CN114716553A - 靶向人lilrb4的纳米抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向LILRB4的纳米抗体、编码所述纳米抗体的核酸、包含所述核酸的表达载体、包含所述纳米抗体的药物组合物、以及制备药物的用途。

Description

靶向人LILRB4的纳米抗体及其应用
技术领域
本发明属于抗体工程领域，具体涉及一种用于诊断或治疗肿瘤的治疗性单域抗体，特别是涉及一种靶向LILRB4的纳米抗体、其衍生蛋白以及用于制备药物的用途。
背景技术
纳米抗体是目前最小的抗体分子，最初由比利时科学家Hamers在骆驼血液中发现，它是工程化抗体产品中备受关注的一类。纳米抗体主要优点：一是体积是普通抗体的1/10，因为体积小，其在动物组织体内的穿透力强，如，可以通过人体的脑组织，可以达到高密度的肿瘤内部，而普通抗体却不能，这使得可以通过纳米抗体来治疗某些肿瘤或脑部疾病；二是抗原特异性好；三是易于基因改造，方便人工改造以获得对抗不同病原的抗体；四是稳定性高，如，纳米抗体在体内不被自然分解的时间比普通抗体长（意味着药效时间更持久），纳米抗体甚至能从人胃中通过而保持有效性。
LILRB4(又被称作ILT3, LIR5, CD85K)是白细胞免疫球蛋白样受体（LILRs/LIRs）的成员，是一种在抗原呈递细胞（APC）上发现的免疫调节性跨膜蛋白。LILRB4抑制APC活化并通过T抑制细胞诱导免疫耐受性。它已被证明通过诱导 T 细胞无反应性和 CD8+ T 抑制细胞的分化来调节免疫反应，并且可能对癌症建立免疫耐受发挥作用。其主要在耐受性树突细胞(DC)、骨髓源性抑制细胞和M2巨噬细胞中表达，少量表达在浆细胞表面，并不在造血前体细胞或者干细胞表面表达。LILRB4是单核细胞急性髓系白血病（monocytic AML）的标志分子，其在monocytic AML细胞表面的高度表达。
目前有2款靶向LILRB4的抗体药物处于临床研究阶段，由NGMBiopharmaceuticals开发的NGM831目前处于临床一期，适应症为胰腺癌、乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、子宫颈癌、宫颈内癌、头颈部鳞状细胞癌、膀胱尿路上皮癌、结直肠癌、食道癌、卵巢癌、肾细胞癌、前列腺癌、黑色素瘤、间皮瘤、胆管癌等；Immune-Onc Therapeutics开发的IO-202目前处于临床一期，适应症为急性骨髓性白血病、骨髓单核细胞白血病等。
发明内容
现有技术中的ScFv、Fab或全IgG类抗LILRB4抗体分子，结构复杂、分子较大，虽然能将活性分子连接到LILRB4上，但影响活性分子的功能、方法复杂、负载效率也较低；纳米抗体分子较小、易于操作，但人源化程度低、亲和力不高，延长半衰期的性能有待进一步提高。
针对上述现有技术的不足，本发明提供一系列抗人LILRB4纳米抗体序列及制备方案。提供的抗LILRB4纳米抗体能高亲和力结合人LILRB4，并在细胞学模型上可以明确观察到对T细胞的激活作用，从而对肿瘤具有潜在的治疗价值。
第一方面，本发明提供一种抗LILRB4的纳米抗体，根据本发明的实施例，所述纳米抗体能够特异性结合LILRB4，且所述纳米抗体中的VHH链的互补决定区CDR为选自下组的一种或多种：
（1）SEQ ID NO：16所示的CDR1，SEQ ID NO：17所示的CDR2，和SEQ ID NO：18所示的CDR3；
（2）SEQ ID NO：19所示的CDR1，SEQ ID NO：20所示的CDR2，和SEQ ID NO：21所示的CDR3；
（3）SEQ ID NO：22所示的CDR1，SEQ ID NO：23所示的CDR2，和SEQ ID NO：24所示的CDR3；
（4）SEQ ID NO：25所示的CDR1，SEQ ID NO：26所示的CDR2，和SEQ ID NO：27所示的CDR3；
（5）SEQ ID NO：28所示的CDR1，SEQ ID NO：29所示的CDR2，和SEQ ID NO：30所示的CDR3；
（6）SEQ ID NO：25所示的CDR1，SEQ ID NO：26所示的CDR2，和SEQ ID NO：31所示的CDR3；
（7）SEQ ID NO：32所示的CDR1，SEQ ID NO：33所示的CDR2，和SEQ ID NO：34所示的CDR3；
（8）SEQ ID NO：35所示的CDR1，SEQ ID NO：36所示的CDR2，和SEQ ID NO：37所示的CDR3。
进一步，在本发明的一些实施方案中，上述纳米抗体是人源化的VHH或骆驼源化的VH。
进一步，在本发明的一些实施方案中，上述纳米抗体具有如SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15任一项所示的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供一种融合蛋白，根据本发明的实施例，其包括能够特异性结合LILRB4的功能结构域，所述功能结构域由上述任一项所述的抗LILRB4的纳米抗体构成。
本发明提供的纳米抗体可以与其他的任意蛋白或物质融合，以实现不同的目的，例如与荧光蛋白、酶或放射性元等结合以实现易于检测的目的，再如与治疗LILRB4介导相关疾病的药物分子融合以实现更佳的治疗目的。与该纳米抗体融合的蛋白类型，本领域技术人员可以根据实际需要或目的合理选择，无论融合何种类型的物质融合，其也在本发明的范围内。
第三方面，本发明提供一种抗LILRB4的抗体，根据本发明的实施例，所述抗体为传统抗体或其功能性片段，所述抗体的重链可变区由前述任一项所述的抗LILRB4的纳米抗体构成；
进一步，上述功能性片段为所述传统抗体的Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、scFv或sdFv结构。
传统抗体在结构上由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，轻链具有轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)；重链具有重链可变区(VH)和重链恒定区(CH1，CH2，CH3和/或CH4)。在本发明公开了具有能够特异性结合LILRB4的纳米抗体的结构前提下，本领域技术人员容易想到利用本发明的纳米抗体对传统抗体以改造，例如将本发明纳米抗体的CDR区结构应用到传统抗体上，以获得可以特异性结合LILRB4的传统抗体，这类传统体也是属于本发明的保护范围；进一步地，基于传统抗体的结构，其部分结构例如Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、scFv或sdFv结构等也是具有LILRB4结合特异性的，这也是属于本发明的保护范围。
第四方面，本发明提供了一种治疗疾病的组合物，其包括如上任一项所述的抗LILRB4的纳米抗体、如上所述的融合蛋白或如上所述的抗体，以及药学上可接受的辅料。
上述药学上可接受的辅料是指药学领域的药用辅料，例如：稀释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、崩解剂、吸附载体、润滑剂等。另外还可以加入其他辅料如香味剂、甜味剂等。即所述的辅料为稀释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、崩解剂、吸附载体、润滑剂、香味剂、甜味剂中的一种或两种以上。
