CN116355089A - 针对IV型胶原蛋白α3链的抗体 - Google Patents
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Abstract
本文提供了靶向IV型胶原蛋白α3链的抗体或其抗原结合片段。本文还提供了该抗体或其抗原结合片段在诊断Alport综合征方面的应用。
Description
本申请要求于2021年12月28日提交至中国专利局、申请号为202111630527.9的中国专利申请的优先权,在此通过引用将其全文并入本文。
技术领域
本发明属于抗体领域,涉及特异性针对IV型胶原蛋白的单克隆抗体,具体涉及特异性针对其α3链的单克隆抗体。
背景技术
Alport综合征(Alport syndrome)亦称遗传性进行性肾炎,临床特点是血尿、蛋白尿及进行性肾功能减退,部分患者可合并感音神经性耳聋、眼部异常、食管平滑肌瘤等肾外表现。该病由编码肾小球基底膜IV型胶原α3~α5链的基因COL4An(n=3,4,5)基因突变所致。约85%的Alport综合征患者是COL4Α5或COL4Α5和COL4A6两个基因突变导致的X连锁显性遗传型Alport综合征(X-linked Alport syndrome,XL Alport综合征,OMIM 301050),其中男性患者病情较重,40岁前肾衰竭的比例达90%,女性患者病情相对较轻。约15%的Alport综合征患者是COL4A3或COL4A4基因突变导致的常染色体遗传型Alport综合征,其中以常染色体隐性遗传型Alport综合征(autosomal recessive Alport syndrome,ARAlport综合征,OMIM 203780)患者为主,几乎均在30岁前出现肾衰竭。
至今尚无基于人口学的Alport综合征的流行病学资料,但在临床出现血尿的遗传性。肾脏疾病中Alport综合征较常见。如果又有进展至终末期肾病(ESRD)的特点,则Alport综合征最常见。来自美国部分地区的资料显示:Alport综合征基因频率大约为1:5000或1:10000。国外肾活检标本中,Alport综合征占1.6%~4%,中国几组较大宗的肾活检病理研究报告(包括13519例、2315例及1100例)中,也分别有0.729%、1.2%和0.818%的患者被诊断为Alport综合征。不同的资料还显示终末期肾病患者中,Alport综合征占0.2%~5%,占儿童慢性肾功能衰竭患者的1.8%~3%,占各年龄接受肾移植患者的0.6%~2.3%。但是在持续性血尿患者,尤其是儿童患者中,Alport综合征较常见,占11%~27%。迄今,尚未确定Alport综合征的发病率在种族和地域分布上的差异,但美国黑人中相对少见。
临床症状综合征的诊断,目前主要有以下几种方法:
一、依据临床综合征表现诊断:典型的Alport综合征临床表现为“血尿+耳聋+肾衰竭家族史”,这种诊断方法应用广泛,被大多数临床大夫掌握,是诊断Alport综合征最简单常用的方法。但是依据临床综合征表现对Alport综合征的诊断并不确切,也不能区分是哪一种遗传型,而且对临床上无耳聋症状的Alport综合征患者容易漏诊。
依据肾组织电镜诊断:Alport综合征患者肾组织电镜典型的病理改变是肾小球基底膜厚薄不均,致密层撕裂、分层、篮网状、虫蚀状改变。但依据电镜诊断Alport综合征也存在局限性,首先研究发现小年龄的Alport综合征患者肾组织电镜改变不典型,常表现为肾小球基底膜弥漫变薄,容易误诊为薄基底膜肾病。其次即使患者肾组织电镜呈Alport综合征典型改变,也不能区分是哪一种遗传型。
二、依据基因突变诊断:Alport综合征的X连锁显性遗传型Alport综合征致病基因是COL4A5基因或COL4A5基因和COL4A6基因共同突变;常染色体隐性遗传型Alport综合征是由COL4A3基因或COL4A4基因的纯合突变或复合杂合突变导致;常染色体显性遗传型Alport综合征是由COL4A3基因或COL4A4基因的杂合突变导致。基因突变检测可以确诊Alport综合征,而且在预测疾病进展的风险、产前基因诊断和再生育的遗传咨询以及指导治疗方面有重要作用。但是该方法存在约10%的漏检并且不能判断疾病的进程。
三、依据肾组织或皮肤组织Ⅳ型胶原α链染色诊断:肾组织或皮肤组织IV型胶原α3链染色方法不仅可以确诊Alport综合征,而且可以诊断常染色体遗传型Alport综合征。常染色体遗传型Alport综合征患者肾组织Ⅳ型胶原α3链染色在肾小球呈阴性,肾小管呈阴性;皮肤基底膜Ⅳ型胶原α3链染色阴性。
因此,使用IV型胶原α3链抗体检测肾脏及皮肤基底膜中IV型胶原的表达情况是最为理想的Alport综合症诊断方法。
免疫荧光学检查和免疫组化检测抗原是常见的疾病诊断方法,具有高灵敏度、方便检测的优点,此方法依赖于高特异性抗体识别抗原。因此,有必要研发一种具有高亲和力的抗α3链单抗。
发明内容
在一方面,本文提供了靶向IV型胶原蛋白α3链的抗体或其抗原结合片段,其包括重链可变区,所述重链可变区的HCDR1包括氨基酸序列DSNIH(SEQ ID NO:1);HCDR2包括氨基酸序列WIDPDNGDSEYAPKFQG(SEQ ID NO:2);HCDR3包括氨基酸序列VNWDYFDY(SEQ ID NO:3)。
在一些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段还包括轻链可变区,所述轻链可变区的LCDR1包括氨基酸序列RSSQSLVHNNGNTYLH(SEQ ID NO:4);LCDR2包括氨基酸序列KVSNRFS(SEQ ID NO:5);LCDR3包括氨基酸序列SQSTHIPIT(SEQ ID NO:6)。
在一些实施方案中,所述重链可变区包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或与SEQID NO:7所示的氨基酸序列有至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的功能性变体。
在一些实施方案中,所述轻链可变区包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与SEQID NO:8所示的氨基酸序列有至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的功能性变体。
在一些实施方案中,所述重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列,所述轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述抗体为单克隆抗体、单链抗体或单域抗体。
在一些实施方案中,所述抗体为鼠抗体或人源化抗体。
在一些实施方案中,所述抗体的重链包括SEQ ID NO:9所示的信号肽序列,和/或所述抗体的轻链包括SEQ ID NO:10所示的信号肽序列。
在一些实施方案中,所述抗体的重链和/或轻链包括纯化标签。
在一些实施方案中,所述抗原结合片段为Fab、Fab'或F(ab')2。
在一些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段还包括Fc片段。
在一些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段通过ELISA测定的与IV型胶原蛋白α3链结合的EC50值为约4.644ng/ml;或者通过生物膜层干涉(BLI)技术测定的与IV型胶原蛋白α3链结合的KD值小于0.4nM,优选为约3.987×10-9M。
