WO2023027186A1 - 肺線維化疾患バイオマーカー - Google Patents

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WO2023027186A1
WO2023027186A1 PCT/JP2022/032288 JP2022032288W WO2023027186A1 WO 2023027186 A1 WO2023027186 A1 WO 2023027186A1 JP 2022032288 W JP2022032288 W JP 2022032288W WO 2023027186 A1 WO2023027186 A1 WO 2023027186A1
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WO
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protein
group
family
protein group
pulmonary
Prior art date
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PCT/JP2022/032288
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English (en)
French (fr)
Inventor
吉人 武田
雄也 白井
貴俊 榎本
淳 熊ノ郷
Original Assignee
国立大学法人大阪大学
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to pulmonary fibrotic disease biomarkers and the like.
  • Idiopathic pulmonary fibrosis is an intractable disease in which pulmonary fibrosis progresses irreversibly. Despite recent efforts to elucidate the pathology and develop antifibrotic drugs, the median survival time is only 3-5 years. ing. IPF is a subtype of idiopathic interstitial pneumonia, and its diagnosis is multidisciplinary based on CT images, clinical course, and histopathology. Current guidelines strongly recommend HRCT at the time of diagnosis and image pattern classification (UIP, Probable UIP, Indeterminate for UIP, Alternative diagnosis). On the other hand, approximately 30% of patients with suspected IPF have indeterminant CT images, so invasive procedures such as surgical lung biopsy are required to obtain a definite diagnosis.
  • UIP diagnosis and image pattern classification
  • PF-ILD interstitial lung disease with progressive fibrosis
  • effective treatment options for chronic interstitial lung disease, including IPF have been limited, and only IPF has been shown to be effective as an antifibrotic drug, which is one of the therapeutic agents.
  • PF-ILD interstitial lung diseases other than IPF, which have the common feature of chronic progressive fibrosis, have been collectively called PF-ILD, and the efficacy of antifibrotic drugs against them has been investigated clinically. test was done. As a result, its effectiveness has been demonstrated, and the therapeutic indications of antifibrotic drugs are expanding for PF-ILD as well.
  • Early diagnosis of PFILD is desirable because the therapeutic effect of antifibrotic drugs can be expected as early as possible, but there are no existing biomarkers that reflect the diagnosis and pathology of this new disease concept, Its development is required.
  • Non-Patent Document 1 Currently, various candidates are listed as biomarkers for IPF and PF-ILD from each omics, but none have been widely confirmed to be effective as a single marker. Therefore, attempts have been made to improve disease progression, prognosis, and therapeutic response to antifibrotic drugs by combining clinical data with various biomarker candidates (Non-Patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide a pulmonary fibrotic disease biomarker and a method for using the same.
  • the present invention provides idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) biomarkers and interstitial lung disease with progressive fibrosis (PF-ILD) biomarkers among pulmonary fibrosis diseases, and methods of using the same. is the subject.
  • IPF idiopathic pulmonary fibrosis
  • PF-ILD progressive fibrosis
  • the present invention includes the following aspects.
  • Section 1 A method of testing for pulmonary fibrotic disease, comprising: (1) Protein group (A), protein group (B), protein group (C), protein group (D), protein group (E), in extracellular vesicles of body fluid or blood sample collected from a subject, and protein group (F): (A) ATP-dependent RNA helicase DDX55, Secretoglobin family 3A member 1, BPI fold-containing family B member 1, Pulmonary surfactant-associated protein B, Protein argonaute-2, Pulmonary surfactant-associated protein A2; Pulmonary surfactant-associated protein A1 , Testin, Copine-2, Sorting nexin-18, Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3, and a protein group consisting of CC motif chemokine 18, (B) Cyclin-dependent kinase 11B; protein group consisting of cyclin-dependent kinase 11A, secretogranin-1, and peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A
  • ILD interstitial lung disease
  • IPF idiopathic pulmonary fibrosis
  • Section 4. Item 3, wherein the protein to be detected contains at least one protein selected from the group consisting of protein group (A) and protein group (B).
  • Item 5 When the detected protein contains at least one protein (protein A') selected from protein group (A), (2A) prognosis of IPF, wherein the subject suffers from idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) when the amount or concentration of protein A' detected in step (1) is equal to or higher than the cutoff value is bad or IPF is progressive;
  • protein A' selected from protein group (A)
  • (2A) prognosis of IPF wherein the subject suffers from idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) when the amount or concentration of protein A' detected in step (1) is equal to or higher than the cutoff value is bad or IPF is progressive;
  • IPPF idiopathic pulmonary fibrosis
  • Item 6 When the detected protein contains at least one protein (protein B') selected from protein group (B), (2B) the subject is suffering from idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) when the amount or concentration of protein B' detected in step (1) is below the cutoff value, prognosis of IPF is bad or IPF is progressive;
  • IPF idiopathic pulmonary fibrosis
  • Item 7 Item 1 or 2, wherein the pulmonary fibrosis disease is interstitial lung disease with progressive fibrosis (PF-ILD).
  • PF-ILD progressive fibrosis
  • Item 8. The test according to item 7, wherein the protein to be detected contains at least one protein selected from the group consisting of protein group (C), protein group (D), protein group (E), and protein group (F). Method.
  • Item 9 When the detected protein contains at least one protein (protein CE') selected from the group consisting of protein group (C) and protein group (E), further (2CE) detected in step (1)
  • the subject has interstitial lung disease with progressive fibrosis (PF-ILD) when the amount or concentration of the protein CE' is equal to or greater than the cutoff value, and the prognosis of PF-ILD is determining that PF-ILD is bad or progressive;
  • Item 10 When the detected protein contains at least one protein (protein DF') selected from the group consisting of protein group (D) and protein group (F), further (2DF) detected in step (1)
  • the subject has interstitial lung disease with progressive fibrosis (PF-ILD) when the amount or concentration of protein DF' is less than or equal to the cutoff value, and the prognosis of PF-ILD is determining that PF-ILD is bad or progressive;
  • PF-ILD interstitial lung disease with progressive fibrosis
  • Item 11 Items 1 to 10, wherein the subject is a human.
  • a biomarker for pulmonary fibrotic disease can be provided.
  • Test Example 8 shows the results of Test Example 8, showing the relationship between the amount of BPI fold-containing family B member 1 (BPIFB1) and the pathology of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF).
  • the vertical axis indicates the amount of protein. * indicates P value less than 0.05, ** indicates P value less than 0.005.
  • Fig. 10 shows the results of Test Example 8 showing the relationship between the amount of Pulmonary surfactant-associated protein A2; Pulmonary surfactant-associated protein A1 (SFTPA) and the pathology of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF).
  • the vertical axis indicates the amount of protein. * indicates P value less than 0.05, ** indicates P value less than 0.005.
  • Test Example 8 shows the results of Test Example 8 showing the relationship between the amount of KL6 in serum and the pathology of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF).
  • the vertical axis indicates the amount of protein. * indicates P value less than 0.05, ** indicates P value less than 0.005.
  • SFTPB Pulmonary surfactant-associated protein B
  • the vertical axis indicates the amount of protein. Numbers in parentheses on the horizontal axis are the number of subjects. HC indicates the Healthy Control group.
  • 12 shows the results of Test Example 12 showing the relationship between pulmonary surfactant-associated protein B (SFTPB) and the pathology of interstitial lung disease with progressive fibrosis (PF-ILD).
  • the vertical axis indicates the amount of protein. * indicates P value less than 0.05.
  • a study showing the relationship between the amount of LDL receptor-related protein 1 (LRP1) and Pulmonary surfactant-associated protein B (SFTPB) in the serum extracellular vesicle fraction and life prognosis in each of 206 ILD patients (nonIPF) 13 results are shown.
  • ELISA quantification results of serum SFTPB in healthy subjects (HC), IPF patients, and PF-ILD patients are shown (Test Example 15).
  • the vertical axis indicates the amount of SFTPB in serum exosomes calculated by DIA proteome analysis, and the horizontal axis indicates the ELISA quantification value of SFTPB in serum.
  • ELISA quantification results of serum SFTPB in healthy subjects (HC), IPF patients, and PF-ILD patients are shown (Test Example 15).
  • the upper row shows the amount of SFTPB in serum exosomes in each group calculated by DIA proteome analysis, and the lower row shows the ELISA quantification value of SFTPB in serum in each group.
  • ELISA quantification results of serum LRP1 in healthy subjects (HC), IPF patients, and PF-ILD patients are shown (Test Example 15).
  • the vertical axis indicates the amount of LRP1 in serum exosomes calculated by DIA proteome analysis
  • the horizontal axis indicates the ELISA quantification value of LRP1 in serum.
  • ELISA quantification results of serum LRP1 in healthy subjects HC
  • IPF patients IPF patients
  • PF-ILD patients PF-ILD patients
  • the upper row shows the amount of LRP1 in serum exosomes in each group calculated by DIA proteome analysis
  • the lower row shows the ELISA quantification value of LRP1 in serum in each group.
  • the results of immunostaining lung specimens of IPF patients and controls with Anti-Surfactant Protein B (Mature) antibody [RM370] ab271345 and Anti-LRP1 antibody [EPR3724] ab92544 are shown (Test Example 16).
  • Fig. 2 shows the results of immunoblot quantification of the expression levels of SP-B (surfactant protein B: SFTPB) in serum-derived extracellular vesicle fraction samples from healthy subjects and patients with various diseases (Test Example 17).
  • SP-B surfactant protein B: SFTPB
  • a method for examining pulmonary fibrotic disease comprising: (1) a protein group in extracellular vesicles of body fluid collected from a subject or in a blood sample; Step of detecting at least one protein selected from the group consisting of (A), protein group (B), protein group (C), protein group (D), protein group (E), and protein group (F) It relates to an inspection method including (step 1) (in this specification, it may be referred to as the “inspection method of the present invention”). This will be explained below.
  • pulmonary fibrosis disease The type of "pulmonary fibrosis disease" to be tested is not particularly limited. All classes, grades, and stages of pulmonary fibrotic disease according to various classification criteria for progression of pulmonary fibrotic disease can be tested. Specific examples of pulmonary fibrosis diseases include, for example, interstitial lung disease, more specifically idiopathic pulmonary fibrosis, interstitial lung disease with progressive fibrosis, chronic hypersensitivity pneumonitis, idiopathic pulmonary Interstitial pneumonia, idiopathic organizing pneumonia, acute interstitial pneumonia, exfoliative interstitial pneumonia, lymphocytic interstitial pneumonia, respiratory bronchiolitis-associated interstitial pneumonia, other interstitial pneumonia of unknown cause Pneumonia, interstitial pneumonia due to collagen disease, interstitial pneumonia due to occupation/environment, interstitial pneumonia due to drugs, interstitial pneumonia due to radiation, interstitial pneumonia due to infectious disease (virus, bacteria, etc.), sarcoidosis, etc.
  • interstitial lung disease more specifically
  • interstitial lung disease preferably interstitial lung disease (ILD), more preferably idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), interstitial lung disease with progressive fibrosis (PF-ILD), chronic hypersensitivity
  • ILD interstitial lung disease
  • IPF idiopathic pulmonary fibrosis
  • PF-ILD interstitial lung disease with progressive fibrosis
  • CPP pneumonia
  • PNF idiopathic pulmonary fibrosis
  • PF-ILD interstitial lung disease with progressive fibrosis
  • chronic hypersensitivity examples include pneumonia (CHP) and the like, and particularly preferred examples include idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), interstitial lung disease with progressive fibrosis (PF-ILD), and the like.
  • the subject is the target organism of the testing method of the present invention, and its species is not particularly limited.
  • Species of the subject include, for example, various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits, preferably humans.
  • Subjects include, for example, a subject with unknown pulmonary fibrosis disease, a subject already determined to have pulmonary fibrosis disease by another method, and a subject without pulmonary fibrosis disease. and a sample already determined by another method, a sample under treatment for pulmonary fibrotic disease, a sample after treatment for pulmonary fibrotic disease, and the like.
  • the sample to be detected in step (1) is preferably extracellular vesicles of body fluid.
  • Body fluids include, for example, whole blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, saliva, synovial fluid, urine, tissue fluid (including bronchoalveolar lavage fluid), sweat, tears, sputum, nasal discharge, exhaled breath, exhaled breath condensate, etc.
  • Whole blood, serum, plasma and cerebrospinal fluid are preferred, and whole blood, serum and plasma are more preferred.
  • One type of body fluid may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • a body fluid can be collected from a subject by a method known to those skilled in the art.
  • whole blood can be collected by blood collection using a syringe or the like.
  • Serum is a portion of whole blood from which blood cells and specific blood coagulation factors have been removed, and can be obtained, for example, as a supernatant after coagulation of whole blood.
  • Plasma is a portion of whole blood from which blood cells have been removed, and can be obtained, for example, as a supernatant when whole blood is subjected to centrifugation under non-clotting conditions.
  • blood samples blood itself such as whole blood, serum, plasma, etc., or blood-derived samples are referred to as "blood samples”.
  • Extracellular vesicles are not particularly limited as long as they are membrane vesicles that are secreted or released from cells.
  • Extracellular vesicles are usually defined as membrane vesicles that carry intracellular proteins and genetic information (mRNA, microRNA, etc.) to the outside of cells, and are responsible for local and systemic intercellular communication. be.
  • Extracellular vesicles include, for example, exosomes, microvesicles, apoptotic bodies, ectosomes, microparticles, secretory microvesicles and the like.
  • Extracellular vesicles can be purified, separated, concentrated, etc. from body fluids according to or in accordance with known methods.
  • Methods for purifying, separating, and concentrating extracellular vesicles include, for example, ultracentrifugation (e.g., pellet down method, sucrose cushion method, density gradient centrifugation method, etc.), methods using immunoaffinity carriers, gel filtration, field centrifugation, and the like. Flow fractionation method, FACS method and the like can be mentioned. Purification, separation, concentration and the like of extracellular vesicles can also be performed using commercially available kits. These methods may be employed singly or in combination of two or more.
  • the detection target in step (1) is selected from the group consisting of protein group (A), protein group (B), protein group (C), protein group (D), protein group (E), and protein group (F). (In this specification, these may be collectively referred to as "proteins of interest").
