ES2324751B1 - Metodos y kits para diagnosticar y/o pronosticar el estado de tolerancia en el trasplante de higado. - Google Patents
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Abstract
Métodos y kits para diagnosticar y/o pronosticar
el estado de tolerancia en el trasplante de hígado.
La supervivencia a largo plazo de los injertos
trasplantados depende de manera crítica de la administración
continuada de fármacos inmunosupresores para prevenir el rechazo
del injerto. Estos fármacos son muy efectivos para prevenir el
rechazo, pero también son responsables de efectos secundarios
graves. Los inventores han seleccionado un grupo de genes cuya
expresión permite caracterizar el estado de tolerancia en el
trasplante hepático en humanos. Basándose en el perfil de expresión
de este grupo de genes, los inventores proporcionan un método no
invasivo para diagnosticar y/o pronosticar el estado de tolerancia
en el trasplante hepático en humanos, así como kits para llevarlo a
cabo. Estos kits son más sencillos y baratos que otros basados en
el análisis de un gran número de genes, tales como los microarrays
comerciales que contienen miles de sondas.
Description
Métodos y kits para diagnosticar y/o pronosticar
el estado de tolerancia en el trasplante de hígado.
Esta invención se refiere al campo de la
medicina humana y específicamente al diagnóstico y/o pronóstico del
estado de tolerancia en un trasplante particular.
La supervivencia a largo plazo de los injertos
trasplantados depende de manera crítica de la administración
continuada de fármacos inmunosupresores para prevenir el rechazo
del injerto. Estos fármacos son muy efectivos para prevenir el
rechazo, pero también son responsables de efectos secundarios
graves, tales como nefrotoxicidad, mayor riesgo de infecciones
oportunistas y tumores, y complicaciones metabólicas como diabetes,
hiperlipidemia, e hipertensión arterial. A causa de los efectos
secundarios de los fármacos inmunosupresores, la inducción de
tolerancia, definida como aquel estado en el cual el injerto,
mantiene una función normal en ausencia de inmunosupresión crónica,
es uno de los objetivos fundamentales de la investigación en
inmunología del trasplante. La inducción de tolerancia es posible
en un gran número de modelos experimentales de trasplante en
roedores. La aplicación de estos tratamientos experimentales en la
clínica ha sido sin embargo en gran parte un fracaso. El trasplante
hepático es la única situación clínica en la cual la tolerancia se
produce de manera espontánea en una proporción substancial de los
pacientes. De hecho, la retirada completa del tratamiento
inmunosupresor puede alcanzarse en hasta un 21% de los pacientes
(cf. J. Lerut et al., "An appraisal of tolerance in liver
transplantation", American Journal of Transplantation
2006, vol. 6, pp. 1774-80). Desgraciadamente,
carecemos en la actualidad de medios para identificar a estos
pacientes tolerantes antes de suprimir el tratamiento
inmunosupresor. Por esta razón, la retirada completa de los
fármacos inmunosupresores raramente se intenta en el trasplante de
hígado, y esto hace que muchos pacientes continúan recibiendo
innecesariamente tratamiento inmunosupresor, con los problemas
económicos y de salud pública que esto comporta.
Una de las razones por las cuales la aplicación
clínica en humanos de los tratamientos experimentales inductores de
tolerancia no ha sido exitosa tiene que ver con la falta de una
herramienta que permita diagnosticar de manera no invasiva la
tolerancia en receptores humanos de trasplante. Publicaciones
recientes enfatizan la necesidad imperiosa de contar con esta
herramienta (p.ej. N. Najafian et al., "How can we measure
immunologic tolerance in humans?", J. Am. Soc. Nephrol.
2006, vol. 17, pp. 2652-63; K. A. Newell et
al., "Tolerance assays: measuring the unknown",
Transplantation 2006, vol. 81, pp.
1503-9).
Para identificar la tolerancia en el trasplante,
fundamentalmente de riñón e hígado, se han utilizado o bien ensayos
funcionales antígeno específicos, o bien ensayos antígeno
no-específicos. En los ensayos funcionales se
prueban linfocitos T del receptor con antígenos del donante, ya sea
in vitro o in vivo (cf. J. Cai et al.,
"Minor H antigen HA-1-specific
regulator and effector CD8+ T cells, and HA-1
microchimerism, in allograft tolerance", J. Exp. Med.
2004, vol. 199, pp. 1017-23; E.
Jankowska-Gan E et al., "Human liver
allograft acceptance and the tolerance assay", Hum.
Immunol. 2002, vol. 63, pp. 862-70; M.
Hernández-Fuentes et al., "Indices of
tolerance: Interim report", abstract #999, World Transplant
Congress 2006,). Estos ensayos son muy valiosos desde un punto de
vista mecanístico, ya que son los únicos tests capaces de
desentrañar los mecanismos responsables de la especificidad del
estado de tolerancia. Desgraciadamente, estos ensayos son también
difíciles de llevar a cabo, muy variables de laboratorio a
laboratorio (difíciles de estandarizar), y requieren la
disponibilidad de células del donante que hayan sido
criopreservadas de manera cuidadosa. Por estas razones, los tests
funcionales no son la metodología óptima para un uso clínico a gran
escala, y en la actualidad se realizan únicamente en laboratorios
seleccionados, muy especializados, y para fines fundamentalmente de
investigación.