另一方面,本文提供了核酸分子,其编码上述抗体或其抗原结合片段。
另一方面,本文提供了包括上述核酸分子的表达载体。
另一方面,本文提供了包括上述核酸分子或表达载体的宿主细胞。
另一方面,本文提供了表达上述抗体或其抗原结合片段的宿主细胞。
在一些实施方案中,所述宿主细胞为小鼠细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞,所述骨髓瘤细胞优选SP2/0、YB2/0、NS0或P3X63Ag8.653细胞。
在一些实施方案中,所述宿主细胞为哺乳动物细胞,优选CHO细胞、CHO-S细胞、HEK-293细胞、BHK细胞或PER-C6细胞。
另一方面,本文提供了免疫偶联物,其包括上述抗体或其抗原结合片段和可检测标签。
在一些实施方案中,所述可检测标签具有酶学活性。
在一些实施方案中,所述可检测标签为荧光基团、荧光蛋白或放射性同位素。
另一方面,本文提供了检测试剂盒,其包括上述抗体或其抗原结合片段或免疫偶联物。
在一些实施方案中,所述检测试剂盒还包括靶向IV型胶原蛋白α1链的抗体和/或靶向IV型胶原蛋白α5链的抗体。
在一些实施方案中,所述检测试剂盒还包括说明如何使用所述抗体、抗原结合片段或免疫偶联物来诊断Alport综合征的说明书。
本文所提供的抗体、抗原结合片段、核酸分子、宿主细胞、免疫偶联物等可用于检测样品中是否存在IV型胶原蛋白α3链或其含量,还可以用于在受试者中鉴定Alport综合征。
另一方面,本文提供了检测样品中是否存在IV型胶原蛋白α3链或其含量的方法,包括:
1)使所述样品与上述抗体或其抗原结合片段或免疫偶联物接触,以及
2)通过检测是否存在IV型胶原蛋白α3链与所述抗体或其抗原结合片段形成的结合复合物或其含量来确定所述样品中是否存在IV型胶原蛋白α3链或其含量。
另一方面,本文提供了在受试者中鉴定Alport综合征的方法,其包括:
1)使来自所述受试者的生物样品与上述抗体或其抗原结合片段或免疫偶联物接触,以及
2)检测是否存在IV型胶原蛋白α3链与所述抗体或其抗原结合片段形成的结合复合物或其含量,以确定所述受试者是否存在Alport综合征或其严重性。
在一些实施方案中,所述生物样品来自肾组织和/或皮肤组织。
在一些实施方案中,所述Alport综合征为X连锁显性遗传型Alport综合征或常染色体隐性遗传型Alport综合征。
另一方面,本文提供了上述抗体或其抗原结合片段或免疫偶联物在制备用于诊断Alport综合征的试剂中的应用。
本发明所提供单克隆抗体特异性结合人IV型胶原蛋白α3链抗体,可用于肾脏病诊断中确诊Alport综合征。且本发明提供的单克隆抗体不与α5、α1或其他胶原蛋白链结合,可以诊断Alport综合征具体类型,比如X连锁显性遗传型男性、女性以及常染色体隐性遗传型Alport综合征。
附图说明
图1显示了使用IV型胶原蛋白多肽免疫小鼠之后的小鼠血清效价检测结果。
图2显示了实施例中抗体纯度检测结果。样品顺序:M:Marker;1:4E5E2-1还原,纯度99%;2:小鼠IgG还原;3:4E5E2-1非还原,纯度84%;4:小鼠IgG非还原。
图3显示了实施例中抗体的EC50测定结果。
图4显示了实施例中抗体的亲和力测定结果。
图5显示了实施例中抗体热加速实验结果。
具体实施方式
除非另有说明,本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义。
术语“或”是指列举的可选择要素中的单个要素,除非上下文明确地另外指出。术语“和/或”是指所列举的可选择要素中的任意一个、任意两个、任意三个、任意更多个或其全部。
本文所用术语“约”表示给定数值的±10%范围内的值。
本文所用术语“包含”、“含有”、“具有”以及类似的表述表示不排除未列举的要素。这些术语也包括仅由所列举的要素组成的情形。
本文使用的术语“抗体”以它的最广泛意义使用,包括包含一个或更多个特异性结合抗原的抗原结合结构域的免疫球蛋白或其他类型分子,为对特定抗原表现出结合特异性的蛋白质或多肽。抗体的具体实例可包括完整抗体(例如经典四链抗体分子)、单链抗体、单域抗体、多特异性抗体等。经典抗体分子通常为由2个相同重链和2个相同轻链通过二硫键相互连接组成的四聚体。根据氨基酸序列的保守性差异,将重链和轻链分为位于氨基端的可变区(V)和位于羧基端的恒定区(C)。可变区用于识别和结合抗原,恒定区(如Fc片段)用于启动下游效应,比如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。在重链和轻链的可变区内,分别有三个局部区域的氨基酸组成和排列顺序具有更高的变异程度,为抗体与抗原结合的关键位置,因而也称为互补决定区(CDR)。CDR的氨基酸序列可以使用本领域公认的编号方案,例如Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact容易地确定。在一个具体实施方案中,已经根据IMGT编号方案确定了本文所述的抗体的CDR。在本文中,三个重链互补决定区分别称为HCDR1、HCDR2和HCDR3,三个轻链互补决定区分别称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。
根据抗体重链恒定区的氨基酸序列,可将抗体分为五种主要的不同类型:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些抗体类型根据铰链区的大小,链间二硫键的位置和分子量的不同可进一步分为亚类,例如,IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3等。根据抗体轻链恒定区氨基酸组成和排列的不同,可将轻链分为κ和λ两种类型。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构象在本领域内是已知的。
抗体的“抗原结合片段”指抗体分子中参与抗原特异性结合的氨基酸片段,例如,Fab、Fab’和F(ab’)2等。本领域技术人员已知如何获得这些抗原结合片段。例如,经典抗体分子可经木瓜蛋白酶消化而得到Fab片段,经胃蛋白酶消化得到F(ab’)2,通过以还原剂处理断开F(ab’)2铰链区之间的二硫键而形成Fab’片段。
本文使用的术语“单链抗体(single chain fragment variable,scFv)”,是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽连接成一条肽链而构成。通过正确折叠,来自重链和轻链的可变区通过非共价键相互作用形成Fv段,因而scFv能较好地保留其对抗原的亲和活性。
本文使用的术语“单域抗体(single domain antibody,sdAb)”,或者也称为“VHH抗体”,指具有抗原结合能力,包括重链可变区而无轻链的抗体分子。从结构上看,单域抗体也可以认为是经典四链抗体分子的片段。单域抗体首先在骆驼科动物中被发现,随后,研究人员通过抗体库(例如噬菌体展示文库)筛选发现了更多的具有抗原结合能力的单域抗体。单域抗体相对于普通抗体分子(例如,经典抗体分子)具有一些优势,例如包括但不限于:分子量更小,使用于人体时易于到达普通抗体分子难以到达的组织或部位,或者,能够接触到蛋白或多肽中普通抗体分子难以接触到的抗原表位;更加稳定,能够耐受例如温度和pH的变化以及变性剂和蛋白酶的作用。
