JP2001103991A

JP2001103991A - 新規デンプン性組成物およびその製造方法

Info

Publication number: JP2001103991A
Application number: JP2000237805A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Kamasaka; 寛釜阪; Takashi Kuriki; 隆栗木; Shigetaka Okada; 茂孝岡田
Original assignee: Ezaki Glico Co Ltd
Current assignee: Ezaki Glico Co Ltd
Priority date: 1999-08-04
Filing date: 2000-08-04
Publication date: 2001-04-17

Abstract

(57)【要約】【課題】デンプンを含む食品に高付加価値を与えるた
めに、デンプンの性質を改変する技術を提供すること。【解決手段】改変デンプンを製造する方法であって、
デンプンを、アミロースへの酵素活性に対するアミロペ
クチンへの酵素活性の比が０．５未満である酵素で処理
する工程を包含する、方法、それにより製造される改変
デンプン、および改変デンプンを含有する食品。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規デンプン組成
物に関する。より詳細には、本発明は、酵素で処理する
ことにより性質が改変されたデンプン、およびそれを含
有する食品に関する。

【０００２】

【従来の技術】デンプンは単一な物質でなく、α−１，
４結合でグルコースが結合された直鎖状のアミロース
と、α−１，６結合を介した分枝構造を有するアミロペ
クチンとの混合物である。アミロース含量と、デンプン
の粘弾性などの物性との関連が示されている。例えば、
コメデンプンにおいては、アミロース含量の少ないほど
炊飯後の飯に粘りがあり、食味評価が高くなるとされて
いる。糊化したデンプン溶液を室温またはそれ以下の温
度で放置すると、アミロース鎖間の水素結合により徐々
に沈澱する。この現象を老化という。デンプンを含む食
品は、老化が生じると食感が硬くなり、食用に適さなく
なる。

【０００３】上記のように、アミロースがデンプンを含
む食品に与える影響は、当業者に公知である。よって、
イネおよびコムギなどの穀物作物において、アミロース
含量を低下させる品種改良がなされている。例えば、
「モチ小麦の作出とその澱粉特性」中村俊樹、日本応用
糖質学会平成８年度大会シンポジウム「糖質の育種と工
学の未来」講演要旨集；「糯小麦の創出」山守ら、農業
技術、５０巻、Ｐ２４１−２４５（１９９５年）には、
小麦における麺の粘弾性とアミロース含量に密接な関係
があることが記載されている。同文献では、その知見に
基づいて、育種によりアミロース含量の低いモチコムギ
デンプンを作出することを試みている。得られたデンプ
ンは、老化耐性が非常に高いが、ゲル強度あるいはゲル
の吸水特性はモチトウモロコシとは大きく異なるもので
あった。

【０００４】デンプンを含む食品の性質を改良するため
に、これまでに種々の試みがなされている。例えば、特
開平１０−３２３１６０号公報には、低温で流通および
販売できる米飯食品のために、リン含量１２００ｐｐｍ
以上、アミロース含量１５％重量以下である梗米（例、
奥羽３４４号）が適することが開示されている。同公報
では、コメの老化を防止することにおける、各種添加物
との相乗作用、特にカルシウム塩との相乗作用の高さ
（特開平１０−２６２５８２号公報）もまた教示され
る。

【０００５】デンプンの酵素処理の例として、特開平５
−３０４９０９号公報には、アミロース含量２０％以上
の粳米を、デンプン分解酵素（特に、α−アミラーゼ）
を含む酵素溶液に浸漬処理した後に炊飯することによ
り、食味が改良された米飯類が製造され得ることが開示
されている。

【０００６】また、特開平６−２６９２９１号公報に
は、デンプン粒にデンプン分解酵素（特に、α−アミラ
ーゼ）を軽度に作用させるだけで粘度低下が著しく生
じ、わずかに粘性を示す程度まで減少することが開示さ
れている。同公報では、デンプンの性質改変と、デンプ
ン中のアミロース含量との関連は特に認められていな
い。

【０００７】さらに、特開平１０−３２３１６３号公報
には、餅米を低温でセルラーゼを代表とする繊維分解酵
素、アミラーゼを代表とするデンプン分解酵素の単品も
しくは両方を加え、程良く餅米のデンプンに反応させる
ことでデンプンの構造が改変され、これが、つきあげた
餅のデンプン老化防止に有用であることが開示されてい
る。

【０００８】これらの文献は、デンプン分解酵素のアミ
ロースおよびアミロペクチンのそれぞれに対する反応性
の異同については特に議論されていない。

【０００９】本発明者らは、デンプンの性質を改変する
ために、デンプン中のアミロースおよびアミロペクチン
の含有量を、酵素処理によって人為的に変化させること
を意図した。すなわち、デンプンからアミロースのみを
除去すれば、より餅的な物性を有し、より老化し難いデ
ンプンが生成され得ると考えた。従って、アミロースの
みを選択的に加水分解し得る酵素に着目した。

【００１０】本発明者らの知る限り、このような酵素の
報告例が１つだけある。Ｋａｔｏ．Ｋら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃＡｃｔａ，第３
９１巻，９６−１０８頁（１９７５年）において、Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｒａｍｏｓａＳＢ１５株
由来の菌体内酵素が報告されている。上記酵素は、アミ
ロースに対して反応性が高く、アミロペクチンに対して
反応性が低い。しかし、この文献は、上記酵素の反応速
度論を検討しただけであり、この酵素の具体的な用途を
教示していない。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、デ
ンプンを含む食品に高付加価値を与えるために、デンプ
ンの性質を改変する技術を提供することを目的とする。
すなわち、本発明によれば、デンプン中のアミロースお
よびアミロペクチンに対して独特の作用を有する酵素で
デンプンを処理することにより、改変されたデンプンが
得られる。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、アミロペ
クチンに対してアミロースへの反応性が高い酵素ネオプ
ルラナーゼ（以下、ＮＰＬと称する）を用いて、そのデ
ンプンへの作用を鋭意検討した。その結果、ＮＰＬがデ
ンプン中のアミロースを選択的に分解するとともに、ア
ミロペクチンにも独特に作用することにより、性質が改
変された新規なデンプンが得られることを見出し、本発
明を完成するに至った。

【００１３】本発明は、改変デンプンを製造する方法で
あって、デンプンを、アミロースとアミロペクチンとに
対する酵素活性比が０．５未満である酵素で処理する工
程を包含する、方法を提供する。

【００１４】１つの実施態様では、上記酵素は、以下の
両方の特性を有する：（ｉ）アミロースに作用させたと
き、１０００以下の分子量を有する生成物が得られる；
および（ｉｉ）アミロペクチン５０〜１００重量％およ
びアミロース０〜５０重量％から構成される基質に作用
させた後のアミロペクチンからの生成物が１×１０⁶以
上の重量平均分子量を有する。

【００１５】１つの実施態様では、上記酵素は、Ｎ末端
側から順にαアミラーゼファミリー酵素における高度保
存領域１、２、３および４を含むアミノ酸配列で構成さ
れ、該αアミラーゼファミリー酵素における領域１がＮ
末端から２３９〜２４２番目のアミノ酸位置またはこの
位置と実質的に同等な位置で開始する場所に存在する。

【００１６】１つの実施態様では、上記酵素はＮＰＬで
ある。好ましくは、ＮＰＬは、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の酵素である。

【００１７】別の実施態様では、上記酵素はシクロデキ
ストリナーゼである。好ましくは、シクロデキストリナ
ーゼは、寄託番号ＦＥＲＭ−Ｐ−１３８６４のアルカリ
耐性Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．Ａ２−５ａ株に由来の酵
素である。

【００１８】なお別の実施態様では、上記酵素は、マル
トース生成アミラーゼである。好ましくは、マルトース
生成アミラーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉ
ｆｏｒｍｉｓに由来の酵素である。

【００１９】１つの実施態様では、上記デンプンは、ジ
ャガイモ、サツマイモ、キャッサバ、トウモロコシ、コ
ムギ、ウルチゴメなどからなる群から選択される植物に
由来する。

【００２０】別の実施態様では、上記デンプンは、モチ
ゴメ、モチトウモロコシ、モチコムギ、モチポテトなど
からなる群から選択される植物に由来する。

【００２１】１つの実施態様において、上記改変デンプ
ンは、上記デンプンに比べて低粘性かつ難老化性であ
る。

【００２２】別の実施態様において、上記改変デンプン
は、前記デンプンに比べて易老化性である。

【００２３】本発明はまた、上記方法により製造され
る、改変デンプンを提供する。

【００２４】本発明はさらに、上記改変デンプンを含有
する食品を提供する。

【００２５】１つの実施態様では、上記食品は、炊飯
米、餅、高デンプン飲料、焼成菓子、ガム・キャンデ
ー、和菓子、および麺からなる群から選択される。

【００２６】

【発明の実施の形態】本発明の改変デンプンを製造する
方法においては、アミロースとアミロペクチンとに対す
る酵素活性比が０．５未満である酵素（以下、「アミロ
ース特異的酵素」ともいう）が使用される。この酵素活
性比は、好ましくは、０．０５、最も好ましくは、０．
０２５未満であり得る。ここでアミロース特異的酵素に
ついての「酵素活性比」とは、実施例６に記載された条
件と実質的に同一の条件で測定した場合の、アミロペク
チンを基質としたときの酵素活性をアミロースを基質と
したときの酵素活性で割った比率を指す。

【００２７】アミロース特異的酵素はまた、実施例７に
記載された条件と実質的に同一の条件で測定した場合
の、ｋｃａｔ／Ｋｍ値において、アミロペクチンを基質
としたときの値をアミロースを基質としたときの値で割
った比によっても特徴づけることができる。この比は、
好ましくは０．２以下、より好ましくは０．０８以下で
あり得る。

【００２８】アミロース特異的酵素は、デンプン中のア
ミロースをより選択的に分解し得る。アミロース特異的
酵素は、アミロースに作用したとき、分子量約１０００
以下の生成物（特にマルトペンタオースおよびより低分
子量のオリゴ糖）、好ましくは約４００以下の生成物
（特にマルトース）を生成し得る。ここで「アミロース
に作用」とは、アミロース特異的酵素を、実施例２に記
載の条件と実質的に同一の条件で作用させることをい
う。アミロース特異的酵素はまた、アミロペクチン、ま
たはアミロースとアミロペクチンとの混合物に作用した
後、１×１０⁶以上、好ましくは２×１０⁶以上、より好
ましくは４×１０⁶以上の重量平均分子量を有する、ア
ミロペクチンからの生成物を生じさせ得る。このこと
は、アミロース特異的酵素によってアミロペクチンが重
量平均分子量１×１０⁶未満には低分子化され得ないこ
とに起因する。ここで「アミロペクチンに作用」とは、
アミロース特異的酵素を、実施例１０に記載の条件と実
質的に同一の条件で作用させることをいう。ここで「ア
ミロースとアミロペクチンとの混合物に作用」とは、ア
ミロース特異的酵素を、実施例９または１０に記載の条
件と実質的に同一の条件で作用させることをいう。アミ
ロペクチン、およびアミロペクチンとアミロースとの混
合物を総称して、アミロペクチンおよびアミロースから
構成される基質ともいう。アミロースとアミロペクチン
との混合比は、特に限定されないが、代表的には、アミ
ロース：アミロペクチン＝０〜５０：１００〜５０であ
る。

【００２９】酵素は、自然界から分離された微生物また
は植物から調製されたものおよび本酵素遺伝子をクロー
ン化し発現させた遺伝子組換え菌からの産物のいずれで
もあり得る。

【００３０】アミロース特異的酵素としては、ネオプル
ラナーゼ（ＮＰＬ）が好適に使用され得る。ＮＰＬは、
プルランのα−１，４−グルコシド結合を主に加水分解
して主としてパノースを生成する能力を有する酵素の一
群として定義される。この酵素は、さらに糖転移反応を
行い得る。公知のＮＰＬの例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓ
ｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＴＲＳ４０（微
工研菌寄託第９６０９号）由来のＮＰＬ（Ｊｏｕｒｎａ
ｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７０巻、第１
５５４頁、１９８８年）、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｓｖｕｌｇａｒｉｓ由来のα−アミラーゼ（Ａ
ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、４２巻、第１６８１頁、１９
７８年）および同菌由来のＮＰＬタイプα−アミラーゼ
（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．５７巻、第３９５頁、１９９３年）、Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
ＫＰ１０６４のプルラン加水分解酵素（Ａｐｐｌｉｅｄ
ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ、２１巻、第２０頁、１９８５年）、Ｂａ
ｃｔｅｒｏｉｄｅｓｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏ
ｎ９５−１のＮＰＬ（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７３巻、第２９２６頁、１９９１
年）およびＢａｃｉｌｌｕｓｐｏｌｙｍｙｘａ由来の
ＮＰＬ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６８巻第１１
３頁１９９７年）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉ
ｆｏｒｍｉｓ由来のアミラーゼ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．、２６７巻、２２１０８頁、１９９２年）、Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓｓｐ．ＫＳＭ−１８７６由来のＮＰＬ（Ｂ
ｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，５６巻，５１４頁、１９９２年）等が含まれる。

【００３１】ＮＰＬは、アミロースに対する反応性が、
アミロペクチンに対する反応性に比べて顕著に高いこと
を特徴とする。ＮＰＬをデンプンと反応させると、デン
プン中のアミロースは、主にマルトースに分解される。
マルトースなどの二糖以上の糖の存在下ではＮＰＬによ
るアミロペクチンの加水分解が阻害されるため、結果と
して、さらにアミロースへの反応性がアミロペクチンに
対する反応性よりも高くなると考えられる。ＮＰＬは、
必ずしもアミロペクチンに全く作用しないわけではな
く、アミロペクチンをある程度低分子化し得る。従っ
て、大部分または実質的にすべてがアミロペクチンから
なるデンプンを基質としても、ＮＰＬによる特有の低分
子化産物が生じ得る。

【００３２】上記ＮＰＬに加えて、アミロース特異的分
解酵素には、シクロマルトデキストリナーゼ（ＣＤａｓ
ｅ）、マルトース生成アミラーゼ（ＭＡ）、Ｔｈｅｒｍ
ｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｖｕｌｇａｒｉｓ α−ア
ミラーゼＩＩ（ＴＶＡＩＩ）などが含まれる。これら
の酵素がデンプン中のアミロペクチンよりもアミロース
をより特異的に切断することが、本願において初めて見
出された。

【００３３】個々の酵素について以下に説明する。

【００３４】ＣＤａｓｅは、マルトトリオース以上の重
合度を有するマルトオリゴ糖およびシクロデキストリン
類を分解し、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲ
ン、パノース、およびイソパノースをほとんど分解しな
い酵素であるとして知られていた（特開平５−６８４８
６号公報）。特開平７−２８９２８０号公報では、ＣＤ
ａｓｅは、シクロデキストリンに対する水解速度または
親和性が、多糖類またはシクロデキストリンと同じ重合
度の直鎖オリゴ糖よりも大きい基質特異性を有するとし
て定義されている。Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３）３９：１９７−２０
３（１９９３）には、ＣＤａｓｅは、デンプン、アミロ
ペクチンよりもシクロデキストリン（ＣＤ）を迅速に加
水分解すること、デンプンからＣＤを作らないので、Ｃ
ＧＴａｓｅとは異なること、ならびにアミノ酸配列の一
次構造において、ＮＰＬと類似することが、記載されて
いる。公知のＣＤａｓｅの例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ由来のＣＤａｓｅ（Ａｐｐｌ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：１９
７−２０３（１９９３）：以下、ＢＳＣＤａｓｅと称す
る）およびＡｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃＢａｃｉｌｌｕ
ｓｓｐ．Ａ２−５ａ株由来のＣＤａｓｅ（寄託番号Ｆ
ＥＲＭ−Ｐ−１３８６４、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．，５８（３），５１７−５２０（１９９４）：以
下、Ａ２−５ａＣＤａｓｅと称する）が含まれる。

【００３５】ＭＡは、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７
（３１）２２１０８−２２１１４、１９９２において、
α−１，４−グルコシド結合を切断する（但し、α−
１，６−グルコシド結合の次のα−１，４−グルコシド
結合は切断できない）こと、および転移活性を有するこ
と、およびシクロデキストリンを分解すること、ならび
にアミノ酸配列の一次構造において、ＮＰＬと類似する
ことが記載されている。公知のＭＡの例には、Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のＭＡ（Ｂ
ＬＭＡと称される）が含まれる。

【００３６】ＴＶＡＩＩは、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５７（３）、３９５−４０
１、１９９３において、ＴＶＡＩよりもＮＰＬに構造的
かつ性質的に似ていること、プルランを加水分解し、ト
リオース（パノースまたはイソパノース）を生成するこ
と、イソパノースを分解し、グルコースまたはマルトー
スを生成する（パノースは分解しない）こと、デンプン
を加水分解し、主にマルトースを生成することが記載さ
れている。

【００３７】これらの酵素のいずれもが、α−アミラー
ゼファミリー酵素に含まれる。このα−アミラーゼファ
ミリーは、含まれる酵素の構造の類似性および触媒機構
の類似性によって定義されると考えられる。すなわち、
このα−アミラーゼファミリーは以下の特性を有すると
して定義される：１．α−グルコシド結合に作用する；２．α−グルコシド結合を加水分解し、α−アノマーの
グルコースまたはマルトオリゴ糖を生成する、あるいは
糖転移反応により新たなα−グルコシド反応を形成す
る；３．一次構造上に、それぞれの酵素に共通の４つの保存
領域が存在する。そしてこの保存領域内に触媒部位のす
べてと基質結合部位の多くが存在する；４．触媒部位としてタカアミラーゼＡのＡｓｐ２０６、
Ｇｌｕ２３０、およびＡｓｐ２９７に対応するＡｓｐ、
Ｇｌｕ、Ａｓｐ残基を有する。

【００３８】上記のように、α−アミラーゼファミリー
に含まれる酵素は、アミノ酸配列の一次構造の比較か
ら、４つの相同性の高い領域、すなわち保存領域を有す
ることが知られている。ここでいうα−アミラーゼファ
ミリー酵素における高度保存領域とは、Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｅｎｇ
ｉｎｉｅｅｒｉｎｇ第８７巻、５５７−５６５頁（１
９９９年）の図１に示すＲｅｇｉｏｎ１、２，３およ
び４を指す。保存領域１〜４は、β−ストランドとα−
ヘリックスとの８つの反復を有する構造（（β／α）₈
−バレル構造と称される）を有するＡドメイン中に存在
する。α−アミラーゼファミリーにおいて、いくつかの
酵素においては、領域１がＮ末端側から約１２０番目の
アミノ酸位置から開始する場所に存在する（例えば、α
−アミラーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ
起源））のに対し、領域１がＮ末端側から約２４０番目
のアミノ酸位置（好ましくは、２３９〜２４２アミノ酸
の位置）から開始する場所に存在する酵素もまた存在す
る。上記酵素のアミノ酸の番号付けは、その成熟形態の
Ｎ末端から開始する。本アミロース特異的酵素は、後者
のアミノ酸配列特徴を有し得る。このような酵素は、Ａ
ドメインの前に、さらに１００以上のアミノ酸で構成さ
れる別のドメイン（Ｎドメイン）もまた有し得る。

【００３９】本アミロース特異的酵素は、Ｎ末端側から
順にαアミラーゼファミリー酵素における高度保存領域
１、２、３および４を含むアミノ酸配列で構成され、該
αアミラーゼファミリー酵素における領域１がＮ末端か
ら２３９〜２４２番目のアミノ酸位置またはこの位置と
実質的に同等な位置で開始する場所に存在し得る。「実
質的に同等な位置」とは、Ｎ末端側またはＣ末端側に、
表記の位置（すなわち、２３９〜２４２番目）から、１
〜１０アミノ酸、好ましくは、１〜５アミノ酸、より好
ましくは１〜３アミノ酸、さらに好ましくは、１〜２ア
ミノ酸、よりさらに好ましくは、１アミノ酸移動した位
置であり得る。最も好ましくは、本アミロース特異的酵
素は、Ｎ末端から２３９〜２４２番目の位置から領域１
を開始する。

【００４０】例えば、本アミロース特異的酵素である、
Ａ２−５ａＣＤａｓｅ、ＮＰＬ、ＢＳＣＤａｓｅ、お
よびＢＬＭＡの配列のアラインメントを図１５Ａおよび
図１５Ｂに示す。図中、囲まれた領域は、αアミラーゼ
ファミリー酵素において高度に保存された領域を示す。
これらの領域は、アミノ酸配列のＮ末端側から順に、領
域１、２、３および４を表す。いずれの酵素において
も、領域１は、Ｎ末端から約２４０番目のアミノ酸の位
置から開始する場所に存在する（Ａ２−５ａＣＤａｓ
ｅおよびＮＰＬは、Ｎ末端から２４２番目の位置、ＢＳ
ＣＤａｓｅは、Ｎ末端から２４０番目の位置、そしてＢ
ＬＭＡは、Ｎ末端から２３９番目の位置から開始す
る）。また、Ａ２−５ａＣＤａｓｅは、酵素の全配列
において、ＮＰＬと５８．７％の相同性を有し、そして
ＢＳＣＤａｓｅとは４８．０％の相同性を有する。

