０Ｌ－Ｆｃ及び抗体を含む細胞を４℃で孵育１５分間インキュベートした。
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、５０ μｌの抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体フィコエリトリン複合体（抗ｍＩｇＧ Ｆｃ－ＰＥ）を１：５００の希釈倍率で、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体フルオレセインイソチオシアネート（抗ｈＩｇＧ Ｆｃ－ＦＩＴＣ）を１：１００の希釈倍率で各ウェルに添加し、４℃で３０分間インキュベートし、その後、ＰＢＳで洗浄した。ＦＩＴＣ及びＰＥのシグナルは、フローサイトメトリーにより決定された。
図３に示すように、マウス抗ｈＯＸ４０抗体９Ｈ３（「０７－９Ｈ３」）の濃度が増加すると、ＦＩＴＣのシグナルが減少し、抗ｈＯＸ４０抗体は、ヒトＯＸ４０とＯＸ４０Ｌの間の結合を遮断することが分かった。
実施例４． ヒトＯＸ４０に対する抗ｈＯＸ４０抗体の結合活性
抗ｈＯＸ４０抗体は、マウス腹水から収集され、クロマトグラフィーにより精製された。ヒトＯＸ４０で一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞２５μｌをプレートの各ウェルに加えた。精製された抗体を、最終濃度が５０、５、０．５、０．０５、０．００５ μｇ／ｍｌになるまで滴下された。滴下された抗体は、各ウェルにウェルあたり２５ μｌ４℃で添加し、３０分間インキュベートした。
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、５０ μｌの抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体フィコエリトリン複合体（抗ｍＩｇＧ Ｆｃ－ＰＥ）を１：５００の希釈倍率で各ウェルに添加し、４℃で３０分間インキュベートし、その後、ＰＢＳで洗浄した。ＰＥのシグナルは、フローサイトメトリーにより決定された。
図４に示すように、マウス抗ｈＯＸ４０抗体９Ｈ３（「０７－９Ｈ３」）の濃度が増加すると、ＰＥのシグナルが増加し、９Ｈ３がヒトＯＸ４０に結合できることを示した。
実施例５． サル、マウス及びヒト－マウスキメラＯＸ４０（ｃｈｉＯＸ４０）に対する抗ｈＯＸ４０抗体の交差反応性
ＣＨＯ細胞にアカゲザルＯＸ４０（ｒｍＯＸ４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５１）、マウスＯＸ４０（ｍＯＸ４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５０）及びキメラ（マウス及びヒト）ＯＸ４０（ｃｈｉＯＸ４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５２）をトランスフェクトした。
ＣＨＯ細胞２５μｌを各ウェルに添加した。２５μｌの精製抗ｈＯＸ４０抗体（１ μｇ／ｍｌ）（９Ｈ３又は「０７－９Ｈ３」）を各ウェルに加え、４℃で３０分間インキュベートした。
ＰＢＳ（１２００ ｒｍｐ、５分間）で２回洗浄した後、５０ μｌの抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体フルオレセインイソチオシアネート（抗ｍＩｇＧ Ｆｃ－ＦＩＴＣ）を１：５００の希釈倍率で各ウェルに加え、４℃で３０分間インキュベートし、その後、ＰＢＳで洗浄した（１２００ ｒｍｐ、５分間）。ＦＩＴＣのシグナルは、フローサイトメトリーにより決定された。
図５に示すように、９Ｈ３は、マウスＯＸ４０と交差反応しなかったが、ｒｍＯＸ４０及びキメラＯＸ４０との強い交差反応性を有した。図５では、ＮＣは、陰性対照を示した。
実施例６． 抗ｈＯＸ４０抗体の結合親和性
抗体とｈＯＸ４０の結合を測定した。抗体の親和性は、タンパク質Ａが固定化されたセンサーチップを搭載した表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００バイオセンサー、 Ｂｉａｃｏｒｅ、 ＩＮＣ、 Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ Ｎ．Ｊ．）により決定された。
抗ｈＯＸ４０抗体９Ｈ３－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ１（１ μｇ／ｍＬ）を目的のタンパク質密度（約１１２応答単位（ＲＵ））になるように１０ μＬ／分間でＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００バイオセンサーに注入して２５秒間持続した。次いで、濃度が１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６２５ ｎＭのヒトＯＸ４０タンパク質（ｈＯＸ４０－Ｈｉｓ）を３０ μＬ／分間で１２０秒間注入した。解離を３００秒間モニタリングした。各滴定の最後の注入後に、チップをグリシン（ｐＨ ２．０、３０ μＬ／分間、１２秒間持続）により再生した。９Ｈ３－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ１の結果は、図６に示された。
動力学的結合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア３．０を使用してデータ全体として１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルにフィッティングすることにより同時に取得された（Ｋａｒｌｓｓｏｎ、 Ｒ． Ｒｏｏｓ、 Ｈ． Ｆａｇｅｒｓｔａｍ、 Ｌ． Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ、 Ｂ．、 １９９４． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６． ９９－１１０）。親和性は、動力学的速度定数の商（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）から推定された。
他のすべての被験抗体については、同じ方法を実行し、そのパラメーター（例えば、抗体の濃度）に必要な適切な調整を行った。以下の表には、被験抗ｈＯＸ４０抗体の結果をまとめた。
Figure 2022179623000002
これらの被験抗体では、９Ａ４は、実施例１でのマウス抗ｈＯＸ４０抗体である。９Ｈ３－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ１、５Ｃ１－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ１、５Ｄ１０－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ１及び９Ａ４－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ１は、キメラ抗ｈＯＸ４０抗体である。それらは、マウス抗ｈＯＸ４０抗体に由来する重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン、ヒトＩｇＧ１抗体定常ドメイン（ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を有する。