Los tests antígeno
no-específicos de inmunomonitorización representan
un grupo heterogéneo de metodologías encaminadas a caracterizar
fenotípicamente el sistema inmune del receptor, sin utilizar para
ello antígenos del donante. Entre estos tests, el estudio de los
patrones de distribución de la longitud del segmento CDR3 del
receptor de células T (TcLand) y el inmunofenotipaje de las células
de sangre periférica por citometría de flujo, han sido utilizados
para identificar biomarcadores característicos de la tolerancia en
humanos. La técnica de TcLand ha sido empleada para discriminar
entre receptores de un trasplante renal tolerantes y receptores con
rechazo crónico, utilizando muestras de sangre periférica (cf. S.
Brouard et al., "Operationally tolerant and minimally
immunosuppressed kidney recipients display strongly altered blood
T-cell clonal regulation", Am. J.
Transplant. 2005, vol. 5, pp. 330-40). Esta
técnica, sin embargo, es cara, está disponible en la actualidad en
un único laboratorio (Inserm 643 and TcLand Biotech en Nantes,
Francia), y no ha sido nunca validada en el trasplante hepático. El
inmunofenotipaje de células de sangre periférica mediante
citometría de flujo ha sido empleado con muestras de pacientes
tolerantes trasplantados de hígado o riñón. Los inventores conocen
dos estudios sobre esta metodología. En el primero de ellos, de la
Universidad de Pittsburgh en EEUU (cf. G.V. Mazariegos et
al., "Dendritic cell subset ratio in peripheral blood
correlates with successful withdrawal of immunosuppression in liver
transplant patients", Am. J. Transplant. 2003, vol. 3,
pp. 689-96), se dice que el cociente entre los
subtipos de células dendríticas pDC y mDC podría discriminar entre
receptores pediátricos de un trasplante hepático tolerantes y no
tolerantes. En el segundo estudio, de Kyoto (cf. Y. Li et
al., "Analyses of peripheral blood mononuclear cells in
operational tolerance after pediatric living donor liver
transplantation", Am. J. Transplant. 2004, vol. 4, pp.
2118-25), se dice que un incremento en el cociente
entre las células T gammadelta en sangre periférica,
delta-1 y delta-2, es más prevalente
en los receptores hepáticos tolerantes que en los no tolerantes.
Sin embargo, ninguno de estos tests alcanza la precisión requerida
para una aplicación clínica a gran escala.
Aunque el uso crónico de los fármacos
inmunosupresores es en la actualidad el único medio de asegurar la
supervivencia a largo plazo de los aloinjertos trasplantados, estos
fármacos son caros y se asocian a la aparición de efectos
secundarios graves (nefrotoxicidad, desarrollo de tumores e
infecciones, diabetes, complicaciones cardiovasculares, etc.) que
dan lugar a una morbilidad y mortalidad importantes. Por ello,
cualquier estrategia capaz de reducir significativamente el uso de
los fármacos inmunosupresores en los trasplantes puede tener un
impacto notable en la salud y la calidad de vida de los pacientes
trasplantados.
Los inventores han seleccionado un grupo de
genes cuya expresión caracteriza el estado de tolerancia en el
trasplante hepático en humanos. Basándose en el perfil de expresión
de este grupo de genes, los inventores proporcionan aquí un método
no-invasivo para diagnosticar y/o pronosticar el
estado de tolerancia en el trasplante hepático en humanos.
En este contexto, es pertinente mencionar que el
estudio del perfil de expresión genética se ha utilizado
previamente para diagnosticar el rechazo tanto en el trasplante de
riñón como de corazón, y también para la detección de la tolerancia
en el trasplante renal (cf. Miqueu M, et al.,
"Discrimination of kidney transplant recipients presenting
operational tolerance from chronic rejection", abstract #998,
World Transplant Congress 2006). En lo que hace referencia al
trasplante hepático, se ha publicado un estudio sobre los perfiles
de expresión genética de los linfocitos obtenidos de receptores
tolerantes en un modelo de trasplante hepático en ratas (cf. Fujino
et al., "Differences in lymphocyte gene expression between
tolerant and syngeneic liver grafted rats", Liver
Transpl. 2004, vol. 10, pp. 379-91). Sin
embargo, las tecnologías de expresión genética para detectar
tolerancia, sin embargo, no se han utilizado todavía en el
trasplante hepático en humanos.
