CN112904020A - Fam172a在筛查和治疗糖尿病大血管病变中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了FAM172A在筛查和治疗动脉粥样硬化等糖尿病大血管病变中的应用，具体地，提供了检测血清中FAM172A表达的试剂在制备筛查动脉粥样硬化产品中的应用以及FAM172A在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。本发明首次提出血清中FAM172A检测在动脉粥样硬化筛查中的应用，为临床动脉粥样硬化的筛查提供一种简便可靠的方法，实现动脉粥样硬化发病风险的有效预估，以便于对其进行早期预防和干预。此外，基于FAM172A可抑制动脉粥样硬化进展及维持斑块的稳定性，也为治疗动脉粥样硬化以及相关疾病提供了新的策略。

Description

FAM172A在筛查和治疗糖尿病大血管病变中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及FAM172A在筛查和治疗糖尿病大血管病变中的应用。
背景技术
糖尿病是严重危害人类健康的全身性代谢疾病，给全球带来巨大经济及健康负担。随着生活方式的改变以及人口老龄化的加剧，糖尿病已成为我国继肿瘤、心血管疾病之后的第3位慢性非传染性疾病。据统计，我国糖尿病患病率已从1980年的0.67％上升至2013年的10.4％。中国已经成为世界上糖尿病人数最多的国家，患病人数约1亿，疾病负担沉重。
糖尿病对健康的危害主要是长期慢性高血糖所致的多种慢性并发症，可引起失明、肾衰竭、脑血管意外、心肌梗死、截肢等严重后果，严重影响人群的生存质量。糖尿病大血管病变又是糖尿病的主要并发症之一，其主要病理变化表现为动脉粥样硬化，是糖尿病患者致死、致残的主要原因。因此早期评估糖尿病大血管病变风险，并及时干预以减少其引发的心脑血管并发症如脑卒中意义重大。目前有遗传分析及基因评估等方法来预测个体的糖尿病大血管病变风险，复杂且花费较高。寻找可靠的糖尿病大血管病变血清分子标志物十分重要。
FAM172A蛋白是从人主动脉组织中首次克隆得出的一种新蛋白，其编码基因高度保守，定位于染色体5q15。该蛋白广泛表达于多种组织，其中，主动脉组织中表达量较高。已知该蛋白含有Arb2结构域，与H3组蛋白第9位赖氨酸(H3K9)的甲基化有关。研究表明FAM172A蛋白参与细胞增殖与凋亡的调控，既往曾报道FAM172A蛋白可促进甲状腺乳头状癌的发展，而抑制肝癌、结直肠癌的发展，其在癌症中的作用存在争议。该蛋白其他生物学功能尚未完全研究透彻。目前，FAM172A蛋白是分泌蛋白的验证未见报道，并且FAM172A与动脉粥样硬化等糖尿病大血管病变的关系未完全明确。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了FAM172A在筛查和治疗动脉粥样硬化等糖尿病大血管病变中的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了检测FAM172A表达的试剂在制备筛查糖尿病大血管病变产品中的应用。
进一步地，上述糖尿病大血管病变包括动脉粥样硬化。
进一步地，该试剂为检测血清中FAM172A的试剂。
进一步地，上述试剂为通过酶联免疫吸附试验、western blot或蛋白芯片检测方法检测血清中FAM172A的试剂。
第二方面，本发明提供了检测血清中FAM172A表达的试剂在制备筛查糖尿病大血管病变试剂盒中的应用。
进一步地，上述糖尿病大血管病变包括动脉粥样硬化。
第三方面，本发明提供了FAM172A在制备治疗动糖尿病大血管病变药物中的应用。
进一步地，上述糖尿病大血管病变包括动脉粥样硬化。
进一步地，上述药物包括促进FAM172A基因表达的物质。
进一步地，上述药物在施用后，具有以下功能的至少一种：
a.抑制动脉粥样硬化进展；