９Ｈ３－Ｈ２Ｋ１－ＩｇＧ１、９Ｈ３－Ｈ２Ｋ２－ＩｇＧ１、９Ｈ３－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ１、９Ｈ３－Ｈ３Ｋ１－ＩｇＧ１、９Ｈ３－Ｈ３Ｋ２－ＩｇＧ１及び９Ｈ３－Ｈ３Ｋ３－ＩｇＧ１は、ヒト化抗体である。それらは、ヒトＩｇＧ１抗体定常ドメイン（ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を有する。中間の数字は、ヒト化可変ドメイン変異体（図３４）を示した。例えば、９Ｈ３－Ｈ２Ｋ１－ＩｇＧ１は、ヒト化９Ｈ３重鎖可変ドメインＨ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５４）及びヒト化９Ｈ３軽鎖可変ドメインＫ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５６）を有した。類似しては、９Ｈ３－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ１は、ヒト化９Ｈ３重鎖可変ドメインＨ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５４）及びヒト化９Ｈ３軽鎖可変ドメインＫ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５８）を有した。
実施例７． 抗ｈＯＸ４０抗体の熱安定性
サーモフルオアッセイ分析は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ（商標）色素キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標） ５リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行われた。そのアッセイは、タンパク質が展開するときに露出した疎水性パッチに結合する蛍光色素を使用して、熱安定性を測定した。
実験は、製造元のプロトコルに従って行われた。抗体２ μＬ、水１０．５ μＬ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔバッファー５ μＬ及び希釈されたＰｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ色素２．５ μＬを混合した。サンプルを１．６℃／秒間で２５℃まで加熱した後、０．０５℃／秒間で９９℃まで加熱した。
ＩｇＧは、マルチドメインタンパク質として記載できるため、融解曲線は、通常、2つの遷移、即ち、第１の変性温度Ｔｍ Ｄ１及び第２の変性温度Ｔｍ Ｄ２を示した。これらの２つのピークの存在は、通常、それぞれＦｃ及びＦａｂドメインの変性を示した。ただし、場合によっては、1つのピークしか観察できない。
以下の表には、さまざまな抗ｈＯＸ４０抗体のＴｍをまとめた。２つの遷移があると、以下の表にはＴｍ Ｄ２はＴｍと扱われた。
Figure 2022179623000003
表２では、９Ｈ３マウス抗体の以外は、すべての抗体はキメラ抗体又はヒト化抗体である。これらの抗体の名称及び配列は、以下に示された。名称は、抗体の来源、可変領域及び定常領域を示した。例えば、本開示では、ヒト化重鎖可変領域Ｈ１、ヒト化軽鎖可変領域Ｋ１及びヒトＩｇＧ１定常領域を有するヒト化５Ｄ１０抗体は、５Ｄ１０－Ｈ１Ｋ１－ＩｇＧ１とラベル付けされた。類似しては、マウスのＶＨとＶＬ、及びヒトＩｇＧ１の定常領域を有する５Ｃ１キメラ抗体は、５Ｃ１－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ１とラベル付けされた。さらに、グリカンの不均一性を低減するために、一部の抗体のＦｃ領域は、さらに変更されて、２９７位のアスパラギンをアラニンに置き換えた（Ｎ２９７Ａ）。さらに、グリカンの不均一性を低減するために、一部の抗体のFc領域はさらに設計されて、位置297のアスパラギンをアラニン（N297A）に置き換えました。
Figure 2022179623000004
幾つかの被験抗体では、２つの遷移が観察された。以下の表には、幾つかの被験抗体のＴｍ Ｄ１及びＴｍ Ｄ２の結果を示した。
Figure 2022179623000005
結果は、９Ｈ３－Ｈ２Ｋ１－ＩｇＧ１、９Ｈ３－Ｈ２Ｋ２－ＩｇＧ１及び９Ｈ３－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ１のＴｍ Ｄ２は幾つかの他の抗体（例えば、９Ｈ３－Ｈ３Ｋ２－ＩｇＧ１）よりもはるかに低いことを示した。９Ｈ３ヒト化重鎖Ｈ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５４）は、他のヒト化重鎖ほど安定ではない可能性がある。この結果は、ＦＡＣＳで測定したＣＨＯ－Ｓ上清（発現した抗体を含む）からの熱安定性の結果とも一致した。
Figure 2022179623000006
Figure 2022179623000007
表５及び表６の結果よりわかるように、ＩｇＧ１定常領域及びＩｇＧ２定常領域を有するヒト化抗体は、類似するＴｍ Ｄ１を有し、類似するＴｍ Ｄ２を有する。ＩｇＧ１のＮ２９７Ａ突然変異は、Ｔｍ Ｄ１を大幅に減少させることができるが、Ｔｍ Ｄ２を減少させることはできない。さらに、ＩｇＧ４定常領域を有するヒト化抗体はＴｍ Ｄ１及びＴｍ Ｄ２が比較的に低い。
実施例８． マウス及びキメラ抗ｈＯＸ４０抗体のｉｎ ｖｉｖｏ検出
ｉｎ ｖｉｖｏで抗ｈＯＸ４０抗体をテストし、これらの抗体の人体への作用を予測するために、ＯＸ４０ヒト化マウスモデルを作成した。ＯＸ４０ヒト化マウスモデルは、マウスＯＸ４０タンパク質の細胞外領域の一部がヒトＯＸ４０細胞外領域置換されたキメラＯＸ４０タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５２）を発現するように設計された。マウスＯＸ４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５０）の３１～１９５番目のアミノ酸残基は、ヒトＯＸ４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４９）の３５～１９７番目のアミノ酸残基に置き換えられた。ヒト化マウスモデル（Ｂ－ｈＯＸ４０ヒト化マウス）は、ヒトとマウスＯＸ４０を発現する通常のマウスの臨床結果の差を大幅に減らすことにより、臨床設定で新しい治療法をテストするための新しいツールを提供できる。ＯＸ４０ヒト化マウスモデルに関する詳細は、ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９９５７５に参照され、その全体が援引により本明細書に組み込まれた。
