RU2796413C2 - Антитела против cd40 и их применения - Google Patents

Антитела против cd40 и их применения Download PDF

Info

Publication number
RU2796413C2
RU2796413C2 RU2021104177A RU2021104177A RU2796413C2 RU 2796413 C2 RU2796413 C2 RU 2796413C2 RU 2021104177 A RU2021104177 A RU 2021104177A RU 2021104177 A RU2021104177 A RU 2021104177A RU 2796413 C2 RU2796413 C2 RU 2796413C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
antibody
seq
amino acid
antigen
ser
Prior art date
Application number
RU2021104177A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2021104177A (ru
Inventor
И Ян
Чуньянь ДУН
Фан ЯН
Чэнюань ЛУ
Юэлэй ШЭНЬ
Цзянь НИ
Янань ГО
Юньюнь ЧЭНЬ
Цзиншу СЕ
Original Assignee
Юкьюр (Бэйцзин) Байофарма Ко., Лтд
Filing date
Publication date
Application filed by Юкьюр (Бэйцзин) Байофарма Ко., Лтд filed Critical Юкьюр (Бэйцзин) Байофарма Ко., Лтд
Publication of RU2021104177A publication Critical patent/RU2021104177A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2796413C2 publication Critical patent/RU2796413C2/ru

Links

Images

Abstract

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфически связываются с CD40. Также раскрыты нуклеиновая кислота, кодирующая указанное антитело; вектор или пара экспрессии, содержащие указанную нуклеиновую кислоту; клетка, содержащая указанный вектор; конъюгат и фармацевтическая композиция, содержащие указанное антитело. Раскрыты способ получения указанного антитела; способ лечения онкологического пациента с помощью указанного антитела; способ уничтожения или уменьшения скорости роста опухоли с помощью указанного антитела; применение указанного антитела для получения биспецифического антитела. Изобретение позволяет эффективно лечить заболевания, ассоциированные с CD40. 19 н. и 33 з.п. ф-лы, 22 ил., 7 табл., 9 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Это раскрытие относится к антителам против CD40 (член 5 суперсемейства рецепторов TNF) и их применениям.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Онкологическое заболевание в настоящее время является одним из заболеваний, которые имеют самую высокую смертность среди людей. Согласно статистическим данным Всемирной организации здравоохранения, в 2012 году число случаев заболеваемости онкологическими заболеваниями и смертности в мире достигло 14 миллионов и 8,2 миллионов, соответственно. В Китае впервые диагностировано 3,07 миллиона случаев онкологических заболеваний, а число погибших составило 2,2 миллиона.
Недавний клинический и коммерческий успех противоопухолевых антител вызвал большой интерес к терапии на основе антител. Существует необходимость в разработке противоопухолевых антител для использования в различных терапевтических средствах на основе антител для лечения онкологических заболеваний.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее раскрытие относится к антителам против CD40, их антигенсвязывающему фрагменту и их применению.
В одном аспекте изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связываются с CD40 (член 5 суперсемейства рецепторов TNF), содержащим вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую области, определяющие комплементарность (CDR) 1, 2 и 3, где область VH CDR1 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR1, область VH CDR2 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR2, а область VH CDR3 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR3; и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR 1, 2 и 3, где область VL CDR1 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности VL CDR1, область VL CDR2 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности VL CDR2, а область VL CDR3 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности VL CDR3, где выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2 и 3 и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR, 1, 2 и 3 являются одними из следующих:
(1) выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO:1, 2, 3, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO:4, 5, 6, соответственно;
(2) выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO:7, 8, 9, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO:10, 11, 12, соответственно;
(3) выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO:13, 14, 15 соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO:16, 17, 18, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO:1, 2 и 3, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO:4, 5 и 6, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO:7, 8 и 9, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO:10, 11 и 12, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO:13, 14 и 15, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO:16, 17 и 18, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с CD40 человека. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFV).
В другом аспекте изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий:
(1) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую области, определяющие комплементарность, (CDR) 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2, и 3, соответственно, и где VH в паре с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:33, 34, 35, 36 или 53, связывается с CD40;
(2) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4, 5 и 6, соответственно, и где VL в паре с VH, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:30, 31, 32 или 52, связывается с CD40;
(3) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:7, 8 и 9, соответственно, и где VH в паре с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:41, 42, 43 или 55, связывается с CD40;
(4) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:10, 11 и 12, соответственно, и где VL в паре с VH, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:37, 38, 39, 40 или 54, связывается с CD40;
(5) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:13, 14, 15 соответственно, и где VH в паре с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:48, 49, 50, 51 или 57, связывается с CD40;
(6) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащий CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:16, 17 и 18, соответственно, и где VL в паре с VH, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:44, 45, 46, 47 или 56, связывается с CD40.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VH, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2, и 3, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4, 5, и 6, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VH, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:7, 8, и 9, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:10, 11, и 12, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VH, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:13, 14 и 15, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:16, 17 и 18, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления VH в паре с VL специфически связывается с человеческим CD40, или VL в паре с VH специфически связывается с человеческим CD40.
В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь иммуноглобулина или ее фрагмент представляют собой тяжелую цепь гуманизированного иммуноглобулина или ее фрагмент, и легкая цепь иммуноглобулина или ее фрагмент представляют собой легкую цепь гуманизированного иммуноглобулина или ее фрагмент.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой кДНК.
В одном аспекте изобретение относится к вектору, содержащему одну или более нуклеиновых кислот, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления вектор кодирует область VL и область VH, которые вместе связываются с CD40.
В одном аспекте в раскрытии представлена пара векторов, где каждый вектор содержит одну из нуклеиновых кислот, как описано в настоящем документе, где вместе пара векторов кодирует область VL и область VH, которые вместе связываются с CD40.
В другом аспекте изобретение относится к клетке, содержащей вектор, как описано в настоящем документе, или пару векторов, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку CHO.
В одном аспекте раскрытие также относится к клетке, содержащей одну или более нуклеиновых кислот, как описано в настоящем документе.
В другом аспекте в раскрытии представлена клетка, содержащая две нуклеиновые кислоты, описанные в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления две нуклеиновые кислоты вместе кодируют область VL и область VH, которые вместе связываются с CD40.
В другом аспекте изобретение относится к способам получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
Способы включают стадии
(а) культивирование клетки, как описано в настоящем документе, в условиях, достаточных для того, чтобы клетка продуцировала антитело или антигенсвязывающий фрагмент; и
(b) сбор антитела или антигенсвязывающего фрагмента, продуцируемого клеткой.
В одном аспекте изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связываются с CD40, содержащим вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична выбранной последовательности VH, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична выбранной последовательности VL, где выбранная последовательность VH и выбранная последовательность VL представляют собой одно из следующих:
(1) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:30, 31, 32 или 52, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:33, 34, 35, 36 или 53;
(2) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:37, 38, 39, 40 или 54, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:41, 42, 43 или 55;
(3) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:44, 45, 46, 47 или 56, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:48, 49, 50, 51 или 57.
В некоторых вариантах осуществления VH содержит последовательность SEQ ID NO:40, а VL содержит последовательность SEQ ID NO:42.
В некоторых вариантах осуществления VH содержит последовательность SEQ ID NO:39, а VL содержит последовательность SEQ ID NO:43.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с CD40 человека.
В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFV).
В одном аспекте изобретение относится к конъюгату антитело-лекарственное средство, содержащему антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем документе, ковалентно связанный с терапевтическим агентом. В некоторых вариантах осуществления терапевтический агент представляет собой цитотоксический или цитостатический агент.
В другом аспекте изобретение относится к способам лечения пациента, имеющего онкологическое заболевание. Способы включают стадии введения пациенту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем документе, или конъюгат антитело-лекарственное средство, как описано в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления у пациента имеется солидная опухоль (например, солидная опухоль на поздней стадии). В некоторых вариантах осуществления онкологическое заболевание представляет собой неоперабельную меланому или метастатическую меланому. В некоторых вариантах осуществления онкологическое заболевание представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), плоскоклеточный рак головы и шеи (SCCHN), рак головы и шеи, почечно-клеточный рак (RCC), меланому, рак мочевого пузыря, рак желудка, уротелиальный рак, карциному из клеток Меркеля, трижды негативный рак молочной железы (TNBC) или колоректальную карциному.
В некоторых вариантах осуществления онкологическое заболевание представляет собой меланому, карциному поджелудочной железы, мезотелиому или гемобластоз (например, неходжкинскую лимфому, лимфому или хронический лимфоцитарный лейкоз).
В одном аспекте изобретение относится к способам уменьшения скорости роста опухоли. Способы включают стадии контакта опухолевой клетки с эффективным количеством композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем документе, или конъюгат антитело-лекарственное средство, как описано в настоящем документе.
В другом аспекте изобретение относится к способам уничтожения опухолевой клетки. Способы включают стадии контакта опухолевой клетки с эффективным количеством композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем документе, или конъюгат антитело-лекарственное средство, как описано в настоящем документе.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель.
В другом аспекте в описании также представлена фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат антитело-лекарственное средство, как описано в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель.
Используемый в настоящем описании термин «злокачественное новообразование» относится к клеткам, обладающим способностью к автономному росту. Примеры таких клеток включают клетки, имеющие аномальное состояние или состояние, отличающееся быстрым ростом пролиферирующих клеток. Подразумевается, что этот термин включает злокачественные образования, например опухоли; онкогенные процессы, метастатические ткани и злокачественно трансформированные клетки, ткани или органы, независимо от гистопатологического типа или стадии инвазивности. Также включены злокачественные новообразования различных систем органов, таких как дыхательная, сердечно-сосудистая, почечная, репродуктивная, гематологическая, неврологическая, печеночная, желудочно-кишечная и эндокринная системы; а также аденокарциномы, которые включают злокачественные новообразования, такие как большинство видов рака толстой кишки, почечно-клеточный рак, рак предстательной железы и/или тестикулярные опухоли, немелкоклеточный рак легкого и рак тонкой кишки. Злокачественное новообразование, которое «возникает естественным путем», включает любое злокачественное новообразование, которое не индуцируется экспериментальной имплантацией опухолевых клеток индивидууму, и включает, например, самопроизвольно возникающее злокачественное новообразование, злокачественное новообразование, вызванное воздействием на пациента канцерогена(канцерогенов), злокачественное новообразование, возникающее в результате вставки трансгенного онкогена или нокаута гена-супрессора опухоли, и злокачественное новообразование, вызванное инфекциями, например, вирусными инфекциями. Термин «карцинома» известен в данной области и относится к злокачественным новообразованиям эпителиальных или эндокринных тканей. Термин также включает карциносаркомы, которые включают злокачественные опухоли, состоящие из канцероматозных и саркоматозных тканей. «Аденокарцинома» относится к карциноме, происходящей из железистой ткани или в которой опухолевые клетки образуют узнаваемые железистые структуры. Термин «саркома» известен в данной области и относится к злокачественным опухолям мезенхимального происхождения. Термин «гематопоэтические неопластические расстройства» включает заболевания, связанные с гиперпластическими/неопластическими клетками гематопоэтического происхождения. Гематопоэтическое неопластическое расстройство может возникать из-за миелоидных, лимфоидных или эритроидных линий или их клеток-предшественников.
Используемый в настоящем описании термин «антитело» относится к любой антигенсвязывающей молекуле, которая содержит по меньшей мере одну (например, одну, две, три, четыре, пять или шесть) область, определяющую комплементарность (CDR) (например, любую из трех CDR из легкой цепи иммуноглобулина или любую из трех CDR из тяжелой цепи иммуноглобулина), и которая способна специфически связываться с эпитопом. Неограничивающие примеры антител включают: моноклональные антитела, поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), одноцепочечные антитела, химерные антитела, человеческие антитела и гуманизированные антитела. В некоторых вариантах осуществления антитело может содержать Fc-область человеческого антитела. Термин антитело также включает производные, например биспецифические антитела, одноцепочечные антитела, диатела, линейные антитела и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.
Используемый в настоящем описании термин «антигенсвязывающий фрагмент» относится к части полноразмерного антитела, где часть антитела способна специфически связываться с антигеном. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере один вариабельный домен (например, вариабельный домен тяжелой цепи или вариабельный домен легкой цепи). Неограничивающие примеры фрагментов антител включают, например, фрагменты Fab, Fab’, F(ab’)2 и Fv.
Используемый в настоящем описании термин «человеческое антитело» относится к антителу, которое кодируется эндогенной нуклеиновой кислотой (например, реаранжированным локусом тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина человека), присутствующей в организме человека. В некоторых вариантах осуществления проводят забор человеческого антитела у человека или продуцируют в культуре клеток человека (например, в человеческих гибридомных клетках). В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело продуцируется в клетке, не являющейся человеческой, (например, в клеточной линии мыши или хомяка). В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело продуцируется в бактериальной или дрожжевой клетке. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело продуцируется в трансгенном животном, но не в человеке (как например, у крупного рогатого скота), содержащее нереаранжированный или реаранжированный локус иммуноглобулина человека (например, локус тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина человека).
Используемый в настоящем описании термин «химерное антитело» относится к антителу, которое содержит последовательность, присутствующую по меньшей мере в двух разных антителах (например, антителах от двух разных видов млекопитающих, таких как человеческое и мышиное антитело). Неограничивающим примером химерного антитела является антитело, содержащее последовательности вариабельного домена (например, всю или часть последовательности вариабельного домена легкой цепи и/или тяжелой цепи) антитела, не являющегося человеческим, (например, мышиного), и константные домены человеческого антитела. Дополнительные примеры химерных антител описаны в настоящем документе и известны в данной области.
Используемый в настоящем описании термин «гуманизированное антитело» относится к антителу животного, но не человека, которое содержит минимальную последовательность, полученную из (например, мышиного) иммуноглобулина животного, но не человека, и содержит последовательности, полученные из человеческого иммуноглобулина. В неограничивающих примерах гуманизированные антитела представляют собой человеческие антитела (реципиентные антитела), в которых остатки гипервариабельной (например, CDR) области реципиентного антитела заменены остатками гипервариабельной (например, CDR) области из антитела животного, но не человека, (например, донорное антитело), например антитело мыши, крысы или кролика, имеющее желаемую специфичность, аффинность и способность. В некоторых вариантах осуществления каркасные остатки Fv человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими нечеловеческими (например, мышиными) остатками иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаружены в реципиентном антителе или в донорном антителе. Эти модификации могут быть сделаны для дальнейшего улучшения характеристик антител. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит практически все из по меньшей мере одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или практически все гипервариабельные петли (CDR) соответствуют таковым иммуноглобулина животного, но не человека (например, мыши) и все или практически все каркасные области соответствуют таковым из человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело также может содержать, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, иммуноглобулина человека. Гуманизированные антитела могут быть получены с использованием методов молекулярной биологии, известных в данной области. Неограничивающие примеры способов получения гуманизированных антител описаны в настоящем документе.
В контексте настоящего описания термин «одноцепочечное антитело» относится к одному полипептиду, который содержит по меньшей мере два вариабельных домена иммуноглобулина (например, вариабельный домен тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина млекопитающих), который способен специфически связываться с антигеном. Неограничивающие примеры одноцепочечных антител описаны в настоящем документе.
Используемый в настоящем описании термин «мультимерное антитело» относится к антителу, которое содержит четыре или более (например, шесть, восемь или десять) вариабельных доменов иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления мультимерное антитело способно сшивать одну целевую молекулу (например, CD40) по меньшей мере с одной второй целевой молекулой (например, CTLA-4) на поверхности клетки млекопитающего (например, Т-клетки человека).
Используемые в настоящем описании термины «индивидуум» и «пациент» используются взаимозаменяемо по всему описанию и описывают животное, человека или не человека, которому предоставляется лечение в соответствии со способами по настоящему изобретению. Ветеринарные и не ветеринарные применения предусмотрены настоящим изобретением. Пациентами-людьми могут быть взрослые люди или молодые люди (например, люди в возрасте до 18 лет). Помимо людей, пациенты включают, но не ограничиваются ими, мышей, крыс, хомяков, морских свинок, кроликов, хорьков, кошек, собак и приматов. Включены, например, приматы (например, обезьяны, шимпанзе, гориллы и т.п.), грызуны (например, крысы, мыши, песчанки, хомяки, хорьки, кролики), зайцеобразные, свиньи (например, свиньи, карликовые свиньи), лошади, собаки, кошки, крупный рогатый скот и другие домашние, сельскохозяйственные и зоопарковые животные.
В контексте настоящего описания, когда речь идет об антителе, фразы «специфическое связывание» и «специфически связываются» означают, что антитело предпочтительнее взаимодействует со своей молекулой-мишенью (например, CD40) по сравнению с другими молекулами, потому что взаимодействие зависит от присутствия конкретной структуры (т.е. антигенная детерминанта или эпитоп) молекулы-мишени; Другими словами, реагент распознает и связывается с молекулами, которые включают определенную структуру, а не со всеми молекулами в целом. Антитело, которое специфически связывается с молекулой-мишенью, может называться антителом, специфичным к мишени. Например, антитело, которое специфически связывается с молекулой CD40, может называться CD40-специфическим антителом или антителом против CD40.
Используемые в настоящем описании термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины, по меньшей мере, из двух аминокислот.
Используемые в настоящем описании термины «полинуклеотид», «молекула нуклеиновой кислоты» и «последовательность нуклеиновой кислоты» используются в настоящем описании взаимозаменяемо для обозначения полимеров нуклеотидов любой длины, по меньшей мере, из двух нуклеотидов и включают, без ограничения, ДНК, РНК, ДНК/РНК-гибриды и их модификации.
Если не определено иначе, то все технические и научные термины, использованные в настоящем документе, имеют тот же смысл, который вкладывается в них обычным специалистом области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Материалы и методы описаны в настоящем документе для применения в настоящем изобретении; другие подходящие материалы и методы, известные в данной области, также могут использоваться. Материалы, методы и примеры являются иллюстративными и не предназначены для ограничения. Все публикации, патентные заявки, патенты, последовательности, занесения в базы данных и другие ссылки, упомянутые в настоящем документе, включены ссылкой в полном объеме. В случае противоречий, они будут урегулированы настоящим описанием изобретения, включающим определения.
Другие признаки и преимущества изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и чертежей, и из формулы изобретения.
Описание чертежей
ФИГ. 1 представляет собой блок-схему, показывающую первую часть иллюстративного протокола получения антител против hCD40.
ФИГ. 2 представляет собой блок-схему, показывающую вторую часть иллюстративного протокола получения антител против hCD40.
ФИГ. 3 представляет собой набор графиков проточной цитометрии, показывающих, что антитела против hCD40 блокируют связывание между hCD40 и лигандом hCD40.
