KR102461895B1

KR102461895B1 - 폐 섬유화 질환 치료를 위한, g-csf의 이용

Info

Publication number: KR102461895B1
Application number: KR1020210107637A
Authority: KR
Inventors: 이수재; 최미영; 명재경; 김민정; 이혜준
Original assignee: 주식회사 에프엔씨티바이오텍
Priority date: 2019-01-30
Filing date: 2021-08-13
Publication date: 2022-11-03
Also published as: EP3919078A1; CN113382751A; KR20220134495A; CN113382751B; KR20210104001A; KR20230054618A; KR102356829B1; KR102520355B1; KR20200094695A; EP3919078A4

Abstract

본 발명은 폐 섬유화 질환 치료를 위한, G-CSF의 이용에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 G-CSF를 억제제를 유효성분으로 포함하는, 폐 섬유화 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명자들은 G-CSF가 질환의 발병 또는 진행의 마커임을 규명하였으며, G-CSF에 결합하여 본래의 기전을 억제할 수 있는 G-CSF를 포함하는 조성물이 폐 세포의 근섬유아세포과다증 또는 폐 섬유화증을 유의적으로 억제하는 효과가 있음을 확인하였는바, 본 발명의 상기 마커 및 상기 조성물은 폐 섬유화 질환의 진단, 예방 또는 치료 용도로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

폐 섬유화 질환 치료를 위한, G-CSF의 이용{Use of G-CSF for Treatment of Pulmonary Fibrosis Disease}

본 발명은 폐 섬유화 질환 치료를 위한, G-CSF의 이용에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 G-CSF 억제제를 유효성분으로 포함하는, 폐 섬유화 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

장기는 대부분 조직 손상이 일어나면 다양한 염증 반응과 치유 반응을 겪게 된다. 손상의 정도가 경미할 경우 정상 구조 및 기능을 유지하면서 손상을 치유하나, 계속적인 손상 또는 극심한 손상의 경우에는 치유 과정에서 조직 본래의 기능을 상실하게 되고 손상 부위를 중심으로 다양한 인자들이 축적되며 조직의 섬유화가 일어난다. 상기와 같은 섬유화 과정에 콜라겐(Collagen), 피브로넥틴(Fibronectin), 엘라스틴(Elastin) 등 세포 외 기질(Extracellular matrix, ECM)의 주요 구성요소가 조직에 동반 축적됨으로써 비정상 구조의 형성 및 기능의 부전이 나타난다. 특히 폐암 및 유방암 치료 시에 사용되는 방사선은 심장 또는 폐 조직의 손상을 유발하여 폐 섬유화의 가능성을 제공하는 치명적인 요인으로 알려져 있다. 특히, 심장과 폐는 순환계를 대표하는 주요 장기인만큼 섬유화 유발의 가능성이 작다 하더라도 환자의 생명 및 삶의 질과 직결되는 문제를 일으킬 수 있는 바, 섬유화 질환에 대하여 효과적인 치료법이나 치료제 개발은 반드시 필요하다.

한편, G-CSF는 호중구 집락 자극 인자로써 체내에 침입하는 바이러스, 곰팡이, 세균 등을 사멸시키는 백혈구 활성 인자이다. 최근 호중구 감소 치료제로 개발되어 암 환자에게 적용하는 사례가 증가하는 추세인데 항암제 및 방사선 치료 이후 골수 기능이 저하된 환자를 대상으로 항생제 또는 항진균제와 병행하여 과립구 생산을 자극하는 약물로써 사용된다. 또한, M-CSF는 대식세포 집락 자극 인자로써 골수 전구세포에 작용하여 증식을 유도한 후 과립세포(granule cell)와 대식세포(macrophage)로 분화시키는 중요한 조혈 인자이다.

다양한 장기의 섬유화 질환에서 공통적으로 발현하는 TGF-β 및 IFN-γ 등에 관한 연구가 보고되었으나, 상기 물질들은 표적 인자 자체가 인체 내에서 다양한 신호의 영향을 받아 치료 효과의 지속성 여부를 담보할 수 없고, 섬유아세포 성장 인자-2(Fibroblast Growth Factor-2)와 관련된 만성 폐쇄성 폐 질환 치료제에 관한 연구는 있으나(한국등록특허공보 제10-0785969호), M-CSF 또는 G-CSF의 폐 섬유화 질환 마커 용도 또는 M-CSF와 G-CSF를 표적하는 혼합 항체를 이용한 폐 섬유화 질환 치료제에 관한 연구는 미진한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 폐암 세포에 대한 방사선 치료 시에 발생할 수 있는 부작용인 폐 세포의 섬유화와 관련된 질환을 예측할 수 있는 마커 및 상기 질환을 억제할 수 있는 유효 물질을 발굴하기 위해 다양한 연구를 진행한 결과, M-CSF 및/또는 G-CSF를 포함하는, 마커를 폐 섬유화 질환 진단용도로 사용할 수 있음을 규명하고, 항 M-CSF 항체 및 항 G-CSF 항체의 혼합 조성물을 이용하여 M-CSF와 G-CSF를 억제하여 폐 세포의 근섬유아세포과다증 또는 폐 섬유화증의 발생을 유의적으로 억제할 수 있음을 규명하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 M-CSF(macrophage-colony stimulating factor) 억제제 및 G-CSF(Granulocyte-colony stimulating factor) 억제제를 유효성분으로 포함하는, 폐 섬유화 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 M-CSF(macrophage-colony stimulating factor) 및 G-CSF (Granulocyte-colony stimulating factor)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는, 폐 섬유화 질환 진단용 또는 폐 섬유화 질환의 진행 진단용 마커 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

본 발명은 M-CSF(macrophage-colony stimulating factor) 및 G-CSF (Granulocyte-colony stimulating factor)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 폐 섬유화 질환 진단용 또는 폐 섬유화 질환의 진행 진단용 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 폐 섬유화 질환 진단용 또는 폐 섬유화 질환의 진행 진단용 키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 폐 섬유화 질환 진단 또는 폐 섬유화 질환의 진행 정도의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

(a) 대상체 유래의 시료에서 M-CSF 및 G-CSF로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

(b) M-CSF 및 G-CSF로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 발현 수준을 측정한 결과, 정상 대조군 보다 증가한 경우, 폐 섬유화 질환 질환의 판정 또는 폐 섬유화 질환이 진행 중이라고 판정하는 단계.