  • Protein group (A) consists of (A) ATP-dependent RNA helicase DDX55, Secretoglobin family 3A member 1, BPI fold-containing family B member 1, Pulmonary surfactant-associated protein B, Protein argonaute-2, Pulmonary surfactant-associated protein A2 A group of proteins consisting of Pulmonary surfactant-associated protein A1, Testin, Copine-2, Sorting nexin-18, Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3, and C-C motif chemokine 18.
  • Protein group (A) is a protein group whose amount in pulmonary fibrotic disease specimens (preferably idiopathic pulmonary fibrosis (IPF)) is higher than that in normal specimens.
  • IPF idiopathic pulmonary fibrosis
  • Protein group (B) is a protein group consisting of (B) Cyclin-dependent kinase 11B; Cyclin-dependent kinase 11A, Secretogranin-1, and Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A.
  • Protein group (B) is a protein group whose amount in pulmonary fibrotic disease specimens (preferably idiopathic pulmonary fibrosis (IPF)) is lower than that in normal specimens.
  • IPF idiopathic pulmonary fibrosis
  • Protein group (C) includes (C) Surfactant protein B, BPI fold containing family B member 1, Argonaute 2, RISC catalytic component, Small integral membrane protein 1 (Vel blood group), Secretoglobin family 3A member 1, Sorting nexin 18, Myelin protein zero like 1, Alpha hemoglobin stabilizing protein, Glycoprotein nmb, Yip1 interacting factor homolog B, membrane trafficking protein, Synaptogyrin 1, LDL receptor related protein 1, Cysteine rich transmembrane module containing 1, Testin LIM domain protein, Endoplasmic reticulum protein 29, A protein group consisting of Erythrocyte membrane protein band 4.2, Reticulon 4, Synaptogyrin 2, and Spectrin alpha, erythrocytic 1.
  • Surfactant protein B BPI fold containing family B member 1, Argonaute 2, RISC catalytic component, Small integral membrane protein 1 (Vel blood group), Secretoglobin family 3A member 1, Sorting nexin 18, Myel
  • Protein group (C) is a protein group whose amount in pulmonary fibrosis disease specimens (preferably interstitial lung disease with progressive fibrosis (PF-ILD)) is higher than that in normal specimens.
  • PF-ILD progressive fibrosis
  • Protein group (D) includes (D) Cyclin dependent kinase 11A, B, FYN proto-oncogene, Src family tyrosine kinase, Peptidylprolyl isomerase A, Serpin family B member 6, Tubulin alpha 8, Sorbitol dehydrogenase, Chromogranin B, Claudin 3, Metallo-beta-lactamase domain containing 2, Inositol polyphosphate-5-phosphatase A, NGFI-A binding protein 2, BRICK1, SCAR/WAVE actin nucleating complex subunit, Tropomyosin 1, PX domain containing serine/threonine kinase-like, Galectin-like, Tandem C2 domains, nuclear, YKT6 v-SNARE homolog, Plexin B2, Nectin cell adhesion molecule 2, Glutathione peroxidase 4, SH3 domain binding glutamate rich protein like 2, C-C motif chemokine receptor 4,
  • Protein group (D) is a protein group whose amount in pulmonary fibrosis disease specimens (preferably interstitial lung disease with progressive fibrosis (PF-ILD)) is lower than that in normal specimens.
  • PF-ILD interstitial lung disease with progressive fibrosis
  • Protein group (E) is a protein group consisting of (E) Surfactant protein B and LDL receptor related protein 1.
  • Protein group (E) has an amount in a pulmonary fibrotic disease specimen (preferably interstitial lung disease with progressive fibrosis (PF-ILD)) that is higher than that in a control specimen (preferably interstitial with progressive fibrosis). This is a protein group that is higher than the amount in interstitial lung disease (non PF-ILD) specimens).
  • PF-ILD interstitial lung disease with progressive fibrosis
  • Protein group (F) is a protein group consisting of (F) CD34 molecule, S100 calcium binding protein A13, and Family with sequence similarity 49 member B.
  • Protein group (F) has an abundance in a pulmonary fibrotic disease specimen (preferably interstitial lung disease with progressive fibrosis (PF-ILD)) compared to a control specimen (preferably interstitial with progressive fibrosis) It is a protein group that is lower than the amount in interstitial lung disease (non PF-ILD) specimens).
  • PF-ILD interstitial lung disease with progressive fibrosis
  • the proteins of the protein groups (A) to (F) are, in the case of humans, proteins specified by the UniProtKB accession numbers shown in Tables 1 to 6 in Examples below. For other species, it is an orthologue of the protein identified by the UniProtKB accession numbers shown in Tables 1-6.
  • the number of target proteins in step (1) may be one, or a combination of two or more.
  • more detection targets for example, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50 or more
  • Detection is usually performed by measuring the amount or concentration of the target protein.
  • “Concentration” is not limited to absolute concentration, but may be relative concentration, weight per unit volume, or raw data measured to know absolute concentration.
  • the method for detecting the target protein is not particularly limited as long as it can specifically detect part or all of the target protein.
  • Specific examples of the detection method include mass spectrometry for detecting peptides constituting the target protein, and immunoassay using an antibody that specifically recognizes the target protein.
  • the amino acid sequence information of the target protein can be obtained by searching the database of EBI (http://www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhelp.html) based on the UniProtKB accession number.
  • Immunohistochemical staining methods ELISA methods, EIA methods, RIA methods, Western blotting methods, etc. can be suitably exemplified as immunological measurement methods.
  • a peptide sample is turned into gaseous ions (ionized) using an ion source, and the peptide sample is moved in vacuum in an analysis unit and ionized using electromagnetic force or by time-of-flight difference.
  • a measurement method using a mass spectrometer that can separate and detect according to the ratio.
  • Methods of ionization using an ion source include the EI method, CI method, FD method, FAB method, MALDI method, and ESI method. and other methods can be selected as appropriate, and methods for separating the ionized peptide sample in the analysis unit include magnetic field deflection, quadrupole, ion trap, time-of-flight (TOF), and Fourier transform.
  • a separation method such as an ion cyclotron resonance type can be appropriately selected.
  • tandem mass spectrometry combining two or more mass spectrometry methods and triple quadrupole mass spectrometry can be used.
  • the sample if the sample contains phosphorylated peptides, the sample can be concentrated using iron ion immobilization affinity chromatography (Fe-IMAC) prior to sample introduction into the mass spectrometer.
  • Fe-IMAC iron ion immobilization affinity chromatography
  • peptides constituting the target protein can be separated and purified and used as a sample by liquid chromatography (LC) or HPLC.
  • the detection unit and data processing method can be selected as appropriate.
  • a peptide that has the same amino acid sequence as the peptide and is labeled with a stable isotope of known concentration is used as an internal standard. can do.
  • a stable isotope-labeled peptide one or more of the amino acids in the peptide constituting the target protein to be detected is a stable isotope-labeled peptide containing any one or more of 15N, 13C, 18O, and 2H. can be selected as appropriate, and such stable isotope-labeled peptides are produced by the F-moc method (Amblard., et al. Methods Mol Biol.
  • iTRAQ registered trademark
  • ICAT registered trademark
  • ICPL registered trademark
  • NBS registered trademark
  • the amount and/or concentration of the target protein which is a detection index for pulmonary fibrotic disease, can be provided, thereby assisting detection of pulmonary fibrotic disease. can do.
  • test results obtained by the test method of the present invention including step (1) are used as therapeutic markers for antifibrotic drugs, elucidation of the pathology of pulmonary fibrotic diseases, prognosis prediction of pulmonary fibrotic diseases, subject stratification, and treatment methods. It can be used for selection (personalized medicine, therapeutic response), intractability in pulmonary fibrotic disease, evaluation of remodeling, differentiation of histological type, phenotype, etc. of pulmonary fibrotic disease.
  • Process (2) As one aspect of the inspection method of the present invention, When the detected protein contains at least one protein (protein ACE') selected from the group consisting of protein group (A), protein group (C), and protein group (E), further (2ACE) if the amount or concentration of the protein ACE' detected in step (1) is equal to or greater than the cutoff value, the subject suffers from pulmonary fibrotic disease, and the prognosis of pulmonary fibrotic disease is determining that the pulmonary fibrotic disease is bad or progressive; is preferably included. According to the examination method of the present invention including step 2ACE, it is possible to determine pulmonary fibrotic disease.
  • protein ACE' protein selected from the group consisting of protein group (A), protein group (C), and protein group (E)
  • the detected protein contains at least one protein (protein BDF') selected from the group consisting of protein group (B), protein group (D), and protein group (F), (2BDF)
  • protein BDF' protein BDF' selected from the group consisting of protein group (B), protein group (D), and protein group (F)
  • the prognosis of pulmonary fibrotic disease is determining that the pulmonary fibrotic disease is bad or progressive; is preferably included.
  • the examination method of the present invention including step 2BDF, it is possible to determine pulmonary fibrotic disease.
  • the testing method of the present invention comprises, as one aspect, When the detected protein contains at least one protein (protein A') selected from protein group (A), (2A) prognosis of IPF, wherein the subject suffers from idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) when the amount or concentration of protein A' detected in step (1) is equal to or higher than the cutoff value is bad or IPF is progressive; is preferably included.
  • the testing method of the present invention including step 2A, it is possible to determine idiopathic pulmonary fibrosis (IPF).
  • the testing method of the present invention comprises, as one aspect, When the detected protein contains at least one protein (protein B') selected from protein group (B), (2B) the subject is suffering from idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) when the amount or concentration of protein B' detected in step (1) is below the cutoff value, prognosis of IPF is bad or IPF is progressive; is preferably included. According to the testing method of the present invention including step 2B, it is possible to determine idiopathic pulmonary fibrosis (IPF).
  • protein B' protein selected from protein group (B)
  • the subject is suffering from idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) when the amount or concentration of protein B' detected in step (1) is below the cutoff value, prognosis of IPF is bad or IPF is progressive; is preferably included.
  • the testing method of the present invention including step 2B, it is possible to determine idiopathic pulmonary fibrosis (IPF).
  • the testing method of the present invention comprises, as one aspect,
  • the detected protein contains at least one protein (protein CE') selected from the group consisting of protein group (C) and protein group (E), (2CE) when the amount or concentration of the protein CE' detected in step (1) is equal to or higher than the cutoff value, the subject has interstitial lung disease with progressive fibrosis (PF-ILD) Determining that PF-ILD is afflicted, has a poor prognosis for PF-ILD, or is progressive; is preferably included.
  • the testing method of the present invention including step 2CE, it is possible to determine interstitial lung disease accompanied by progressive fibrosis (PF-ILD).
  • the testing method of the present invention comprises, as one aspect, When the detected protein contains at least one protein (protein DF') selected from the group consisting of protein group (D) and protein group (F), (2DF) when the amount or concentration of protein DF' detected in step (1) is below the cutoff value, the subject has interstitial lung disease with progressive fibrosis (PF-ILD) Determining that PF-ILD is afflicted, has a poor prognosis for PF-ILD, or is progressive; is preferably included. According to the examination method of the present invention including step 2DF, it is possible to determine interstitial lung disease accompanied by progressive fibrosis (PF-ILD).
  • the cut-off value can be appropriately set by those skilled in the art from the viewpoint of sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value, etc.
  • Subject not suffering from a specific pulmonary fibrosis disease such as PF-ILD and suffering from a pulmonary fibrosis disease other than the specific pulmonary fibrosis disease, subject suffering from a pulmonary fibrosis disease subject, subject with IPF, subject with PF-ILD), the It can be a value determined each time or a predetermined value.
  • the cutoff value is, for example, the amount and / or concentration of the target protein in extracellular vesicles of body fluid or blood sample collected from a subject not suffering from pulmonary fibrotic disease (when there are multiple subjects, the average value, median, etc.), for example, 0.7 to 1.5 times. It can also be set by performing statistical analysis (more specifically, a method using Youden index is exemplified) based on Receiver Operating Characteristic (ROC) curve analysis, etc. can.
  • ROC Receiver Operating Characteristic
  • the cutoff value is, for example, the amount of the target protein in a past sample of the same subject and/or Alternatively, the therapeutic effect can be determined by using a concentration-based value.
  • the test method of the present invention including the step (2) of diagnosing pulmonary fibrotic disease with higher accuracy determines that the subject is suffering from pulmonary fibrotic disease
  • the test method of the present invention further includes By combining the steps of applying a diagnosis of pulmonary fibrotic disease by a physician, pulmonary fibrotic disease can be diagnosed with higher accuracy.
  • the testing method of the present invention can more accurately detect pulmonary fibrotic disease, combining the above steps with the testing method of the present invention can more efficiently and more accurately identify patients suffering from pulmonary fibrosis disease. can be diagnosed.
  • test method of the present invention including the treatment step (2) for pulmonary fibrosis disease determines that the subject has a pulmonary fibrosis disease
  • the test method of the present invention may additionally be treated with the above "2 Diagnosis of pulmonary fibrotic disease with higher accuracy”, when the patient is diagnosed as suffering from pulmonary fibrotic disease, the combination of the examination method of the present invention and the step of applying the diagnosis by a doctor is effective.
  • treating a subject determined or diagnosed as having a pulmonary fibrosis disease by performing a step of treating the disease; It becomes possible.
  • the examination method of the present invention can more accurately detect pulmonary fibrotic diseases
  • the steps for the examination method of the present invention or the combination of the examination method of the present invention and the step of applying a diagnosis by a doctor are applied. By combining 3, subjects suffering from pulmonary fibrotic disease can be treated more efficiently and more reliably.
  • the treatment method for pulmonary fibrotic disease is not particularly limited, but typically includes drug treatment.
  • Pharmaceuticals used for drug therapy are not particularly limited, but include, for example, antifibrotic agents such as Pirespa; steroids; immunosuppressants;
  • antifibrotic agents such as Pirespa; steroids; immunosuppressants;
  • anticholinergic drugs such as Spiriva, Siebli, Enclasse, Ekrira, Atrovent, and Tercigan; Stimulants; anticholinergic drugs/ ⁇ 2 stimulant combination drugs such as Ultibro, Anoro, and Spiort
  • steroid drugs such as Cubal, Flutide, Palmicort, Alvesco, and Asmanex; steroid drug/ ⁇ 2 stimulant drug combinations such as Advair, Symbicort, and Relvea etc.