La invención proporciona un método para
diagnosticar y/o pronosticar el estado de tolerancia en el
trasplante hepático en un paciente humano, que comprende los
siguientes pasos: (a) obtención de una muestra biológica del
paciente; y (b) medición de los niveles de expresión en la muestra
de un grupo de genes que comprenden los veintidós siguientes:
receptor III del factor de transformación del crecimiento beta
(TGFBR3, NCBI Gene ID 7049), miembro 1 de la subfamilia B de los
receptores tipo lectina de las células killer (KLRB1, NCBI
Gene ID 3820), homólogo 8 de la glicosilación de la asparagina
(ALG8, NCBI Gene ID 79053), grupo G de la complementación de la
anemia de Fanconi (FANCG, NCBI Gene ID 2189), proteína asociada
gem 7 (GEMIN7, NCBI Gene ID 79760), secuencia natural
killer grupo 7 (NKG7, NCBI Gene ID 4818), homólogo B de RAD23
de Saccharomyces cerevisiae (RAD23B, NCBI Gene ID 5887),
miembro 7 de la familia SLAM (SLAMF7, NCBI Gene ID 57823),
inhibidor de la apoptosis 1 regulado por TP53 (TRIAP1, NCBI Gene ID
51499), isoforma beta de la fosfatasa 1B dependiente de magnesio
(PPM1 B, NCBI Gene ID 5495), marco de lectura abierto 119 del
cromosoma 10 (C10orf119, NCBI Gene ID 79892), locus delta del
receptor de células T (TRD@, NCBI Gene ID 6964), miembro 1 de la
familia A de proteínas nucleolares (NOLA1, NCBI Gene ID 54433),
dominio 1 conteniendo DCN1 defectiva en cullin neddylation 1 de
Saccharomyces cerevisiae (DCUNID1, NCBI Gene ID 54165),
proteína 1 de unión a la distrobrevina (DTNBP1, NCBI Gene ID
84062), subunidades alfa y beta de
N-acetilglucosamina-1-fosfato
transferasa (GNPTAB, NCBI Gene ID 79158), subunidad 26S
no-ATPasa 14 del proteosoma (PSMD14, NCBI Gene ID
10213), subunidad zeta 1 del complejo proteico de coatómero (COPZ1,
NCBI Gene ID 22818), proteína Al0 de unión al calcio S100 (S100A10,
NCBI Gene ID 6281), ataxina 10 (ATXN10, NCBI Gene ID 25814), factor
1 de unión a secuencia ARN rica en G (GRSF1, NCBI Gene ID 2926), y
molécula CD244 receptor de células natural killer 2B4
(CD244, NCBI Gene ID 51744); donde niveles de expresión de los
genes por encima o por debajo de valores dintel
pre-determinados son indicativos del estado de
tolerancia en el trasplante hepático. Las referencias de los genes
se han hecho incluyendo el nombre, símbolo, y la identificación
(Gene ID) de la NCBI.
Tal y como aquí se usa aquí, el término
"estado de tolerancia" significa la aceptación de un hígado
trasplantado que mantiene una función normal en ausencia de
tratamiento inmunosupresor continuado. En lo que respecta a la
presente invención, los términos "tolerancia" y "tolerancia
operacional" se consideran equivalentes. El término
"diagnóstico" se refiere a la identificación de pacientes
tolerantes de entre los receptores de un trasplante hepático que
están recibiendo tratamiento inmunosupresor de mantenimiento. El
término "pronóstico" hace referencia a la capacidad de
predecir que la reducción/retirada de la medicación inmunosupresora
en receptores de un trasplante hepático se lleve a cabo con éxito,
antes de que se intente modificar la medicación.
En una realización de la presente invención los
niveles de expresión de los genes se encuentran por encima de
valores dintel pre-determinados obtenidos a partir
de una muestra control. En una realización particular, la muestra
control se obtiene de un receptor de trasplante hepático
no-tolerante que requiere tratamiento
inmunosupresor continuado, que puede llamarse "paciente
dependiente de inmunosupresión" (ID).
Los genes diferentemente expresados pueden estar
tanto sobre o infra-regulados en una situación
determinada. "Sobre-regulación" e
"infra-regulación" son términos relativos e
indican que la diferencia en la expresión genética que se puede
detectar por encima de la contribución del ruido del sistema de
medición se establece en referencia a un valor de expresión
genética basal. En el caso presente, la expresión basal es la
expresión genética medida en la muestra control. Los genes de
interés en el estado de tolerancia se hayan
sobre-regulados en relación con los niveles basales
obtenidos utilizando el mismo método de medición.
La presente invención proporciona medios para
usar la cuantificación de la expresión genética para diagnosticar
el estado de tolerancia en pacientes receptores de un trasplante
hepático antes de que la retirada o reducción del tratamiento
inmunosupresor haya sido efectuada. La principal aplicación de esto
es el diagnóstico de los receptores tolerantes de un trasplante
hepático de entre todos los pacientes que están recibiendo
tratamiento inmunosupresor crónico. Por consiguiente, esto permite
la reducción en la dosis o la retirada de los fármacos
inmunosupresores en aquellos pacientes identificados como
tolerantes sin que estos desarrollen rechazo. Esto puede tener como
resultado una reducción substancial de la morbilidad/mortalidad
asociadas a los efectos secundarios de los fármacos
inmunosupresores. Esto también implica una disminución
significativa en los costes financieros del tratamiento que se
administra después de un trasplante hepático.
La medición de los niveles de expresión de los
genes en la muestra biológica puede efectuarse tanto utilizando los
productos de la transcripción de estos genes (ARN mensajeros), como
los productos de la traducción (las proteínas).