本文使用的术语“Fc片段”指Y形经典抗体分子的柄部区域,即可结晶片段(fragment crystallizable,Fc),包括重链的第二和第三恒定结构域(CH2和CH3结构域)。可通过蛋白水解酶(如木瓜蛋白酶)水解抗体分子得到抗体Fc区。在一些实例中,Fc区可包含铰链、CH2和CH3。当Fc区包含铰链时可介导两个含Fc的多肽之间的二聚化。Fc片段可来自IgG、IgM、IgD、IgE或IgA。在一些实例中,Fc区来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。“Fc片段”还包括来自天然Fc片段,经改动但仍保持其效应功能的变体Fc片段。“变体Fc片段”包含在天然Fc片段的氨基酸序列上具有至少一个氨基酸变动的氨基酸序列。在一些实例中,变体Fc片段相比于亲本Fc片段(天然Fc片段)具有至少一个氨基酸取代,例如在亲本Fc片段中约1至约10个氨基酸被取代,且优选约1至约5个氨基酸取代。在一些实例中,变体Fc片段Fc区与亲本Fc片段具有至少约80%序列一致性、至少约90%序列一致性、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%序列一致性。“Fc片段”的效应功能可包括与Fc受体的结合、Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、介导吞噬作用等。
本文使用的术语“鼠抗体”指可变区和恒定区(如果有的话)衍生自小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗体。鼠抗体可方便地以相应抗原免疫小鼠或大鼠并从其分离目的抗体而获得。或者,在以相应抗原免疫小鼠或大鼠后,分离并培养表达目的抗体的细胞(如B细胞)而获得。又或者,在以相应抗原免疫小鼠或大鼠后,分离并培养表达目的抗体的细胞,将其与永生化细胞如骨髓瘤细胞融合而获得杂交瘤细胞,培养杂交瘤细胞则可长期和大量获得目的抗体(如单克隆抗体)。在一些实施方案中,所述“鼠抗体”是小鼠抗体。术语“人源化抗体”是指对非人抗体,即可变区和恒定区(如果有的话)非衍生自人免疫球蛋白的抗体进行人为改造以使其含有人抗体的氨基酸序列,由此获得的嵌合抗体。人源化抗体可以包含人抗体的恒定区和/或骨架区。人源化抗体可以通过基因工程手段获得,例如以人抗体的恒定区替换鼠抗体的恒定区和/或以人抗体的骨架区替换鼠抗体的骨架区。这种人源化改造通常不影响原抗体与对应抗原的结合特异性,因此这样的抗原也包括在本发明的范围内。
本文使用的术语“单克隆抗体”指均一的、仅针对某一特定抗原表位的抗体。与典型地包括针对不同抗原决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体相比,每种单克隆抗体针对抗原上的单个抗原决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的均一特征,不解释为需要通过任何特定方法产生的抗体。本发明的单克隆抗体可通过本领域公知的杂交瘤方法或重组DNA方法产生,或通过本文其它地方描述的筛选方法获得。
本文使用的术语“免疫偶联物”指连接有其他化学基团或肽段的抗体或其抗原结合片段。出于本发明的目的,所述化学基团或肽段可以有利于对该抗体或其抗原结合片段的检测,或者有利于对该抗体或其抗原结合片段与对应抗原(如IV型胶原蛋白α3链)形成的免疫复合物(即抗原抗体复合物)的检测,因此可以包括“可检测标签”。术语“可检测标签”可用于指示样品中相应抗原的存在或含量,或者用于跟踪相应抗原在细胞或体内的位置。可检测标签的实例包括免疫检测中可使用的各种酶,例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP);荧光基团(如FAM、FITC)或荧光蛋白(如GFP);放射性同位素(例如3H、14C、35S)。当可检测标签为酶时,可通过酶的酶学活性来确定与酶连接的抗体或其抗原结合片段存在或含量。
本文使用的术语“纯化标签”指有助于从表达目的多肽或蛋白的细胞培养物或上清液中分离该目的多肽或蛋白的氨基酸序列。其实例包括但不限于His6标签、Flag标签、MBP标签、GST标签、SUMO标签等。
对于抗体或其抗原结合片段来说,“靶向”、“针对”或“特异性结合”指,相对于环境中同时存在的其他分子,一种分子(例如抗体或其抗原结合片段)对另一种分子(如抗原)具有更高的结合亲和力。一种分子可以靶向、针对或特异性结合一种以上的分子,例如双特异性抗体可以对两种不同抗原具有相对于其他分子而言更高的结合亲和力。可以通过一些参数测量来衡量抗体对抗原的结合亲和力,例如抗体与抗原结合的EC50值或KD值。
EC50(concentration for 50%of maximal effect)指引起50%最大效应的浓度。在酶联免疫吸附测定(ELISA)中用于表示抗体分子与对应抗原的结合能力时,可指产生最大检测信号(如比色或荧光强度)一半时的抗体分子浓度。EC50值越低,则与抗原的结合亲和力越大。
KD值也可以用于衡量抗体与其抗原之间的结合亲和力。KD值是抗体与其抗原之间的平衡解离常数,即koff/kon的比值。因此KD值越低(浓度越低),抗体的亲和力越高。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用且指氨基酸残基的聚合物。氨基酸残基的此类聚合物可含有天然或非天然氨基酸残基且包括但不限于氨基酸残基构成的肽、寡肽、二聚体、三聚体和多聚体。全长蛋白与其片段皆涵盖于该定义中。该术语亦包括多肽的表达后修饰,例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化和类似修饰。此外,出于本发明的目的,“多肽”指一种蛋白质,其包括对天然序列的修饰,诸如缺失、添加和取代(实际上通常为保守的),只要该蛋白质保持所需活性即可。这些修饰可为有目的的,如经由定点突变诱发;或可为偶然的,诸如经由产生蛋白质的宿主的突变或因PCR扩增所致的误差。
本文所用的术语“功能性变体”指,在母体蛋白分子(例如天然蛋白分子)基础上引入一个或多个氨基酸插入、缺失或替换后所获得的变体分子,其仍然保留了母体蛋白分子的至少部分功能(尤其是所关注的功能,例如与对应抗原的结合能力)。例如,抗体分子的功能性变体可保留其母体分子对抗原结合能力的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%,或甚至具有比起母体分子更高的结合能力。在一些实施方案中,抗体分子的功能性变体可保留其母体分子对抗原结合亲和力的至少80%、85%、90%、95%或甚至100%或以上。对于抗体分子或其抗原结合片段来说,功能性变体通常包括在可变区骨架序列和/或恒定区存在氨基酸改变,但并不排除可对CDR区序列进行一个或少数几个氨基酸改动。
本文中,术语“核酸分子”、“核酸”和“多核苷酸”可互换使用,指核苷酸聚合物。此类核苷酸聚合物可含有天然和/或非天然核苷酸且包括(但不限于)DNA、RNA和PNA。“核酸序列”指包含于核酸分子或多核苷酸中的核苷酸线性序列。
术语“载体”指可经工程改造以含有目的多核苷酸(例如目的多肽的编码序列)的核酸分子或可在宿主细胞中复制的核酸分子(例如,核酸、质粒、或病毒等)。载体可包括以下组件中的一个或更多个:复制起点、一或更多个调控目的多核苷酸的表达的调控序列(诸如启动子和/或增强子)和/或一个或更多个可选择标记物基因(诸如抗生素抗性基因和可用于比色分析中的基因,例如β-半乳糖)。术语“表达载体”指用于在宿主细胞中表达目的多肽的载体。