本发明所提供的药物的剂型并没有严格的限制，可根据药剂领域的现有方法制备成各种剂型，通过口服、鼻吸、直肠、肠胃外或经皮给药等方式施用于需要治疗的患者。
第五方面，本发明提供一种分离的核酸分子，其编码如上任一项所述的单域抗体。
基于本发明公开的内容，本领域技术人员通过本领域常规技术容易获得编码上述纳米抗体以及融合蛋白的多核苷酸分子，并基于密码子的简并性，该多核酸分子是多变的，其具体的碱基序列存在多种可能性，基于此，无论其多核酸分子如何变化，只要其能够编码本发明的单域抗体或融合蛋白即属于本发明的保护范围。
第六方面，本发明提供含有如上所述的核酸分子的载体。
第七方面，本发明提供含有如上所述的载体的重组细胞。
第八方面，本发明提供制备如上任一项所述的纳米抗体的方法，其包括：培养如上所述的重组细胞，从培养产物中分离纯化获得所述纳米抗体。
需要说明的是，制备本发明的纳米抗体、融合蛋白和抗体可以通过化学合成的方法，也可以是通过基因工程技术实现，或者是其他的方法，无论以何种方法制备本发明前述的纳米抗体、融合蛋白或抗体，其都是属于本发明的保护范围。
第九方面，本发明提供一种激活T细胞的方法，包括使T细胞与如上任一项所述的抗LILRB4纳米抗体、如上所述的融合蛋白、如上所述的抗体、如上所述的组合物、如上所述的核酸分子、如上所述的载体、或如上所述的重组细胞接触。
任选地，所述接触包括在癌细胞存在下。
LILRB4在单核细胞、巨噬细胞和树突细胞上表达，可以以细胞自主的方式抑制先天免疫，并通过间接机制抑制T细胞活化。LILRB4是单核细胞性急性髓细胞白血病(AML)的特异性标记，包括难治性和复发性疾病。已表明LILRB4支持肿瘤细胞浸润到组织中，并通过涉及AML细胞中APOE、LILRB4、SHP-2、uPAR和ARG1的信号通路抑制T细胞活性(Deng M. etah，Nature (2018)562:605-09)。
第十方面，提供了本发明如上任一项所述的抗LILRB4纳米抗体、如上所述的融合蛋白、如上所述的抗体、如上所述的组合物、如上所述的核酸分子、如上所述的载体、或如上所述的重组细胞的用途，用于在制备由人LILRB4蛋白介导的相关疾病的药物中的用途。
本发明的抗体可以用于治疗以LILRB4为靶点中和LILRB4进而实现预防、治疗和/或改善疾病的效果，该类疾病包括但不限于肿瘤。
为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源于两个或更多个物种的抗体。通常，轻链与重链两者的可变区均对应于抗体的源于一个哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特异性、亲和力和能力的可变区，而恒定区与抗体中源于另一物种(通常是人)的序列同源以避免在那个物种中引发免疫应答。
“纳米抗体”通常如在WO 2008/020079或WO 2009/138519中所定义，且因而在一个具体的方面通常表示VHH、人源化的VHH或骆驼源化的VH(诸如骆驼源化的人VH)，或通常表示序列优化的VHH(例如为了化学稳定性和/或溶解度、与已知人框架区的最大重叠和最大表达而优化)。“纳米抗体”用基因工程方法获得，主要有3类，第一类是从骆驼科动物HCAb获得的重链可变区，为单一的折叠单元，保留了完整的抗原结合活性，是最小的天然抗体片段。第二类是从鲨鱼等软骨鱼IgNAR获得的重链可变区，用VNAR表示。第三类是从人源或鼠源单抗获得的重链或轻链可变区，保留了抗原结合活性，但亲和性和可溶性大为下降。
“Fc区”或“Fc”是指免疫球蛋白重链的C端区，其含有铰链区的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的Fc受体结合或与经典补体系统的第一组分(例如C1q)结合，包括天然序列Fc区和变异Fc区。通常，人IgG重链Fc区为自其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段，但其边界可能有变化。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447，依照EU编号系统)可以存在或可以不存在。Fc还可以指隔离的这一区域，或在包含Fc的蛋白多肽的情况下，例如“包含Fc区的结合蛋白”，还称为“Fc融合蛋白”(例如，抗体或免疫粘合素)。本发明的抗体中天然序列Fc区包括人IgG1，IgG2(IgG2A，IgG2B)，IgG3和IgG4。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区包含抗体的两条重链的每一条的CH2和CH3恒定结构域；IgM和IgEFc区包含在每条多肽链中的三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。
“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。术语“免疫结合”是指发生在抗体分子和抗原(对于该抗原而言抗体为特异性的)之间的特异性结合反应。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以相互作用的平衡解离常数(KD)表示，其中KD值越小，表示亲和力越高。两分子间的的免疫结合性质可使用本领域中公知的方法定量。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。指特定抗体-抗原相互作用的“结合速率常数”(Ka或Kon)和“解离速率常数”(Kd或Koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出，可用任何有效的方法测量KD、Ka和Kd值。在优选的实施方案中，用生物发光干涉测量法来测量解离常数。在其它优选的实施方案中，可用表面等离子共振技术(例如Biacore)或KinExa来测量解离常数。
“载体”是指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点和游离型哺乳动物载体的细菌载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们有效连接的基因的表达。
“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，并且可以是cDNA。
本发明取得了以下有益的技术效果：
本发明的抗LILRB4纳米抗体能高亲和力结合人LILRB4，并在细胞学模型上可以明确观察到对T细胞的激活作用，从而对肿瘤具有潜在的治疗价值。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
图1： FACS检测抗人LILRB4嵌合抗体在THP-1细胞上的结合活性。
图2： FACS检测抗人LILRB4嵌合抗体在RPMI-8226细胞上的结合活性。
图3： 抗人LILRB4嵌合抗体对T细胞的激活曲线图。
图4： FACS检测抗人LILRB4人源化抗体在RPMI-8226细胞上的结合活性。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1：骆驼纳米抗体免疫噬菌体库构建