본 발명은 하기를 포함하는, 폐 섬유화 질환의 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

(1) 대상체 유래의 폐 상피세포에 후보물질을 처리하는 단계;

(2) 상기 세포에서 M-CSF 및 G-CSF로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

(3) 후보물질 비처리군에 비해 상기 M-CSF 및 G-CSF로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 발현 수준을 감소시키는 물질을 치료물질로 선정하는 단계.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 M-CSF(macrophage-colony stimulating factor) 억제제 및 G-CSF(Granulocyte-colony stimulating factor) 억제제를 유효성분으로 포함하는, 폐 섬유화 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로 상기 폐 섬유화 질환은 방사선 조사에 의해 유도된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로 상기 폐 섬유화 질환은 폐 세포의 근섬유아세포과다증 또는 폐 섬유화증을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로 상기 M-CSF 억제제는 항 M-CSF 항체일 수 있고, 상기 G-CSF 억제제는 항 G-CSF 항체일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로 상기 조성물은 폐 세포의 근섬유아세포(myofibroblast)로의 분화를 억제할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로 상기 조성물은 상피 간엽 이행(Epithelial to Mesenchymal Transition, ETM)을 억제할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로 상기 조성물은 세포 외 기질 리모델링(Extra Cellular Matrix remodeling, ECM remodeling)을 억제할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로 상기 근섬유아세포로의 분화 억제는 알파-근섬유화구성단백질(α-Smooth Muscle Actin, α-SMA)의 발현을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로 상기 상피 간엽 이행의 억제는 피브로넥틴(Fibronectin, FN), 비멘틴(Vimentin, VIM) 및 ZEB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질의 발현을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로 상기 세포 외 기질 리모델링의 억제는 베르시칸(Versican), OPN(Osteopontin), 콜라겐(Collagen) 및 HAS3로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질의 발현을 억제하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 폐 섬유화 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물의 폐 섬유화 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 M-CSF(macrophage-colony stimulating factor) 및 G-CSF (Granulocyte-colony stimulating factor)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는, 폐 섬유화 질환 진단용 또는 폐 섬유화 질환의 진행 진단용 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 M-CSF(macrophage-colony stimulating factor) 및 G-CSF (Granulocyte-colony stimulating factor)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 폐 섬유화 질환 진단용 또는 폐 섬유화 질환의 진행 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 폐 섬유화 질환 진단용 또는 폐 섬유화 질환의 진행 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 폐 섬유화 질환 진단 또는 폐 섬유화 질환의 진행 정도의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

(a) 대상체 유래 시료에서 M-CSF 및 G-CSF로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

또한, 본 발명은 하기를 포함하는, 폐 섬유화 질환의 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

(1) 대상체 폐 상피세포에 후보물질을 처리하는 단계;

본 발명자들은 M-CSF 및 G-CSF로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이 폐 섬유화 질환의 발병 또는 진행의 마커임을 규명하였으며, M-CSF와 G-CSF에 결합하여 본래의 기전을 억제할 수 있는 M-CSF 및 G-CSF를 포함하는 조성물이 폐 세포의 근섬유아세포과다증 또는 폐 섬유화증을 유의적으로 억제하는 효과가 있음을 확인하였는바, 본 발명의 상기 마커 및 상기 조성물은 폐 섬유화 질환의 진단, 예방 또는 치료 용도로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 BEAS-2B 세포 라인에 대한 방사선 치료 재현 실험 계획을 나타낸 것이다.
도 2는 방사선에 노출된 상피세포에서의 알파-근섬유화구성단백질(α-SMA)의 발현 및 콜라겐(collagen)의 축적 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 방사선에 노출된 상피세포에서의 알파-근섬유화구성단백질(α-SMA)의 발현 및 콜라겐(collagen)의 축적 여부를 mRNA 발현양을 측정하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실험동물 모델에 대한 방사선 조사 실험 계획을 나타낸 것이다.
도 5는 실험동물 모델에서 국소적인 방사선 조사 후 시간의 흐름에 따른 폐 조직의 변화를 HE 염색, 시리우스 레드(SIRIUS RED) 염색 및 Masson's trichrome 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실험동물 모델에서 국소적인 방사선 조사 후 시간의 흐름에 따른 근섬유아세포의 증식과 콜라겐의 분비를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 폐 섬유화가 유발된 실험동물 모델의 폐 실질 조직에서의 상피 간엽 이행의 표지자 및 조절 인자의 발현 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 폐 섬유화가 유발된 실험동물 모델의 폐 실질 조직에서의 상피 간엽 이행의 표지자 및 조절 인자의 발현 여부를 mRNA 발현양을 측정하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 폐 섬유화 조직에서 세포 외 기질의 구성 인자들의 발현 양상을 관찰하여 세포 외 기질의 리모델링 진행 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 폐 섬유화 조직에서 세포 외 기질의 구성 인자들의 발현양 증가 여부를 mRNA 발현양을 측정하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 방사선에 의한 손상이 유발된 폐 실질 조직에서 발현된 염증성 활성 인자를 스크리닝한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 방사선에 의한 손상이 유발된 폐 실질 조직을 대상으로 mRNA 발현양을 측정하여 M-CSF와 G-CSF의 발현 증가 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 폐 섬유화 손상의 악화에 따른 M-CSF와 G-CSF의 발현 증가 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 폐 섬유화 손상의 악화에 따른 M-CSF, G-CSF, 알파-근섬유화구성단백질(α-SMA) 및 콜라겐의 발현 증가 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 폐 섬유화 손상의 악화에 따른 M-CSF, G-CSF의 발현 증가 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 폐 실질 조직을 대상으로 M-CSF와 G-CSF에 의해 매개되어 영입된 대식세포를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 폐 실질 조직에서 M-CSF 및 G-CSF의 발현 증가에 따라 대식세포의 응집이 증가하는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 면역세포의 활성 평가 인자(TRM1), 항염증 대식세포의 분비 인자(iNOS, CXCL10), 비면역 대식세포 분비 인자(CCL2)의 증가 여부를 상기 인자들의 mRNA 발현양 측정을 통해서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 방사선 조사 및 항체 주입 실험 계획을 나타낸 것이다.
도 20은 방사선 조사로 인한 폐 실질 조직의 병리학적 변화와 표적 항체를 주입한 폐 실질 조직의 병리학적 변화를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 방사선 조사 27주 경과 후, 방사선 조사 그룹의 폐 실질 조직의 세포 외 기질요소의 축적 정도와 표적 항체를 주입한 그룹의 폐 실질 조직의 세포 외 기질요소의 축적 정도를 콜라겐 염색을 통해 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 방사선 조사 그룹(폐 실질 조직)의 활성분비 인자의 양과 표적 항체를 주입한 그룹(폐 실질 조직)의 활성분비 인자의 양을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 방사선 조사 그룹(폐 실질 조직)의 상피 간엽 이행의 조절 인자의 양과 표적 항체를 주입한 그룹(폐 실질 조직)의 상피 간엽 이행의 조절 인자의 양을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 방사선 조사 그룹(폐 실질 조직)의 세포 외 기질 구성요소 인자의 양과 표적 항체를 주입한 그룹(폐 실질 조직)의 세포 외 기질 구성요소 인자의 양을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 G-CSF, M-CSF 및 GM-CSF를 단일 표적 항체 및 G-CSF/M-CSF의 혼합 표적 항체를 주입한 그룹(BEAS-2B)에서 알파-근섬유화구성단백질(α-SMA) 및 콜라겐의 발현 감소 여부를 mRNA 발현양 측정을 통해서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 G-CSF/M-CSF의 혼합 표적 항체를 주입한 그룹(BEAS-2B)에서 알파-근섬유화구성단백질(α-SMA) 및 콜라겐의 mRNA 발현양을 측정하여, 상기 혼합 표적 항체의 섬유화 질환 예방 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 27은 G-CSF/M-CSF의 혼합 표적 항체를 주입한 그룹(BEAS-2B)에서 알파-근섬유화구성단백질(α-SMA) 및 콜라겐의 mRNA 발현양을 측정하여, 상기 혼합 표적 항체의 섬유화 질환 치료 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 폐암 세포에 대한 방사선 치료 시에 정상 폐 세포의 섬유화가 발생하는 경우 M-CSF 및/또는 G-CSF의 발현이 증가함을 관찰하고, 폐암 세포에 대한 정상 폐 세포의 섬유화를 억제하는 유효 물질을 발굴하기 위해 다양한 연구를 진행한 결과, 상기 M-CSF 및/또는 G-CSF의 폐 섬유화 발병 또는 진행 판단의 마커 용도 및 항 M-CSF 항체 및 항 G-CSF 항체의 혼합 조성물을 이용하여 M-CSF와 G-CSF의 억제를 통해 폐 세포의 근섬유아세포과다증 또는 폐 섬유화증의 발생을 유의적으로 억제할 수 있음을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 M-CSF(macrophage-colony stimulating factor) 및 G-CSF (Granulocyte-colony stimulating factor)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는, 폐 섬유화 질환 진단용 또는 폐 섬유화 질환의 진행 진단용 마커 조성물, 상기 M-CSF 및 G-CSF로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 폐 섬유화 질환 진단용 또는 폐 섬유화 질환의 진행 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는, 폐 섬유화 질환 진단용 또는 폐 섬유화 질환의 진행 진단용 키트를 제공한다.