“宿主细胞”指可为或已为载体或经分离多核苷酸的接受体的细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。示例性真核细胞包括哺乳动物细胞,诸如灵长类动物或非灵长类动物细胞;真菌细胞,诸如酵母;植物细胞;以及昆虫细胞。非限制性示例性哺乳动物细胞包括(但不限于)CHO细胞、HEK-293细胞、BHK细胞或PER-C6细胞,以及其衍生细胞,诸如293-6E、CHO-DG44、CHO-K1、CHO-S和CHO-DS细胞。在一些实施方案中,本发明提供的抗α3单链抗体由哺乳动物细胞分泌产生。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代,且后代可能由于自然、偶然或故意突变而不一定与原始亲代细胞完全一致(在形态或基因组DNA互补方面)。宿主细胞可以分离的细胞或细胞系,也包括在活体内经本文提供的核酸分子或表达载体转染的细胞。
“受试者”包括动物,例如哺乳动物,包括(但不限于)灵长类动物、啮齿动物、猿猴、猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物、猪科动物、绵羊、山羊、哺乳类实验动物、哺乳类农畜、哺乳类运动动物和哺乳类宠物。受试者可为雄性或雌性且可为任何适龄受试者,包括婴儿、幼年、青年、成年和老年受试者。在一些实例中,受试者指需要诊断或治疗疾病或病症的个体。在一些实例中,接受诊断或治疗的受试者可为患者,其患有与该诊断或治疗有关联的病症,或有风险患上该病症。在特定实例中,受试者为人类,诸如人类患者。该术语通常可与“患者”、“检测对象”、“治疗对象”等互换使用。
本文使用的“样品”或“生物样品”指来自受试者的物质。所述物质包括(但不限于)血液(例如全血)、血浆、血清、尿液、羊水、滑液、内皮细胞、白血球、单核细胞、其他细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和脾脏。
当提及氨基酸或核苷酸序列时,术语“序列一致性(sequence identity)”(也称为“序列同一性”)指两氨基酸或核苷酸序列(例如查询序列和参照序列)之间一致性程度的量,一般以百分比表示。通常,在计算两氨基酸或核苷酸序列之间的一致性百分比之前,先进行序列比对(alignment)并引入缺口(gap)(如果有的话)。如果在某个比对位置,两序列中的氨基酸残基或碱基相同,则认为两序列在该位置一致或匹配;两序列中的氨基酸残基或碱基不同,则认为在该位置不一致或错配。在一些算法中,用匹配位置数除以比对窗口中的位置总数以获得序列一致性。在另一些算法中,还将缺口数量和/或缺口长度考虑在内。常用的序列对比算法或软件包括DANMAN、CLUSTALW、MAFFT、BLAST、MUSCLE等。出于本发明的目的,可以采用公开的比对软件BLAST(可从https://www.ncbi.nlm.nih.gov/获得),通过使用缺省设置来获得最佳序列比对并计算出两氨基酸或核苷酸序列之间的序列一致性。
本文提供了针对IV型胶原α3链的单克隆抗体或其功能片段,其包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含分别在如下HCDR1、HCDR2、HCDR3序列中替换、插入或缺失1个、2个或3个氨基酸残基的氨基酸序列,所述轻链可变区包含分别在LCDR1、LCDR2和LCDR3序列中替换、插入或缺失1个、2个或3个氨基酸残基的氨基酸序列:
HCDR1的氨基酸序列为DSNIH(SEQ ID NO:1);
HCDR2的氨基酸序列为WIDPDNGDSEYAPKFQG(SEQ ID NO:2);
HCDR3的氨基酸序列为VNWDYFDY(SEQ ID NO:3);
LCDR1的氨基酸序列为RSSQSLVHNNGNTYLH(SEQ ID NO:4);
LCDR2的氨基酸序列为KVSNRFS(SEQ ID NO:5);
LCDR3的氨基酸序列为SQSTHIPIT(SEQ ID NO:6)。
本文提供了针对IV型胶原α3链的单克隆抗体或其功能片段,其包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含分别与如下HCDR1、HCDR2、HCDR3序列具有80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含分别与如下LCDR1、LCDR2和LCDR3序列具有80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列:
HCDR1的氨基酸序列为DSNIH(SEQ ID NO:1);
HCDR2的氨基酸序列为WIDPDNGDSEYAPKFQG(SEQ ID NO:2);
HCDR3的氨基酸序列为VNWDYFDY(SEQ ID NO:3);
LCDR1的氨基酸序列为RSSQSLVHNNGNTYLH(SEQ ID NO:4);
LCDR2的氨基酸序列为KVSNRFS(SEQ ID NO:5);
LCDR3的氨基酸序列为SQSTHIPIT(SEQ ID NO:6)。
在一些实施方案中,所述的抗α3链抗体的重链可变区包含如下HCDR1、HCDR2、和HCDR3序列所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如下LCDR1、LCDR2和LCDR3所示的氨基酸序列:
HCDR1的氨基酸序列为DSNIH(SEQ ID NO:1);
HCDR2的氨基酸序列为WIDPDNGDSEYAPKFQG(SEQ ID NO:2);
HCDR3的氨基酸序列为VNWDYFDY(SEQ ID NO:3);
LCDR1的氨基酸序列为RSSQSLVHNNGNTYLH(SEQ ID NO:4);
LCDR2的氨基酸序列为KVSNRFS(SEQ ID NO:5);
LCDR3的氨基酸序列为SQSTHIPIT(SEQ ID NO:6)。
在一些实施方案中,本文所提供的抗人IV型胶原蛋白α3链抗体进一步包含抗体框架区。
在一些实施方案中,本发明提供的抗人IV型胶原蛋白α3链抗体的重链序列包含如下所示的氨基酸序列:EVQLQQSGAELVRSGASVKLSCTASGFNIKDSNIHWLIQRPEQDLEWIGWIDPDNGDSE YAPKFQGEATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYFCNAVNWDYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:7)。
在一些实施方案中,本发明提供的抗人IV型胶原蛋白α3链抗体的轻链序列包含如下所示的氨基酸序列:DVVVTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHNNGNTYLHWYLQRPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRVSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHIPITFGSGTKLEIK(SEQ IDNO:8)。
在一些实施方案中,所述的抗α3链单抗的重链和/或轻链进一步包含信号肽序列。
在一些实施方案中,所述重链信号肽序列为MKCSWVIFFLMAVVIGINS(SEQ ID NO:9)。
在一些实施方案中,所述轻链信号肽序列为MKLPVRLLVLMFWIPVSSS(SEQ ID NO:10)。