【００４１】ＮＰＬおよび他のアミロース特異的酵素
は、公知の配列情報に基づいて、組換えにより産生され
得る。例えば、ＮＰＬについては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＮＰＬの
塩基配列（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第
１３５巻、１５２１頁（１９８９年））およびアミノ酸
配列（特開平７−１７７８９１号公報；組換えの手順に
ついても記載する）が利用され得る。あるいは、公知の
配列に基づいて設計されたプライマーを用いて植物また
は微生物などのＤＮＡライブラリーを検索することによ
り、新たなＮＰＬまたは他のアミロース特異的酵素を取
得し得る。このような新たな酵素の利用もまた、本発明
の範囲に含まれる。

【００４２】上述のような酵素のポリペプチドに１〜約
１０アミノ酸残基付加された、上述のような酵素のポリ
ペプチドから１〜約１０アミノ酸残基欠失された、また
は上述のような酵素のポリペプチドにおいて１〜約１０
アミノ酸残基変更されたポリペプチドもまた、アミロー
ス特異性のような望ましい生物学的活性を示し得る。上
記付加、欠失、または変更されるアミノ酸残基は、１０
個程度から数個から１個であり得る。好ましくは、上記
アミノ酸残基数は、１０個、８個、５個、３個、２個ま
たは１個であり得る。このような酵素を自然界からのス
クリーニングによって得ることもまた当業者によって容
易である。さらに、このようなポリペプチドは、当業者
に公知の遺伝子操作技術によって作製され得る。

【００４３】本発明の方法において、酵素の添加量およ
びその他の反応条件は、用いられる酵素に依存し得る。
例えば、ＮＰＬの場合、デンプン処理における添加量
は、デンプン１０ｍｇあたり０．１〜５０Ｕ、好ましく
は１〜５Ｕ（１Ｕとは１分間にマルトトリオースから１
μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量）である。酵素
反応は、緩衝液または水中で、酵素が至適に作用する温
度で、例えば、４０〜９０℃、好ましくは５０〜８０℃
で、５〜１２０分、好ましくは、２０〜６０分間行い得
る。反応条件の最適化は当業者には容易である。

【００４４】酵素のアミロースおよびアミロペクチンへ
の反応性を示す指標として、デンプン中のアミロース含
量、ならびにアミロースおよびアミロペクチンの分解性
が挙げられる。これらの測定は、以下の通りである。

【００４５】酵素処理によるデンプン中のアミロース含
量の変化は、当業者に周知の方法で確認され得る。デン
プン中のアミロースおよびアミロペクチンの２成分を純
粋な形で単離する努力が、従来から多くの研究者によっ
てなされてきたが、両成分とも決して均一で一様なもの
ではなく、今日でも実験的に不充分な点があり、明確な
意見の一致があるわけではない。しかし、一般的にはＳ
ｃｈｏｃｈのｎ−ブタノール沈澱法で得られる画分、ま
たは、ヨウ素親和力が１９〜２０％の主に直鎖状の画分
をアミロースとし、一方、ｎ−ブタノールと複合体を形
成せず、または、ヨウ素親和力をほとんど示さず高分子
で高度に分枝した画分をアミロペクチンと定義している
（生物化学実験法１９「澱粉・関連糖質実験法」中村道
徳・貝沼圭二編学会出版センター、８３頁、１９８６
年）。後述の実施例１５に示すように、ｎ−ブタノール
でのアミロースおよびアミロペクチンの分画方法を用い
て、ＮＰＬのアミロースに特異的な作用を証明している
が、同時に示したヨード呈色を用いたアミロースおよび
アミロペクチンの簡便な定量法においても、ｎ−ブタノ
ールを用いた方法と同様に、ＮＰＬの特異的な作用の証
明が十分に可能であった。さらに、低分子化したアミロ
ースは、ｎ−ブタノールでも沈澱しなくなると同様に、
ヨード呈色法でも定量できなくなった。ヨード呈色法
は、ＫＩ−Ｉ₂溶液中に基質−酵素反応溶液を添加して
ヨウ素−デンプン反応を生じさせる。得られた溶液の吸
光度を測定することにより、アミロースおよびアミロペ
クチンの含量をそれぞれ決定し得る（例えば、山下ら、
日本食品工業会誌４０巻（５）、３６５頁１９９３
年に示される方法を参照のこと）。

【００４６】酵素処理によるアミロースおよびアミロペ
クチンの分解率を測定するために、ソモギ・ネルソン法
が用いられ得る。本方法は、檜作ら、Ｓｔａｒｃｈ、２
２巻３３８頁（１９７０年）に示された条件にて行い、
生じた還元糖をグルコース量に換算することにより、基
質の分解率を測定するものである。

【００４７】本発明の方法において基質として用いられ
るデンプンは、任意の起源に由来し得る。通常、デンプ
ンは、α−１，４結合でグルコースが結合された直鎖の
アミロース０〜３０％、およびα−１，６結合を介した
分枝成分を有するアミロペクチン７０〜１００％から構
成される。アミロースとアミロペクチンとの混合物であ
るデンプンとしては、例えば、ジャガイモ、サツマイ
モ、キャッサバ、トウモロコシ、コムギ、ウルチゴメな
どが挙げられる。モチゴメ、モチトウモロコシ、モチコ
ムギおよびモチポテトは、ほとんどアミロペクチンから
なる。

【００４８】本発明の上記方法により、新規な特性を有
する改変デンプンが提供され得る。本明細書中で用いら
れる用語「改変デンプン」は、天然のデンプンとは異な
る構造を有し、アミラーゼ特異的酵素で処理される前の
デンプン（もとのデンプン）に比較して、少なくとも次
の条件の一方を満たす：（ｉ）デンプン中のアミロース
の構造が変化している；および（ｉｉ）デンプン中のア
ミロペクチンの構造が変化している。上記条件の（ｉ）
においては、作用させるアミラーゼ特異的酵素の量に依
存して、アミロースの分解度が異なる。アミロース特異
的酵素が、より多い量でデンプンに処理された場合、ア
ミロースの構造において、改変デンプンは、（ａ）アミ
ロースがｎ−ブタノールによって沈澱を生じないほどに
分解されたアミロースで、分子量はおおよそ５００００
以下の生成物（特にマルトペンタオースおよびより低分
子量のオリゴ糖）に分解されるために、アミロース含量
が低い。この場合、例えば、１％の糊化デンプン溶液１
０ｍｌに対し、ＮＰＬの精製酵素として約２μｇ以上で
あり、好ましくは約８μｇ以上の添加が好ましい。しか
し、この条件は、基質濃度、反応温度等の条件で容易に
変動し得ることが当業者に容易に理解される。他方、ア
ミロース特異的酵素が、より少ない量でデンプンに処理
された場合、改変デンプンは、（ｂ）アミロースが分解
されて、その分子量を特定の分子量（老化しやすい分子
量）に低下させる。この場合、例えば、１％の糊化デン
プン溶液１０ｍｌに対し、ＮＰＬの精製酵素として約８
μｇ以下であり、好ましくは約２μｇ以下の添加が好ま
しい。この条件は、基質濃度、反応温度などの条件で容
易に変動し得ることが、当業者に容易に理解される。酵
素処理後のアミロースは、実施例に記載のｎ−ブタノー
ルによる沈澱化方法によって全く回収できないレベルに
まで低分子化すれば（ａ）のアミロースに変化してお
り、回収できる場合は（ｂ）のアミロースが混入してい
ることになる。分子量はおおよそ５００００以下で、な
かでも全糖量／還元糖量で算出される平均重合度（ｄ
ｐ）で記述するならば、約６００から１４００程度（分
子量約９００００から２５００００）のアミロースが
（ｂ）に相当する。改変デンプンは、このような構造の
変化に起因して、変化した性質を示し得る。特に、改変
デンプンは、（ａ）の場合、もとのデンプンに比べて低
粘性かつ難老化性であり得る。改変デンプンは、（ｂ）
の場合、もとのデンプンに比べて易老化性であり得る。

【００４９】本発明の方法により得られる改変デンプン
は、以下の特性を有し得る：ａ）粘度が低い（例えば、
実施例５に記載の条件と実質的に同一の条件で測定した
場合、２０ｍＰａ・ｓ以下、好ましくは、１０ｍＰａ・
ｓ以下の粘度を有する）；ｂ）高濃度でも溶解性が高
く、その溶液の透明度も高く、冷蔵しても老化しにくい
（例えば、実施例１１に記載の条件と実質的に同一の条
件で測定した場合、５℃冷蔵保存溶液の濁度（７２０ｎ
ｍでの吸光度）は０．５未満、好ましくは、０．１未
満、より好ましくは０．０５未満であり、凍結乾燥後調
製した５℃冷蔵保存溶液の濁度は１．０未満、好ましく
は０．５未満である）；ｃ）改変デンプンがもとのデン
プンに添加された場合、そのデンプンの粘度も低下させ
得る（例えば、実施例１３に記載の条件と実質的に同一
の条件で測定した場合、１．０Ｐａ・ｓ以下、好ましく
は、０．３Ｐａ・ｓ以下の粘度に低下させる）；および
ｄ）冷凍および解凍に対して高い耐性を有する（例え
ば、実施例１２に記載の条件と実質的に同一の条件で測
定した場合、冷凍および解凍を繰り返した後に得られる
溶液の濁度（７２０ｎｍでの吸光度）が０．０５未満、
好ましくは０．０３未満である）。本発明における改変
デンプンは、好ましくは、少なくともａ）およびｂ）の
特性を有し、より好ましくは、少なくともａ）、ｂ）お
よびｃ）またはａ）、ｂ）およびｄ）の特性を有し、さ
らにより好ましくは、ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の特
性を有する。

【００５０】あるいは、本発明の方法により得られる改
変デンプンは、ｄ）冷凍および解凍における老化に感受
性であり得る。本改変デンプンは、例えば、実施例２２
に記載の条件と実質的に同一の条件で測定した場合、冷
凍および解凍を繰り返した後に得られる溶液の濁度（７
２０ｎｍでの吸光度）が、０．７以上、好ましくは１．
０以上、より好ましくは、２．０以上、さらにより好ま
しくは、２．５以上である。または、本改変デンプン
は、例えば、実施例２２に記載の条件と実質的に同一の
条件で測定した場合、冷蔵保存後に得られる溶液の濁度
（７２０ｎｍでの吸光度）が、０．４以上、好ましくは
０．６以上、より好ましくは、０．７以上である。

【００５１】本発明のデンプン改変方法およびそれによ
り得られる改変デンプンは、種々の食品用途、およびそ
の他の工業的用途に有用であり得る。本発明を利用し得
る食品の例として、炊飯米、餅、高デンプン飲料、焼成
菓子、ガム・キャンデー、和菓子、および麺の他、餃子
・シュウマイの皮、たれ・ソース類、カスタードクリー
ム、油脂代替物質、粉末状基剤、粉末状添加剤、低甘味
ボディー、気泡形成剤、などが挙げられるが、これらに
限定されない。

【００５２】改変デンプンを含有する食品は、デンプン
を含有する食品原料（例えば、コメ）を本発明の方法の
基質として用いた後、さらに必要な調理加工を施すこと
により製造され得る。または、調理加工前もしくはその
途中で、食品原料に、別途調製された改変デンプンを粉
末または水溶液などの状態で添加することにより、製造
され得る。

【００５３】炊飯米に本発明の改変デンプン製造方法を
適用することにより、照りのある、消化性の高い、日持
ちのする、チルド耐性のある、老化しにくい、かつ餅的
な食感に近い炊飯米が得られ得る。改変デンプン製造方
法を用いることにより、炊飯米、すし米が、固まること
なく、解れが良くなる。米飯の改質効果をより高めるた
めに、本発明の改変デンプン製造方法はまた、公知の米
飯の改質技術と併用して実施され得る。公知の技術の例
として、玄米にセルラーゼ酵素単独またはセルラーゼ酵
素、アミラーゼ酵素、およびプロテアーゼ酵素を配合し
た水溶液中に浸漬した後炊飯する、あるいはさらに糖
類、糖アルコール、デキストリン、デンプン、加工デン
プンを添加して粘りを出し、炊飯後数時間を経ても食感
の低下を少なくし得る技術（特開平１０−０９４３６８
号公報）、ならびに、多糖類であるペクチンを添加して
ふっくらとしてつやのある炊飯を作る技術（特開平１０
−２９５２５３号公報）が挙げられる。

【００５４】餅に本発明の改変デンプンを含有させるこ
とにより、歯切れが良く、硬くなりにくい（老化しにく
い）低粘度の餅が得られ得る。この餅は、例えば、以下
のような利点を有し得る：老人や子供が喉につめにく
い；湯戻りがはやく、加熱調理がすばやくできる；もち
しゃぶができる；および、入れ歯の人が安心して食する
ことができる。

【００５５】高デンプン飲料に本発明の改変デンプンを
含有させることにより、低粘度の高デンプン飲料が得ら
れ得る。この飲料は、例えば、以下のような利点を有す
る：持久力の持続性がよい；運動後の筋肉グリコーゲン
の回復が早い；および浸透圧が高くならないため、胃に
もたれず、病離食および離乳食に適している。

【００５６】焼成菓子類に本発明の改変デンプンを含有
させることにより、加工特性の改善された焼成菓子類が
得られ得る。焼成菓子類としては、スナック菓子、おか
き・せんべい、ビスケットなどが挙げられる。例えば、
本発明のデンプンを含有するスナック菓子は、エクスト
ルーダーでの加工が容易となり得る。本発明のデンプン
を含有するおかき・せんべいは、火通りが早いため、生
産コストが削減され得る。おかき・せんべいおよびビス
ケットは、軽い食感で、歯につきにくく、入れ歯の人が
安心して食することができる。

【００５７】ガム・キャンデーに本発明の改変デンプン
を含有させることにより、透明度および食感を低下させ
ることなく、口どけの良い好適なガム・キャンデーが得
られ得る。

【００５８】和菓子（例えば、わらび餅）に本発明の改
変デンプンを含有させることにより、老化しにくく、特
有の食感を有する和菓子が得られ得る。

【００５９】麺（スパゲティー、うどん、ラーメン、そ
ば、そーめんなど）に本発明の改変デンプンを含有させ
ることにより、湯戻りが良く、解れがよい麺が得られ得
る。

【００６０】鮫子・シュウマイの皮に本発明の改変デン
プンを添加することにより、透明度の高い皮を製造し得
る。

【００６１】たれ・ソース類に本発明の改変デンプンを
含有させることにより、適度な粘度のたれ・ソース類が
得られ得る。

【００６２】カスタードクリームに本発明の改変デンプ
ンを含有させることにより、柔らかいよりソフトなクリ
ームが得られ得る。

【００６３】バター、マヨネーズ、ドレッシングに本発
明の改変デンプンを油脂代替物質として含有させること
により、低カロリーのバター、マヨネーズ、ドレッシン
グがが得られ得る。

【００６４】以上の他、粉末状基剤として本発明の改変
デンプンを使用することにより、低粘度の粉末香料、粉
末果汁、粉末コーヒー、紅茶、粉末スープなどが得られ
得る。

【００６５】本発明の改変デンプンはまた、コーヒー飲
料およびスープ飲料などのコク味つけのための粉末状添
加剤として、クリームの低甘味ボディーとして、および
ホイップクリームなどにおいて含有される気泡形成剤と
して有用であり得る。

【００６６】食品以外の用途として、本発明の改変デン
プンは、フィルム性があり、例えば、オブラートなどの
ような、医薬品の抱剤などに利用できる。さらに、本発
明の改変デンプンは、易分解性プラスチックなどの原料
として、デンプン糊を低粘度化させ塗りやすくするため
の成分として、およびつやだし剤として、有用であり得
る。

【００６７】本発明の改変デンプンはまた、日本画の修
理・修復に使用するための糊としても使用され得る。古
来より、日本画を修理・修復する際に、表具師は、古糊
という特別に調製した糊を使用してきた。この糊は粘性
が低く、紙のしわになりにくく、昆虫や糸状菌の被害を
受け難いという特徴を有している。この糊を分析したと
ころ（山田ら、応用糖質科学、第４３巻、Ｐ１３７−１
４２、１９９６年）、アミロペクチンの主な構造が残っ
ており、アミロースが減少しているらしい。これより、
本特徴を有する酵素で処理したデンプンは、古来より使
用され、厳密にはその組成や構造が解明されていないデ
ンプン組成物を簡単に作り出せる可能性がある。

【００６８】本発明の改変デンプンはまた、焼成菓子類
の製造において好都合に使用され得る。このような焼成
菓子類としては、せんべい、おかきなどが挙げられる。
この焼成菓子の製造において、好ましくは、材料である
デンプンは、部分的に老化され得る。従来の焼成菓子の
製造では、デンプンを部分的に老化させるために、長時
間の工程を要していた。また、アミラーゼを使用してデ
ンプンが分解される場合、デンプンは、たとえ添加され
るアミラーゼの量が微量であったとしても、低分子のマ
ルトースを生成するまで分解される。従って、従来のア
ミラーゼを使用するデンプン分解方法では、易老化性分
子量を有するアミロースで反応を停止させるためには、
例えば、加熱することにより、酵素を失活させる必要が
あった。本発明の改変デンプンの製造方法を使用する
と、添加された酵素量が少ない場合、熱による失活を行
うことなく易老化性分子量を有するアミロース分子が得
られる。よって、本発明の改変デンプンを用いることに
より、焼成菓子の工業規模での製造は、反応制御を行う
必要なく、極めて簡略化され得る。

【００６９】以下、本発明を実施例により説明するが、
本発明はこれに限定されない。

【００７０】

【実施例】以下の実施例においては、ＮＰＬ（Ｂ．ｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＴＲＳ４０株由
来、微工研寄託第９６０９号の菌より調製、特に断りの
ない限り精製酵素、７．４Ｕ／ｍｇを使用、１Ｕは、１
分間にマルトトリオースから１μｍｏｌのグルコースを
生成する酵素量）、ＮＯＶＡＭＹＬ１００００ＢＧ
（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ由来、ＮＯＶＯＮｏｒｄｉｓｋ製）、β−アミラ
ーゼ（ダイズ由来、ナガゼ生化学製）、細菌由来デンプ
ン糖化型α−アミラーゼ（ＢＳＡ）（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓＸ−２３由来、生工研寄託第Ｐ−１３５６０号の
菌より、特許第２６６２６６７号公報の記載に従って調
製、特に断りのない限り精製酵素、３０００Ｕ／ｍｇを
使用、１Ｕは１分間に可溶性デンプン（和光純薬製）か
ら１μｍｏｌのグルコース量に相当する還元力を生成す
る酵素量）、および細菌由来デンプン液化型α−アミラ
ーゼ（ＢＬＡ）（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ由来、
ＳｉｇｍａＡ−４５５１）をそれぞれ用いた。酢酸−
酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）緩衝液は、他に指示のな
い限り、０．２Ｍ、ｐＨ５．５で使用した。

【００７１】（実施例１：人工デンプン反応物のゲル濾
過分析）本実施例は、市販のアミロースおよびアミロペ
クチンを用いて作製した人工デンプンにおけるＮＰＬお
よび種々のアミラーゼの作用を試験した。

【００７２】１％アミロースＡＳ−７０（フナコシ製）
および１％アミロペクチン（ジャガイモ由来、Ｓｉｇｍ
ａ製、Ａ−８５１５）を用いて人工的なデンプン溶液を
作製した。アミロース溶液は、９０％ジメチルスルホキ
シド（ＤＭＳＯ）溶液に２０％となるように、アミロー
スを溶かし糊化した後蒸留水で希釈することにより調製
した。アミロペクチン溶液は、９０％ＤＭＳＯ溶液に１
０％となるように、アミロペクチンを溶かし糊化した後
蒸留水で希釈することにより調製した。以下、特に示さ
ない限り、アミロース溶液およびアミロペクチン溶液
は、これらの方法で調製した。上記１％アミロースおよ
び１％アミロペクチンを混合し、１：１混合溶液とした
（最終濃度０．５％、７５０μｌ）。この溶液を、０．
２Ｍ２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）−Ｎ
ａ緩衝液（ｐＨ６．０）中０．０７ｍｇ／ｍｌ濃度に調
製したＮＰＬ溶液７５０μｌに添加し、総容積１５００
μｌの溶液とした。得られた溶液に、５０℃で０分、１
０分、３０分、６０分、および１２０分、ＮＰＬを作用
させた。次いで、これらの溶液をゲル濾過分析に供し
た。ゲル濾過分析のカラムとして、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ
６ｐｇ（φ１０×３００ｍｍ；ＰｈａｒｍａｃｉａＢ
ｉｏｔｅｃｈ社製）およびＳｕｐｅｒｄｅｘ３０ｐｇ
（φ１０×３００ｍｍ；ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔ
ｅｃｈ社製）を連結したものを使用した。溶媒として
０．１ＭＮａＣｌ溶液を使用し、室温で流速１．０ｍ
ｌ／分で実施し、ＲＩにより検出した。結果を図１Ａに
示す。図１Ａ中の左側のピーク（溶出時間１７分）はア
ミロペクチンを、そして右側のピーク（溶出時間２４
分）はアミロースを示す。ＮＰＬ処理の結果、アミロー
スのピークが消失した。このことは、ＮＰＬがデンプン
中のアミロースのみを特異的に加水分解し、これにより
デンプンを低分子化させたことを示す。