본 발명에서 대상으로 하는 질환인 "폐 섬유화 질환"은 폐 조직이 굳어서 심각한 호흡 장애를 불러일으키는 호흡기 질환이며, 폐가 굳는다고 하는 것은 섬유질 결합 조직의 과다 누적을 의미하며 이 과정을 섬유화라고 한다. 섬유화가 진행되면 폐 벽이 두꺼워져 혈액에 공급되는 산소량이 줄어들어 결과적으로 환자는 지속적으로 숨 가쁨을 느끼게 되며 섬유화가 진행된 폐 조직을 복구할 수 있는 방법은 없는 것으로 보고된다. 원인이 밝혀진 폐 섬유화 질환은 직업적, 환경적, 유전적, 방사선 노출 등 여러 가지 원인으로 발생할 수 있으나, 본 발명에 따른 폐 섬유화 질환은 방사선 조사에 의해 유도된 것일 수 있으며, 폐 섬유화 질환의 진행 정도에 폐 상피세포의 근섬유아세포과다증 또는 폐 섬유화증일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서의 "근섬유아세포"란, 폐 섬유화를 유도하는 세포로서, 방사선에 의해 손상된 부위로 이동하여 다양한 세포 외 기질 및 콜라겐을 합성하고 분비하여 폐 섬유화를 유도하는 것으로 알려져 있고 상기 근섬유아세포는 알파-근섬유화구성단백질 (α-SMA), 칼포닌(calponin), SM22α 등을 발현한다.

본 발명에서의 "근섬유아세포화"란, 정상 폐 세포가 근섬유아세포로 전환되는 것을 의미하며, 본 발명자들은 정상 폐 세포에 방사선을 조사하는 경우, 정상 폐 상피세포가 근섬유아세포로 전환 유도됨을 밝혔다. 이를 통해 종국적으로 폐 섬유화가 유도된다.

본 발명에서의 "M-CSF"란, 집락 자극 인자 패밀리 중 하나로서, 사이토카인의 일종이며, 대식세포 콜로니 자극 인자(macrophage-colony stimulating factor)라고 부르기도 한다. 일반적으로 골수(myeloid) 전구체를 단핵구, 대식세포, 수지상 돌기세포 등의 다양한 세포로 분화시키는 역할을 한다. 또한, 선천적 면역 또는 후천적 면역에 작용하는 대식세포의 이동, 증식 및 기능뿐만 아니라 생존에도 영향을 주는 것으로 알려져 있으며, 태반 발달에 관여한다.

본 발명에서의 "G-CSF"란, 집락 자극 인자 패밀리 중 하나로서, 사이토카인의 일종이며, 과립구 콜로니 자극 인자(Granulocyte-colony stimulating factor)라고 부르기도 한다. 내피세포, 대식세포 또는 다른 면역세포에 의해 생성되며, 골수의 전구세포를 자극하여 과립구로의 분화 및 증식을 유도한다. 또한 호중구 전구체 및 호중구의 생존, 증식 및 분화를 유도하는 것으로 알려져 있으며, 신경 영양 인자로서 신경세포에 영향을 줄 수 있으므로 뇌 허혈성 질환 치료에 쓰인다.

본 발명에서 사용되는 용어 "진단(diagnosis)"이란, 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태 및 합병증의 유무 등이다. 본 발명에서 진단은 폐 섬유화 질환의 발병 여부 및 진행단계 수준 등을 판단하는 것이다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 대상체 유래의 시료에서 M-CSF 및 G-CSF 및 G-CSF로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 발현 수준을 측정한 결과, 정상 대조군 보다 증가한 경우, 폐 섬유화 질환의 판정 또는 폐 섬유화 질환이 진행 중이라고 판정하는 단계를 포함하는, 폐 섬유화 질환 진단 또는 폐 섬유화 질환의 진행 정도의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "폐 섬유화 질환 진단을 위한 정보제공방법"이란 진단 또는 예후 예측을 위한 예비적 단계로써 폐 섬유화 질환 진단을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다. 상기 대상체 유래의 시료는 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면, 조직, 세포 등일 수 있다.