ФИГ. 4 представляет собой набор графиков, показывающих результаты проточной цитометрии анализа перекрестной реактивности антител против hCD40 с CD40 обезьяны (rmCD40), CD40 мыши (mCD40) и химерным CD40 человека-мыши (chiCD40). NC означает отрицательный контроль.
ФИГ. 5 представляет собой график, показывающий результаты поверхностного плазменного резонанса (SPR) с использованием химерного антитела против hCD40 6A7-mHvKv-IgG4 и человеческого CD40.
ФИГ. 6 представляет собой график, показывающий результаты поверхностного плазменного резонанса (SPR) с использованием гуманизированного антитела 6A7-H1K1-IgG4 против hCD40 и человеческого CD40.
ФИГ. 7 представляет собой график, показывающий изменение массы тела гуманизированных мышей с CD40 (B-hCD40) с опухолевыми клетками MC-38, обработанных мышиными антителами против hCD40. PS - физиологический раствор (контроль).
ФИГ. 8 представляет собой график, показывающий процентное изменение массы тела с течением времени у гуманизированных мышей CD40 (B-hCD40) с опухолевыми клетками MC-38, обработанных мышиными антителами против hCD40. PS - физиологический раствор (контроль).
ФИГ. 9 представляет собой график, показывающий изменение размера опухоли с течением времени у гуманизированных мышей CD40 (B-hCD40) с опухолевыми клетками MC-38, обработанных мышиными антителами против hCD40. PS - физиологический раствор (контроль).
ФИГ. 10 представляет собой график, показывающий изменение с течением времени массы тела гуманизированных мышей CD40 (B-hCD40) с опухолевыми клетками MC-38, обработанных химерными антителами против hCD40. PS - физиологический раствор (контроль).
ФИГ. 11 представляет собой график, показывающий процентное изменение массы тела с течением времени у гуманизированных мышей CD40 (B-hCD40) с опухолевыми клетками MC-38, обработанных химерными антителами против hCD40. PS - физиологический раствор (контроль).
ФИГ. 12 представляет собой график, показывающий размер опухоли с течением времени у гуманизированных мышей CD40 (B-hCD40) с опухолевыми клетками MC-38, обработанных химерными антителами против hCD40. PS - физиологический раствор (контроль).
ФИГ. 13 представляет собой график, показывающий изменение массы тела гуманизированных мышей CD40 (B-hCD40) с опухолевыми клетками MC-38, обработанных гуманизированными антителами против hCD40. PS - физиологический раствор (контроль).
ФИГ. 14 представляет собой график, показывающий процентное изменение массы тела с течением времени у гуманизированных мышей CD40 (B-hCD40) с опухолевыми клетками MC-38, обработанных гуманизированными антителами против hCD40. PS - физиологический раствор (контроль).
ФИГ. 15 представляет собой график, показывающий размер опухоли с течением времени у гуманизированных мышей CD40 (B-hCD40) с опухолевыми клетками MC-38, обработанных гуманизированными антителами против hCD40. PS - физиологический раствор (контроль).
На ФИГ. 16 перечислены последовательности CDR мышиных антител против hCD40 (03-7F10, 06-6A7 и 07-4H6) и последовательности CDR их гуманизированных антител против hCD40, как определено нумерацией по Kabat.
На ФИГ. 17 перечислены последовательности CDR мышиных антител против hCD40 (03-7F10, 06-6A7 и 07-4H6) и последовательности CDR их гуманизированных антител против hCD40, как определено нумерацией Chothia.
На ФИГ. 18 перечислены аминокислотные последовательности CD40 человека (hCD40), CD40 мыши (mCD40), CD40 обезьяны (rmCD40) и химерного CD40 (chiCD40).
На ФИГ. 19 перечислены аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи гуманизированных антител против hCD40 на основе 7F10.
На ФИГ. 20 перечислены аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи гуманизированных антител против hCD40 на основе 6A7.
На ФИГ. 21 перечислены аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи гуманизированных антител против hCD40 на основе 4H6.
На ФИГ. 22 перечислены аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи мышиных антител против hCD40 03-7F10, 06-6A7 и 07-4H6.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
В настоящем описании представлены примеры антител, их антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с CD40 (член 5 надсемейства рецепторов TNF).
CD40 и онкологические заболевания
Иммунная система может различать нормальные клетки в организме и те, которые она считает «чужеродными», что позволяет иммунной системе атаковать чужеродные клетки, оставляя нормальные клетки в покое. Этот механизм иногда включает белки, называемые иммунными контрольными точками. Иммунные контрольные точки представляет собой молекулы в иммунной системе, которые либо увеличивают сигнал (костимулирующие молекулы), либо понижают сигнал.
Ингибиторы контрольных точек могут предотвращать атаку иммунной системы на нормальные ткани и тем самым предотвращать аутоиммунные заболевания. Многие опухолевые клетки также экспрессируют ингибиторы контрольных точек. Эти опухолевые клетки избегают иммунного надзора, кооптируя определенные пути иммунных контрольных точек, особенно в Т-клетках, которые специфичны для опухолевых антигенов (Creelan, Benjamin C. «Update on immune checkpoint inhibitors in lung cancer» Cancer Control 21.1 (2014): 80-89). Поскольку многие иммунные контрольные точки инициируются взаимодействиями лиганд-рецептор, они могут быть легко заблокированы антителами против лигандов и/или их рецепторов.
CD40 (также известный как член суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли 5 или TNFRSF5) является членом суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли, экспрессируемым на антигенпрезентирующих клетках (APC), таких как дендритные клетки (DC), макрофаги, B-клетки и моноциты, а также многие другие неиммунные клетки и широкий спектр опухолей. Взаимодействие с его тримерным лигандом CD154 (также известным как лиганд CD40 или CD40L) на активированных Т-хелперных клетках приводит к активации APC, что приводит к индукции адаптивного иммунитета.
С физиологической точки зрения, передача сигналов через CD40 на APC, как полагают, представляет собой основной компонент помощи Т-клеток и в значительной степени опосредует способность хелперных Т-клеток лицензировать APC. Лигирование CD40 на DC, например, индуцирует повышенную поверхностную экспрессию костимулирующих молекул и молекул MHC, продуцирование провоспалительных цитокинов и усиление Т-клеточной активации. Лигирование CD40 на покоящихся В-клетках усиливает антиген-презентирующую функцию и пролиферацию.
В доклинических моделях крысиные mAb против CD40 мыши проявляют замечательную терапевтическую активность при лечении CD40+ B-клеточных лимфом (80-100% мышей вылечены и обладают иммунитетом к повторному заражению зависимым от CD8 T-клеток образом) и также эффективны при различных CD40-отрицательных опухолях. Эти mAb способны к элиминации опухоли у мышей с почти неизлечимой болезнью. CD40 mAb были исследованы в клинических испытаниях и используются для лечения меланомы, карциномы поджелудочной железы, мезотелиомы, гемобластозов, особенно неходжкинской лимфомы, лимфомы, хронического лимфолейкоза и солидных опухолей на поздней стадии.
Терапевтические антитела против CD40 проявляют разнообразную активность, от сильной агонистической активности до антагонизма. В настоящее время нет удовлетворительного объяснения этой неоднородности. Основное механистическое обоснование агонистических mAb к CD40 состоит в том, чтобы активировать APC хозяина для того, чтобы вызвать клинически значимые противоопухолевые Т-клеточные ответы у пациентов. Они включают независимую от Т-клеток, но зависимую от макрофагов активацию регрессии опухоли. CD40-активированные макрофаги могут стать туморицидными и, по меньшей мере, при раке поджелудочной железы, могут также способствовать истощению стромы опухоли, что вызывает коллапс опухоли in vivo. Важно отметить, что эти механизмы не требуют экспрессии CD40 опухолью, что оправдало включение пациентов с широким спектром опухолей во многие клинические испытания. Поскольку эти стратегии направлены на активацию DC, макрофагов или того и другого, цель не обязательно состоит в том, чтобы mAb к CD40 уничтожали клетку, с которой они связываются, например, посредством комплемент-опосредованной цитотоксичности (CMC) или антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Таким образом, по замыслу сильное агонистическое антитело не опосредует CMC или ADCC.
Напротив, другие человеческие mAb к CD40 могут опосредовать CMC и ADCC против CD40+ опухолей, таких как почти все B-клеточные злокачественные новообразования, часть меланом и некоторые карциномы. Наконец, есть некоторые свидетельства того, что лигирование CD40 на опухолевых клетках способствует апоптозу и что это может быть выполнено без задействования какого-либо иммунного эффекторного пути. Это было показано для CD40+ В-клеточных злокачественных новообразований и некоторых солидных опухолей, таких как CD40+ карциномы и меланомы.
Подробное описание CD40 и его функции можно найти, например, в Vonderheide et al., «Agonistic CD40 antibodies and cancer therapy.» (2013): 1035-1043; Beatty, et al. «CD40 agonists alter tumor stroma and show efficacy against pancreatic carcinoma in mice and humans». Science 331.6024 (2011): 1612-1616; Vonderheide, et al. «Clinical activity and immune modulation in cancer patients treated with CP-870,893, a novel CD40 agonist monoclonal antibody.» Journal of Clinical Oncology 25.7 (2007): 876-883; каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
В настоящем описании представлены несколько антител против CD40, их антигенсвязывающие фрагменты и способы использования этих антител против CD40 и антигенсвязывающих фрагментов для ингибирования роста опухоли и лечения онкологических заболеваний.
Антитела и антигенсвязывающие фрагменты
В настоящем раскрытии представлены антитела против CD40 и их антигенсвязывающие фрагменты. Как правило, антитела (также называемые иммуноглобулинами) состоят из двух классов полипептидных цепей, легких цепей и тяжелых цепей. Неограничивающий пример антитела по настоящему изобретению может представлять собой интактное антитело с четырьмя иммуноглобулиновыми цепями, содержащее две тяжелые цепи и две легкие цепи. Тяжелая цепь антитела может быть любого изотипа, включая IgM, IgG, IgE, IgA или IgD, или подкласса, включая IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE1, IgE2 и т.д. Легкая цепь может быть легкой цепью каппа или легкой цепью лямбда. Антитело может содержать две идентичные копии легкой цепи и две идентичные копии тяжелой цепи. Тяжелые цепи, каждая из которых содержит один вариабельный домен (или вариабельную область, VH) и множество константных доменов (или константных областей), связываются друг с другом посредством дисульфидной связи в своих константных доменах, образуя «стебель» антитела. Легкие цепи, каждая из которых содержит один вариабельный домен (или вариабельную область, VL) и один константный домен (или константную область), каждая связывается с одной тяжелой цепью посредством дисульфидного связывания. Вариабельная область каждой легкой цепи выровнена с вариабельной областью тяжелой цепи, с которой она связана. Вариабельные области как легких цепей, так и тяжелых цепей содержат три гипервариабельные области, расположенные между более консервативными каркасными областями (FR).
Эти гипервариабельные области, известные как области, определяющие комплементарность, (CDR), образуют петли, которые включают основную антигенсвязывающую поверхность антитела. Четыре каркасных области в основном принимают конформацию бета-листа, а CDR образуют петли, соединяющие, а в некоторых случаях образующие часть структуры бета-листа. CDR в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости от каркасных областей и, вместе с CDR из другой цепи, способствуют образованию антигенсвязывающей области.
Способы идентификации областей CDR антитела путем анализа аминокислотной последовательности антитела хорошо известны, и обычно используется ряд определений CDR. Определение Kabat основано на вариабельности последовательности, а определение Chothia основано на расположении структурных петлевых областей. Эти методы и определения описаны, например, в публикации Martin, «Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains,» Antibody engineering, Springer Berlin Heidelberg, 2001. 422-439; Abhinandan, et al. «Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains,» Molecular immunology 45.14 (2008): 3832-3839; Wu, T.T. and Kabat, E.A. (1970) J. Exp. Med. 132: 211-250; Martin et al., Methods Enzymol. 203: 121-53 (1991); Morea et al., Biophys Chem. 68(1-3):9-16 (Oct. 1997); Morea et al., J. Mol Biol. 275(2):269-94 (Jan.1998); Chothia et al., Nature 342(6252):877-83 (Dec. 1989); Ponomarenko and Bourne, BMC Structural Biology 7:64 (2007); каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Если специально не указано в настоящем раскрытии, нумерация Kabat используется в настоящем раскрытии по умолчанию.
CDR важны для распознавания эпитопа антигена. Используемый в настоящем описании термин «эпитоп» представляет собой наименьшую часть молекулы-мишени, способную специфически связываться с антигенсвязывающим доменом антитела. Минимальный размер эпитопа может составлять примерно три, четыре, пять, шесть или семь аминокислот, но эти аминокислоты не обязательно должны быть в последовательной линейной последовательности первичной структуры антигена, поскольку эпитоп может зависеть от трехмерной конфигурации на основе вторичной и третичной структуры антигена.
В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой интактную молекулу иммуноглобулина (например, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgD, IgE, IgA). Подклассы IgG (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) высоко консервативны, различаются по своей константной области, особенно по своим шарнирам и верхним доменам CH2. Последовательности и различия подклассов IgG известны в данной области и описаны, например, в Vidarsson, et al., «IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions.» Frontiers in immunology 5 (2014); Irani, et al. «Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases.» Molecular immunology 67.2 (2015): 171-182; Shakib, Farouk, ed. The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Elsevier, 2016; каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Антитело также может представлять собой молекулу иммуноглобулина с происхождением из любого вида (например, человека, грызуна, мыши, верблюда). Антитела, раскрытые в настоящем описании, также включают, но не ограничиваются ими, поликлональные, моноклональные, моноспецифические, полиспецифические антитела и химерные антитела, которые включают связывающий домен иммуноглобулина, слитый с другим полипептидом. Термин «антигенсвязывающий домен» или «антигенсвязывающий фрагмент» означает часть антитела, которая сохраняет специфическую связывающую активность интактного антитела, т.е. любую часть антитела, которая способна специфически связываться с эпитопом на молекуле-мишени интактного антитела. Он включает, например, Fab, Fab', F(ab')2 и варианты этих фрагментов. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может быть, например, scFv, Fv, Fd, dAb, биспецифическим антителом, биспецифическим scFv, диантителом, линейным антителом, одноцепочечной молекулой антитела, полиспецифическим антителом, образованным из фрагментов антитела, и любым полипептидом, который включает домен связывания, который является доменом связывания антитела или гомологичен ему. Неограничивающие примеры антигенсвязывающих доменов включают, например, CDR тяжелой и/или легкой цепи интактного антитела, вариабельные области тяжелой и/или легкой цепи интактного антитела, полноразмерные тяжелые или легкие цепи интактного антитела или индивидуальную CDR из тяжелой цепи или легкой цепи интактного антитела.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент может образовывать часть химерного антигенного рецептора (CAR). В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор представляет собой слияния одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv), как описано в настоящем документе, слитых с трансмембранным доменом CD3-дзета и эндодоменом. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор также содержит внутриклеточные сигнальные домены от различных рецепторов костимулирующих белков (например, CD28, 41BB, ICOS). В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит несколько сигнальных доменов, например CD3z-CD28-41BB или CD3z-CD28-OX40, для повышения эффективности. Таким образом, в одном аспекте в раскрытии дополнительно представлены клетки (например, Т-клетки), которые экспрессируют химерные антигенные рецепторы, как описано в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления scFV имеет один вариабельный домен тяжелой цепи и один вариабельный домен легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления scFV имеет два вариабельных домена тяжелой цепи и два вариабельных домена легкой цепи.
Антитела против CD40 и антигенсвязывающие фрагменты
Раскрытие относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые специфически связываются с CD40. Описанные в настоящем документе антитела и антигенсвязывающие фрагменты способны связываться с CD40. Эти антитела могут быть агонистами или антагонистами. В некоторых вариантах осуществления эти антитела могут стимулировать сигнальный путь CD40, таким образом увеличивая иммунный ответ. В некоторых вариантах осуществления эти антитела могут инициировать CMC или ADCC.
Раскрытие относится, например, к мышиным антителам против CD40 03-7F10 («7F10»), 06-6A7 («6A7») и 07-4H6 («4H6»), их химерным антителам и их гуманизированным антителам (например, некоторые из антител представлены в Таблице 1).
Последовательности CDR для антител, производных 7F10 и 7F10 (например, гуманизированных антител), включают CDR вариабельного домена тяжелой цепи, SEQ ID NO:1-3, и CDR вариабельного домена легкой цепи, SEQ ID NO:4-6 как определяется нумерацией Kabat. CDR также могут быть определены системой Chothia. Под нумерацией Chothia последовательности CDR вариабельного домена тяжелой цепи представлены в SEQ ID NO:19, 20, 3, а последовательности CDR вариабельного домена легкой цепи представлены в SEQ ID NO:4, 21, 6.
Точно так же последовательности CDR для антител, производных от 6A7 и 6A7, включают CDR вариабельного домена тяжелой цепи, SEQ ID NO:7-9, и CDR вариабельного домена легкой цепи, SEQ ID NO:10-12, как определено нумерацией Kabat. Под нумерацией Chothia последовательности CDR вариабельного домена тяжелой цепи представлены в SEQ ID NO:22, 23, 9, а CDR вариабельного домена легкой цепи представлены в SEQ ID NO:10-12.
Последовательности CDR для антител, полученных из 4H6 и 4H6, включают CDR вариабельного домена тяжелой цепи, SEQ ID NO:13, 14, 15 и CDR вариабельного домена легкой цепи, SEQ ID NO:16, 17, 18, как определено нумерацией Kabat. Под нумерацией Chothia последовательности CDR вариабельного домена тяжелой цепи представлены в SEQ ID NO:24, 25, 15, а CDR вариабельного домена легкой цепи представлены в SEQ ID NO:16, 17, 18.
Также представлены аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи гуманизированных антител. Поскольку существуют различные способы гуманизации антитела мыши (например, последовательность может быть модифицирована различными аминокислотными заменами), тяжелая цепь и легкая цепь антитела могут иметь более одной версии гуманизированных последовательностей. Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи гуманизированного антитела 7F10 представлены в SEQ ID NO:30-32. Аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи гуманизированного антитела 7F10 представлены в SEQ ID NO:33-36. Любая из этих последовательностей вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO:30-32) может быть спарена с любой из этих последовательностей вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO:33-36).
Аналогично, аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 6A7 представлены в SEQ ID NO:37-40. Аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 6A7 представлены в SEQ ID NO:41-43. Любая из этих последовательностей вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO:37-40) может быть спарена с любой из этих последовательностей вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO:41-43).
Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи гуманизированного антитела 4H6 представлены в SEQ ID NO:44-47. Аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 4H6 представлены в SEQ ID NO:48-51. Любая из этих последовательностей вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO:44-47) может быть спарена с любой из этих последовательностей вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO:48-51).
Некоторые химерные и гуманизированные антитела на основе 7F10, 6A7 и 4H6 представлены в Таблице 1 и Таблице 4.
Таблица 1
Тип Название антитела VH SEQ ID NO: VL SEQ ID NO: Константные области
Химерное антитело на основе 6A7 6A7-mHvKv-IgG1 54 55 Человеческий IgG1
6A7-mHvKv-IgG2 54 55 Человеческий IgG2
6A7-mHvKv-IgG4 54 55 Человеческий IgG4
6A7-mHvKv-IgG1-N297A 54 55 Человеческий IgG1 с мутацией N297A
6A7-mHvKv-IgG1-LALA 54 55 Человеческий IgG1 с мутацией LALA
Гуманизированные антитела на основе 6A7 6A7-H1K1-IgG4 37 41 Человеческий IgG4
6A7-H2K1-IgG4 38 41 Человеческий IgG4
6A7-H3K1-IgG4 39 41 Человеческий IgG4
6A7-H4K1-IgG4 40 41 Человеческий IgG4
6A7-H1K2-IgG4 37 42 Человеческий IgG4
6A7-H2K2-IgG4 38 42 Человеческий IgG4
6A7-H3K2-IgG4 39 42 Человеческий IgG4
6A7-H4K2-IgG2 40 42 Человеческий IgG2
6A7-H4K2-IgG4 40 42 Человеческий IgG4
6A7-H1K3-IgG4 37 43 Человеческий IgG4
6A7-H2K3-IgG4 38 43 Человеческий IgG4
6A7-H3K3-IgG2 39 43 Человеческий IgG2
6A7-H3K3-IgG4 39 43 Человеческий IgG4
6A7-H4K3-IgG4 40 43 Человеческий IgG4
Химерное антитело на основе 4H6 4H6-mHvKv-IgG1 56 57 Человеческий IgG1
Гуманизированные антитела на основе 4H6 4H6-H1K1-IgG4 44 48 Человеческий IgG4
4H6-H2K1-IgG4 45 48 Человеческий IgG4
4H6-H3K1-IgG4 46 48 Человеческий IgG4
4H6-H4K1-IgG4 47 48 Человеческий IgG4
4H6-H1K2-IgG4 44 49 Человеческий IgG4
4H6-H2K2-IgG4 45 49 Человеческий IgG4
4H6-H3K2-IgG4 46 49 Человеческий IgG4
4H6-H4K2-IgG4 47 49 Человеческий IgG4
4H6-H1K3-IgG4 44 50 Человеческий IgG4
4H6-H2K3-IgG4 45 50 Человеческий IgG4
4H6-H3K3-IgG4 46 50 Человеческий IgG4
4H6-H4K3-IgG4 47 50 Человеческий IgG4
4H6-H1K4-IgG4 44 51 Человеческий IgG4
4H6-H2K4-IgG4 45 51 Человеческий IgG4
4H6-H3K4-IgG4 46 51 Человеческий IgG4
4H6-H4K4-IgG4 47 51 Человеческий IgG4
Химерное антитело на основе 7F10 7F10-mHvKv-IgG1-N297A 52 53 Человеческий IgG1 с мутацией N297A
Гуманизированные антитела на основе 7F10 7F10-H1K1-IgG4 30 33 Человеческий IgG4
7F10-H1K2-IgG4 30 34 Человеческий IgG4
7F10-H1K3-IgG4 30 35 Человеческий IgG4
7F10-H1K4-IgG4 30 36 Человеческий IgG4
7F10-H2K1-IgG4 31 33 Человеческий IgG4
7F10-H2K2-IgG4 31 34 Человеческий IgG4
7F10-H2K3-IgG4 31 35 Человеческий IgG4
7F10-H2K4-IgG4 31 36 Человеческий IgG4
7F10-H3K1-IgG4 32 33 Человеческий IgG4
7F10-H3K2-IgG4 32 34 Человеческий IgG4
7F10-H3K3-IgG4 32 35 Человеческий IgG4
7F10-H3K4-IgG4 32 36 Человеческий IgG4
Процент гуманизации означает процент идентичности последовательности вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи по сравнению с последовательностями человеческого антитела в базе данных Международной иммуногенетической информационной системы (IMGT). Лучший вариант означает, что последовательность вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи ближе к конкретному виду, чем к другим видам. Например, лучший вариант относительно человека означает, что последовательность ближе к человеку, чем к другим видам. Лучший вариант относительно человека и Macaca flavicularis означает, что последовательность имеет одинаковый процент идентичности с человеческой последовательностью и последовательностью Macaca flavicularis, и эти проценты идентичности являются самыми высокими по сравнению с последовательностями других видов. В некоторых вариантах осуществления процент гуманизации составляет более чем 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% 94% или 95%. Подробное описание того, как определять процент гуманизации и как определять лучшие результаты, известно в данной области техники и описано, например, в Jones, et al. «The INNs and outs of antibody nonproprietary names». MAbs. Vol. 8. № 1 Taylor & Francis, 2016, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Высокий процент гуманизации часто имеет различные преимущества, например, более безопасен и более эффективен для людей, с большей вероятностью переносится человеком и/или с меньшей вероятностью имеет побочные эффекты.
Кроме того, в некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, также могут содержать одну, две или три CDR вариабельной области тяжелой цепи, выбранные из группы SEQ ID NO:1-3, SEQ ID NO:7-9, SEQ ID NO:13-15, SEQ ID NO:19, 20, 3, SEQ ID NO:22, 23, 9 и SEQ ID NO:24, 25, 15; и/или одну, две или три CDR вариабельной области легкой цепи, выбранные из группы SEQ ID NO:4-6, SEQ ID NO:10-12, SEQ ID NO:16-18 и SEQ ID NO:4, 21, 6.
В некоторых вариантах осуществления антитела могут иметь вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую области, определяющие комплементарность (CDR) 1, 2, 3, где область CDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR1, область CDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR2, а область CDR3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR 1, 2, 3, где область CDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной аминокислотной последовательности VL CDR1, область CDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной аминокислотной последовательности VL CDR2, и область CDR3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной аминокислотной последовательности VL CDR3. Выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR, 1, 2, 3 показаны на ФИГ. 16 (Kabat CDR) и ФИГ. 17 (Chothia CDR).
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO:1, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены; SEQ ID NO:2, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены; SEQ ID NO:3, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO:7, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены; SEQ ID NO:8, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены; SEQ ID NO:9, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три из CDR SEQ ID NO:13, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены; SEQ ID NO:14, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены; SEQ ID NO:15, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три из CDR SEQ ID NO:19, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены; SEQ ID NO:20, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены; SEQ ID NO:3, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO:22, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены; SEQ ID NO:23, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены; SEQ ID NO:9, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три из CDR SEQ ID NO:24, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены; SEQ ID NO:25, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены; SEQ ID NO:15, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены.
В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO:4, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены; SEQ ID NO:5, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены; SEQ ID NO:6, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены.
В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO:10, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены; SEQ ID NO:11, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены; SEQ ID NO:12, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три CDR из SEQ ID NO:16, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены; SEQ ID NO:17, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены; SEQ ID NO:18, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены.
В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO:4, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены; SEQ ID NO:21, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены; SEQ ID NO:6, содержащих ноль, одну или две аминокислотные вставки, делеции или замены.
Вставки, делеции и замены могут быть в последовательности CDR или на одном или обоих концевых участках последовательности CDR.
Раскрытие также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с CD40. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной последовательности VH, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной последовательности VL. В некоторых вариантах осуществления выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:30, 31, 32 или 52, а выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:33, 34, 35, 36 или 53. В некоторых вариантах осуществления выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:37, 38, 39, 40 или 54, а выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:41, 42, 43 или 55. В некоторых вариантах осуществления выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:44, 45, 46, 47 или 56, а выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:48, 49, 50, 51 или 57.
Чтобы определить процент идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот, последовательности выравнивают для целей оптимального сравнения (например, могут быть введены пробелы в одной или обеих из первой и второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности для оптимальное выравнивание, и негомологичные последовательности можно не принимать во внимание для целей сравнения). Длина эталонной последовательности, выровненной для целей сравнения, составляет, по меньшей мере, 80% длины эталонной последовательности, и в некоторых вариантах осуществления составляет, по меньшей мере, 90%, 95% или 100%. Затем сравниваются аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или нуклеотидов. Если положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом что и в соответствующем положении второй последовательности, то молекулы являются идентичными по этому положению. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, совместно используемых последовательностями, с учетом количества пробелов и длины каждого пробела, которые необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. В целях настоящего раскрытия сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть выполнено с использованием матрицы оценки Blossum 62 со штрафом за пробел 12, штрафом за расширение пробела 4 и штрафом за сдвиг пробела 5.
В раскрытии также представлена нуклеиновая кислота, содержащая полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или легкую цепь иммуноглобулина. Тяжелая цепь иммуноглобулина или легкая цепь иммуноглобулина содержит CDR, как показано на ФИГ. 16 или ФИГ. 17, или имеет последовательности, показанные на ФИГ. 19-22. Когда полипептиды спарены с соответствующим полипептидом (например, соответствующей вариабельной областью тяжелой цепи или соответствующей вариабельной областью легкой цепи), спаренные полипептиды связываются с CD40 (например, человеческим CD40).
Антитела против CD40 и антигенсвязывающие фрагменты также могут быть вариантами антител (включая производные и конъюгаты) антител или фрагментов антител и полиспецифических (например, биспецифических) антител или фрагментов антител. Дополнительные антитела, представленные в настоящем документе, представляют собой поликлональные, моноклональные, полиспецифические (мультимерные, например, биспецифические), человеческие антитела, химерные антитела (например, химеры человек-мышь), одноцепочечные антитела, внутриклеточные антитела (т.е. интраантитела) и их антигенсвязывающие фрагменты. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело IgG или его антигенсвязывающий фрагмент.
Фрагменты антител пригодны для использования в предложенных способах при условии, что они сохраняют желаемую аффинность и специфичность полноразмерного антитела. Таким образом, фрагмент антитела, который связывается с CD40, сохранит способность связываться с CD40. Фрагмент Fv представляет собой фрагмент антитела, который содержит полный сайт распознавания и связывания антигена. Эта область состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи в тесной ассоциации, которая может быть ковалентной по своему характеру, например, в scFv. Именно в этой конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют, определяя антигенсвязывающий сайт на поверхности димера VH-VL. В совокупности шесть CDR или их подгруппа придают антителу антигенсвязывающую специфичность. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащего только три CDR, специфичных для антигена) может обладать способностью распознавать и связывать антиген, хотя обычно с более низкой аффинностью, чем весь сайт связывания.
Одноцепочечные фрагменты антител Fv или (scFv) содержат домены (или области) VH и VL антитела, где эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Как правило, полипептид scFv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет sсFv образовывать требуемую структуру для связывания антигена.
Фрагмент Fab содержит вариабельный и константный домен легкой цепи, а также вариабельный домен и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Фрагменты антитела F(ab')2 содержат пару Fab-фрагментов, которые обычно ковалентно связаны вблизи своих карбоксиконцов посредством шарнирных цистеинов между ними. Другие химические конденсации фрагментов антител также известны в данной области.
Диантитела представляют собой небольшие фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, которые содержат VH, связанную с VL в одной и той же полипептидной цепи (VH и VL). При использовании линкера, который является слишком коротким чтобы позволить спаривание между двумя вариабельными доменами на одной и той же цепи, домены диантитела вынуждены спариваться с комплементарными доменами связывания другой цепи и создают два антигенсвязывающих сайта.
Линейные антитела содержат пару тандемных сегментов Fd (VH-CH1-VH-CH1), которые вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи образуют пару антигенсвязывающих областей. Линейные антитела могут быть биспецифическими или моноспецифическими.
Антитела и фрагменты антител по настоящему изобретению могут быть модифицированы в Fc-области для обеспечения желаемых эффекторных функций или желаемого периода полужизни в сыворотке.
Мультимеризация антител может быть достигнута посредством естественной агрегации антител или с помощью химических или рекомбинантных способов связывания, известных в данной области. Например, некоторый процент препаратов очищенных антител (например, очищенных молекул IgG1) спонтанно образуют белковые агрегаты, содержащие гомодимеры антител и другие мультимеры антител более высокого порядка.
Альтернативно, гомодимеры антител могут быть получены с помощью методов химической связи, известных в данной области. Например, для образования мультимеров антител можно использовать гетеробифункциональные сшивающие агенты, включая, но не ограничиваясь ими, SMCC (сукцинимидил-4- (малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат) и SATA (N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат). Иллюстративный протокол для образования гомодимеров антител описан в Ghetie et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 7509-7514, 1997). Гомодимеры антител можно превратить в гомодимеры Fab’2 путем расщепления пепсином. Другой способ образования гомодимеров антител заключается в использовании аутофильного пептида T15, описанного в Zhao et al. (J. Immunol. 25: 396-404, 2002).
В некоторых вариантах осуществления полиспецифическое антитело представляет собой биспецифическое антитело. Биспецифические антитела могут быть получены путем конструирования интерфейса между парой молекул антител, чтобы максимизировать процент гетеродимеров, которые извлекают из культуры рекомбинантных клеток. Например, интерфейс может содержать, по меньшей мере, часть домена СН3 константного домена антитела. В этом методе одна или более небольших боковых цепей аминокислот из интерфейса первой молекулы антитела заменяются более крупными боковыми цепями (например, тирозином или триптофаном). Компенсирующие «полости» идентичного или сходного размера с крупной боковой цепью (цепями) создаются в интерфейсе второй молекулы антитела путем замены крупных боковых цепей аминокислот меньшими (например, аланином или треонином). Это обеспечивает механизм повышения выхода гетеродимера по отношению к другим нежелательным конечным продуктам, таким как гомодимеры. Этот метод описан, например, в WO 96/27011, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Биспецифические антитела включают сшитые или «гетероконъюгатные» антитела. Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть связано с авидином, а другое - с биотином. Гетероконъюгатные антитела также могут быть получены с использованием любых удобных способов сшивки. Подходящие сшивающие агенты и методы сшивания хорошо известны в данной области и раскрыты в Патенте США № 4676980, который включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Способы получения биспецифических антител из фрагментов антител также известны в данной области. Например, биспецифические антитела могут быть получены с использованием химической связи. Brennan et al. (Science 229: 81, 1985) описывают процедура, при которой интактные антитела протеолитически расщепляются с образованием F(ab')2-фрагментов. Эти фрагменты восстанавливаются в присутствии дитиольного комплексообразующего агента арсенита натрия и предотвращают образование межмолекулярных дисульфидных связей. Полученные Fab'-фрагменты затем превращаются в производные тионитробензоата (TNB). Затем одно из производных Fab' TNB превращается в Fab' тиол путем восстановления меркаптоэтиламином и смешивается с эквимолярным количеством другого производного Fab' TNB с образованием биспецифического антитела.
Любое из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, может быть конъюгировано со стабилизирующей молекулой (например, с молекулой, которая увеличивает период полужизни антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в организме пациента или в растворе). Неограничивающие примеры стабилизирующих молекул включают: полимер (например, полиэтиленгликоль) или белок (например, сывороточный альбумин, такой как сывороточный альбумин человека). Конъюгация стабилизирующей молекулы может увеличивать период полужизни или увеличивать биологическую активность антитела или антигенсвязывающего фрагмента in vitro (например, в культуре ткани или при хранении в виде фармацевтической композиции) или in vivo (например, в организме человека).
В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, могут быть конъюгированы с терапевтическим агентом. Конъюгат антитело-лекарственное средство, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, может ковалентно или нековалентно связываться с терапевтическим агентом. В некоторых вариантах осуществления терапевтический агент представляет собой цитотоксический или цитостатический агент (например, цитохалазин B, грамицидин D, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрацин, майтансиноиды такие как DM -1 и DM-4, дион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол, пуромицин, эпирубицин, циклофосфамид и аналоги).
Характеристики антител
Описанные в настоящем документе антитела или их антигенсвязывающие фрагменты могут блокировать связывание между лигандами CD40 и CD40 (например, CD154).
Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, как описано в настоящем документе, могут быть агонистами или антагонистами CD40. В некоторых вариантах осуществления изобретения путем связывания с CD40 антитело может ингибировать сигнальный путь CD40. В некоторых вариантах осуществления антитело может усиливать иммунный ответ или подавлять иммунный ответ.
В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, как описано в настоящем документе, могут увеличивать иммунный ответ, активность или количество иммунных клеток (например, Т-лимфоцитов, CD8+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток, макрофагов, антигенпрезентирующих клеток) по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, в 2 раза, 3 раза, 5 раз, 10 раз или в 20 раз. В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, как описано в настоящем документе, могут снижать активность или количество иммунных клеток (например, Т-клеток, CD8+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток, макрофагов, антигенпрезентирующих клеток) по меньшей мере на 10%. 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, в 2 раза, 3 раза, 5 раз, 10 раз или в 20 раз.
В некоторых реализациях антитело (или его антигенсвязывающие фрагменты) специфически связывается с CD40 (например, CD40 человека, CD40 обезьяны (например, макаки-резус, Macaca fascicularis), CD40 мыши и/или химерного CD40) со скоростью диссоциации (koff) менее чем 0,1 с-1, менее чем 0,01 с-1, менее чем 0,001 с-1, менее чем 0,0001 с-1 или менее чем 0,00001 с-1. В некоторых вариантах осуществления скорость диссоциации (koff) составляет более чем 0,01 с-1, более чем 0,001 с-1, более чем 0,0001 с-1, более чем 0,00001 с-1 или более чем 0,000001 с-1.
В некоторых вариантах осуществления скорость кинетической ассоциации (kon) составляет более чем 1×102/Mс, более чем 1×103/Mс, более чем 1×104/Mс, более чем 1×105/Mс или более чем 1×106/Mс. В некоторых вариантах осуществления изобретения скорость кинетической ассоциации (kon) составляет менее чем 1×105/Mс, менее чем 1×106/Mс или менее чем 1×107/Mс.
Аффинности можно вывести из отношения кинетических констант скорости (KD=koff/kon). В некоторых вариантах осуществления KD составляет менее чем 1×10-6 M, менее чем 1×10-7 M, менее чем 1×10-8 M, менее чем 1×10-9 M или менее чем 1×10-10 М. В некоторых вариантах осуществления KD составляет менее чем 50 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 15 нМ, 10 нМ, 9 нМ, 8 нМ, 7 нМ, 6 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ или 1 нМ. В некоторых вариантах осуществления KD составляет более чем 1×10-7 M, более чем 1×10-8 M, более чем 1×10-9 M, более чем 1×10-10 M, более чем 1×10-11 M или более 1×10-12 М. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с CD40 человека с KD, составляющей менее чем или равной примерно 6 нМ.