b.增强动脉粥样硬化斑块的稳定性。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明通过一系列实验证明FAM172A蛋白是分泌蛋白，并且与动脉粥样硬化密切相关；构建了Fam172a全身基因敲除小鼠模型，并且将Fam172a全身敲除小鼠与载脂蛋白敲除(Apoe-/-)小鼠进行杂交，获得Fam172a-/-Apoe-/-小鼠与同窝Fam172a+/+Apoe-/-小鼠；Western diet诱导动脉粥样硬化模型，结果显示FAM172A可抑制动脉粥样硬化进展及维持斑块的稳定性。
本发明首次提出血清中FAM172A检测在动脉粥样硬化等糖尿病大血管病变筛查中的应用，为临床动脉粥样硬化等糖尿病大血管病变的筛查提供一种简便可靠的方法，实现动脉粥样硬化发病风险的有效预估，以便于对其进行早期预防和干预。此外，基于FAM172A可抑制动脉粥样硬化进展及维持斑块的稳定性，也为治疗动脉粥样硬化以及相关疾病提供了新的策略。
附图说明
图1显示了本发明一实施例中Movas细胞培养基中的FAM172A蛋白的分泌量；
图2显示了本发明一实施例中Apoe-/-小鼠血清中的FAM172A蛋白水平；
图3显示了本发明一实施例中甲状腺滤泡癌患者术前和术后血清中的FAM172A蛋白水平；
图4显示了本发明一实施例中小鼠主动脉组织FAM172A敲除效率鉴定结果；
图5显示了本发明一实施例中两组小鼠全主动脉油红O染色图片(图A)及定量统计图(图B)；
图6显示了本发明一实施例中两组小鼠主动脉根部油红O染色图片(图A)及定量统计图(图B)；
图7显示了本发明一实施例中两组小鼠主动脉根部HE染色图片(图A)及定量统计图(图B)；
图8显示了本发明一实施例中两组小鼠主动脉根部Masson染色图片(图A)及定量统计图(图B)；
图9显示了本发明一实施例中两组小鼠主动脉根部CD68免疫组化图片(图A)及定量统计图(图B)；
图10显示了本发明一实施例中两组小鼠主动脉根部α-SMA和SM22α免疫组化结果，其中，图A和B分别为两组小鼠主动脉根部α-SMA免疫组化图片及柱状统计图，图C和D分别为两组小鼠主动脉根部SM22α免疫组化图片及柱状统计图；
图11显示了本发明一实施例中两组小鼠主动脉组织α-SMA和SM22α表达水平；其中，图A为两组小鼠主动脉组织α-SMA和SM22α表达水平的western blot结果，图B和图C分别为α-SMA和SM22α表达水平的统计图；
图12显示了本发明一实施例中CCK-8检测FAM172A对PVSMCs(原代血管平滑肌细胞)细胞增殖的影响；
图13显示了本发明一实施例中FAM172A对PVSMCs增殖的影响；其中，图A和图B分别表示为Ki67和Dapi染色检测细胞增殖水平的免疫荧光图以及柱状统计图；
图14显示了本发明一实施例中FAM172A对PVSMCs迁移的影响；其中，图A和图B分别显示了划痕面积和划痕愈合率。
具体实施方式
本发明提供了FAM172A在筛查和治疗动脉粥样硬化等糖尿病大血管病变中的应用，可实现动脉粥样硬化发病风险的有效预估，以便于对其进行早期预防和干预，也为治疗动脉粥样硬化以及相关疾病提供了新的策略。
下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1
本实施例通过细胞、动物、人体三种水平上证明FAM172A是分泌蛋白，进而证明FAM172A可作为动脉粥样硬化等糖尿病大血管病变血清分子标志物的候选者；具体的操作步骤以及实验结果如下：
(1)细胞水平：收集小鼠主动脉血管平滑肌细胞(Movas)培养24小时后的无血清培养基，离心过滤，超滤管浓缩蛋白后，进行western blot实验，无血清培养基作为阴性参照，Movas细胞蛋白作为阳性参照，检测到Movas细胞培养基中存在FAM172A蛋白，且随着蛋白上样量增多，FAM172A蛋白水平升高(图1)。