또한, 본 발명은 (1) 대상체 유래 후보물질을 처리하는 단계; (2) 상기 세포에서 M-CSF 및 G-CSF로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (3) 후보물질 비처리군에 비해 상기 M-CSF 및 G-CSF로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 발현 수준을 감소시키는 물질을 치료물질로 선정하는 단계를 포함하는, 폐 섬유화 질환의 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 M-CSF(macrophage-colony stimulating factor) 억제제 및 G-CSF(Granulocyte-colony stimulating factor) 억제제를 유효성분으로 포함하는, 폐 섬유화 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 M-CSF 억제제는 항 M-CSF 항체일 수 있으며, G-CSF 억제제는 항 G-CSF 항체일 수 있고, 본 발명에 따른 항체는 폐 세포의 근섬유아세포(myofibroblast)로의 분화, 상피 간엽 이행(Epithelial to Mesenchymal Transition, ETM) 또는 세포 외 기질 리모델링(Extracellular Matrix remodeling, ECM remodeling)을 억제할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 폐 세포의 근섬유아세포(myofibroblast)로의 분화 억제는 알파-근섬유화구성단백질(α-Smooth Muscle Actin, α-SMA)의 발현을 억제하는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 상피 간엽 이행의 억제는 피브로넥틴(Fibronectin, FN), 비멘틴(Vimentin, VIM) 및 ZEB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질의 발현을 억제하는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 세포 외 기질 리모델링의 억제는 베르시칸(Versican), OPN(Osteopontin), 콜라겐(Collagen) 및 HAS3로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질의 발현을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 "상피 간엽 이행(epithelial mesenchymal transition)"은 상피세포가 세포의 극성 및 세포 간 부착성을 잃고, 이동상 및 침습성을 얻음으로써 간엽 줄기세포가 되는 과정을 의미하며, 이들은 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 다능성 기질세포(stromal cell)이다. 상피 간엽 이행은 중배엽 형성과 신경관 형성을 포함한 수많은 발달 과정에 필수적이며, 상처 치유, 장기 섬유화증 및 암 전이 과정에서 관찰된다.

본 발명에 따른 "세포 외 기질 리모델링(Extracellular Matrix Remodeling)"은 종양의 성장과 전이를 촉진하는 신생물 변이 과정(neoplastic transformation)에서 세포 외 기질의 정량적 및 질적 변화를 의미한다. 세포 외 기질은 주위의 세포에 의해 영향을 받아 생성되고 조립되는데, 세포 외 기질의 주 성분은 글리코사미노글라이칸(glycosaminoglycans)과 프로테오아미노글라이칸(proteoaminoglycan), 피브리넥틴(fibronectin), 라미닌(aminin) 또는 테나스신(tenascin) 등의 비콜라겐 당화단백질(noncolagenous glycoproteins) 콜라겐(collagen) 및 세포 사이 또는 세포와 기질 사이의 상호작용과 관련된 생체 분자이다. 주변 세포의 형태나 성질이 어떠한 요인으로 변화하게 되면 그에 따라 세포 외 기질의 구성이나 성질도 변하게 된다.

본 발명에서는 전술한 바와 같이, 암을 치료하기 위해 조사한 방사선에 의한 폐 섬유화 질환의 발생에 M-CSF와 G-CSF가 관여함을 확인하기 위해 다양한 연구를 진행하였는데, 본 발명의 일실시예에서는 섬유화가 유발된 실험동물 모델의 폐 실질 조직을 추출하여 상피 간엽 이행의 진행 여부와 세포 외 기질의 리모델링 여부를 확인하는 실험을 수행한 결과, 상기 폐 실질 조직에서 상피 간엽 이행의 표지자(Fibronectin, vimentin) 및 조절 인자(ZEB1)의 발현이 크게 증가하고, 세포 외 기질 구성요소의 다양한 표지 인자(Versican, OPN) 및 collagen 합성의 주요 인자(HAS3)의 발현 증가를 확인하였으며(실시예 3 참조), 상기 폐 실질 조직을 대상으로 염증성 활성 인자를 스크리닝한 결과, 섬유화된 다양한 세포에서 공통적으로 분비되는 IL-6, IL-8 및 TGF-β1와 함께 M-CSF(CSF type1), G-CSF(CSF type3)가 검출되는 것을 확인하였다. 특히 M-CSF와 G-CSF 발현은 방사선 조사 후 매우 큰 폭으로 증가하였으며, 폐 섬유화 손상이 악화함에 따라 M-CSF와 G-CSF의 발현이 더욱 증가하는 것을 확인하였다(실시예 4-1 참조). 이는 폐 섬유화의 발병 및 진행 정도의 진단에 있어서, M-CSF 및/또는 G-CSF가 마커 용도를 가짐을 확인한 것이다.

또한, M-CSF 및 G-CSF 증가와 함께 근섬유아세포의 표지자인 알파-근섬유화구성단백질(α-SMA) 및 세포 외 기질의 주요 구성인 콜라겐의 발현이 증가하는 것을 확인하였다 (실시예 4-2 참조).

본 발명의 다른 일실시예에서는 실험동물 모델의 흉부를 방사선에 노출하고 24시간이 지난 후 3일간 M-CSF(단일), G-CSF(단일), MCSF/GCSF(혼합)의 표적 항체를 복강을 통해 주입한 결과, 방사선에 노출되고 표적 항체를 주입하지 않은 그룹의 폐 주변 부위 및 정상 부위에 섬유아세포-병소(Fibroblastic　Foci)가 크게 증가하였고 회복 불가능한 폐의 구조적 손상이 발생하였으나 G-CSF, M-CSF의 단일 혹은 혼합 표적 항체를 주입한 그룹은 방사선 노출로 인해 발생한 폐 손상 정도가 크게 완화됨을 확인하였으며, 특히 G-CSF/M-CSF의 혼합 표적 항체를 주입한 그룹에서 폐 손상이 가장 크게 완화된 것을 확인하였다. 또한, 정상그룹, 방사선 노출에 의한 폐 조직 섬유화 그룹 및 G-CSF/M-CSF 단일 및 혼합 표적 항체 주입한 그룹을 대상으로 세포 외 기질 구성의 주요 요소인 콜라겐의 축적의 감소 여부를 확인하는 실험을 수행한 결과, G-CSF, M-CSF의 단일 표적 항체를 주입한 그룹에 비하여 혼합 표적 항체를 주입한 그룹에서 방사선 노출에 의해 증가한 콜라겐이 더욱 많이 감소된 것을 확인하였다(실시예 5-1 참조). 또한, 방사선에 노출된 폐 상피세포 라인 그룹 및 방사선에 노출된 폐 상피세포 라인에 M-CSF, G-CSF의 단일 표적 항체 또는 혼합 표적 항체를 주입한 그룹을 대상으로 하여 폐 손상과 관련된 유전자 발현 정도를 비교하는 실험을 수행한 결과, G-CSF, M-CSF 및 GM-CSF의 단일 표적 항체를 주입한 그룹에 비하여 G-CSF/M-CSF의 혼합 표적 항체를 주입한 그룹에서 알파-근섬유화구성단백질 (α-SMA) 및 콜라겐의 발현이 더욱 크게 감소하는 것을 확인하였고, 방사선에 노출된 폐 상피세포 라인에 G-CSF/M-CSF의 혼합 표적 항체를 적용하는 경우, 섬유화 질환에 대한 예방 및 치료 효과가 있음을 확인하였다(실시예 5-2 참조).