結腸癌モデルにおいて、抗ｈＯＸ４０抗体をアッセイしてｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍増殖に対するそれらの作用を実証した。ＭＣ－３８癌腫瘍細胞（結腸腺癌細胞）をＢ－ｈＯＸ４０ヒト化マウスに皮下注射した。マウスの腫瘍が１５０±５０ｍｍ３の体積に達したとき、腫瘍の体積に基づいてマウスを異なる群にランダムに分けた。
そして、腹腔内投与により、マウスに生理食塩水（ＰＳ）及び抗ｈＯＸ４０抗体を注射した。毎週の１日目及び４日目に抗体を投与し、３週周持続した（合計６回の注射）。
注射量は、３ｍｇ／ｋｇでマウスの体重に基づいて計算された。腫瘍の長軸及び短軸の長さを測定し、腫瘍の体積を０．５×（長軸）×（短軸）２として計算された。マウスの体重は、さらに、注射前、マウスを異なる群に分ける際に（１回目の抗体注射前）、抗体注射期間中に週２回、安楽死前に測定した。
腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ％）は、次の式：ＴＧＩ（％）＝ ［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００を使用して計算された。Ｔｉは、ｉ日目の治療群の平均腫瘍体積である。Ｔ０は、０日目の治療群の平均腫瘍体積である。Ｖｉは、ｉ日目の対照群の平均腫瘍体積である。Ｖ０は、０日目の対照群の平均腫瘍体積である。
統計分析のためにＴ検定を実施した。ＴＧＩ％が６０％を超えると、腫瘍の増殖が著しく抑制された。ｐ ＜０．０５は、有意差を示す閾値である。
マウス抗ｈＯＸ４０抗体０７－９Ｈ３、０７－９Ａ４、１１－５Ｃ１、１７－５Ｄ１０、０８－６Ａ１１及び１４－７Ｆ１１のｉｎ ｖｉｖｏ結果
Ｂ－ｈＯＸ４０ヒト化マウス（ＯＸ４０ヒト化マウス）には、マウス抗－ｈＯＸ４０抗体０７－９Ｈ３、０７－９Ａ４、１１－５Ｃ１、１７－５Ｄ１０、０８－６Ａ１１及び１４－７Ｆ１１を投与した。マウスの体重は、治療期間全体にわたってモニタリングされた。異なる群のマウスの体重は、すべて増加した（図７及び図８）。対照群と抗ｈＯＸ４０治療群の間で体重に有意差は観察されなかった。結果は、抗ｈＯＸ４０抗体は忍容性が高く、マウスに対して毒性がないことを示した。
しかしながら、腫瘍体積は、抗体０７－９Ｈ３、０７－９Ａ４、１１－５Ｃ１及び１７－５Ｄ１０で処置された群において有意差を示した（図９を参照）。
以下の表に示すように、各治療群の２４日目のＴＧＩ％も計算された。
Figure 2022179623000008
結果は、５Ｃ１は、最優のＴＧＩ％を有したことを示した。６Ａ１１及び７Ｆ１１は、腫瘍増殖を抑制するのに効果がなかった。
キメラ抗ｈＯＸ４０抗体のｉｎ ｖｉｖｏ結果
Ｂ－ｈＯＸ４０ヒト化マウス（ヒト化ＯＸ４０マウス）に、腹腔内投与によりマウス抗ｈＯＸ４０抗体９Ｈ３、キメラ抗ｈＯＸ４０抗体 ９Ｈ３－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ１、９Ｈ３－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ２、９Ｈ３－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ４及び９Ｈ３－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ１－Ｎ２９７Ａを投与した。注射量は、３ｍｇ／ｋｇでマウスの体重に基づいて計算された。毎週の１日目及び４日目に抗体を投与した（合計５回の注射）。
治療期間全体にわたってモニタリングされた。異なる群のマウスの体重は、すべて増加した（図１０及び図１１）。対照群と抗ｈＯＸ４０治療群の間で体重に有意差は観察されなかった。結果は、抗ｈＯＸ４０抗体は忍容性が高く、マウスに対して毒性がないことを示した。
しかしながら、腫瘍体積は、抗体９Ｈ３－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ１、９Ｈ３－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ２、９Ｈ３－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ４及び９Ｈ３－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ１－Ｎ２９７Ａで処置された群において有意差を示した（図１２）。
以下の表に示すように、各治療群の２１日目のＴＧＩ％も計算された。
Figure 2022179623000009
結果は、マウス抗ｈＯＸ４０抗体９Ｈ３、キメラ抗ｈＯＸ４０抗体９Ｈ３－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ１及び９Ｈ３－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ２は腫瘍増殖を有意に阻害できることを示した。中でも、９Ｈ３－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ１が最も高いＴＧＩ％を示した。
実施例９． ヒト化抗ｈＯＸ４０抗体のｉｎ ｖｉｖｏ検出
ＯＸ４０ヒト化マウスでヒト化抗ｈＯＸ４０抗体をテストし、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍増殖に対するその作用を実証した。
ＭＣ－３８癌腫瘍細胞（結腸腺癌細胞）をＢ－ｈＯＸ４０ヒト化マウスに皮下注射した。マウスの腫瘍が１５０±５０ ｍｍ３の体積に達したとき、腫瘍の体積に基づいてマウスを異なる群にランダムに分けた（各群あたり８匹のマウス）。
次に、マウスにヒトＩｇＧ（対照）及び抗ｈＯＸ４０抗体を３ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与により注射した。毎週の１日目及び４日目に抗体を投与し、３週周持続した（合計６回の注射）。
マウスの体重は、治療期間全体にわたってモニタリングされた。異なる群のマウスの体重は、すべて増加した（図１３及び図１４）。対照群と抗ｈＯＸ４０治療群の間で体重に有意差は観察されなかった。結果は、抗ｈＯＸ４０抗体は忍容性が高く、マウスに対して毒性がないことを示した。
腫瘍体積は、抗ｈＯＸ４０抗体で処置された群において有意差を示した（図１５）。
以下の表に示すように、各治療群の１８日目（群分け後１８日）のＴＧＩ％も計算された。
Figure 2022179623000010
以上の結果よりわかるように、すべての抗ｈＯＸ４０抗体は、いずれも腫瘍増殖を阻害できた。中でも、９Ｈ３－Ｈ３Ｋ３－ＩｇＧ１（３ｍｇ／ｋｇ）は、最も高い腫瘍増殖阻害率を示した。
Ｇ１群の３匹のマウス及びＧ５群の３匹のマウスをさらなる評価のために選択した。