【００７３】糖化型α−アミラーゼであるＢＳＡおよび
液化型α−アミラーゼであるＢＬＡそれぞれ０．１ｍｇ
／ｍｌを、上記と同様に人工デンプン溶液に反応させ、
そしてゲル濾過分析に供した。結果を図１Ｂ（ＢＳＡ）
および図１Ｃ（ＢＬＡ）に示す。図１ＢおよびＣ中の左
側のピーク（溶出時間１７分）はアミロペクチンを、そ
して右側のピーク（溶出時間２４分）はアミロースを示
す。ＢＳＡでは、経時的に両ピークとも低くなり、アミ
ロースおよびアミロペクチンの両方が加水分解されるこ
とを示す。ＢＬＡでは、経時的に左側のピークの右側の
ピークへの吸収が観察され、アミロペクチンが加水分解
されることを示す。

【００７４】（実施例２：アミロースおよびアミロペク
チンについての分解率および青価）本実施例では、アミ
ロースおよびアミロペクチンのそれぞれに対する、ＮＰ
Ｌおよび種々のアミラーゼの作用を、分解率および青価
を指標として試験した。

【００７５】基質溶液として、３００μｌの１％アミロ
ース（ジャガイモ由来、Ｓｉｇｍａ製、Ａ−０５１２）
溶液または１％アミロペクチン（Ａ−８５１５）溶液を
調製した。各酵素溶液は以下のように作製した：ＮＰＬ
を０．２ＭＭＥＳ−Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．０）中に
０．０７ｍｇ／ｍｌで溶解した。ＮＯＶＡＭＹＬ１０
０００ＢＧを０．００５ｍｇ／ｍｌでＮａＯＡｃ緩衝液
中に溶解した。β−アミラーゼを、０．００５ｍｇ／ｍ
ｌ（７，５００ＡＵＮ／ｇ）でＮａＯＡｃ中に溶解し
た。ＢＳＡを０．００３５ｍｇ／ｍｌでＮａＯＡｃ緩衝
液中に溶解した。ＢＬＡを０．００２９ｍｇ／ｍｌでＮ
ａＯＡｃ中に溶解した。

【００７６】上記各酵素溶液３００μｌを上記１％アミ
ロース溶液３００μｌに５０℃で５分、１０分、２０
分、３０分、１時間、および２時間反応させた。これら
の反応液の２０μｌをソモギ・ネルソン法に供した。ソ
モギ・ネルソン法は、檜作らの文献（前出）に従い、和
光純薬工業製のソモギ溶液およびネルソン溶液を用いて
行い、生じた還元糖をマルトース量として換算すること
により、基質の分解率を測定するものである。

【００７７】別の２０μｌをヨード呈色測定に供した。
この方法では、反応溶液の２０μｌに２ｍｌＫＩ−Ｉ₂
溶液（０．５ｇＩ₂および５ｇＫＩを１００ｍｌ蒸
留水に溶解した原液を１００倍希釈して得た）を添加し
て、得られた溶液の吸光度を６６０ｎｍで測定した。

【００７８】上記酵素反応後の別の３μｌを薄層クロマ
トグラフィー（ＭＥＲＣＫ社製ＳｉｌｉｃａＧｅｌ
６０、１０×２０ｃｍ）分析に供した。溶媒としてア
セトニトリル／水＝８０／２０を用い、３回展開した。
展開終了後、乾燥し、メタノールと硫酸を等量混合した
溶液をスプレーして、１３０℃で５分間焼成しスポット
を発色させた。

【００７９】薄層クロマトグラフィーの結果を図２Ａ
（アミロース）および図２Ｂ（アミロペクチン）に示
す。Ｍは、２μｌの２．５％マルトオリゴ糖である。こ
れを除いて左から順に、ＮＰＬ、ＮＯＶＡＭＹＬ、β−
アミラーゼ、ＢＳＡ、ＢＬＡの結果を示す。なお、左側
のＧ１、Ｇ２・・・Ｇ６は、それぞれ、グルコース、マ
ルトース、・・・マルトヘキサオースを表す。ヨード呈
色測定およびソモギ・ネルソン法の結果を図３に示す
（黒四角、ＮＰＬ；縞四角、β−アミラーゼ；白菱形、
ＢＳＡ；黒丸、ＢＬＡ；白三角、ＮＯＶＡＭＹＬ）。縦
軸にヨード呈色（％）を示し、横軸に基質の分解率をＧ
２（マルトース）換算％で示す。

【００８０】図２ＡおよびＢに示されるように、ＮＯＶ
ＡＭＹＬおよびβアミラーゼが、アミロースとアミロペ
クチンの両方からマルトースを生成し、そしてＢＳＡお
よびＢＬＡは、アミロースおよびアミロペクチンの両方
から種々のオリゴ糖を生成した。これに対して、ＮＰＬ
は、アミロースとのみ顕著に反応し、主としてマルトー
スを生成した。次にアミロースへの作用を詳しく調べた
のが図３である。

【００８１】図３から、ＮＯＶＡＭＹＬおよびβアミラ
ーゼは、デンプンの非還元末端から分解するエキソ型酵
素の特徴を示し、ＢＳＡおよびＢＬＡは、デンプンの内
部鎖から分解するエンド型酵素の特徴を示すことが分か
る。ＮＰＬは、その両者の中間的な性質を有していた。

【００８２】実施例１および２の結果は、ＮＰＬがアミ
ロースを選択的に分解することを示す。

【００８３】（実施例３：アミロースおよびアミロペク
チンへの作用の比較）本実施例では、アミロースおよび
アミロペクチンのそれぞれに対する、ＮＰＬおよび種々
のアミラーゼの作用を、比色定量に基づいて調べた。

【００８４】基質溶液として、０．２５％アミロース
（Ｓｉｇｍａ社製Ａ−０５１２）および０．２５％アミ
ロペクチン（Ｓｉｇｍａ社製Ａ−８５１５）溶液のそれ
ぞれ３００μｌを作製した。各酵素溶液は以下のように
作製した：ＮＰＬを０．２ＭＭＥＳ−Ｎａ緩衝液（ｐＨ
６．０）中に０．０７、０．１４、０．３５、または
０．７ｍｇ／ｍｌで溶解した。ＮＰＬは、約６Ｕ／ｍｇ
の活性を有した（１Ｕは、１分間に、Ｇ３（マルトトリ
オース）から１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素
量）。ＢＳＡを１．７５、３．５、１０．０、または２
０．０μｇ／ｍｌでＮａＯＡｃ緩衝液中に溶解した。Ｂ
ＳＡは、約１３Ｕ／ｍｇの活性を有した（１分間に、Ｇ
３（マルトトリオース）から１μｍｏｌのグルコースを
生成する酵素量）。

【００８５】上記各酵素溶液３００μｌを上記基質溶液
３００μｌに５０℃で０分、１０分、２０分、３０分、
１時間、および２時間反応させた。これら反応溶液の２
０μｌに２ｍｌＫＩ−Ｉ₂溶液（０．５ｇＩ₂および５
ｇＫＩを１００ｍｌ蒸留水に溶解した原液を２５倍に
希釈して得た）を添加して、ヨード呈色反応によりアミ
ロースおよびアミロペクチンの分解を観察した。アミロ
ース、アミロペクチンの分別定量は、山下らの方法（日
本食品工業学会誌４０巻（５）３６５頁（１９９３
年）で行った。一方、これらの反応溶液の２０μｌに１
９００μｌソモギ溶液を添加し、アミロースおよびアミ
ロペクチンの加水分解率を調べた。これらの結果を図４
Ａ〜図４Ｈに示す（図４Ａ：ＮＰＬ０．０７ｍｇ／ｍ
ｌ；図４Ｂ：ＮＰＬ０．１４ｍｇ／ｍｌ；図４Ｃ：ＮＰ
Ｌ０．３５ｍｇ／ｍｌ；図４Ｄ：ＮＰＬ０．７ｍｇ／ｍ
ｌ；図４Ｅ：ＢＳＡ１．７５μｇ／ｍｌ；図４Ｆ：ＢＳ
Ａ３．５μｇ／ｍｌ；図４Ｇ：ＢＳＡ１０．０μｇ／ｍ
ｌ；または図４Ｈ：ＢＳＡ２０．０μｇ／ｍｌ）。各図
において、横軸は反応時間（分）を示し、左の縦軸はア
ミロースおよびアミロペクチン含量（ｍｇ／ｍｌ）（棒
グラフの上の濃い方がアミロースであり、下の薄い方が
アミロペクチンである）、そして右の縦軸は分解率
（％）（グラフでは黒丸）を示す。

【００８６】ＮＰＬがアミロースのみを加水分解した
（図４Ａ〜図４Ｄ）のに対し、ＢＳＡは、アミロースお
よびアミロペクチンの両方を加水分解した（図４Ｅ〜図
４Ｈ）。

【００８７】（実施例４：天然デンプンへの作用）本実
施例では、天然デンプンに対する、ＮＰＬおよび種々の
アミラーゼの作用を調べた。

【００８８】基質溶液として、２００μｌの１％ジャガ
イモデンプン（松谷化学製）溶液を作製した。各酵素溶
液は以下のように作製した：ＮＰＬを０．２ＭＭＥＳ
−Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．０）中に０．１７５ｍｇ／ｍｌ
で溶解した。ＮＯＶＡＭＹＬ１００００ＢＧを０．０１
ｍｇ／ｍｌでＮａＯＡｃ中に溶解した。ＢＳＡを０．０
０３５ｍｇ／ｍｌでＮａＯＡｃ中に溶解した。ＢＬＡを
０．００２９ｍｇ／ｍｌでＮａＯＡｃ緩衝液中に溶解し
た。

【００８９】上記各酵素溶液２００μｌを上記１％基質
溶液２００μｌに５０℃で５分、１０分、２０分、３０
分、または１時間反応させた。これらの反応液に、さら
にプルラナーゼ溶液１０μｌを添加した。Ｋｌｅｂｓｉ
ｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＡＴＣＣ９６２１
株由来プルラナーゼ溶液（林原製）を４０Ｕ／ｍｌでＮ
ａＯＡｃ緩衝液中に溶解することによって得た。これを
さらに、５０℃で５分、１０分、２０分、および３０分
間反応させた。実施例２と同様にソモギ・ネルソン法に
よりデンプンの分解率を測定し、そしてヨード呈色反応
によりデンプン中のアミロースの減少を調べた。

【００９０】これらの結果を図５に示す。図５Ａは、ソ
モギ・ネルソン法によるデンプンの分解率の結果を示
し、そして図５Ｂは、ヨード呈色反応によるデンプン中
のアミロースの減少を示す。図中の記号は以下を示す：
黒四角、ＮＰＬ；白菱形、ＮＯＶＡＭＹＬ；白丸、ＢＳ
Ａ；および白三角、ＢＬＡ。図５Ａに示されるように、
ＮＰＬは、他の酵素と異なり、アミロースのデンプン中
の一般的な含量である２０％程度の分解率で平衡化し
た。図５Ａおよび図５Ｂの両方に示されるように、枝切
り酵素であるプルラナーゼを添加した後、ＮＰＬの場合
のデンプンの分解率およびヨード呈色減少度は一旦上昇
した。これらの結果は、ＮＰＬが、直鎖アミロースを好
んで加水分解したことを示す。

【００９１】さらに、ＮＰＬとＮＯＶＡＭＹＬとをその
含量を変化させて、これらの酵素のデンプンに対する作
用をさらに調べた。ＮＰＬの含量は、０．０３５、０．
０７、０．１７５、０．３５、０．７ｍｇ／ｍｌであ
り、ＮＯＶＡＭＹＬの含量は、０．００５、０．０１、
０．０５、０．１ｍｇ／ｍｌである。図６Ａおよび図６
Ｄは、各酵素処理によるデンプンの分解率を示し（縦軸
は分解率（％）を示し、横軸は反応時間（分）を示
す）、図６Ｂおよび図６Ｅは、各酵素処理によるヨード
呈色減少度を示し（縦軸はヨード呈色減少度（％）を示
し、横軸は反応時間（分）を示す）、そして図６Ｃおよ
び図６Ｆは、各酵素におけるデンプン分解率とヨード呈
色減少度との相関を示す（縦軸はヨード呈色減少度
（％）を示し、横軸は分解率（％）を示す）。図６Ａ〜
Ｃにおいて、白四角、０．０３５ｍｇ／ｍｌ；黒菱形、
０．０７ｍｇ／ｍｌ；白丸、０．１７５ｍｇ／ｍｌ；黒
三角、０．３５ｍｇ／ｍｌ；縞四角、０．７ｍｇ／ｍｌ
を表す。図６Ｄ〜Ｆにおいて、白四角、０．００５ｍｇ
／ｍｌ；黒菱形、０．０１ｍｇ／ｍｌ；白丸、０．０５
ｍｇ／ｍｌ；黒三角、０．１ｍｇ／ｍｌを表す。図６Ａ
およびＤから理解されるように、ＮＯＶＡＭＹＬが７５
％まで分解するのに対して、ＮＰＬは、デンプンを２０
％程度の分解率でしか分解しない。図６Ｂ、Ｃ、および
Ｅ、Ｆから理解されるように、ＮＰＬによるヨード呈色
減少度はＮＯＶＡＭＹＬに比較して初期に減少し、その
後あまり減少しない。これらの結果もまた、ＮＰＬが直
鎖アミロースを好んで加水分解したことを示す。

【００９２】（実施例５：デンプンの粘度測定）本実施
例では、ＮＰＬのデンプンに対する作用を調べるため
に、その粘度について試験した。

【００９３】基質溶液として、３０ｍｌの１％ジャガイ
モデンプン（松谷化学製）溶液を作製した。糊化させる
ために、デンプン溶液を１２１℃で１５分処理した。各
酵素溶液は以下のように作製した：ＮＰＬを０．２Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中に０．７ｍｇ／ｍｌで溶
解した。ＢＳＡを０．００３５ｍｇ／ｍｌでＮａＯＡｃ
緩衝液中に溶解した。

【００９４】上記各酵素溶液０．４５ｍｌを上記１％基
質溶液３０ｍｌに５０℃で０分、５分、１０分、２０
分、３０分、１時間、および２時間反応させた。粘度の
測定には、ＴＯＫＹＯＫＥＩＫＩＤＩＧＩＴＡＬＶ
ＩＳＣＯＭＥＴＥＲＤＶＬ−Ｂを用いた。条件は回転
軸にＮｏ．３を用い、３０ｒｐｍの回転で３０秒後の粘
度を測定した。この結果を図７Ａに示す（縦軸は、粘度
（ｍＰａ・ｓ）を示し、横軸は、反応時間（分）を示
す）。その後１００℃で５分間放置した後、冷蔵保存し
た。冷蔵保存溶液の濁度を７２０ｎｍの吸光度を測定す
ることにより調べた。この結果を図７Ｂに示す（縦軸
は、７２０ｎｍでの濁度を示し、横軸は、冷蔵保存日数
を示す）。図７ＡおよびＢの両方において、黒丸は、コ
ントロール、白四角は、ＮＰＬ、そして黒菱形は、ＢＳ
Ａを表す。

【００９５】図７Ａでは、ＮＰＬは、ＢＳＡと同様に粘
度を低下させることが示されている。図７Ｂでは、ＮＰ
Ｌは、ＢＳＡと同様に濁度を増加させていないことが示
されている。これらにより、ＮＰＬは、デンプンの粘度
を低下させ、冷蔵保存における老化を防ぐ役割を有し得
ることが示される。

【００９６】（実施例６：アミロース／アミロペクチン
への反応性比較）本実施例では、ＮＰＬおよび種々のア
ミラーゼのアミロースまたはアミロペクチンへの反応性
の比較を行った。

【００９７】基質溶液として、１００μｌの１％アミロ
ース（ジャガイモ由来、Ｓｉｇｍａ製、Ａ−０５１２）
または１％アミロペクチン（Ｓｉｇｍａ製Ａ−８５１
５）溶液を調製した。各酵素溶液は、以下のように作製
した。ＮＰＬを０．２ＭＭＥＳ−Ｎａ緩衝液（ｐＨ
６．０）中に０．１４ｍｇ／ｍｌで溶解した。ＢＳＡ
は、ＮａＯＡｃ緩衝液中に８．７５μｇ／ｍｌで溶解し
た。ＢＬＡは、ＮａＯＡｃ緩衝液中に８．７５μｇ／ｍ
ｌで溶解した。ＮＯＶＡＭＹＬは、０．２ＭＮａＯＡ
ｃ緩衝液（ｐＨ５．０）中に０．１０ｍｇ／ｍｌで溶解
した。β−アミラーゼは、ＮａＯＡｃ緩衝液中に０．１
０ｍｇ／ｍｌで溶解した。これらの各１００μｌを５０
℃で０分、１０分、２０分、３０分、および６０分反応
させた。２０μｌを１００μｌのソモギ溶液と反応さ
せ、アミロースまたはアミロペクチンの分解率を測定し
た。分解率の測定には、マルトースを用いた検量線を使
用した。酵素活性を、１Ｕが、１分間に１μｍｏｌのマ
ルトースが生成する酵素活性として決定した。結果を図
８に示す。反応時間（分）を横軸とし、酵素活性比（ア
ミロペクチンへの活性（Ｕ）／アミロースへの活性
（Ｕ）比）を縦軸とした。図中、黒四角はＮＰＬ、白三
角はＮＯＶＡＭＹＬ、縞四角はβ−アミラーゼ、白菱形
はＢＳＡ、黒丸はＢＬＡを表す。

【００９８】図８に示されるように、β−アミラーゼ、
ＢＬＡおよびＢＳＡでは、上記酵素活性比はほぼ１であ
り、これはアミロースおよびアミロペクチンに同等に作
用することを示す。ＮＯＶＡＭＹＬは、初速時の活性比
はほぼ２に近く、これはむしろアミロペクチンに対して
作用することを示す。これらの他のアミラーゼに比較し
て、ＮＰＬは、活性比が反応時間を通じて０に近く、こ
れは、ＮＰＬがアミロースに対して特異的に反応するこ
とを示す。

【００９９】（実施例７：酵素速度論的解析）本実施例
では、ＮＰＬのアミロースまたはアミロペクチンへの反
応性を調べるために、この酵素の速度論的解析を行っ
た。

【０１００】ラインウェーバー−バークプロット（１／
ｓ−１／ｖ）およびホフスティープロット（ｓ−ｓ／
ｖ）によって、ＮＰＬの速度論的解析を行った。ＮＰＬ
のアミロース、アミロペクチン、およびプルランへの反
応速度定数を算定した。アミロースは、ジャガイモ由
来、Ｓｉｇｍａ製、Ａ−０５１２であって、サンプル
はアルカリ調製法（Ｔａｋｅｄａら、Ｃａｒｂｏｈｙｄ
ｒａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈ２４０巻２５３頁（１
９９３年））から調製され、サンプルは９０％ＤＭＳ
Ｏ溶液中２０％アミロースとして調製した。アミロペク
チンは、ジャガイモ由来、Ｓｉｇｍａ製、Ａ−８５１５
であり、プルランは、林原製（分子量９０，５００）で
ある。それぞれの基質溶液は、２％を最大限度とし、
０．２％まで１０段階の濃度で作製した。ＮＰＬ酵素溶
液は、実施例２と同様に作製した。基質溶液１００μｌ
および酵素溶液１００μｌを５０℃で１０分、２０分、
３０分、および４０分反応させて反応速度を算出し、各
時間ごとにラインウェーバー−バークプロットおよびホ
フスティープロットを行い、反応初期の反応速度係数を
定法に従って求めた。結果を下表に示す。

【０１０１】

【表１】

【０１０２】ｋｃａｔ／Ｋｍ値が反応性の高さを示す。
表１から理解されるように、ＮＰＬは、アミロースに対
して顕著に高い反応性を示した。

【０１０３】（実施例８：低分子受容体によるＮＰＬの
作用の影響）酵素による現実のデンプンの分解を考慮す
ると、分解反応によりグルコースおよびマルトースのよ
うな低分子産物が生じ、これらは転移反応における受容
体として作用し得る。そこで、本実施例では、グルコー
スまたはマルトースのような低分子産物の存在下で、Ｎ
ＰＬのアミロペクチンへの作用に与える影響を調べた。

【０１０４】以下の濃度のＮＰＬ溶液１２５μｌを調製
した（０．７ｍｇ／ｍｌで０．２ＭＭＥＳ−Ｎａ緩衝液
(ｐＨ６．０）に溶解した）。各ＮＰＬ溶液に、１％
アミロペクチン（Ｓｉｇｍａ製、Ａ−８５１５）２５０
μｌおよび各受容体溶液１２５μｌを添加し、５０℃で
０分、１０分、２０分、３０分、または６０分間反応さ
せた。受容体溶液は、それぞれ１００ｍＭのグルコース
溶液、マルトース溶液、およびマルトトリオース溶液で
ある。次いで、実施例３と同様、２０μｌを２ｍｌのＫ
Ｉ−Ｉ₂溶液中に添加した。ヨード呈色反応によりアミ
ロペクチンの含有量を調べた。