利用抗原免疫骆驼，分离外周血单核细胞（PBMC）并提取总RNA进行反转录，以反转录产物为模板扩增纳米抗体重链可变区 (variable domain of the heavy-chain ofheavy chain antibody, VHH) 并连入噬菌体展示载体，电转入大肠杆菌TG1感受态细胞，构建骆驼免疫库。
具体地，骆驼免疫两周一次，共4次。每次注射0.8 mg LILRB4胞外区重组蛋白，佐以弗氏完全/不完全佐剂（Sigma，F5881, F5506），采取皮下多点注射的方式。每次免疫后2周采集1mL血分离血清，用免疫原作为测定抗原，通过ELISA法分别测定血清中全抗体（IgG）和重链抗体（heavy chain antibody，HcAb）的滴度。当血清滴度达到建库要求后，采集100mL骆驼外周血并用分离试剂盒（天津灏洋，Cat: TBD2011CM）分离PBMC，提取PBMC的总RNA反转获得cDNA，作为后续扩增VHH片段的模板。根据相关文献和数据库中检索到驼源VHH抗体的基因，设计并合成VHH抗体库构建引物，PCR扩增出抗体可变区基因序列。随后利用核酸内切酶对载体和扩增的抗体片段进行酶切。采用T4连接酶的连接方式构建连接产物，利用电转染技术将连接产物转入到TG1菌种之中。最终构建了一个1.8×108骆驼抗人LILRB4 VHH抗体免疫库，用于特异性抗人LILRB4纳米抗体的筛选。为检测文库的正确率，随机选取50个克隆进行菌落PCR，结果显示插入率达到90％。
通过固相筛选的方法对所构建的骆驼免疫库进行筛选，获得特异性噬菌体展示纳米抗体。通过原始库呈现及筛选和鉴定获得了10株可同时结合人LILRB4的重组蛋白的噬菌体展示的纳米抗体：D2、D5、C6、C7、H9、F1、C3、B2、E5和B4。
实施例2：抗人LILRB4纳米抗体及对照抗体的制备
同靶点对照抗体193（序列来源：WO2020056077A1，SEQ NO.231和SEQ NO.237）进行可变区基因合成，其轻、重链可变区序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。将轻重链序列分别克隆至含有human kappa/ IgG1轻重链恒定区的真核瞬时表达载体中，获得对照抗体轻链和重链表达质粒，转入大肠杆菌扩增，分离获得大量含对照抗体轻链和重链的质粒，提取质粒并进行乙醇沉淀，并根据转染试剂293fectin（Cat:12347019，Gibco）的操作说明，分别将对照抗体的轻、重链质粒转入HEK293细胞中重组表达。细胞转染后5-6天，取培养上清，利用ProA亲和层析柱对表达上清进行纯化，获得对照抗体。
根据噬菌体展示的纳米抗体测序结果，设计引物，将D2、D5、C6、C7、H9、F1、C3、B2、E5和B4通过PCR方法克隆至含有人Fc（hFc）编码基因的真核瞬时表达载体中，并在HEK293细胞中重组表达。细胞转染5-6天后，取培养上清，利用ProA亲和层析柱对表达上清进行纯化，获得chD2、chD5、chC6、chC7、chH9、chF1、chC3、chB2、chE5和chB4重组蛋白。chD2可变区序列见SEQ ID NO.3，chD5可变区序列见SEQ ID NO.4,chC6可变区序列见SEQ ID NO.5,chC7可变区序列见SEQ ID NO.6,chH9可变区序列见SEQ ID NO.7,chF1可变区序列见SEQ IDNO.8,chC3可变区序列见SEQ ID NO.9,chB2可变区序列见SEQ ID NO.10,chE5可变区序列见SEQ ID NO.11和chB4可变区序列见SEQ ID NO.12，恒定区序列见SEQ ID NO.13。
重链可变区氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSSYWISWVRQAPGKGLEWIGSIDSGSVGITYYATWVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGDNWALDLWGQGTLVTVSS
SEQ.ID NO.2: 193轻链可变区氨基酸序列
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSINSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDAATYYCQHGYIRGDLDNVFGGGTKVEIK
SEQ.ID NO.3: chD2 VHH氨基酸序列
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCTASGYTASSDYMGWFRQAPGKKREGVACINTNGGETYHANSVSGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPDDTAMYYCAVGRTNPDSYGGSRCLLAPEYTYWGQGTQVTVSS
chD2抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：16、17和18，用下划线标出（根据Kabat CDR的定义）。
氨基酸序列
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCATSGDTYSTLCMGWFRQAPGKEREGVAAIYRGGDSTVYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNGLKPEDTAIYYCAASSLGRCAADIRTGPPFWAVGFRYWGQGTQVTVSS
chD5抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：19、20和21，用下划线标出（根据Kabat CDR的定义）。
氨基酸序列
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLAFSRYYMSWVRQAPGKGLEWVSGIRSDGLSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLFLQMNNLKSEDTALYYCATGVGDSGDYRGQGTQVTVSS
chC6抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：22、23和24，用下划线标出（根据Kabat CDR的定义）。
氨基酸序列
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASEYTYSRHCMAWFRQAPGKEREGVATIYTGGGITRYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAADIASRACVTDPFPLKHAQFSSWGQGTQVTVSS
chC7抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：25、26和27，用下划线标出（根据Kabat CDR的定义）。
氨基酸序列
