CN108624677B - Npl在子痫前期诊断和治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了NPL在子痫前期诊断和治疗中的应用，本发明通过高通量测序技术以及进行生物信息学分析，首次发现了NPL在子痫前期孕妇中表达下调，并通过大样本进一步证实了该发现。进一步进行细胞实验，发现促进NPL的表达可以促进滋养细胞的增殖和侵袭，提示该基因可应用于改善滋养细胞浸润不足而引发的病征。

Description

NPL在子痫前期诊断和治疗中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及NPL在子痫前期诊断和治疗中的应用。
背景技术
子痫前期(Pre-eclampsia,PE)是人类妊娠期特有疾病，发病率约为6～8％，并可以导致高达15％孕产妇死亡率，是导致孕产妇和围生儿发病率和病死率最高的疾病之一。它常在妊娠20周以后出现，以高血压和蛋白尿症状为主要特征，严重者还可能导致患者出现溶血、肝酶增高、血小板减少等一系列症状。临床上PE的诊断标准包括：收缩压大于140mmHg或舒张压大于90mmHg；24小时尿蛋白≥0.3g或检测随机尿蛋白≥30mg/dL。目前认为，子痫前期是一种母体内皮细胞功能紊乱的系统性疾病，是由多种因素相互作用的结果。对于PE的病因研究有多重学说，可能涉及母体、胎盘和胎儿等多种因素，包括有滋养细胞侵袭异常、内皮细胞损伤、炎症反应、免疫调节功能异常、遗传因素和营养因素等。迄今为止，子痫前期的病因及病理机制尚未完全阐明，临床上至今未找到理想的能够彻底治愈该病的方法，目前最彻底的治疗方法就是提前终止妊娠，对母子造成极大危害。因此，子痫前期病因及病理机制的探讨一直是产科学研究的重要课题。
生命活动中基因表达的改变是生物学研究的核心问题，理解人类基因组中10万个不同的基因功能，监测某些组织、细胞不同分化阶段的差异基因表达十分重要。对差异表达的研究，可以推断基因与基因的相互关系，揭示基因与疾病的发生、发展、转归的内在联系。随着分子生物学研究技术的不断提高和创新，发现基因在子痫前期疾病的发展中起着重要的作用，但是仍缺乏有效的基因应用于子痫前期的诊断和治疗，因此寻找与子痫前期相关的基因应用于子痫前期的诊断和治疗具有重要的意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与子痫前期发生发展相关的基因标志物，灵敏和特异性的实现子痫前期的诊断和治疗。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种试剂，所述试剂能够检测NPL基因或其表达产物的水平。
进一步，所述试剂包括：
特异性识别NPL基因的探针；或
特异性扩增NPL基因的引物；或
特异性结合NPL基因编码的蛋白的抗体或配体。
进一步，特异性扩增NPL的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
本发明的第二方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的试剂。
本发明的第三方面提供了一种芯片，所述芯片包括本发明第一方面所述的试剂。
本发明的第四方面提供了一种组合物，所述组合物包括NPL的促进剂。
进一步，所述促进剂为含有NPL的载体。
进一步，所述组合物还包括与所述促进剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
本发明的第五方面提供了一种筛选治疗子痫前期的候选药物的方法，所述方法包括：
用待筛选物质处理表达或含有NPL基因或其编码的蛋白的培养体系；和
检测所述体系中NPL基因或其编码的蛋白的表达或活性；
其中，若所述待筛选物质可以促进NPL基因的水平或表达活性，则表明该待筛选物质是治疗子痫前期的候选药物。
在本发明中，所述体系包括(但不限于)：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
在本发明中，所述的步骤还包括：对获得的候选药物进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选药物中进一步选择可以治疗子痫前期的药物。
本发明的第六方面提供了如下任一项所述的应用：
a.本发明第一方面所述的试剂在制备早期诊断子痫前期的产品中的应用；
b.本发明第二方面所述的试剂盒在制备诊断子痫前期的产品中的应用；
c.本发明第三方面所述的芯片在制备诊断子痫前期的产品中的应用；
d.本发明第四方面所述的组合物在制备治疗子痫前期的药物中的应用；
e.本发明第五方面所述的方法在筛选治疗子痫前期的候选药物中的应用；
f.NPL在筛选治疗子痫前期的候选药物中的应用；
g.NPL在制备治疗子痫前期的药物中的应用。
附图说明
图1是利用QPCR检测NPL基因在子痫前期患者中的表达情况；其中，A是胎盘组织中的表达水平，图B是血液中的表达水平；
图2是NPL基因表达水平图；
图3是NPL蛋白表达水平图；
图4是MTT法检测NPL对细胞增殖活性的影响图；
图5是利用transwell小室检测NPL基因对细胞侵袭的影响图。
具体的实施方式
本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序技术以及进行高通量测序分析，检测子痫前期患者和正常孕妇血液中的基因表达水平，发现其中具有明显差异的基因，探讨其与子痫前期的发生之间的关系，从而为子痫前期的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。经过筛选本发明首次发现了NPL在子痫前期患者中表达下调，并进一步进行了验证。NPL可作为子痫前期的独立预测因子，也可以和其他的基因标志物联合应用。
NPL基因