Общие методы измерения аффинности антитела к антигену включают, например, ИФА, RIA и поверхностный плазмонный резонанс (SPR). В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с CD40 человека (SEQ ID NO:26), CD40 обезьяны (например, CD40 макаки-резуса, SEQ ID NO:28), химерным CD40 (SEQ ID NO:29) и/или CD40 мыши (SEQ ID NO:27). В некоторых вариантах осуществления антитело не связывается с CD40 человека (SEQ ID NO:26), CD40 обезьяны (например, CD40 макаки-резуса, SEQ ID NO:28; CD40 яванской макаки), химерным CD40 (SEQ ID NO:29) и/или CD40 мыши (SEQ ID NO:27).
В некоторых вариантах осуществления определяют термическую стабильность. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты, как описано в настоящем документе, могут иметь Tm более чем 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 или 95 °C. В некоторых вариантах осуществления Tm составляет менее чем 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 или 95°C.
В некоторых вариантах осуществления антитело имеет процент ингибирования роста опухоли (TGI%), который составляет более чем 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% или 200%. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет процент ингибирования роста опухоли, который составляет менее чем 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% или 200%. TGI% может быть определен, например, через 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 дней после начала лечения или через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев после начала лечения. Используемый в настоящем описании процент ингибирования роста опухоли (TGI%) рассчитывается по следующей формуле:
TGI (%) = [1- (Ti-T0)/(Vi-V0)] × 100
Ti представляет собой средний объем опухоли в группе обработки в день i. T0 представляет собой средний объем опухоли в группе обработки в нулевой день. Vi представляет собой средний объем опухоли в контрольной группе в день i. V0 представляет собой средний объем опухоли в контрольной группе в нулевой день.
В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, являются антагонистами CD40. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты снижают передачу сигнала CD40 в клетке-мишени, которая экспрессирует CD40.
В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут усиливать функцию APC (например, клеток DC), например, индуцируя поверхностную экспрессию костимулирующих молекул и молекул MHC, индуцируя продуцирование провоспалительных цитокинов и/или усиливая Т-клеточную активацию.
В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут связываться с опухолевыми клетками, экспрессирующими CD40. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут индуцировать опосредованную комплементом цитотоксичность (CMC) и/или антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и уничтожать опухолевую клетку.
В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты имеют функциональную область Fc. В некоторых вариантах осуществления эффекторная функция функциональной области Fc представляет собой антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC). В некоторых вариантах осуществления эффекторной функцией функциональной области Fc является фагоцитоз. В некоторых вариантах осуществления эффекторной функцией функциональной области Fc является ADCC и фагоцитоз.
В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут индуцировать опосредованную комплементом цитотоксичность (CMC).
В некоторых вариантах осуществления область Fc представляет собой IgG1 человека, IgG2 человека, IgG3 человека или IgG4 человека.
В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты не имеют функциональной области Fc. Например, антитела или антигенсвязывающие фрагменты представляют собой фрагменты Fab, Fab’, F(ab’)2 и Fv. В некоторых вариантах осуществления область Fc имеет мутации LALA (мутации L234A и L235A в нумерации EU) или мутации LALA-PG (мутации L234A, L235A, P329G в нумерации EU).
Способы получения антител против CD40
Выделенный фрагмент CD40 человека можно использовать в качестве иммуногена для генерации антител с использованием стандартных методик получения поликлональных и моноклональных антител. Поликлональные антитела могут быть получены у животных путем множества инъекций (например, подкожных или внутрибрюшинных инъекций) антигенного пептида или белка. В некоторых вариантах осуществления антигенный пептид или белок инъецируют по меньшей мере с одним адъювантом. В некоторых вариантах осуществления антигенный пептид или белок можно конъюгировать с агентом, который является иммуногенным для видов, которые должны быть иммунизированы. Животным можно вводить антигенный пептид или белок более одного раза (например, два, три или четыре раза).
Можно использовать полноразмерный полипептид или белок или, в качестве альтернативы, можно использовать их антигенные пептидные фрагменты в качестве иммуногенов. Антигенный пептид белка содержит по меньшей мере 8 (например, по меньшей мере 10, 15, 20 или 30) аминокислотных остатков аминокислотной последовательности CD40 и охватывает эпитоп белка, так что антитело, индуцированное против пептида, образует специфический иммунный комплекс с белком. Как описано выше, полноразмерная последовательность человеческого CD40 известна в данной области (SEQ ID NO:26).
Иммуноген обычно используется для получения антител путем иммунизации подходящего индивидуума (например, человека или трансгенного животного, экспрессирующего по меньшей мере один локус иммуноглобулина человека). Подходящий иммуногенный препарат может содержать, например, рекомбинантно экспрессируемый или химически синтезированный полипептид (например, фрагмент CD40 человека). Препарат может дополнительно включать адъювант, такой как полный или неполный адъювант Фрейнда, или подобный иммуностимулирующий агент.
Поликлональные антитела могут быть получены, как описано выше, путем иммунизации подходящего индивидуума полипептидом CD40 или его антигенным пептидом (например, частью CD40) в качестве иммуногена. Титр антител у иммунизированного индивидуума можно контролировать с течением времени стандартными методами, такими как иммуноферментный анализ (ИФА) с использованием иммобилизованного полипептида или пептида CD40. При желании молекулы антител могут быть выделены из млекопитающего (например, из крови) и дополнительно очищены хорошо известными методами, такими как хроматография на протеине A, протеине G, для получения фракции IgG. В подходящее время после иммунизации, например, когда титры специфических антител являются наивысшими, у индивидуума можно получить продуцирующие антитела клетки и использовать их для получения моноклональных антител стандартными методами, такими как гибридомный метод, первоначально описанный Kohler et al. (Nature 256: 495-497, 1975), метод гибридомы B-клеток человека (Kozbor et al., Immunol. Сегодня 4:72, 1983), метод EBV-гибридомы (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., стр. 77-96, 1985), или метод триомы. Технология получения гибридом хорошо известна (см., в целом Current Protocols in Immunology, 1994, Coligan et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). Клетки гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, выявляют путем скрининга супернатантов гибридомной культуры на антитела, которые связывают интересующий полипептид или эпитоп, например, с использованием стандартного анализа ИФА.
Варианты антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, могут быть получены путем введения соответствующих нуклеотидных изменений в ДНК, кодирующую человеческое, гуманизированное или химерное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в настоящем документе, или путем пептидного синтеза. Такие варианты включают, например, делеции, вставки или замены остатков в аминокислотных последовательностях, которые составляют антигенсвязывающий сайт антитела или антигенсвязывающий домен. В популяции таких вариантов некоторые антитела или антигенсвязывающие фрагменты будут иметь повышенную аффинность к белку-мишени, например, CD40. Любая комбинация делеций, вставок и/или комбинации могут быть сделаны для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, который обладает повышенной аффинностью связывания с мишенью. Аминокислотные замены, введенные в антитело или антигенсвязывающий фрагмент, также могут изменять или вводить новые посттрансляционные модификации в антитело или антигенсвязывающий фрагмент, такие как изменение (например, увеличение или уменьшение) количества сайтов гликозилирования, изменение типа сайта гликозилирования (например, изменение аминокислотной последовательности таким образом, что другой сахар присоединяется ферментами, присутствующими в клетке) или введение новых сайтов гликозилирования.
Антитела, раскрытые в настоящем описании, могут быть получены из любых видов животных, включая млекопитающих. Неограничивающие примеры природных антител включают антитела с происхождением от людей, приматов, например, обезьян и человекообразных обезьян, коров, свиней, лошадей, овец, верблюдовых (например, верблюдов и лам), кур, коз и грызунов (например, крыс, мышей, хомяков и кроликов), включая трансгенных грызунов, генетически сконструированных для производства человеческих антител.
Человеческие и гуманизированные антитела включают антитела, имеющие вариабельные и константные области, полученные из (или имеющие ту же аминокислотную последовательность, что и у полученной последовательности) последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Антитела человека могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, введенные случайным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или соматической мутацией in vivo), например, в CDR.
Гуманизированное антитело, как правило, имеет человеческий каркас (FR), трансплантированные CDR, не являющиеся человеческими. Таким образом, гуманизированное антитело имеет одну или более аминокислотных последовательностей, введенных в него из источника, который не является человеком. Эти аминокислотные остатки, не являющиеся человеческими, часто называют «импортными» остатками, которые обычно берут из «импортного» вариабельного домена. Гуманизация может быть в основном выполнена, например, путем замены CDR или последовательностей CDR грызунов на соответствующие последовательности человеческого антитела. Эти методы описаны, например, в Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988); каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Соответственно, «гуманизированные» антитела представляют собой химерные антитела, в которых по существу меньше, чем интактный человеческий V-домен, заменен соответствующей последовательностью из вида, отличного от человека. На практике гуманизированные антитела обычно представляют собой антитела мыши, в которых некоторые остатки CDR и некоторые остатки FR заменены остатками из аналогичных сайтов в антителах человека.
Выбор человеческих доменов VH и VL для использования при создании гуманизированных антител очень важен для снижения иммуногенности. В соответствии с так называемым методом «наилучшего соответствия» последовательность V-домена мышиного антитела подвергается скринингу против всей библиотеки известных последовательностей человеческого домена. Последовательность человека, наиболее близкая к последовательности мыши, затем принимается в качестве FR человека для гуманизированного антитела (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Биол., 196: 901 (1987)).
Кроме того, важно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокой специфичности и аффинности к антигену и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели гуманизированные антитела могут быть получены путем анализа родительских последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные иммуноглобулиновые модели широко доступны и хорошо знакомы специалистам в данной области. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных кандидатных иммунглобиновых последовательностей. Просмотр этих выведенных данных позволяет анализировать вероятную роль некоторых остатков в функционировании кандидатной иммуноглобулиновой последовательности, т.е. проводить анализ остатков, которые влияют на способность кандидатного иммуноглобулина связываться с антигеном. Таким образом, FR-остатки могут быть выбраны и объединены из реципиента и импортируемых последовательностей так, чтобы достигалась целевая характеристика антитела, такая как повышенная аффинность к целевому антигену.
Обычно варианты аминокислотной последовательности человеческого, гуманизированного или химерного антитела против CD40 будут содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью, присутствующей в легкой или тяжелой цепи исходного антитела.
Идентичность или гомология в отношении исходной последовательности обычно представляет собой процент аминокислотных остатков, присутствующих в кандидатной последовательности, которые идентичны последовательности, присутствующей в человеческом, гуманизированном или химерном антителе против CD40 или в его фрагменте, после выравнивания последовательностей и введения пробелов, если необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности последовательности, и без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательности.
Могут быть сделаны дополнительные модификации антител против CD40 или антигенсвязывающих фрагментов. Например, остаток(остатки) цистеина может быть введен в Fc-область, тем самым обеспечивая образование межцепочечной дисульфидной связи в этой области. Полученное таким образом гомодимерное антитело может иметь любое увеличенное время полужизни in vitro и/или in vivo. Гомодимерные антитела с увеличенным периодом полужизни in vitro и/или in vivo также могут быть получены с использованием гетеробифункциональных сшивающих агентов, как описано, например, в Wolff et al. (Cancer Res. 53: 2560-2565, 1993). В качестве альтернативы можно сконструировать антитело, которое имеет двойные Fc-области (см., например, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230, 1989).
В некоторых вариантах осуществления ковалентная модификация может быть выполнена для антитела против CTLA4 или его антигенсвязывающего фрагмента. Эти ковалентные модификации могут быть сделаны химическим или ферментативным синтезом или ферментативным или химическим расщеплением. Другие типы ковалентных модификаций антитела или фрагмента антитела вводятся в молекулу путем взаимодействия целевых аминокислотных остатков антитела или фрагмента с органическим дериватизирующим агентом, который способен реагировать с выбранными боковыми цепями или N- или C-концевыми остатками.
В некоторых вариантах осуществления представлены варианты антител, имеющие углеводную структуру, в которой отсутствует фукоза, присоединенная (прямо или косвенно) к Fc-области. Например, количество фукозы в таком антителе может составлять от 1% до 80%, от 1% до 65%, от 5% до 65% или от 20% до 40%. Количество фукозы определяется путем расчета среднего количества фукозы в сахарной цепи в Asn297 относительно суммы всех гликоструктур, присоединенных к Asn 297 (например, сложных, гибридных и высокоманнозных структур), как измерено с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF, как описано, например, в WO 2008/077546. Asn297 относится к остатку аспарагина, находящемуся примерно в положении 297 в Fc-области (нумерация Eu остатков Fc-области; или положение 314 в нумерации Kabat); однако Asn297 может также располагаться примерно на ± 3 аминокислоты выше или ниже положения 297, то есть между положениями 294 и 300, из-за незначительных вариаций последовательности в антителах. Такие варианты фукозилирования могут иметь улучшенную функцию ADCC. В некоторых вариантах осуществления для уменьшения гетерогенности гликанов Fc-область антитела может быть дополнительно сконструирована для замены аспарагина в положении 297 на аланин (N297A).
В некоторых вариантах осуществления для повышения эффективности продукции за счет предотвращения обмена Fab-плеча область Fc антител была дополнительно сконструирована для замены серина в положении 228 (нумерация ЕС) IgG4 на пролин (S228P). Подробное описание мутации S228 описано, например, в Silva et al. «The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG4 Fab-arm exchange as demonstrated using a combination of novel quantitative immunoassays and physiological matrix preparation.» Journal of Biological Chemistry 290.9 (2015): 5462-5469, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Рекомбинантные векторы
Настоящее раскрытие также относится к рекомбинантным векторам (например, экспрессирующим векторам), которые включают выделенный полинуклеотид, раскрытый в настоящем документе (например, полинуклеотид, кодирующий полипептид, раскрытый в настоящем документе), клетки-хозяева, в которые вводят рекомбинантные векторы (т.е. такие, что клетки-хозяева содержат полинуклеотид и/или вектор, содержащий полинуклеотид), и продуцирование полипептидов рекомбинантных антител или их фрагментов с помощью рекомбинантных методов.
Используемый в настоящем описании термин «вектор» представляет собой любую конструкцию, способную доставлять один или более представляющих интерес полинуклеотидов в клетку-хозяин, когда вектор вводится в клетку-хозяин. «Экспрессирующий вектор» способен доставлять и экспрессировать один или более представляющих интерес полинуклеотидов в виде кодируемого полипептида в клетке-хозяине, в которую был введен экспрессирующий вектор. Таким образом, в экспрессирующем векторе интересующий полинуклеотид располагается для экспрессии в векторе, будучи функционально связанным с регуляторными элементами, такими как промотор, энхансер и/или поли-А-хвост, либо внутри вектора, либо в геноме клетки-хозяин находится в сайте интеграции или примерно него или фланкирует сайт интеграции интересующего полинуклеотида, так что интересующий полинуклеотид будет транслироваться в клетке-хозяине, в которую вводили экспрессирующий вектор.
Вектор можно ввести в клетку-хозяина способами, известными в данной области, например, электропорацией, химической трансфекцией (например, DEAE-декстраном), трансформацией, трансфекцией и инфицированием и/или трансдукцией (например, с использованием рекомбинантного вируса). Таким образом, неограничивающие примеры векторов включают вирусные векторы (которые можно использовать для генерирования рекомбинантного вируса), депротеинизированную ДНК или РНК, плазмиды, космиды, фаговые векторы и экспрессирующие векторы ДНК или РНК, связанные с катионными конденсирующими агентами.
В некоторых реализациях описанный в настоящем документе полинуклеотид (например, полинуклеотид, кодирующий описанный в настоящем документе полипептид) вводится с использованием системы вирусной экспрессии (например, вируса коровьей оспы или другого вируса оспы, ретровируса или аденовируса), которая может включать использование непатогенного (дефектного) вируса, способного к репликации, или может использовать вирус с дефектом репликации. В последнем случае размножение вируса обычно происходит только в дополняющих клетках, упаковывающих вирус. Подходящие системы раскрыты, например, в Fisher-Hoch et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 317-321; Flexner et al., 1989, Ann. N.Y. Acad Sci. 569:86-103; Flexner et al., 1990, Vaccine, 8:17-21; Пат. США No. 4603112, 4769330, и 5017487; WO 89/01973; Пат. США № 4777127; GB 2 200 651; EP 0,345,242; WO 91/02805; Berkner-Biotechniques, 6: 616-627, 1988; Rosenfeld et al., 1991, Science, 252: 431-434; Kolls et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 215-219; Kass-Eisler et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. США, 90: 11498-11502; Guzman et al., 1993, Circulation, 88: 2838-2848; и Guzman et al., 1993, Cir. Res., 73: 1202-1207. Методы включения ДНК в такие системы экспрессии хорошо известны специалистам в данной области. ДНК также может быть «депротеинизированной», как описано, например, в Ulmer et al., 1993, Science, 259: 1745-1749, и Cohen, 1993, Science, 259: 1691-1692. Поглощение депротеинизированной ДНК может быть увеличено путем нанесения ДНК на биодеградируемые гранулы, которые эффективно транспортируются в клетки.
Для экспрессии вставка ДНК, содержащая полинуклеотид, кодирующий антитело или кодирующий полипептид, описанный в настоящем документе, может быть функционально связан с подходящим промотором (например, гетерологичным промотором), таким как промотор PL фага лямбда, lac, trp и tac промоторы, ранние и поздние промоторы SV40 и промоторы ретровирусных LTR, и это лишь некоторые из них. Другие подходящие промоторы известны специалисту в данной области. Экспрессирующие конструкции могут дополнительно содержать сайты инициации, терминации транскрипции и, в транскрибируемой области, сайт связывания рибосомы для трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессируемых этими конструкциями, может включать в себя кодон инициации трансляции в начале и терминирующий кодон (UAA, UGA или UAG), соответствующим образом расположенный на конце полипептида, подлежащего трансляции.
Как указано, экспрессирующие векторы могут включать по меньшей мере один селектируемый маркер. Такие маркеры включают гены устойчивости к дигидрофолатредуктазе или неомицину для культуры эукариотических клеток и гены устойчивости к тетрациклину или ампициллину для культивирования в E.coli и других бактериях. Репрезентативные примеры подходящих хозяев включают, но не ограничиваются ими, бактериальные клетки, такие как клетки E.coli, Streptomyces и Salmonella typhimurium; грибные клетки, такие как дрожжевые клетки; клетки насекомых, такие как клетки Drosophila S2 и Spodoptera Sf9; животные клетки, такие как клетки СНО, COS, меланомы Bowes и клетки HK 293; и растительные клетки. Подходящие культуральные среды и условия для клеток-хозяев, описанные в настоящем документе, известны в данной области.