  • One, two, or a combination of three or more medicaments can be used.
  • a test agent and test kit for pulmonary fibrosis disease protein group (A), protein group (B), protein group (C), protein group (D), protein group (E), and A diagnostic agent for pulmonary fibrotic disease, containing at least one protein-detecting agent selected from the group consisting of protein group (F) (in the present specification, it may be referred to as "the diagnostic agent of the present invention"). Regarding. This will be explained below.
  • protein group (A), protein group (B), protein group (C), protein group (D), protein group (E), protein group (F), pulmonary fibrosis disease, etc. see “1.
  • the definition is the same as the definition in “Methods of testing for inflammatory diseases”.
  • the detection agent is not particularly limited as long as it can specifically detect the target protein.
  • the detection agent includes, for example, an antibody against the target protein.
  • the detection agent may be modified as long as its function is not significantly impaired. Modifications include, for example, addition or introduction of labels such as fluorescent dyes, luminescent substances, dyes, enzymes, proteins, radioisotopes, chemiluminescent substances, colloidal gold, biotin, and the like.
  • the detection agent can also be used by immobilizing it on any solid phase.
  • the test agent of the present invention can be provided in the form of a substrate on which a detection agent is immobilized (for example, a microarray chip on which probes are immobilized, etc. As another example, an ELISA plate on which antibodies are immobilized, etc.).
  • the solid phase used for immobilization is not particularly limited as long as it can immobilize antibodies and the like. Examples include glass plates, nylon membranes, microbeads, silicon chips, capillaries and other substrates. can. Immobilization of the detection agent to the solid phase is not particularly limited.
  • the antibody is not particularly limited as long as it selectively (specifically) recognizes the target protein.
  • selectively (specifically) recognize means that the target protein can be specifically detected in, for example, Western blotting or ELISA, but is not limited thereto. Any substance can be used as long as it can be determined that the detected substance is derived from the target protein.
  • Antibodies include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single-chain antibodies, or portions of the above antibodies that have antigen-binding properties, such as Fab fragments and fragments generated by Fab expression libraries.
  • the antibody of the present invention also includes an antibody that has antigen-binding to a polypeptide consisting of at least 8 consecutive amino acids, preferably 15 amino acids, more preferably 20 amino acids in the amino acid sequence of the target protein.
  • the antibodies of the present invention can also be produced according to these conventional methods (Current protocols in Molecular Biology, Chapter 11.12-11.13 (2000)).
  • the antibody of the present invention is a polyclonal antibody
  • an oligopeptide having a partial amino acid sequence of the target protein is synthesized using a target protein expressed in Escherichia coli or the like and purified according to a standard method. Then, it is possible to immunize a non-human animal such as a rabbit and obtain the serum from the immunized animal according to a conventional method.
  • a non-human animal such as a mouse is immunized with a target protein expressed and purified in Escherichia coli or the like according to a conventional method, or an oligopeptide having a partial amino acid sequence of the target protein, and spleen cells obtained by immunizing a non-human animal such as a mouse are used. It can be obtained from hybridoma cells prepared by cell fusion with myeloma cells (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4-11.11).
  • the target protein used as an immunizing antigen for the production of antibodies is based on the known gene sequence information, DNA cloning, construction of each plasmid, transfection into the host, culture of transformants, and recovery of the protein from the culture. can be obtained by the operation of These manipulations are performed according to methods known to those skilled in the art or methods described in literature (Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)). can be done.
  • a recombinant DNA capable of expressing a gene encoding a target protein in a desired host cell is prepared, introduced into the host cell for transformation, and the transformant is cultured.
  • the protein By recovering the target protein from the resulting culture, the protein can be obtained as an immunizing antigen for producing the antibody of the present invention.
  • a partial peptide of the target protein can also be produced by a general chemical synthesis method (peptide synthesis) according to known gene sequence information.
  • the antibody of the present invention may also be prepared using an oligopeptide having a partial amino acid sequence of the target protein.
  • the oligo(poly)peptides used for the production of such antibodies need not have functional biological activity, but desirably have immunogenic properties similar to the protein of interest.
  • An oligo(poly)peptide preferably having this immunogenic property and consisting of at least 8 consecutive amino acids, preferably 15 amino acids, more preferably 20 amino acids in the amino acid sequence of the target protein can be exemplified.
  • Antibodies against such oligo(poly)peptides can also be produced by enhancing the immunological response using various adjuvants depending on the host.
  • adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, and surface agents such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin and dinitrophenol.
  • Active substances human adjuvants such as BCG (Bacille Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum.
  • the test agent of the present invention may be in the form of a composition.
  • the composition may contain other ingredients as needed.
  • Other components include bases, carriers, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, thickeners, humectants, colorants, and perfumes. , chelating agents and the like.
  • the test agent of the present invention may be in the form of a kit.
  • the kit may contain, in addition to the detection agent or the composition containing the same, those that can be used to detect the target protein in extracellular vesicles of body fluids or blood samples of a subject.
  • Specific examples of such materials include various reagents (eg, secondary antibodies, buffer solutions, etc.), instruments (eg, extracellular vesicle purification, separation, and concentration instruments (eg, columns, etc.)), and the like.
  • the prophylactic or therapeutic agent for pulmonary fibrotic disease of the present invention suppression of at least one protein selected from the group consisting of protein group (A), protein group (C), and protein group (E) agent, and at least one agent selected from the group consisting of protein enhancers selected from the group consisting of protein group (B), protein group (D), and protein group (F)
  • the present invention relates to a prophylactic or therapeutic agent for pulmonary fibrotic diseases (which may be referred to herein as the “agent of the present invention”). This will be explained below.
  • protein group (A), protein group (B), protein group (C), protein group (D), protein group (E), protein group (F), pulmonary fibrosis disease, etc. see “1.
  • the definition is the same as the definition in “Methods of testing for inflammatory diseases”.
  • Inhibitors include, for example, antibodies against target proteins.
  • the antibody the same antibody as described in the above “4. Test agent and test kit for pulmonary fibrosis disease” can be used.
  • Another example of an inhibitor is a target protein expression inhibitor.
  • the agent for suppressing the expression of the target protein is not particularly limited as long as it can suppress the expression level of the target protein, its mRNA, its precursor, etc.
  • examples include gene-specific small interfering RNA (siRNA) of the target protein, target Gene-specific microRNA (miRNA) for proteins, gene-specific antisense nucleic acids for target proteins, expression vectors for these; gene-specific ribozymes for target proteins; gene editing agents for target proteins by CRISPR/Cas system, etc.
  • the expression suppression means that the expression level of the target protein, its mRNA, etc. , 1/200, 1/300, 1/500, 1/1000, 1/10000 or less, and also includes setting the expression level to zero.
  • Enhancers include, for example, target protein expression enhancers.
  • the agent for enhancing the expression of the target protein is not particularly limited as long as it can enhance the expression level of the target protein, its mRNA, its precursor, etc.
  • Examples include expression vectors for the target protein.
  • expression enhancement means that the expression level of the target protein, its mRNA, etc. is enhanced, for example, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, 100, 200, 300, 500, 1000, 10000 times. means.
  • the gene siRNA of the target protein is not particularly limited as long as it is a double-stranded RNA molecule that specifically suppresses the expression of the gene encoding the target protein.
  • the siRNA is preferably, for example, 18 bases or longer, 19 bases or longer, 20 bases or longer, or 21 bases or longer.
  • the siRNA preferably has a length of, for example, 25 bases or less, 24 bases or less, 23 bases or less, or 22 bases or less. Any combination of the upper and lower limits of the siRNA length described herein is assumed.
  • siRNA may be shRNA (small hairpin RNA).
  • a portion of shRNA can be designed to form a stem-loop structure.
  • sequence a if the sequence of a certain region is sequence a, and the complementary strand to sequence a is sequence b, these sequences are present in one RNA strand in the order of sequence a, spacer, and sequence b. and can be designed to be 45-60 bases in length overall.
  • Sequence a is a sequence of a partial region of the base sequence encoding the target protein of interest, and the target region is not particularly limited, and any region can be a candidate.
  • the length of sequence a is 19-25 bases, preferably 19-21 bases.
  • the gene-specific siRNA of the target protein may have additional bases at the 5' or 3' end.
  • the length of the additional bases is usually about 2-4 bases.
  • the additional base may be either DNA or RNA, but using DNA may improve the stability of the nucleic acid.
  • Such additional base sequences include, for example, ug-3', uu-3', tg-3', tt-3', ggg-3', guuu-3', gttt-3', tttt-3 ', uuuuuu-3', and the like, but are not limited to these.
  • the siRNA may have an overhang sequence (overhang) at the 3' end, and specifically includes those with dTdT (dT represents deoxythymidine) added. It may also be a blunt end (blunt end) without terminal addition.
  • the siRNA may have a different number of bases in the sense strand and the antisense strand.
  • aiRNA asymmetrical interfering RNA
  • a typical aiRNA consists of an antisense strand of 21 nucleotides, a sense strand of 15 nucleotides, and an overhang structure of 3 nucleotides at each end of the antisense strand.
  • the position of the target sequence of the gene-specific siRNA of the protein of interest is not particularly limited, but in one embodiment, the target sequence is from the 5'-UTR and the start codon to about 50 bases and from a region other than the 3'-UTR. Sequence selection is preferred. BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ ) to confirm the specificity of the selected target sequence.
  • a sense strand having a TT or UU 3' overhang at 19-21 bases after AA (or NA), a sequence complementary to the 19-21 bases and TT or A double-stranded RNA consisting of an antisense strand having a UU 3'-terminal overhang may be designed as an siRNA.
  • siRNA which is a precursor of siRNA
  • an arbitrary linker sequence (for example, about 5 to 25 bases) capable of forming a loop structure is appropriately selected, and the sense strand and antisense strand are connected via the linker sequence. It can be designed by concatenating.
  • siRNA and/or shRNA sequences can be searched using search software provided free of charge on various websites. Examples of such sites include the following. siRNA Target Finder provided by Ambion (http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html) Insert design tool for pSilencer® Expression Vector (http://www.ambion.com/ jp/techlib/misc/psilencer_converter.html) GeneSeer provided by RNAi Codex (http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi).
  • siRNA is prepared by synthesizing the sense strand and antisense strand of the target sequence on mRNA with an automatic DNA/RNA synthesizer, and denaturing them in an appropriate annealing buffer at about 90 to about 95°C for about 1 minute. It can be prepared by annealing at about 30 to about 70° C. for about 1 to about 8 hours. It can also be prepared by synthesizing shRNA, which is a precursor of siRNA, and cleaving it with the RNA-cleaving protein dicer.
  • the gene-specific miRNA for the target protein is optional as long as it inhibits translation of the gene encoding the target protein.
  • miRNAs may bind to the 3' untranslated region (UTR) of the target and inhibit its translation, rather than cleaving the target mRNA as siRNAs do.
  • miRNA may be pri-miRNA (primary miRNA), pre-miRNA (precursor miRNA), or mature miRNA.
  • the length of miRNA is not particularly limited, and the length of pri-miRNA is usually several hundred to several thousand bases, the length of pre-miRNA is usually 50-80 bases, and the length of mature miRNA is usually 18 bases. ⁇ 30 bases.
  • the gene-specific miRNA of the protein of interest is preferably pre-miRNA or mature miRNA, more preferably mature miRNA.
  • Such gene-specific miRNAs for target proteins may be synthesized by known methods or purchased from companies that provide synthetic RNAs.
  • a gene-specific antisense nucleic acid for a target protein is a nucleic acid comprising a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to the nucleotide sequence of the mRNA of the gene encoding the target protein, or a part thereof, and is specific to the mRNA. It is a nucleic acid that has the function of inhibiting target protein synthesis by forming and binding to a stable double strand.
  • Antisense nucleic acids can be DNA, RNA, or DNA/RNA chimeras. When the antisense nucleic acid is DNA, an RNA:DNA hybrid formed by the target RNA and the antisense DNA is recognized by endogenous ribonuclease H (RNase H) to cause selective degradation of the target RNA.
  • RNase H endogenous ribonuclease H
  • the target sequence may be not only the sequence in mRNA but also the sequence of the intron region in the initial translation product of the gene of interest protein.
  • the intron sequence can be determined by comparing the genomic sequence and the cDNA nucleotide sequence of the gene of the target protein using homology search programs such as BLAST and FASTA.
  • the target region of the gene-specific antisense nucleic acid of the target protein is not limited in length as long as the hybridization of the antisense nucleic acid results in inhibition of translation into the target protein.
  • a gene-specific antisense nucleic acid for a protein of interest may be the entire sequence or a partial sequence of the mRNA encoding the protein of interest. Oligonucleotides of about 10 to about 40 bases, particularly about 15 to about 30 bases, are preferred in consideration of ease of synthesis, antigenicity, intracellular translocation, etc., but are not limited to these.
  • the 3' end hairpin loop or the like can be selected as a preferred target region of the antisense nucleic acid, but is not limited thereto.
  • the gene-specific antisense nucleic acid of the target protein not only hybridizes with the mRNA or initial transcript of the target protein gene to inhibit translation into protein, but also binds to these genes, which are double-stranded DNA. It may be one that can form a triplex and inhibit transcription to RNA (antigene).
  • nucleotide molecules that make up the above-described gene-specific siRNA of the protein of interest, gene-specific miRNA of the protein of interest, and gene-specific antisense nucleic acid of the protein of interest have stability (chemical and/or enzymatic) and specific activity ( Various chemical modifications may be included in order to improve affinity with RNA).
  • the phosphate residue (phosphate) of each nucleotide that constitutes the antisense nucleic acid is replaced with, for example, phosphorothioate (PS), methylphosphonate, phosphorodithioate. can be substituted with chemically modified phosphate residues such as phosphorodithioates.
  • the base moiety pyrimidine, purine
  • part of the nucleotide molecules that constitute siRNA or miRNA may be replaced with natural DNA.