En una realización particular, la medición de
los niveles de expresión de los genes se lleva a cabo utilizando un
microarray o un chip genético que comprende sondas de ácidos
nucleicos. Dichas sondas comprenden secuencias que se hibridan de
manera específica a los productos de la transcripción del grupo de
genes definido anteriormente. Como mínimo es preciso que en el
microarray o en el chip génico exista al menos una sonda
para cada uno de los productos de transcripción para detectar todos
los genes definidos antes, pero es posible que exista más de una
sonda para el mismo producto de transcripción.
El término "se hibridan de manera específica
a" se refiere a la unión, formación de un dúplex o hibridación
que se lleva a cabo de manera substancial entre una molécula y una
o varias secuencias particulares de nucleótidos en condiciones
estrictas, cuando esta secuencia se encuentra en una mezcla
compleja (por ejemplo ADN o ARN celular total). "Hibridación"
se refiere al proceso por el cual dos polinucleótidos de cadena
única se unen de manera no covalente para formar un polinucleótido
de doble cadena estable.
La tecnología de los microarrays es capaz
de medir los niveles de ARNm de un gran número de genes de manera
simultánea, y constituye por tanto una herramienta muy potente para
identificar perfiles de expresión genética característicos de
enfermedades o estados específicos. En la actualidad se utilizan
fundamentalmente dos tipos de tecnologías de microarrays. La
primera son los microarrays de ADN complementario (ADNc) y la
segunda los microarrays de olignonucleótidos. Aunque existen
diferencias en la construcción de estos chips, la información que
proporcionan y el análisis de los datos es muy similar.
Habitualmente la muestra de ácidos nucleicos se prepara de una
fuente adecuada y se marca con un marcador específico, como p.ej.
una molécula fluorescente). La muestra se incuba con el
microarray en unas condiciones específicas que favorezcan la
hibridación. Los microarrays son entonces lavados o
procesados de alguna otra manera para eliminar los ácidos nucleicos
no hibridados. A continuación la hibridación es evaluada mediante
la detección de la distribución del marcador en el chip. La
distribución del marcador puede detectarse escaneando los
microarrays para determinar la distribución de la intensidad
de fluorescencia. Típicamente la hibridación de cada sonda se
estima por la intensidad de los pixels correspondientes. La
intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de ADNc y, por
tanto, de ARNm, expresado en la muestra. El análisis de los niveles
de expresión diferencial se efectúa comparando estas intensidades
para la muestra en estudio y la muestra control. El cociente entre
las intensidades indica la expresión relativa
("fold-change") entre la muestra en estudio y
la muestra control.
En una realización particular de la invención,
el microarray es un microarray de ADNc. En este
formato las sondas de ADNc (\sim500-5000 bases de
longitud) son inmovilizadas sobre una superficie sólida, por ejemplo
cristal, utilizando un robot y las muestras en estudio y control
son hibridadas bien mezcladas o por separado. Este método
tradicionalmente conocido como microarray de ADN, fue
desarrollado originariamente en la Universidad de Stanford.
En otra realización particular, el
microarray es un microarray de oligonucleótidos. En
este formato los oligonucleótidos
(\sim20-80-mer) o las sondas de
ácido péptido nucleico (PNA, de "peptide nucleic acid") son
sintetizadas in situ (en el propio chip) o bien sintetizadas
de manera convencional y posteriormente inmovilizadas en el chip.
La muestra de ácidos nucleicos marcados es hibridada con el
microarray tras lo cual se calcula la abundancia e identidad
de las secuencias complementarias. Este método históricamente
conocido como chip de ADN, fue desarrollado por Affymetrix, Inc.,
que los fabrica utilizando técnicas de fotolitografía y los
comercializa bajo la marca registrada GeneChipe. Muchas compañías
fabrican en la actualidad microarrays de oligonucleótidos
utilizando otras técnicas alternativas de síntesis in situ o
de deposición.
El microarray puede confeccionarse bajo
un gran número de formatos, por ejemplo, como librerías de
moléculas solubles, y como librerías de compuestos unidos a
partículas de resina o a chips de sílice, de vidrio o a cualquier
otro soporte sólido. Existe por tanto un gran número de
configuraciones, soportes y métodos de producción que son bien
conocidos por los expertos en la materia. Las sondas pueden ser
confeccionadas según cualquiera de las metodologías conocidas, ya
sea sintéticamente o mediante la producción en un hospedador
biológico. Los métodos sintéticos incluyen, pero no están limitados
a, la síntesis de oligonucleótidos, sondas de ARN
("riboprobes") y reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las
sondas pueden ser marcadas con un marcador que pueda ser detectado
utilizando métodos conocidos. Métodos para el marcaje de las sondas
incluyen random priming, end labeling, PCR y nick
translation.
En una realización particular, el
microarray o chip genético comprende además una o más sondas
internas control que se utilizan como sondas de normalización,
controles del nivel de expresión y controles de hibridación cruzada
(controles mismatch). Las sondas de normalización se utilizan
para controlar aquellos factores que pueden impedir que la
hibridación sea perfecta, y por tanto que se produzcan diferencias
entre distintos microarrays, por ejemplo, debido a
diferencias en las condiciones de hibridación, intensidad del
marcaje, eficiencia de la "lectura", etc. Los controles de
nivel de expresión son sondas que se hibridan específicamente con
genes expresados de manera constitutiva en la muestra analizada
(genes "housekeeping"). Los controles mismatch son
sondas de oligonucleótidos idénticas a sus correspondientes sondas
test o control excepto en una o unas pocas bases. Los controles
mismatch permiten descartar la hibridación no específica o
hibridación cruzada, es decir, aquella por la cual una sonda se une
a un ácido nucleico diferente de aquél frente al cual es específica
(falsos positivos).