상기 결과들은 폐 섬유화의 발병 및 진행 정도의 진단에 있어서, M-CSF 및 G-CSF로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 마커 용도를 시사하고, M-CSF 및 G-CSF의 혼합 표적 항체가 상피 간엽 이행 조절 인자와 세포 외 기질 구성요소 인자를 억제하여, 폐 상피세포의 상피 간엽 이행 및 세포 외 기질의 축적을 감소시켜 폐 섬유화 질환의 예방제 또는 치료제로써 유용하게 이용될 수 있음을 시사한다.

본 발명에 따른 조성물은 항 M-CSF 항체 및 항 G-CSF 항체를 유효성분으로 포함하며, 또한 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제, 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 피부, 비강, 기도에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150mg, 바람직하게는 0.01 내지 100mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 폐 섬유화 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 폐 섬유화 질환 예방, 조절 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 폐 섬유화 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 폐 섬유화 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 "대상체"란 질병의 예방, 조절 또는 치료방법을 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 폐 상피세포 및 단핵세포 준비

한국 세포주 은행(https://cellbank.snu.ac.kr/)으로부터 인간의 폐 조직 구성 세포인 폐 상피세포 BEAS-2B(Human Bronchial Epithelial Cell Line)와 인간의 백혈구의 일종인 단핵세포 주 THP1(Human Leukamic monocyte)을 동결 상태로 분양 받은 후, Gibco^TM 회사의 RPMI 1640 배양 배지를 사용하여 세포배양 하였다. 이때 세포배양의 배지는 10%의 우태아혈청(fetal bovine serum; FBC)과 1% 항생제를 혼합하여 사용하였다.

또한, 본 실험은 방사선치료 후 방사선에 의한 세포 손상의 재현성 실험의 일환으로 외부 자극에 의한 세포학적 영향을 평가하기 위한 것으로서, 폐암 및 유방암 환자가 근치적 치료 목적을 위해 방사선 치료를 받을 경우 조직 내의 상피세포, 내피세포, 섬유세포 등은 방사선의 자극 및 손상이 유발하게 되는데, 이때 여러 장기의 손상을 해결하고자 세포는 다양한 염증성 매개물질을 생성하게 되며 이에 따라 세포가 분화되고 이동성 획득 및 다양한 세포외 기질 구성인자들의 분비를 촉진한다. 전술한 일련의 반응을 재현하고자 THP1 및 폐 상피세포를 포함하는 특수 목적의 삼차원 배양구조체 (trans-well inset)를 활용하였다.

1-2. 실험동물 모델 준비

㈜ 중앙실험동물로부터 C57BL/6J 구매 후 실험동물의 안정을 위하여 1주일간 순화 기간을 거친다. 이후 12.5Gy의 세기로 흉부에 국소적 방사선 조사를 시행하였다. 본 실험 준비는 근치적 목적으로 사용하는 방사선 국소 요법 치료의 부작용에 따른 폐 손상에 모델을 구축하기 위한 재현 실험의 일환으로서 방사선 노출에 따른 폐 조직내의 섬유화 정도 영향을 평가하기 위함이다.

1-3. 상피 간엽 이행 및 세포 외 기질 활성 검출을 위한 면역화학(형광)염색법

면역화학염색법은 원인 요인 및 자극에 의해 생성된 단백질에 대하여 항체를 이용함으로써 유전자와 관련된 특정 질환의 특이 진단에 이용되며 유전자 및 단백질 분포 및 발현을 관찰하기 위하여 실시되는 실험법이다. 방사선 노출에 따른 폐 세포 및 조직의 상피 간엽 이행 정도와 세포 외 기질 구성요소와의 상호 리모델링 활성 평가를 위하여 항원-항체 면역화학 세포염색법 및 조직염색법을 시행하였다.

일반적으로, 세포나 조직 수준에서 이들의 활성을 확인하는 경우, 특정 세포 및 조직에서 특이 단백질의 존재를 검출하기 위하여 1차 및 2차 항체를 사용한다. 즉, 1차 항체는 특정 단백질을 검출하기 위한 항체 단백질로써 특정 단백질에 높은 친화성을 가지고 2차 항체는 1차 항체를 검출하기 위해 사용될 뿐만 아니라 특정 단백질의 분포를 표식할 수 있다. 관찰 시 특정 단백질의 표출 신호를 확장 유도하거나 특정한 색으로 구분 짓기 위하여 형광단백질을 활용한다. 예를 들어, 녹색 파장의 항체 단백질로 표식 및 검출하고자 할 경우 Fluorescein isothiocyanate(FITC)를, 붉은색 파장을 띄는 항체 단백질의 경우 cyanine-3(Cy3) 사용할 수 있으며, 겨자무화과산화효소(hooseradich peroxidase, HRP)에 결합되어 DAB(3,3′-디아미노벤지딘) 반응으로 염색하여 항원을 국재화(localization)할 수 있다.

해당 근섬유아세포과다증 또는 폐 섬유화증의 정도를 확인하기 위하여 1차 항체로 근섬유아세포의 표지자인 알파-근섬유화구성단백질(α-SMA)과 콜라겐을 사용하였고, 상피 간엽 이행을 확인하기 위하여 표면 항체인 N-cadherin, E-cadherin, Fibronectin, Vimentin, Snail 및 전사 조절 단백질인 Snail과 Zeb1을 사용하였다.

이와 함께, 폐 상피세포 주변부의 세포 외 기질 구성요소들과의 상호조절 및 리모델링 활성을 검출하기 위하여 세포 골격 주요인자인 단백질인 osteopontin(OPN), Versicn 및 콜라겐 합성 주요인자인 Hyaluronan synthase(HAS3)로 폐 섬유화 관련 실험을 시행하였다. 면역화학 염색법을 위해 사용된 항체의 반응을 위하여 사용된 희석배율은 1:100 내지 1:200으로 사용되었으며 희석배지는 1%의 bovine serum albumin 용액을 사용하였다.

1-4. 정량 중합효소연쇄반응

실시간 중합 효소 연쇄 반응은 목표로 한 DNA 분자의 증폭과 양의 측정을 동시에 하는 기법으로써 타겟된 유전자의 절대적인 복제 수 또는 상대적인 양을 측정하는 실험 기법이다.

근섬유아세포과다증 또는 폐 섬유화증을 일으킨 세포 및 조직을 추출 후 Trizol을 사용하여 세포/조직 내의 DNA, RNA, protein을 분리한다. 이후 세포/조직을 원심분리하고 RNA 층을 분리 후 chloroform을 섞여 RNA만을 정제한다. 정제 및 세척 과정을 이후 획득된 순수한 RNA는 100ng의 양을 정량 하여 cDNA로 합성한다. 합성된 DNA를 주형으로 하여 타겟된 유전자의 프라이머를 함께 넣어주고 변성(Denature), 결합(Annealing), 신장(elongation)과정을 거쳐 표적된 유전자의 증폭이 실제로 반응을 유발하는지 확인하였다. 실시예 1-1에서 사용된 항체명과 동일한 인간의 유전자 sequence를 주문 제작하여 사용하였으며 사용된 프라이머는 아래와 같다.