これらのマウスの肝臓組織を調べた（図１６）。結果は、以下の表にまとめた。結果は、対照群と比較して、有意な肝障害観察されなかったことを示した。
Figure 2022179623000011
これらのマウスの腎臓も調査された（図１７）。結果を以下の表にまとめた。結果は、対照群と比較して、９Ｈ３－Ｈ３Ｋ３－ＩｇＧ１が腎臓に深刻な損傷を引き起こさなかったことを示した。
Figure 2022179623000012
これらのマウスの腸も調査された（図１８）。結果を以下の表にまとめた。結果は、対照群と比較して、９Ｈ３－Ｈ３Ｋ３－ＩｇＧ１が腸に深刻な損傷を引き起こさなかったことを示した。
Figure 2022179623000013
全体としては、結果は、９Ｈ３－Ｈ３Ｋ３－ＩｇＧ１がヒト化マウスに深刻な副作用を持たないことを示した。
実施例１０． キイトルーダとの併用療法
併用療法の有効性を評価するために、マウスには抗ｈＯＸ４０抗体を幾つかの他の治療剤とともに投与した。
ヒト化マウスにおけるＭＣ－３８癌腫瘍細胞に対する９Ｈ３及びキイトルーダのｉｎ ｖｉｖｏ結果
Ｂ－ｈＯＸ４０ヒト化マウスにＭＣ－３８癌腫瘍細胞を皮下注射した。マウスの腫瘍が１５０±５０ ｍｍ３の体積に達したとき、腫瘍の体積に基づいてマウスを異なる群にランダムに分けた（各群あたり６匹のマウス）。次いで、腹腔内投与によりマウスに（Ｇ１）ＰＳ（対照）、（Ｇ２）キイトルーダ（０．３ｍｇ／ｋｇ）（Ｍｅｒｃｋ）、（Ｇ３）９Ｈ３（３ｍｇ／ｋｇ）、および（Ｇ４）キイトルーダ（０．３ｍｇ／ｋｇ）及び９Ｈ３（３ｍｇ／ｋｇ）を注射した。毎週の１日目及び４日目に抗体を投与し、３週周持続した（合計６回の注射）。
マウスの体重は、治療期間全体にわたってモニタリングされた。異なる群のマウスの体重は、すべて増加した（図１９及び図２０）。対照群と抗ｈＯＸ４０治療群の間で体重に有意差は観察されなかった。結果は、抗ｈＯＸ４０抗体は忍容性が高く、マウスに対して毒性がないことを示した。
腫瘍体積は、抗ｈＯＸ４０抗体で処置された群において有意差を示した（図２１）。各処置群の２１日目（群分け後２１日）のＴＧＩ％も計算され、以下の表に示された。
Figure 2022179623000014
結果は、キイトルーダと組み合わせた９Ｈ３は、腫瘍増殖の抑制作用を改善させることができることを示した。
ヒト化マウスにおけるＥＬ４癌腫瘍細胞に対する９Ｈ３及びキイトルーダのｉｎ ｖｉｖｏ結果
Ｂ－ｈＯＸ４０ヒト化マウスにＥＬ４癌腫瘍細胞（化学的に誘導されたリンパ腫に由来するマウス腫瘍細胞株）を皮下注射した。マウスの腫瘍が１５０±５０ ｍｍ３の体積に達したとき、腫瘍の体積に基づいてマウスを異なる群にランダムに分けた（各群あたり５匹のマウス）。次いで、腹腔内投与によりマウスに（Ｇ１）ＰＳ（対照）、（Ｇ２）９Ｈ３（３ｍｇ／ｋｇ）、（Ｇ３）キイトルーダ（３ｍｇ／ｋｇ）、および（Ｇ４）キイトルーダ（３ｍｇ／ｋｇ）及び９Ｈ３（３ｍｇ／ｋｇ）を注射した。毎週の１日目及び４日目に抗体を投与し、３週周持続した（合計６回の注射）。
マウスの体重は、治療期間全体にわたってモニタリングされた。異なる群のマウスの体重は、すべて増加した（図２２及び図２３）。結果としては、抗体は忍容性が高く、マウスに対して毒性がないことを示した。
９Ｈ３及び９Ｈ３とキイトルーダの併用治療の群では、腫瘍体積は有意差を示した（図２４）。各治療群の１８日目（群分け後１８日）のＴＧＩ％は以下の表に示された。
Figure 2022179623000015
結果は、キイトルーダは自体で腫瘍の増殖を阻害できないことを示した。ただし、キイトルーダと９Ｈ３の組み合わせは、９Ｈ３の単独使用よりもＴＧＩ％が優れた。
実施例１１． 抗ＰＤ１又は抗ＰＤＬ１抗体との併用療法
併用療法の有効性を評価するために、マウスには抗ｈＯＸ４０抗体を抗ＰＤ１又は抗ＰＤＬ１抗体とともに投与した。
Ｂ－ｈＯＸ４０ヒト化マウスにＭＣ－３８癌腫瘍細胞を皮下注射した。マウスの腫瘍が１５０±５０ ｍｍ３の体積に達したとき、腫瘍の体積に基づいてマウスを異なる群にランダムに分けた（各群あたり５匹のマウス）。次いで、腹腔内投与によりマウスに（Ｇ１）ＰＳ（対照）；（Ｇ２）９Ｈ３（１ｍｇ／ｋｇ）；（Ｇ３）ｍＰＤ－１（ＲＭＰ１－１４）（マウス抗ｍＰＤ１抗体；ＢｉｏＸｃｅｌｌ、カタログ番号ＢＥ０１４６）（１ｍｇ／ｋｇ）；（Ｇ４）９Ｈ３（１ｍｇ／ｋｇ）及びｍＰＤ－１（ＲＭＰ１－１４）（１ｍｇ／ｋｇ）；（Ｇ５）ｍＰＤ－Ｌ１（１０Ｆ．９Ｇ２）（マウス抗ｍＰＤＬ１抗体；ＢｉｏＸｃｅｌｌ、カタログ番号ＢＥ０１０１）（１ｍｇ／ｋｇ）；又は（Ｇ６）９Ｈ３（１ｍｇ／ｋｇ）及びｍＰＤ－Ｌ１（１０Ｆ．９Ｇ２）（１ｍｇ／ｋｇ）を注射した。抗体を毎週２回投与し、３週周持続した（合計６回の注射）。
マウスの体重は、治療期間全体にわたってモニタリングされた（図２５及び図２６）。結果は、これらの抗体はマウスに対して毒性がないことを示した。
腫瘍体積は、抗体で処置された群で減少した（図２７）。各処置群の２５日目（群分け後２５日）のＴＧＩ％は以下の表に示された。
Figure 2022179623000016
結果は、ｍＰＤ－１（ＲＭＰ１－１４）（抗ＰＤ－１抗体）と組み合わせた９Ｈ３は最高の腫瘍増殖阻害率を有することを示した。
実施例１２． 抗ＬＡＧ－３、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＢＴＬＡ、抗ＣＴＬＡ－４又は抗ＧＩＴＲ抗体との併用療法
併用療法の有効性を評価するために、マウスに抗ｈＯＸ４０抗体を抗ＬＡＧ－３、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＢＴＬＡ、抗ＣＴＬＡ－４又は抗ＧＩＴＲ抗体とともに投与した。
Ｂ－ｈＯＸ４０ヒト化マウスにＭＣ－３８癌腫瘍細胞を皮下注射した。マウスの腫瘍が１５０±５０ ｍｍ３の体積に達したとき、腫瘍の体積に基づいてマウスを異なる群にランダムに分けた（各群あたり５匹のマウス）。次いで、マウスに腹腔内投与により以下のものを注射した。
（Ｇ１）ＰＳ（対照）；
（Ｇ２）９Ｈ３（１ｍｇ／ｋｇ）；
（Ｇ３）ｍＬＡＧ－３（Ｃ９Ｂ７Ｗ）（マウス抗ＬＡＧ－３抗体；ＢｉｏＸｃｅｌｌ、カタログ番号：ＢＥ０１７４）（３ｍｇ／ｋｇ）；
（Ｇ４）９Ｈ３（１ｍｇ／ｋｇ）及びｍＬＡＧ－３（Ｃ９Ｂ７Ｗ）（３ｍｇ／ｋｇ）；
（Ｇ５）ｍＴＩＧＩＴ（１Ｇ９）（マウス抗ｍＴＩＧＩＴ抗体；ＢｉｏＸｃｅｌｌ、カタログ番号：ＢＥ０２７４）（３ｍｇ／ｋｇ）；
（Ｇ６）９Ｈ３（１ｍｇ／ｋｇ）及びｍＴＩＧＩＴ（１Ｇ９）（３ｍｇ／ｋｇ）；
（Ｇ７）ｍＢＴＬＡ（ＰＪ１９６）（マウス抗ｍＢＴＬＡ抗体；ＢｉｏＸｃｅｌｌ、カタログ番号：ＢＥ０１９６）（１０ｍｇ／ｋｇ）；
（Ｇ８）９Ｈ３（１ｍｇ／ｋｇ）及びｍＢＴＬＡ（ＰＪ１９６）（１０ｍｇ／ｋｇ）；
（Ｇ９）ｍＣＴＬＡ－４（９Ｄ９）（マウス抗ｍＣＴＬＡ－４抗体；ＢｉｏＸｃｅｌｌ、カタログ番号：ＢＥ０１６４）（１ｍｇ／ｋｇ）；
（Ｇ１０）９Ｈ３（１ｍｇ／ｋｇ）及びｍＣＴＬＡ－４（９Ｄ９）（１ｍｇ／ｋｇ）；