En otras realizaciones de la invención, la
medición de los niveles de expresión de los genes se lleva a cabo
utilizando PCR transcripción reversa (RT-PCR),
RT-PCR competitiva, RT-PCR en tiempo
real, differential display RT-PCR, análisis
de Northern Blot y otros tests relacionados. En una realización
particular de la invención, la medición de los niveles de expresión
de los genes se lleva a cabo utilizando transcripción reversa y
reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa a partir de ARN
extraído de la muestra. En una realización más particular, la
RT-PCR comprende uno o más reactivos que actúan
como controles internos. Otra opción es llevar a cabo estas
técnicas de cuantificación de la expresión genética utilizando
reacciones PCR para amplificar ADNc o ARNc producido a partir de
ARNm y analizarlos utilizando microarrays.
En otras realizaciones, la medición de los
niveles de expresión de los genes se lleva a cabo midiendo las
proteínas codificadas por cada uno de los genes con anticuerpos
específicos para ellas o con un chip de proteínas. Un chip o
array de proteínas puede construirse en diversos formatos,
pero habitualmente consiste en un soporte sólido sobre el cual se
inmovilizan enzimas, proteínas receptores, anticuerpos o moléculas
pequeñas que permiten detectar las proteínas contenidas en la
muestra en estudio. En otra realización, la medición de los niveles
de expresión de los genes se lleva a cabo por HPLC. Los niveles de
expresión pueden también detectarse analizando una característica
del gen que afecta su actividad transcripcional, como por ejemplo
amplificación de ADN, metilación, mutación o variación alélica.
Estos métodos son bien conocidos por los expertos en la materia.
Otros aspectos de la invención son kits para
llevar a cabo los ensayos descritos previamente. Ya que estos kits
se basan en la selección de un grupo de genes que comprenden los
que se han pormenorizado previamente, los kits son más sencillos y
baratos que otros métodos basados en un gran número de genes, como
por ejemplo los microarrays comerciales que contienen miles
de genes. Así pues, un aspecto de la invención se refiere al uso de
un kit para llevar a cabo el método definido anteriormente, que
comprende (i) medios para medir los niveles de expresión de los
genes seleccionados; y (ii) instrucciones para correlacionar los
niveles de expresión por encima o por debajo de valores dintel
pre-determinados indicativos del estado de
tolerancia en el trasplante hepático. En una realización particular
de la invención, los medios comprenden un microarray o un
chip genético que comprende sondas de ácidos nucleicos, dichas
sondas comprendiendo secuencias que se hibridan de manera
específica a los productos de la transcripción del grupo de genes
definido antes. Adicionalmente, el kit comprende además reactivos
para llevar a cabo el análisis por microarray. En otra
realización, los medios comprenden cebadores oligonucleótidos para
llevar a cabo transcripción reversa y reacción en cadena de la
polimerasa cuantitativa, dichos cebadores comprendiendo secuencias
que se hibridan de manera específica al ADN complementario derivado
de los productos de la transcripción del grupo de genes definido
antes. Preferiblemente, cada uno de estos kits incluirá
instrucciones así como los reactivos necesarios para llevar a cabo
el tipo de ensayo descrito. Estos reactivos pueden ser arrays
de ácidos nucleicos (p.ej. microarrays de oligonucleótidos o
ADNc) configurados de manera que puedan detectar el perfil de
expresión genética de la invención. También pueden consistir en
reactivos para llevar a cabo la amplificación y detección de los
ácidos nucleicos, incluyendo p.ej. transcriptasa inversa, cebadores
para llevar a cabo la retrotranscripción, grupo de cebadores para
la PCR correspondiente, ADN polimerasa termoestable como la Taq
polimerasa, y reactivos apropiados para llevar a cabo la detección
como pueden ser, entre otros, sondas fluorescentes o pigmentos que
se unen al ADN de doble cadena como el bromuro de etidio o el
SYBRgreen. Los kits basados en anticuerpos contendrán tampones,
anticuerpos secundarios, enzimas de detección y su substrato, por
ejemplo "Horse Radish Peroxidase" o reactivos basados en
biotina-avidina.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
de un microarray o un chip genético para llevar a cabo el
método definido antes, que comprende un soporte sólido sobre el
cual se han depositado sondas de ácidos nucleicos que comprenden
secuencias que se hibridan de manera específica a los productos de
la transcripción del grupo de genes definido antes.
La práctica de la presente invención también
puede requerir el uso de métodos biológicos convencionales y
software. Los productos de software de la invención
incluyen medios legibles por ordenador que contienen instrucciones
ejecutables por ordenador para realizar los pasos lógicos del
método de la invención. La presente invención puede también utilizar
diversos softwares y programas informáticos diseñados para
llevar a cabo una gran variedad de funciones, como por ejemplo el
diseño de sondas, el procesamiento de datos, el análisis, y la
manipulación de los aparatos necesario.