도 3 과 도 22에서 사용한 프라이머는 마우스 유전자이며, 하기의 표 1에 나타낸 바와 같고, 방사선 노출에 의한 근섬유아세포과다증 또는 폐 섬유화증을 일으킨 실험동물의 폐 조직을 대상으로 실험에 사용하였다(모든 PRIMER 순서는 5'-> 3'으로 작성).

구분	Forward Primer(정방향)	Reverse Primer(역방향)
α-SMA	TCAGCGCCTCCAGTTCCT	AAAAACCACGAGTAACAAATCAA
collagen	ATGTCGCTATCCAGCTGACCTT	GATGACTGTCTTGCCCCAAGTT

도 8과 도 23에서 사용된 프라이머는 마우스 유전자이며, 하기의 표 2에 나타낸 바와 같고, 방사선 노출에 의한 근섬유아세포과다증 또는 폐 섬유화증을 일으킨 실험동물의 폐 조직을 대상으로 실험에 사용하였다.

구분	Forward Primer(정방향)	Reverse Primer(역방향)
N-CAD	ATGTGCCGGATAGCGGGAGC	TACACCGTGCCGTCCTCGTC
E-cad	CACCTGGAGAGAGGCCATGT	TGGGAAACATGAGCAGCTCT
Fibronectin	AGGGAAACACAGGTAGCCAA	AAGTGAGTTCTGTGGGAGGG
VIM	GGGTGAGTAGAGAGTTCGGC	GACCCGGAAAGAAGTGAGGA
Snail	AAGATGCACATCCGAAGCCA	CTCTTGGTGCTTGTGGAGCA
Zeb	GATCGCCGATTCTGTGAACC	TTCCTGGGGCTCATTTCCAT

도 10과 도 24에서 사용된 프라이머는 마우스 유전자이며, 하기 표 3에 나타낸 바와 같고, 방사선 노출에 의한 근섬유아세포과다증 또는 폐 섬유화증을 일으킨 실험동물의 폐 조직을 대상으로 실험에 사용하였다.

구분	Forward Primer(정방향)	Reverse Primer(역방향)
Versican	ACCAGACATGCTTCCCTCTC	GTCACTGCACTGTAGGTCCT
OPN	ATGCCACAGATGAGGACCTC	CCTGGCTTCTTTGGATGC
HAS3	CACACCAAAACATCCCAGGG	ACCCTGACCCTCTCATCTCT

도 12에서 사용된 프라이머는 마우스 유전자이며, 하기의 표 4에 나타낸 바와 같고, 방사선 노출에 의한 근섬유아세포과다증 또는 폐 섬유화증을 일으킨 실험동물의 폐 조직을 대상으로 실험에 사용하였다.

구분	Forward Primer(정방향)	Reverse Primer(역방향)
MCSF	CGAGTCAACAGAGCAACCAA	GAGGGGGAAAACTTTGCTTC
GCSF	CTCAACTTTCTGCCCAGAGG	TAGGTGGCACACAACTGCTC

도 18에서 사용된 프라이머는 인간의 유전자이며, 하기의 표 5에 나타낸 바와 같고, 방사선 노출에 의한 대식세포의 직접적인 활성을 평가하기 위하여 사용되었다.

구분	Forward Primer(정방향)	Reverse Primer(역방향)
MCSF	CCCCGTTTTAACTCCGTTCC	TGTAGAACAAGAGGCCTCCG
GCSF	CCCTCCCCATCCATGTATT	GATGGGAGGACAGGAGCTTT
α-SMA	GTTTGGGAAAGTGGGAG	CATTGTCACACACCAAGGCA
TREM	CTCAGTCTGCTCCTGGAACA	TATCCGAAAGTGCCCAGTGT
iNOS	ACAAGCCTACCCCTCCAGAT	TCCCGTCAGTTGGTAGGTTC
CXCL10	CTGTACGCTGTACCTGCATCA	TTCTTGATGGCCTTCGATTC
CCL2	GCTCAGCCAGATGCAATCAA	ACAGATCTCCTTGGCCACAA

실시예 2. 방사선에 노출된 정상 폐 상피세포의 변화

2-1. 정상 폐 상피세포의 근섬유아세포로의 분화와 콜라겐 축적의 확인

인간 기관지 상피세포인 BEAS-2B 세포 라인(Human Bronchial Epithelial Cell Line)에 방사선을 하루에 2Gy의 세기로 3일 동안 조사하였다. 본 실험은 방사선 치료에 대한 재현 실험의 일환으로써 방사선 조사의 세포학적 영향을 평가하기 위함이다. 도 1은 상기의 방사선 조사의 실험 계획을 나타낸 것이다.

그 결과, 방사선에 노출된 상피세포에서 근섬유아세포의 표지자인 알파-근섬유화구성단백질(α-SMA)과 세포 내의 콜라겐의 축적이 증가한 것을 확인하였다.

또한, 도 2에서 나타내는 바와 같이 표면 항원 표지자를 이용하여 방사선에 노출된 상피세포에서 알파-근섬유화구성단백질(α-SMA)과 콜라겐의 축적이 증가한 것을 확인하였다.

또한, 도 3에서 나타내는 바와 같이 방사선 조사 전후의 mRNA의 양을 비교하여 방사선에 노출된 상피세포에서 알파-근섬유화구성단백질(a-SMA)과 콜라겐의 축적이 증가한 것을 확인하였다.

2-2. 실험동물 모델에서 근섬유아세포로의 분화와 콜라겐 축적 확인

국소적인 방사선의 노출에 의한 직접적인 영향을 평가하기 위해 실험동물 모델을 이용하여 12.5Gy의 세기로 방사선을 조사하고 1, 4, 16, 19 및 27주 후 폐 실질 조직을 적출하여 HE 염색(HE staining), 시리우스 레드 염색(SIRIUS RED Staining) 및 Masson's trichrome 염색을 통해 폐 섬유화 정도를 추적하여 상기의 실시예 2-1. 실험 결과와 일치하는지를 확인하였다. 도 4는 실험동물 모델에 대한 국소적인 방사선 조사의 실험 계획을 나타낸 것이다.

그 결과, 도 5에서 나타내는 바와 같이 국소적인 방사선 노출 후 시간이 경과함에 따라 폐 섬유모세포 병소(fibroblast foci)의 형성 및 폐의 구조적 이형화가 눈에 띄게 증가하는 것을 HE 염색을 통하여 확인하였다. 또한, 콜라겐의 축적의 증가, 섬유세포 및 교원세포의 증가를 시리우스 레드 염색 및 Masson's trichrome 염색을 통하여 확인하였다.

또한, 표면 항원 표지자를 이용하여 근섬유아세포의 증식 및 콜라겐의 축적이 증가하였는지 여부를 확인하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 6에서 나타내는 바와 같이 알파-근섬유화구성단백질(α-SMA)이 증가한 것으로부터 근섬유아세포의 과대 활성증식를 확인하였고, 콜라겐의 축적이 증가한 것을 확인하였다.