在一些实施方案中,本文提供的抗人IV型胶原蛋白α3链的抗体,进一步包含恒定区序列。
在一些实施方案中,本文所述提供的抗人IV型胶原蛋白抗α3链的抗体属于IgG亚型,在一些实施方案中,属于IgG1亚型。
在一些实施方案中,本发明提供的抗人IV型胶原蛋白α3链抗体与人IV型胶原蛋白α3链之间的解离常数KD小于0.4nM。
在一些实施方案中,本文提供的单克隆抗体是以构建的IV型胶原蛋白的一段多肽为免疫原,小鼠为免疫对象,通过免疫小鼠,取小鼠脾细胞,与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞分泌产生,所述骨髓瘤细胞包括但不限于SP2/0、YB2/0、NS0或P3X63Ag8.653细胞。
在一些实施方案中,本文提供的抗α3单链抗体由小鼠腹水产生。
在一些实施方案中,本文提供的抗α3单链抗体由哺乳动物细胞分泌产生,所述细胞包括但不限于CHO细胞、CHO-S细胞、HEK-293细胞、BHK细胞或PER-C6细胞。
在一些实施方案中,本发明提供的抗α3链抗体可用于制备Alport综合征检测试剂盒。
在一些实施方案中,本文所述检测试剂盒进一步地可以包含抗α5抗体和/或抗α1抗体。
在一些实施方案中,本文所述的检测试剂盒是免疫荧光检测试剂盒、免疫组化检测试剂盒等本领域公知常识内检测IV型胶原的各种检测试剂盒。
靶向IV型胶原蛋白α3链的抗体或其抗原结合片段
本文提供了特异性结合IV型胶原蛋白α3链的抗体或其抗原结合片段。该抗体或其抗原结合片段以相对较高的结合亲和力结合IV型胶原蛋白α3链。例如下文实施例中所阐述的,抗体或其抗原结合片段与IV型胶原蛋白α3链结合能力可通过诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)的测定方法来进行测量。另外,也可通过本领域已知的其他蛋白相互作用测定方法来测定,例如,表面等离子体共振技术(SPR)和生物层干涉(BLI)技术。
在一些实施方案中,该靶向IV型胶原蛋白α3链的抗体或其抗原结合片段通过以IV型胶原蛋白α3链免疫小鼠获得。在一些实施方案中,该靶向IV型胶原蛋白α3链的抗体或其抗原结合片段通过基因工程技术获得,例如通过向宿主细胞中引入表达该抗体或其抗原结合片段的表达载体并培养所述宿主细胞而获得。
在一些实施方案中,该抗原结合片段为单链抗体(scFv)。另外,发明人预期,在本文提供的CDR序列基础上,本领域技术人员可获得对应的单域抗体(sdAb).
本文提供了靶向IV型胶原蛋白α3链的抗体或其抗原结合片段的重链和轻链CDR序列,它们分别如SEQ ID NO:1-3和4-6所示。
在本文已提供这些CDR序列基础上,本领域技术人员可构建各种具有IV型胶原蛋白α3链结合能力的多肽构建体(包括抗体或其抗原结合片段),这包括使用来自不同抗体分子的骨架区(FR)和/或恒定区与这些CDR序列进行组合。这些骨架区包括来自人抗体或动物(如小鼠、大鼠、羊、骆驼等)抗体的天然骨架区序列。这些骨架区还可以包括对天然骨架区序列改动所产生的骨架区序列变体。通过使本文提供的CDR序列与不同的骨架区序列组合形成重链可变区,并检测其与IV型胶原蛋白α3链的结合能力,可容易地获得特异性结合IV型胶原蛋白α3链的多肽构建体。
在一些实施方案中,本发明提供的靶向IV型胶原蛋白α3链的抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括与SEQ ID NO:7所示序列有至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,本发明提供的靶向IV型胶原蛋白α3链的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包括与SEQ ID NO:8所示序列有至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
本领域技术人员可以理解的是,在本文提供的具体序列基础上,可以通过对少数氨基酸进行替换、删除、添加并验证或筛选所得产物与IV型胶原蛋白α3链的结合能力或生物学活性,从而获得本文提供的靶向IV型胶原蛋白α3链的抗体分子的相应变体,这些变体也应包括在本发明的范围内。例如,本文提供的抗体分子在其全长或可变区序列或CDR序列上,可以有至少1个且不超过10个,例如不超过5、4、3、2或1个氨基酸的改变。例如,可以在SEQ ID NO:7所示的重链可变区序列上有至少1个且不超过10个,例如不超过5、4、3、2或1个氨基酸的改变,或者可以在SEQ ID NO:8所示的轻链可变区序列上有至少1个且不超过10个,例如不超过5、4、3、2或1个氨基酸的改变,或者可以在SEQ ID NO:1-3的重链CDR中具有总计不超过5、4、3、2或1个氨基酸的改变,或者可以在SEQ ID NO:4-6所示的轻链CDR中具有总计不超过5、4、3、2或1个氨基酸的改变,或者可以在SEQ ID NO:1-3所示的任意一个HCDR中具有不超过3、2或1个氨基酸的改变,或者可以在SEQ ID NO:4-6所示的任意一个LCDR中具有不超过3、2或1个氨基酸的改变,或者所述抗体具有以上修饰的任意组合。
预期本文描述的抗体或其抗原结合片段可包含保守氨基酸取代。保守氨基酸取代通常可被描述为一种氨基酸残基被类似化学结构的另一种氨基酸残基取代,并且对多肽的功能、活性或其他生物学性质几乎没有或基本上没有影响。保守氨基酸取代是本领域众所周知的。保守性取代可例如是下列(a)-(e)组中的一个氨基酸被同组内的另一个氨基酸取代:(a)小的脂肪族非极性或弱极性残基:Ala、Ser、Thr、Pro和Gly;(b)极性带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺:Asp、Asn、Glu和Gln;(c)极性带正电荷的残基:His、Arg和Lys;(d)大的脂肪族非极性残基:Met、Leu、Ile、Val和Cys;和(e)芳族残基:Phe、Tyr和Trp。
免疫偶联物
本文提供了含有至少一个本文提供的特异性结合IV型胶原蛋白α3链的抗体或其抗原结合片段以及至少一个其他功能部分的偶联物。
所述其他部分可为化学基团,例如治疗剂,诸如细胞毒性剂,或可为示踪剂。在一些实例中,所述功能部分可为靶向部分、小分子药物(例如小于500Da的非多肽药物)、毒素、细胞生长抑制剂、细胞毒性剂、免疫抑制剂、适合于诊断目的的放射性试剂、用于治疗目的的放射性金属离子等。
在一些实施方案中,免疫偶联物为含有一个或更多个本文提供的抗体或其抗原结合片段和治疗剂的抗体药物偶联物(ADC),其具有细胞毒性,抑制细胞生长,或者提供一些治疗益处。在一些实施例中,细胞毒性剂为化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(亦即,放射性偶联物)。在一些实例中,本发明提供的抗体药物偶联物允许药物部分靶向递送至肿瘤。在一些情况下,此可引起肿瘤细胞的靶向杀死。
在一些实例中,治疗剂包括例如道诺霉素(daunomycin)、阿霉素(doxorubicin)、甲氨喋呤(methotrexate)、长春地辛(vindesine)、类美登素(maytansinoid)等。在一些实例中,治疗剂具有细胞内活性。在一些实例中,结合IV型胶原蛋白α3链的免疫偶联物经内化且治疗剂具有阻断细胞蛋白质合成活性,阻断核酸合成活性,并导致细胞生长停滞或死亡。