  • Gene-specific siRNAs for proteins of interest, gene-specific miRNAs for proteins of interest, and gene-specific antisense nucleic acids for proteins of interest, etc. target mRNA or early transcripts based on the cDNA or genomic DNA sequence of the gene for the protein of interest. It can be prepared by determining the sequence and synthesizing a complementary sequence using a commercially available automatic DNA/RNA synthesizer. In addition, antisense nucleic acids containing the various modifications described above can also be chemically synthesized by known techniques.
  • the expression vector comprises a promoter sequence and a gene-specific siRNA for the protein of interest, a gene-specific miRNA for the protein of interest, a gene-specific antisense nucleic acid for the protein of interest, or a coding sequence for the protein of interest (optionally and a transcription termination signal sequence), optionally other sequences.
  • the promoter is not particularly limited, for example, RNA polymerase II (polII) promoters such as CMV promoter, EF1 promoter, SV40 promoter, MSCV promoter, hTERT promoter, ⁇ -actin promoter, CAG promoter; mouse and human U6-snRNA promoters; Examples thereof include RNA polymerase III (polIII) promoters such as human H1-RNase P RNA promoter and human valine-tRNA promoter.
  • Other sequences are not particularly limited, and various known sequences that can be contained in an expression vector can be employed. Examples of such sequences include origins of replication, drug resistance genes, and the like.
  • the types of drug-resistant genes and the types of vectors can be exemplified by those described above.
  • ribozyme in the narrow sense means RNA having enzymatic activity that cleaves nucleic acid, but in the present application also includes DNA as long as it has sequence-specific nucleic acid cleaving activity.
  • the most versatile ribozyme nucleic acids are self-splicing RNAs found in infectious RNAs such as viroids and virusoids, and hammerhead and hairpin types are known.
  • the hammerhead type exhibits enzymatic activity at about 40 bases, and a few bases at each end (about 10 bases in total) adjacent to the part that forms the hammerhead structure are linked to the sequence complementary to the desired cleavage site of the mRNA. By doing so, it is possible to specifically cleave only the target mRNA.
  • This type of ribozyme nucleic acid has the advantage that it does not attack genomic DNA because it uses only RNA as a substrate.
  • the target sequence is converted to a single strand by using a hybrid ribozyme that ligates an RNA motif derived from a viral nucleic acid that can specifically bind to RNA helicase.
  • a hybrid ribozyme that ligates an RNA motif derived from a viral nucleic acid that can specifically bind to RNA helicase.
  • the application target of the agent of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, rabbits, pigs, horses, cows, sheep, goats, and deer. .
  • the form of the drug of the present invention is not particularly limited, and can take any form commonly used for each application depending on the use of the drug of the present invention.
  • Forms include, for example, tablets (orally disintegrating tablets, chewable tablets, effervescent tablets, lozenges, jelly-like drops, etc.) when the application is pharmaceuticals, health-enhancing agents, nutritional supplements (supplements, etc.), etc. ), pills, granules, fine granules, powders, hard capsules, soft capsules, dry syrups, liquids (including drinks, suspensions, syrups), jelly preparations suitable for oral intake forms (oral formulations), formulations suitable for parenteral intake such as nasal drops, inhalants, rectal suppositories, inserts, enemas, jellies, injections, patches, lotions, and creams (non oral dosage forms).
  • tablets orally disintegrating tablets, chewable tablets, effervescent tablets, lozenges, jelly-like drops, etc.
  • pills pills, granules, fine granules, powders, hard capsules, soft capsules, dry syrups, liquids (including drinks, suspensions, syrups), jelly preparations suitable
  • liquid, gel or solid food such as juice, soft drink, tea, soup, soy milk, salad oil, dressing, yogurt, jelly, pudding, furikake, powdered milk for infants , cake mixes, powdered or liquid dairy products, breads, cookies, etc.
  • liquid for example, liquid (solution, milky lotion, suspension, etc.), semisolid (gel, cream, paste, etc.), solid (tablet, granule, capsule, Film agent, kneaded product, molten solid, waxy solid, elastic solid, etc.), more specifically, dentifrice (toothpaste, liquid dentifrice, liquid dentifrice, toothpaste, etc.), mouthwash, Coating agents, patches, mouth fresheners, foods (eg, chewing gum, tablet candy, candy, gummies, films, lozenges, etc.) and the like.
  • the drug of the present invention may further contain other ingredients as necessary.
  • Other ingredients are not particularly limited as long as they are ingredients that can be blended in pharmaceuticals, food compositions, oral compositions, health-promoting agents, nutritional supplements (supplements, etc.). , carriers, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, thickeners, moisturizers, colorants, perfumes, chelating agents and the like.
  • the total content of the suppressor and enhancer for the target protein of the drug of the present invention depends on the type of suppressor and enhancer, application, mode of use, application target, condition of application target, etc., and the limitation is However, it can be, for example, 0.0001 to 100% by weight, preferably 0.001 to 50% by weight.
  • the amount of application (for example, administration, ingestion, inoculation, etc.) of the composition of the present invention is not particularly limited as long as it is an effective amount that exhibits efficacy. mg/kg body weight.
  • the above dosage is preferably administered once a day or in 2 to 3 divided doses, and can be adjusted appropriately according to age, condition and symptoms.
  • a screening method for an active ingredient of a prophylactic or therapeutic agent for pulmonary fibrosis disease is characterized by a protein group ( The amount or concentration of at least one protein selected from the group consisting of A), protein group (B), protein group (C), protein group (D), protein group (E), and protein group (F)
  • the present invention relates to a method for screening an active ingredient (or a candidate substance thereof) of a prophylactic or therapeutic agent for pulmonary fibrosis disease to be used as an indicator (herein, also referred to as "screening method for active ingredient of the present invention"). This will be explained below.
  • Body fluids, extracellular vesicles, blood samples, protein group (A), protein group (B), protein group (C), protein group (D), protein group (E), protein group (F), pulmonary fibrotic disease , the measurement of the amount or concentration of the target protein, etc. are the same as those defined in the above "1. Test method for pulmonary fibrotic disease”.
  • Animal species are not particularly limited. Examples of animal species include various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits.
  • test substances can be used, regardless of whether they are naturally occurring compounds or artificially created compounds.
  • purified compounds but also compositions in which various compounds are mixed, and extracts of animals and plants can be used.
  • Compounds include not only low-molecular-weight compounds, but also high-molecular-weight compounds such as proteins, nucleic acids, and polysaccharides.
  • the method for screening an active ingredient of the present invention is characterized by the value of the indicator for at least one protein selected from the group consisting of protein group (A), protein group (C), and protein group (E). is lower than the amount or concentration of the corresponding protein in extracellular vesicles of bodily fluids or blood samples taken from animals not treated with the test substance.
  • the step of selecting as an active ingredient of the agent, and the index value for at least one protein selected from the group consisting of the protein group (B), the protein group (D), and the protein group (F) is the test substance when the amount or concentration of the corresponding protein in extracellular vesicles of body fluids or blood samples collected from animals not treated with At least one step selected from the group consisting of selecting steps.
  • a corresponding protein means the same protein as the target protein used as an index.
  • Low means, for example, that the index value is 1/2, 1/5, 1/10, 1/20, 1/50, 1/100 of the control value.
  • High means, for example, that the index value is 2, 5, 10, 20, 50, or 100 times the control value.
  • a protein group (A) in extracellular vesicles of body fluid or a blood sample collected from an animal treated with a test substance Protein Group (B), Protein Group (C), Protein Group (D), Protein Group (E), and Protein Group (F).
  • the present invention relates to a method for evaluating producibility or exacerbation of pulmonary fibrotic disease (also referred to herein as the “method for evaluating toxicity of the present invention”). This will be explained below.
  • the index value for at least one protein selected from the group consisting of protein group (A), protein group (C), and protein group (E) is , the amount or concentration of the corresponding protein in extracellular vesicles of body fluids or blood samples taken from animals not treated with the test substance to induce or exacerbate pulmonary fibrotic disease.
  • the value of the indicator for at least one protein selected from the group consisting of protein group (B), protein group (D), and protein group (F) is the test substance
  • a test substance is determined to induce or exacerbate pulmonary fibrotic disease if it is lower than the amount or concentration of the corresponding protein in extracellular vesicles of body fluids or blood samples taken from untreated animals.
  • a corresponding protein means the same protein as the target protein used as an index.
  • High means, for example, that the index value is 2, 5, 10, 20, 50, or 100 times the control value.
  • Low means, for example, that the index value is 1/2, 1/5, 1/10, 1/20, 1/50, 1/100 of the control value.
  • Extracellular vesicle fraction preparation 1 Extracellular vesicle fractions were prepared from the serum of each human subject (145) diagnosed with idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) and from the serum of each healthy human subject (34). The extracellular vesicle fraction was prepared using an extracellular vesicle preparation kit (MagCapturTM Exosome Isolation Kit PS, manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with the same volume of serum for each sample. rice field.
  • MagCapturTM Exosome Isolation Kit PS manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the extracellular vesicle particle count and particle size were measured for the obtained extracellular vesicle fraction. Specifically, it was measured using Nanosite (Nippon Quantum Design Co., Ltd., Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) Version 2.3 Build 0025). This is an analysis based on the difference in Brownian motion speed for each particle size. The particle size (hydrodynamic diameter) in can be calculated.
  • extracellular vesicles were observed by immunoelectron microscopy. Specifically, it was carried out as follows. 5 to 8 ⁇ L of the fixed extracellular vesicle solution was placed on the grid and allowed to stand for 15 minutes to allow the extracellular vesicles to settle on the formvar of the grid. After washing with PBS three times, a blocking reaction (1% BSA/PBS, 10 minutes) was performed, followed by a primary antibody reaction (Invitrogen AHS0902 Mouse (monoclonal) Anti-Human Leukemia and Platelet Associated Antigen CD9 Clone: MM2/57, 100-fold dilution, 2.5 hours, room temperature).
  • a blocking reaction 1% BSA/PBS, 10 minutes
  • extracellular vesicle fractions were Western blotted using antibodies against exosome markers (anti-CD9 antibody and anti-CD63 antibody).
  • Test example 2 Proteomics analysis (DIA proteome analysis) 1 Proteins in the extracellular vesicle fraction obtained in Test Example 1 were quantified by DIA proteome analysis. Specifically, it was carried out as follows.
  • a 10x phase transfer surfactant (PTS) buffer consisting of 500 mM NH 4 HCO 3 , 120 mM sodium deoxycholate, and 120 mM sodium N-lauroyl sarcosinate was added to the exosome eluate and boiled at 95°C for 5 minutes.
  • This sample was treated with 10 mM TCEP at 37°C for 30 minutes, followed by alkylation with 20 mM iodoacetamide at 37°C for 30 minutes in the dark, followed by 2 mAU LysC (Wako Chemical, Tokyo, Japan) and 1 ⁇ g Trypsin (Wako Chemical, Tokyo). Tokyo, Japan) at 37°C overnight.
  • PTS phase transfer surfactant
  • the digestate was acidified with 1% TFA and centrifuged at 20,000 g for 10 min to precipitate the detergent.
  • the supernatant containing the digested peptides was desalted using a C18-SCX StageTip, dried using a centrifugal evaporator, and then the dried peptides were dissolved in 2% ACN and 1% TFA.
  • LC-MS/MS was performed on an UltiMate 3000 Nano LC system (Thermo Scientific, Bremen, Germany) and an HTC-PAL autosampler (CTC Analytics, Zwingen, Switzerland) coupled to an Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer (Thermo Scientific). rice field. Peptides were analyzed on an analytical column (75 ⁇ m ⁇ 20 cm, ReproSil-Pur C18-AQ, 1.9 ⁇ m resin, Dr. Maisch, Ammerbuch, Germany) with a 45 min gradient from 5% to 30% solvent B (solvent A, 0.1% FA; solvent B, 0.1% FA and 99.9% acetonitrile) was used for separation at a flow rate of 280 nL/min.
  • the Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer has a 5GPF (gas-phase fractionation)-DIA mode covering 418-494, 490-566, 562-638, 634-710, 706-782 m/z (5xGPF) during library acquisition (precursor resolution 120,000, fragment resolution 50,000, AGC targets 1e6 and 2e5, maximum IIT 250ms and 86ms, NCE 30, precursor separation window 2m/z). Individual samples were run in DIA mode (precursor resolution 120,000, fragment resolution 30,000, AGC targets MS1 4e5, MS2 2e5, maximum IIT 100 ms MS1, 54 ms MS2, NCE 30, precursor separation window of 8 m/z). analyzed in 5GPF (gas-phase fractionation)-DIA mode covering 418-494, 490-566, 562-638, 634-710, 706-782 m/z (5xGPF) during library acquisition (precursor resolution 120,000, fragment resolution 50,000, AGC targets 1e6 and 2e5, maximum IIT 250ms and
  • DIA data was analyzed using DIA-NN (version 1.7.12).
  • DIA-NN used the default settings (automatic mass accuracy tolerance and scan window settings).
  • MS files were searched using the uniprot human database under the following conditions.
  • Thresholds for protein identification were set at ⁇ 1% for both precursor and protein FDRs.
  • a logistic regression analysis (covariates: age, sex) was performed to compare idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) subjects with healthy subjects, and 14 extracted.
  • Table 1 shows proteins whose expression levels were higher in idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) subjects than in healthy subjects.
  • "Fold change” is the value obtained by dividing the average expression level of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) subjects by the average expression level of healthy subjects (idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) subjects (average expression level/average expression level in healthy subjects).
  • Table 2 shows proteins whose expression levels in idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) subjects were lower than those in healthy subjects, among the extracted idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) biomarkers.
  • "Fold change” is the value obtained by dividing the average expression level of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) subjects by the average expression level of healthy subjects (idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) subjects (average expression level/average expression level in healthy subjects).
  • Test example 3 Preparation of extracellular vesicle fraction 2 An extracellular vesicle fraction was prepared from the serum of each of 41 human subjects diagnosed with interstitial lung disease with progressive fibrosis (PF-ILD). Specifically, it was carried out in the same manner as in Test Example 1.
  • PF-ILD progressive fibrosis
  • Test example 4 Proteomics analysis (DIA proteome analysis) 2 Quantification of proteins in the extracellular vesicle fraction obtained in Test Example 3 was performed by DIA proteome analysis. Specifically, it was carried out in the same manner as in Test Example 2.