(2)动物水平：收集6只Apoe-/-小鼠的血清，进行western blot实验，人甲状腺癌细胞(FTC-133)蛋白作为阳性参照，检测到小鼠血清中存在FAM172A蛋白(图2)。
(3)人体水平：收集7例甲状腺滤泡癌患者术前和术后的血清，进行western blot实验，人甲状腺癌细胞(FTC-133)蛋白作为阳性参照，检测到人血清中存在FAM172A蛋白(图3)。
实施例2
本实施例通过动物实验验证FAM172A可抑制动脉粥样硬化进展及维持斑块的稳定性，具体的操作方法和结果如下：
1.构建Fam172a-/-Apoe-/-小鼠与Fam172a+/+Apoe-/-小鼠并验证
通过Crisper/cas9技术成功构建了Fam172a flox/wt小鼠，与EIIa-Cre工具鼠杂交获得Fam172a-/-小鼠与同窝对照小鼠，再与Apoe-/-小鼠进行杂交获得Fam172a-/-Apoe-/-小鼠与Fam172a+/+Apoe-/-小鼠。
通过PCR及琼脂糖电泳鉴定验证小鼠Fam172a基因敲除成功，成功构建Fam172a-/-Apoe-/-小鼠与Fam172a+/+Apoe-/-小鼠。在蛋白质水平，western blot检测小鼠主动脉组织FAM172A表达水平，结果显示Fam172a+/+Apoe-/-小鼠主动脉组织FAM172A蛋白有较高表达水平，而Fam172a-/-Apoe-/-小鼠主动脉组织并不表达FAM172A蛋白(图4)，成功构建Fam172a-/-Apoe-/-小鼠与Fam172a+/+Apoe-/-小鼠。
2.构建动脉粥硬化动物模型并探究Fam172a与动脉粥样硬化病程的关系
基于Fam172a是否影响动脉粥样硬化病程至今尚未明确，本发明通过构建Fam172a-/-Apoe-/-小鼠与同窝Fam172a+/+Apoe-/-小鼠，western diet诱导的动脉粥样硬化模型，探究Fam172a在动脉粥样硬化中的作用。
(1)雄性Fam172a-/-Apoe-/-小鼠与同窝雄性Fam172a+/+Apoe-/-小鼠于8周开始，western diet持续喂养18周，行全主动脉油红O染色，以全主动脉油红O阳性面积占全主动脉面积百分比(％)反应其斑块形成情况。由图5可知，和Fam172a+/+Apoe-/-组相比，Fam172a-/-Apoe-/-组油红O阳性面积/全主动脉面积显著增加。
(2)对主动脉根部行油红O染色，斑块大小以油红O阳性面积占主动脉瓣总面积百分比(％)来表示。由图6可知，和Fam172a+/+Apoe-/-组相比，Fam172a-/-Apoe-/-组主动脉根部油红O阳性面积显著增加。
(3)对主动脉根部行HE染色。由图7可知，和Fam172a+/+Apoe-/-组相比，Fam172a-/-Apoe-/-组全主动脉斑块面积显著增加。
以上结果均表明，在western diet诱导Apoe-/-小鼠动脉粥样硬化模型上，Fam172a可以发挥抑制动脉粥样硬化进展的作用。
(4)行主动脉根部Masson染色。由图8可知，Fam172a可以增加斑块中的胶原含量，进而增强动脉粥样硬化斑块的稳定性。
(5)不稳定型斑块显著性特征之一是斑块中炎症细胞尤其是大量巨噬细胞的浸润，对主动脉根部行CD68免疫组化，反应小鼠主动脉根部炎症浸润情况。由图9可知，和Fam172a+/+Apoe-/-组相比，Fam172a-/-Apoe-/-组主动脉根部CD68+信号显著增加。因此，Fam172a可以抑制斑块中的巨噬细胞浸润，进而增强动脉粥样硬化斑块的稳定性。
实施例3
本实施例验证Fam172a-/-抑制动脉粥样硬化斑块中血管平滑肌细胞(VSMCs)收缩表型，促进表型转化，具体的操作步骤和实验结果如下：
雄性Fam172a-/-Apoe-/-小鼠与同窝雄性Fam172a+/+Apoe-/-小鼠于8周开始，westerndiet持续喂养18周，对主动脉根部行α-SMA和SM22α免疫组化。由图10可知，与Fam172a+/+Apoe-/-组相比，Fam172a-/-Apoe-/-组主动脉根部α-SMA和SM22α表达水平显著减少。