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAVSEYVYSRCTMAWYRQAPGKERELVSAFDSGETTWYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCNTVGVKSVKSGGGSWCFSPDYWGQGTQVTVSS
chH9抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：28、29和30，用下划线标出（根据Kabat CDR的定义）。
氨基酸序列
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASEYSYRRHCMAWFRQAPGKEREGVATIYTGGGITRYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAADIASRACVTDPFPLERARFSAWGQGTQVTVSS
chF1抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：25、26和31，用下划线标出（根据Kabat CDR的定义）。
氨基酸序列
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVASEYIYTRCNMAWYRQAPGKERELVSAFDIGDTLYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCNTVGVKPGGGSWCFNPDYWGQGTQVTVSS
chC3抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：32、33和34，用下划线标出（根据Kabat CDR的定义）。
氨基酸序列
QVQLQESGGGPVQAGGSLRLSCAASEYSYRRHCMAWFRQAPGKEREGVATIYTGGGITRYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAADIASRACVTDPFPLERARFSAWGQGTQVTVSS
chB2抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：25、26和31，用下划线标出（根据Kabat CDR的定义）。
氨基酸序列
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASEYTYSRHCMAWFRQAPGKEREGVATIYTGGGITRYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAADIASRACVTDPFPLKHAQFSSWGQGTQVTVSS
chE5抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：25、26和27，用下划线标出（根据Kabat CDR的定义）。
氨基酸序列
qvqlqesgggpvqaggslrlscaasrydietkcitwlrqapgkerervasispgdgstyyadsvkgrftisqeyakntvdlqmnslksedtamyycaaarapwgrcaqwtagidfdywgqgtqvtvss
chB4抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：35、36和37，用下划线标出（根据Kabat CDR的定义）。
恒定区氨基酸序列
asepkssdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
实施例3：嵌合抗体亲和力检测
利用Fortebio公司的Octet QKe system仪器，采用抗人抗体 Fc 段的捕获抗体（AHC）生物探针捕获抗体Fc段的方法测定抗体亲和力。测定时将chD2、chD5、chC6、chC7、chH9、chF1、chC3、chB2、chE5和chB4嵌合抗体及对照抗体193，用PBS缓冲液稀释至4ug/ml，流经AHC探针（Cat:18-0015，PALL）表面，时间为120s。人LILRB4重组蛋白（购于义翘，Cat.16742-H08H)或食蟹猴LILRB4重组蛋白（购于ACRO，Cat.3CDK-C5227) 60nm；作为流动相，结合时间为300s，解离时间为300s。实验完毕，扣除空白对照响应值，用软件进行 1：1Langmuir 结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数。
动力学参数如下表1所示，结果表明这10株嵌合抗体均与人LILRB4重组蛋白结合，其中chD2、chD5、chC6亲和力均优于或相当于对照抗体193。这10株嵌合抗体均与食蟹猴LILRB4重组蛋白结合，除chC6外，其余9株与食蟹猴LILRB4重组蛋白亲和力均优于或相当于对照抗体193。
表1. 嵌合抗体与LILRB4重组蛋白的亲和力测定结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例4：FACS检测抗人LILRB4嵌合抗体在THP-1细胞上的结合活性
取2E5个THP-1细胞分别与不同浓度的抗LILRB4嵌合抗体结合，chD2、chD5、chC6、chC7、chH9嵌合抗体及对照抗体193，从198nM开始3倍梯度稀释11个梯度。4℃避光孵育60min，充分PBS洗涤后，加入1:200稀释的FITC标记的羊抗人抗体（sigma,F9512）,4°C避光孵育30min后充分PBS洗涤，重悬于200ul的PBS中，流式细胞仪检测。
结果显示（图1），chD2、chD5、chC6、chC7、chH9可以剂量依赖的结合人LILRB4阳性细胞THP-1细胞，EC50值见表2所示，在THP-1细胞上的结合能力均优于对照抗体。
表2. FACS检测抗人LILRB4嵌合抗体在THP-1细胞上的结合EC50值
193 chD2 chD5 chC6 chC7 chH9
EC50（nM） 1.43 0.27 0.31 0.22 0.39 0.44
实施例5：FACS检测抗LILRB4嵌合抗体在RPMI-8226细胞上的结合活性
取2E5个RPMI-8226细胞分别与不同浓度的抗LILRB4嵌合抗体结合，chF1、chC3、chB2、chE5和chB4嵌合抗体及对照抗体193，从132nM开始3倍梯度稀释8个梯度。4℃避光孵育60min，充分PBS洗涤后，加入1:200稀释的FITC标记的羊抗人抗体（sigma,F9512）,4°C避光孵育30min后充分PBS洗涤，重悬于200ul的PBS中，流式细胞仪检测。
结果显示（图2），chF1、chC3、chB2、chE5和chB4可以剂量依赖的结合人LILRB4阳性细胞RPMI-8226细胞，结合活性不弱于对照193。
实施例6：LILRB4细胞模型评价抗人LILRB4嵌合抗体对T细胞的激活作用