Finalmente, otro aspecto de la invención se
refiere a un método para seleccionar o modificar un protocolo de
tratamiento, ya sea antes o después del trasplante hepático, que
comprende el uso del método para diagnosticar y/o pronosticar según
se define anteriormente. Antes de que se lleve a cabo un trasplante
hepático, la invención permite identificar a aquellos pacientes que
acabarán desarrollando tolerancia, y que por tanto no necesitan
pautas agresivas de inmunosupresión. Una vez el trasplante hepático
ya ha sido realizado, la invención permite adecuar la medicación
inmunosupresora al estado del paciente. Los cambios en el
tratamiento del paciente podrán incluir la administración de
fármacos adicionales, cambios en la dosis o frecuencia de las
medicaciones, o retirada completa del tratamiento. Este análisis
permite intervenciones o ajustes del tratamiento antes de que se
produzcan cambios clínicamente detectables en el estado de los
pacientes, o cuando los cambios clínicos resulten ser ambiguos.
Tal y como se utiliza aquí, "la muestra
biológica del paciente" puede ser sangre no fraccionada,
leucocitos, bilis o células procedentes de la bilis, y pueden ser
también porciones de tejido hepático en forma de tejido fresco,
secciones congeladas o secciones fijadas en formalina. Tal y como es
evidente para alguien experto en la materia, las muestras
biológicas serán procesadas por el método o procedimiento adecuados
al tipo de tecnología analítica que vaya a llevarse a cabo a
continuación. Los métodos para extraer ARN total o ARNm son bien
conocidos. Además de muestras de ARN, las muestras utilizadas
pueden incluir ADNc sintetizado a partir de ARNm o ARN total
aislados a partir de una célula o tejido de interés. Estas muestras
también pueden incluir ADN amplificado a partir del ADNc y ARN
transcrito a partir de ADN amplificado.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se
pretende que sean limitativos de la presente invención.
Los inventores utilizaron la tecnología de los
microarrays de oligonucleótidos en muestras de sangre
obtenidas de receptores de trasplante hepático tolerantes y
no-tolerantes, y determinaron que los pacientes
hepáticos tolerantes exhiben en células de sangre periférica un
perfil de expresión genética característico. Los inventores han
utilizando diversas metodologías de clasificación para identificar
un grupo de genes cuyos niveles de expresión pueden utilizarse para
diagnosticar el estado de tolerancia con gran precisión.
Se obtuvieron muestras de sangre periférica de
una cohorte de 9 receptores adultos de un trasplante hepático
tolerantes (TOL) (>1 año después de la retirada de la
inmunosupresión). Para los estudios comparativos se obtuvieron
también muestras de sangre de 11 receptores adultos de un trasplante
hepático a los cuales en algún momento se intentó de manera
infructuosa retirar la medicación inmunosupresora, lo cual condujo
al desarrollo de rechazo agudo de injerto y por tanto a la
reinstauración del tratamiento inmunosupresor (pacientes
dependientes de inmunosupresión o ID). En los receptores ID las
muestras de sangre fueron recolectadas al menos 2 años después de
la resolución completa del episodio de rechazo agudo. También se
obtuvieron muestras de sangre de un grupo de 10 individuos sanos de
edades similares a las de los receptores hepáticos.
Después de aislar las células mononucleares de
sangre periférica empleando un gradiente de densidad
Ficoll-Hypaque layer (Amersham Biosciences,
Uppsala, Suecia), se extrajo el ARN total utilizando el reactivo
Trizol (Life Technologies, Rockville, MD, EEUU), a partir del cual
se generó ARNc que fue hibridado a los chips Affymetrix Human
Genome U133 Plus 2.0 Array que contienen sondas para 47000 ARNm
(Affymetrix, Inc, Santa Clara, CA, EEUU). La base de datos completa
comprendía medidas de expresión de 54675 genes para 9 muestras TOL
y 11 muestras ID. Los archivos CEL resultantes fueron procesados,
normalizados y sus valores de expresión tabulados utilizando el
algoritmo gcrma contenido el paquete bioinformático
Bioconductor (http://www.bioconductor.org). Para identificar
los genes diferentemente expresados entre los receptores TOL y ID
se analizaron inicialmente los datos procedentes de un subgrupo de
muestras (9 TOL y 8 ID) utilizando una metodología Bayesiana para
el análisis diferencial que se encuentra implementada en el
programa BADGE (Bayesian Analysis of Differential Gene Expression,
http://www.genomethods.org/badge). La base de datos completa fue a
continuación re-analizada independientemente
utilizando el programa Significance Analysis of Microarray (SAM;
V.G. Tusher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001
vol. 98, pp. 5116–21) para 500 permutaciones. SAM es un
software para la detección de genes diferentemente
expresados en microarrays. Su metodología de permutación
mantiene la correlación inter-gen y da cuenta del
problema de las comparaciones múltiples de manera automática. Para
realizar el análisis se seleccionaron los parámetros con una
predicción de un 5% de falsos positivos. Finalmente, se utilizó el
programa Prediction Analysis of Microarray (PAM; R. Tibshirani
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002, vol. 99, pp.