Неограничивающие векторы для использования в бактериях включают pQE70, pQE60 и pQE-9, доступные от Qiagen; векторы pBS, векторы Phagescript, векторы Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, доступные от Stratagene; и ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, доступные от Pharmacia. Неограничивающие эукариотические векторы включают pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 и pSG, доступные от Stratagene; и pSVK3, pBPV, pMSG и pSVL, доступные от Pharmacia. Другие подходящие векторы будут очевидны для специалиста.
Неограничивающие бактериальные промоторы, подходящие для использования, включают промоторы E.coli lacI и lacZ, промоторы T3 и T7, промотор gpt, промоторы лямбда PR и PL и промотор trp. Подходящие эукариотические промоторы включают немедленный ранний промотор CMV, промотор тимидинкиназы HSV, ранний и поздний промоторы SV40, промоторы ретровирусных LTR, такие как промоторы вируса саркомы Рауса (RSV), и промоторы металлотионеина, такие как промотор металлотионеина-I мыши.
В дрожжах Saccharomyces cerevisiae может быть использован ряд векторов, содержащих конститутивные или индуцируемые промоторы, такие как промоторы альфа-фактора, алкогольоксидазы и PGH. Для обзоров см. Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, и Grant et al., Methods Enzymol., 153: 516-544 (1997).
Введение конструкции в клетку-хозяина может осуществляться кальцийфосфатной трансфекцией, трансфекцией, опосредованной DEAE-декстраном, трансфекцией, опосредованной катионными липидами, электропорацией, трансдукцией, инфекцией или другими методами. Такие методы описаны во многих стандартных лабораторных руководствах, таких как Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986), которые включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Транскрипция ДНК, кодирующей антитело по настоящему изобретению, высшими эукариотами может быть увеличена путем введения энхансерной последовательности в вектор. Энхансеры являются cis-действующими элементами ДНК, обычно примерно от 10 до 300 п.н., которые действуют повышая транскрипционную активность промотора в данном типе хозяйских клеток. Примеры энхансеров включают энхансер SV40, который расположен в участке позднего начала репликации на расстоянии 100-270 п.н., энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на участке позднего начала репликации и энхансеры аденовируса.
Для секреции транслированного белка в межклеточное пространство эндоплазматического ретикулума, в периплазматическое пространство или во внеклеточную среду соответствующие сигналы секреции могут быть включены в экспрессированный полипептид. Сигналы могут быть эндогенными по отношению к полипептиду или могут быть гетерологичными сигналами.
Полипептид (например, антитело) может экспрессироваться в модифицированной форме, такой как гибридный белок (например, GST-гибрид) или с гистидиновой меткой, и может включать не только сигналы секреции, но также дополнительные гетерологичные функциональные области. Например, область дополнительных аминокислот, в частности заряженных аминокислот, может быть добавлена к N-концу полипептида для улучшения стабильности и устойчивости в клетке-хозяине, во время очистки или во время последующей обработки и хранения. Также пептидные фрагменты могут быть добавлены к полипептиду для облегчения очистки. Такие области могут быть удалены до конечного получения полипептида. Добавление пептидных фрагментов к полипептидам для того чтобы вызвать секрецию или экскрецию, чтдля улучшения стабильности и облегчения очистки, среди прочего, являются известными и обычными методами в данной области.
Способы лечения
Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему раскрытию можно использовать для различных терапевтических целей.
В одном аспекте раскрытие относится к способам лечения онкологического заболевания у пациента, способам снижения скорости увеличения объема опухоли у пациента с течением времени, способам снижения риска развития метастазирования или способам снижения риска развития дополнительного метастазирования у пациента. В некоторых вариантах осуществления лечение может останавливать, замедлять, тормозить или ингибировать прогрессирование онкологического заболевания. В некоторых вариантах осуществления лечение может приводить к уменьшению количества, тяжести и/или продолжительности одного или более симптомов онкологического заболевания у пациента.
В одном аспекте в раскрытии представлены способы, которые включают введение терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, раскрытого в настоящем документе, пациенту, который в этом нуждается (например, пациенту, который имеет онкологическое заболевание, у которого идентифицировано или диагностировано онкологическое заболевание), например, рак молочной железы (например, трижды негативный рак молочной железы), карциноидный рак, рак шейки матки, рак эндометрия, глиому, рак головы и шеи, рак печени, рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, лимфому, меланому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, колоректальный рак, рак желудка, рак яичек, рак щитовидной железы, рак мочевого пузыря, рак уретры или гемобластозы. В некоторых вариантах осуществления онкологическое заболевание представляет собой неоперабельную меланому или метастатическую меланому, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), мелкоклеточный рак легкого (SCLC), рак мочевого пузыря или метастатический гормонорезистентный рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления у пациента имеется солидная опухоль. В некоторых вариантах осуществления онкологическое заболевание представляет собой плоскоклеточную карциному головы и шеи (SCCHN), почечно-клеточную карциному (RCC), трижды негативный рак молочной железы (TNBC) или колоректальную карциному. В некоторых вариантах осуществления у пациента имеется лимфома Ходжкина. В некоторых вариантах осуществления у пациента имеется трижды негативный рак молочной железы (TNBC), рак желудка, уротелиальный рак, карцинома из клеток Меркеля или рак головы и шеи. В некоторых вариантах осуществления онкологическое заболевание представляет собой меланому, карциному поджелудочной железы, мезотелиому, гемобластозы, особенно неходжкинскую лимфому, лимфому, хронический лимфоцитарный лейкоз или солидные опухоли на поздней стадии.
В некоторых вариантах осуществления композиции и способы, раскрытые в настоящем описании, можно использовать для лечения пациентов с риском развития онкологического заболевания. Пациентов, имеющих онкологические заболевания, можно идентифицировать различными способами, известными в данной области.
В одном аспекте раскрытие относится к способам лечения, предотвращения или снижения риска развития расстройств, связанных с аномальным или нежелательным иммунным ответом, например, аутоиммунным расстройством, например, путем воздействия на функциональные свойства клеток APC (например, путем блокирование взаимодействия между CD40 и CD40L). Эти аутоиммунные заболевания включают, но не ограничиваются ими, очаговую алопецию, волчанку, анкилозирующий спондилит, болезнь Меньера, антифосфолипидный синдром, смешанное заболевание соединительной ткани, аутоиммунную болезнь Аддисона, рассеянный склероз, аутоиммунную гемолитическую анемию, миастению гравис, аутоиммунный гепатит, пузырчатку обыкновенную, болезнь Бехчета, пернициозную анемию, буллезный пемфигоид, узелковый полиартериит, кардиомиопатию, полихондрит, целиакия-спру-дерматит, полигландулярные синдромы, синдром хронической усталости (CFIDS), ревматическую полимиалгию, хронический воспалительный демиелинизирующий полимиозит и дерматомиозит, хроническую воспалительную полиневропатию, первичную агаммаглобулинемию, синдром Чарга-Стросса, первичный билиарный цирроз, рубцующийся пемфигоид, псориаз, синдром CREST, феномен Рейно, болезнь холодовых агглютининов, синдром Рейтера, болезнь Крона, ревматический полиартрит, дискоидную волчанку, ревматоидный артрит, криоглобулинемию, саркоидоз, фибромиалгию, склеродермию, болезнь Грейвса, синдром Сергена, синдром Гийена-Барре, синдром скованного человека, тиреоидит Хашимото, артериит Такаясу, идиопатический фиброз легких, височный артериит/гигантоклеточный артериит, идиопатическую тромбоцитопению пурпура (ИТП), язвенный колит, например, нефропатию IgA, увеит, диабет I типа (например), васкулит, красный плоский лишай и витилиго. Антитела против CD40 или их антигенсвязывающие фрагменты также можно вводить пациенту для лечения, предотвращения или снижения риска развития расстройств, связанных с аномальным или нежелательным иммунным ответом, связанным с трансплантацией клеток, тканей или органов, например, с трансплантацией почки, печени и сердца, например, болезнь трансплантат против хозяина (GVHD), или для предотвращения отторжения аллотрансплантата. В некоторых вариантах осуществления пациент страдает болезнью Крона, язвенным колитом или диабетом 1 типа.
Используемый в настоящем описании термин «эффективное количество» означает количество или дозировку, достаточную для достижения полезных или желаемых результатов, включая остановку, замедление, задержку или ингибирование прогрессирования заболевания, например, аутоиммунного заболевания или онкологического заболевания. Эффективное количество будет варьироваться в зависимости, например, от возраста и массы тела пациента, которому следует вводить антитело, антигенсвязывающий фрагмент, полинуклеотид, кодирующий антитело, вектор, содержащий полинуклеотид, и/или их композиции, в зависимости от степени тяжести симптомов и пути введения, и, таким образом, введение можно определить в индивидуальном порядке.
Эффективное количество может вводиться посредством одного или более введений. Например, эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента представляет собой количество, достаточное для улучшения, остановки, стабилизации, обращения вспять, ингибирования, замедления и/или задержки прогрессирования аутоиммунного заболевания или онкологического заболевания у пациента, или количество, достаточное для улучшения, остановки, стабилизации, обращения вспять, замедления и/или задержки пролиферации клетки (например, клетки, подвергшейся биопсии, любой из опухолевых клеток, описанных в настоящем документе, или линии клеток (например, опухолевой клеточной линии)) in vitro. Как понятно в данной области, эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента может варьироваться в зависимости, в частности, от истории болезни пациента, а также от других факторов, таких как тип (и/или дозировка) используемого антитела.
Эффективные количества и схемы введения антител, полинуклеотидов, кодирующих антитела, и/или композиций, раскрытых в настоящем описании, могут быть определены эмпирически, и такие определения в компетенции специалистов в данной области. Специалистам в данной области будет понятно, что дозировка, которая должна быть введена, будет варьироваться в зависимости, например, от млекопитающего, которое получает антитела, полинуклеотиды, кодирующие антитела, и/или композиции, раскрытые в настоящем описании, от пути введения, конкретного типа используемых антител, полинуклеотидов, кодирующих антитела, антигенсвязывающих фрагментов и/или композиций, раскрытых в настоящем описании, и других лекарственных средств, вводимых млекопитающему. Руководство по выбору подходящих доз для антитела или антигенсвязывающего фрагмента можно найти в литературе по терапевтическому применению антител и антигенсвязывающих фрагментов, например, Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., Eds., Noges Publications, Park Ridge, NJ, 1985, гл. 22 and pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York, 1977, pp. 365-389.
Типичная суточная доза эффективного количества антитела составляет от 0,01 мг/кг до 100 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления дозировка может составлять менее чем 100 мг/кг, 10 мг/кг, 9 мг/кг, 8 мг/кг, 7 мг/кг, 6 мг/кг, 5 мг/кг, 4 мг/кг, 3 мг/кг, 2 мг/кг, 1 мг/кг, 0,5 мг/кг или 0,1 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления дозировка может составлять более чем 10 мг/кг, 9 мг/кг, 8 мг/кг, 7 мг/кг, 6 мг/кг, 5 мг/кг, 4 мг/кг, 3 мг/кг, 2 мг/кг, 1 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,1 мг/кг, 0,05 мг/кг или 0,01 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления дозировка составляет примерно 10 мг/кг, 9 мг/кг, 8 мг/кг, 7 мг/кг, 6 мг/кг, 5 мг/кг, 4 мг/кг, 3 мг/кг, 2 мг/кг, 1 мг/кг, 0,9 мг/кг, 0,8 мг/кг, 0,7 мг/кг, 0,6 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,2 мг/кг или 0,1 мг/кг.
В любом из способов, описанных в настоящем документе, по меньшей мере одно антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или фармацевтическая композиция (например, любое из антител, антигенсвязывающих фрагментов или фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе) и, необязательно, по меньшей мере, один дополнительный терапевтический агент можно вводить пациенту по меньшей мере один раз в неделю (например, один раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю, четыре раза в неделю, один раз в день, два раза в день или три раза в день). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два разных антитела и/или антигенсвязывающих фрагмента вводят в одной и той же композиции (например, жидкой композиции). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно антитело или антигенсвязывающий фрагмент и по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент вводят в одной и той же композиции (например, жидкой композиции). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно антитело или антигенсвязывающий фрагмент и по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент вводят в двух разных композициях (например, жидкой композиции, содержащей по меньшей мере одно антитело или антигенсвязывающий фрагмент, и твердой пероральной композиции, содержащей хотя бы один дополнительный терапевтический агент). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент вводят в виде пилюли, таблетки или капсулы. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, один дополнительный терапевтический агент вводят в пероральной композиции с замедленным высвобождением.
В некоторых вариантах осуществления один или более дополнительных терапевтических агентов можно вводить пациенту до или после введения по меньшей мере одного антитела, фрагмента антигенсвязывающего антитела или фармацевтической композиции (например, любого из антител, антигенсвязывающих фрагментов антител или фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе). В некоторых вариантах осуществления один или более дополнительных терапевтических агентов и по меньшей мере одно антитело, фрагмент антигенсвязывающего антитела или фармацевтическая композиция (например, любое из антител, фрагментов антигенсвязывающего антитела или фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе) вводят пациенту так, что имеет место перекрывание биоактивного периода одного или более дополнительных терапевтических агентов и по меньшей мере одного антитела или антигенсвязывающего фрагмента (например, любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе) у пациента.
В некоторых вариантах осуществления пациенту можно вводить по меньшей мере одно антитело, фрагмент антигенсвязывающего антитела или фармацевтическую композицию (например, любое из антител, фрагментов антигенсвязывающих антител или фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе) в течение длительного периода времени (например, в течение периода, составляющего по меньшей мере 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года или 5 лет). Квалифицированный медицинский работник может определить продолжительность периода лечения, используя любой из описанных здесь способов для диагностики или отслеживания эффективности лечения (например, наблюдения по меньшей мере одного симптома онкологического заболевания). Как описано в настоящем документе, квалифицированный медицинский работник может также изменить идентичность и количество (например, увеличение или уменьшение) антител или фрагментов антигенсвязывающих антител (и/или одного или нескольких дополнительных терапевтических агентов), вводимых пациенту, а также может регулировать (например, увеличить или уменьшить) дозировку или частоту введения по меньшей мере одного антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела (и/или одного или более дополнительных терапевтических агентов) у пациента на основе оценки эффективности лечения (например, с использованием любого из способов, описанных в настоящем документе и известных в данной области).
В некоторых вариантах осуществления пациенту можно вводить один или более дополнительных терапевтических агентов. Дополнительный терапевтический агент может включать один или более ингибиторов, выбранных из группы, состоящей из ингибитора B-Raf, ингибитора EGFR, ингибитора MEK, ингибитора ERK, ингибитора K-Ras, ингибитора c-Met, ингибитора киназы анапластической лимфомы (ALK), ингибитора фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K), ингибитора Akt, ингибитора mTOR, двойного ингибитора PI3K/mTOR, ингибитора тирозинкиназы Брутона (BTK) и ингибитора изоцитратдегидрогеназы 1 (IDH1) и/или изоцитратдегидрогеназы 2 (IDH2). В некоторых вариантах осуществления дополнительный терапевтический агент представляет собой ингибитор индоламин-2,3-диоксигеназы-1) (IDO1) (например, эпакадостат).
В некоторых вариантах осуществления дополнительный терапевтический агент может включать один или более ингибиторов, выбранных из группы, состоящей из ингибитора HER3, ингибитора LSD1, ингибитора MDM2, ингибитора BCL2, ингибитора CHK1, ингибитора активированного сигнального пути hedgehog, и агента, избирательно разрушающего рецептор эстрогена.
В некоторых вариантах осуществления дополнительный терапевтический агент может включать один или более терапевтических агентов, выбранных из группы, состоящей из трабектина, наб-паклитаксела, требананиба, пазопаниба, цедираниба, пальбоциклиба, эверолимуса, фторпиримидина, IFL, регорафениба, реолизина, алимта, зукадиа, сутента, темсиролимуса, акситиниба, эверолимуса, сорафениба, вотриента, пазопаниба, IMA-901, AGS-003, кабозантиниба, винфлунина, ингибитора Hsp90, Ad-GM-CSF, темазоломида, IL-2, IFNa, винбластина, циклобластина, таломида, дакарбазина, циклофосфамида, леналидомида, азацитидина, леналидомида, бортезомида, амрубицина, карфилзомиба, пралатрексата и энзастаурина.
В некоторых вариантах осуществления дополнительный терапевтический агент может включать один или более терапевтических агентов, выбранных из группы, состоящей из адъюванта, агониста TLR, фактора некроза опухоли (TNF) альфа, IL-1, HMGB1, антагониста IL-10, IL -4, антагонист IL-13, антагониста IL-17, антагониста HVEM, агониста ICOS, лечения, направленного на CX3CL1, лечения, направленного на CXCL9, лечения, направленного на CXCL10, лечения, направленного на CCL5, агониста LFA-1, агониста ICAM1 и агониста селектина.
В некоторых вариантах осуществления пациенту вводят карбоплатин, наб-паклитаксел, паклитаксел, цисплатин, пеметрексед, гемцитабин, FOLFOX или FOLFIRI.
В некоторых вариантах осуществления дополнительный терапевтический агент представляет собой антитело против OX40, антитело против PD-1, антитело против PD-L1, антитело против PD-L2, антитело против LAG-3, антитело против TIGIT, антитело против BTLA, антитело против CTLA-4 или антитело против GITR.
Фармацевтические композиции и пути введения
В настоящем документе также представлены фармацевтические композиции, которые содержат по меньшей мере одно (например, одно, два, три или четыре) антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе. Два или более (например, два, три или четыре) любых антитела или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, могут присутствовать в фармацевтической композиции в любой комбинации. Фармацевтические композиции могут быть приготовлены любым способом, известным в данной области.
Фармацевтические композиции приготовлены таким образом, чтобы они были совместимы с предполагаемым путем введения (например, внутривенным, внутриартериальным, внутримышечным, внутрикожным, подкожным или внутрибрюшинным). Композиции могут включать стерильный разбавитель (например, стерильную воду или физиологический раствор), нелетучее масло, полиэтиленгликоль, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители, антибактериальные или противогрибковые агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены, хлорбутанол, фенол, аскорбиновая кислота, тимеросал и тому подобное, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия, хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота, буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и изотонические агенты, такие как сахара (например, декстроза), многоатомные спирты (например, маннит или сорбит) или соли (например, хлорид натрия) или любую их комбинацию. Липосомные суспензии также можно использовать в качестве фармацевтически приемлемых носителей (см., например, Патент № 4522811). Препараты композиций могут быть приготовлены и заключены в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы с многократными дозами. При необходимости (как, например, в инъецируемых составах) надлежащая текучесть может поддерживаться, например, путем использования покрытия, такого как лецитин или поверхностно-активное вещество. Абсорбция антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может быть продлена путем включения агента, замедляющего абсорбцию (например, моностеарата алюминия и желатина). Альтернативно, контролируемое высвобождение может быть достигнуто с помощью имплантатов и микрокапсулированных систем доставки, которые могут включать биоразлагаемые, биосовместимые полимеры (например, этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевую кислоту, коллаген, полиортоэфиры и полимолочную кислоту; Alza Corporation и Nova Pharmaceutical, Inc.).
