CN114716554A - 抗原结合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗原结合蛋白及其应用，具体的，所述的抗原结合蛋白包含第一可变区和第二可变区，其中，所述的第一可变区是重链可变区，所述的重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3‑5所示，所述的第二可变区是轻链可变区，所述的轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6‑8所示。

Description

抗原结合蛋白及其应用
技术领域
本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域，具体涉及一种抗原结合蛋白及其应用。
背景技术
抑制性白细胞免疫球蛋白样受体(LILRBs 1-5)，主要在髓系细胞表达，同时在肿瘤干细胞上也高表达，并可能直接调控癌症的发生和复发以及肿瘤干细胞的活性。而肿瘤微环境中大量的髓系细胞，通常会介导肿瘤发生免疫逃逸，促进肿瘤生长和转移。因此，LILRBs在肿瘤生物学中具有双重协同作用——作为免疫检查点分子和肿瘤维持因子。
在生理条件下，白细胞免疫球蛋白样受体B4（LILRB4）通过在T细胞和浆细胞等多种免疫细胞上的表达，在免疫系统的功能中起着非常重要的作用。在病理条件下，LILRB4通过多种信号通路影响各种疾病的进程，如肿瘤和白血病的转化和浸润。LILRB4的差异表达存在于多种免疫系统疾病中，如川崎病、系统性红斑狼疮（SLE）和败血症，最近的研究表明LILRB4在精神疾病中也起作用。鉴于LILRB4在免疫系统中的重要作用及其在多种疾病中的差异表达，使其成为多种疾病潜在的治疗靶点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够靶向LILRB4的抗原结合蛋白，为实现该目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明第一方面提供了一种能与LILRB4特异性结合的抗原结合蛋白，所述的抗原结合蛋白包括抗体或其抗原结合片段，所述的抗原结合蛋白包含第一可变区和第二可变区，其中，所述的第一可变区是重链可变区(VH)，所述的重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3-5所示，所述的第二可变区是轻链可变区(VL)，所述的轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6-8所示。
在本发明的上下文中，术语“抗体”(Ab)是指具有在典型生理条件下与抗原特异性结合的能力的免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其任一种的衍生物，其中半衰期为显著的时间段，如至少约30min、至少约45min、至少约一小时、至少约两小时、至少约四小时、至少约八小时、至少约12小时、约24小时或更长时间、约48小时或更长时间、约三、四、五、六、七天或更长时间等，或任何其他相关的功能定义的时间段(如足以诱导、促进、增强、和/或调节与结合抗原的抗体相关的生理反应的时间和/或足以使抗体招募效应子活性的时间)。免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体(Ab)的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和补体系统的组分(如C1q，即补体激活的经典途径中的第一组分)。抗体也可以是双特异性抗体、双抗体、多特异性抗体或类似分子。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常是指一个与抗原结合（即特异性结合）的完整抗体（即与它们所衍生的完整抗体）竞争的免疫球蛋白或抗体的多肽片段。所述抗原结合片段可以包括但不限于：Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段，线性抗体，单链抗体，双体抗体，以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。可变性集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR) 或超变区中的三个片段中。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区（可变区中较保守的部分），它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
进一步，所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步，所述的抗原结合蛋白还包含重链恒定区、轻链恒定区。
进一步，所述的重链恒定区优选来自IgG4或IgG1亚型。
进一步，所述的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.9或SEQ IN NO.10所示。
进一步，所述的轻链恒定区来自抗体kappa链或抗体lamda链。
进一步，所述的轻链恒定区来自抗体kappa链。
进一步，所述的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