在一些实施方案中,免疫偶联物含有一个或更多个本文提供的抗体或其抗原结合片段和示踪剂。该免疫偶联物可用于研究或诊断目的,例如用于活体内检测癌症。示踪剂可直接或间接产生可侦测信号。例如,示踪剂可为射性同位素,如3H、14C、32P、35S、123I;荧光(荧光团)或化学发光(发色团)化合物,诸如荧光异硫氰酸盐、若丹明或荧光素;显影剂;或金属离子。在一些实施例中,示踪剂为用于闪烁摄影研究的放射性原子,例如99Tc或123I,或用于核磁共振(NMR)成像(亦称为磁共振成像,MRI)的自旋标记,例如89Zr、123I、19F、13C、15N和17O。89Zr可与多种金属螯合剂螯合且结合至抗体,例如用于PET成像。
本文提供的抗体或其抗原结合片段与其他功能部分的连接可为共价或非共价连接。非共价连接的实例可包括通过生物素-亲和素系统(Biotin-Avidin System)。共价连接的实例可包括各种化学接头,包括肽接头、可裂解接头、或不可裂解接头。示例性接头组分包括6-顺丁烯二酰亚胺基己酰基(MC)、顺丁烯二酰亚胺基丙酰基(MP)、缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(ala-phe)、对氨基苯甲氧基羰基(PAB)、N-丁二酰亚胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)、N-丁二酰亚胺基4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1甲酸酯(SMCC)和N-丁二酰亚胺基(4-碘-乙酰基)胺基苯甲酸酯(SIAB)。
在一些实施方案中,接头可包含氨基酸残基。例示性氨基酸接头组分包括二肽、三肽、四肽或五肽。示例性二肽包括:缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(afa-phe)。示例性三肽包括:甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。包含氨基酸接头组分的氨基酸残基包括天然存在的残基以及非天然存在的氨基酸类似物,诸如瓜氨酸。氨基酸接头组分可在其选择性方面经设计和优化,以通过特定酶,例如肿瘤相关蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D、胞浆素蛋白酶进行酶促裂解。
本文提供的抗体或其抗原结合片段与其他功能部分的连接可使用多种双官能蛋白质偶合剂制得,诸如N-丁二酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚胺基硫杂环戊烷(IT)、酰亚胺酯的双官能衍生物(诸如己二酰亚胺酸二甲酯HCl)、活性酯(诸如二丁二酰亚胺基基质)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
在一些实施方案中,本文提供了多特异性的抗体分子,例如双特异性抗体分子,其至少包括一个结合IV型胶原蛋白α3链的结合结构域(如本发明的抗体或抗原结合片段,或重链可变区或轻链可变区)和一个或更多个额外的结合结构域。该一个或更多个额外的结合结构域可结合至除IV型胶原蛋白α3链外的第二抗原或蛋白质。
在一些实施方案中,多特异性的抗体或其抗原结合片段还包括Fc片段。Fc片段的存在便于结合结构域的多聚化,并且可提供相关的效应功能。
包括靶向IV型胶原蛋白α3链的抗体或其抗原结合片段的检测或诊断试剂盒
本文提供的靶向IV型胶原蛋白α3链的抗体或其抗原结合片段以及包括该抗体或其抗原结合片段的其他形式的分子(例如免疫偶联物或双特异性抗体分子)可与样品中的IV型胶原蛋白α3链特异性结合。通过检测IV型胶原蛋白α3链-抗体或其抗原结合片段与其抗原(IV型胶原蛋白α3链所形成的)复合物的量,或者检测该复合物中的抗体或其抗原结合片段的量,可方便地确定样品中的IV型胶原蛋白α3链含量(或是否存在)。
如上文所描述的,用于该目的,本文提供的抗体或其抗原结合片段可与各种检测标签偶联,以便于通过各种手段进行检测,这些手段包括但不限于生物发光、荧光、放射性标记、酶促反应产物的产量等。将检测到的样品中的IV型胶原蛋白α3链的含量与正常人群中正常IV型胶原蛋白α3链的含量进行比较,可用于确定提供该样品的受试者的疾病状况或严重程度。通过在受试者治疗过程中随时间反复检测IV型胶原蛋白α3链含量变化,还可用于确定治疗手段是否有效,从而为治疗方案的调整提供依据。
本文提供的抗体或其抗原结合片段以及包括该抗体或其抗原结合片段的其他形式分子(例如免疫偶联物或双特异性抗体分子)可被置于容器中,以形成检测或诊断试剂盒。这些容器可以是盒、安瓿瓶、小瓶、管子、袋子或本领域已知的合适容器形式。这些容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或适用于保存蛋白质保存的其他材料制成。如果需要,与该容器一起提供的还包括使用说明书。说明书通常可包括关于如何使用抗体或其抗原结合片段进行免疫检测的信息,例如可包括如何对样品IV型胶原蛋白α3链进行定量的说明;如何根据检测结果诊断Alport综合征的说明。说明书可直接打印在容器(如果存在的话)上,或作为贴于容器的标签,或者作为提供于容器中或与容器在一起的单独的纸、册、卡或折叠印刷品。
下面通过实施例,并结合附图,对本发明的技术方案作进一步详细的说明。除非另有说明,下文描述的实施例的方法和材料均为可以通过市场购买获得的常规产品。本发明所属领域的技术人员将会理解,下文描述的方法和材料,仅是示例性的,而不应视为限定本发明的范围。
本发明的实施方式并不限于上述实施例所述,在不偏离本发明的精神和范围的情况下,本领域普通技术人员可以在形式和细节上对本发明做出各种改变和改进,而这些均被认为落入了本发明的保护范围。
实施例1:动物免疫
用PBS溶解的含25μg血蓝蛋白(KLH)偶联的人IV型胶原蛋白α3链多肽(GenScript合成)与弗氏佐剂(抗原:佐剂=1:1)用搅拌方法乳化后,按200μl/只,对6-8周的3只Balb/c和3只C57BL/6小鼠进行皮下免疫,随后,每隔2周重复免疫,进行加强免疫,共3次。于第二次免疫一周后进行第一次采血,第三次免疫一周后进行第二次采血,对血清进行ELISA检测。选取血清效价最高的一只Balb/c和一只C57BL/6在第三次免疫后第三周进行最后一次免疫,最后一次免疫后4天进行融合。
实施例2:抗人IV型胶原蛋白α3链小鼠单克隆抗体制备
1)杂交瘤融合和筛选
提取实施例1的小鼠脾脏并进行均质化以产生单细胞悬液,将两只小鼠的单细胞悬液混合。同时准备骨髓瘤细胞(SP2/0)单细胞悬液。使用电融仪将脾细胞:SP2/0=2:1进行融合。将融合的细胞重悬于300ml含杂交瘤细胞选择剂胸腺核苷嘧啶,次黄嘌呤和氨基喋呤的DMEM/10% FBS培养基中,并用移液器以200μl的体积移至15×96孔板中。将板在37℃下在5% CO2中培养。培养7天之后,开始使用下文所述的间接ELISA筛选可分泌针对α3多肽的杂交瘤。
2)间接ELISA检测方法
间接ELISA用于评估上清液中抗体对于多肽的结合能力。将ELISA板用100μl/孔的PBS中1μg/ml的IV型胶原蛋白α3链多肽在4℃下包被过夜。用PBS-T(0.05%吐温)洗涤板,并将其用200μl/孔的含1% BSA的PBST在37℃封闭0.5小时。随后弃去封闭液,向每个孔加入100μl杂交瘤细胞培养上清液,然后在室温下孵育1小时。将板用PBST洗涤三次,并用100μl/孔的缀合辣根过氧化物酶的山羊抗鼠IgG(GenScript)37℃孵育0.5小时。将板用PBST洗涤五次,然后加入TMB显色液(GenScript)并在室温下在黑暗中孵育15分钟。通过加入50μl的1M HCl终止液(Sigma)终止反应。使用酶标仪在450nm下读板,得到阳性克隆孔15孔,OD450大于0.5。