NPL基因位于1号染色体长臂2区5带上，本发明中的NPL包括野生型、突变型或其片段。在本发明的具体实施例中，NPL具有如目前国际公共核酸数据库GeneBank中NPL基因(NM_001200050.1)所示的序列。本发明的NPL核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。
本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。
检测技术
本发明的基因和蛋白使用本领域普通技术人员已知的多种技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术。
如本文所用，“检测基因的表达水平”指确定生物样品中标记基因的mRNA存在及其表达水平以便预测子痫前期发展的过程并且通过测量mRNA的量可实现。用于此目的分析方法是但不限于RT-PCR、竞争性RT-PCR(competitiveRT-PCR)、实时RT-PCR(Real-timeRTPCR)、RNA酶保护测定法(RPA；RNaseprotectionassay)、northern印迹法(northernblotting)、DNA微阵列芯片等。
如本文所用，“检测蛋白的表达水平”指确定生物样品中标记基因内表达的蛋白质存在及其表达水平以便预测子痫前期发展的过程，并且可以通过使用与上述基因中表达的蛋白质特异性结合的抗体来确定蛋白质的量。用于此目的分析方法是但不限于western印迹法(westernblotting)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、放射性免疫测定(Radioimmunoassay)、放射性免疫扩散法(Radioimmunodiffusion)、奥克特洛尼(Ouchterlony)免疫扩散法、火箭(Rocket)电泳法、组织免疫染色法、免疫沉淀测定法(immunoprecipitationassay)、补体结合测定法(completefixationassay)、FACS、蛋白质芯片(proteinchip)等。
检测NPL蛋白的试剂为NPL蛋白的特异性结合剂。特异性结合剂是例如蛋白质NPL的受体、结合蛋白质NPL的凝集素、针对蛋白质NPL的抗体、针对蛋白质NPL的肽抗体(peptidebody)、双特异性双重结合剂或双特异性抗体形式。
特异性结合剂的例子是肽、肽模拟物、aptamer、spiegelmer、darpin、锚蛋白重复蛋白、Kunitz型域、抗体、单域抗体和单价抗体片段。在本发明的具体实施例中，所述特异性结合剂为NPL特异性抗体。
核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。
芯片、试剂盒
本发明提供了检测中NPL基因的表达水平的产品，所述产品包括(但不限于)芯片或试剂盒。其中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针或抗体，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于NPL所示的部分或全部序列，所述抗体特异性的结合NPL蛋白。
所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。
术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
术语“互补的”或“互补性”用于指代通过碱基配对原则相关的多核苷酸(即，核苷酸的序列)。例如，序列“5'-A-G-T-3'”与序列“3'-T-C-A-5'”互补。互补性可以是“部分的”，其中只有一些核酸的碱基根据碱基配对原则匹配。或者，也可在核酸之间存在“完全”或“总”互补性。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间的杂交效率和强度具有显著的影响。这在扩增反应以及依赖核酸之间的结合的检测方法中尤其重要。
本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。
本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测NPL基因或蛋白的试剂。选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。
本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测。
试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。
促进剂和药物组合物
基于本发明的发现，本发明提供了一种(药物)组合物，所述(药物)组合物包含NPL的促进剂。所述促进剂包括提高NPL基因或其表达产物稳定性、上调NPL基因或其表达产物的表达水平、增加NPL基因或其表达产物有效作用时间的物质。
通常，可将这些促进剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
作为本发明的一种优选方式，所述的NPL的促进剂是一种NPL的表达载体。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
在本发明中，是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。表达载体向宿主细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、与细胞膜透过性肽的结合等周知的方法。
在本发明中，“宿主细胞”胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、或293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量的所述的NPL的促进剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于治疗子痫前期。任何前述的NPL的促进剂均可用于组合物的制备。所述药学上可接受的载体和/或辅料，包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。