  • Test example 5 Preparation of extracellular vesicle fraction 3 Extracellular vesicle fractions from the serum of each of 55 human subjects diagnosed with interstitial lung disease (non PF-ILD) but not interstitial lung disease with progressive fibrosis (PF-ILD) was prepared. Specifically, it was carried out in the same manner as in Test Example 1.
  • Test example 6 Proteomics analysis (DIA proteome analysis) 3 Proteins in the extracellular vesicle fraction obtained in Test Example 5 were quantified by DIA proteome analysis. Specifically, it was carried out in the same manner as in Test Example 2.
  • PF-ILD interstitial lung disease with progressive fibrosis
  • Table 6 Proteins whose expression levels were lower than the samples are shown in Table 6.
  • "Fold change” is the value obtained by dividing the average expression level of interstitial lung disease with progressive fibrosis (PF-ILD) subjects by the average expression level of non-PF-ILD subjects ( The average expression level of interstitial lung disease with progressive fibrosis (PF-ILD) subjects/mean expression level of non-PF-ILD subjects) is shown.
  • Test example 7 Evaluation of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) biomarkers1 Based on the quantitative results of Test Example 2, BPI fold-containing family B member 1 (BPIFB1), Pulmonary surfactant-associated protein B (SFTPB), and Pulmonary surfactant-associated protein A2; Pulmonary surfactant-associated protein A1 (SFTPA), respectively.
  • a ROC curve was generated when used alone as an idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) biomarker.
  • an ROC curve was also generated for the same subject using serum KL6 as an idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) biomarker.
  • Test example 8 Evaluation of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) biomarkers2
  • IPF idiopathic pulmonary fibrosis
  • BPIFB1 and SFTPA were found to be associated with the extent of interstitial opacity, similar to serum KL6.
  • Test example 9 Assessment of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) biomarkers3
  • respiratory function %FVC
  • BPIFB1 BPI fold-containing family B member 1
  • SFTPB Pulmonary surfactant-associated protein B
  • SFTPA Pulmonary surfactant-associated protein A1
  • Test example 10 Assessment of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) biomarkers4
  • various respiratory diseases HC: normal, BA: bronchial asthma, COPD: chronic obstructive pulmonary disease, CHP: chronic hypersensitivity pneumonitis, SAR: sarcoidosis
  • SFTPB Pulmonary surfactant-associated protein B
  • the expression level of SFTPB was increased in pathological conditions with strong fibrosis such as IPF and CHP.
  • Test example 11 Evaluation of interstitial lung disease with progressive fibrosis (PF-ILD) biomarkers1 Based on the quantitative results of Test Examples 4 and 6, LDL receptor related protein 1 (LRP1), Pulmonary surfactant-associated protein B (SFTPB), S100 calcium binding protein A13 (S100A13), and CD34 molecule (CD34) proceed independently.
  • LRP1 LDL receptor related protein 1
  • SFTPB Pulmonary surfactant-associated protein B
  • S100A13 S100 calcium binding protein A13
  • CD34 CD34 molecule
  • Test example 12 Evaluation of interstitial lung disease with progressive fibrosis (PF-ILD) biomarkers2
  • PF-ILD progressive fibrosis
  • SFTPB was found to be associated with the extent of interstitial opacity.
  • Test example 13 Evaluation of interstitial lung disease with progressive fibrosis (PF-ILD) biomarkers3
  • respiratory function %FVC and %Dlco
  • LRP1 LDL receptor related protein 1
  • SFTPB Pulmonary surfactant-associated protein B
  • S100A13 S100 calcium binding protein A13
  • CD34 CD34
  • Test example 13 Evaluation of biomarkers For each of 206 ILD patients (nonIPF), we investigated the relationship between the amount of LDL receptor related protein 1 (LRP1) and Pulmonary surfactant-associated protein B (SFTPB) in the serum extracellular vesicle fraction and the survival prognosis. Examined.
  • LRP1 LDL receptor related protein 1
  • SFTPB Pulmonary surfactant-associated protein B
  • Test example 14 Evaluation of interstitial lung disease with progressive fibrosis (PF-ILD) biomarkers4 Based on the quantitative results of Test Examples 4 and 6, an ROC curve was created when using Pulmonary surfactant-associated protein B (SFTPB) alone as a biomarker for predicting the progression of interstitial lung disease. Also, as a positive control, an ROC curve was generated for the same subject using serum KL6 and SP-D as idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) biomarkers. Specifically, an ROC curve with sensitivity (positive rate) on the vertical axis and a value obtained by subtracting specificity from 1 (1 - specificity) (false positive rate) on the horizontal axis was created using the statistical software JMP. . The results are shown in Table 13. Progressiveness was defined as %FVC decrease >10% after 1 year, acute exacerbation within 1 year, or death within 1 year.
  • SFTPB Pulmonary surfactant-associated protein B
  • Test example 15 Evaluation of biomarkers Serum SFTPB was quantified using an ELISA kit (SEB622Hu, Cloud Clone corp.). Serum SFTPB was increased in IPF and PF-ILD patients compared to healthy subjects. In addition, as a result of quantifying serum LRP1 using an ELISA kit (SEB010Hu, Cloud Clone corp.), serum LRP1 was increased in IPF and PF-ILD patients compared to healthy subjects. The results are shown in FIGS. 7 and 8. FIG.
  • Test example 16 Biomarker Evaluation Lung specimens from IPF patients and controls were immunostained with Anti-Surfactant Protein B (Mature) antibody [RM370] ab271345, and Anti-LRP1 antibody [EPR3724] ab92544.
  • SFTPB Anti-Surfactant Protein B
  • LRP1 was strongly expressed in fibroblasts and macrophages. The results are shown in FIG.
  • Test example 17 Evaluation of biomarkers Expression levels of SP-B (surfactant protein B: SFTPB) in serum-derived extracellular vesicle fraction samples from healthy subjects and patients with each disease were quantified by immunoblotting. Specifically, it was carried out as follows. Protein samples were loaded on NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (Invitrogen). For immunoblot analysis, gels were electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes (Bio-Rad). Membranes were blocked with Blocking One (Nacalai Tesque) for 60 minutes at room temperature, incubated with specific primary antibodies and then with appropriate secondary antibodies. The following primary antibodies were used for immunoblotting.
  • SFTPB surfactant protein B
  • Mouse anti-human SP-B (sc-133143; Santa Cruz Biotechnology, Inc., TX, USA) was diluted 1:100 with can get signal solution 1 (TOYOBO) and allowed to react at room temperature for 120 minutes. Immunoreactive signals were visualized using SuperSignal West Atto Ultimate Sensitivity Maximum Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific) and detected on the ChemiDoc Touch (Bio-Rad). ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) was used for densitometry analysis.
  • SP-B was found to be upregulated in fibrotic diseases, especially idiopathic pulmonary fibrosis.

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Abstract

肺線維化疾患バイオマーカー及びその利用方法を提供すること。肺線維化疾患を検査する方法であって、（1）被検体から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、タンパク質群（C）、タンパク質群（D）、タンパク質群（E）、並びにタンパク質群（F）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質を検出する工程を含む、検査方法。

Description

肺線維化疾患バイオマーカー
　本発明は、肺線維化疾患バイオマーカー等に関する。
　特発性肺線維症（IPF）は不可逆的に肺の線維化が進行する難病であり、近年の病態解明や抗線維化薬の開発にも関わらず、生存期間中央値が3-5年に止まっている。IPFは特発性間質性肺炎の中の1つのサブタイプであり、診断はCT画像・臨床経過・病理組織などに基づいて集学的に行われる。現在のガイドラインでは診断時にHRCTを撮影し、画像パターン分類（UIP、 Probable UIP、 Indeterminate for UIP、 Alternative diagnosis）を行うことを強く推奨されている。一方でIPFを疑われる患者の約30％のCT画像がIndeterminantであるため、definiteの診断を得るためには外科的肺生検などの侵襲的な処置が必要となる。しかし、IPF患者は呼吸機能が著しく低下しており、高齢の症例も多いことから、外科的肺生検が行われる場面は限られている。更に、IPFにおいては長年病状が安定している症例もあれば進行性に線維化を来す症例もあり、その経過も様々である。そのため、診断に有用で、病態を反映するバイオマーカーの開発が求められている。
　一方、近年では進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）という概念が提唱され注目を集めている。これまでIPFを初めとした慢性間質性肺疾患に対する有効な治療選択肢は限られており、さらに治療薬の一つである抗線維化薬の有効性が示されていたのはIPFのみであった。しかしその後、IPF以外の間質性肺疾患で、慢性進行性の線維化を伴うという共通した特徴をもつものを総称してPF-ILDとし、それらに対する抗線維化薬の有効性を検討した臨床試験がなされた。結果としてその有効性が示され、PF-ILDに対しても抗線維化薬の治療適応が拡大している。早期から開始するほど抗線維化薬の治療効果は期待できることからもPFILDの早期診断が望まれるが、この新たな疾患概念であるPF-ILDの診断および病態を反映する既存のバイオマーカーはなく、その開発が求められている。
　現在、IPFならびにPF-ILDのバイオマーカーとして、各オミクスから様々な候補が挙げられているが、単一のマーカーとして有効性が広く確認されているものはない。そのため、臨床データと様々なバイオマーカー候補を組み合わせることで、病勢の進行や予後、抗線維化薬の治療反応性を向上させる試みがなされている（非特許文献１）。
White ES, et al,Am J Respir Crit Care Med.2016. 2016 Nov 15;194(10):1242-1251. doi: 10.1164/rccm.201505-0862OC.
　本発明は、肺線維化疾患バイオマーカー及びその利用方法を提供することを課題とする。特に、本発明は、肺線維化疾患の中でも、特発性肺線維症（IPF）バイオマーカー及び進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）バイオマーカー及びその利用方法を提供することを課題とする。
　本発明者は、鋭意研究を進めた結果、被検体から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における特定のタンパク質群が、肺線維化疾患のバイオマーカーとして有用であることを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　項１．　肺線維化疾患を検査する方法であって、
（1）被検体から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、タンパク質群（C）、タンパク質群（D）、タンパク質群（E）、並びにタンパク質群（F）：
（A）ATP-dependent RNA helicase DDX55、Secretoglobin family 3A member 1、BPI fold-containing family B member 1、Pulmonary surfactant-associated protein B、Protein argonaute-2、Pulmonary surfactant-associated protein A2; Pulmonary surfactant-associated protein A1、Testin、Copine-2、Sorting nexin-18、Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3、及びC-C motif chemokine 18からなるタンパク質群、
（B）Cyclin-dependent kinase 11B; Cyclin-dependent kinase 11A、Secretogranin-1、及びPeptidyl-prolyl cis-trans isomerase Aからなるタンパク質群、
（C）Surfactant protein B、BPI fold containing family B member 1、Argonaute 2, RISC catalytic component、Small integral membrane protein 1 (Vel blood group)、Secretoglobin family 3A member 1、Sorting nexin 18、Myelin protein zero like 1、Alpha hemoglobin stabilizing protein、Glycoprotein nmb、Yip1 interacting factor homolog B, membrane trafficking protein、Synaptogyrin 1、LDL receptor related protein 1、Cysteine rich transmembrane module containing 1、Testin LIM domain protein、Endoplasmic reticulum protein 29、Erythrocyte membrane protein band 4.2、Reticulon 4、Synaptogyrin 2、及びSpectrin alpha, erythrocytic 1からなるタンパク質群、