3)小鼠杂交瘤亚克隆
以上所有克隆制备待克隆的杂交瘤细胞悬液,用含20%血清的HT培养基(20%FBS+2% HT+2ml IL-6+78% DMEM)稀释腹腔巨噬细胞(作为饲养细胞)至每毫升5×104细胞,每孔0.1ml进行预铺板,将待亚克隆细胞用DMEM将其稀释到每毫升5、30或100个细胞后按每孔0.1ml进行混匀后铺到预先铺的饲养细胞板中,此时总体积为每孔200μL,每孔杂交瘤细胞数0.5、3和10个,每个稀释度32孔;37℃、7.5% CO2湿润培养7-10天,出现肉眼可见的克隆即可检测抗体;在倒置显微镜下观察,标出只有单个克隆生长的阳性孔,再次进行克隆重复上述步骤2-3次,直至阳性孔率100%。进行抗体检测、细胞扩大培养并冻存。
实施例3:小鼠单克隆抗体的可变区测序及抗体生产
1)将实施例2得到的细胞克隆提取RNA,RNA提取使用RNeasy Plus Micro Kit试剂盒(QIAGEN,货号:74034)。然后将RNA逆转录为cDNA,同时加入随机引物与Oligo dT引物,使用SMARTScribe逆转录酶(TaKaRa,货号:639536)进行逆转录。PCR扩增(Genscript)得到抗体重链和轻链可变区序列后插入pcDNA3.1表达质粒并转化至DH5α感受态细胞,摇菌3-4小时,直接吸取100μL菌液于平板中,盖上平板,拿到台式振荡器上进行涂板3min。涂好的平板拿回超净工作台,然后将平板放在37℃隔水式恒温培养箱中过夜培养12-16h。挑取单菌落摇菌,并进行测序。最终获得了克隆4E5E2-1抗体氨基酸序列如下,加粗序列为信号肽,CDR序列(根据IMGT编号方案确定)加有下划线:
重链可变区(含信号肽)(136aa)
MKCSWVIFFLMAVVIGINSEVQLQQSGAELVRSGASVKLSCTASGFNIKDSNIHW LIQRPEQDLEWIGWIDPDNGDSEYAPKFQGEATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYF CNAVNWDYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ IDNO:11)
轻链可变区(含信号肽)(131aa)
MKLPVRLLVLMFWIPVSSSDVVVTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHNNGNT YLHWYLQRPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRVSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQ STHIPITFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:12)
抗体可以选择多种方式扩大生产,例如在CHO-S细胞中生产、小鼠腹水生产或杂交瘤生产。下面杂交瘤生产方式为例进行描述:
2)杂交瘤生产,将杂交瘤细胞于37℃摇瓶中培养6天后,收取上清用于抗体纯化。将柱用含有0.05M Tris和1.5M NaCl(pH8.0)的缓冲液重新平衡。随后将收获的细胞培养物上清液,使用2×上述缓冲液1:1稀释并过滤除菌。将过滤的上清液和蛋白A柱室温孵育2小时,用并1×上述缓冲液洗涤柱后,使用无菌0.1M柠檬酸钠(pH3.5)洗脱IgG,收集了洗脱液并用九分之一体积的无菌1M Tris-HCl(pH9.0)中和。在无菌条件下,将所述产品缓冲液交换为PBS(pH7.4)以除去任何的洗脱缓冲液并浓缩所述样品。浓缩之后,使用1.43的消光系数Ec(0.1%)通过OD280nm对抗体进行定量。
3)纯化的抗体通过BioRad电泳系统用10%预制胶(GenScript)通过SDS-PAGE来分析。将所述凝胶用Estain2.0(GenScript)染色并通过比较染色带与蛋白Ladder(GenScript)估计分子大小约为150KD和还原后纯度约99%,非还原纯度为84%,如图2所示。
实施例4:单克隆抗体亚型的测定
用PBS(磷酸盐缓冲液,PH7.4)将试剂盒(SBA Clonotyping System-HRP*1kit)中捕获抗体(羊抗鼠Ig)稀释到目的浓度,100μl/孔,4度过夜包被;甩出包被液,每孔加入150μl PBST洗液(PBS+Tween20)洗板一次,加入封闭液(1%BSA,1%蔗糖,0.5%Tween20),37℃,2小时;使用杂交瘤上清点样9个孔,100μl孔,37℃孵育;甩去杂交瘤上清,每孔加入250μ洗液洗板三次,向孔中加入相对应的100μl HRP标记的羊抗鼠κ、λ、Ig、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3酶标二抗,37℃孵育30min;甩去酶标二抗,250μlPBST每孔洗板4-5次,向孔中加入100μl TMB显色液(Genescript),25℃恒温箱显色;每孔加入50μl终止液。立即在酶标仪上450nm读数。测得此抗体为IgG1.K亚型。
实施例5:单克隆抗体EC50的测定
间接ELISA用于评估纯化抗体对于多肽的结合能力。将ELISA板用100μl/孔的PBS中0.5μg/ml的多肽在4℃下包被过夜。用PBS-T(0.05%吐温)洗涤板,并将其用250μl/孔的含1% BSA的PBST在37℃封闭2小时。随后弃去封闭液,向首孔加入1μg/ml的杂交瘤生产的纯化抗体100μl,并按照3倍梯度稀释,共计11个测试浓度梯度和1个零孔。然后在室温下孵育1小时。将板用PBST洗涤三次,并用100μl/孔的缀合辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG(Fc特异性)(GenScript)37℃孵育0.5小时。将板用PBST洗涤4次,然后加入TMB显色液(GenScript)并在室温下在黑暗中孵育15分钟。通过加入50μl的1M HCl终止液终止反应。使用酶标仪在450nm下读板。如图3所示,4E5E2-1的EC50为4.644ng/ml;
实施例6:单克隆抗体亲和力测定
使用Fortebio Octet检测仪器检测抗体的亲和力,用200μl PBST对链霉亲和素(SA)生物传感器进行平衡。将生物素标记的抗原多肽(Genscript合成)稀释到10μg/ml浓度,体积为200μl,将抗原固化在SA生物传感器。用200μl PBS对固化后的SA生物传感器进行平衡。将抗体4E5E2-1按照7个浓度点进行稀释,分别为(nM):100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56,体积为200μl,与SA生物传感器上固化的抗原进行结合。在200μl PBST中对抗原和抗体进行解离。根据实验结果计算抗体的KD(M)为3.987E-10,如图4所示。
实施例7:抗体热加速实验
热加速稳定实验用于测定抗体在一定温度下的保存时间,根据阿伦尼乌斯方程,确定抗体的有效期。37℃恒温培养箱内进行热加速一天相当于4℃保存1.5个月;将4E5E2-1纯化抗体进行20μl/管分装然后-20℃保存备用。