【０１０５】結果を図９に示す（縦軸はアミロペクチン
の含有量（ｍｇ／ｍｌ）を示し、横軸は反応時間（分）
を示す、白丸、コントロール（無添加）；白菱形、グル
コース；白四角、マルトース；および白三角、マルトト
リオース）。図９に示されるように、マルトース以上の
重合度の糖（すなわち二糖以上）が共存した場合、ＮＰ
Ｌによるアミロペクチンの低分子化は抑制された。この
結果から、ＮＰＬをデンプンに作用させた場合、その作
用により生じたマルトースの存在により、さらにデンプ
ン中のアミロペクチンへのＮＰＬの作用が抑制されると
考えられる。

【０１０６】（実施例９：各種デンプンへのＮＰＬの作
用）本実施例では、種々のデンプンに対するＮＰＬの作
用を調べた。

【０１０７】基質溶液として、以下の植物由来のデンプ
ン溶液を調製した：ジャガイモ（松谷化学）、コムギ
（グリコ栄養食品）、ウルチゴメ（島田化学）、タピオ
カ（キャッサバ由来のデンプン；三和澱粉）、トウモロ
コシ（日本食品加工）、モチトウモロコシ（「ワキシコ
ーン」と同義；三和澱粉）。１％デンプン溶液８００μ
ｌを１００℃で糊化し、次いでオートクレーブに１２１
℃で１５分間オートクレーブすることによって十分に糊
化させ、５０℃で３０分間放置した。これに、ＮＰＬ溶
液（０．２ＭＭＥＳ−Ｎａ（ｐＨ６．０）中０．７ｍ
ｇ／ｍｌ）５０μｌおよび１ＭＭＥＳ−Ｎａ緩衝液
（ｐＨ６．０）１５０μｌを添加し、５０℃で０分、１
０分、２０分、３０分、６０分または１２０分放置し
た。デンプンに対する分解率を測定するためにソモギ・
ネルソン法を、デンプン中のアミロースおよびアミロペ
クチンの含量を決定するためにヨード呈色反応を実施例
３と同様に行った。

【０１０８】各種デンプンにおけるＮＰＬ作用の経時的
なデンプン中のアミロースおよびアミロペクチンの含
量、ならびに分解率を図１０Ａ〜図１０Ｆに示す（図１
０Ａ、ジャガイモ；図１０Ｂ、コムギ；図１０Ｃ、ウル
チゴメ；図１０Ｄ、タピオカ；図１０Ｅ、トウモロコ
シ；または図１０Ｆ、モチトウモロコシ）。各図におい
て、横軸は反応時間（分）を示し、左の縦軸はアミロー
スおよびアミロペクチン含量（ｍｇ／ｍｌ）（棒グラフ
の上の濃い方がアミロースであり、下の薄い方がアミロ
ペクチンである）、そして右の縦軸は分解率（％）（グ
ラフでは黒丸）を示す。図１０の各図に示されるよう
に、ＮＰＬは、いずれのデンプンにおいても、主にアミ
ロースを加水分解している。

【０１０９】上記各反応溶液の５０μｌを１００℃で３
分間処理することで反応を停止させた。０．２２μｍ限
外濾過膜で沈澱を除去し、４倍希釈した反応溶液４０μ
ｌをゲル濾過液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）に供し
て、分子量分布を分析した。溶媒として０．１ＭＮａ
ＮＯ₃水溶液を使用し、カラムとしてｓｈｏｄｅｘＯ
Ｈ−ｐａｋＳＢ−８０６Ｑ（φ８ｍｍ×３００ｍｍ；
昭光通商製）およびＧｕａｒｄカラム（ＯＨ−ｐａｋ
ＳＢ−Ｇ；昭光通商製）を使用した。流速１ｍｌ／分で
カラム温度４０℃で流した。検出はＲＩ（昭光通商Ｒ
Ｉ−７１）および多角度光散乱検出器（ＭＡＬＬＳ；Ｗ
ｙａｔｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｒｐ．製ＤＡ
ＷＮＤＳＰ）で行った。ＭＡＬＬＳを用いて測定し
た分子量分布は、本分析器が高分子量での感度が高いこ
と、および３０分後以降のアミロースの分解物が既にヨ
ード呈色法で定量されなくなっており、かなり低分子化
が進んでいること（図１０）を考慮すると、デンプン中
のほとんどアミロペクチンのみを測定していることにな
る。

【０１１０】図１１は種々のデンプンにおける分子量分
布を示す。ここでいう分子量とは重量平均分子量（Ｍ
ｗ）を指す。図１１Ａは、ジャガイモにおける分子量の
累積重量分率（特定の分子量以下にどれだけ分布してい
るか）を表す（縦軸は累積重量分率を示し；横軸は分子
量を示し、各記号は、以下の処理を表す：黒四角、３０
分；黒菱形、６０分；黒丸、１２０分；黒三角、１８０
分；縞四角、２４時間）。図１１Ｂは、ジャガイモにお
ける酵素処理時間に対する分子量の変化を示す（縦軸は
重量平均分子量を示し；横軸は反応時間（分）を示
す）。反応時間の経過に伴って、アミロペクチンの重量
平均分子量は約２．７×１０⁷（３０分反応後）から約
６．０×１０⁶（２４時間反応後）に変化した。

【０１１１】図１１Ｃは、コムギにおける分子量の累積
重量分率（特定の分子量以下にどれだけ分布している
か）を表す（縦軸は累積重量分率を示し；横軸は分子量
を示し、各記号は、図１１Ａと同様である）。図１１Ｄ
は、コムギにおける酵素処理時間に対する分子量の変化
を示す（縦軸は重量平均分子量を示し；横軸は反応時間
（分）を示す）。反応時間の経過に伴って、アミロペク
チンの重量平均分子量は約２．８×１０⁷（３０分反応
後）から約１．０×１０⁷（２４時間反応後）に変化し
た。

【０１１２】図１１Ｅは、タピオカにおける分子量の累
積重量分率（特定の分子量以下にどれだけ分布している
か）を表す（縦軸は累積重量分率を示し；横軸は分子量
を示し、各記号は、図１１Ａと同様である）。図１１Ｆ
は、タピオカにおける酵素処理時間に対する分子量の変
化を示す（縦軸は重量平均分子量を示し；横軸は反応時
間（分）を示す）。反応時間の経過に伴って、アミロペ
クチンの重量平均分子量は約３．５×１０⁷（３０分反
応後）から約６．３×１０⁶（２４時間反応後）に変化
した。

【０１１３】図１１Ｇは、ウルチゴメにおける分子量の
累積重量分率（特定の分子量以下にどれだけ分布してい
るか）を表す（縦軸は累積重量分率を示し；横軸は分子
量を示し、各記号は、図１１Ａと同様である）。図１１
Ｈは、ウルチゴメにおける酵素処理時間に対する分子量
の変化を示す（縦軸は重量平均分子量を示し；横軸は反
応時間（分）を示す）。反応時間の経過に伴って、アミ
ロペクチンの重量平均分子量は約２．５×１０⁷（３０
分反応後）から約２．２×１０⁶（２４時間反応後）に
変化した。

【０１１４】図１１Ｉは、トウモロコシにおける分子量
の累積重量分率（特定の分子量以下にどれだけ分布して
いるか）を表す（縦軸は累積重量分率を示し；横軸は分
子量を示し、各記号は、以下を除いて図１１Ａと同様で
ある：黒三角は２４時間処理を表す）。図１１Ｊは、ト
ウモロコシにおける酵素処理時間に対する分子量の変化
を示す（縦軸は重量平均分子量を示し；横軸は反応時間
（分）を示す）。反応時間の経過に伴って、アミロペク
チンの重量平均分子量は約５．５×１０⁷（６０分反応
後）から約１．２×１０⁷（２４時間反応後）に変化し
た。

【０１１５】図１１Ｋは、モチトウモロコシにおける分
子量の累積重量分率（特定の分子量以下にどれだけ分布
しているか）を表す（縦軸は累積重量分率を示し；横軸
は分子量を示し、各記号は、以下の処理を表す：黒四
角、０分；白菱形、３０分；黒丸、８０分；黒三角、１
２０分；縞四角、２４０分；黒逆三角、３６０分；縞
丸、２４時間）。図１１Ｌは、モチトウモロコシにおけ
る酵素処理時間に対する分子量の変化を示す（縦軸は重
量平均分子量を示し、横軸は反応時間を示す）。反応時
間の経過に伴って、アミロペクチンの重量平均分子量
は、約５．０６×１０ ⁷（未反応時）から約３．５×１
０⁶（２４時間反応後）に変化した。

【０１１６】（実施例１０：アミロペクチンへのＮＰＬ
の作用）本実施例では、アミロペクチンに対するＮＰＬ
の作用を調べた。

【０１１７】基質溶液としては、３００μｌの１％アミ
ロペクチン（Ａ−８５１５）溶液、および１％アミロー
ス（Ａ−０５１２）と１％アミロペクチンとを含有する
溶液を、それぞれ９０％ＤＭＳＯ溶液中１０％基質から
調製した。ＮＰＬ溶液（０．２ＭＭＥＳ−Ｎａ緩衝液
（ｐＨ６．０）中０．０７ｍｇ／ｍｌ）３００μｌを、
各基質溶液に添加し、５０℃で０分、１０分、２０分、
３０分、６０分および１２０分間放置した。アミロペク
チンに対する分解率を測定するためにソモギ・ネルソン
法を、アミロースおよびアミロペクチンの含量を決定す
るためにヨード呈色反応を実施例３と同様に行った。上
記各反応溶液の５０μｌを１００℃で３分間さらに反応
させた。４倍希釈した反応溶液４０μｌを実施例９と同
様にＭＡＬＬＳとＲＩ検出器を併用したＨＰＬＣ分析で
分子量分布を測定した。また、本分析によって測定でき
る分子量分布も実施例９と同様に、デンプン中のほとん
どアミロペクチンのみを測定していることになる（用い
たＳｉｇｍａ社のアミロースの重量平均分子量は５０万
程度であり、一方、アミロペクチンは１０００万程度で
ある）。

【０１１８】図１２ＡおよびＢは、ＮＰＬでの反応後の
基質の量の変化および分解率を示す（Ａ、アミロペクチ
ンのみ；Ｂ、アミロペクチンおよびアミロース混合
物）。各図において、横軸は反応時間（分）を示し、左
の縦軸はアミロースおよびアミロペクチン含量（ｍｇ／
ｍｌ）（棒グラフの上の濃い方がアミロースであり、下
の薄い方がアミロペクチンである）、そして右の縦軸は
分解率（％）（グラフでは黒丸）を示す。図１２Ａよ
り、ＮＰＬは、アミロペクチンを全く分解しないわけで
はないことが理解される。図１２Ｂでは、ＮＰＬが、ア
ミロペクチンに比較して、アミロースをより選択的に分
解し得ることが示されている。

【０１１９】図１２ＣおよびＥは、ＮＰＬ処理したアミ
ロペクチンの分子量の累積重量分率（特定の分子量以下
にどれだけ分布しているか）を表す（縦軸は累積重量分
率を示し；横軸は分子量を示す：Ｃ、アミロペクチンの
み；Ｅ、アミロペクチンおよびアミロース混合物）。図
中、各記号は、以下の処理を表す：白四角、０分；黒菱
形、１０分；黒丸、３０分；黒三角、６０分；黒四角、
１５０分；縞四角、２００分。図１２ＤおよびＦは、Ｎ
ＰＬ処理したアミロペクチンの処理時間に対する分子量
の変化を示す（縦軸は重量平均分子量を示し；横軸は反
応時間（分）を示す：Ｄ、アミロペクチンのみ；Ｆ、ア
ミロペクチンおよびアミロース混合物）。反応時間の経
過に伴って、ＮＰＬで処理したアミロペクチン単独の重
量平均分子量は、約１．０×１０⁷から約４．０×１０⁶
に変化し、アミロペクチンおよびアミロースの混合物を
ＮＰＬで処理した場合のアミロペクチンの重量平均分子
量は、約１．０×１０⁷から約８．０×１０⁶に変化し
た。

【０１２０】Ｓｉｇｍａ社製の本アミロペクチンの重量
平均分子量は、未反応の段階で１千万程度であるよう
に、本来のジャガイモデンプンのアミロペクチンの重量
平均分子量（図１１Ｂ）と比較して小さく、またＮＰＬ
２４時間反応後の重量平均分子量とほぼ同じ程度であ
る。このことからも、ＮＰＬでの処理により、本アミロ
ペクチンは、これ以上低分子化が進行しないことが認め
られる。しかし、実施例８に見られるように、アミロー
ス基質の存在下でアミロペクチンの低分子化が抑制され
る傾向がわずかであるが観察されている。

【０１２１】図１２Ａ〜Ｆにおいて、ＮＰＬが、アミロ
ースだけでなく、アミロペクチンにも作用し得ること、
および実際のデンプンにおけるようなアミロースの存在
下では、ＮＰＬのアミロペクチンに対する反応性がさら
に低くなり、ＮＰＬによるアミロペクチンの分解は遅延
され得ることが示された。

【０１２２】（実施例１１：ＮＰＬによるデンプンの老
化防止作用）本実施例では、実施例５において検討され
たＮＰＬによるデンプンの老化防止特性をさらに調べ
た。

【０１２３】基質溶液として、以下のデンプン溶液を調
製した：ジャガイモ（松谷化学）、コムギ（グリコ栄養
食品）、ウルチゴメ（島田化学）、タピオカ（三和澱
粉）、トウモロコシ（日本食品加工）、モチトウモロコ
シ（三和澱粉）。１％デンプン溶液２０μｌを１００℃
で糊化し、次いでオートクレーブに１２１℃で１５分間
供した。次いで５０℃で３０分間放置した。この時点の
溶液にＮＰＬ処理を行わなかったものをコントロールと
した。これに、ＮＰＬ溶液（０．２ＭＭＥＳ−Ｎａ緩
衝液（ｐＨ６．０）中０．７ｍｇ／ｍｌ）５００μｌま
たは１ＭＭＥＳ−Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．０）５００μ
ｌを添加し、これらを５０℃で２４時間放置した。得ら
れた反応溶液を以下の２つの処理のいずれかに供した：
（１）５ｍｌを５℃で冷蔵保存する（１％溶液）；また
は（２）１５ｍｌを凍結乾燥し、２ｍｌの蒸留水をこれ
に添加して７．５％溶液を作製した後、５℃で冷蔵保存
する。（１）および（２）で得られた溶液の濁度を、７
２０ｎｍでの吸光度により測定した。（１）の結果を表
２に、そして（２）の結果を表３に示す。

【０１２４】

【表２】

【０１２５】

【表３】

【０１２６】（１）の場合、ＮＰＬ処理後は、いずれの
デンプンにおいてもその透明度は高く、冷蔵保存後もな
おこの特性は保持されていた。一方、ＮＰＬ未処理デン
プンは、冷蔵保存で白濁した。（２）の場合、ＮＰＬ処
理デンプンの凍結乾燥物の溶解性が著しく高かった。Ｎ
ＰＬ反応デンプンの溶液の透明度もまた高く、冷蔵保存
後もなおこの特性は保持されていた（濁度は０に近
い）。一方、ＮＰＬ未処理デンプンは、だまになって溶
解性が低く、冷蔵保存で著しく白濁して流動性がなくな
った。

【０１２７】（２）で得られた溶液の糊化度を、澱粉・
関連糖質実験法（第１９０頁、生物化学実験法１９、学
会出版センター、中村道徳ら編、１９８６年）に従って
測定した。糊化度は以下のように算定した。

【０１２８】

【数１】

【０１２９】結果を以下の表４に示す。

【０１３０】

【表４】

【０１３１】糊化から２週間後においても、ＮＰＬ処理
デンプンでは高い糊化度が保持された。このことは、Ｎ
ＰＬ処理デンプンが老化されにくいことを示している。

【０１３２】（実施例１２：デンプンの冷凍・解凍耐性
についてのＮＰＬの影響）本実施例では、デンプンの冷
凍・解凍耐性についてのＮＰＬの影響を調べた。

【０１３３】１％モチトウモロコシデンプン溶液５０ｍ
ｌを、１００℃で糊化し、次いでオートクレーブに１２
１℃で１５分間供した。次いで５０℃で３０分間放置し
た。これに、ＮＰＬ溶液（０．２ＭＭＥＳ−Ｎａ緩衝
液（ｐＨ６．０）中０．７ｍｇ／ｍｌ）５００μｌまた
は１ＭＭＥＳ−Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．０）５００μｌ
を添加し、これらを５０℃で１９時間放置した。コント
ロールとして、ＮＰＬ溶液の代わりに蒸留水５００μｌ
を使用した。次いで、このうち、５０μｌを１００℃で
３分間処理した。上述のように調製したＮＰＬ処理デン
プン溶液およびコントロール溶液を−３０℃で冷凍し、
次いで常温解凍した。濁度は、７２０ｎｍでの吸光度に
より測定した。この冷凍−解凍サイクルを５回まで繰り
返した。結果を図１３に示す（縦軸に濁度、横軸に解凍
回数を示す、白四角はＮＰＬであり、黒菱形はコントロ
ールである）。

【０１３４】ＮＰＬ処理デンプンは、冷凍−解凍サイク
ルを繰り返した後でも濁度の上昇が見られず（０に近
い）、冷凍・解凍反応に対する高い耐性を有していた。

【０１３５】（実施例１３：ＮＰＬ処理デンプンの粘度
低下作用）本実施例では、通常のデンプンにＮＰＬ処理
デンプンを添加することによる影響を調べた。

【０１３６】ジャガイモデンプン（松谷化学製）７．５
ｇに（１）ＮＰＬ処理ジャガイモデンプン７．５ｇをさ
らに添加するか、または（２）何も添加せずに、３００
ｇの懸濁液を生成した。この懸濁液を１００℃で２５分
放置した。次いで、冷水中２６℃まで冷却し、ＤＩＧＩ
ＴＡＬＶＩＳＣＯＭＥＴＥＲ（ＴＯＫＩＭＥＣ）を用
いて粘度を測定した（軸Ｎｏ．４使用）。６０ｒｐｍお
よび３０ｒｐｍで測定し、３０秒後の値を２〜３回測定
した。結果を以下の表５に示す。

【０１３７】

【表５】

【０１３８】表５に示されるように、ＮＰＬ処理デンプ
ンを未処理デンプンに添加することにより、得られた溶
液の粘度は低下した。

【０１３９】（実施例１４：食品への応用）本実施例で
は、ＮＰＬの各食品への応用例を示す。

【０１４０】１）わらび餅の製造わらび餅粉（サツマイモデンプン；山本貢資商店製）２
０ｇに、１０ｍｇエクセルＴ−９５（花王製；飽和モノ
グリセリド）および酵素溶液５０ｍｌを添加して撹拌し
た。酵素溶液は、以下のようにして得た：（１）ＮＰＬ
（粗精製品、１．８Ｕ／ｍｌ）、５００ｍｇ；および
（２）ＮＯＶＡＭＹＬ１００００ＢＧ（ＮＯＶＯ
製）、５０ｍｇを１０ｍｌ蒸留水中に添加および溶解し
（無添加の蒸留水を用いた場合をコントロールとし
た）、８，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、得られた溶
液に冷却下で３０ｍｌエタノールを添加し、さらに８，
０００ｒｐｍ×３０分間遠心した。その沈殿物を蒸留水
に溶解した。不溶物を遠心で除去して、その上清を酵素
溶液として用いた。撹拌後、室温で２４時間放置し、次
いで５０℃で２時間放置した。得られた溶液を透明にな
るまで直火で煮た。次いで氷水中に大さじで落として、
わらび餅を作製した。得られたわらび餅の官能評価を行
った。官能評価では、（１）および（２）をそれぞれコ
ントロールと比較して、見た目、粘弾性および食感につ
いて、それぞれ−２〜＋２までの５段階評価を行った。
官能評価の結果を、以下の表６に示す。

【０１４１】

【表６】

【０１４２】ＮＰＬを添加したわらび餅は、腰が強く粘
りがあると評価された。ＮＯＶＡＭＹＬを添加したわら
び餅は、べたべたした生地となり、餅に成形しづらかっ
た。

【０１４３】２）炊飯米への効果２８０ｇ（２合）の粳米（コシヒカリ）を１０ｍｇエク
セルＴ−９５（花王製）を含む４００ｍｌ蒸留水中に浸
漬した。これらを室温で１時間放置した。これに各酵素
溶液８０ｍｌを添加した。酵素溶液は、以下のようにし
て得た：（１）ＮＰＬ（粗精製品、１．８Ｕ／ｍｌ）、
３００ｍｇ；および（２）ＮＯＶＡＭＹＬ１００００
ＢＧ（ＮＯＶＯ製）、５０ｍｇを１０ｍｌ蒸留水中に添
加し（無添加の蒸留水を用いた場合をコントロールとし
た）、超音波処理し、８，０００ｒｐｍで１５分間遠心
した。酵素添加後、室温で１５時間放置し、次いで５０
℃で２時間放置した。流水洗浄後、３８０ｍｌ蒸留水中
に浸漬した。得られた米を炊飯した。炊飯米の官能評価
を上記と同様に５段階で行った。得られた結果を以下の
表７に示す。