6567-72) para identificar el grupo más reducido de
genes con capacidad discriminativa para distinguir las muestras TOL
de las ID. El programa PAM es muy potente a la hora de seleccionar
un pequeño grupo de genes con alto valor predictivo. Se utilizaron
parámetros de validación cruzada con un dintel de 2.9 para obtener
una lista de genes con un porcentaje de error global del 5%.
Para validar técnicamente los resultados del
array se seleccionaron los siguientes genes, a partir de la lista
de 628 genes obtenida con el programa BADGE (CD94, IL1, IL23,
TNF\alpha, ICAM1, BAX, BCL-2, CD103, FASL, FOXP3,
GITR, GZMB, TIM1, TIM3, HO1, IFN\gamma, IL10, IL15, TGF\beta1,
A20, PRF1, IL6), y se cuantificó su expresión utilizando PCR en
tiempo real con un aparato ABI 7900 Sequence Detector System y
sondas y cebadores de
Assays-on-Demand primer/probe sets
(PE Applied Biosystems, Foster City, CA, EEUU). Para estos estudios
el ARN total fue tratado con una enzima ADNasa (Ambion, Austin, TX,
EEUU), y se llevó a cabo la transcripción reversa utilizando la
enzima Multiscribed Reverse Transcriptase (PE Applied Biosystems).
Para cuantificar los niveles de ARNm, la expresión de los genes
diana descritos fue normalizada al gen housekeeping 18S, y
los resultados fueron tabulados como expresión relativa (fold
change) entre el ADNc de las muestras en estudio y una muestra
calibrador. Por otra parte, se llevaron a cabo estudios de
inmunofenotipaje utilizando los siguientes anticuerpos: CD3, CD4,
CD8, CD19, CD11 c, CD14, CD20, CD28, CD45RA, CD62L, CD123,
HLA-DR, \alpha\beta-TCR,
\gamma\delta-TCR, V\delta1-TCR
(de BD Biosciences, Mountain View, CA, USA),
V\delta2-TCR, V\alpha24-TCR (de
Beckman Coulter, Fullerton, CA, EEUU) y Foxp3 (Treg staining kit,
eBioscience, San Diego, CA, EEUU). Para llevar a cabo las
tinciones, alícuotas de 100 \mul de sangre anticoagulada con EDTA
fueron incubadas a temperatura ambiente durante 15 minutos con una
combinación de los anticuerpos apropiados. Las muestras teñidas
fueron analizadas utilizando un citómetro FACScalibur con el
programa Cellquest Pro software (BD Biosciences).
En el primer análisis, en el que únicamente se
utilizó los datos de un subgrupo de muestras el programa BADGE
seleccionó aquellos genes con más del 99.5% y menos del 0.5% de
probabilidad de estar más expresados en los receptores TOL que en
los ID. Esto dio como resultado un total de 462 genes
sobre-expresados y 166 genes
infra-expresados. De entre estos 628 genes, los
niveles de expresión de un subgrupo seleccionado (CD94, IL1, IL23,
TNF\alpha, ICAM1, BAX, BCL-2, CD103, FASL, FOXP3,
GITR, GZMB, TIM1, TIM3, HO1, IFN\gamma, IL10, IL15, TGF\beta1,
A20, PRF1, IL6) fueron cuantificados por PCR en tiempo real para
validar desde el punto de vista técnico la precisión de los
resultados del microarray. En todos los casos las tendencias
observadas por PCR fueron similares a los patrones de expresión
genética identificados por los microarrays. Estos
experimentos confirmatorios por PCR indican que es posible utilizar
la PCR en tiempo real para cuantificar de manera directa los
niveles de expresión de un grupo seleccionado de genes sin
necesidad de llevar a cabo estudios utilizando microarrays de
todo el genoma.
Para evaluar la significación estadística de los
genes diferentemente expresados en la base de datos completa se
utilizó entonces el programa SAM utilizando los parámetros
correspondientes a una predicción de un 5% de falsos positivos.
Esto dio como resultado una lista de 68 genes capaces de
discriminar entre muestras TOL y ID con una precisión del 95%. De
manera independiente se utilizó el programa PAM en la misma base de
datos completa para encontrar la lista con el mínimo número de
genes capaz de clasificar las muestras en TOL o ID de manera
precisa. El resultado de este análisis fue una lista de 34 genes
que cumplían el criterio del 5% de error global. De entre los 68
genes identificados por SAM, 22 fueron seleccionados también por
PAM, indicando que 44 de los 68 genes identificados por SAM no eran
imprescindibles para una correcta clasificación. Experimentos de
validación computacional adicionales utilizando la técnica de la
validación cruzada revelaron que la lista consensuada de 22 genes
podía clasificar las muestras en las categorías TOL o ID con un
error global del 5%. La tabla que se muestra a continuación (Tabla
1) incluye la lista de 22 genes que constituye el mínimo número de
genes capaz de discriminar entre muestras TOL y ID.