Композиции, содержащие одно или более из любых антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, могут быть прготовлены для парентерального (например, внутривенного, внутриартериального, внутримышечного, внутрикожного, подкожного или внутрибрюшинного) введения в виде стандартной лекарственной формы (т.е. физически дискретных единиц, содержащих заранее определенное количество активного соединения для простоты введения и единообразия дозировки).
Токсичность и терапевтическая эффективность композиций можно определить стандартными фармацевтическими процедурами на культурах клеток или экспериментальных животных (например, обезьянах). Можно, например, определить LD50 (доза, летальная для 50% популяции) и ED50 (доза, терапевтически эффективная для 50% популяции): терапевтический индекс представляет собой соотношение LD50: ED50. Агенты, которые демонстрируют высокие терапевтические индексы, являются предпочтительными. Если агент проявляет нежелательный побочный эффект, следует проявлять осторожность, чтобы минимизировать потенциальный ущерб (т.е. уменьшить нежелательные побочные эффекты). Токсичность и терапевтическая эффективность могут быть определены другими стандартными фармацевтическими процедурами.
Данные, полученные из анализов клеточных культур и исследований на животных, могут быть использованы для определения подходящей дозировки любого данного агента для использования у пациента (например, человека). Терапевтически эффективное количество одного или более (например, одного, двух, трех или четырех) антител или их антигенсвязывающих фрагментов (например, любого из антител или фрагментов антител, описанных в настоящем документе) будет количеством, которое лечит заболевание (например, уничтожает опухолевые клетки) у пациента (например, у пациента-человека, идентифицированного как имеющего онкологическое заболевание), или у пациента, идентифицированного как подверженного риску развития заболевания (например, у пациента, у которого ранее развилось онкологическое заболевание, но теперь он был излечен), снижает тяжесть, частоту и/или продолжительность одного или более симптомов заболевания у пациента (например, человека). Эффективность и дозировка любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, может быть определена специалистом здравоохранения или ветеринаром с использованием методов, известных в данной области, а также путем наблюдения одного или более симптомов заболевания у пациента (например, человека). Определенные факторы могут влиять на дозировку и время, необходимые для эффективного лечения пациента (например, тяжесть заболевания или расстройства, предыдущее лечение, общее состояние здоровья и/или возраст пациента, а также наличие других заболеваний).
Типичные дозы включают количество в миллиграммах или микрограммах любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, на килограмм веса пациента (например, от примерно 1 мкг/кг до примерно 500 мг/кг; от примерно 100 мкг/кг до примерно 500 мг/кг); от примерно 100 мкг/кг до примерно 50 мг/кг; от примерно 10 мкг/кг до примерно 5 мг/кг; от примерно 10 мкг/кг до примерно 0,5 мг/кг; или от примерно 1 мкг/кг до примерно 50 мкг/кг). Хотя эти дозы охватывают широкий диапазон, специалист в данной области поймет, что терапевтические агенты, включая антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, различаются по своей эффективности, и эффективные количества могут быть определены способами, известными в данной области. Как правило, сначала вводят относительно низкие дозы, а лечащий врач или ветеринарный врач (в случае терапевтического применения) или исследователь (на стадии разработки) могут впоследствии и постепенно увеличивать дозу до соответствующего получаемого ответа. Кроме того, подразумевается, что конкретный уровень дозы для любого конкретного пациента будет зависеть от множества факторов, включая активность конкретного используемого соединения, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и рацион питания пациента, время введения, путь введения, скорость выведения и время полужизни антитела или фрагмента антитела in vivo.
Фармацевтические композиции могут быть включены в контейнер, упаковку или дозатор вместе с инструкциями для введения. Раскрытие также относится к способам производства антител или их антигенсвязывающих фрагментов для различных применений, как описано в настоящем документе.
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение дополнительно описано следующими примерами, которые не ограничивают рамки изобретения, описанные формуле изобретения.
Пример 1. Получение мышиных антител против hCD40
Для получения мышиных антител против человеческого CD40 (hCD40; SEQ ID NO:26) самок мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель иммунизировали человеческим CD40. Антитела против hCD40 собирали способами, описанными ниже и показанными на ФИГ. 1 и ФИГ. 2.
Иммунизация мышей
Самок мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель иммунизировали His-меченными человеческими белками CD40 в дозе 20 мкг/мышь в концентрации 100 мкг/мл. His-меченные человеческие белки CD40 эмульгировали с адъювантом и вводили в четыре положения на спине мышей. Для первой подкожной (s.c.) инъекции разбавленный антиген эмульгировали с полным адъювантом Фрейнда (CFA) в равном объеме. В следующих подкожных инъекциях белок эмульгировали с неполным адъювантом Фрейнда (IFA) в равном объеме. Через три дня после третьей инъекции или бустерной иммунизации кровь (сыворотку) собирали и анализировали на титр антител с использованием ИФА.
В другом эксперименте иммунизировали самок мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель путем введения экспрессирующей плазмиды, кодирующей человеческий CTLA4, мышам. Плазмиды, кодирующие антиген, вводили в переднюю большеберцовую мышцу (внутримышечная инъекция; внутримышечная инъекция) мышей с использованием генных пушек в концентрации 1000 мкг/мкл при 60 мкг на мышь. Было выполнено не менее четырех инъекций с промежутком по меньшей мере 14 дней между двумя инъекциями. Кровь (сыворотку) собрали через семь дней после последней иммунизации, и сыворотку проверяли на титр антител с помощью ИФА.
Процедуры для усиления иммунизации также проводили по меньшей мере через четырнадцать дней после предыдущей иммунизации (либо путем инъекции плазмиды, либо путем введения белков). Клетки СНО, которые экспрессируют антиген CD40 на поверхности, вводили мышам внутривенно через хвостовые вены. Затем селезенку собирали через четыре дня после инъекции.
Слияние клеток SP2/0 и клеток селезенки
Ткани селезенки измельчали. Клетки селезенки сначала отбирали с помощью микрогранул CD3ε и микрогранул с антителом против мышиного IgM, а затем сливали с клетками SP2/0. Затем клетки высевали в 96-луночные планшеты со средой гипоксантин-аминоптерин-тимидин (HAT).
Первичный скрининг гибридомы
Первичный скрининг супернатанта гибридомы в 96-луночных планшетах проводили с использованием сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) в соответствии со стандартными процедурами. Клетки яичника китайского хомячка (СНО) добавляли в 96-луночные планшеты (2×104 клеток на лунку) перед скринингом. Использовали 50 мкл супернатанта. Антитела, которые были использованы в экспериментах, представляли собой
(1) Конъюгированный с флуоресцеином (FITC) AffiniPure козий F(ab)2-фрагмент против мышиного IgG, специфичный для Fcγ-фрагмента, и
(2) Alexa Fluor®-647-конъюгированный AffiniPure козий F(ab)2-фрагмент против человеческого IgG, специфичный для Fcγ-фрагмента.
Субклонирование
Субклонирование проводили с использованием ClonePix2. Вкратце, положительные лунки, идентифицированные во время первичного скрининга, переносили в полутвердую среду, и IgG-положительные клоны идентифицировали и тестировали. Использовали FITC-конъюгипрованное антитело Fc против мышиного IgG.
Асцитная жидкость антител
1×106 положительных гибридомных клеток вводили внутрибрюшинно мышам B-NDGTM (Beijing Biocytogen, Пекин, Китай; Кат. № B-CM-002). Моноклональные антитела получали путем выращивания клеток гибридомы в брюшной полости мыши. Клетки гибридомы размножались и производили асцитную жидкость в брюшной полости мышей. Жидкость содержала высокую концентрацию антител, которые можно собирать для последующего использования.
Очистка антител
Антитела в асцитной жидкости очищали с использованием белковой хроматографии GE AKTA (GE Healthcare, Чикаго, Иллинойс, США). 03-7F10 («7F10»), 06-6A7 («6A7»), 07-4H6 («4H6»), 03-9D7 («9D7»), 03-2A7 («2A7») и 03-9E11 («9E11») были среди мышиных антител, полученных описанными выше способами.
Определяли области VH, VL и CDR антител. Аминокислотные последовательности CDR1, CDR2, CDR3 тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи 7F10 показаны в SEQ ID NO:1-6 (нумерация Kabat) или SEQ ID NO:19, 20, 3, 4, 21, 6 (нумерация Chothia).
Аминокислотные последовательности CDR1, CDR2, CDR3 тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи 6A7 показаны в SEQ ID NO:7-12 (нумерация Kabat) или SEQ ID NO:22, 23, 9, 10, 11, 12 (нумерация Chothia).
Аминокислотные последовательности CDR1, CDR2, CDR3 тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи 4H6 показаны в SEQ ID NO:13-18 (нумерация Kabat) или SEQ ID NO:24, 25, 15, 16, 17, 18 (нумерация Chothia).
Пример 2. Гуманизация мышиных антител
Отправной точкой для гуманизации были мышиные антитела (например, 7F10, 6A7 и 4H6). Были определены аминокислотные последовательности для вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи этих мышиных антител.
Были сконструированы три гуманизированных варианта вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO:30-32) и четыре гуманизированных варианта вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO:33-36) для 7F10, содержащие различные модификации или замены.
Были сконструированы четыре гуманизированных варианта вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO:37-40) и три гуманизированных варианта вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO:41-43) для 6A7, содержащие различные модификации или замены.
Были сконструированы четыре гуманизированных варианта вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO:44-47) и четыре гуманизированных варианта вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO:48-51) для 4H6, содержащие различные модификации или замены.
Эти гуманизированные варианты вариабельной области тяжелой цепи можно комбинировать с любыми вариантами вариабельной области легкой цепи на основе того же антитела мыши. Например, 6A7-H4 (SEQ ID NO:40) можно комбинировать с любым гуманизированным вариантом вариабельной области легкой цепи на основе того же мышиного антитела 6A7 (например, 6A7-K2 (SEQ ID NO:42)), и это антитело обозначено соответствующим образом (например, 6A7-H4K2).
Пример 3. Тестирование мышиных антител против hCD40 in vitro: блокирование связывания CD40 человека (hCD40) и лиганда CD40 человека (hCD40L)
Были проведены анализы блокирования, чтобы определить, могут ли антитела против hCD40 блокировать связывание между hCD40 и его лигандом hCD40L.
Антитела против hCD40 собирали из асцитной жидкости мышей и очищали хроматографией. В каждую лунку планшета добавляли 25 мкл клеток СНО, транзиторно трансфецированных человеческим CD40. Очищенные антитела титровали до конечных концентраций 50, 5, 0,5, 0,05 и 0,005 мкг/мл. Титрированные антитела добавляли в каждую лунку по 25 мкл на лунку при 4°C и инкубировали в течение 30 минут.
Лиганд hCD40-hFc экспрессировался клетками H293T. В каждую лунку добавляли 50 мкл hCD40L-hFc (1:500). Клетки с hCD40L-hFc и антителами инкубировали при 4°C в течение 15 минут.
После двукратной промывки фосфатно-солевым буфером (PBS), 50 мкл PE-меченного Fc антитела против IgG мыши (анти-mIgG Fc-PE) в разведении 1:500 и FITC-меченного Fc антитела против человеческого IgG (анти-hIgG Fc-FITC) в разведении 1:100 добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 30 минут при 4°C с последующей промывкой PBS. Сигналы для FITC и PE определяли с помощью проточной цитометрии.
Как показано на ФИГ. 3, когда концентрация мышиных антител к hCD40 03-7F10, 06-6A7 и 07-4H6 увеличивалась, сигнал для клеток, связывающихся с hCD40L, уменьшался (ось y), в то время как сигнал для клеток, связывающихся с мышиными антителами против hCD40, увеличивался, что позволяет предположить, что связывание CD40 человека с CD40L человека блокируется антителами против hCD40.
Пример 4. Перекрестная реактивность антител против hCD40 против CD40 обезьяны, мыши и химерного CD40 человека-мыши
В каждом эксперименте клетки СНО трансфецировали CD40 мыши (mCD40, SEQ ID NO:27), CD40 обезьяны (макака-резус) (rmCD40, SEQ ID NO:28) или химерным (мышь и человек) CD40 (chiCD40, SEQ ID NO:29).
В каждую лунку добавляли 25 мкл клеток СНО. 25 мкл очищенных антител против hCD40 (1 мкг/мл) (7F10, 6A7 или 4H6) добавляли в каждую лунку и инкубировали при 4°C в течение 30 минут.
После двукратной промывки PBS (1200 об/мин, 5 мин) 50 мкл FITC-меченного Fc антитела против IgG мыши (анти-mIgG Fc-FITC) добавляли в каждую лунку при разведении 1:100 с последующей инкубацией при 4 °C. в течение 30 минут, а затем промывали PBS (1200 об/мин, 5 минут). Сигналы для FITC были обнаружены с помощью проточной цитометрии.
Как показано на ФИГ. 4, 7F10, 6A7 и 4H6 не проявляли перекрестной реактивности с CD40 мыши, но обладали сильной перекрестной реактивностью с rmCD40 и химерным CD40. На ФИГ. 4 NC означает отрицательный контроль.
Пример 5. Аффинность связывания антител против hCD40
Аффинность связывания антител против hCD40 измеряли с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием биосенсора Biacore (Biacore, INC, Piscataway N.J.) T200, снабженного сенсорными чипами с предварительно иммобилизованным протеином A.
Антитела против hCD40 собирали путем трансфекции клеток CHO-S и затем очищали. Антитела (1 мкг/мл) вводили в биосенсор Biacore T200 со скоростью 10 мкл/мин в течение примерно 24-33 секунд для достижения желаемой плотности белка (примерно 44-57 единиц ответа (RU)). Затем вводили меченные гистидином человеческие белки CD40 (hCD40-His) в концентрации 800, 200, 50, 12,5, 3,125, 0,78125 нМ со скоростью 30 мкл/мин в течение 300 секунд. За диссоциацией наблюдали в течение 300 секунд. Чип регенерировали после последней инъекции каждого титрования глицином (pH 2,0, 30 мкл/мин в течение 12 секунд). Результат для 6A7-mHvKv-IgG4 показан на ФИГ. 5.
Кинетические скорости ассоциации (kon) и скорости диссоциации (koff) были получены одновременно путем аппроксимации данных в глобальном масштабе к модели связывания Ленгмюра 1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B., 1994. Methods Enzymology 6. 99-110) с помощью оценочного программного обеспечения Biacore T200 Evaluation Software 3.0. Аффинности выводили из отношения кинетических констант скорости (KD=koff/kon).
Как будет понятно специалисту в данной области, тот же метод с соответствующими корректировками параметров (например, концентрации антитела) был выполнен для каждого тестируемого антитела. Например, график, показывающий результаты 6A7-H1K1-IgG4, показан на ФИГ. 6. Результаты для тестируемых антител приведены в таблице ниже. Результат для дацетузумаба также включен в целях сравнения.
Таблица 2
Антитела против hCD40 Скорость ассоциации
kon (1/Mс)		 Скорость диссоциации
koff (1/с)		 Аффинность
KD (M)
Дацетузумаб 4,17E+05 8,33E-03 2,00E-08
6A7-mHvKv-IgG4 9,94E+04 2,59E-04 2,60E-09
6A7-H1K1-IgG4 2,04E+04 5,71E-03 2,80E-07
6A7-H2K1-IgG4 2,37E+04 7,08E-03 2,98E-07
6A7-H3K1-IgG4 2,76E+04 5,74E-04 2,08E-08
6A7-H4K1-IgG4 2,39E+04 5,72E-04 2,39E-08
6A7-H1K2-IgG4 2,06E+04 3,86E-03 1,87E-07
6A7-H2K2-IgG4 2,63E+04 4,96E-03 1,89E-07
6A7-H3K2-IgG4 6,46E+04 3,71E-04 5,74E-09
6A7-H4K2-IgG4 1,05E+05 3,22E-04 3,06E-09
6A7-H1K3-IgG4 2,87E+04 3,90E-03 1,36E-07
6A7-H2K3-IgG4 4,53E+04 5,05E-03 1,11E-07
6A7-H3K3-IgG4 1,23E+05 3,56E-04 2,90E-09
6A7-H4K3-IgG4 1,07E+05 3,73E-04 3,49E-09
4H6-mHvKv-IgG1 5,612E+5 2,050E-02 3,652E-8
4H6-H1K1-IgG4 2,167E+04 1,673E-01 7,723E-06
4H6-H2K1-IgG4 5,074E+05 2,269E-01 4,472E-07
4H6-H3K1-IgG4 8,270E+04 3,420E-02 4,130E-07
4H6-H4K1-IgG4 1,850E+05 2,690E-02 1,450E-07
4H6-H1K2-IgG4 3,856E+05 6,319E-02 1,639E-07
4H6-H2K2-IgG4 4,138E+05 5,700E-02 1,378E-07
4H6-H3K2-IgG4 4,014E+05 2,152E-02 5,361E-08
4H6-H4K2-IgG4 3,918E+05 1,907E-02 4,866E-08
4H6-H1K3-IgG4 2,420E+05 5,540E-02 2,290E-07
4H6-H2K3-IgG4 2,600E+05 6,590E-02 2,530E-07
4H6-H3K3-IgG4 3,120E+05 2,860E-02 9,160E-08
4H6-H4K3-IgG4 3,266E+05 2,574E-02 7,881E-08
4H6-H1K4-IgG4 1,490E+05 6,950E-02 4,650E-07
4H6-H2K4-IgG4 1,960E+05 7,420E-02 3,780E-07
4H6-H3K4-IgG4 2,980E+05 2,820E-02 9,480E-08
4H6-H4K4-IgG4 3,125E+05 2,778E-02 8,891E-08
7F10-mHvKv-IgG1-N297A 1,504E+05 2,924E-02 1,944E-07
7F10-H1K1-IgG4 1,769E+05 5,144E-02 2,908E-07
7F10-H1K2-IgG4 8,277E+04 4,915E-02 5,938E-07
7F10-H1K3-IgG4 7,312E+04 3,913E-02 5,351E-07
7F10-H1K4-IgG4 1,153E+05 3,208E-02 2,782E-07
7F10-H2K1-IgG4 1,205E+05 6,505E-02 5,397E-07
7F10-H2K2-IgG4 1,056E+05 5,337E-02 5,053E-07
7F10-H2K3-IgG4 1,720E+05 3,126E-02 1,817E-07
7F10-H2K4-IgG4 1,880E+05 3,801E-02 2,021E-07
7F10-H3K1-IgG4 1,320E+05 5,679E-02 4,302E-07
7F10-H3K2-IgG4 1,266E+05 4,817E-02 3,805E-07
7F10-H3K3-IgG4 1,320E+05 3,137E-02 2,376E-07
7F10-H3K4-IgG4 1,487E+05 2,737E-02 1,841E-07
Среди этих протестированных антител 6A7-mHvKv-IgG4, 4H6-mHvKv-IgG1 и 7F10-mHvKv-IgG1-N297A являются химерными антителами против hCD40. Химерные антитела содержат вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи из соответствующих антител мыши против hCD40 с константными доменами из человеческого антитела (включая, например, домены CL, CH1, CH2 и CH3). Термин mHvKv обозначает вариабельную область тяжелой цепи мыши и вариабельную область легкой цепи мыши.