【０１４４】

【表７】

【０１４５】ＮＰＬ処理炊飯米は、粘弾性があり、優れ
た食感を有していた。

【０１４６】３）餅への効果４２０ｇ（３合＝０．５４Ｌ）の餅米「味だより」を洗
い、約４０分浸漬し、約１０分水切りし、約２５分蒸し
た（温度は１００℃に上昇した）。次いで、餅つきおよ
び練りを約１５分行った。０分後、温度は９５℃にな
り、５分後、６０℃になった。この時点で：１）酵素溶
液としてＮＰＬ（組換え酵素１ｇを２０ｍｌ蒸留水中に
溶解し、遠心し、上清を使用するか；または２）コント
ロールとして２０ｍｌ蒸留水を使用した。１５分後に
は、温度は４５℃であった。これらの工程は、東芝「餅
つき機」ＰＦＵ−２０ＡＭを用いて、製造者の指示書に
従って行った。つき上がりの餅を７人のパネラーに試食
させた。官能評価では、コントロールを０点として５段
階評価した。結果を以下の表８に示す。

【０１４７】

【表８】

【０１４８】ＮＰＬ添加餅は、コントロールに比べて軟
化し、歯切れがよかった。

【０１４９】（実施例１５；デンプンヘのＮＰＬ作用後
のｎ−ブタノールによるアミロースおよびアミロペクチ
ンの分画）本実施例はジャガイモデンプンに対するＮＰ
Ｌの作用を、Ｍｉｚｕｋａｍｉ．Ｈらの方法（Ｃａｒｂ
ｏｈｙｄｒａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈ、３８巻、３２９
頁、１９９９年）を参考にして、ｎ−ブタノールによる
アミロースおよびアミロペクチンの分画法を用いて調べ
た。基質溶液として、ジャガイモ由来のデンプン（松谷
化学製）を用いて調製した。実施例９と同様の方法で、
十分に糊化したデンプン１％溶液１０ｍｌ（０．２Ｍ
ＭＥＳ−Ｎａ（ｐＨ６．０）溶液に調製済み）を５０℃
で３０分間放置した。これに、ＮＰＬ溶液（０．２Ｍ
ＭＥＳ−Ｎａ（ｐＨ６．０）中０．７ｍｇ／ｍｌ）５０
μｌを添加し、５０℃で０分、５分、１０分、２０分、
３０分、６０分、１２０分、１８０分、２７０分および
２４時間放置した。デンプンに対する分解率を測定する
ためにソモギ・ネルソン法を、デンプン中のアミロース
およびアミロペクチンの含量を決定するためにヨード呈
色反応を実施例８と同様に行なった。また、各反応液１
ｍｌを１００℃で５分間放置し、反応を停止して後ｎ−
ブタノールを１１０μｌ添加し、３７℃で２４時間放置
した。その後、１０，０００ｇで１０分間、室温で遠心
して沈澱を集めた。この沈澱がアミロース画分である。
上清は６０℃で２００μｌまで遠心濃縮し、８００μｌ
のエタノール（和光純薬製特級品；以下特に断りがない
限り、本エタノールを指す）を添加し、１０，０００ｇ
で１０分間、室温で遠心して沈澱を集めた。本沈澱がア
ミロペクチン画分であり、上清がマルトースを主体とす
る低分子画分であった。アミロース沈澱画分は少量の蒸
留水に糊化溶解後、４倍量のエタノールを添加し、遠心
で回収することを数回繰り返して洗浄し、ｎ−ブタノー
ルを除去し、５００μｌの９０％ＤＭＳＯ中に溶解し保
存した。他の２画分も遠心濃縮してエタノールを除去し
濃縮した後、５００μｌの９０％ＤＭＳＯ中に溶解し保
存した。３画分の全糖量はフェノール硫酸法（Ｄｕｂｏ
ｉｓら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２８巻、３５０頁、１
９５６年）で測定した。図１４ＡはＮＰＬ作用時のデン
プン中のアミロースおよびアミロペクチンのヨード呈色
法により定量した含量の経時変化および分解率を示して
おり、図１４ＢはＮＰＬ作用時のデンプン中のｎ−ブタ
ノールにより分画後定量したアミロースおよびアミロペ
クチンおよび低分子画分の含量の経時変化を示してい
る。図１４Ａにおいて、横軸は反応時間（分）を示し、
左の縦軸はアミロースおよびアミロペクチン含量（ｍｇ
／ｍｌ）（棒グラフの上の濃い方がアミロースであり、
下の薄い方がアミロペクチンである）、そして右の縦軸
は分解率（％）（グラフでは黒丸）を示す。図１４Ｂに
おいて、横軸は反応時間（分）を示し、左の縦軸はアミ
ロース、アミロペクチン、および低分子画分含量（ｍｇ
／ｍｌ）（棒グラフの上の濃い方がアミロースであり、
下の薄い方がアミロペクチンであり、斜線部分は低分子
画分を表す）、そして右の縦軸は分解率（％）（グラフ
では黒丸）を示す。低分子画分は実施例２記載の薄層ク
ロマトグラフィーを行なった結果、ＤＭＳＯの影響で検
出スポットはテーリングを起こしたが、図２Ａと同様
に、主にマルトースが検出された。この結果より、両方
の定量法において、アミロースのみがＮＰＬの作用で分
子量で１０００以下まで低分子化し、消失して行くこと
が明らかである。また、簡便なヨード呈色法が、ＮＰＬ
作用時に見かけ上の含量の上昇が認められること以外
は、アミロースヘの特徴的な作用を十分に検出できてい
ることが明らかとなった。さらに、図１４Ｂより、低分
子化したアミロースは最終的にはマルトースまで低分子
化されてくることも良く分かる。

【０１５０】次に、上記アミロース・アミロペクチン分
画ＤＭＳＯ溶解物１００μｌに、エタノールを９００μ
ｌを添加し、遠心で沈澱を回収することを数回繰り返
し、ＤＭＳＯを除去した。６０℃の遠心濃縮でこのエタ
ノールを除去した後、実施例７のアルカリ調製法で糊化
溶解し、２００μｌの溶液を調製した。本調製アミロー
スおよびアミロペクチン分画物１００μｌをそれぞれ用
いて、実施例９と同様にＭＡＬＬＳとＲＩ検出器を併用
したＨＰＬＣ分析で分子量分布の測定を行なった。図１
４Ｃは、ＮＰＬ作用時のアミロースおよびアミロペクチ
ンのそれぞれの別個に求めた各重量平均分子量の経時変
化を示している（縦軸は重量平均分子量を示し；横軸は
反応時間（分）を示し、白四角は、アミロペクチン、黒
丸は、アミロースをそれぞれ表す）。図１４Ｃよりアミ
ロースはＮＰＬ反応開始後減少を続け、６０分後までに
消失した。その時の重量平均分子量はおよそ５０万から
５万程度まで一気に減少し、以降はｎ−ブタノールでは
沈澱しなくなった。つまり、６０分以降は確実に重量平
均分子量が５万以下のアミロースになっており、やが
て、マルトースにまで分解が進んでいくことを現してい
る。一方、アミロペクチンは、分子量が１億以上のもの
がＮＰＬの作用で、実施例９の図１１Ｂと同様に、約６
００万以上で低分子化が止まった。本実験結果からも、
実施例９のヨード呈色法でのアミロース画分消失後の分
子量分布測定時においても、アミロペクチンのみの分子
量分布が測定されていることが分かる。

【０１５１】（実施例１６：ＮＰＬ関連酵素の取得）ＢＬＭＡ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒ
ｍｉｓ由来）１）遺伝子のクローニング下記のプライマー２種を用い、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉ
ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＡＴＣＣ２７８１１株の染色
体を鋳型としてＰＣＲを行うことによりＢＬＭＡの遺伝
子を増幅した。染色体の調製、およびＰＣＲは定法にし
たがって行った。ＰＣＲプライマーとして、公開されて
いるＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ
ＡＴＣＣ２７８１１株ＢＬＭＡ遺伝子の塩基配列（Ｋｉ
ｍ，Ｉ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６７，２２１０８−２２１１４（１９９２））
を参考にし、下記のオリゴヌクレオチドを定法により合
成した：ＰＣＲプライマーＮＰ４Ｎ−ＮＤＥ；ＴＧＧＣＡＴＡＴＧＡＴＣＧＡＡＴ
ＴＡＧＣＡＧＣＧＡＴＡＣＮＰ４Ｃ−ＥＣＯ；ＣＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＣＡＧ
ＡＡＴＴＴＡＧＡＣＣＧＣ。

【０１５２】増幅された遺伝子断片を、制限酵素Ｎｄｅ
ＩとＥｃｏＲＩで切断し、同制限酵素で切断したベクタ
ーｐＧＥＸ−Ｎｄｅ２と連結することにより、組換えプ
ラスミドｐＮＰＲ４２２を得た。ｐＧＥＸ−Ｎｄｅ２は
Ｔｅｒａｄａらの文献（ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎ
ｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，
Ｖｏｌ６５，ｐ９１０−９１５，１９９９）に記載され
たｐＧＥＸ−Ｎｄｅの唯一のＸｂａＩ制限酵素切断部位
に、ＤＮＡポリメラーゼを用いて４塩基を挿入したプラ
スミドである。

【０１５３】２）酵素液の調製組換えプラスミドｐＮＰＲ４２２を保持する大腸菌ＴＧ
−１株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地
（１．０％トリプトン，０．５％酵母抽出液，０．５％
ＮａＣｌ）で３７℃、一晩振とう培養を行った。この前
培養液１０ｍｌを１リットルのＴｅｒｒｉｆｉｃ培地
（ライフテックオリエンタル（株）製，５０μｇ／ｍ１
のアンピシリンを含む）を入れた２リットル容坂口フラ
スコに添加し、３７℃で３時間振とうした。フラスコを
１５℃に移し、さらに２０時間振とうを行った。

【０１５４】遠心分離により、菌体を回収し、５０ｍｌ
の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）
（以下、緩衝液Ａという）に懸濁した。超音波処理によ
り菌体を破砕後、遠心分離により不溶物を除くことによ
って粗酵素液を得た。粗酵素液に７０％飽和となるよう
に硫酸アンモニウムを添加して、ＢＬＭＡを沈殿させ、
これを約２０ｍ１の緩衝液Ａに懸濁後、同緩衝液に対し
て透析した。透析内液を緩衝液Ａで平衡化したＱセファ
ロースカラム（アマシャムファルマシアバイオテク製）
にロードし、０．４ＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａで洗浄
し、続いて１．０ＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａを流すこ
とによりＢＬＭＡを溶出させた。得られた活性画分を緩
衝液Ａに対して透析し酵素液を得た。

【０１５５】３）酵素活性の測定５０μ１の２％（ｗ／ｖ）可溶性デンプン（和光純薬
（株））水溶液と５０μ１の５０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ６．５）を混合し、あらかじめ４０℃で
保温した。これに１００μ１の適当に希釈した酵素溶液
を添加することにより反応を開始した。酵素の希釈は
０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）により行った。１
０分の保温後、４００μ１のＤＮＳ溶液（本試薬は、
０．４ＭＮａＯＨ，２２ｍＭ３，５−ジニトロサリ
チル酸，および１．１Ｍ（＋）−酒石酸ナトリウムカ
リウム四水和物を混合することにより調製した）を添加
して反応を停止し、沸騰水中で５分加熱した。冷却後
１．８ｍｌの蒸留水を添加した後、５３５ｎｍの吸光度
を測定し、生じた還元糖量を定量した。酵素液添加前に
ＤＮＳ溶液を加えたものを対照とした。この条件におい
て１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖を
生じる酵素量を１単位とした。

【０１５６】酵素活性は、２．１ｍｇ／ｍｌの濃度で
２．０ＩＵ／ｍｌであった。本酵素溶液を膜濃縮して、
×１／２、×１、×２、×５倍濃度の各溶液を作成した
（０．５２５ｍｇ／ｍｌ、１．０５ｍｇ／ｍｌ、２．１
ｍｇ／ｍｌ、５．２５ｍｇ／ｍｌ）。

【０１５７】４）酵素の簡単な性質作用至適ｐＨは６．５であり、作用至適温度は４０℃か
ら５０℃であった。

【０１５８】ＣＤａｓｅ（Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｌｉ
ｃＢａｃｉｌｌｕｓｓｐ．Ａ２−５ａ株由来）１）遺伝子のクローニング下記のプライマー２種を用い、Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｌ
ｉｃＢａｃｉｌｌｕｓｓｐ．Ａ２−５ａ株（寄託番
号ＦＥＲＭ−Ｐ−１３８６４）の染色体を鋳型としてＰ
ＣＲを行うことによりＣＤａｓｅの遺伝子を増幅した。
染色体の調製、およびＰＣＲは定法にしたがって行っ
た。ＰＣＲプライマーとして、公開されているＡｌｋａ
ｌｏｐｈｉｌｌｉｃＢａｃｉｌｌｕｓｓｐ．Ａ２−
５ａ株ＣＤａｓｅ遺伝子の塩基配列（ＤＤＢＪ／ＥＭＢ
Ｌ／ＧｅｎＢａｎｋ；ＡＢ０１５６７０）を参考にし、
下記のオリゴヌクレオチドを定法により合成した。増幅
された遺伝子断片を、制限酵素ＮｃｏＩとＫｐｎＩで切
断し、同制限酵素で切断したベクターｐＫＫ３８８−１
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）と連結することにより、組換
えプラスミドｐＮＰＲ６３を得た。

【０１５９】ＰＣＲプライマーＮＰ６Ｎ−ＮＣＯ；ＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＡＡＡＡＧＡ
ＡＧＣＧＡＴＴＴＡＮＰ６Ｎ−ＫＰＮ；ＴＴＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＡＴＣ
ＡＣＣＴＴＴＡＴＡＡＣＡＣＣ。

【０１６０】２）酵素液の調製組換えプラスミドｐＮＰＲ６３を保持する大腸菌ＴＧ−
１株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地（
に記載）で３７℃、一晩振とう培養を行った。この前培
養液１０ｍｌを１リットルのＴｅｒｒｉｆｉｃ培地（ラ
イフテックオリエンタル（株）製，５０μｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含む）を入れた２リットル容坂口フラスコ
に添加し、３７℃で３時間振とうした。フラスコを１５
℃に移し、３０分間振とう後、終濃度０．１ｍＭになる
ように、イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
（ＩＰＴＧ，和光純薬製）を添加し、さらに２０時間１
５℃で振とうを行った。遠心分離により、菌体を回収
し、５０ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）（以下、緩衝液Ａという）に懸濁した。超音
波処理により菌体を破砕後、遠心分離により不溶物を除
くことによって粗酵素液を得た。粗酵素液に７０％飽和
となるように硫酸アンモニウムを添加して、ＣＤａｓｅ
を沈殿させ、これを約２０ｍｌの緩衝液Ａに懸濁後、同
緩衝液に対して透析した。透析内液を緩衝液Ａで平衡化
したＱセファロースカラム（アマシャムファルマシアバ
イオテク製）にロードし、０．２ＭのＮａＣｌを含む緩
衝液Ａで洗浄し、続いて０．４ＭのＮａＣｌを含む緩衝
液Ａを流すことによりＣＤａｓｅを溶出させた。得られ
た活性画分を緩衝液Ａに対して透析し、Ｒｅｓｏｕｒｃ
ｅＱカラム（アマシャムファルマシアバイオテク製）に
ロードした。０．２ＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａで洗浄
した後、緩衝液Ａ中のＮａＣｌ濃度を直線的に０．４Ｍ
まで上げることにより、ＣＤａｓｅを溶出させた。得ら
れた活性画分を緩衝液Ａに対して透析し、酵素液を得
た。

【０１６１】３）酵素活性の測定５０μｌの２％（ｗ／ｖ）αサイクロデキストリン（片
山化学工業（株）製）水溶液と５０μ１の５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を混合し、あらか
じめ４０℃で保温した。これに１００μｌの適当に希釈
した酵素溶液を添加することにより反応を開始した。酵
素の希釈は０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む１
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）により行
った。１０分の保温後、４００μｌのＤＮＳ溶液（に
記載）を添加して反応を停止し、沸騰水中で５分加熱し
た。冷却後１．８ｍｌの蒸留水を添加した後、５３５ｎ
ｍの吸光度を測定し、生じた還元糖量を定量した。酵素
液添加前にＤＮＳ溶液を加えたものを対照とした。

【０１６２】この条件において１分間に１μｍｏｌのグ
ルコースに相当する還元糖を生じる酵素量を１単位とし
た。

【０１６３】酵素活性は、０．９ｍｇ／ｍｌタンパク質
濃度で４５．５ＩＵ／であった。本酵素溶液を膜濃縮し
て、×１／２、×１、×２、×５倍濃度の各溶液を作成
した（０．２２５ｍｇ／ｍｌ、０．４５ｍｇ／ｍｌ、
０．９ｍｇ／ｍｌ、２．２５ｍｇ／ｍｌ）。

【０１６４】４）酵素の簡単な性質本酵素の反応至適ｐＨは６．５、反応至適温度は４０か
ら５０℃程度であった。

【０１６５】（実施例１７：取得酵素のアミロース／ア
ミロペクチンへの作用後のゲル濾過分析）１％アミロー
スＡＳ−７０（フナコシ製）および１％アミロペクチン
（ジャガイモ由来、Ｓｉｇｍａ製、Ａ−８５１５）を用
いて人工的なデンプン溶液を作製した。アミロース溶液
は、９０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液に２
０％となるように、アミロースを溶かし糊化した後蒸留
水で希釈することにより調製した。アミロペクチン溶液
は、９０％ＤＭＳＯ溶液に１０％となるように、アミロ
ペクチンを溶かし糊化した後蒸留水で希釈することによ
り調製した。上記１％アミロースおよび１％アミロペク
チンを混合し、１：１混合溶液とした（最終濃度０．５
％、７５０μｌ）。この溶液を、０．２Ｍ２−モルホ
リノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）−Ｎａ緩衝液（ｐＨ
６．０）中０．０７ｍｇ／ｍｌ濃度に調製したＮＰＬ溶
液７５０μｌに添加し、総容積１５００μｌの溶液とし
た。

【０１６６】得られた溶液に、実施例１６で調製した各
酵素溶液を、４０℃で０分、１０分、３０分、６０分、
１２０分、および２４０分、それぞれ作用させた（用い
た酵素濃度は、Ａ２−５ａＣＤａｓｅが０．４５ｍｇ
／ｍｌであり、そしてＢＬＭＡが１．０５ｍｇ／ｍｌで
ある）。次いで、これらの溶液をゲル濾過分析に供し
た。ゲル濾過分析のカラムとして、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ
６ｐｇ（φ１０×３００ｍｍ；ＰｈａｒｍａｃｉａＢ
ｉｏｔｅｃｈ社製）およびＳｕｐｅｒｄｅｘ３０ｐｇ
（φ１０×３００ｍｍ；ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔ
ｅｃｈ社製）を連結したものを使用した。溶媒として
０．１ＭＮａＣｌ溶液を使用し、室温で流速１．０ｍ
ｌ／分で実施し、ＲＩにより検出した。Ａ２−５ａＣ
ＤａｓｅおよびＢＬＭＡにおける結果をそれぞれ、図１
６Ａおよび図１６Ｂに示す。実施例１と同様に、図１６
Ａおよび図１６Ｂ中の左側のピーク（溶出時間１７分）
はアミロペクチンを、そして右側のピーク（溶出時間２
４分）はアミロースを示す。これら酵素での処理の結
果、アミロースのピークが消失した。このことは、これ
らの酵素もまた、ＮＰＬと同様に、デンプン中のアミロ
ースのみを特異的に加水分解し、これによりデンプンを
低分子化させたことを示す。

【０１６７】（実施例１８：取得酵素のアミロースおよ
びアミロペクチンについての分解率および青価）本実施
例では、アミロースおよびアミロペクチンのそれぞれに
対する、実施例１６で調製した酵素の作用を、分解率お
よび青価を指標として試験した。

【０１６８】基質溶液として、１５０μｌの１％アミロ
ース（ジャガイモ由来、Ｓｉｇｍａ製、Ａ−０５１２）
溶液または１％アミロペクチン（Ａ−８５１５）溶液を
調製した。実施例１６で調製した各酵素溶液を使用し
た。

【０１６９】上記各酵素溶液１２０μｌを上記１％アミ
ロースまたはアミロペクチン溶液１２０μｌに４０℃で
０分、５分、１０分、３０分、１時間、および２時間反
応させた。これらの反応液の２０μｌをソモギ・ネルソ
ン法に供した。ソモギ・ネルソン法は、檜作らの文献
（前出）に従い、和光純薬工業製のソモギ溶液およびネ
ルソン溶液を用いて行い、生じた還元糖をマルトース量
として換算することにより、基質の分解率を測定するも
のである。

【０１７０】別の２０μｌをヨード呈色測定に供した。
この方法では、反応溶液の２０μｌに２ｍｌＫＩ−Ｉ₂
溶液（０．５ｇＩ₂および５ｇＫＩを１００ｍｌ蒸
留水に溶解した原液を２５倍希釈して得た）を添加し
て、得られた溶液の吸光度を５１３ｎｍ、６２０ｎｍ、
および７７８ｎｍで測定した。