本发明中的药物组合物还可以包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂等添加剂。
如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。促进剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的NPL基因的促进剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
本发明所述药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。本发明药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。
本发明的药物组合物还可以与其他治疗子痫前期的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。
优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将NPL的促进剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带NPL的促进调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，具体情况需视所述的促进剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。
本发明中，术语“样本”以其最广泛的含义使用。意在包括从任何来源获得的标本或培养物，以及生物和环境样本。生物样本可获自动物(包括人)并涵盖液体、固体、组织和气体。生物样本包括血液制品，诸如血浆、血清等。然而，此类样本不应解释为限制适用于本发明的样本类型。
下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1筛选与子痫前期相关的基因标志物
1、样品收集
1)血清标本的收集
各收集45例正常孕妇与未接受治疗的子痫前期患者的血液，EDTA抗凝管静置10min，离心分离血清，-20℃保存备用。
2)胎盘标本的收集
各收集45例子痫前期和正常孕妇的胎盘组织，生理盐水漂洗2次，去除水分后分装于冻存管内，-80℃保存备用。
两组均排除多胎妊娠、传染性疾病、化学药物依赖、孕妇吸烟、胎儿先天畸形及其他妊娠合并症及并发症，所有纳入的研究对象均于收集标本前签署知情同意书。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。每组各取5例标本进行基因表达谱的检测分析，进行差异表达基因的筛选，并在各组全部45例标本中进行验证实验。
2、RNA样品的制备
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取胎盘组织中的总RNA，具体步骤参考说明书。
3、RNA样品的质量分析
将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。
4、去除rRNA
使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。
5、构建cDNA文库
利用Illumina TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作按说明书进行。
6、上机测序
使用Illumina X-Ten测序平台对cDNA文库进行测序，具体操作按说明书进行。
7、高通量转录组测序数据分析
对测序结果进行生物信息学分析，利用TopHat v1.3.1进行RNA-seq读段定位，通过Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度，利用cuffdiff检测差异表达，当p值<0.05时，认为基因显著差异表达。
8、结果
RNA-seq结果显示，与正常孕妇的胎盘组织相比，NPL基因在子痫前期胎盘组织中的表达量显著下调，提示NPL基因可能与子痫前期相关，因此进行进一步的大样本验证。
实施例2 QPCR测序验证NPL基因的差异表达
1、对NPL基因差异表达进行大样本QPCR验证。
2、RNA提取
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取胎盘组织中的总RNA，血液RNA提取试剂盒提取血清中的RNA，具体步骤参考说明书。
3、逆转录：
1)加入dNTP mixture1μl，Oligo dT primer 1μl，总RNA 2μg，加Rnase FreeddH2O使总体积至10μl，在PCR仪上进行变性、退火反应，65℃，5min，反应完成后置于4℃。
2)构建20μl反应体系，继续加入5×Primer Script Buffer 4μl，RNaseInhibitor 0.5μl，Prime Script RTase 0.5μl，RNase Free ddH2O 5.0μl，在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：42℃15～30min，95℃5min，反应完成之后，置于冰上。
3)水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min，-20℃储存备用。
4、QPCR检测NPL的表达水平
1)引物设计
根据Genebank中NPL基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：
NPL基因：
正向引物为5’-TGAGGAGTTGTTGGATGG-3’(SEQ ID NO.1)；