Una validación adicional de los resultados
obtenidos por microarrays se obtuvo a partir de los
experimentos por citometría de flujo, en los cuales de entre todas
las células mononucleares de sangre periférica únicamente el número
de linfocitos T gammadelta (que expresan el gen TRD@) fue
estadísticamente diferente entre receptores TOL y ID.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Claims (16)
1. Método para diagnosticar y/o pronosticar el
estado de tolerancia en trasplante hepático en un paciente humano,
que comprende los siguientes pasos:
- a)
- obtención de una muestra biológica del paciente; y
- b)
- medición de los niveles de expresión en la muestra de un grupo de genes que comprende los veintidós siguientes: receptor III del factor de transformación del crecimiento beta (TGFBR3), miembro 1 de la subfamilia B de los receptores tipo lectina de las células killer (KLRB1), homólogo 8 de la glicosilación de la asparagina (ALG8), grupo G de la complementación de la anemia de Fanconi (FANCG), proteína asociada gem 7 (GEMIN7), secuencia natural killer grupo 7 (NKG7), homólogo B de RAD23 de Saccharomices cerevisiae (RAD23B), miembro 7 de la familia SLAM (SLAM F7), inhibidor de la apoptosis 1 regulado por TP53 (TRIAPI), isoforma beta de la fosfatasa 1B dependiente de magnesio (PPM1B), marco de lectura abierto 119 del cromosoma 10 (C10orf119), locus delta del receptor de células T (TRD@), miembro 1 de la familia A de proteínas nucleolares (NOLA1), dominio 1 conteniendo DCN1 defectiva en cullin neddylation 1 de Saccharomices cerevisiae (DCUN1D1), proteína 1 de unión a la distrobrevina (DTNBP1), subunidades alfa y beta de N-acetilglucosamina-1-fosfato transferasa (GNPTAB), subunidad 26S no-ATPasa 14 del proteosoma (PSMD14), subunidad zeta 1 del complejo proteico de coatómero (COPZ1), proteína A10 de unión al calcio S100 (S100A10), ataxina 10 (ATXN10), factor 1 de unión a secuencia ARN rica en G (GRSF1) y molécula CD244 receptor de células natural killer 2B4 (CD244); donde los correspondientes niveles de expresión de los genes por encima o por debajo de valores umbral pre-determinados son indicativos del estado de tolerancia en el trasplante hepático.
2. Método, según la reivindicación 1, donde los
niveles de expresión de los genes se encuentran por encima de un
valor umbral pre-determinado obtenido a partir de
una muestra control.
3. Método, según la reivindicación 2, donde la
muestra control se obtiene de un receptor de trasplante hepático no
tolerante que requiere tratamiento inmunosupresor continuado.
4. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, donde la medición de los
niveles de expresión de los genes se lleva a cabo utilizando un
microarray o un chip genético que comprende sondas de ácidos
nucleicos, dichas sondas comprendiendo secuencias que se hibridan
de manera específica a los productos de la transcripción del
correspondiente grupo de genes.
5. Método, según la reivindicación 4, donde el
microarray es un microarray de ADNc.
6. Método, según la reivindicación 4, donde el
microarray es un microarray de oligonucleótidos.
7. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, donde la medición de los
niveles de expresión de los genes se lleva a cabo utilizando
transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa
cuantitativa a partir de ARN extraído de la muestra.
8. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, donde la medición de los
niveles de expresión de los genes se lleva a cabo midiendo las
proteínas codificadas por los correspondientes genes.
9. Método, según la reivindicación 8, donde las
proteínas se detectan mediante anticuerpos específicos para las
proteínas.
10. Método, según la reivindicación 8, donde las
proteínas se detectan mediante un chip de proteínas.
11. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, donde la medición de los
niveles de expresión de los genes se lleva a cabo por HPLC.
12. Uso de un kit para llevar a cabo el método
de las reivindicaciones 1-11, que comprende (i)
medios para medir los niveles de expresión del correspondiente
grupo de genes; y (ii) instrucciones para correlacionar los niveles
de expresión por encima o por debajo de valores umbral
pre-determinados indicativos del estado de
tolerancia en el trasplante hepático.
13. Uso del kit, según la reivindicación 12,
donde los medios comprenden un microarray o un chip genético que
comprende sondas de ácidos nucleicos, dichas sondas comprendiendo
secuencias que se hibridan de manera específica a los productos de
la transcripción del correspondiente grupo de genes.
14. Uso del kit, según la reivindicación 13, que
comprende además reactivos para llevar a cabo el análisis por
microarray.
\newpage
15. Uso del kit, según la reivindicación 12,
donde los medios comprenden cebadores oligonucleótidos para llevar
a cabo la transcripción reversa y reacción en cadena de la
polimerasa cuantitativa, dichos cebadores comprendiendo secuencias
que se hibridan de manera específica al ADN complementario derivado
de los productos de la transcripción del correspondiente grupo de
genes.
16. Uso de un microarray o un chip genético para
llevar a cabo el método definido en las reivindicaciones
2-5, que comprende un soporte sólido sobre el cual
se han depositado sondas de ácidos nucleicos que comprenden
secuencias que se hibridan de manera específica a los productos de
las transcripción del correspondiente grupo de genes.
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