（D）Cyclin dependent kinase 11A, B、FYN proto-oncogene, Src family tyrosine kinase、Peptidylprolyl isomerase A、Serpin family B member 6、Tubulin alpha 8、Sorbitol dehydrogenase、Chromogranin B、Claudin 3、Metallo-beta-lactamase domain containing 2、Inositol polyphosphate-5-phosphatase A、NGFI-A binding protein 2、BRICK1, SCAR/WAVE actin nucleating complex subunit、Tropomyosin 1、PX domain containing serine/threonine kinase like、Galectin like、Tandem C2 domains, nuclear、YKT6 v-SNARE homolog、Plexin B2、Nectin cell adhesion molecule 2、Glutathione peroxidase 4、SH3 domain binding glutamate rich protein like 2、C-C motif chemokine receptor 4、S100 calcium binding protein A13、CD69 molecule、Spleen associated tyrosine kinase、D-tyrosyl-tRNA deacylase 1、Acyl-CoA dehydrogenase very long chain、及びCoagulation factor VIIからなるタンパク質群、
（E）Surfactant protein B、及びLDL receptor related protein 1からなるタンパク質群、並びに
（F）CD34 molecule、S100 calcium binding protein A13、及びFamily with sequence similarity 49 member Bからなるタンパク質群、
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質を検出する工程を含む、検査方法。
　項２．　前記肺線維化疾患が間質性肺疾患（ILD）である、項１に記載の検査方法。
　項３．　前記肺線維化疾患が特発性肺線維症（IPF）である、項１又は２に記載の検査方法。
　項４．　検出するタンパク質が、タンパク質群（A）及びタンパク質群（B）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質を含む、項３に記載の検査方法。
　項５．　検出したタンパク質が、タンパク質群（A）より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質A’）を含む場合、さらに、
（2A）前記工程（1）で検出されたタンパク質A’の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が特発性肺線維症（IPF）に罹患している、IPFの予後が悪い、又はIPFが進行性であると判定する工程、
を含む、項３又は４に記載の検査方法。
　項６．　検出したタンパク質が、タンパク質群（B）より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質B’）を含む場合、さらに、
（2B）前記工程（1）で検出されたタンパク質B’の量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体が特発性肺線維症（IPF）に罹患している、IPFの予後が悪い、又はIPFが進行性であると判定する工程、
を含む、項３～５のいずれかに記載の検査方法。
　項７．　前記肺線維化疾患が進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）である、項１又は２に記載の検査方法。
　項８．　検出するタンパク質が、タンパク質群（C）、タンパク質群（D）、タンパク質群（E）、及びタンパク質群（F）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質を含む、項７に記載の検査方法。
　項９．　検出したタンパク質が、タンパク質群（C）及びタンパク質群（E）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質CE’）を含む場合、さらに、（2CE）前記工程（1）で検出されたタンパク質CE’の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）に罹患している、PF-ILDの予後が悪い、又はPF-ILDが進行性であると判定する工程、
を含む、項７又は８に記載の検査方法。
　項１０．　検出したタンパク質が、タンパク質群（D）及びタンパク質群（F）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質DF’）を含む場合、さらに、（2DF）前記工程（1）で検出されたタンパク質DF’の量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体が進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）に罹患している、PF-ILDの予後が悪い、又はPF-ILDが進行性であると判定する工程、
を含む、項７～９のいずれかに記載の検査方法。
　項１１．　前記被検体がヒトである、項１～１０のいずれかに記載の検査方法。
　項１２．　タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、タンパク質群（C）、タンパク質群（D）、タンパク質群（E）、並びにタンパク質群（F）：
（A）ATP-dependent RNA helicase DDX55、Secretoglobin family 3A member 1、BPI fold-containing family B member 1、Pulmonary surfactant-associated protein B、Protein argonaute-2、Pulmonary surfactant-associated protein A2; Pulmonary surfactant-associated protein A1、Testin、Copine-2、Sorting nexin-18、Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3、及びC-C motif chemokine 18からなるタンパク質群、
（B）Cyclin-dependent kinase 11B; Cyclin-dependent kinase 11A、Secretogranin-1、及びPeptidyl-prolyl cis-trans isomerase Aからなるタンパク質群、
（C）Surfactant protein B、BPI fold containing family B member 1、Argonaute 2, RISC catalytic component、Small integral membrane protein 1 (Vel blood group)、Secretoglobin family 3A member 1、Sorting nexin 18、Myelin protein zero like 1、Alpha hemoglobin stabilizing protein、Glycoprotein nmb、Yip1 interacting factor homolog B, membrane trafficking protein、Synaptogyrin 1、LDL receptor related protein 1、Cysteine rich transmembrane module containing 1、Testin LIM domain protein、Endoplasmic reticulum protein 29、Erythrocyte membrane protein band 4.2、Reticulon 4、Synaptogyrin 2、及びSpectrin alpha, erythrocytic 1からなるタンパク質群、
（D）Cyclin dependent kinase 11A, B、FYN proto-oncogene, Src family tyrosine kinase、Peptidylprolyl isomerase A、Serpin family B member 6、Tubulin alpha 8、Sorbitol dehydrogenase、Chromogranin B、Claudin 3、Metallo-beta-lactamase domain containing 2、Inositol polyphosphate-5-phosphatase A、NGFI-A binding protein 2、BRICK1, SCAR/WAVE actin nucleating complex subunit、Tropomyosin 1、PX domain containing serine/threonine kinase like、Galectin like、Tandem C2 domains, nuclear、YKT6 v-SNARE homolog、Plexin B2、Nectin cell adhesion molecule 2、Glutathione peroxidase 4、SH3 domain binding glutamate rich protein like 2、C-C motif chemokine receptor 4、S100 calcium binding protein A13、CD69 molecule、Spleen associated tyrosine kinase、D-tyrosyl-tRNA deacylase 1、Acyl-CoA dehydrogenase very long chain、及びCoagulation factor VIIからなるタンパク質群、
（E）Surfactant protein B、及びLDL receptor related protein 1からなるタンパク質群、並びに
（F）CD34 molecule、S100 calcium binding protein A13、及びFamily with sequence similarity 49 member Bからなるタンパク質群、
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の検出剤を含む、肺線維化疾患の検査薬。
　項１３．　タンパク質群（A）、タンパク質群（C）、並びにタンパク質群（E）：（A）ATP-dependent RNA helicase DDX55、Secretoglobin family 3A member 1、BPI fold-containing family B member 1、Pulmonary surfactant-associated protein B、Protein argonaute-2、Pulmonary surfactant-associated protein A2; Pulmonary surfactant-associated protein A1、Testin、Copine-2、Sorting nexin-18、Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3、及びC-C motif chemokine 18からなるタンパク質群、
（C）Surfactant protein B、BPI fold containing family B member 1、Argonaute 2, RISC catalytic component、Small integral membrane protein 1 (Vel blood group)、Secretoglobin family 3A member 1、Sorting nexin 18、Myelin protein zero like 1、Alpha hemoglobin stabilizing protein、Glycoprotein nmb、Yip1 interacting factor homolog B, membrane trafficking protein、Synaptogyrin 1、LDL receptor related protein 1、Cysteine rich transmembrane module containing 1、Testin LIM domain protein、Endoplasmic reticulum protein 29、Erythrocyte membrane protein band 4.2、Reticulon 4、Synaptogyrin 2、及びSpectrin alpha, erythrocytic 1からなるタンパク質群、並びに
（E）Surfactant protein B、及びLDL receptor related protein 1からなるタンパク質群、
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の抑制剤、並びに
タンパク質群（B）、タンパク質群（D）、並びにタンパク質群（F）：
（B）Cyclin-dependent kinase 11B; Cyclin-dependent kinase 11A、Secretogranin-1、及びPeptidyl-prolyl cis-trans isomerase Aからなるタンパク質群、
（D）Cyclin dependent kinase 11A, B、FYN proto-oncogene, Src family tyrosine kinase、Peptidylprolyl isomerase A、Serpin family B member 6、Tubulin alpha 8、Sorbitol dehydrogenase、Chromogranin B、Claudin 3、Metallo-beta-lactamase domain containing 2、Inositol polyphosphate-5-phosphatase A、NGFI-A binding protein 2、BRICK1, SCAR/WAVE actin nucleating complex subunit、Tropomyosin 1、PX domain containing serine/threonine kinase like、Galectin like、Tandem C2 domains, nuclear、YKT6 v-SNARE homolog、Plexin B2、Nectin cell adhesion molecule 2、Glutathione peroxidase 4、SH3 domain binding glutamate rich protein like 2、C-C motif chemokine receptor 4、S100 calcium binding protein A13、CD69 molecule、Spleen associated tyrosine kinase、D-tyrosyl-tRNA deacylase 1、Acyl-CoA dehydrogenase very long chain、及びCoagulation factor VIIからなるタンパク質群、並びに
（F）CD34 molecule、S100 calcium binding protein A13、及びFamily with sequence similarity 49 member Bからなるタンパク質群、
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の亢進剤
からなる群より選択される少なくとも1種の薬剤を含有する、肺線維化疾患の予防又は治療剤。
　項１４．　被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、タンパク質群（C）、タンパク質群（D）、タンパク質群（E）、並びにタンパク質群（F）：
（A）ATP-dependent RNA helicase DDX55、Secretoglobin family 3A member 1、BPI fold-containing family B member 1、Pulmonary surfactant-associated protein B、Protein argonaute-2、Pulmonary surfactant-associated protein A2; Pulmonary surfactant-associated protein A1、Testin、Copine-2、Sorting nexin-18、Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3、及びC-C motif chemokine 18からなるタンパク質群、
（B）Cyclin-dependent kinase 11B; Cyclin-dependent kinase 11A、Secretogranin-1、及びPeptidyl-prolyl cis-trans isomerase Aからなるタンパク質群、
（C）Surfactant protein B、BPI fold containing family B member 1、Argonaute 2, RISC catalytic component、Small integral membrane protein 1 (Vel blood group)、Secretoglobin family 3A member 1、Sorting nexin 18、Myelin protein zero like 1、Alpha hemoglobin stabilizing protein、Glycoprotein nmb、Yip1 interacting factor homolog B, membrane trafficking protein、Synaptogyrin 1、LDL receptor related protein 1、Cysteine rich transmembrane module containing 1、Testin LIM domain protein、Endoplasmic reticulum protein 29、Erythrocyte membrane protein band 4.2、Reticulon 4、Synaptogyrin 2、及びSpectrin alpha, erythrocytic 1からなるタンパク質群、
（D）Cyclin dependent kinase 11A, B、FYN proto-oncogene, Src family tyrosine kinase、Peptidylprolyl isomerase A、Serpin family B member 6、Tubulin alpha 8、Sorbitol dehydrogenase、Chromogranin B、Claudin 3、Metallo-beta-lactamase domain containing 2、Inositol polyphosphate-5-phosphatase A、NGFI-A binding protein 2、BRICK1, SCAR/WAVE actin nucleating complex subunit、Tropomyosin 1、PX domain containing serine/threonine kinase like、Galectin like、Tandem C2 domains, nuclear、YKT6 v-SNARE homolog、Plexin B2、Nectin cell adhesion molecule 2、Glutathione peroxidase 4、SH3 domain binding glutamate rich protein like 2、C-C motif chemokine receptor 4、S100 calcium binding protein A13、CD69 molecule、Spleen associated tyrosine kinase、D-tyrosyl-tRNA deacylase 1、Acyl-CoA dehydrogenase very long chain、及びCoagulation factor VIIからなるタンパク質群、
（E）Surfactant protein B、及びLDL receptor related protein 1からなるタンパク質群、並びに
（F）CD34 molecule、S100 calcium binding protein A13、及びFamily with sequence similarity 49 member Bからなるタンパク質群、
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、肺線維化疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法。
　項１５．　被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、タンパク質群（C）、タンパク質群（D）、タンパク質群（E）、並びにタンパク質群（F）：
（A）ATP-dependent RNA helicase DDX55、Secretoglobin family 3A member 1、BPI fold-containing family B member 1、Pulmonary surfactant-associated protein B、Protein argonaute-2、Pulmonary surfactant-associated protein A2; Pulmonary surfactant-associated protein A1、Testin、Copine-2、Sorting nexin-18、Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3、及びC-C motif chemokine 18からなるタンパク質群、
（B）Cyclin-dependent kinase 11B; Cyclin-dependent kinase 11A、Secretogranin-1、及びPeptidyl-prolyl cis-trans isomerase Aからなるタンパク質群、