进一步，本发明所述的抗体还包括人源化与非人源化抗体，以及具有与其前面所述抗体相同功能或改造及优化的一切抗体。
进一步，本发明所述的抗体为人源化抗体。
本发明第二方面提供了编码本发明第一方面所述的抗原结合蛋白的核酸。
典型地，所述核酸还编码与成熟重链和轻链融合的信号肽。核酸上的编码序列可以与调节序列可操作地连接以确保编码序列的表达，所述调节序列如启动子、增强子、核糖体结合位点、转录终止信号等。编码重链和轻链的核酸可以以分离的形式存在，或者可以克隆至一个或多个载体中。所述核酸可以通过例如重叠寡核苷酸的固态合成或PCR来合成。编码重链和轻链的核酸可以例如在表达载体内连接为一个连续的核酸，或者可以是分开的，例如各自克隆至其自己的表达载体中。
本发明第三方面提供了一种包含本发明第二方面所述的核酸的表达载体。
除了前面所述的核酸之外，表达载体还包括与所述核酸序列操作性相连的表达调控序列。
表达载体是指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。载体的种类包括本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。在表达载体中，除了含有复制起点外，还可含有标记基因和其他翻译控制元件。
本发明第四方面提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞包含本发明第二方面所述的核酸或本发明第三方面所述的表达载体。
进一步，所述的细胞包括原核细胞、真核细胞。
进一步，所述的原核细胞包括细菌细胞。
进一步，所述的真核细胞包括原生生物细胞、动物细胞、植物细胞、真菌细胞。
进一步，所述的动物细胞包括哺乳动物细胞、禽类细胞、昆虫细胞。
用重组DNA转化、转染宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。一些采用的转化、转染方法包括但并不限于：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
本发明第五方面提供了一种制备本发明第一方面所述的抗原结合蛋白的方法，所述的方法包括将本发明第四方面所述的宿主细胞在适合于表达所述的抗原结合蛋白的条件下培养以及回收所述的抗原结合蛋白。
本发明第六方面提供了如下任一项所述的产品：
1）一种双特异性抗体，所述的双特异性抗体包含本发明第一方面所述的抗原结合蛋白；
2）一种偶联物或缀合物，所述的偶联物或缀合物包含本发明第一方面所述的抗原结合蛋白；
3）一种药物组合物，所述的药物组合物包含本发明第一方面所述的抗原结合蛋白；
4）一种嵌合抗原受体蛋白，所述的嵌合抗原受体蛋白包含本发明第一方面所述的抗原结合蛋白。
术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指人工构建的杂交蛋白或多肽，其含有连接至活化免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)的结构域或信号传导(例如T细胞信号传导或T细胞活化结构域)的抗体(例如单链可变片段(scFv))的抗原结合域(参见例如前述Kershaw等人,Eshhar等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,90(2):720-724(1993),及Sadelain等人,《免疫学新见(Curr.Opin.Immunol.)》21(2):215-223(2009))。CAR能够利用单克隆抗体的抗原结合特性以非MHC限制性方式将免疫细胞特异性及反应性导向至所选靶标。非MHC限制性抗原识别赋予表达CAR的免疫细胞不依赖抗原加工来识别抗原的能力，从而绕过主要的肿瘤逃逸机理。
本发明中，所述的偶联物或缀合物是由本发明的抗原结合蛋白偶联到官能剂上形成的。
官能剂可以是细胞毒素剂如化学治疗剂、毒素( 例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)、或放射性同位素( 即放射性偶联物)、抗生素、溶核酶、或它们的任意组合。化学治疗剂可以用于产生免疫偶联物，例如，甲氨喋呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(vinca alkaloid)( 长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))、阿霉素(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin) 或其它嵌入剂、酶、和/或它们的片段，如溶核酶、抗生素、和毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体。