反向引物为5’-ACATTGCCCGAAGTCTAA-3’(SEQ ID NO.2)。
管家基因GAPDH的引物序列为：
正向引物：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.3)
反向引物：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.4)
2)PCR反应体系：正向引物和反向引物各1μl，SYBR Green PCR master mix 10μl，cDNA 1μl，ddH2O 7μl。
3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃10s，60℃30s，72℃15s)×40个循环，65℃～95℃，温度升高速度0.5℃/5s。在Bio-Rad iQ5荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
5、统计学方法
以GAPDH为内参，计算子痫前期胎盘组织与正常孕妇胎盘组织，子痫前期患者血液与正常孕妇血液中NPL荧光定量RT-PCR的实验结果，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，以P<0.05具有统计学差异。
6、结果
结果如图1所示，与正常孕妇相比，子痫前期孕妇中NPL基因表达显著下调，差异具有统计学意义(P<0.05)。
胎盘组织中的阳性检出率＝下调表达例数/总检测例数×100％＝43/45×100％＝95.6％，血液中的阳性检出率为42/45×100％＝93.3％，提示检测血液或胎盘组织中NPL的表达水平对于子痫前期患者的辅助诊断具有重要的作用。
实施例3 NPL基因的过表达
1、细胞培养
人早孕绒毛滋养细胞株(HTR-8/SVneo)用含10％胎牛血清的RPIM-1640培养基在37℃、5％CO2的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。
2、转染
1)转染前细胞的处理
将处于对数期的滋养细胞HTR-8/SVneo以1×105的密度分别种于六孔板中，于37℃5％CO2的培养箱中培养。
2)基因过表达载体的构建
根据GeneBank中NPL的序列合成特异的PCR扩增引物，引物序列如下：
正向引物：5’-CCGGAAGCTTGCCACCATGAGCAGGGCCC-3’(SEQ ID NO.5)
反向引物：5’-CGGGCGGCCGCGCTACCAGCTTCCAAGTT-3’(SEQ ID NO.6)
在5’端引物和3’端引物分别添加HindIII和NotI两个限制性酶切位点。以子痫前期患者提取和反转录得到的cDNA作为扩增模板，上述cDNA序列经限制性内切酶HindIII和NotI双酶切后插入到经HindIII和NotI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-1用于后续实验。
3)转染
将神经细胞分为3组，分别为对照组(HTR-8/SVneo)、空白对照组(转染pcDNA3.1-NC)、实验组(转染pcDNA3.1-1)。使用脂质体3000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-1的转染浓度均为0.5μg/ml。
3、QPCR检测NPL基因的转录水平
3.1细胞总RNA的提取
采用QIAGEN的细胞RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取，具体步骤详见试剂盒说明书
3.2逆转录步骤同实施例2。
3.3QPCR扩增步骤同实施例2。
4、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，过表达NPL基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果
结果如图2显示，相比对照组HTR-8/SVneo和转染空载pcDNA3.1-NC，实验组能够显著增加NPL基因的表达水平，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4 ELISA检测HTR-8/SVneo细胞中NPL的蛋白表达
应用双抗体夹心酶标免疫(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)分应用双抗体夹心酶标免疫(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)分析法测定HTR-8/SVneo细胞上清中NPL蛋白水平。转染后48h分别收集三组HTR-8/SVneo细胞的上清液，按照ELISA试剂盒操作流程定量检测细胞上清液中NPL的浓度。
1、配置浓度为70000pg/ml的标准品，10倍稀释后，再进行2倍倍比稀释，共有7个稀释度。
2、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液50μl，余孔分别加不同浓度梯度的标准品和待测样品各50μl。轻轻晃动混匀，酶标板加上盖，37℃反应2h。
3、弃去液体，晾干。每孔加200μl VEGF-C结合物。37℃，120min后，弃去孔内液体，晾干，PBS洗板3次。
4、依序每孔加底物溶液200μl，37℃避光显色30min。
5、依序每孔加终止溶液50μl，终止反应。
6、用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。所有标准品和待测样品的OD值均需减去零孔的OD值以得到校正值。
7、计算样品的实际浓度。
8、结果如下图3所示，过表达HTR-8/SVneo细胞的NPL基因，NPL的蛋白含量也相应增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例5 MTT法检测HTR-8/SVneo细胞增殖活性