检测前21天、前17天、前14天、前11天、前7天、前3天,取出样本分别放置到4℃和37℃条件下保存,最后在检测当天将存放在不同条件下(包括一直存放在-20℃)待测定的抗体均取出,统一应用间接ELISA方法测定热加速后的纯化抗体对于多肽的结合能力,评估抗体的稳定性。将ELISA板用100μl/孔的PBS中1μg/ml的多肽在4℃下包被过夜。用PBS-T(0.05%吐温)洗涤板1次,并将其用250μl/孔的含1% BSA的PBST在37℃封闭2小时。随后弃去封闭液,向首孔加入1μg/ml的纯化抗体100μl,并按照3倍梯度稀释,共计11个测试浓度梯度和1个零孔。然后在37℃孵育1小时。将板用PBST洗涤三次,并用100μl/孔的羊抗鼠IgG抗体(Jackson,货号115-035-071)37℃孵育0.5小时。将板用PBST洗涤4次,然后加入TMB显色液(GenScript)并在25℃下在黑暗中孵育15分钟。通过加入50μl的1M HCl终止液终止反应。使用酶标仪在450nm下读板。根据阿伦尼乌斯方程,抗体可在37℃稳定存放21天,根据阿伦尼乌斯方程换算,抗体可在4℃稳定存放31.5个月。
Claims (27)
1.靶向IV型胶原蛋白α3链的抗体或其抗原结合片段,包括重链可变区,所述重链可变区的HCDR1包括氨基酸序列DSNIH(SEQ ID NO:1);HCDR2包括氨基酸序列WIDPDNGDSEYAPKFQG(SEQ ID NO:2);HCDR3包括氨基酸序列VNWDYFDY(SEQ ID NO:3)。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,还包括轻链可变区,所述轻链可变区的LCDR1包括氨基酸序列RSSQSLVHNNGNTYLH(SEQ ID NO:4);LCDR2包括氨基酸序列KVSNRFS(SEQ ID NO:5);LCDR3包括氨基酸序列SQSTHIPIT(SEQ ID NO:6)。
3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述重链可变区包括SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列有至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的功能性变体。
4.如权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述轻链可变区包括SEQID NO:8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列有至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的功能性变体。
5.如权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述重链可变区具有SEQID NO:7所示的氨基酸序列,所述轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
6.如权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体为单克隆抗体、单链抗体或单域抗体。
7.如权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体为鼠抗体或人源化抗体。
8.如权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体的重链包括SEQID NO:9所示的信号肽序列,和/或所述抗体的轻链包括SEQ ID NO:10所示的信号肽序列;或者所述抗体的重链和/或轻链包括纯化标签。
9.如权利要求1-8任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗原结合片段为Fab、Fab'或F(ab')2。
10.如权利要求1-9任一项所述的抗体或其抗原结合片段,还包括Fc片段。
11.如权利要求1-10任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其通过ELISA测定的与IV型胶原蛋白α3链结合的EC50值为约4.644ng/ml;或者其通过生物膜层干涉(BLI)技术测定的与IV型胶原蛋白α3链结合的KD值小于0.4nM,优选为约3.987×10-9M。
12.核酸分子,其编码权利要求1-11任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
13.包括权利要求12所述的核酸分子的表达载体。
14.包括权利要求12所述的核酸分子或权利要求13所述的表达载体的宿主细胞。
15.表达权利要求1-11任一项所述的抗体或其抗原结合片段的宿主细胞。
16.如权利要求15所述的宿主细胞,其为小鼠细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞,所述骨髓瘤细胞优选SP2/0、YB2/0、NS0或P3X63Ag8.653细胞。
17.如权利要求15所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞为哺乳动物细胞,优选CHO细胞、CHO-S细胞、HEK-293细胞、BHK细胞或PER-C6细胞。
18.免疫偶联物,包括权利要求1-11任一项所述的抗体或其抗原结合片段和可检测标签。
19.如权利要求18所述的免疫偶联物,其中所述可检测标签具有酶学活性、或所述可检测标签为荧光基团、荧光蛋白或放射性同位素。
20.检测试剂盒,包括权利要求1-11任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求18或19所述的免疫偶联物。
21.如权利要求20所述的检测试剂盒,还包括靶向IV型胶原蛋白α1链的抗体和/或靶向IV型胶原蛋白α5链的抗体。
22.如权利要求20或21所述的检测试剂盒,还包括说明如何使用所述抗体、抗原结合片段或免疫偶联物来诊断Alport综合征的说明书。
23.检测样品中是否存在IV型胶原蛋白α3链或其含量的方法,包括:
1)使所述样品与权利要求1-11任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求18或19所述的免疫偶联物接触,以及
2)通过检测是否存在IV型胶原蛋白α3链与所述抗体或其抗原结合片段形成的结合复合物或其含量来确定所述样品中是否存在IV型胶原蛋白α3链或其含量。
24.在受试者中鉴定Alport综合征的方法,包括:
1)使来自所述受试者的生物样品与权利要求1-11任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求18或19所述的免疫偶联物接触,以及
2)检测是否存在IV型胶原蛋白α3链与所述抗体或其抗原结合片段形成的结合复合物或其含量,以确定所述受试者是否存在Alport综合征或其严重性。
25.如权利要求24所述的方法,其中所述生物样品来自肾组织和/或皮肤组织。
26.如权利要求24或25所述的方法,其中所述Alport综合征为X连锁显性遗传型Alport综合征或常染色体隐性遗传型Alport综合征。
27.权利要求1-11任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求18或19所述的免疫偶联物在制备用于诊断Alport综合征的试剂中的应用。
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