可使用的酶活性毒素及其片段包括：例如，白喉A 链(diphtheria A chain)、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A 链(exotoxin Achain)( 来自绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒素A 链(ricin A chain)、相思豆毒素A 链(abrin A chain)、蒴莲根毒素A 链(modeccin A chain)，α- 八叠球菌(alpha-sarcin)、油桐(Aleuritesfordii) 蛋白，石竹素蛋白(dianthin protein)，美洲商陆(Phytolacca americana) 蛋白(PAPI，PAPII 和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia) 抑制剂、麻疯树毒素(curcin)、巴豆毒素(crotin)、石碱草(saponaria officinalis) 抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝裂蛋白(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)、和单端孢霉烯族毒素类(tricotheeenes)。本领域已知或可用的任何合适的放射性核苷酸或放射性试剂均可用于产生放射性偶联的抗体。
所述免疫缀合物还可以是本发明的抗原结合蛋白直接或间接偶联至可检测的部分形成的复合物。
可检测的部分包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。
为了检测和/或分析和/或诊断目的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色( 组织) 样品、流式细胞计量术、激光扫描细胞计量术检测、荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、生物测定( 例如吞噬作用测定)、蛋白质印迹应用等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。
进一步，所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体，所述载体包括但不限于已经被食品与药品管理局认可的而可用于人类或动物的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/ 着色剂、香味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗压剂、溶剂或乳化剂等对组成药物组合物无副作用的各种形式的载体。
本发明第七方面提供了一种检测LILRB4蛋白的工具，所述的工具包括本发明第一方面所述的抗原结合蛋白、本发明第六方面所述的双特异性抗体或本发明第六方面所述的偶联物或缀合物。
本发明第八方面提供了如下任一项所述的应用：
（1）本发明第一方面所述的抗原结合蛋白、本发明第二方面所述的核酸、本发明第三方面所述的表达载体、或本发明第六方面所述的双特异性抗体或本发明第六方面所述的偶联物或缀合物在制备检测LILRB4蛋白的工具中的应用；
（2）本发明第一方面所述的抗原结合蛋白、本发明第二方面所述的核酸、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第六方面所述的双特异性抗体、本发明第六方面所述的偶联物或缀合物、本发明第六方面所述的药物组合物或本发明第六方面所述的嵌合抗原受体蛋白在制备治疗与LILRB4信号传导相关的疾病或病症中的应用，所述的与LILRB4信号传导相关的疾病或病症包括恶性血液疾病、免疫系统疾病或与LILRB4信号传导相关的实体瘤。
术语“治疗”是指对受试者进行的任何类型的干预或处理，或向受试者施用活性药剂，目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或预防与疾病相关的症状、并发症、病症或者生化指标的发作、进展、发展、严重性或复发。在一些实施方案中，所述疾病是恶性血液疾病。
“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括但不限于脊椎动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗和啮齿动物(如小鼠、大鼠和豚鼠)。在一些实施方案中，所述受试者是人。术语“受试者”和“患者”和“个体”在本文中可互换使用。
在本发明中，所述的恶性血液疾病包括但不限于骨髓发育不良综合症、骨髓增生性肿瘤、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、慢性髓细胞白血病，或急性髓细胞白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病(APL)或M3 AML、急性粒单核细胞白血病或M4 AML、急性单核细胞白血病或M5 AML、急性骨髓母细胞白血病，真性红细胞增多症。
在本发明的具体实施例中，所述的恶性血液疾病为急性单核细胞白血病。
在本发明中，所述的免疫系统疾病包括但不限于川崎病、系统性红斑狼疮（SLE）、败血症。
在本发明中所述的与LILRB4信号传导相关的实体瘤包括但不限于乳腺癌、黑色素瘤、结肠癌、肺癌、肾癌、胰腺癌。
本发明第九方面提供了一种非诊断目的的检测LILRB4蛋白的方法，所述的方法包括使样品与本发明第一方面所述的抗原结合蛋白或本发明第六方面所述的双特异性抗体、或本发明第六方面所述的偶联物或缀合物接触。