（Ｇ１１）ｍＧＩＴＲ（ＤＴＡ－１）（マウス抗ｍＧＩＴＲ抗体；ＢｉｏＸｃｅｌｌ、カタログ番号：ＢＥ００６３）（０．３ｍｇ／ｋｇ）；
（Ｇ１２）９Ｈ３（１ｍｇ／ｋｇ）及びｍＧＩＴＲ（ＤＴＡ－１）（０．３ｍｇ／ｋｇ）を注射した。
抗体を毎週２回投与した（合計３回の注射）。
マウスの体重は、治療期間全体にわたってモニタリングされた（図２８及び図２９）。結果は、これらの抗体はマウスに対して毒性がないことを示した。
Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ６、Ｇ８、Ｇ１０、Ｇ１１及びＧ１２処置群では、腫瘍体積は減少した（図３０）。各処置群の２５日目（群分け後２５日）のＴＧＩ％は、以下の表に示した。
Figure 2022179623000017
結果は、９Ｈ３の単独使用よりも、抗ＬＡＧ－３、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＢＴＬＡ、抗ＣＴＬＡ－４又は抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせた９Ｈ３は、優れた腫瘍増殖抑制作用を持つことを示した。
実施例１３． ヒト化９Ａ４、５Ｃ１及び５Ｄ１０抗体のｉｎ ｖｉｖｏ検出
ＯＸ４０ヒト化マウスにおいてヒト化９Ａ４、５Ｃ１及び５Ｄ１０抗体をテストし、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍増殖に対するそれらの作用を実証した。
Ｂ－ｈＯＸ４０ヒト化マウスにＭＣ－３８癌腫瘍細胞（結腸腺癌細胞）を皮下注射した。マウスの腫瘍が１５０±５０ ｍｍ３の体積に達したとき、腫瘍の体積に基づいてマウスを異なる群にランダムに分けた。次いで、腹腔内投与により３ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇでマウスにヒトＩｇＧ（対照）、ヒト化９Ａ４、５Ｃ１及び５Ｄ１０抗体を注射した。毎週の１日目及び４日目に抗体を投与し、３週周持続した（合計６回の注射）。
マウスの体重は、治療期間全体にわたってモニタリングされた。対照群と抗ｈＯＸ４０抗体処置群の間で体重の有意差が観察されないが、ヒト化９Ａ４、５Ｃ１及び５Ｄ１０抗体はマウス的腫瘍増殖を阻害できると予想された。
他の実施方案
本発明に係る具体的な実施形態と組み合わせて本発明を説明したが、上記の説明は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するのではなく例示することを意図していることを理解すべきである。他の側面、利点及び修正案も添付の特許請求の範囲内にある。

Claims (42)

  1. 相補性決定領域（ＣＤＲｓ）１、２及び３（ここで、ＶＨ ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つＶＨ ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、
    ＣＤＲｓ １、２及び３（ここで、ＶＬ ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つＶＬ ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含むＯＸ４０（ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４）に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントにおいて、
    前記選択されたＶＨ ＣＤＲｓ １、２及び３のアミノ酸配列及び前記選択されたＶＬ ＣＤＲｓ １、２及び３アミノ酸配列は、以下のいずれか１つである、ＯＸ４０（ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４）に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント。
    （１）前記選択されたＶＨ ＣＤＲｓ １、２、３アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １、２、３に示され、且つ前記選択されたＶＬ ＣＤＲｓ １、２、３アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ４、５、６に示されること、
    （２）前記選択されたＶＨ ＣＤＲｓ １、２、３アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ７、８、９に示され、且つ前記選択されたＶＬ ＣＤＲｓ １、２、３アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １０、１１、１２に示されること；
    （３）前記選択されたＶＨ ＣＤＲｓ １、２、３アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １３、１４、１５に示され、且つ前記選択されたＶＬ ＣＤＲｓ １、２、３アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １６、１７、１８に示されること；
    （４）前記選択されたＶＨ ＣＤＲｓ １、２、３アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １９、２０、２１に示され、且つ前記選択されたＶＬ ＣＤＲｓ １、２、３アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ２２、２３、２４に示されること。
  2. 前記ＶＨは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １、２及び３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲｓ １、２、３を含み、且つ前記ＶＬは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ４、５及び６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲｓ １、２、３を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  3. 前記ＶＨは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １３、１４及び１５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲｓ １、２、３を含み、且つ前記ＶＬは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １６、１７及び１８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲｓ １、２、３を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  4. 前記抗体又は抗原結合フラグメンは、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  5. 前記抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  6. 前記抗体又は抗原結合フラグメントは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）である、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  7. ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸において、前記ポリペプチドは、