Тестируемые антитела также включают гуманизированные антитела. Эти протестированные гуманизированные антитела имеют константные домены антител IgG4 человека (включая, например, домены CL, CH1, CH2 и CH3). Гуманизированные вариабельные домены тяжелой цепи пронумерованы H1, H2, H3 и т.д.; а гуманизированные вариабельные домены легкой цепи пронумерованы K1, K2, K3 и т.д. Последовательности гуманизированных вариабельных доменов суммированы на ФИГ. 19-21. Например, 7F10-H1K1-IgG4 основан на антителе мыши 7F10 и имеет гуманизированный вариабельный домен H1 тяжелой цепи (SEQ ID NO:30) и гуманизированный вариабельный домен K1 легкой цепи (SEQ ID NO:33). Аналогичным образом, 6A7-H3K2-IgG4 основан на антителе 6A7 мыши и имеет гуманизированный вариабельный домен H3 тяжелой цепи (SEQ ID NO:39) и гуманизированный вариабельный домен K2 легкой цепи 6A7 (SEQ ID NO:42).
Название и последовательности химерных антител против CD40 и гуманизированных антител против CD40 суммированы в Таблице 1. Несколько протестированных антител имеют мутацию N297A (нумерация EU) в Fc-области. Мутация N297A может привести к отсутствию гликозилирования по N297 и, таким образом, к потере эффекторной функции.
Пример 6. Аффинность связывания антител против hCD40 с mfCD40
Аффинность связывания антител против hCD40 с mfCD40 (Macaca fascicularis) измеряли с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием биосенсора Biacore (Biacore, INC, Piscataway N.J.) T200, снабженного сенсорными чипами с предварительно иммобилизованным Протеином А.
Очищали антитела против hCD40. Антитела (0,5 мкг/мл) вводили в биосенсор Biacore T200 со скоростью 10 мкл/мин в течение примерно 18-26 секунд для достижения желаемой плотности белка (примерно 44-58 единиц ответа (RU)). Затем вводили меченные гистидином белки mfCD40 (mfCD40-His) (Acrobiosystems, Кат. №: CD0-C52H6) в концентрации 200, 50, 12,5, 3,125 нМ со скоростью 30 мкл/мин в течение 180 секунд. За диссоциацией наблюдали в течение 300 секунд. Чип регенерировали после последней инъекции каждого титрования глицином (pH 2,0, 30 мкл/мин в течение 12 секунд).
Кинетическая скорость ассоциации (kon) и скорость диссоциации (koff) были получены одновременно путем аппроксимации данных в глобальном масштабе к модели связывания Ленгмюра 1:1 с использованием Biacore T200 Evaluation Software 3.0. Аффинности выводили из отношения кинетических констант скорости (KD=koff/kon).
Результаты для тестируемых антител приведены в таблице ниже.
Таблица 3
Антитела против hCD40 Скорость ассоциации
kon (1/Mс)		 Скорость диссоциации
koff (1/с)		 Аффинность
KD (M) с mfCD40
4H6-H3K2-IgG4 5,700E+05 1,918E-02 3,365E-08
4H6-H4K2-IgG4 5,683E+05 1,688E-02 2,970E-08
6A7-H3K3-IgG4 2,308E+05 2,010E-04 8,705E-10
6A7-H4K2-IgG4 1,988E+05 7,874E-04 3,960E-09
Пример 7. Термическая стабильность антител против hCD40
Термофлуоресцентный анализ (Thermofluor assay) выполняли с использованием набора красителей Protein Thermal Shift ™ (Thermo Fisher Scientific) и систем ПЦР в реальном времени QuantStudio ™ 5 (Thermo Fisher Scientific). В этом анализе измеряли термостабильность с использованием флуоресцентного красителя, который связывается с гидрофобными участками, открытыми по мере разворачивания белка.
Эксперименты проводили согласно протоколу производителя. На стадии 1 образцы нагревали до 25°C со скоростью 1,6°C/секунду. На стадии 2 образцы нагревали до 99°C со скоростью 0,05°C/секунду.
В таблице ниже приведены значения Tm для протестированных гуманизированных антител против hCD40. Результат для дацерузумаба также был включен в целях сравнения.
Таблица 4
Антитело Вариабельные домены Тип
(константные домены)		 Термостабильность (Tm C°)
4H6-H3K2-IgG4 4H6 H3K2 Человеческий IgG4 75,03
4H6-H4K2-IgG4 4H6 H4K2 Человеческий IgG4 77,92
4H6-H3K3-IgG4 4H6 H3K3 Человеческий IgG4 75,21
4H6-H3K4-IgG4 4H6 H3K4 Человеческий IgG4 74,62
4H6-H4K3-IgG4 4H6 H4K3 Человеческий IgG4 76,91
4H6-H4K4-IgG4 4H6 H4K4 Человеческий IgG4 74,47
4H6-mHvKv-IgG1 4H6 mHvKv Человеческий IgG1 76,25
4H6-mHvKv-IgG4 4H6 mHvKv Человеческий IgG4 75,73
4H6-mHvKv-IgG1-N297A 4H6 mHvKv Человеческий IgG1 с мутацией N297A 75,88
4H6-H3K2-IgG2 4H6 H3K2 Человеческий IgG2 75,22
4H6-H4K2-IgG2 4H6 H4K2 Человеческий IgG2 76,55
6A7-H3K2-IgG4 6A7 H3K2 Человеческий IgG4 77,77
6A7-H3K3-IgG4 6A7 H3K3 Человеческий IgG4 78,58
6A7-H4K2-IgG4 6A7 H4K2 Человеческий IgG4 76,66
6A7-H4K3-IgG4 6A7 H4K3 Человеческий IgG4 78,88
6A7-mHvKv-IgG1 6A7 mHvKv Человеческий IgG1 76,95
6A7-mHvKv-IgG2 6A7 mHvKv Человеческий IgG2 77,25
6A7-mHvKv-IgG4 6A7 mHvKv Человеческий IgG4 76,73
6A7-mHvKv-IgG1-LALA 6A7 mHvKv Человеческий IgG1 с мутацией LALA
(мутации L234A и L235A в нумерации
EU)		 76,95
6A7-H3K3-IgG2 6A7 H3K3 Человеческий IgG2 79,07
A7-H4K2-IgG2 6A7 H4K2 Человеческий IgG2 78,48
7F10-H1K1-IgG4 7F10 H1K1 Человеческий IgG4 74,36
7F10-H1K2-IgG4 7F10 H1K2 Человеческий IgG4 76,28
7F10-H1K3-IgG4 7F10 H1K3 Человеческий IgG4 75,10
7F10-H1K4-IgG4 7F10 H1K4 Человеческий IgG4 74,73
7F10-H2K1-IgG4 7F10 H2K1 Человеческий IgG4 73,99
7F10-H2K2-IgG4 7F10 H2K2 Человеческий IgG4 75,54
7F10-H2K3-IgG4 7F10 H2K3 Человеческий IgG4 74,36
7F10-H2K4-IgG4 7F10 H2K4 Человеческий IgG4 74,13
7F10-H3K1-IgG4 7F10 H3K1 Человеческий IgG4 73,62
7F10-H3K2-IgG4 7F10 H3K2 Человеческий IgG4 74,95
7F10-H3K3-IgG4 7F10 H3K3 Человеческий IgG4 74,65
7F10-H3K4-IgG4 7F10 H3K4 Человеческий IgG4 73,99
7F10-mHvKv-IgG1 7F10 mHvKv Человеческий IgG1 75,54
7F10-mHvKv-IgG1-N297A 7F10 mHvKv Человеческий IgG1 с мутацией N297A 76,21
7F10-mHvKv-IgG2 7F10 mHvKv Человеческий IgG2 75,84
7F10-mHvKv-IgG4 7F10 mHvKv Человеческий IgG4 75,02
Daceruzumab NA Человеческий IgG1 77,46
Пример 8. Тестирование мышиных и химерных антител против hCD40 in vivo
Чтобы протестировать антитела против hCD40 in vivo и предсказать эффекты этих антител у человека, была создана модель мыши с гуманизированным CD40. Модель мыши с гуманизированным CD40 была сконструирована для экспрессии химерного белка CD40 (SEQ ID NO:29), в котором часть внеклеточной области белка CD40 мыши была заменена соответствующей внеклеточной областью CD40 человека. Аминокислотные остатки 20-192 мышиного CD40 (SEQ ID NO:27) были заменены аминокислотными остатками 20-192 человеческого CD40 (SEQ ID NO:26). Модель гуманизированных мышей (мыши B-hCD40) представляет собой новый инструмент для тестирования новых терапевтических методов лечения в клинических условиях путем значительного уменьшения разницы между клиническим исходом у человека и у обычных мышей, экспрессирующих мышиный CD40. Подробное описание модели мыши с гуманизированным CD40 можно найти в документе PCT/CN2018/091845, который включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Антитела против hCD40 испытывали на предмет их влияния на рост опухоли in vivo на модели карциномы толстой кишки. Опухолевые клетки рака MC-38 (клетки аденокарциномы толстой кишки) вводили подкожно мышам B-hCD40. Когда опухоли у мышей достигли объема 100-150 мм3, мышей случайным образом распределяли в разные группы в зависимости от объема опухоли (по пять мышей в каждой группе).
Затем мышам внутрибрюшинно вводили физиологический раствор (PS) и антитела против hCD40. Антитело вводили в первый и четвертый день каждой недели в течение 3 недель (всего 6 инъекций).
Введенное количество рассчитывали на основе массы мыши 3 мг/кг. Измеряли длину длинной оси и короткой оси опухоли, и рассчитывали объем опухоли как 0,5 × (длинная ось) × (короткая ось) 2. Массу мышей также измеряли перед инъекцией, когда мышей помещали в разные группы (до первой инъекции антитела), дважды в неделю в течение периода инъекции антитела и перед эвтаназией.
Процент ингибирования роста опухоли (TGI%) рассчитывали по следующей формуле: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100. Ti представляет собой средний объем опухоли в группе обработки в день i. T0 представляет собой средний объем опухоли в группе обработки в нулевой день. Vi представляет собой средний объем опухоли в контрольной группе в день i. V0 представляет собой средний объем опухоли в контрольной группе в нулевой день.
Т-тест выполняли для статистического анализа. % TGI выше 60% указывает на значительное подавление роста опухоли. P <0,05 представляет собой порог, указывающий на значительную разницу.
Результаты in vivo для мышиных антител против hCD40
В каждой из семи групп (G1-G7) мышам B-hCD40 вводили физиологический раствор (PS) в качестве контроля (G1), мышиное антитело против hCD40 03-9D7 (G2; 3 мг/кг), мышиное антитело против hCD40 03-2A7 (G3; 3 мг/кг), мышиное антитело против hCD40 03-9E11 (G4; 3 мг/кг), мышиное антитело против hCD40 06-6A7 (G5; 3 мг/кг), мышиное антитело против hCD40 07-4H6 (G6; 3 мг/кг) или мышиное антитело против hCD40 03-7F10 (G7; 3 мг/кг).
Массу мышей контролировали в течение всего периода обработки (ФИГ. 7 и ФИГ. 8). Между этими группами не наблюдалось большой разницы в массе. Результаты показали, что 03-7F10, 06-6A7 и 07-4H6 хорошо переносятся и не токсичны для мышей.
Размер опухоли в группах, получавших 03-7F10, 06-6A7 и 07-4H6, увеличивался в меньшей степени по сравнению с контрольной группой (ФИГ.9) и другими группами обработки антителами.
TGI% на 25 день (25 дней после группирования) также рассчитывали, как показано в таблице ниже.
Таблица 5
Объем опухоли (мм3) Выживаемость TGITV% P-значение
День
0		 День
11		 День
21		 День
25		 Масса тела Объем опухоли
Контроль G1 121±7 457
±35		 1391
±235		 2311
±531		 4/5 n.a. n.a. n.a.
Обработка G2
03-9D7		 124±9 407
±79		 1174
±300		 1979
±488		 5/5 15,29% 0,456 0,660
G3
03-2A7		 121±8 327
±34		 1087
±125		 1696
±129		 5/5 28,13% 0,256 0,248
G4
03-9E11		 121±10 347
±64		 880
±98		 1254
±169		 5/5 48,28% 0,129 0,074
G5
06-6A7		 120±8 238
±26		 293
±43		 434
±59		 5/5 85,65% 0,419 0,005
G6
07-4H6		 119±8 274
±25		 440
±120		 647
±172		 5/5 75,90% 0,118 0,013
G7
03-7F10		 123±10 286
±43		 476
±108		 809
±227		 5/5 68,67% 0,495 0,131
Результаты in vivo для химерных антител против hCD40
Химерные антитела против hCD40 6A7-mHvKv-IgG1 (G2), 6A7-mHvKv-IgG2 (G3), 6A7-mHvKv-IgG4 (G4), 6A7-mHvKv-IgG1-N297A (G5) и 6A7-mGHvKv (G6) вводили мышам B-hCD40 (мыши с гуманизированным CD40) внутрибрюшинным введением. В качестве контроля вводили физиологический раствор (группа 1, G1). Дацетузумаб (гуманизированное моноклональное антитело против CD40, которое разработано для лечения гемобластозов) также был включен в целях сравнения (G7).
Введенное количество антител рассчитывали на основе массы мыши 3 мг/кг. Антитела вводили в первый и четвертый день каждой недели (всего 6 инъекций).
Массу мышей контролировали в течение всего периода обработки. Масса мышей в разных группах увеличивалась (ФИГ.10 и ФИГ.11). Четкой разницы в массе между разными группами не наблюдалось. Результаты показали, что антитела против hCD40 хорошо переносятся и не токсичны для мышей.
Размер опухоли показал значительную разницу в группах, получавших определенные химерные антитела, по сравнению с контрольной группой (ФИГ. 12).
TGI% на 21 день (21 день после группирования) для каждой экспериментальной группы рассчитывали, как показано в таблице ниже.
Таблица 6
Объем опухоли (мм3) Выживаемость TGITV% P-значение
День
0		 День
7		 День
14		 День
21		 Масса тела Объем опухоли
Контроль G1 153±18 567
±98		 1465
±275		 2995
±714		 5/5 n.a. n.a. n.a.
Обработка G2 153±19 585
±120		 1646
±377		 3214
±732		 5/5 -7,70% 0,371 0,836
G3 153±22 341
±18		 672
±114		 1072
±238		 5/5 67,67% 0,042 0,034
G4 151±32 583
±109		 1343
±484		 1875
±164		 4/5 39,32% 0,415 0,215
G5 152±33 568
±61		 1686
±308		 3466
±719		 5/5 -16,59% 0,772 0,655
G6 151±26 562
±50		 1385
±104		 2670
±242		 5/5 11,37% 0,390 0,678
G7 154±22 371±62 1180±164 2606±395 5/5 13,73% 0,585 0,646
Результаты показали, что химерные антитела 6A7-mHvKv-IgG2 значительно ингибировали рост опухоли. Среди этих антител 6A7-mHvKv-IgG4 (G4) и 6A7-mHvKv-IgG1-LALA (G6) также обладают эффектом ингибирования опухоли.
Пример 9. Тестирование гуманизированных антител против hCD40 in vivo
Гуманизированные антитела против hCD40 тестировали на мышах с гуманизированным CD40 (B-hCD40), чтобы продемонстрировать их влияние на рост опухоли in vivo.
Опухолевые клетки рака MC-38 (клетки аденокарциномы толстой кишки) вводили подкожно мышам B-hCD40. Когда опухоли у мышей достигли объема 150 ± 50 мм3, мышей случайным образом распределили в разные группы в зависимости от объема опухоли (по пять мышей в каждой группе).
Затем мышам вводили физиологический раствор в качестве контроля (G1), гуманизированное антитело против CD40 6A7-H3K3-IgG2 (G2), гуманизированное антитело против CD40 6A7-H4K2-IgG2 (G3), гуманизированное антитело против CD40 6A7- H3K3-IgG4 (G4) или гуманизированное антитело против CD40 6A7-H4K2-IgG4 (G5).
Антитела вводили на второй и пятый день каждой недели путем внутрибрюшинной инъекции в дозе 3 мг/кг в течение 3 недель (всего 6 инъекций).
Массу мышей контролировали в течение всего периода обработки. Масса мышей в разных группах увеличивалась (ФИГ. 13 и ФИГ. 14). Результаты показали, что антитела против hCD40 хорошо переносятся и не токсичны для мышей.
Размер опухоли показал значительную разницу в группах, получавших антитела против hCD40 (ФИГ. 15). В частности, размер опухоли в G3 меньше, чем в G1 (P=0,15).
TGI% на 21 день (21 день после группирования) для каждой экспериментальной группы также рассчитывали, как показано в таблице ниже.
Таблица 7
Объем опухоли (мм3) Выживаемость TGITV% P-значение
День
0		 День
7		 День
14		 День
21		 Масса тела Объем опухоли
Контроль G1 137
±4		 424
±45		 916
±127		 1453
±310		 4/5 n.a. n.a. n.a.
Обработка G2 137
±7		 376
±22		 602
±118		 871
±276		 5/5 44,26% 0,105 0,203
G3 137
±7		 414
±26		 484
±65		 544
±67		 5/5 69,10% 0,002 0,015
G4 137
±5		 523
±28		 1303
±158		 1925
±198		 5/5 -35,88% 0,177 0,223
G5 137
±5		 420
±32		 1081
±99		 1778
±121		 5/5 -24,72% 0,720 0,321
Приведенные выше результаты показывают, что некоторые из гуманизированных антител против hCD40 могут ингибировать рост опухоли. Среди них 6A7-H4K2-IgG2 (G3) имел самый высокий процент ингибирования роста опухоли (TGI%).