取对数生长的 APOE/TCR Activator/CHO 细胞， 胰酶消化后 1000 转离心 5 分钟去除上清，重悬于新鲜的含 10%FBS 的 F12K 培养基中，将重悬的细胞密度调整为 4×105/ml。将重悬的细胞接种到白壁透明底的 96 孔细胞培养板中，100ul/孔细胞悬液，37℃5%CO2 培养箱培养过夜。第二天将接种APOE/TCR Activator/CHO 细胞的 96 孔板内 F12K+10%FBS 培养基吸干，并用150 ul/孔的 DPBS 润洗孔板一次，吸去DPBS,然后用含 0.5%BSA 的 RPMI1640 培养基对chD2、chD5、chH9嵌合抗体以及对照抗体193进行梯度稀释（起始浓度为256nM，4倍梯度依次稀释11个浓度），加入梯度稀释的2*浓度样品（50 ul/孔）到接种好细胞的 96 孔板中，并另外设置不加抗体的培养基对照孔。取对数期生长的 LILRB4Effector Reporter 细胞,细胞离心弃上清，用 DPBS 洗细 胞一次，离心去除 DPBS, 然后将细胞重悬于新鲜的含 0.5% BSA 的 RPMI1640 培养基中将重悬的细胞密度调整为 8×105/ml,然后将细胞加入上述含有抗体的 96 孔板中，每孔50 ul，放置 37 度培养箱中继续培养 5 到 6 小时。将 96 孔板从培养箱中取出，加入 100ul/孔 Bright-Glo™ 萤光素酶检测试剂放置3 分钟，放入酶标仪中读取数值。根据每个梯度浓度孔对应的读值，利用Prism Graphpad 软件拟合样品对细胞激活的梯度曲线，并且计算样品的半数有效结合浓度（EC50）。
激活梯度曲线如图3所示，对应的EC50如表3所示，chD2、chD5、chH9对T细胞的激活效应与对照抗体193近似。
表3. 抗人LILRB4嵌合抗体对T细胞激活的EC50值
chD2 chD5 chH9 193
EC50（nM） 0.153 0.043 0.064 0.094
实施例7：抗人LILRB4纳米抗体的人源化及重组表达分析
首先对驼源抗体VHH序列进行综合分析，确定抗体与抗原结合的抗原互补决定簇（CDR）区域及支撑抗体保守三维构象的框架区（framework）。随后根据同源性比对结果，选择最近似人源抗体template为基础模板，结合全序列blast结果，进行CDR移植，实现了chD2可变区（VH）在Framework区的人源化。D2人源化分子hzD2-1氨基酸序列见序列14；D2人源化分子hzD2-2氨基酸序列见序列15。将人源化设计的hzD2-1和hzD2-2可变区序列进行全合成，克隆至含有人Fc（hFc）编码基因的真核表达载体上。获得序列正确的表达质粒后，转入HEK293细胞中重组表达，细胞转染5-6天后，取培养上清，利用ProA亲和层析柱对表达上清进行纯化，获得的人源化抗体重组蛋白。
氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSDYMGWFRQAPGKEREGVACINTNGGETYHANSVSGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRTNPDSYGGSRCLLAPEYTYWGQGTLVTVSS
hzD2-1抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：16、17和18，用下划线标出（根据Kabat CDR的定义）。
氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTASSDYMGWFRQAPGKEREGVACINTNGGETYHANSVSGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRTNPDSYGGSRCLLAPEYTYWGQGTLVTVSS
hzD2-2抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：16、17和18，用下划线标出（根据Kabat CDR的定义）。
实施例8：人源化LILRB4抗体亲和力检测
利用Fortebio公司的Octet QKe system仪器，采用抗人抗体 Fc 段的捕获抗体（AHC）生物探针捕获抗体Fc段的方法测定抗体亲和力。测定时将嵌合抗体及其对应的人源化抗体，对照抗体128，用PBS缓冲液稀释至4ug/ml，流经AHC探针（Cat:18-0015，PALL）表面，时间为120s。LILRB4重组蛋白（购于义翘，Cat.16742-H08H) 100nm；作为流动相，结合时间为300s，解离时间为300s。实验完毕，扣除空白对照响应值，用软件进行 1：1 Langmuir 结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数。
动力学参数如下表4所示。结果表明人源化后抗体与嵌合抗体亲和力基本保持一致。
表4. 人源化抗体与人LILRB4重组蛋白的亲和力测定结果
样本 KD (M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
193 7.21E-10 3.05E+05 2.20E-04
chD2 3.12E-10 2.98E+05 9.30E-05
hzD2-1 1.03E-09 1.67E+05 1.72E-04
hzD2-2 9.48E-10 1.85E+05 1.75E-04
实施例9：FACS检测抗LILRB4人源化抗体在RPMI-8226细胞上的结合活性
取2E5个RPMI-8226细胞分别与不同浓度的抗LILRB4人源化抗体结合，hzD2-1和hzD2-2人源化抗体从22nM开始3倍梯度稀释10个梯度。4℃避光孵育60min，充分PBS洗涤后，加入1:200稀释的FITC标记的羊抗人抗体（sigma, F9512）,4°C避光孵育30min后充分PBS洗涤，重悬于200ul的PBS中，流式细胞仪检测。
结果显示（图4），hzD2-1和hzD2-2可以与人LILRB4阳性细胞RPMI-8226细胞结合，结合活性与对照抗体193一致，EC50值见表5所示。
表5. FACS检测抗人LILRB4人源化抗体在RPMI-8226细胞上的EC50值
hzD2-1 hzD2-2 193
EC50（nM） 0.221 0.215 0.227
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京科诺信诚科技有限公司
<120> 靶向人LILRB4的纳米抗体及其应用
<160> 37
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Asp Ser Gly Ser Val Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Gly Asp Asn Trp Ala Leu Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Gly Tyr Ile Arg Gly Asp
85 90 95
Leu Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 3
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Ala Ser Ser Asp