    （１）重鎖可変領域（ＶＨ）を含む免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントにおいて、前記重鎖可変領域（ＶＨ）はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １、２及び３に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲｓ）１、２及び３を含み、且つ前記ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ５６、５７、５８又は８０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とペアリングする場合に、ＯＸ４０に結合する免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメント；
    （２）ＶＬを含む免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントにおいて、前記ＶＬは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ４、５及び６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲｓ １、２及び３を含み、且つ前記ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ５３、５４、５５又は７９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨとペアリングする場合に、ＯＸ４０に結合する免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメント；
    （３）重鎖可変領域（ＶＨ）を含む免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントにおいて、前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ７、８及び９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲｓ １、２及び３を含み、且つ前記ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ６２、６３、６４、６５又は８２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とペアリングする場合に、ＯＸ４０に結合する免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメント；又は
    （４）ＶＬを含む免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントにおいて、前記ＶＬは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １０、１１及び１２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲｓ １、２及び３を含み、且つ前記ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ５９、６０、６１又は８１に示されるアミノ酸配列を含むＶＨとペアリングする場合に、ＯＸ４０に結合する免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメント；
    （５）重鎖可変領域（ＶＨ）を含む免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントにおいて、前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １３、１４及び１５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲｓ １、２及び３を含み、且つ前記ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ６９、７０、７１、７２又は８４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とペアリングする場合に、ＯＸ４０に結合する免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメント；
    （６）ＶＬを含む免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントにおいて、前記ＶＬは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １６、１７及び１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲｓ １、２及び３を含み、且つ前記ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ６６、６７、６８又は８３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨとペアリングする場合に、ＯＸ４０に結合する免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメント；
    （７）重鎖可変領域（ＶＨ）を含む免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントにおいて、前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １９、２０及び２１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲｓ １、２及び３を含み、且つ前記ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ７６、７７、７８又は８６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とペアリングする場合に、ＯＸ４０に結合する免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメント；