Другие варианты осуществления
Следует понимать, что хотя изобретение приведено вместе с подробным описанием, представленное выше описание предназначено для иллюстрации и не ограничивает объем изобретения, который определен объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации находятся в пределах представленной ниже формулы изобретения
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ЮКЬЮР (БЭЙЦЗИН) БАЙОФАРМА КО., ЛТД
<120> АНТИТЕЛА ПРОТИВ CD40 И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> 1
<160> 57
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 1
Asp Tyr Tyr Met Tyr
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 2
Tyr Ile Ser Tyr Gly Gly Asp Ser Thr Phe Tyr Pro Asp Thr Val Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 3
Pro Ala Pro Ser Ala His Ser Tyr Tyr Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 5
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 5
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 6
Gln Gln Gly Lys Thr Leu Pro Phe Thr
1 5
<210> 7
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 7
Ser Tyr Tyr Ile Tyr
1 5
<210> 8
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 8
Gly Ile Asn Pro Arg Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 9
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 9
His Gly Asn Gly Val Tyr
1 5
<210> 10
<211> 16
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 10
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 11
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 11
Gln Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 12
Ser Gln Thr Thr His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 13
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 13
Ser Gly Tyr Trp Asn
1 5
<210> 14
<211> 16
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 14
Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 15
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 15
Phe Arg Arg Tyr Asp Asp Gly Val Asp Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 16
Arg Ala Ser His Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 17
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 17
Ala Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 18
Leu Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 19
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 19
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Tyr
1 5 10
<210> 20
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 20
Ser Tyr Gly Gly Asp Ser
1 5
<210> 21
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 21
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 22
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 22
Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr Tyr Ile Tyr
1 5 10
<210> 23
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 23
Asn Pro Arg Asn Gly Gly
1 5
<210> 24
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 24
Gly Asp Ser Val Ser Ser Gly Tyr Trp Asn
1 5 10
<210> 25
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 25
Ser Tyr Ser Gly Ser
1 5
<210> 26
<211> 277
<212> Белок
<213> человек
<400> 26
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35 40 45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
50 55 60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65 70 75 80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85 90 95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
100 105 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
165 170 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
180 185 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile
195 200 205
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
210 215 220
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp
225 230 235 240
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
245 250 255
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser
260 265 270
Val Gln Glu Arg Gln
275
<210> 27
<211> 289
<212> Белок
<213> мышь
<400> 27
Met Val Ser Leu Pro Arg Leu Cys Ala Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val His Leu Gly Gln Cys Val Thr Cys Ser Asp Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
His Asp Gly Gln Cys Cys Asp Leu Cys Gln Pro Gly Ser Arg Leu Thr
35 40 45
Ser His Cys Thr Ala Leu Glu Lys Thr Gln Cys His Pro Cys Asp Ser
50 55 60
Gly Glu Phe Ser Ala Gln Trp Asn Arg Glu Ile Arg Cys His Gln His
65 70 75 80
Arg His Cys Glu Pro Asn Gln Gly Leu Arg Val Lys Lys Glu Gly Thr
85 90 95
Ala Glu Ser Asp Thr Val Cys Thr Cys Lys Glu Gly Gln His Cys Thr
100 105 110
Ser Lys Asp Cys Glu Ala Cys Ala Gln His Thr Pro Cys Ile Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Met Glu Met Ala Thr Glu Thr Thr Asp Thr Val Cys His
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Gln Ser Ser Leu Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys Tyr Pro Trp Thr Ser Cys Glu Asp Lys Asn Leu Glu Val Leu Gln
165 170 175
Lys Gly Thr Ser Gln Thr Asn Val Ile Cys Gly Leu Lys Ser Arg Met
180 185 190
Arg Ala Leu Leu Val Ile Pro Val Val Met Gly Ile Leu Ile Thr Ile
195 200 205
Phe Gly Val Phe Leu Tyr Ile Lys Lys Val Val Lys Lys Pro Lys Asp
210 215 220
Asn Glu Ile Leu Pro Pro Ala Ala Arg Arg Gln Asp Pro Gln Glu Met
225 230 235 240
Glu Asp Tyr Pro Gly His Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu
245 250 255
His Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile
260 265 270
Ser Val Gln Glu Arg Gln Val Thr Asp Ser Ile Ala Leu Arg Pro Leu
275 280 285
Val
<210> 28
<211> 278
<212> Белок
<213> Обезьяна
<400> 28
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val Tyr Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35 40 45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Ser Glu
50 55 60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr Arg Cys His Gln His
65 70 75 80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85 90 95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Leu His Cys Met
100 105 110
Ser Glu Ser Cys Glu Ser Cys Val Pro His Arg Ser Cys Leu Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys Arg Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
165 170 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Gln
180 185 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Cys Leu Gly Ile Leu Phe Val Ile
195 200 205
Leu Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Asn
210 215 220
Asp Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Leu
225 230 235 240
Asp Asp Leu Pro Gly Ser Asn Pro Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu
245 250 255
His Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile
260 265 270
Ser Val Gln Glu Arg Gln
275
<210> 29
<211> 289
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 29
Met Val Ser Leu Pro Arg Leu Cys Ala Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35 40 45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
50 55 60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65 70 75 80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85 90 95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
100 105 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
165 170 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
180 185 190
Arg Ala Leu Leu Val Ile Pro Val Val Met Gly Ile Leu Ile Thr Ile
195 200 205
Phe Gly Val Phe Leu Tyr Ile Lys Lys Val Val Lys Lys Pro Lys Asp
210 215 220
Asn Glu Ile Leu Pro Pro Ala Ala Arg Arg Gln Asp Pro Gln Glu Met
225 230 235 240
Glu Asp Tyr Pro Gly His Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu
245 250 255
His Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile
260 265 270
Ser Val Gln Glu Arg Gln Val Thr Asp Ser Ile Ala Leu Arg Pro Leu
275 280 285
Val
<210> 30
<211> 121
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Tyr Gly Gly Asp Ser Thr Phe Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Ala Pro Ser Ala His Ser Tyr Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 121
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Tyr Gly Gly Asp Ser Thr Phe Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Ala Pro Ser Ala His Ser Tyr Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 121
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 32
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Tyr Gly Gly Asp Ser Thr Phe Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Ala Pro Ser Ala His Ser Tyr Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Leu Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Ala Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 34
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Leu Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Ala Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 35
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Leu Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Ala Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 36
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Leu Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Ala Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 37
<211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Arg Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Asn Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 38
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Arg Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Asn Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 39
<211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Arg Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Gly Asn Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 40
<211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Arg Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Gly Asn Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 41
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 41
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg His Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 42
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 42
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Asn His Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 43
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 43
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Asn His Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 44
<211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 44
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Lys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Phe Arg Arg Tyr Asp Asp Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 45
<211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 45
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Lys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Phe Arg Arg Tyr Asp Asp Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 46
<211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 46
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Lys Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Phe Arg Arg Tyr Asp Asp Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 47
<211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 47
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Lys Lys Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Phe Arg Arg Tyr Asp Asp Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 48
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser His Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gly Val Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Asn Ala Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 49
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 49
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser His Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Ile Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Asn Ala Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 50
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser His Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Ile Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Asn Ala Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 51
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 51
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser His Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Ile Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Asn Ala Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 52
<211> 121
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 52
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Tyr Gly Gly Asp Ser Thr Phe Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Ala Pro Ser Ala His Ser Tyr Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 53
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 53
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Leu Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Ala Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 54
<211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 54
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Arg Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Gly Asn Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 55
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 55
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Asn His Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 56
<211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 56
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Phe Arg Arg Tyr Asp Asp Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 57
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 57
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser His Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Ile Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Asn Ala Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Glu Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<---

Claims (80)

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с CD40 (член 5 суперсемейства рецепторов TNF), содержащие:
вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую области, определяющие комплементарность, (CDR) 1, 2 и 3, где область VH CDR1 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR1, область VH CDR2 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR2, и область VH CDR3 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR3; и
вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR 1, 2 и 3, где область VL CDR1 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична выбранной аминокислотной последовательности VL CDR1, область VL CDR2 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична выбранной аминокислотной последовательности VL CDR2, и область VL CDR3 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична выбранной аминокислотной последовательности VL CDR3,
где выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2 и 3 и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2 и 3 представляют собой одно из следующих:
(1) выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 представляют SEQ ID NO:1, 2, 3, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 представляют SEQ ID NO:4, 5, 6, соответственно;
(2) выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 представляют собой SEQ ID NO:19, 20, 3, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 представляют собой SEQ ID NО:4, 21, 6, соответственно;
(3) выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 представляют SEQ ID NO:7, 8, 9, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 представляют SEQ ID NO:10, 11, 12, соответственно;
(4) выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 представляют SEQ ID NO:22, 23, 9, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 представляют SEQ ID NO:10, 11, 12, соответственно;
(5) выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 представляют SEQ ID NO:13, 14, 15, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 представляют SEQ ID NO:16, 17, 18, соответственно; и
(6) выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 представляют SEQ ID NO:24, 25, 15, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 представляют SEQ ID NO:16, 17, 18, соответственно.
2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:1, 2 и 3, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:4, 5 и 6, соответственно, согласно нумерации Kabat.
3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:7, 8 и 9, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:10, 11 и 12, соответственно, согласно нумерации Kabat.
4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:13, 14 и 15, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:16, 17 и 18, соответственно, согласно нумерации Kabat.
5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:19, 20 и 3, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:4, 21 и 6, соответственно, согласно нумерации Сhothia.
6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:22, 23 и 9, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:10, 11 и 12, соответственно, согласно нумерации Сhothia.
7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:24, 25 и 15, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:16, 17 и 18, соответственно, согласно нумерации Сhothia.
8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-7, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с CD40 человека.
9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-9, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFV).
11. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-9 для получения биспецифического антитела.
12. Нуклеиновая кислота для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, где нуклеиновая кислота кодирует:
(1) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую области, определяющие комплементарность, (CDR) 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2, и 3, соответственно, и где VH в паре с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:33, 34, 35, 36 или 53, связываются с CD40;
(2) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4, 5 и 6, соответственно, и где VL в паре с VH, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:30, 31, 32 или 52, связывается с CD40;
(3) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:7, 8 и 9, соответственно, и где VH в паре с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:41, 42, 43 или 55, связываются с CD40;
(4) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:10, 11 и 12, соответственно, и где VL в паре с VH, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:37, 38, 39, 40 или 54, связываются с CD40;
(5) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:13, 14, 15 соответственно, и где VH в паре с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:48, 49, 50, 51 или 57, связываются с CD40; или
(6) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащий CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:16, 17 и 18, соответственно, и где VL в паре с VH, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:44, 45, 46, 47 или 56, связываются с CD40.
13. Нуклеиновая кислота по п.12, где нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащий VH, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2 и 3, соответственно.
14. Нуклеиновая кислота по п.12, где нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащий VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4, 5 и 6, соответственно.
15. Нуклеиновая кислота по п.12, где нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащий VH, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:7, 8 и 9, соответственно.
16. Нуклеиновая кислота по п.12, где нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащий VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:10, 11 и 12, соответственно.
17. Нуклеиновая кислота по п.12, где нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащий VH, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:13, 14 и 15, соответственно.
18. Нуклеиновая кислота по п.12, где нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащий VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:16, 17 и 18, соответственно.
19. Нуклеиновая кислота по любому из пп.12-18, где VH в паре с VL, специфически связывается с человеческим CD40, или VL в паре с VH, специфически связывается с человеческим CD40.
20. Нуклеиновая кислота по любому из пп.12-19, где тяжелая цепь иммуноглобулина или ее фрагмент представляют собой тяжелую цепь гуманизированного иммуноглобулина или ее фрагмент, а легкая цепь иммуноглобулина или ее фрагмент представляют собой легкую цепь гуманизированного иммуноглобулина или ее фрагмент.
21. Нуклеиновая кислота по любому из пп.12-20, где нуклеиновая кислота кодирует одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).
22. Нуклеиновая кислота по любому из пп.12-21, где нуклеиновая кислота представляет собой кДНК.
23. Вектор экспрессии, содержащий одну или более нуклеиновых кислот по любому из пп.12-22.
24. Вектор экспрессии, содержащий две нуклеиновые кислоты по любому из пп.12-22, где вектор кодирует область VL и область VH, которые вместе связываются с CD40.
25. Пара векторов экспрессии, где каждый вектор содержит одну из нуклеиновых кислот по любому из пп.12-22, где вместе пара векторов кодирует область VL и область VH, которые вместе связываются с CD40.
26. Клетка для продукции антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с CD40, содержащая вектор экспрессии по п.23 или 24, или пару векторов экспрессии по п.25.
27. Клетка по п.26, где клетка представляет собой клетку СНО.
28. Клетка для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с CD40, содержащая одну или более нуклеиновых кислот по любому из пп.12-22.
29. Клетка для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с CD40, содержащая две нуклеиновые кислоты по любому из пп.12-22.
30. Клетка по п.29, где две нуклеиновые кислоты вместе кодируют область VL и область VH, которые вместе связываются с CD40.
31. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий культивирование клетки по любому из пп.26-30 в условиях, достаточных для того, чтобы клетка продуцировала антитело или антигенсвязывающий фрагмент.
32. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с CD40, содержащие
вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность, которая идентична выбранной последовательности VH, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность, которая идентична выбранной последовательности VL, где выбранная последовательность VH и выбранная последовательность VL представляют собой одну из следующих:
(1) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:30, 31, 32 или 52, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:33, 34, 35, 36 или 53;
(2) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:37, 38, 39, 40 или 54, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:41, 42, 43 или 55; и
(3) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:44, 45, 46, 47 или 56, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:48, 49, 50, 51 или 57.
33. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.32, где:
(а) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:40, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:42; или
(b) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:40, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:43.
34. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.32, где:
(a) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:39, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:42; или
(b) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:39, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:43.
35. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.32, где:
(a) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:46 и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:49;
(b) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:47 и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:49; или
(c) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:47 и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:50.
36. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.32-35, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с CD40 человека.
37. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.32-36, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
38. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.32-37, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFV).
39. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.32-37 для получения биспецифического антитела.
40. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с CD40, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH CDR 1, 2, 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую VL CDR 1, 2, 3, где VH CDR 1, 2, 3 и VL CDR 1, 2, 3 идентичны VH CDR 1, 2, 3 и VL CDR 1, 2, 3 антитела или его антиген-связывающего фрагмента по любому из пп.32-38.
41. Конъюгат антитело-лекарственное средство для лечения рака, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-10, 32-38 и 40, ковалентно связанные с терапевтическим агентом.
42. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.41, где терапевтический агент представляет собой цитотоксический или цитостатический агент.
43. Способ лечения онкологического пациента, где способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-10, 32-38 и 40 или конъюгат антитело-лекарственное средство по п.41 или 42.
44. Способ по п.43, где у пациента имеется солидная опухоль.
45. Способ по п.43, где злокачественная опухоль представляет собой меланому, карциному поджелудочной железы, мезотелиому или гемобластоз.
46. Способ по п.43, где злокачественная опухоль представляет собой неходжкинскую лимфому, лимфому или хронический лимфоцитарный лейкоз.
47. Способ по п.43, дополнительно включающий введение терапевтически эффективного количества дополнительного терапевтического агента.
48. Способ по п.47, где дополнительное терапевтическое средство представляет собой анти-OX40 антитело, анти-PD-1 антитело, анти-PD-L1 антитело, анти-PD-L2 антитело, анти-LAG-3 антитело, анти-TIGIT антитело, анти-BTLA антитело, анти-CTLA-4 антитело или анти-GITR антитело.
49. Способ уменьшения скорости роста опухоли, где способ включает
приведение опухолевой клетки в контакт с эффективным количеством композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-10, 32-38 и 40 или конъюгат антитело-лекарственное средство по п.41 или 42.
50. Способ уничтожения опухолевой клетки, где способ включает
контакт опухолевой клетки с эффективным количеством композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-10, 32-38 и 40 или конъюгат антитело-лекарственное средство по п.41 или 42.
51. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-10, 32-38 и 40 и фармацевтически приемлемый носитель.
52. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая конъюгат антитело-лекарственное средство по п.41 или 42 и фармацевтически приемлемый носитель.
RU2021104177A 2018-07-20 Антитела против cd40 и их применения RU2796413C2 (ru)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2021104177A RU2021104177A (ru) 2022-08-22
RU2796413C2 true RU2796413C2 (ru) 2023-05-23

Family

ID=

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012149356A2 (en) * 2011-04-29 2012-11-01 Apexigen, Inc. Anti-cd40 antibodies and methods of use
CN104357469A (zh) * 2006-05-03 2015-02-18 科罗拉多州立大学董事会 Cd40激动剂抗体/1型干扰素协同佐剂组合、包含前述的结合物及其用途
RU2599447C2 (ru) * 2010-02-04 2016-10-10 Юниверсити Оф Майами Моноклональные антетела к cd44, предназначенные для применения при лечении плоскоклеточной карциномы головы и шеи
US9676861B2 (en) * 2012-10-30 2017-06-13 Apexigen, Inc. Anti-CD40 antibodies and methods of use

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104357469A (zh) * 2006-05-03 2015-02-18 科罗拉多州立大学董事会 Cd40激动剂抗体/1型干扰素协同佐剂组合、包含前述的结合物及其用途
RU2599447C2 (ru) * 2010-02-04 2016-10-10 Юниверсити Оф Майами Моноклональные антетела к cd44, предназначенные для применения при лечении плоскоклеточной карциномы головы и шеи
WO2012149356A2 (en) * 2011-04-29 2012-11-01 Apexigen, Inc. Anti-cd40 antibodies and methods of use
US9676861B2 (en) * 2012-10-30 2017-06-13 Apexigen, Inc. Anti-CD40 antibodies and methods of use

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10934365B2 (en) Anti-OX40 antibodies and uses thereof
US11155625B2 (en) Anti-PD-1 antibodies and uses thereof
JP7387743B2 (ja) 抗ｔｎｆｒｓｆ９抗体及びその使用
US11142582B2 (en) Anti-CD40 antibodies and uses thereof
WO2020253722A1 (en) Anti-cd40 antibodies and uses thereof
RU2796413C2 (ru) Антитела против cd40 и их применения
US12134653B2 (en) Anti-CD40 antibodies and uses thereof
RU2812200C2 (ru) Антитела против tnfrsf9 и их применение
RU2783314C2 (ru) Антитела против ox40 и их применения
WO2024175020A1 (en) Anti-il2ra antibodies and uses thereof
WO2023198194A1 (en) Anti-cd40 antibodies and uses thereof
RU2788616C2 (ru) Антитела против pd-1 и их применение