【０１７１】上記酵素反応後の別の５μｌを薄層クロマ
トグラフィー（ＭＥＲＣＫ社製ＳｉｌｉｃａＧｅｌ
６０、１０×２０ｃｍ）分析に供した。溶媒としてア
セトニトリル／蒸留水＝７５／２５を用い、３回展開し
た。展開終了後、乾燥し、メタノールと硫酸を等量混合
した溶液をスプレーして、１３０℃で５分間焼成しスポ
ットを発色させた。

【０１７２】薄層クロマトグラフィーの結果を図１７に
示す。Ｍは、２μｌの２．５％マルトオリゴ糖である。
これを除いて左から順に、Ａ２−５ａＣＤａｓｅ、Ｂ
ＬＭＡ、ＮＰＬの結果を示す。なお、左側のＧ１、Ｇ２
・・・Ｇ６は、それぞれ、グルコース、マルトース、・
・・マルトヘキサオースを表す。

【０１７３】ヨード呈色測定およびソモギ・ネルソン法
の結果を図１８Ａ（Ａ２−５ａＣＤａｓｅ）および図
１８Ｂ（ＢＬＭＡ）に示す（共に、上方のグラフがアミ
ロースであり、下方のグラフが、アミロペクチンであ
る）。各図において、横軸に反応時間（分）を示し、左
の縦軸にヨード呈色（％）を示し、右の縦軸に基質の分
解率をＧ２（マルトース）換算％で示す。折れ線グラフ
は、基質の分解率を示し、そして棒グラフは、分解後の
基質の割合を示す。

【０１７４】図１７は、Ａ２−５ａＣＤａｓｅおよび
ＢＬＭＡが、ＮＰＬと同様に、アミロースをマルトース
に分解することを示す。

【０１７５】図１８ＡおよびＢは、Ａ２−５ａＣＤａ
ｓｅおよびＢＬＭＡが、アミロースを選択的に分解する
ことを示している。

【０１７６】実施例１７および１８の結果は、Ａ２−５
ａＣＤａｓｅおよびＢＬＭＡが、ＮＰＬと同様に、ア
ミロースを選択的に分解することを示す。

【０１７７】（実施例１９：取得酵素のアミロースおよ
びアミロペクチンへの作用の比較）本実施例では、アミ
ロースおよびアミロペクチンのそれぞれに対する、実施
例１６で得られた酵素の作用を、比色定量に基づいて調
べた。

【０１７８】基質溶液として、０．２５％アミロース
（Ｓｉｇｍａ社製Ａ−０５１２）溶液および０．２５％
アミロペクチン（Ｓｉｇｍａ社製Ａ−８５１５）溶液の
それぞれ３００μｌを作製した。各酵素溶液は実施例１
６に記載のものを使用した。

【０１７９】上記各酵素溶液３００μｌを上記基質溶液
３００μｌに４０℃で０分、１０分、３０分、１時間、
２時間、および４時間反応させた。これら反応溶液の２
０μｌに２ｍｌＫＩ−Ｉ₂溶液（０．５ｇＩ₂および５
ｇＫＩを１００ｍｌ蒸留水に溶解した原液を２５倍に
希釈して得た）を添加して、ヨード呈色反応によりアミ
ロースおよびアミロペクチンの分解を観察した。アミロ
ース、アミロペクチンの分別定量は、山下らの方法（日
本食品工業学会誌４０巻（５）３６５頁（１９９３
年）で行った。一方、これらの反応溶液の２０μｌに１
００μｌソモギ溶液を添加し、アミロースおよびアミロ
ペクチンの加水分解率を調べた。これらの結果を図１９
Ａ〜図１９Ｇに示す（図１９Ａ：Ａ２−５ａＣＤａｓ
ｅ０．２２５ｍｇ／ｍｌ；図１９Ｂ：Ａ２−５ａＣＤ
ａｓｅ０．４５ｍｇ／ｍｌ；図１９Ｃ：Ａ２−５ａＣ
Ｄａｓｅ２．２５ｍｇ／ｍｌ；図１９Ｄ：ＢＬＭＡ０．
５２５ｍｇ／ｍｌ；図１９Ｅ：ＢＬＭＡ１．０５ｍｇ／
ｍｌ；図１９Ｆ：ＢＬＭＡ２．１ｍｇ／ｍｌ；または図
１９Ｇ：ＢＬＭＡ５．２５ｍｇ／ｍｌ、これら酵素濃度
は、反応液中の終濃度を示す）。各図において、横軸は
反応時間（分）を示し、左の縦軸はアミロースおよびア
ミロペクチン含量（ｍｇ／ｍｌ）（棒グラフの上の濃い
方がアミロースであり、下の薄い方がアミロペクチンで
ある）、そして右の縦軸は分解率（％）（グラフでは黒
丸）を示す。

【０１８０】Ａ２−５ａＣＤａｓｅおよびＢＬＭＡも
また、ＮＰＬと同様に、アミロースを選択的に加水分解
した（図１９Ａ〜図１９Ｇ）。

【０１８１】（実施例２０：取得酵素のアミロース／ア
ミロペクチンへの反応性比較）本実施例では、実施例１
６で得られた酵素のアミロースまたはアミロペクチンへ
の反応性の比較を行った。

【０１８２】基質溶液として、１００μｌの１％アミロ
ース（ジャガイモ由来、Ｓｉｇｍａ製、Ａ−０５１２）
または１％アミロペクチン（Ｓｉｇｍａ製Ａ−８５１
５）溶液を調製した。各酵素溶液は、実施例１６に記載
のように調製した。これらの各１００μｌを４０℃で０
分、５分、１０分、３０分、６０分および１２０分反応
させた。２０μｌを１００μｌのソモギ溶液と反応さ
せ、アミロースまたはアミロペクチンの分解率を測定し
た。分解率の測定には、マルトースを用いた検量線を使
用した。酵素活性を、１Ｕが、１分間に１μｍｏｌのマ
ルトースが生成する酵素活性として決定した。結果を図
２０に示す。反応時間（分）を横軸とし、酵素活性比
（アミロペクチンへの活性（Ｕ）／アミロースへの活性
（Ｕ）比）を縦軸とした。図中、縞丸はＡ２−５ａＣ
Ｄａｓｅおよび黒三角はＢＬＭＡを表す。

【０１８３】図２０に示されるように、Ａ２−５ａＣ
ＤａｓｅおよびＢＬＭＡの上記酵素活性比は０．１以下
である。これは、Ａ２−５ａＣＤａｓｅおよびＢＬＭ
Ａがアミロースに対して特異的に反応することを示す。

【０１８４】（実施例２１：取得酵素の天然デンプンへ
の作用）基質溶液として、以下の植物由来のデンプン溶
液を調製した：ジャガイモ（松谷化学）、モチトウモロ
コシ（「ワキシコーン」と同義；三和澱粉）。１％デン
プン溶液８００μｌを１００℃で糊化し、次いでオート
クレーブに１２１℃で１５分間オートクレーブすること
によって十分に糊化させ、４０℃で１５分間放置した。
これに、実施例１６で調製された酵素溶液（ＣＤａｓｅ
４．５ｍｇ／ｍｌおよびＢＬＭＡ０．１７５ｍｇ／ｍ
ｌ）２００μｌを添加し、４０℃で０分、１０分、３０
分、６０分、１２０分または２４０分放置した。デンプ
ンに対する分解率を測定するためにソモギ・ネルソン法
を、デンプン中のアミロースおよびアミロペクチンの含
量を決定するためにヨード呈色反応を実施例３と同様に
行った。

【０１８５】各種デンプンにおけるＡ２−５ａＣＤａ
ｓｅ作用の経時的なデンプン中のアミロースおよびアミ
ロペクチンの含量、ならびに分解率を図２１Ａおよび図
２１Ｂに示す（図２１Ａ、ジャガイモまたは図２１Ｂ、
モチトウモロコシ）。各種デンプンにおけるＢＬＭＡ作
用の経時的なデンプン中のアミロースおよびアミロペク
チンの含量、ならびに分解率を図２２Ａおよび図２２Ｂ
に示す（図２２Ａ、ジャガイモまたは図２２Ｂ、モチト
ウモロコシ）。各図において、横軸は反応時間（分）を
示し、左の縦軸はアミロースおよびアミロペクチン含量
（ｍｇ／ｍｌ）（棒グラフの上の濃い方がアミロースで
あり、下の薄い方がアミロペクチンである）、そして右
の縦軸は分解率（％）（グラフでは黒丸）を示す。図２
１および図２２の各図に示されるように、Ａ２−５ａ
ＣＤａｓｅおよびＢＬＭＡは共に、ＮＰＬと同様に、主
にアミロースを加水分解している。

【０１８６】上記各反応溶液の５０μｌを１００℃で５
分間処理することで反応を停止させた。０．２２μｍ限
外濾過膜で沈澱を除去し、４倍希釈した反応溶液４０μ
ｌをゲル濾過液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）に供し
て、分子量分布を分析した。溶媒として０．１ＭＮａ
ＮＯ₃水溶液を使用し、カラムとしてｓｈｏｄｅｘＯ
Ｈ−ｐａｋＳＢ−８０６Ｑ（φ８ｍｍ×３００ｍｍ；
昭光通商製）およびＧｕａｒｄカラム（ＯＨ−ｐａｋ
ＳＢ−Ｇ；昭光通商製）を使用した。流速１ｍｌ／分で
カラム温度４０℃で流した。検出はＲＩ（昭光通商Ｒ
Ｉ−７１）および多角度光散乱検出器（ＭＡＬＬＳ；Ｗ
ｙａｔｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｒｐ．製ＤＡ
ＷＮＤＳＰ）で行った。

【０１８７】ＭＡＬＬＳを用いて測定した分子量分布
は、本分析器が高分子量での感度が高いこと、および３
０分後以降のアミロースの分解物が既にヨード呈色法で
定量されなくなっており、かなり低分子化が進んでいる
ことを考慮すると、デンプン中のほとんどアミロペクチ
ンのみを測定していることになる。

【０１８８】図２３は種々のデンプンにおける分子量分
布を示す。ここでいう分子量とは重量平均分子量（Ｍ
ｗ）を指す。ジャガイモデンプン（図２３Ａ）およびモ
チトウモロコシデンプン（図２３Ｂ）における酵素処理
時間に対する分子量の変化を示す（縦軸は重量平均分子
量を示し；そして横軸は反応時間（分）を示す；図中、
白四角はＡ２−５ａＣＤａｓｅを示し；そして黒菱形
はＢＬＭＡを示す）。

【０１８９】市販のアミロペクチンに対してこれら酵素
を作用させた場合の重量平均分子量の変化を、図２４に
示す（縦軸は重量平均分子量を示し；そして横軸は反応
時間（分）を示す；図中、白四角はＡ２−５ａＣＤａ
ｓｅを示し；そして黒菱形はＢＬＭＡを示す）。Ａ２−
５ａＣＤａｓｅおよびＢＬＭＡは両方とも、２４０分
作用させた後であっても、アミロペクチンは百万以上の
分子量を有していた。

【０１９０】（実施例２２：種々のＮＰＬ酵素濃度にお
けるデンプンの変化）以下の表９に示す組成で、５０
℃、１８時間酵素反応を実施した。

【０１９１】

【表９】

【０１９２】種々のＮＰＬ酵素濃度におけるデンプンの
変化を、以下の実験により分析した。

【０１９３】実験１）これらの反応液の２０μｌをヨー
ド呈色測定に供した。この方法では、反応溶液の２０μ
ｌに２ｍｌＫＩ−Ｉ₂溶液（０．５ｇＩ₂および５ｇ
ＫＩを１００ｍｌ蒸留水に溶解した原液を２５倍希釈し
て得た）を添加して、得られた溶液の吸光度を５１３ｎ
ｍ、６２０ｎｍ、および７７８ｎｍで測定した。

【０１９４】実験２）２０μｌをソモギ・ネルソン法に
供した。ソモギ・ネルソン法は、檜作らの文献（前出）
に従い、和光純薬工業製のソモギ溶液およびネルソン溶
液を用いて行い、生じた還元糖をマルトース量として換
算することにより、基質の分解率を測定するものであ
る。

【０１９５】実験３）０．２２μｍ限外濾過膜で沈澱を
除去し、５倍希釈した反応溶液１００μｌをゲル濾過液
体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）に供して、分子量分布を
分析した。溶媒として０．１ＭＮａＮＯ₃水溶液を使
用し、カラムとしてｓｈｏｄｅｘＯＨ−ｐａｋＳＢ
−８０６Ｑ（φ８ｍｍ×３００ｍｍ；昭光通商製）およ
びＧｕａｒｄカラム（ＯＨ−ｐａｋＳＢ−Ｇ；昭光通
商製）を使用した。流速１ｍｌ／分でカラム温度４０℃
で流した。検出はＲＩ（昭光通商ＲＩ−７１）および
多角度光散乱検出器（ＭＡＬＬＳ；ＷｙａｔｔＴｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙＣｏｒｐ．製ＤＡＷＮＤＳＰ）で行
った。

【０１９６】実験４）上記酵素反応後の別の４μｌを薄
層クロマトグラフィー（ＭＥＲＣＫ社製Ｓｉｌｉｃａ
Ｇｅｌ６０、１０×２０ｃｍ）分析に供した。溶媒
としてアセトニトリル／蒸留水＝７５／２５を用い、３
回展開した。展開終了後、乾燥し、メタノールと硫酸を
等量混合した溶液をスプレーして、１３０℃で５分間焼
成しスポットを発色させた。

【０１９７】実験５）Ｍｉｚｕｋａｍｉ．Ｈらの方法
（ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈ、３８
巻、３２９頁、１９９９年）を参考にして、ｎ−ブタノ
ールによるアミロースおよびアミロペクチンの分画法を
用いて、ＮＰＬによるアミロース画分の重量の変化を調
べた。表９に示す５ｍｌの試料溶液に、１ｍｌの５ＮＮ
ａＯＨ溶液、５００μｌのｎ−ブタノール、１ｍｌの５
ＮＨＣｌ、１ｍｌの１ＭＮａＯＡｃ（ｐＨ６．０）
を添加し、これを１０，０００ｇで、室温で２０分間遠
心分離した。１ｍｌの５ＮＮａＯＨ溶液を添加して十
分に酵素反応後のデンプン溶液を溶解させて、５００μ
ｌのｎ−ブタノールを添加した。直ちに、１ｍｌの５Ｎ
ＨＣｌ溶液を添加して中和後、１ｍｌの１ＭＮａＯ
Ａｃ（ｐＨ６．０）を本溶液へ添加することでｐＨを調
整した。これを１０，０００ｇで２０分間遠心して沈澱
（アミロース）を回収した。得られた沈澱物を１ｍｌの
エタノールで洗浄し、再度、１０，０００ｇで５分間遠
心して沈澱（アミロース）を回収した。この沈澱に、１
ｍｌのジエチルエーテルを添加して、洗浄後１０，００
０ｇで５分間遠心して後、４０℃でドラフト内で溶液を
十分に乾燥させた。こうして得られたアミロースを、５
００μｌの５ＮＮａＯＨ溶液を添加してボルテックス
混合し十分に溶解させた。直ちに、１ｍｌの５ＮＨＣ
ｌ溶液および１ｍｌの１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．
５）を添加して中和した。全糖量はフェノール硫酸法
（Ｄｕｂｏｉｓら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２８巻、３
５０頁、１９５６年）で測定した。還元量は、パーク・
ジョンソン法を用いて測定した。全糖量を還元量で割っ
たものを平均重合度ｄｐとした。

【０１９８】種々の濃度のＮＰＬ処理によるデンプンの
老化について調べた。

【０１９９】実験６）反応溶液の５ｍｌを、−３０℃で
冷凍した後、解凍し、室温下でその濁度を７２０ｎｍで
測定した。

【０２００】実験７）反応溶液の５ｍｌを、５℃で冷蔵
保存した後、室温下でその濁度を７２０ｎｍで測定し
た。

【０２０１】実験８）反応後の各溶液を用いて、Ｉ．
Ｈａｎａｓｈｉｒｏらの方法（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔ
ｅＲｅｓ．第３０６巻，４２１−４２６頁，１
９９８年）で、糖質の還元末端を２−アミノピリジンで
蛍光標識後分析した。つまり、蛍光標識試料をＨＰＬＣ
ポンプを用いたゲル濾過カラム［ＴｏｙｏｐｅａｒｌＨ
Ｗ−７５Ｓ，５０Ｓ，４０Ｓ（２：３：１）］に供し
た。重量分布分子量を示差屈折計で、数分布分子量を蛍
光検出器で測定した。ここで言う重合度（ＤＰ）は、市
販の合成アミロースＡＳ−１０００を標準物質として、
蛍光検出器（Ｆ）と示差屈折計（ＲＩ）のレスポンス比
（Ｆ／ＲＩ）から求めた。

【０２０２】実験１）および２）で測定して得られたア
ミロース／アミロペクチン定量および分解率の結果を、
図２５Ａおよび図２５Ｂに示す（図２５Ａ、ジャガイモ
デンプンまたは図２５Ｂ、モチトウモロコシデンプ
ン）。各図において、横軸は表９に示したサンプル番号
を示し、左の縦軸はアミロースおよびアミロペクチン含
量（ｍｇ／ｍｌ）（棒グラフの上の濃い方がアミロース
であり、下の薄い方がアミロペクチンである）、そして
右の縦軸は分解率（％）（グラフでは黒丸）を示す。Ｎ
ＰＬ濃度の高いサンプル番号１〜４では、アミロースが
完全に分解され（図２５Ａ）、そしてアミロペクチンは
ほとんど分解されていなかった（図２５Ｂ）。一方、Ｎ
ＰＬ濃度の低いサンプル番号５〜８では、アミロースは
完全には分解されず、デンプン中に高分子の形態で残存
し、アミロペクチンもほとんど分解されないようであ
る。

【０２０３】実験３）で得られた分子量を図２６に示
す。白四角は、ジャガイモデンプンの分子量を示し、そ
して黒菱形は、モチトウモロコシデンプンの分子量を示
す。縦軸は重量平均分子量を示し、横軸はサンプル番号
を示す。モチトウモロコシデンプンでは、いずれのサン
プル番号でも同様の分子量を示したが、ジャガイモデン
プンでは、酵素濃度が上昇するにつれて、分子量が低下
した。しかしサンプル１−３以下では１０⁷以上の重量
平均分子量で収斂したので、サンプル３の濃度以上に酵
素を作用させても、重量平均分子量１０⁷よりも低分子
化しないことがわかった。この分子量はモチトウモロコ
シデンプンと同程度であった。（サンプル番号７〜９は
測定できなかった）。

【０２０４】実験４）で得られたＴＬＣ分析写真を、図
２７に示す。左側のレーンにジャガイモデンプンの結果
を示し、右側のレーンにモチトウモロコシデンプンの結
果を示す。Ｍは、２μｌの２．５％マルトオリゴ糖であ
る。なお、左右両側のＧ１、Ｇ２・・・Ｇ６は、それぞ
れ、グルコース、マルトース、・・・マルトヘキサオー
スを表す。いずれのデンプンも、サンプル番号が高くな
るにつれて、マルトースの出現が低くなった。

【０２０５】図２８に、実験５）で得られたＮＰＬ作用
時のデンプン中のｎ−ブタノールにより分画後定量した
アミロースおよび低分子画分の含量の経時変化を示す。
図２８において、横軸は表９に示したジャガイモデンプ
ンのサンプル番号を示し、左の縦軸はデンプン総量に対
するアミロース含量の割合（％）（グラフでは棒グラ
フ）を示し、そして右の縦軸は還元量／全糖量（ｄｐ）
（グラフでは黒菱形）を示す。図２８からも、サンプル
番号１〜４では、デンプン中のアミロースが分解されて
低分子化されているが、一方、サンプル番号５〜８で
は、デンプン中のアミロースはそれほど分解されず、高
分子アミロースの形態で存在していることが理解され
る。

【０２０６】種々の濃度のＮＰＬ処理によるデンプンの
老化（実験６）および７））の結果をそれぞれ図２９お
よび図３０に示す（Ａ、ジャガイモデンプンまたはＢ、
モチトウモロコシ）。横軸は表９に示したデンプンのサ
ンプル番号を示し、縦軸は７２０ｎｍでの吸光度を示
す。図２９に示されるように、ジャガイモデンプンで
は、サンプル番号１〜４は１回解凍後であっても濁度は
低かった。一方、サンプル番号５〜８は１回解凍後には
白濁を生じた。図３０に示されるように、ジャガイモデ
ンプンでは、サンプル番号１〜５は６日冷蔵処理後であ
って濁度は低かった。一方、サンプル番号６〜８は処理
時間につれて白濁を生じた。

【０２０７】以上より、処理されるＮＰＬの量に依存し
て、デンプンは、難老化性または易老化性になり得る。
本実施例では、サンプル番号４の酵素濃度（０．０８８
ｍｇ／ｍｌ）までの濃度のＮＰＬを処理したとき、デン
プンは、老化しにくいデンプンとなり、そしてそれより
高い酵素濃度の本酵素を処理したとき、老化しやすいデ
ンプンとなった。