    （８）ＶＬを含む免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントにおいて、前記ＶＬは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ２２、２３及び２４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲｓ １、２及び３を含み、且つ前記ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ７３、７４、７５又は８５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨとペアリングする場合に、ＯＸ４０に結合する免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメント；
    を含む、核酸。
  8. 前記核酸は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリペプチドは、ＶＨを含む免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントを含み、前記ＶＨは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １、２及び３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲｓ １、２及び３を含む、請求項７に記載の核酸。
  9. 前記核酸は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリペプチドは、ＶＬを含む免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントを含み、前記ＶＬは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ４、５及び６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲｓ １、２及び３を含む、請求項７に記載の核酸。
  10. 前記核酸は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリペプチドは、ＶＨを含む免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントを含み、前記ＶＨは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １３、１４及び１５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲｓ １、２及び３を含む、請求項７に記載の核酸。
  11. 前記核酸は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリペプチドは、ＶＬを含む免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントを含み、前記ＶＬは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： １６、１７及び１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲｓ １、２及び３を含む、請求項７に記載の核酸。
  12. 前記ＶＨは、ＶＬとペアリングする場合に、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する、又は前記ＶＬは、ＶＨとペアリングする場合に、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する、請求項７～１１のいずれか１項に記載の核酸。
  13. 前記免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントは、ヒト化免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントであり、且つ前記免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントは、ヒト化免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントである、請求項７～１２のいずれか１項に記載の核酸。
  14. 前記核酸は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードする、請求項７～１３のいずれか１項に記載の核酸。
  15. 前記核酸は、ｃＤＮＡである、請求項７～１４のいずれか１項に記載の核酸。
  16. 請求項７～１５のいずれか１項に記載の核酸の１種又は複数種を含むベクター。
  17. 請求項７～１５のいずれか１項に記載の核酸の２種を含むベクターであって、前記ベクターは、ＯＸ４０に一緒に結合するＶＬ領域及びＶＨ領域をコードする、ベクター。
  18. 各ベクターは、請求項７～１５のいずれか１項に記載の核酸の１種を含むベクターのペアであって、ＯＸ４０に一緒に結合するＶＬ領域及びＶＨ領域をコードするベクターのペア。
  19. 請求項１６又は１７に記載のベクター又は請求項１８に記載のベクターのペアを含む、細胞。
  20. 前記細胞は、ＣＨＯ細胞である、請求項１９に記載の細胞。
  21. 請求項７～１５のいずれか１項に記載の核酸の１種又は複数種を含む細胞。
  22. 請求項７～１５のいずれか１項に記載の核酸の２種を含む細胞。
  23. 前記の２種の核酸は、ＯＸ４０に一緒に結合するＶＬ領域及びＶＨ領域をコードする、請求項２２に記載の細胞。
  24. 抗体又はその抗原結合フラグメントを産生する方法において、
    （ａ）請求項１９～２３のいずれか１項に記載の細胞に前記抗体又は抗原結合フラグメントを産生させるために十分な条件下で、前記細胞を培養すること；及び
    （ｂ）前記細胞によって産生された前記抗体又は抗原結合フラグメントを収集すること、を含む方法。
  25. 重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＯＸ４０に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントにおいて、