术语“样本”与“样品”在本文中可以互换使用，用于本文时指获得自或衍生自受试者(例如感兴趣的个体)的组合物，其包含有待根据例如物理，生化，化学和/或生理特点来表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。例如，短语“疾病样本”或其变体指得自感兴趣的受试者的任何样本，预计或已知其包含待表征的细胞和/或分子实体。样本包括但不限于，组织样本(例如肿瘤组织样本)，原代或培养的细胞或细胞系，细胞上清，细胞裂解物，血小板，血清，血浆，玻璃体液，淋巴液，滑液，滤泡液，精液，羊水，乳，全血，血液衍生的细胞，尿液，脑脊髓液，唾液，痰，泪，汗液，粘液，肿瘤裂解物，和组织培养液，组织提取物如匀浆化的组织，肿瘤组织，细胞提取物，及其组合。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供了一种能与LILRB4特异性结合的抗原结合蛋白，该抗原结合蛋白具有较高的亲和活性和特异性，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是本申请所述全人源抗体与LILRB4的结合情况的实验结果图；
图2是本申请所述全人源抗体与THP-1细胞的结合情况的实验结果图；
图3是本申请所述全人源抗体特异性分析结果图；
图4是本申请所述全人源抗体对THP-1细胞的迁移抑制的实验结果图；
图5是评价本申请所述全人源抗体在THP-1-GFP/CD8+T淋巴细胞共培养体系中活化CD8+ T细胞的能力的实验结果图，其中，图A是TNF-α的水平统计图；图B是IFN-γ的水平统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1 噬菌体抗体库筛选全人源抗LILRB4抗体
利用固相法对全人源噬菌体抗体库进行筛选，将LILRB4蛋白（Human LILRB4/CD85k/ILT3 Protein(ECD, His Tag)，Sino Biological）包被免疫管，加入噬菌体展示抗体库，室温孵育2小时，PBST洗10遍，无菌水洗5遍，Tris-盐酸缓冲液（PH=2.7）洗脱。洗脱后的免疫管加入2mL TG1，37℃孵育30min，将菌液离心涂布氨苄抗性的琼脂培养板。第二天将菌膜刮下扩大培养，进行下一轮筛选。经过三轮富集筛选后，挑取单克隆进行噬菌体ELISA鉴定与LILRB4蛋白结合情况，选择结合阳性的克隆进行序列测定。
实施例2 表达纯化
将噬菌体展示库筛选得到阳性克隆进行密码子优化后，克隆到含有人IgG恒定区基因的真核表达载体pCMV-163中，构建全抗体表达载体。将获得的真核表达载体，使用GibcoExpiFectamine CHO Transfection kit 转染至CHO-S细胞中进行表达，收集含有目的蛋白的细胞培养上清，经过ELISA试验利用羊抗人IgG（Affinity Purified Antibody ToHumanIgG(H+L)，KPL公司）以及辣根酶标记的羊抗人IgG（Goat Anti human IgG HRP，ThermoFisher Scientific）进行双夹心ELISA法检测上清中抗体的含量，利用常规的Protein A亲和纯化目标抗体。得到纯化的全人源抗体2B9、2E5、1D2、1C12、1F2、1G5、1C3等。
本发明中全人源抗体2B9抗体序列如下所示：
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；
重链恒定区包含IgG4的重链恒定区；
重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
轻链恒定区包含Igκ轻链恒定区；
轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
实施例3 ELISA检测全人源抗体与人LILRB4的结合情况
将人LILRB4蛋白（Human LILRB4/CD85k/ILT3 Protein(ECD, His Tag)，SinoBiological）包被ELISA板条，4℃过夜；PBST洗涤后，加入10%的胎牛血清，37℃封闭1小时；加入不同浓度的实施例2制备的全人源抗体和阳性抗体C84，37℃反应1小时；PBST洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG二抗（Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody，HRP ，Invitrogen），37℃反应30分钟；PBST洗涤5次；每孔加入100μL TMB（eBioscience），室温（20±5℃）避光放置2~3min；随后每孔加入100μL 2NH2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450 nm处读取OD值，分析全人源抗体与LILRB4的结合能力。
结果如图1所示。图1显示全人源抗体2B9, 2E5，1D2, 1C12与LILRB4的结合能力最强且与阳性抗体C84相似，全人源抗体1F2、1G5、1C3与LILRB4的结合能力较弱。
本发明中C84为阳性对照抗体，C84抗体的重链序列如SEQ ID NO.12所示，C84抗体的轻链序列如SEQ ID NO.13所示。
实施例4 FACS检测全人源抗体与LILRB4阳性细胞THP-1结合情况
收集人单核白血病细胞THP-1，按照每管5×105个细胞加至1.5 mL EP管中；加入不同浓度的实施例2制备的全人源抗体和阳性抗体C84，冰上避光孵育30min；FACS洗液洗涤后，加入PE荧光标记的羊抗人IgG Fc二抗（Goat Anti-Human IgG Fc SecondaryAntibody，Invitrogen），冰上避光孵育30min；FACS洗液洗涤2遍；每管加入400μL 1%多聚甲醛固定液（Solarbio）固定细胞，混匀后上机检测PE荧光的相对荧光强度，分析全人源抗体与LILRB4阳性肿瘤细胞THP-1的结合能力。