（C）Surfactant protein B、BPI fold containing family B member 1、Argonaute 2, RISC catalytic component、Small integral membrane protein 1 (Vel blood group)、Secretoglobin family 3A member 1、Sorting nexin 18、Myelin protein zero like 1、Alpha hemoglobin stabilizing protein、Glycoprotein nmb、Yip1 interacting factor homolog B, membrane trafficking protein、Synaptogyrin 1、LDL receptor related protein 1、Cysteine rich transmembrane module containing 1、Testin LIM domain protein、Endoplasmic reticulum protein 29、Erythrocyte membrane protein band 4.2、Reticulon 4、Synaptogyrin 2、及びSpectrin alpha, erythrocytic 1からなるタンパク質群、
（D）Cyclin dependent kinase 11A, B、FYN proto-oncogene, Src family tyrosine kinase、Peptidylprolyl isomerase A、Serpin family B member 6、Tubulin alpha 8、Sorbitol dehydrogenase、Chromogranin B、Claudin 3、Metallo-beta-lactamase domain containing 2、Inositol polyphosphate-5-phosphatase A、NGFI-A binding protein 2、BRICK1, SCAR/WAVE actin nucleating complex subunit、Tropomyosin 1、PX domain containing serine/threonine kinase like、Galectin like、Tandem C2 domains, nuclear、YKT6 v-SNARE homolog、Plexin B2、Nectin cell adhesion molecule 2、Glutathione peroxidase 4、SH3 domain binding glutamate rich protein like 2、C-C motif chemokine receptor 4、S100 calcium binding protein A13、CD69 molecule、Spleen associated tyrosine kinase、D-tyrosyl-tRNA deacylase 1、Acyl-CoA dehydrogenase very long chain、及びCoagulation factor VIIからなるタンパク質群、
（E）Surfactant protein B、及びLDL receptor related protein 1からなるタンパク質群、並びに
（F）CD34 molecule、S100 calcium binding protein A13、及びFamily with sequence similarity 49 member Bからなるタンパク質群、
からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、肺線維化疾患の誘発性又は増悪性の評価方法。
　本発明によれば、肺線維化疾患のバイオマーカーを提供することができる。該バイオマーカーを利用することにより、肺線維化疾患の検査、肺線維化疾患の予防又は治療、肺線維化疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング、肺線維化疾患の誘発性又は増悪性の評価等が可能になり得る。
、BPI fold-containing family B member 1（BPIFB1）の量と特発性肺線維症（IPF）の病態との関連を表す、試験例8の結果を示す。縦軸はタンパク量を示す。*はP値が0.05未満であることを示し、**はP値が0.005未満であることを示す。 Pulmonary surfactant-associated protein A2; Pulmonary surfactant-associated protein A1（SFTPA）の量と特発性肺線維症（IPF）の病態との関連を表す、試験例8の結果を示す。縦軸はタンパク量を示す。*はP値が0.05未満であることを示し、**はP値が0.005未満であることを示す。 血清中のKL6の量と特発性肺線維症（IPF）の病態との関連を表す、試験例8の結果を示す。縦軸はタンパク量を示す。*はP値が0.05未満であることを示し、**はP値が0.005未満であることを示す。 様々な呼吸器疾患におけるPulmonary surfactant-associated protein B（SFTPB）の量を調べた結果を示す。縦軸はタンパク量を示す。横軸の括弧内の数字は被検体数である。HCは、Healthy Control（健常者）群を示す。 Pulmonary surfactant-associated protein B（SFTPB）と進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）の病態との関連を表す、試験例12の結果を示す。縦軸はタンパク量を示す。*はP値が0.05未満であることを示す。 ILD患者（nonIPF）206例それぞれについて、LDL receptor related protein 1（LRP1）、Pulmonary surfactant-associated protein B（SFTPB）の血清細胞外小胞画分中の量と生命予後との関連を示す、試験例13の結果をしめす。 健常者（HC）、IPF患者、及びPF-ILD患者について、血清中SFTPBをELISA定量した結果を示す（試験例15）。縦軸は血清エクソソーム中のSFTPBのDIAプロテオーム解析により算出した量を示し、横軸は血清中SFTPBのELISA定量値を示す。 健常者（HC）、IPF患者、及びPF-ILD患者について、血清中SFTPBをELISA定量した結果を示す（試験例15）。上段は各群における血清エクソソーム中のSFTPBのDIAプロテオーム解析により算出した量を示し、下段は各群における血清中SFTPBのELISA定量値を示す。 健常者（HC）、IPF患者、及びPF-ILD患者について、血清中LRP1をELISA定量した結果を示す（試験例15）。縦軸は血清エクソソーム中のLRP1のDIAプロテオーム解析により算出した量を示し、横軸は血清中LRP1のELISA定量値を示す。 健常者（HC）、IPF患者、及びPF-ILD患者について、血清中LRP1をELISA定量した結果を示す（試験例15）。上段は各群における血清エクソソーム中のLRP1のDIAプロテオーム解析により算出した量を示し、下段は各群における血清中LRP1のELISA定量値を示す。 IPF患者およびコントロールの肺検体をAnti-Surfactant Protein B (Mature) antibody [RM370] ab271345、およびAnti-LRP1 antibody[EPR3724] ab92544を用いて免疫染色した結果を示す（試験例16）。 健常者及び各疾患の患者の血清由来細胞外小胞画分サンプル中の、SP-B（surfactant protein B：SFTPB）の発現量をイムノブロットで定量した結果を示す（試験例17）。
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　1．肺線維化疾患の検査方法
　本発明は、その一態様において、肺線維化疾患を検査する方法であって、（1）被検体から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、タンパク質群（C）、タンパク質群（D）、タンパク質群（E）、並びにタンパク質群（F）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質を検出する工程（工程1）を含む、検査方法（本明細書において、「本発明の検査方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　1-1．工程（1）
　検査対象である「肺線維化疾患」の種類は、特に制限されない。肺線維化疾患の進行度に関する各種分類基準における全てのクラス、グレード、ステージの肺線維化疾患が検査対象となり得る。肺線維化疾患としては、具体的には、例えば、間質性肺疾患、より具体的には特発性肺線維症、進行性線維化を伴う間質性肺疾患、慢性過敏性肺炎、特発性間質性肺炎、特発性器質化肺炎、急性間質性肺炎、剥離性間質性肺炎、リンパ球性間質性肺炎、呼吸細気管支炎関連間質性肺炎、その他の原因不明の間質性肺炎、膠原病による間質性肺炎、職業・環境による間質性肺炎、薬剤による間質性肺炎、放射線による間質性肺炎、感染症（ウイルス、細菌等）による間質性肺炎、サルコイドーシス、他の疾患による間質性肺炎等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは間質性肺疾患（ILD）が挙げられ、より好ましくは特発性肺線維症（IPF）、進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）、慢性過敏性肺炎（CHP）等が挙げられ、特に好ましくは特発性肺線維症（IPF）、進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）等が挙げられる。
　被検体は、本発明の検査方法の対象生物であり、その生物種は特に制限されない。被検体の生物種としては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類動物が挙げられ、好ましくはヒトが挙げられる。
　被検体の状態は、特に制限されない。被検体としては、例えば肺線維化疾患に罹患しているかどうか不明な検体、肺線維化疾患に罹患していると既に別の方法により判定されている検体、肺線維化疾患に罹患していないと既に別の方法により判定されている検体、肺線維化疾患の治療中の検体、肺線維化疾患の治療後の検体等が挙げられる。
　工程（1）における検出試料は、好ましくは体液の細胞外小胞である。
　体液は、特に制限されない。体液としては、例えば全血、血清、血漿、髄液、唾液、関節液、尿、組織液（気管支肺胞洗浄液を含む）、汗、涙、喀痰、鼻汁、呼気、呼気凝縮液などが挙げられ、好ましくは全血、血清、血漿、髄液が挙げられ、より好ましくは全血、血清、血漿が挙げられる。体液は、1種単独で採用してもよいし、2種以上を組み合わせて採用してもよい。
　体液は、当業者に公知の方法で被検体から採取することができる。例えば、全血は、注射器などを用いた採血によって採取することができる。血清は、全血から血球及び特定の血液凝固因子を除去した部分であり、例えば、全血を凝固させた後の上澄みとして得ることができる。血漿は、全血から血球を除去した部分であり、例えば、全血を凝固させない条件下で遠心分離に供した際の上澄みとして得ることができる。
　本明細書においては、全血、血清、血漿等の血液そのもの又は血液由来の試料を「血液試料」と示す。
　細胞外小胞は、細胞から分泌、放出等される膜小胞である限り特に制限されない。細胞外小胞は、通常は、細胞内のタンパク質や遺伝情報（mRNA, microRNA等）を細胞外に運搬することにより、局所や全身における細胞間の情報伝達を担っている膜小胞として定義される。細胞外小胞としては、例えばエクソソーム、微小小胞体、アポトーシス小体、エクトソーム、マイクロパーティクル、分泌マイクロベシクル等が挙げられる。
　細胞外小胞は、体液から、公知の方法に従って又は準じて、精製、分離、濃縮等することができる。細胞外小胞を精製、分離、濃縮等する方法としては、例えば超遠心法（例えばペレットダウン法、スクロースクッション法、密度勾配遠心法等）、イムノアフィニティー担体を用いる方法、ゲルろ過法、フィールド・フロー分画法、FACS法等が挙げられる。また、細胞外小胞の精製、分離、濃縮等は、市販のキットを用いて行うことも可能である。これらの方法は、1種単独で採用してもよいし、2種以上を組み合わせて採用してもよい。
　工程（1）の検出対象は、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、タンパク質群（C）、タンパク質群（D）、タンパク質群（E）、並びにタンパク質群（F）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質（本明細書において、これらをまとめて「対象タンパク質」と示すこともある。）である。
　タンパク質群（A）は、（A）ATP-dependent RNA helicase DDX55、Secretoglobin family 3A member 1、BPI fold-containing family B member 1、Pulmonary surfactant-associated protein B、Protein argonaute-2、Pulmonary surfactant-associated protein A2; Pulmonary surfactant-associated protein A1、Testin、Copine-2、Sorting nexin-18、Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3、及びC-C motif chemokine 18からなるタンパク質群である。
　タンパク質群（A）は、肺線維化疾患検体（好ましくは、特発性肺線維症（IPF））における量が正常検体における量よりも高いタンパク質群である。
　タンパク質群（B）は、（B）Cyclin-dependent kinase 11B; Cyclin-dependent kinase 11A、Secretogranin-1、及びPeptidyl-prolyl cis-trans isomerase Aからなるタンパク質群である。
　タンパク質群（B）は、肺線維化疾患検体（好ましくは、特発性肺線維症（IPF））における量が正常検体における量よりも低いタンパク質群である。
　タンパク質群（C）は、（C）Surfactant protein B、BPI fold containing family B member 1、Argonaute 2, RISC catalytic component、Small integral membrane protein 1 (Vel blood group)、Secretoglobin family 3A member 1、Sorting nexin 18、Myelin protein zero like 1、Alpha hemoglobin stabilizing protein、Glycoprotein nmb、Yip1 interacting factor homolog B, membrane trafficking protein、Synaptogyrin 1、LDL receptor related protein 1、Cysteine rich transmembrane module containing 1、Testin LIM domain protein、Endoplasmic reticulum protein 29、Erythrocyte membrane protein band 4.2、Reticulon 4、Synaptogyrin 2、及びSpectrin alpha, erythrocytic 1からなるタンパク質群である。
　タンパク質群（C）は、肺線維化疾患検体（好ましくは、進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD））における量が正常検体における量よりも高いタンパク質群である。
　タンパク質群（D）は、（D）Cyclin dependent kinase 11A, B、FYN proto-oncogene, Src family tyrosine kinase、Peptidylprolyl isomerase A、Serpin family B member 6、Tubulin alpha 8、Sorbitol dehydrogenase、Chromogranin B、Claudin 3、Metallo-beta-lactamase domain containing 2、Inositol polyphosphate-5-phosphatase A、NGFI-A binding protein 2、BRICK1, SCAR/WAVE actin nucleating complex subunit、Tropomyosin 1、PX domain containing serine/threonine kinase like、Galectin like、Tandem C2 domains, nuclear、YKT6 v-SNARE homolog、Plexin B2、Nectin cell adhesion molecule 2、Glutathione peroxidase 4、SH3 domain binding glutamate rich protein like 2、C-C motif chemokine receptor 4、S100 calcium binding protein A13、CD69 molecule、Spleen associated tyrosine kinase、D-tyrosyl-tRNA deacylase 1、Acyl-CoA dehydrogenase very long chain、及びCoagulation factor VIIからなるタンパク質群である。
　タンパク質群（D）は、肺線維化疾患検体（好ましくは、進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD））における量が正常検体における量よりも低いタンパク質群である。
　タンパク質群（E）は、（E）Surfactant protein B、及びLDL receptor related protein 1からなるタンパク質群である。
　タンパク質群（E）は、肺線維化疾患検体（好ましくは、進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD））における量が対照検体（好ましくは、進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）ではない間質性肺疾患（non PF-ILD）検体）における量よりも高いタンパク質群である。
　タンパク質群（F）は、（F）CD34 molecule、S100 calcium binding protein A13、及びFamily with sequence similarity 49 member Bからなるタンパク質群である。
　タンパク質群（F）は、肺線維化疾患検体（好ましくは、進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD））における量が対照検体（好ましくは、進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）ではない間質性肺疾患（non PF-ILD）検体）における量よりも低いタンパク質群である。
　タンパク質群（A）～（F）のタンパク質は、ヒトの場合であれば、後述の実施例における表１～６に示されるUniProtKBアクセッション番号によって特定されるタンパク質である。他の生物種の場合であれば、表１～６に示されるUniProtKBアクセッション番号によって特定されるタンパク質のオーソログである。
　工程（1）における対象タンパク質の数は、1種のみでもよいが、2種以上の組み合わせであってもよい。より多く（例えば2種、5種、10種、20種、30種、40種、50種以上）の検出対象を組み合わせることにより、肺線維化疾患の検査等を、より正確に行うことが可能になる。
　検出は、通常は、対象タンパク質の量又は濃度を測定することによって行われる。「濃度」とは、絶対濃度に限らず、相対濃度や、単位体積辺りの重量や、絶対濃度を知るために測定した生データなどでもよい。
　対象タンパク質を検出する方法としては、対象タンパク質の一部又は全部を特異的に検出できる方法であれば特に制限されない。検出方法としては、具体的には、例えば、対象タンパク質を構成するペプチドを検出する質量分析法、対象タンパク質を特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法等を挙げることができる。なお、対象タンパク質のアミノ酸配列情報は、UniProtKBアクセッション番号を基に、EBI（http://www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhelp.html）のデータベースで検索することにより得ることができる。
　免疫学的測定法としては、免疫組織化学染色法、ELISA法、EIA法、RIA法、ウェスタンブロッティング法等を好適に例示することができる。
　質量分析法とは、ペプチド試料を、イオン源を用いて気体状のイオンとし（イオン化）、分析部において、真空中で運動させ電磁気力を用いて、あるいは飛行時間差によりイオン化したペプチド試料を質量電荷比に応じて分離し、検出できる質量分析計を用いた測定方法のことをいい、イオン源を用いてイオン化する方法としては、EI法、CI法、FD法、FAB法、MALDI法、ESI法などの方法を適宜選択することができ、また、分析部において、イオン化したペプチド試料を分離する方法としては、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間（TOF）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型などの分離方法を適宜選択することができる。また、2以上の質量分析法を組み合わせたタンデム型質量分析（MS／MS）やトリプル四重極型質量分析を利用することができる。また、サンプルがリン酸化したペプチドを含む試料の場合、質量分析計へのサンプル導入前に、サンプルを鉄イオン固定化アフィニティークロマトグラフィー（Fe-IMAC）を用いて濃縮することができる。また、液体クロマトグラフ（LC）やHPLCにより、対象タンパク質を構成するペプチドを分離・精製してサンプルとすることができる。また、検出部やデータ処理方法も適宜選択することができる。なお、質量分析法を用いて対象タンパク質を構成するペプチドを質量分析法で検出・定量する場合、かかるペプチドと同一のアミノ酸配列からなる、濃度が既知の安定同位体で標識したペプチドを内部標準とすることができる。かかる安定同位体標識ペプチドとしては、検出する対象タンパク質を構成するペプチドにおけるアミノ酸の1個以上が、15N，13C，18O，及び2Hのいずれか1以上を含む安定同位体標識ペプチドであれば、アミノ酸の種類、位置、数などは適宜選択することができ、かかる安定同位体標識ペプチドは、安定同位元素により標識されたアミノ酸を用いてF-moc法（Amblard., et al. Methods Mol Biol.298:3-24(2005)）等の適当な手段で化学合成することができるが、iTRAQ（登録商標）試薬、ICAT（登録商標）試薬、ICPL（登録商標）試薬、NBS（登録商標）試薬などの標識試薬を用いて作製することもできる。
　工程（1）を含む本発明の検査方法によれば、肺線維化疾患の検出指標である対象タンパク質の量及び／又は濃度を提供することができ、これにより肺線維化疾患の検出などを補助することができる。