【０２０８】さらに、実験８）の結果を図３１Ａ、Ｂ、
Ｃ、およびＤに示す。ジャガイモデンプンについて、サ
ンプル１および６の結果を、それぞれ図３１ＡおよびＢ
に示す。横軸は溶出時間を表し、左縦軸が各検出器のレ
スポンスを表す。図中、破線は、ＲＩレスポンスを示
し、実線は、Ｆレスポンスを示し、そして黒丸は、レス
ポンス比（Ｆ／ＲＩ）からもとめたＤＰを示す。図３１
ＢのＤＰ１７０位のピークはほとんどがアミロースと考
えられる。このピークは、酵素濃度が高まるに従って、
減少していっていることが分かる。一方、アミロペクチ
ンはＲＩレスポンスに現れてきていると考えられる。わ
ずかな低分子化はみとめられるものの、大きくは変化し
ていない。モチトウモロコシデンプンについて、サンプ
ル１および６の結果を、それぞれ図３１ＣおよびＤに示
す。図３１ＣおよびＤでは、高分子のアミロペクチンが
ほとんど残存しているものの、ＤＰ１５３０とＤＰ４７
０位の低分子化したフラグメントも認められた。

【０２０９】（実施例２３：ＮＰＬのアミロペクチンへ
の作用）上記表９のサンプル１および９に示す組成の試
料を用いて、以下の実験を行った。反応後のアミロペク
チン画分を用いて、Ｉ．Ｈａｎａｓｈｉｒｏらの方法
（ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＲｅｓ．第２８３巻，
１５１−１５６頁，１９９６年）を用いて、α１，６
結合を切断する酵素であるイソアミラーゼでこれらの試
料を処理し、アミロペクチンの鎖長分析を行った。

【０２１０】この結果を図３２に示す。モチトウモロコ
シデンプンでは、サンプル１および９を、それぞれ、図
３２ＡおよびＢに示し、そしてジャガイモデンプンで
は、サンプル１および９を、それぞれ、図３２Ｃおよび
Ｄに示す。縦軸は、トータルピークレスポンスに対する
各ピークの割合を％で表し、横軸は、各鎖長の重合度を
示す。デンプン鎖長の重合度の１個づつの違いによっ
て、分画定量できることが、本分析の特徴である。本結
果から、本酵素の作用によって、ほとんどアミロペクチ
ンの鎖長に変化が認められないことが理解される。

【０２１１】

【発明の効果】以上のように、本発明により、デンプン
を含む食品に高付加価値を与える、性質が改変されたデ
ンプンを製造する方法が提供される。この方法により得
られたデンプンは、食品用途および工業的用途に有用で
あり得る。

【０２１２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Ezaki Glico Co., Ltd. <120> Novel starch composition and method for producing the same <130> PH12-013 <140> <141> <150> JP P1999-221810 <151> 1999-08-04 <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 588 <212> PRT <213> Bacillus stearothermophilus <400> 1 Met Arg Lys Glu Ala Ile Tyr His Arg Pro Ala Asp Asn Phe Ala Tyr 1 5 10 15 Ala Tyr Asp Ser Glu Thr Leu His Leu Arg Leu Arg Thr Lys Lys Asp 20 25 30 Asp Ile Asp Arg Val Glu Leu Leu His Gly Asp Pro Tyr Asp Trp Gln 35 40 45 Asn Gly Ala Trp Gln Phe Gln Met Met Pro Met Arg Lys Thr Gly Ser 50 55 60 Asp Glu Leu Phe Asp Tyr Trp Phe Ala Glu Val Lys Pro Pro Tyr Arg 65 70 75 80 Arg Leu Arg Tyr Gly Phe Val Leu Tyr Ser Gly Glu Glu Lys Leu Val 85 90 95 Tyr Thr Glu Lys Gly Phe Tyr Phe Glu Val Pro Thr Asp Asp Thr Ala 100 105 110 Tyr Tyr Phe Cys Phe Pro Phe Leu His Arg Val Asp Leu Phe Glu Ala 115 120 125 Pro Asp Trp Val Lys Asp Thr Val Trp Tyr Gln Ile Phe Pro Glu Arg 130 135 140 Phe Ala Asn Gly Asn Pro Ser Ile Ser Pro Glu Gly Ser Arg Pro Trp 145 150 155 160 Gly Ser Glu Asp Pro Thr Pro Thr Ser Phe Phe Gly Gly Asp Leu Gln 165 170 175 Gly Ile Ile Asp His Leu Asp Tyr Leu Val Asp Leu Gly Ile Thr Gly 180 185 190 Ile Tyr Leu Thr Pro Ile Phe Arg Ser Pro Ser Asn His Lys Tyr Asp 195 200 205 Thr Ala Asp Tyr Phe Glu Val Asp Pro His Phe Gly Asp Lys Glu Thr 210 215 220 Leu Lys Thr Leu Ile Asp Arg Cys His Glu Lys Gly Ile Arg Val Met 225 230 235 240 Leu Asp Ala Val Phe Asn His Cys Gly Tyr Glu Phe Ala Pro Phe Gln 245 250 255 Asp Val Trp Lys Asn Gly Glu Ser Ser Lys Tyr Lys Asp Trp Phe His 260 265 270 Ile His Glu Phe Pro Leu Gln Thr Glu Pro Arg Pro Asn Tyr Asp Thr 275 280 285 Phe Arg Phe Val Pro Gln Met Pro Lys Leu Asn Thr Ala Asn Pro Glu 290 295 300 Val Lys Arg Tyr Leu Leu Asp Val Ala Thr Tyr Trp Ile Arg Glu Phe 305 310 315 320 Asp Ile Asp Gly Trp Arg Leu Asp Val Ala Asn Glu Ile Asp His Glu 325 330 335 Phe Trp Arg Glu Phe Arg Gln Glu Val Lys Ala Leu Lys Pro Asp Val 340 345 350 Tyr Ile Leu Gly Glu Ile Trp His Asp Ala Met Pro Trp Leu Arg Gly 355 360 365 Asp Gln Phe Asp Ala Val Met Asn Tyr Pro Phe Thr Asp Gly Val Leu 370 375 380 Arg Phe Phe Ala Lys Glu Glu Ile Ser Ala Arg Gln Phe Ala Asn Gln 385 390 395 400 Met Met His Val Leu His Ser Tyr Pro Asn Asn Val Asn Glu Ala Ala 405 410 415 Phe Asn Leu Leu Gly Ser His Asp Thr Ser Arg Ile Leu Thr Val Cys 420 425 430 Gly Gly Asp Ile Arg Lys Val Lys Leu Leu Phe Leu Phe Gln Leu Thr 435 440 445 Phe Thr Gly Ser Pro Cys Ile Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Met Thr 450 455 460 Gly Gly Asn Asp Pro Glu Cys Arg Lys Cys Met Val Trp Asp Pro Met 465 470 475 480 Gln Gln Asn Lys Glu Leu His Gln His Val Lys Gln Leu Ile Ala Leu 485 490 495 Arg Lys Gln Tyr Arg Ser Leu Arg Arg Gly Glu Ile Ser Phe Leu His 500 505 510 Ala Asp Asp Glu Met Asn Tyr Leu Ile Tyr Lys Lys Thr Asp Gly Asp 515 520 525 Glu Thr Val Leu Val Ile Ile Asn Arg Ser Asp Gln Lys Ala Asp Ile 530 535 540 Pro Ile Pro Leu Asp Ala Arg Gly Thr Trp Leu Val Asn Leu Leu Thr 545 550 555 560 Gly Glu Arg Phe Ala Ala Glu Ala Glu Thr Leu Cys Thr Ser Leu Pro 565 570 575 Pro Tyr Gly Phe Val Leu Tyr Ala Ile Glu His Trp 580 585 <210> 2 <211> 587 <212> PRT <213> Alkalophillic Bacillus sp. A2-5a <400> 2 Met Leu Lys Glu Ala Ile Tyr His Arg Pro Lys Asn Asn Tyr Ala Tyr 1 5 10 15 Ala Tyr Ser Lys Asp Thr Leu His Ile Arg Leu Arg Thr Lys Lys Asn 20 25 30 Asp Leu Thr Gln Val Glu Leu Leu Tyr Ala Asp Pro Tyr Asn Trp Asn 35 40 45 Glu Asp Gly Trp Leu Tyr Glu Gln Lys Thr Met Arg Leu Glu Ala Ser 50 55 60 Asp His Leu Phe Asp Tyr Trp Ile Ile Asp Val Thr Val Pro Tyr Arg 65 70 75 80 Arg Leu Arg Tyr Gly Phe Lys Leu Thr Ser Glu Asp Glu Thr Leu Tyr 85 90 95 Tyr Thr Glu Lys Gly Phe Tyr Glu Thr Ala Pro Thr Asp Asp Thr Ala 100 105 110 Tyr Tyr Phe Cys Phe Pro Phe Ile Asn Pro Val Asp Ile Phe Gln Ala 115 120 125 Pro Glu Trp Val Lys Lys Thr Val Trp Tyr Gln Ile Phe Pro Glu Arg 130 135 140 Phe Ala Asn Gly Asp Ser Ser Ile Asn Pro Ala Ser Thr Leu Pro Trp 145 150 155 160 Gly Ser Thr Glu Ala Thr Pro Thr Asn Phe Phe Gly Gly Asp Phe Glu 165 170 175 Gly Ile Leu Asn His Leu Asp Tyr Leu Val Asp Leu Gly Ile Asn Gly 180 185 190 Ile Tyr Phe Thr Pro Ile Phe Lys Ala Lys Ser Asn His Lys Tyr Asp 195 200 205 Thr Ile Asp Tyr Met Glu Ile Asp Pro Gln Phe Gly Asp Lys Glu Thr 210 215 220 Phe Arg Lys Leu Val Asn Ala Cys His Glu Lys Gly Ile Lys Ile Met 225 230 235 240 Leu Asp Ala Val Phe Asn His Ser Gly Tyr Tyr Phe Glu Ala Phe Gln 245 250 255 Asp Val Leu Lys His Gln Glu Gln Ser Lys Tyr Lys Asp Trp Phe His 260 265 270 Ile Arg Asp Phe Pro Val Thr Pro Gly Pro Lys Pro Asn Tyr Asp Thr 275 280 285 Phe Gly Phe Val Glu Tyr Met Pro Lys Leu Asn Thr Glu Asn Gln Glu 290 295 300 Val Lys Asp Tyr Leu Leu Lys Val Ala Arg Tyr Trp Ile Glu Glu Phe 305 310 315 320 Asn Ile Asp Gly Trp Arg Leu Asp Val Ala Asn Glu Val Asp His Gln 325 330 335 Phe Trp Arg Asp Phe Arg Arg Glu Val Lys Thr Ile Asn Pro Asp Val 340 345 350 Tyr Ile Leu Gly Glu Ile Trp His Asp Ser Met Pro Trp Leu Gln Gly 355 360 365 Asp Gln Phe Asp Ala Val Met Asn Tyr Pro Phe Thr Val Ala Ala Leu 370 375 380 Asp Tyr Ile Ala Lys Asp Lys Ile Asn Ala Glu Glu Phe Ala His Gln 385 390 395 400 Leu Thr Asp Val Leu Cys Ser Tyr Pro Ala Asn Ile His Glu Val Thr 405 410 415 Phe Asn Leu Leu Gly Ser His Asp Thr Ala Arg Val Leu Thr Val Cys 420 425 430 Lys Asp Asn Lys Glu Lys Thr Lys Leu Leu Tyr Leu Leu Leu Leu Ser 435 440 445 Ser Lys Gly Ser Pro Cys Ile Phe Tyr Gly Glu Glu Ile Gly Met Ala 450 455 460 Gly Glu Asn Asp Pro Gly Cys Arg Asp Cys Met Ile Trp Glu Glu Asp 465 470 475 480 Gln Gln Asp Leu Glu Phe Lys Ala Phe Ile Lys Lys Cys Ile Glu Leu 485 490 495 Arg Lys Thr Glu Pro Ala Phe Ser Ser Glu Ala Ser Phe Glu Ile Val 500 505 510 Glu Ala Asn Thr Glu Ser Asn His Leu Ile Tyr Ala Arg Glu Leu Asp 515 520 525 Gly Glu Arg Ile Tyr Phe Val Ile Asn Pro Thr Glu Gln Pro Ile Thr 530 535 540 Val Thr Leu Pro Ile Asp Pro Thr Gly Gln Gln Ile Lys Asp Ala Trp 545 550 555 560 Thr Asp Lys Ser Ile Glu Ala Val Asp Asn Lys Val Thr Met Asp Ile 565 570 575 Ser Ala Thr Gly Phe Gly Val Ile Lys Val Ile 580 585 <210> 3 <211> 578 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 3 Met Ile Glu Leu Ala Ala Ile His His Gln Pro Phe Asn Ser Asp Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Tyr Asn Gly Arg Thr Leu His Ile Lys Ile Arg Thr Lys Lys 20 25 30 Asp Asp Ala Glu His Val Ala Trp Phe Gly Ala Ile Leu Thr Asn Thr 35 40 45 Pro Ala His Met Glu Ser Glu Arg Ala Tyr Val Ala Lys Ile Gly Arg 50 55 60 Asn Lys Gln Pro Met Ile Thr Gly Leu Pro Lys Cys Gly Leu His Ser 65 70 75 80 Gly Ser Ala Ile Arg Ile Tyr Leu Thr Ala Leu Met Ile Glu Thr Leu 85 90 95 Phe Thr Glu Ala Met Val His Val Arg Phe Arg Tyr Arg Gln Thr His 100 105 110 Val Leu Asn Phe Arg Leu Phe Met Arg Gln Thr Arg Leu Met His Arg 115 120 125 Leu Gly Gln Ile Asn Arg Leu Val Ser Asn Phe Ser Gly Ala Phe Arg 130 135 140 Ala Gly Gly Lys Ile Cys Ser Gly Lys Pro Leu Pro Trp Gly Arg Lys 145 150 155 160 Asp Pro Glu Ala His Asp Phe Phe Gly Gly His Leu Gln Gly Ile Met 165 170 175 Thr Ser Trp Thr Ile Trp Lys Thr Trp Gly Glu Ala Gly Ile Tyr Leu 180 185 190 Thr Pro Ile Phe Ala Ala Pro Ser Asn His Lys Tyr Asp Thr Leu Asp 195 200 205 Tyr Cys Ser Ile Asp Pro His Phe Gly Asp Glu Glu Leu Phe Arg Thr 210 215 220 Val Val Ser Arg Ile His Glu Arg Gly Met Lys Ile Met Leu Asp Ala 225 230 235 240 Val Phe Asn His Ile Gly Thr Ser Gln Glu Trp Gln Asp Val Val Lys 245 250 255 Asn Gly Glu Thr Ser Arg Tyr Lys Asp Trp Phe Ile Phe Ile Leu Ser 260 265 270 Leu Leu Lys Lys Ala Ala Met Ile His Leu Arg Leu Val Pro Arg Cys 275 280 285 Arg Ser Ser Ile Ala Gly Thr Arg Lys Phe Arg Leu Ile Cys Leu Ile 290 295 300 Leu Arg Cys Thr Gly Ser Ala Asn Leu Ile Ser Thr Ala Gly Val Trp 305 310 315 320 Met Trp Gln Met Lys Leu Ile Met Arg Phe Gly Arg Asn Ser Gly Lys 325 330 335 Pro Ser Pro Glu Lys Pro Asp Ile Phe Ile Leu Gly Glu Ile Trp His 340 345 350 Gln Ala Asp Pro Trp Leu Arg Gly Asp Glu Phe His Ile Gly His Glu 355 360 365 Leu Pro Val His Arg Thr Asp Asp Ser Leu Phe Phe Arg Arg Ile Asp 370 375 380 Phe Ser Ser Gln Ile Ala Ser Arg Ile Asn Ser Gln Lys Met Ser Gly 385 390 395 400 Met Lys Gln Val Lys Glu Val Met Leu Asn Leu Leu Asp Ser His Glu 405 410 415 Arg Ile Leu Thr Arg Cys Gly Gly Asp Gln Arg Lys Gly Ala Arg Leu 420 425 430 Phe Trp His Ser Cys Leu Leu Arg Gln Gly Arg Ile Tyr Tyr Pro Arg 435 440 445 Lys Ser Gly Phe Thr Ala Ala Met Ile His Cys Ala Gly Ser Ala Trp 450 455 460 Phe Gly Lys Arg Lys Asn Arg Ile Lys Arg Cys Leu Ala Phe Met Lys 465 470 475 480 Pro Leu Ile Ala Leu Arg Lys Gln Glu Asn Asp Val Leu Thr Tyr Gly 485 490 495 Ala Leu Glu Trp Lys Leu Val Asp Asp Gln Asn Asp Phe Val Ser Phe 500 505 510 Ser Arg Thr His Glu Gly Lys Glu Leu Ile Tyr Phe Phe His Gln Gly 515 520 525 Arg Glu Val Arg Arg Val Arg Leu Arg Asp Leu Lys Ile Ala Ser Asp 530 535 540 Lys Arg Ile Tyr Asp Ala Trp Thr Glu Glu Ala Leu His Asp Asp Asp 545 550 555 560 Val Val Asp Ile Gln Pro Gly Asp Phe Ser Phe Leu Gly Arg Ser Lys 565 570 575 Phe Cys <210> 4 <211> 591 <212> PRT <213> Bacillus sphaericus <400> 4 Met Ile Met Leu Glu Ala Val Tyr His Arg Met Gly Gln Asn Trp Ser 1 5 10 15 Tyr Ala Tyr Asn Asp Ser Thr Leu His Ile Arg Ile Arg Thr Lys Arg 20 25 30 Asp Asn Val Pro Arg Ile Asp Leu His Cys Gly Glu Lys Tyr Asp Pro 35 40 45 Glu Lys Tyr Lys Glu Thr Ile Pro Met Glu Arg Met Ala Ser Asp Gly 50 55 60 Leu Phe Asp Tyr Trp Gln Ala Ala Val Gln Pro Arg Tyr Arg Arg Leu 65 70 75 80 Val Tyr Tyr Phe Ala Leu His Ser Asp Asn Gly Asp Ala Val Tyr Phe 85 90 95 Met Glu Lys Gly Phe Phe Asp Gln Pro Pro Lys Val Met Tyr Glu Gly 100 105 110 Leu Phe Asp Phe Pro Tyr Leu Asn Arg Gln Asp Val His Thr Pro Pro 115 120 125 Ala Trp Val Lys Glu Ala Ile Phe Tyr Gln Ile Phe Pro Glu Arg Phe 130 135 140 Ala Asn Gly Asp Pro Ser Asn Asp Pro Glu Gly Val Gln Glu Trp Gly 145 150 155 160 Gly Thr Pro Ser Ala Gly Asn Phe Phe Gly Gly Asp Leu Gln Gly Val 165 170 175 Ile Asp His Leu Asp Tyr Leu Ser Asp Leu Gly Val Asn Ala Leu Tyr 180 185 190 Phe Asn Pro Leu Phe Ala Ala Thr Thr Asn His Lys Tyr Asp Thr Ala 195 200 205 Asp Tyr Met Lys Ile Asp Pro Gln Phe Gly Thr Asn Glu Lys Leu Lys 210 215 220 Glu Leu Val Asp Ala Cys His Ala Arg Gly Met Arg Val Leu Leu Asp 225 230 235 240 Ala Val Phe Asn His Cys Gly His Thr Phe Pro Pro Phe Val Asp Val 245 250 255 Leu Asn Asn Gly Leu Asn Ser Arg Tyr Ala Asp Trp Phe His Val Arg 260 265 270 Glu Trp Pro Leu Arg Val Val Asp Gly Ile Pro Thr Tyr Asp Thr Phe 275 280 285 Ala Phe Glu Pro Ile Met Pro Lys Leu Asn Thr Gly Asn Glu Glu Val 290 295 300 Lys Ala Tyr Leu Leu Asn Val Gly Arg Tyr Trp Leu Glu Glu Met Gly 305 310 315 320 Leu Asp Gly Trp Arg Leu Asp Val Ala Asn Glu Val Asp His Gln Phe 325 330 335 Trp Arg Glu Phe Arg Ser Glu Ile Lys Arg Ile Asn Pro Ser Ala Tyr 340 345 350 Ile Leu Gly Glu Ile Met His Asp Ser Met Pro Trp Leu Gln Gly Asp 355 360 365 Gln Phe Asp Ala Val Met Asn Tyr Pro Phe Thr Asn Ile Leu Leu Asn 370 375 380 Phe Phe Ala Arg Arg Leu Thr Asn Ala Ala Glu Phe Ala Gln Ala Ile 385 390 395 400 Gly Thr Gln Leu Ala Gly Tyr Pro Gln Gln Val Thr Glu Val Ser Phe 405 410 415 Asn Leu Leu Gly Ser His Asp Thr Thr Arg Leu Leu Thr Leu Cys Ser 420 425 430 Gly Asn Val Glu Arg Met Lys Leu Ala Thr Leu Phe Gln Leu Thr Tyr 435 440 445 Gln Gly Thr Pro Cys Ile Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Met Asp Gly 450 455 460 Glu Tyr Asp Pro Leu Asn Arg Lys Cys Met Glu Trp Asp Lys Ser Lys 465 470 475 480 Gln Asn Thr Glu Leu Leu Ala Phe Phe Arg Ser Met Ile Ser Leu Arg 485 490 495 Lys Ala His Pro Ala Leu Arg Gly Ser Gly Leu Arg Phe Leu Pro Val 500 505 510 Leu Glu His Pro Gln Leu Leu Val Tyr Glu Arg Trp Asp Asp Asn Glu 515 520 525 Arg Phe Leu Ile Met Leu Asn Asn Glu Asp Ala Pro Val Asn Val Val 530 535 540 Ile Pro Ala Ala Gln Pro Gly Ala Ser Trp Arg Thr Val Asn Gly Glu 545 550 555 560 Pro Cys Ala Val Val Glu Glu Ser Ser Ile Gln Ala Ala Leu Pro Pro 565 570 575 Tyr Gly Tyr Ala Ile Leu His Ala Pro Ile Ala Gly Thr Ala Glu 580 585 590 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for amplification of BLMA gene from Bacillus licheniformis ATCC 27811 <400> 5 cttgaattct taacagaatt tagaccgc 28 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for amplification of BLMA gene from Bacillus licheniformis ATCC 27811 <400> 6 tggcatatga tcgaattagc agcgatac 28 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for amplification of CDase gene from Alkalophillic Bacillus sp. A2-5a <400> 7 ttcggtacct taaatcacct ttataacacc 30 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for amplification of CDase gene from Alkalophillic Bacillus sp. A2-5a <400> 8 tggccatggt aaaagaagcg attta 25