结果如图2所示。图2显示全人源抗体2B9与LILRB4阳性肿瘤细胞THP-1的结合能力最强且强于阳性抗体C84。
实施例5 LILRB4全人源抗体特异性
将LILRB4蛋白（Human LILRB4/CD85k/ILT3 Protein (ECD, His Tag)，SinoBiological）、LILRB1蛋白（LILRB1 Protein, Human, Recombinant (ECD, His Tag)，SinoBiological）、LILRB2蛋白（ILT4 Protein, Human, Recombinant (ECD, His Tag)，SinoBiological）、LILRB3蛋白（LILRB3 Protein, Human, Recombinant (ECD, His Tag)，SinoBiological）、LILRB5蛋白（LILRB5/CD85c Protein, Human, Recombinant (ECD, HisTag)，Sino Biological）等抑制性白细胞免疫球蛋白样受体B亚家族蛋白（The leukocyteIg-like receptor subfamily B LILRB）包被ELISA板条，4℃过夜；PBST洗涤后，加入10%的胎牛血清，37℃封闭1小时；每孔加入浓度为10 μg/mL的全人源抗体100μL，37℃反应1小时；PBST洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG二抗（Goat anti-Human IgG (H+L)Cross-Adsorbed Secondary Antibody，HRP ，Invitrogen），37℃反应30分钟；PBST洗涤5次；每孔加入100μL TMB（eBioscience），室温（20±5℃）避光放置2~3min；随后每孔加入100μL 2N H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450 nm处读取OD值，分析全人源抗体与包括LILRB4在内的LILRB家族蛋白的结合能力。
结果如图3所示。图3显示全人源抗体1C3、1C12、1D2、1F2、1G5、2B9、2E5均能结合LILRB4蛋白，与LILRB家族其他蛋白均不结合。
实施例6 LILRB4全人源抗体抑制THP-1细胞迁移
收集血清饥饿24h的人单核白血病细胞THP-1，以3×105个细胞/孔加入24孔细胞培养板，加入终浓度为10 μg/mL的实施例2制备的全人源抗体和阳性对照抗体C84，置37℃5% CO2培养箱孵育1h；取100 μL细胞与抗体的混合液加入到Transwell (6.5 mmTranswell® with 8.0 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert, Corning)的上室中，并向下室加入700 μL的完全培养基，置37℃ 5% CO2培养箱孵育24h；从下室取100 μL溶液加入到白色透明底96孔板(96-well Black/Clear and White/Clear Bottom PolystyreneMicroplates, Corning)中，加入100 μL的细胞活力检测试剂(CellTiter-Lumi™发光法细胞活力检测试剂盒，碧云天)，室温避光孵育10min后，用多功能酶标仪检测化学发光的相对荧光强度值，以梯度稀释的THP-1细胞及其对应的相对荧光强度值绘制标准曲线，计算下室的细胞数，分析全人源抗体对THP-1细胞迁移的抑制作用。
结果如图4所示。图4显示全人源抗体2B9抑制THP-1细胞迁移的能力最强且优于阳性抗体C84，其他抗体不能抑制THP-1细胞的迁移。
实施例7 抗体活化CD8+ T细胞的能力
从健康供体全血中提取PBMC，用CD8+ T细胞分离试剂盒(CD8+ T Cell IsolationKit, Miltenyi)分离得到CD8+T细胞，按5×104个细胞/孔加到96孔板(96-well ClearRound Bottom TC-treated Microplate, Corning)；加入T细胞激活磁珠(Dynabeads®Human T-Activator CD3/CD28/CD137, GIBCO)，置37℃ 5% CO2培养箱孵育2天；加入终浓度100 μg/mL的抗体，再按5×104个细胞/孔加入人单核白血病细胞THP-1-GFP，置37℃ 5%CO2 培养箱共孵育，5天后收集上清，用Human IFN-γ Elisa Kit (ExCell Bio)和HumanTNF-α Elisa Kit (ExCell Bio)分别检测上清中的IFN-γ和TNF-α的水平，评价抗体在THP-1-GFP/CD8+T淋巴细胞共培养体系中活化CD8+ T细胞的能力。
结果如图5所示。图5显示抗体2B9在THP-1-GFP/CD8+T淋巴细胞共培养中活化CD8+T细胞的能力最强，1C3和C84的活化能力较弱。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 尚健单抗（北京）生物技术有限公司
杭州尚健生物技术有限公司
<120> 抗原结合蛋白及其应用
<141> 2022-06-02