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Lys Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Cys Ile Asn Thr Asn Gly Gly Glu Thr Tyr His Ala Asn Ser Val
50 55 60
Ser Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Gly Arg Thr Asn Pro Asp Ser Tyr Gly Gly Ser Arg Cys Leu
100 105 110
Leu Ala Pro Glu Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 4
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Asp Thr Tyr Ser Thr Leu
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Tyr Arg Gly Gly Asp Ser Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Ser Leu Gly Arg Cys Ala Ala Asp Ile Arg Thr Gly Pro
100 105 110
Pro Phe Trp Ala Val Gly Phe Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 5
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ala Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Arg Ser Asp Gly Leu Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Val Gly Asp Ser Gly Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Thr Tyr Ser Arg His
20 25 30
Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Thr Ile Tyr Thr Gly Gly Gly Ile Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Ile Ala Ser Arg Ala Cys Val Thr Asp Pro Phe Pro Leu
100 105 110
Lys His Ala Gln Phe Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 7
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Glu Tyr Val Tyr Ser Arg Cys
20 25 30
Thr Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ser Ala Phe Asp Ser Gly Glu Thr Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Thr Val Gly Val Lys Ser Val Lys Ser Gly Gly Gly Ser Trp Cys Phe
100 105 110
Ser Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 8
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ser Tyr Arg Arg His
20 25 30
Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Thr Ile Tyr Thr Gly Gly Gly Ile Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Ile Ala Ser Arg Ala Cys Val Thr Asp Pro Phe Pro Leu
100 105 110
Glu Arg Ala Arg Phe Ser Ala Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 9
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Glu Tyr Ile Tyr Thr Arg Cys
20 25 30
Asn Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ser Ala Phe Asp Ile Gly Asp Thr Leu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Thr Val Gly Val Lys Pro Gly Gly Gly Ser Trp Cys Phe Asn Pro Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Pro Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ser Tyr Arg Arg His
20 25 30
Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Thr Ile Tyr Thr Gly Gly Gly Ile Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Ile Ala Ser Arg Ala Cys Val Thr Asp Pro Phe Pro Leu
100 105 110
Glu Arg Ala Arg Phe Ser Ala Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 11
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Thr Tyr Ser Arg His
20 25 30
Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Thr Ile Tyr Thr Gly Gly Gly Ile Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Ile Ala Ser Arg Ala Cys Val Thr Asp Pro Phe Pro Leu
100 105 110
Lys His Ala Gln Phe Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 12
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Pro Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Tyr Asp Ile Glu Thr Lys