1、细胞转染后24h，,0.25％胰蛋白酶消化，培养基重悬后计数，稀释细胞悬液，按每孔调整浓度控制在104个/ml；
2、按每孔150μl将细胞接种至96孔板，复设5个平行孔；
3、分别于转染1～6天时，弃掉各孔培养基，加入MTT培养液100μl(0.5mg/ml)继续培养5h。弃去MTT培养液，每孔加入150μl DMSO溶解MTT还原物甲瓒，摇床上震荡10min，使结晶物充分溶解，酶联免疫仪检测490nm处吸光度值；
4、统计每天的细胞吸光度值，得到的数值用曲线图表示。
5、结果
结果如图4所示，转染pcDNA3.1-1组的细胞增殖显著增加，提示改变NPL的表达水平可以改变滋养细胞的增殖能力。
实施例7 Transwell细胞体外侵袭实验
细胞转染后48h收集不同组别的HTR-8/SVneo细胞，重悬于培养液中，使细胞终浓度为106/ml，吸取100μl细胞悬液加入Transwell小室中。应用Transwell小室方法观察NPL基因沉默对HTR-8/SVneo细胞侵袭性的影响。
1、将Matrigel放入4℃融化，准备冰盒(冰浴环境)。Matrigel用RPIM-1640稀释后使用，终浓度为1mg/ml。
2、取出预冷的Transwell小室放入24孔板中，向每个Transwell小室膜上均匀加入稀释好的Matrigel胶50μ1，37℃，细胞培养箱放置3～4h使胶凝聚。
3、收集对数生长期的细胞，重悬于培养液中，终浓度为106/ml，轻轻加100μ1细胞悬液入小室。
4、24孔板中加入600μ1含20％血清的培养基，37℃、5％CO2孵箱内孵育36h。
5、棉签轻轻地擦净Transwell孔内Matrigel胶和细胞，用甲醛固定小室底端的细胞，室温放置25min，取出小室后晾干。
6、0.4％结晶紫染色10min，生理盐水快速洗涤三次，甩干后显微镜下观察，随机选择八个不同的视野照相并计数，统计结果并分析。
7、数据处理
用SPSS18.0软件对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示。多个样本均数比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
8、结果
结果如图5所示，HTR-8/SVneo、pcDNA3.1-NC、pcDNA3.1-1在transwell小室中培养后，实验组pcDNA3.1-1细胞膜下室面的细胞数增加，说明增加NPL的表达水平可以增加滋养细胞的浸润能力，提示NPL可以用于子痫前期的治疗。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> NPL在子痫前期诊断和治疗中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgaggagttg ttggatgg 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acattgcccg aagtctaa 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctctggtaaa gtggatattg t 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtggaatca tattggaaca 20
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccggaagctt gccaccatga gcagggccc 29
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgggcggccg cgctaccagc ttccaagtt 29

Claims (11)

1.一种试剂在制备早期诊断子痫前期的产品中的应用，其特征在于，所述试剂能够检测NPL基因或其表达产物的水平。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：
特异性识别NPL基因的探针；或
特异性扩增NPL基因的引物；或
特异性结合NPL基因编码的蛋白的抗体或配体。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述特异性扩增NPL的引物序列如SEQ IDNO.1~2所示。
4.一种试剂盒在制备早期诊断子痫前期的产品中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的试剂。
5.一种芯片在制备早期诊断子痫前期的产品中的应用，其特征在于，所述芯片包括权利要求1-3任一项所述的试剂。
6.一种组合物在制备早期治疗子痫前期的药物中的应用，其特征在于，所述组合物包括NPL的促进剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述促进剂为含有NPL的载体。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述组合物还包括与所述促进剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
9.一种筛选治疗子痫前期的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括：
用待筛选物质处理表达或含有NPL 基因或其编码的蛋白的培养体系；和
检测所述体系中NPL 基因或其编码的蛋白的表达或活性；
其中，若所述待筛选物质可以促进NPL基因的水平或表达活性，则表明该待筛选物质是治疗子痫前期的候选药物。
10.权利要求9所述的方法在体外筛选治疗子痫前期的候选药物中的应用。
11.NPL在体外筛选治疗子痫前期的候选药物中的应用。
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