取主动脉组织，western blot法检测Fam172a-/-对主动脉组织表达α-SMA和SM22α的影响。实验结果显示，与Fam172a+/+Apoe-/-组相比，Fam172a-/-Apoe-/-组主动脉组织中α-SMA表达水平显著减少，SM22α表达水平显著减少，差异具有统计学意义(图11)。结果提示，Fam172a-/-可以促进VSMCs表型转化，减少α-SMA和SM22α含量。
实施例4
本实施例验证Fam172a促进小鼠的PVSMCs增殖，具体的操作步骤和实验结果如下：
取雄性Fam172a-/-Apoe-/-小鼠与同窝雄性Fam172a+/+Apoe-/-小鼠于8周开始，western diet持续喂养18周。提取两组小鼠的PVSMCs，分别应用CCK-8法和免疫荧光法检测FAM172A对PVSMCs增殖的影响。
细胞饥饿24小时后，以CCK-8试剂盒检测PVSMCs OD值。实验结果显示，与Fam172a+/+Apoe-/-组相比，Fam172a-/-Apoe-/-组PVSMCs增殖显著被抑制(图12)。
取PVSMCs爬片，Ki67和Dapi染色检测细胞增殖水平，以Ki67阳性信号(Ki67+)/Dapi(％)反应细胞增殖情况。实验结果显示，与Fam172a+/+Apoe-/-组相比，Fam172a-/-Apoe-/-组PVSMCs中Ki67+信号显著减少，而Ki67+/Dapi比值显著降低，Fam172a-/-可显著抑制血管平滑肌细胞增殖(图13)。
实施例5
本实施例验证Fam172a抑制PVSMCs迁移，具体的操作步骤和结果如下：
取PVSMCs，应用划痕实验评估Fam172a对PVSMCs迁移的影响，以细胞迁移面积/细胞原始划痕面积(％)反应细胞迁移能力。实验结果显示，与Fam172a+/+Apoe-/-组相比，Fam172a-/-Apoe-/-组PVSMCs迁移面积显著较少，细胞划痕愈合显著被抑制(图14)。结果表明，Fam172a可促进PVSMCs迁移。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.检测FAM172A表达的试剂在制备筛查糖尿病大血管病变产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述糖尿病大血管病变包括动脉粥样硬化。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为检测血清中FAM172A的试剂。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为通过酶联免疫吸附试验、western blot或蛋白芯片检测方法检测血清中FAM172A的试剂。
5.检测血清中FAM172A表达的试剂在制备筛查动脉粥样硬化等糖尿病大血管病变试剂盒中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述糖尿病大血管病变包括动脉粥样硬化。
7.FAM172A在制备治疗动脉粥样硬化等糖尿病大血管病变药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述糖尿病大血管病变包括动脉粥样硬化。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物包括促进FAM172A基因表达的物质。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物在施用后，具有以下功能的至少一种：
a.抑制动脉粥样硬化进展；
b.增强动脉粥样硬化斑块的稳定性。
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