20 25 30
Cys Ile Thr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Pro Gly Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Glu Tyr Ala Lys Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Arg Ala Pro Trp Gly Arg Cys Ala Gln Trp Thr Ala Gly
100 105 110
Ile Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 13
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Ala Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
20 25 30
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
35 40 45
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
50 55 60
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
65 70 75 80
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
85 90 95
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
100 105 110
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
115 120 125
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
130 135 140
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
165 170 175
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
180 185 190
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
195 200 205
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
210 215 220
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 14
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asp
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Cys Ile Asn Thr Asn Gly Gly Glu Thr Tyr His Ala Asn Ser Val
50 55 60
Ser Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Thr Asn Pro Asp Ser Tyr Gly Gly Ser Arg Cys Leu
100 105 110
Leu Ala Pro Glu Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 15
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Ala Ser Ser Asp
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Cys Ile Asn Thr Asn Gly Gly Glu Thr Tyr His Ala Asn Ser Val
50 55 60
Ser Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Thr Asn Pro Asp Ser Tyr Gly Gly Ser Arg Cys Leu
100 105 110
Leu Ala Pro Glu Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Ser Asp Tyr Met Gly
1 5
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Cys Ile Asn Thr Asn Gly Gly Glu Thr Tyr His Ala Asn Ser Val Ser
1 5 10 15
Gly
<210> 18
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gly Arg Thr Asn Pro Asp Ser Tyr Gly Gly Ser Arg Cys Leu Leu Ala
1 5 10 15
Pro Glu Tyr Thr Tyr
20
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Thr Leu Cys Met Gly
1 5
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Ala Ile Tyr Arg Gly Gly Asp Ser Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Asp Ile Arg Thr Gly Pro Pro Phe Trp Ala Val Gly Phe Arg Tyr
1 5 10 15
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Arg Tyr Tyr Met Ser
1 5
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Gly Ile Arg Ser Asp Gly Leu Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Gly Val Gly Asp Ser Gly Asp Tyr
1 5
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Arg His Cys Met Ala
1 5
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Thr Ile Tyr Thr Gly Gly Gly Ile Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 27
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Asp Ile Ala Ser Arg Ala Cys Val Thr Asp Pro Phe Pro Leu Lys His