상기의 실험 결과들로부터 방사선의 노출로 인한 폐 상피세포 자극 및 손상에 의해서 특정 매개 인자가 활성화되고 이에 따라 정상 폐 상피세포가 근섬유아세포로 분화되며 세포 외 기질의 주요 물질인 콜라겐의 분비가 증가함을 확인하였다.

실시예 3. 폐 섬유화 진행에 따른 상피 간엽 이행 및 세포 외 기질의 리모델링

섬유화가 유발된 실험동물 모델의 폐 실질 조직을 추출하여 상피 간엽 이행 여부와 세포 외 기질의 리모델링이 일어났는지를 확인하는 실험을 수행하였다.

3-1. 상피 간엽 이행의 진행 여부 확인

폐 섬유화가 유발된 실험동물 모델의 폐 실질 조직을 추출하여 상피 간엽 이행 여부를 확인하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 7에서 나타내는 바와 같이 섬유화가 진행됨에 따라 상피 간엽 이행의 표지자(Fibronectin, vimentin) 및 조절 인자(ZEB1)의 발현이 크게 증가하는 것을 확인하였다.

또한, 해당 조직으로부터 추출한 mRNA의 양을 비교하여 상기 인자들의 발현 정도를 비교하였다.

그 결과, 도 8에서 나타내는 바와 같이 상피 간엽 이행의 표지자(Fibronectin, vimentin) 및 조절 인자(ZEB1)의 발현이 증가한 것을 확인하였다. 상기 인자들을 제외하고, 방사선 조사 후에 E-Cad의 발현양이 감소하였으며, N-Cad, Snail은 발현양이 증가한 것을 확인하였다.

3-2. 세포 외 기질의 리모델링 진행 여부 확인

폐 섬유화가 유발된 실험동물 모델의 폐 실질 조직을 추출하여 세포 외 기질이 증가하였는지를 확인하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 9에서 나타내는 바와 같이 폐 섬유화 조직에서 세포 외 기질 구성요소의 다양한 표지 인자(Versican, OPN) 및 콜라겐 합성의 주요 인자(HAS3)의 발현 증가를 확인하였으며, 도 9의 4주와 27주 이미지에서 나타낸 바와 같이 세포 외 기질의 리모델링이 일어난 것을 확인하였다.

그 결과, 도 10에서 나타내는 바와 같이 폐 섬유화 조직에서 세포 외 기질 구성요소의 다양한 표지 인자(Versican, OPN) 및 콜라겐 합성의 주요 인자(HAS3)의 발현 증가를 확인하였다.

상기 실험 결과들로부터 방사선에 의한 폐 섬유화가 진행됨에 따라 폐 조직 내의 다양한 세포들의 상피 간엽 이행 및 세포 외 기질 리모델링(ECM remodeling)이 일어난다는 것을 확인하였다.

실시예 4. 폐 섬유화에 있어서 M-CSF 및 G-CSF의 작용 기전

4-1. 방사선에 노출된 폐 실질 조직의 사이토카인 분석(Cytokine array)

방사선에 의한 세포의 자극 및 손상이 유발되었을 때 세포는 손상을 수복하기 위한 방어 기작으로 세포 분화, 상피 간엽 이행 및 세포 외 기질 구성 성분들과 상호작용을 통한 복구 기전을 가동한다.

이때, 어떤 물질이 복구 기전에 관여하는지 확인하기 위하여 방사선에 의한 손상이 유발된 폐 실질 조직을 대상으로 염증성 활성 인자를 스크리닝 하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 11에서 나타내는 바와 같이 섬유화된 다양한 세포에서 공통적으로 분비되는 IL-6, IL-8 및 TGF-β1과 함께 M-CSF(CSF type1), G-CSF(CSF type3)가 증가하는 것을 확인하였다. 그러나 IL-6, IL-8 TGFβ1은 이미 다양한 섬유성 질환의 유발 혹은 매개 물질로 알려졌고 다양한 신호전달의 영향을 받기 때문에 질환 치료의 표적으로 삼는 것은 바람직하지 않으므로 본 발명에서는 이를 표적하지 않았다.

또한, 방사선에 의해 손상이 유발된 폐 실질 조직에서 추출한 mRNA의 양을 비교하여 상기 물질들의 발현 정도를 비교하였다.

그 결과, 도 12에서 나타내는 바와 같이 시간이 지남에 따라 M-CSF와 G-CSF의 발현이 매우 큰 폭으로 증가한 것을 확인하였다. 또한, 도 13에서 나타내는 바와 같이 폐 섬유화 손상이 악화함에 따라 M-CSF와 G-CSF의 발현이 증가함을 확인하였다. 이는 폐 섬유화의 발병 및 진행 정도의 진단에 있어서, M-CSF 또는 G-CSF가 마커 용도를 가짐을 확인한 것이다.

4-2. M-CSF 및 G-CSF의 발현 증가와 알파-근섬유화구성단백질(α-SMA) 및 콜라겐 발현 증가

M-CSF 및 G-CSF의 발현이 증가하면 근섬유아세포와 콜라겐의 발현이 증가하는지를 확인하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 14 또는 도 15에서 나타내는 바와 M-CSF 및 G-CSF 증가와 함께 근섬유아세포의 표지자인 알파-근섬유화구성단백질(α-SMA) 및 세포 외 기질의 주요 구성인 콜라겐의 발현이 증가함을 확인하였다.

4-3. M-CSF 및 G-CSF의 발현 증가와 대식세포의 영입

M-CSF와 G-CSF는 체내의 면역세포의 성장과 활성을 돕는 매개 물질로 알려져 있다. 또한, 도 16에서 나타내는 바와 같이 폐 섬유화가 약화된 조직 내로 침윤되어 있는 대식세포를 확인하였는바, 이에, 폐 실질 조직을 대상으로 M-CSF와 G-CSF에 의해 매개되어 대식세포가 영입되는지를 시각적으로 확인하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 17에서 나타내는 바와 같이 M-CSF 및 G-CSF의 발현이 증가함에 따라 대식세포의 응집이 증가함을 확인하였다.

이에, 상기 응집이 증가된 대식세포 자체의 활성 인자 및 분비 인자의 발현 수준을 확인할 필요가 있어 mRNA 발현양을 측정하여 상기 인자들의 발현 정도를 확인하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 18에서 나타내는 바와 같이 M-CSF, G-CSF, 알파-근섬유화구성단백질(α-SMA), 콜라겐과 함께 면역세포의 활성 평가 인자(TRM1), 항염증 대식세포의 분비 인자(iNOS, CXCL10), 비면역 대식세포의 분비 인자(CCL2)의 발현이 증가함을 확인하였다.