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】市販のアミロースおよびアミロペクチンを用
いて作製した人工デンプンにおけるＮＰＬの作用を示す
ゲル濾過分析の結果を示す図である。

【図１Ｂ】市販のアミロースおよびアミロペクチンを用
いて作製した人工デンプンにおけるＢＳＡの作用を示す
ゲル濾過分析の結果を示す図である。

【図１Ｃ】市販のアミロースおよびアミロペクチンを用
いて作製した人工デンプンにおけるＢＬＡの作用を示す
ゲル濾過分析の結果を示す図である。

【図２Ａ】アミロースを種々のアミラーゼで処理した結
果を示す薄層クロマトグラフ写真である。

【図２Ｂ】アミロペクチンを種々のアミラーゼで処理し
た結果を示す薄層クロマトグラフ写真である。

【図３】種々のアミラーゼによるアミロースの分解率お
よび酵素分解によるアミロース減少を示すグラフであ
る。

【図４Ａ】ＮＰＬ０．０７ｍｇ／ｍｌ濃度溶液を用いて
アミロースおよびアミロペクチンを処理した際のこれら
アミロースおよびアミロペクチンの分解の結果を示すグ
ラフである。

【図４Ｂ】ＮＰＬ０．１４ｍｇ／ｍｌ濃度溶液を用いて
アミロースおよびアミロペクチンを処理した際のこれら
アミロースおよびアミロペクチンの分解の結果を示すグ
ラフである。

【図４Ｃ】ＮＰＬ０．３５ｍｇ／ｍｌ濃度溶液を用いて
アミロースおよびアミロペクチンを処理した際のこれら
アミロースおよびアミロペクチンの分解の結果を示すグ
ラフである。

【図４Ｄ】ＮＰＬ０．７ｍｇ／ｍｌ濃度溶液を用いてア
ミロースおよびアミロペクチンを処理した際のこれらア
ミロースおよびアミロペクチンの分解の結果を示すグラ
フである。

【図４Ｅ】ＢＳＡ１．７５μｇ／ｍｌ濃度溶液を用いて
アミロースおよびアミロペクチンを処理した際のこれら
アミロースおよびアミロペクチンの分解の結果を示すグ
ラフである。

【図４Ｆ】ＢＳＡ３．５μｇ／ｍｌ濃度溶液を用いてア
ミロースおよびアミロペクチンを処理した際のこれらア
ミロースおよびアミロペクチンの分解の結果を示すグラ
フである。

【図４Ｇ】ＢＳＡ１０．０μｇ／ｍｌ濃度溶液を用いて
アミロースおよびアミロペクチンを処理した際のこれら
アミロースおよびアミロペクチンの分解の結果を示すグ
ラフである。

【図４Ｈ】ＢＳＡ２０．０μｇ／ｍｌ濃度溶液を用いて
アミロースおよびアミロペクチンを処理した際のこれら
アミロースおよびアミロペクチンの分解の結果を示すグ
ラフである。

【図５Ａ】種々のアミラーゼによるデンプンの処理にお
ける、ソモギ・ネルソン法によるデンプンの分解率の結
果を示すグラフである。

【図５Ｂ】種々のアミラーゼによるデンプンの処理にお
ける、ヨード呈色反応によるデンプン中のアミロースの
減少を示すグラフである。

【図６Ａ】ＮＰＬ処理によるデンプンの分解率を示すグ
ラフである。

【図６Ｂ】ＮＰＬ処理によるデンプンのヨード呈色減少
度を示すグラフである。

【図６Ｃ】ＮＰＬにおけるデンプン分解率に対するヨー
ド呈色減少度を示すグラフである。

【図６Ｄ】ＮＯＶＡＭＹＬ処理によるデンプンの分解率
を示すグラフである。

【図６Ｅ】ＮＯＶＡＭＹＬ処理によるデンプンのヨード
呈色減少度を示すグラフである。

【図６Ｆ】ＮＯＶＡＭＹＬにおけるデンプン分解率に対
するヨード呈色減少度を示すグラフである。

【図７Ａ】ＮＰＬおよびＢＳＡで処理したデンプンの粘
度を示すグラフである。

【図７Ｂ】ＮＰＬおよびＢＳＡで処理したデンプンの濁
度を示すグラフである。

【図８】種々のアミラーゼのアミロースまたはアミロペ
クチンへの反応性を示すグラフである。

【図９】低分子受容体の存在下におけるＮＰＬのアミロ
ペクチンへの作用に与える影響を表すグラフである。

【図１０Ａ】ジャガイモデンプンにおけるＮＰＬ作用の
経時的なデンプン中のアミロースおよびアミロペクチン
の含量、ならびに分解率を示すグラフである。

【図１０Ｂ】コムギデンプンにおけるＮＰＬ作用の経時
的なデンプン中のアミロースおよびアミロペクチンの含
量、ならびに分解率を示すグラフである。

【図１０Ｃ】ウルチゴメデンプンにおけるＮＰＬ作用の
経時的なデンプン中のアミロースおよびアミロペクチン
の含量、ならびに分解率を示すグラフである。

【図１０Ｄ】タピオカデンプンにおけるＮＰＬ作用の経
時的なデンプン中のアミロースおよびアミロペクチンの
含量、ならびに分解率を示すグラフである。

【図１０Ｅ】トウモロコシデンプンにおけるＮＰＬ作用
の経時的なデンプン中のアミロースおよびアミロペクチ
ンの含量、ならびに分解率を示すグラフである。

【図１０Ｆ】モチトウモロコシデンプンにおけるＮＰＬ
作用の経時的なデンプン中のアミロースおよびアミロペ
クチンの含量、ならびに分解率を示すグラフである。

【図１１Ａ】ジャガイモにおけるデンプンの分子量の累
積重量分率を表すグラフである。

【図１１Ｂ】ジャガイモにおける酵素処理時間に対する
デンプンの分子量の変化を示すグラフである。

【図１１Ｃ】コムギにおけるデンプンの分子量の累積重
量分率を表すグラフである。

【図１１Ｄ】コムギにおける酵素処理時間に対するデン
プンの分子量の変化を示すグラフである。

【図１１Ｅ】タピオカにおけるデンプンの分子量の累積
重量分率を表すグラフである。

【図１１Ｆ】タピオカにおける酵素処理時間に対するデ
ンプンの分子量の変化を示すグラフである。

【図１１Ｇ】ウルチゴメにおけるデンプンの分子量の累
積重量分率を表すグラフである。

【図１１Ｈ】ウルチゴメにおける酵素処理時間に対する
デンプンの分子量の変化を示すグラフである。

【図１１Ｉ】トウモロコシにおけるデンプンの分子量の
累積重量分率を表すグラフである。

【図１１Ｊ】トウモロコシにおける酵素処理時間に対す
るデンプンの分子量の変化を示すグラフである。

【図１１Ｋ】モチトウモロコシにおけるデンプンの分子
量の累積重量分率を表すグラフである。

【図１１Ｌ】モチトウモロコシにおける酵素処理時間に
対するデンプンの分子量の変化を示すグラフである。

【図１２Ａ】アミロペクチンのみの場合における、ＮＰ
Ｌでの反応後の基質の量の変化および分解率を示すグラ
フである。

【図１２Ｂ】アミロペクチンおよびアミロース混合物の
場合における、ＮＰＬでの反応後の基質の量の変化およ
び分解率を示すグラフである。

【図１２Ｃ】アミロペクチンのみの場合における、ＮＰ
Ｌ処理したアミロペクチンの分子量の累積重量分率を表
すグラフである。

【図１２Ｄ】アミロペクチンのみの場合における、ＮＰ
Ｌ処理したアミロペクチンの処理時間に対する分子量の
変化を示すグラフである。

【図１２Ｅ】アミロペクチンおよびアミロース混合物に
おける、ＮＰＬ処理したアミロペクチンの分子量の累積
重量分率を表すグラフである。

【図１２Ｆ】アミロペクチンおよびアミロース混合物に
おける、ＮＰＬ処理したアミロペクチンの処理時間に対
する分子量の変化を示すグラフである。

【図１３】ＮＰＬ処理によるデンプンの冷凍−解凍サイ
クルにおける濁度の変化を示すグラフである。

【図１４Ａ】ＮＰＬ作用時のデンプン中のアミロースお
よびアミロペクチンのヨード呈色法により定量した含量
の経時変化および分解率を示すグラフである。

【図１４Ｂ】ＮＰＬ作用時のデンプン中のｎ−ブタノー
ルにより分画後定量したアミロースおよびアミロペクチ
ン、および低分子画分の含量の経時変化を示すグラフで
ある。

【図１４Ｃ】ＮＰＬ作用時のアミロースおよびアミロペ
クチンのそれぞれの別個に求めた各重量平均分子量の経
時変化を示すグラフである。

【図１５Ａ】本発明の方法で使用され得る酵素である、
ＮＰＬ、Ａ２−５ａＣＤａｓｅ、ＢＳＣＤａｓｅおよ
びＢＬＭＡの配列のアラインメントを示す図である。

【図１５Ｂ】図１５Ａの続きであり、本発明の方法で使
用され得る酵素である、ＮＰＬ、Ａ２−５ａＣＤａｓ
ｅ、ＢＳＣＤａｓｅおよびＢＬＭＡの配列のアラインメ
ントを示す図である。

【図１６Ａ】市販のアミロースおよびアミロペクチンを
用いて作製した人工デンプンにおけるＡ２−５ａＣＤ
ａｓｅの作用を示すゲル濾過分析の結果を示す図であ
る。

【図１６Ｂ】市販のアミロースおよびアミロペクチンを
用いて作製した人工デンプンにおけるＢＬＭＡの作用を
示すゲル濾過分析の結果を示す図である。

【図１７】アミロースをＡ２−５ａＣＤａｓｅ、ＢＬ
ＭＡ、またはＮＰＬで処理した結果を示す薄層クロマト
グラフ写真である。

【図１８Ａ】Ａ２−５ａＣＤａｓｅによるアミロース
またはアミロペクチンの分解率および酵素分解によるア
ミロースまたはアミロペクチンの減少を示すグラフであ
る（上方のグラフがアミロースを示し、下方のグラフが
アミロペクチンを示す）。

【図１８Ｂ】ＢＬＭＡによるアミロースまたはアミロペ
クチンの分解率および酵素分解によるアミロースまたは
アミロペクチンの減少を示すグラフである（上方のグラ
フがアミロースを示し、下方のグラフがアミロペクチン
を示す）。

【図１９Ａ】Ａ２−５ａＣＤａｓｅ０．２２５ｍｇ／
ｍｌ濃度溶液を用いてアミロースおよびアミロペクチン
を処理した際のこれらアミロースおよびアミロペクチン
の分解の結果を示すグラフである。

【図１９Ｂ】Ａ２−５ａＣＤａｓｅ０．４５ｍｇ／ｍ
ｌ濃度溶液を用いてアミロースおよびアミロペクチンを
処理した際のこれらアミロースおよびアミロペクチンの
分解の結果を示すグラフである。

【図１９Ｃ】Ａ２−５ａＣＤａｓｅ２．２５ｍｇ／ｍ
ｌ濃度溶液を用いてアミロースおよびアミロペクチンを
処理した際のこれらアミロースおよびアミロペクチンの
分解の結果を示すグラフである。

【図１９Ｄ】ＢＬＭＡ０．５２５ｍｇ／ｍｌ濃度溶液を
用いてアミロースおよびアミロペクチンを処理した際の
これらアミロースおよびアミロペクチンの分解の結果を
示すグラフである。

【図１９Ｅ】ＢＬＭＡ１．０５ｍｇ／ｍｌ濃度溶液を用
いてアミロースおよびアミロペクチンを処理した際のこ
れらアミロースおよびアミロペクチンの分解の結果を示
すグラフである。

【図１９Ｆ】ＢＬＭＡ２．１ｍｇ／ｍｌ濃度溶液を用い
てアミロースおよびアミロペクチンを処理した際のこれ
らアミロースおよびアミロペクチンの分解の結果を示す
グラフである。

【図１９Ｇ】ＢＬＭＡ５．２５ｍｇ／ｍｌ濃度溶液を用
いてアミロースおよびアミロペクチンを処理した際のこ
れらアミロースおよびアミロペクチンの分解の結果を示
すグラフである。

【図２０】Ａ２−５ａＣＤａｓｅおよびＢＬＭＡのア
ミロースまたはアミロペクチンへの反応性を示すグラフ
である。

【図２１Ａ】Ａ２−５ａＣＤａｓｅ作用の経時的なジ
ャガイモデンプン中のアミロースおよびアミロペクチン
の含量、ならびに分解率を示すグラフである。

【図２１Ｂ】Ａ２−５ａＣＤａｓｅ作用の経時的なモ
チトウモロコシデンプン中のアミロペクチンの含量、な
らびに分解率を示すグラフである。

【図２２Ａ】ＢＬＭＡ作用の経時的なジャガイモデンプ
ン中のアミロースおよびアミロペクチンの含量、ならび
に分解率を示すグラフである。

【図２２Ｂ】ＢＬＭＡ作用の経時的なモチトウモロコシ
デンプン中のアミロースおよびアミロペクチンの含量、
ならびに分解率を示すグラフである。

【図２３Ａ】Ａ２−５ａＣＤａｓｅまたはＢＬＭＡを
作用させたジャガイモデンプンにおける酵素処理時間に
対する分子量の変化を示すグラフである。

【図２３Ｂ】Ａ２−５ａＣＤａｓｅまたはＢＬＭＡを
作用させたモチトウモロコシデンプンにおける酵素処理
時間に対する分子量の変化を示すグラフである。

【図２４】市販のアミロペクチンに対してＡ２−５ａ
ＣＤａｓｅまたはＢＬＭＡを作用させた場合の重量平均
分子量の変化を示すグラフである。

【図２５Ａ】実施例２２の実験１）および２）で得られ
た、ジャガイモデンプンにおけるアミロース／アミロペ
クチン定量および分解率の結果を示すグラフである。

【図２５Ｂ】実施例２２の実験１）および２）で得られ
た、モチトウモロコシデンプンにおけるアミロース／ア
ミロペクチン定量および分解率の結果を示すグラフであ
る。

【図２６】実施例２２の実験３）で得られた重量平均分
子量を示すグラフである。

【図２７】実施例２２の実験４）で得られたＴＬＣ分析
写真である。

【図２８】実施例２２の実験５）で得られたＮＰＬ作用
時のデンプン中のｎ−ブタノールにより分画後定量した
アミロースおよび低分子画分の含量の経時変化を示すグ
ラフである。

【図２９Ａ】実施例２２の実験６）で得られた種々の濃
度のＮＰＬ処理によるジャガイモデンプンの老化の結果
を示すグラフである。

【図２９Ｂ】実施例２２の実験６）で得られた種々の濃
度のＮＰＬ処理によるモチトウモロコシデンプンの老化
の結果を示すグラフである。

【図３０Ａ】実施例２２の実験７）で得られた種々の濃
度のＮＰＬ処理によるジャガイモデンプンの老化の結果
を示すグラフである。

【図３０Ｂ】実施例２２の実験７）で得られた種々の濃
度のＮＰＬ処理によるモチトウモロコシデンプンの老化
の結果を示すグラフである。

【図３１Ａ】実施例２２の実験８）で得られたジャガイ
モデンプンのサンプル１の結果を示すグラフである。

【図３１Ｂ】実施例２２の実験８）で得られたジャガイ
モデンプンのサンプル６の結果を示すグラフである。

【図３１Ｃ】実施例２２の実験８）で得られたモチトウ
モロコシデンプンのサンプル１の結果を示すグラフであ
る。

【図３１Ｄ】実施例２２の実験８）で得られたモチトウ
モロコシデンプンのサンプル６の結果を示すグラフであ
る。

【図３２】実施例２３におけるアミロペクチンの鎖長分
析の結果を示すグラフである（Ａ：モチトウモロコシデ
ンプンのサンプル１；Ｂ：モチトウモロコシデンプンの
サンプル９；Ｃ：ジャガイモデンプンのサンプル１；お
よびＤ：ジャガイモデンプンのサンプル９）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ２３Ｌ 1/10 Ａ２３Ｌ 1/10 Ｂ１０２１０２ 1/16 1/16 Ａ 2/52 Ｃ０８Ｂ 31/00 Ｃ０８Ｂ 31/00 Ｃ１２Ｎ 9/28 Ｃ１２Ｎ 9/28 9/46 9/46 Ｃ１２Ｐ 19/16 Ｃ１２Ｐ 19/16 (Ｃ１２Ｐ 19/14 Ｚ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 19/14 (Ｃ１２Ｐ 19/14 Ｃ１２Ｒ 1:07）Ｃ１２Ｒ 1:10） (Ｃ１２Ｐ 19/14 (Ｃ１２Ｎ 9/28 Ｃ１２Ｒ 1:10）Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/28 (Ｃ１２Ｎ 9/28 Ｃ１２Ｒ 1:07）Ｃ１２Ｒ 1:10） (Ｃ１２Ｎ 9/28 (Ｃ１２Ｎ 9/46 Ｃ１２Ｒ 1:10）Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/46 (Ｃ１２Ｐ 19/16 Ｃ１２Ｒ 1:07）Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 19/16 ）Ｃ１２Ｒ 1:07） 1:10） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＡ２３Ｌ 2/00 ＥＣ１２Ｒ 1:07）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:07）Ｃ１２Ｒ 1:10） 1:10）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】改変デンプンを製造する方法であって、
デンプンを、アミロースへの酵素活性に対するアミロペ
クチンへの酵素活性の比が０．５未満である酵素で処理
する工程を包含する、方法。
【請求項２】前記酵素が、以下の両方の特性を有す
る：（ｉ）アミロースに作用させたとき、１０００以下の分
子量を有する生成物が得られる；および（ｉｉ）アミロ
ペクチン５０〜１００重量％およびアミロース０〜５０
重量％から構成される基質に作用させた後のアミロペク
チンからの生成物が１×１０⁶以上の重量平均分子量を
有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記酵素が、Ｎ末端側から順にαアミラ
ーゼファミリー酵素における高度保存領域１、２、３お
よび４を含むアミノ酸配列で構成され、該αアミラーゼ
ファミリー酵素における領域１がＮ末端から２３９〜２
４２番目のアミノ酸位置またはこの位置と実質的に同等
な位置で開始する場所に存在する、請求項１に記載の方
法。
【請求項４】前記酵素がネオプルラナーゼである、請
求項３に記載の方法。
【請求項５】前記ネオプルラナーゼが、Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の酵
素である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】前記酵素がシクロデキストリナーゼであ
る、請求項３に記載の方法。
【請求項７】前記シクロデキストリナーゼが、寄託番
号ＦＥＲＭ−Ｐ−１３８６４のアルカリ耐性Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓｓｐ．Ａ２−５ａ株に由来の酵素である、請求
項６に記載の方法。
【請求項８】前記酵素がマルトース生成アミラーゼで
ある、請求項３に記載の方法。
【請求項９】前記マルトース生成アミラーゼが、Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓに由来の酵
素である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】前記デンプンが、ジャガイモ、サツマ
イモ、キャッサバ、トウモロコシ、コムギおよびウルチ
ゴメからなる群から選択される植物に由来する、請求項
１に記載の方法。
【請求項１１】前記デンプンが、モチゴメ、モチトウ
モロコシ、モチコムギからなる群から選択される植物に
由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】前記改変デンプンが、前記デンプンに
比べて低粘性かつ難老化性である、請求項１に記載の方
法。
【請求項１３】前記改変デンプンが、前記デンプンに
比べて易老化性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】請求項１から１３のいずれかに記載の
方法により製造される、改変デンプン。
【請求項１５】請求項１４に記載の改変デンプンを含
有する食品。
【請求項１６】前記食品が、炊飯米、餅、高デンプン
飲料、焼成菓子、ガム・キャンデー、和菓子、および麺
からなる群から選択される、請求項１５に記載の食品。