1 5 10 15
Ala Gln Phe Ser Ser
20
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Arg Cys Thr Met Ala
1 5
<210> 29
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Ala Phe Asp Ser Gly Glu Thr Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 30
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Val Gly Val Lys Ser Val Lys Ser Gly Gly Gly Ser Trp Cys Phe Ser
1 5 10 15
Pro Asp Tyr
<210> 31
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Asp Ile Ala Ser Arg Ala Cys Val Thr Asp Pro Phe Pro Leu Glu Arg
1 5 10 15
Ala Arg Phe Ser Ala
20
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Arg Cys Asn Met Ala
1 5
<210> 33
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Ala Phe Asp Ile Gly Asp Thr Leu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Val Gly Val Lys Pro Gly Gly Gly Ser Trp Cys Phe Asn Pro Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 35
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Thr Lys Cys Ile Thr
1 5
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Ser Ile Ser Pro Gly Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 37
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Ala Arg Ala Pro Trp Gly Arg Cys Ala Gln Trp Thr Ala Gly Ile Asp
1 5 10 15
Phe Asp Tyr

Claims (13)

1.一种抗LILRB4的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体能够特异性结合LILRB4，且所述纳米抗体中的VHH链的互补决定区CDR为选自下组的一种或多种：
（1）SEQ ID NO：16所示的CDR1，SEQ ID NO：17所示的CDR2，和SEQ ID NO：18所示的CDR3；
（2）SEQ ID NO：19所示的CDR1，SEQ ID NO：20所示的CDR2，和SEQ ID NO：21所示的CDR3；
（3）SEQ ID NO：22所示的CDR1，SEQ ID NO：23所示的CDR2，和SEQ ID NO：24所示的CDR3；
（4）SEQ ID NO：25所示的CDR1，SEQ ID NO：26所示的CDR2，和SEQ ID NO：27所示的CDR3；
（5）SEQ ID NO：28所示的CDR1，SEQ ID NO：29所示的CDR2，和SEQ ID NO：30所示的CDR3；
（6）SEQ ID NO：25所示的CDR1，SEQ ID NO：26所示的CDR2，和SEQ ID NO：31所示的CDR3；
（7）SEQ ID NO：32所示的CDR1，SEQ ID NO：33所示的CDR2，和SEQ ID NO：34所示的CDR3；
（8）SEQ ID NO：35所示的CDR1，SEQ ID NO：36所示的CDR2，和SEQ ID NO：37所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体是人源化的VHH或骆驼源化的VH。
3.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体具有如SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15任一项所示的氨基酸序列。
4.一种融合蛋白，其特征在于，其包括能够特异性结合LILRB4的功能结构域，所述功能结构域由权利要求1-3任一项所述的抗LILRB4的纳米抗体构成。
5.一种抗LILRB4的抗体，其特征在于，所述抗体为传统抗体或其功能性片段，所述抗体的重链可变区由权利要求1-3任一项所述的抗LILRB4的纳米抗体构成。
6.根据权利要求5所述的抗LILRB4的抗体，其特征在于，所述功能性片段为所述传统抗体的Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、scFv或sdFv结构。
7.一种药物组合物，其特征在于，其包括权利要求1-3任一项所述的抗LILRB4的纳米抗体、权利要求4所述的融合蛋白、权利要求5或6所述的抗体，以及药学上可接受的辅料。
8.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1-3任一项所述的抗LILRB4纳米抗体、编码权利要求4所述的融合蛋白、编码权利要求5或6所述的抗体。
9.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求8所述的核酸分子。
10.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求9所述的表达载体。
11.制备权利要求1-3任一项所述的纳米抗体的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求10所述的重组细胞，从培养产物中分离纯化获得所述纳米抗体。
12.一种激活T细胞的方法，包括使T细胞与权利要求1-3任一项所述的抗LILRB4纳米抗体、权利要求4所述的融合蛋白、权利要求5或6所述的抗体、权利要求7所述的组合物、权利要求8所述的核酸分子、权利要求9所述的载体、或权利要求10所述的重组细胞接触，所述接触包括在癌细胞存在下。
13.权利要求1-3任一项所述的抗LILRB4纳米抗体、权利要求4所述的融合蛋白、权利要求5或6所述的抗体、权利要求7所述的组合物、权利要求8所述的核酸分子、权利要求9所述的载体、或权利要求10所述的重组细胞在制备药物中的用途，所述药物用于预防、治疗和/或改善肿瘤。
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