상기 실험 결과들로부터 방사선 손상에 의해 증가된 분비 인자는 세포 스스로의 분화를 유도함과 동시에 세포 외 기질을 순환하고 있는 대식세포를 영입하고 분화시킴으로써 손상을 복구하거나 섬유화 질환을 악화시킴을 확인하였다.

실시예 5. 표적 항체를 이용한 폐 섬유화 치료 효과 확인

5-1. M-CSF(단일), G-CSF(단일), M-CSF/G-CSF(혼합)의 표적 항체의 폐 섬유화 질환 치료 효과

실험동물 모델의 흉부를 12.5Gy 세기의 방사선에 노출하고 24시간이 지난 후, 3일 동안 M-CSF(단일), G-CSF(단일), M-CSF/G-CSF(혼합)의 표적 항체를 복강을 통해 250ug/kg의 농도로 주입하였다. 상기의 표적 항체를 주입하고 1주, 4주, 16주, 19주 및 27주의 기간 동안 실질 폐 조직을 분석하였다. 도 19는 상기 방사선 조사의 실험 계획을 나타낸 것이다. 구체적으로, 정상그룹, 방사선 노출에 의한 폐 조직 섬유화 그룹 및 G-CSF/M-CSF 단일, 혼합 표적 항체 주입한 그룹을 대상으로 폐 실질 조직의 병리학적 변화 및 유전자 발현 양상 변화를 통해 확인하였다.

그 결과, 도 20에서 나타내는 바와 같이 방사선이 노출되고 표적 항체를 주입하지 않은 그룹의 폐 주변 부위 및 정상 부위에 섬유아세포-병소(Fibroblstic Foci)가 크게 증가하였고 회복 불가능한 폐의 구조적 손상이 발생하였음을 확인하였다.

그러나 G-CSF, M-CSF를 단일 또는 혼합 표적 하여 항체를 주입한 그룹은 방사선 노출로 인해 발생한 폐 손상 정도가 크게 완화됨을 확인하였으며, 특히 G-CSF/M-CSF의 혼합 표적 항체를 주입한 그룹에서 폐 손상이 가장 크게 완화된 것을 확인하였다.

또한, 정상그룹, 방사선 노출에 의한 폐 조직 섬유화 그룹 및 G-CSF/M-CSF 단일 또는 혼합 표적 항체 주입한 그룹을 대상으로 세포 외 기질 구성의 주요 요소인 콜라겐의 축적 감소 여부를 확인하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 21에서 나타내는 바와 같이 G-CSF, M-CSF의 단일 표적 항체를 주입한 그룹에 비하여 G-CSF/M-CSF의 혼합 표적 항체를 주입한 그룹에서 방사선 노출에 의해 증가된 콜라겐이 가장 많이 감소된 것을 확인하였다.

또한, 정상그룹, 방사선 노출에 의한 폐 조직 섬유화 그룹 및 G-CSF/M-CSF 단일 및 혼합 표적 항체 주입한 그룹을 대상으로 폐 손상과 관련된 유전자 발현 정도를 비교하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 22에서 나타내는 바와 같이 M-CSF, G-CSF 단일 표적 항체 또는 혼합 표적 항체를 주입한 그룹에서 방사선에 의한 손상에 의해 증가된 활성 분비 인자(M-CSF, G-CSF, α-SMA 및 Collagen)가 감소한 것을 확인하였다. 또한, 도 23에서 나타내는 바와 같이 상피 간엽 이행 조절 인자(Vimentin, ZEB1)가 감소한 것을 확인하였다. 또한, 도 24에서 나타내는 바와 같이 세포 외 기질 구성요소 인자(Versican, HAS3)가 크게 감소된 것을 확인하였다. 특히, 혼합 표적 항체를 주입한 그룹에서 상기 인자들의 발현이 가장 크게 감소된 것을 확인하였다.

5-2. M-CSF(단일), G-CSF(단일), GM-CSF(단일), M-CSF/G-CSF(혼합)의 표적 항체의 폐 섬유화 질환 치료 효과

6Gy 세기의 방사선에 노출된 폐 상피세포 라인 그룹 및 6Gy 세기의 방사선에 노출된 폐 상피세포 라인에 M-CSF와 G-CSF의 단일 표적 항체 또는 혼합 표적 항체를 주입한 그룹을 대상으로 하여 폐 손상과 관련된 유전자 발현 정도를 비교하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 25에서 나타내는 바와 같이 G-CSF, M-CSF 및 GM-CSF의 단일 표적 항체를 주입한 그룹에 비하여 G-CSF/M-CSF의 혼합 표적 항체를 주입한 그룹에서 알파-근섬유화구성단백질(α-SMA) 및 콜라겐의 발현이 더욱 크게 감소하는 것을 확인하였다.

또한, 폐 상피세포를 각각 3 X 10⁵로 세팅하고, 6Gy 세기의 방사선을 조사한 후 다양한 비율(G-CSF/M-CSF = 7/3, 5/5, 3/7)의 G-CSF/M-CSF 혼합 표적 항체를 즉시 처리하고, 48시간을 경과시켰다.

그 결과, 도 26에서 나타내는 바와 같이 G-CSF/M-CSF의 혼합 표적 항체를 주입한 모든 그룹에서 대조군(방사선을 조사하고 항체를 처리하지 않은 실험군)에 비해 알파-근섬유화구성단백질(α-SMA) 및 콜라겐의 발현이 감소함을 확인하였다.

또한, 폐 상피세포를 각각 2 X 10⁵로 세팅하고, 6Gy 세기의 방사선을 조사한 후 G-CSF/M-CSF 혼합 표적 항체를 24시간이후에 처리하고, 48시간을 경과시켰다.

그 결과, 도 26에서 나타내는 바와 같이 G-CSF/M-CSF의 혼합 표적 항체를 주입한 그룹에서 대조군(방사선을 조사하고 항체를 처리하지 않은 실험군)에 비해 알파-근섬유화구성단백질(α-SMA) 및 콜라겐의 발현이 감소하는 것을 확인하였다.

상기 실험 결과들로부터 폐 섬유화 질환에 대하여 복합 표적 항체 치료 요법이 단일 표적 항체 치료 요법에 비하여 그 치료 효과가 크다는 것을 확인하였다. 또한, M-CSF 및 G-CSF의 혼합 표적 항체 적용은 방사선에 의한 조직 손상에 따라 증가된 매개 물질(M-CSF, G-CSF)을 원천적으로 불활성화하여 섬유아세포로의 분화 및 세포 외 기질의 축적을 억제하여 일련의 섬유화 연쇄반응을 제어 가능하게 하여 해당 질환의 예방 및 치료가 가능함을 확인하였다

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

항 G-CSF(Granulocyte-colony stimulating factor) 항체를 유효성분으로 포함하는, 폐 섬유화증 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 폐 섬유화증은 방사선 조사에 의해 유도된 것을 특징으로 하는, 폐 섬유화증 치료용 조성물.
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