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Ala Thr Gly Gly His Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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1 5
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Ala Thr Gly Gly His Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 9
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Ala Thr Gly Gly His Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 10
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Ala Thr Gly Gly His Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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275 280 285
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385 390 395 400
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 11
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 12
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Ile Tyr Tyr His Thr Ser Leu Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 13
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (10)

1.一种能与LILRB4特异性结合的抗原结合蛋白，所述的抗原结合蛋白包括抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗原结合蛋白包含第一可变区和第二可变区，其中，所述的第一可变区是重链可变区，所述的重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO.3-5所示，所述的第二可变区是轻链可变区，所述的轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6-8所示。
2.根据权利要求1所述的抗原结合蛋白，其特征在于，所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.编码权利要求1或2所述的抗原结合蛋白的核酸。
4.一种包含权利要求3所述的核酸的表达载体。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含权利要求3所述的核酸或权利要求4所述的表达载体。
6.一种制备权利要求1或2所述的抗原结合蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括将权利要求5所述的宿主细胞在适合于表达所述的抗原结合蛋白的条件下培养以及回收所述的抗原结合蛋白。
7.如下任一项所述的产品：
（1）一种双特异性抗体，所述的双特异性抗体包含权利要求1或2所述的抗原结合蛋白；
（2）一种偶联物或缀合物，所述的偶联物或缀合物包含权利要求1或2所述的抗原结合蛋白；
（3）一种药物组合物，所述的药物组合物包含权利要求1或2所述的抗原结合蛋白；
（4）一种嵌合抗原受体蛋白，所述的嵌合抗原受体蛋白包含权利要求1或2所述的抗原结合蛋白。
8.一种检测LILRB4蛋白的工具，其特征在于，所述的工具包括权利要求1或2所述的抗原结合蛋白、权利要求7所述的双特异性抗体或权利要求7所述的偶联物或缀合物。
9.如下任一项所述的应用：
（1）权利要求1或2所述的抗原结合蛋白、权利要求3所述的核酸、权利要求4所述的表达载体、或权利要求7所述的双特异性抗体或权利要求7所述的偶联物或缀合物在制备检测LILRB4蛋白的工具中的应用；
（2）权利要求1或2所述的抗原结合蛋白、权利要求3所述的核酸、权利要求4所述的表达载体、权利要求7所述的双特异性抗体、权利要求7所述的偶联物或缀合物、权利要求7所述的药物组合物或权利要求7所述的嵌合抗原受体蛋白在制备与LILRB4信号传导相关的疾病或病症中的应用，所述的与LILRB4信号传导相关的疾病或病症包括恶性血液疾病、免疫系统疾病或与LILRB4信号传导相关的实体瘤。
10.一种非诊断目的的检测LILRB4蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括使样品与权利要求1或2所述的抗原结合蛋白、权利要求7所述的双特异性抗体或权利要求7所述的偶联物或缀合物接触。
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