    前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、選択されたＶＨ配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は、選択されたＶＬ配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記選択されたＶＨ配列及び前記選択されたＶＬ配列は、以下のいずれか１つである、抗体又はその抗原結合フラグメント。
    （１）前記選択されたＶＨ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ５３、５４、５５又は７９であり、且つ前記選択されたＶＬ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ５６、５７、５８又は８０であること；
    （２）前記選択されたＶＨ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ５９、６０、６１又は８１であり、且つ前記選択されたＶＬ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ６２、６３、６４、６５又は８２であること；
    （３）前記選択されたＶＨ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ６６、６７、６８又は８３であり、且つ前記選択されたＶＬ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ６９、７０、７１、７２又は８４であること；
    （４）前記選択されたＶＨ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ７３、７４、７５又は８５であり、且つ前記選択されたＶＬ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ７６、７７、７８又は８６であること。
  26. 前記ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３の配列を含み、且つ前記ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５６の配列を含む、請求項２５に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  27. 前記ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５５の配列を含み、且つ前記ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５８の配列を含む、請求項２５に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  28. 前記ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５５の配列を含み、且つ前記ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５６の配列を含む、請求項２５に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  29. 前記ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７３の配列を含み、且つ前記ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７７の配列を含む、請求項２５に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  30. 前記の抗体又は抗原結合フラグメンは、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する、請求項２５～２９のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  31. 前記の抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項２５～３０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  32. 前記の抗体又は抗原結合フラグメントは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）である、請求項２５～３１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  33. 治療剤と共有結合する請求項１～６及び２５～３２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、抗体－薬物複合体。
  34. 前記治療剤は、細胞傷害性薬又は細胞増殖抑制薬である、請求項３３に記載の抗体薬物複合体。
  35. 癌を有する対象を治療する方法において、前記対象に治療有効量の、請求項１～６及び２５～３２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、又は請求項３３又は３４に記載の抗体－薬物複合体を含む組成物を投与する、方法。
  36. 前記対象は、固形腫瘍を有する、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記癌症は、切除不能な黒色腫又は転移性黒色腫である、請求項３５に記載の方法。
  38. 前記癌症は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮がん（ＳＣＣＨＮ）、腎細胞がん（ＲＣＣ）、黒色腫、膀胱がん、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）又は大腸がんである、請求項３５に記載の方法。
  39. 腫瘍増殖速度を低下させる方法において、有効量の、請求項１～６及び２５～３２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、又は請求項３３又は３４に記載の抗体－薬物複合体を含む組成物を腫瘍細胞に接触させる、方法。
  40. 腫瘍細胞を殺す方法において、有効量の、請求項１～６及び２５～３２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、又は請求項３３又は３４に記載の抗体－薬物複合体を含む組成物を腫瘍細胞に接触させる、方法。
  41. 請求項１～６及び２５～３２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  42. 請求項３３又は３４に記載の抗体薬物複合体、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
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