　工程（1）を含む本発明の検査方法による検査結果は、抗線維化薬の治療マーカー、肺線維化疾患の病態解明、肺線維化疾患の予後予測、被検体の層別化、治療方法の選択（個別化医療、治療反応性）、肺線維化疾患における難治化や、リモデリングの評価、肺線維化疾患の組織型や表現型等の鑑別等に利用し得る。
　1-2．工程（2）
　本発明の検査方法は、一態様として、
検出したタンパク質が、タンパク質群（A）、タンパク質群（C）、及びタンパク質群（E）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質ACE’）を含む場合、さらに、
（2ACE）前記工程（1）で検出されたタンパク質ACE’の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が肺線維化疾患に罹患している、肺線維化疾患の予後が悪い、又は肺線維化疾患が進行性であると判定する工程、
を含むことが好ましい。該工程2ACEを含む本発明の検査方法によれば、肺線維化疾患を判定することが可能となる。
　本発明の検査方法は、一態様として、
検出したタンパク質が、タンパク質群（B）、タンパク質群（D）、及びタンパク質群（F）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質BDF’）を含む場合、さらに、
（2BDF）前記工程（1）で検出されたタンパク質BDF’の量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体が肺線維化疾患に罹患している、肺線維化疾患の予後が悪い、又は肺線維化疾患が進行性であると判定する工程、
を含むことが好ましい。該工程2BDFを含む本発明の検査方法によれば、肺線維化疾患を判定することが可能となる。
　肺線維化疾患が特発性肺線維症（IPF）である場合において、本発明の検査方法は、一態様として、
検出したタンパク質が、タンパク質群（A）より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質A’）を含む場合、さらに、
（2A）前記工程（1）で検出されたタンパク質A’の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が特発性肺線維症（IPF）に罹患している、IPFの予後が悪い、又はIPFが進行性であると判定する工程、
を含むことが好ましい。該工程2Aを含む本発明の検査方法によれば、特発性肺線維症（IPF）を判定することが可能となる。
　肺線維化疾患が特発性肺線維症（IPF）である場合において、本発明の検査方法は、一態様として、
検出したタンパク質が、タンパク質群（B）より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質B’）を含む場合、さらに、
（2B）前記工程（1）で検出されたタンパク質B’の量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体が特発性肺線維症（IPF）に罹患している、IPFの予後が悪い、又はIPFが進行性であると判定する工程、
を含むことが好ましい。該工程2Bを含む本発明の検査方法によれば、特発性肺線維症（IPF）を判定することが可能となる。
　肺線維化疾患が進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）である場合において、本発明の検査方法は、一態様として、
検出したタンパク質が、タンパク質群（C）及びタンパク質群（E）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質CE’）を含む場合、さらに、
（2CE）前記工程（1）で検出されたタンパク質CE’の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）に罹患している、PF-ILDの予後が悪い、又はPF-ILDが進行性であると判定する工程、
を含むことが好ましい。該工程2CEを含む本発明の検査方法によれば、進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）を判定することが可能となる。
　肺線維化疾患が進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）である場合において、本発明の検査方法は、一態様として、
検出したタンパク質が、タンパク質群（D）及びタンパク質群（F）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質DF’）を含む場合、さらに、
（2DF）前記工程（1）で検出されたタンパク質DF’の量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体が進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）に罹患している、PF-ILDの予後が悪い、又はPF-ILDが進行性であると判定する工程、
を含むことが好ましい。該工程2DFを含む本発明の検査方法によれば、進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）を判定することが可能となる。
　カットオフ値は、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などの観点から当業者が適宜設定することができ、例えば、対照被検体（例えば肺線維化疾患に罹患していない被検体、PF-ILD等の特定の肺線維化疾患に罹患しておらず且つ当該特定の肺線維化疾患以外の肺線維化疾患に罹患している被検体、肺線維化疾患に罹患している被検体、IPFに罹患している被検体、PF-ILDに罹患している被検体）から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における対象タンパク質の量及び／又は濃度に基づいて、その都度定められた値、或いは予め定められた値とすることができる。カットオフ値は、例えば、肺線維化疾患に罹患していない被検体から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における対象タンパク質の量及び／又は濃度（被検体が複数の場合は、平均値、中央値など）の、例えば0.7～1.5倍の値とすることができる。また、受信者操作特性（Receiver Operating Characteristic, ROC）曲線の解析などに基づいた統計解析（より具体的には、Youden indexを用いた方法が例示される。）を行うことにより、設定することもできる。
　工程（2）の好ましい一態様においては、被検体が肺線維化疾患の治療中又は治療後の検体である場合、カットオフ値を、例えば同一検体についての過去の試料における対象タンパク質の量及び／又は濃度に基づいた値とすることにより、治療効果を判定することができる。
　2．肺線維化疾患のより高い精度での診断
　工程（2）を含む本発明の検査方法により、被検体が肺線維化疾患に罹患していると判定された場合、本発明の検査方法に、さらに肺線維化疾患の医師による診断を適用する工程を組み合わせることによって、より高い精度で肺線維化疾患を診断することができる。また、本発明の検査方法はより正確に肺線維化疾患を検出できるので、本発明の検査方法に上記工程を組み合わせることによって、より効率的且つより正確に「肺線維化疾患に罹患している」と診断できる。
　3．肺線維化疾患の治療
　工程（2）を含む本発明の検査方法により被検体が肺線維化疾患に罹患していると判定された場合は本発明の検査方法に対してさらに、或いは上記「2．肺線維化疾患のより高い精度での診断」に記載の様に肺線維化疾患に罹患していると診断された場合は本発明の検査方法と医師による診断を適用する工程との組合せに対してさらに、（3）肺線維化疾患に罹患していると判定又は診断された被検体に対して、該疾患の治療を行う工程を行うことによって、被検体の該疾患を治療することが可能となる。また、本発明の検査方法はより正確に肺線維化疾患を検出できるので、本発明の検査方法に対して、或いは本発明の検査方法と医師による診断を適用する工程との組合せに対して工程3を組み合わせることによって、肺線維化疾患に罹患している被検体をより効率的に、より確実に治療できる。
　肺線維化疾患の治療方法は、特に制限されないが、代表的には投薬治療が挙げられる。投薬治療に用いる医薬としては、特に制限されないが、例えばピレスパ等の抗線維化剤；　ステロイド；　免疫抑制剤等が挙げられる。また、慢性閉塞性肺疾患を合併している場合であれば、さらに、例えばスピリーバ、シーブリ、エンクラッセ、エクリラ、アトロベント、テルシガン等の抗コリン薬；　セレベント、オンブレス、オーキシス、サルタノール、メプチン等のβ2刺激薬；　ウルティブロ、アノーロ、スピオルト等の抗コリン薬・β2刺激薬配合剤；　キュバール、フルタイド、パルミコート、オルベスコ、アズマネックス等のステロイド薬；　アドエア、シムビコート、レルベア等のステロイド薬・β2刺激薬配合剤等を併用することもできる。医薬は、1種、2種、又は3種以上を組み合わせて用いることができる。
　4．肺線維化疾患の検査薬、検査キット
　本発明は、その一態様において、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、タンパク質群（C）、タンパク質群（D）、タンパク質群（E）、並びにタンパク質群（F）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の検出剤を含む、肺線維化疾患の検査薬（本明細書において、「本発明の検査薬」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、タンパク質群（C）、タンパク質群（D）、タンパク質群（E）、タンパク質群（F）、肺線維化疾患等については、上記「1．肺線維化疾患の検査方法」における定義と同様である。
　検出剤は、対象タンパク質を特異的に検出できるものである限り特に制限されない。該検出剤としては、例えば対象タンパク質に対する抗体が挙げられる。
　検出剤は、その機能が著しく損なわれない限りにおいて、修飾が施されていてもよい。修飾としては、例えば、標識物、例えば蛍光色素、発光物質、色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、金コロイド、ビオチン等の付加、導入等が挙げられる。
　検出剤は、任意の固相に固定化して用いることもできる。このため本発明の検査薬は、検出剤を固定化した基板（例えばプローブを固定化したマイクロアレイチップ等。別の例として、抗体を固定化したELISAプレート等）の形態として提供することができる。
　固定化に使用される固相は、抗体等を固定化できるものであれば特に制限されることなく、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーまたはその他の基板等を挙げることができる。固相への検出剤の固定は、特に制限されない。
　抗体は、対象タンパク質を選択的に（特異的に）認識するものであれば、特に限定されない。ここで、「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばウェスタンブロット法やELISA法において、対象タンパク質が特異的に検出できることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物が対象タンパク質に由来するものであると判断できるものであればよい。
　抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。対象タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。
　これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology , Chapter 11.12～11.13(2000)）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した対象タンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該対象タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した対象タンパク質、あるいは対象タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4～11.11）。
　抗体の作製に免疫抗原として使用される対象タンパク質は、公知の遺伝子配列情報に基づいて、DNAクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行うことができる。
　具体的には、対象タンパク質をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えDNA（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、本発明抗体の製造のための免疫抗原としてのタンパク質を得ることができる。また対象タンパク質の部分ペプチドは、公知の遺伝子配列情報に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
　また本発明の抗体は、対象タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってよい。かかる抗体の製造のために用いられるオリゴ（ポリ）ペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、対象タンパク質と同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはこの免疫原特性を有し、且つ対象タンパク質のアミノ酸配列において少なくとも連続する8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるオリゴ（ポリ）ペプチドを例示することができる。
　かかるオリゴ（ポリ）ペプチドに対する抗体の製造は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、BCG（カルメット－ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントが含まれる。
　本発明の検査薬は、組成物の形態であってもよい。該組成物には、必要に応じて他の成分が含まれていてもよい。他の成分としては、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
　本発明の検査薬は、キットの形態であってもよい。該キットには、上記検出剤或いはこれを含む上記組成物のほかに、被検体の体液の細胞外小胞又は血液試料における対象タンパク質の検出に使用し得るものを含んでいてもよい。このようなものの具体例としては、各種試薬（例えば二次抗体、緩衝液等）、器具（例えば細胞外小胞の精製、分離、濃縮用器具（例えばカラム等））等が挙げられる。
　5．肺線維化疾患の予防又は治療剤
　本発明は、その一態様において、タンパク質群（A）、タンパク質群（C）、並びにタンパク質群（E）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の抑制剤、並びにタンパク質群（B）、タンパク質群（D）、並びにタンパク質群（F）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の亢進剤からなる群より選択される少なくとも1種の薬剤を含有する、肺線維化疾患の予防又は治療剤（本明細書において、「本発明の薬剤」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、タンパク質群（C）、タンパク質群（D）、タンパク質群（E）、タンパク質群（F）、肺線維化疾患等については、上記「1．肺線維化疾患の検査方法」における定義と同様である。
　抑制剤としては、例えば対象タンパク質に対する抗体が挙げられる。該抗体については、上記「4．肺線維化疾患の検査薬、検査キット」で説明した抗体と同様のものを使用することができる。
　抑制剤の別の例としては、対象タンパク質の発現抑制剤が挙げられる。
　対象タンパク質の発現抑制剤としては、対象タンパク質、そのmRNA、その前駆体などの発現量を抑制し得るものである限り特に制限されず、例えば対象タンパク質の遺伝子特異的small interfering RNA（siRNA）、対象タンパク質の遺伝子特異的microRNA（miRNA）、対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸、これらの発現ベクター；　対象タンパク質の遺伝子特異的リボザイム；　CRISPR/Casシステムによる対象タンパク質の遺伝子遺伝子編集剤などが挙げられる。
　なお、発現抑制とは、対象タンパク質、そのmRNAなどの発現量を、例えば1/2、1/3、1/5、1/10、1/20、1/30、1/50、1/100、1/200、1/300、1/500、1/1000、1/10000以下に抑制することを意味し、これらの発現量を0とすることをも包含する。
　亢進剤としては、例えば対象タンパク質の発現亢進剤が挙げられる。
　対象タンパク質の発現亢進剤としては、対象タンパク質、そのmRNA、その前駆体などの発現量を亢進し得るものである限り特に制限されず、例えば対象タンパク質の発現ベクターなどが挙げられる。
　なお、発現亢進とは、対象タンパク質、そのmRNAなどの発現量を、例えば2、3、5、10、20、30、50、100、200、300、500、1000、10000倍に亢進させることを意味する。
　対象タンパク質の遺伝子siRNAは、対象タンパク質をコードする遺伝子の発現を特異的に抑制する二本鎖RNA分子である限り特に制限されない。一実施形態において、siRNAは、例えば、18塩基以上、19塩基以上、20塩基以上、又は21塩基以上の長さであることが好ましい。また、siRNAは、例えば、25塩基以下、24塩基以下、23塩基以下、又は22塩基以下の長さであることが好ましい。ここに記載するsiRNAの長さの上限値及び下限値は任意に組み合わせることが想定される。例えば、下限が18塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が19塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が20塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が21塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さの組み合わせが想定される。
　siRNAは、shRNA(small hairpin RNA)であっても良い。shRNAは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、shRNAは、ある領域の配列を配列aとし、配列aに対する相補鎖を配列bとすると、配列a、スペーサー、配列bの順になるようにこれらの配列が一本のRNA鎖に存在するようにし、全体で45～60塩基の長さとなるように設計することができる。配列aは、標的となる対象タンパク質をコードする塩基配列の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されず、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列aの長さは19～25塩基、好ましくは19～21塩基である。
　対象タンパク質の遺伝子特異的siRNAは、5’又は3’末端に、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは、通常2～4塩基程度である。該付加的塩基は、DNAでもRNAでもよいが、DNAを用いると核酸の安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的塩基の配列としては、例えばug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　siRNAは、3'末端に突出部配列（オーバーハング）を有していてもよく、具体的には、dTdT（dTはデオキシチミジンを表わす）を付加したものが挙げられる。また、末端付加がない平滑末端（ブラントエンド）であってもよい。siRNAは、センス鎖とアンチセンス鎖が異なる塩基数であってもよく、例えば、アンチセンス鎖が3'末端及び5'末端に突出部配列（オーバーハング）を有している「asymmetrical interfering RNA（aiRNA）」を挙げることができる。典型的なaiRNAは、アンチセンス鎖が21塩基からなり、センス鎖が15塩基からなり、アンチセンス鎖の両端で各々3塩基のオーバーハング構造をとる。
　対象タンパク質の遺伝子特異的siRNAの標的配列の位置は特に制限されるわけではないが、一実施形態において、5’-UTR及び開始コドンから約50塩基まで、並びに3’-UTR以外の領域から標的配列を選択することが望ましい。選択された標的配列の候補群について、標的以外のmRNAにおいて16-17塩基の連続した配列に相同性がないかどうかを、BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）などのホモロジー検索ソフトを用いて調べ、選択した標的配列の特異性を確認することが好ましい。特異性が確認された標的配列について、AA（もしくはNA）以降の19－21塩基にTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するセンス鎖と、該19－21塩基に相補的な配列及びTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するアンチセンス鎖とからなる2本鎖RNAをsiRNAとして設計してもよい。また、siRNAの前駆体であるshRNAは、ループ構造を形成しうる任意のリンカー配列（例えば、5-25塩基程度）を適宜選択し、上記センス鎖とアンチセンス鎖とを該リンカー配列を介して連結することにより設計することができる。
　siRNA及び／又はshRNAの配列は、種々のwebサイト上に無料で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、以下を挙げることができる。
Ambionが提供するsiRNA Target Finder（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html）pSilencer（登録商標）Expression Vector用インサートデザインツール（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html）RNAi Codexが提供するGeneSeer（http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi）。
　siRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90～約95℃で約1分程度変性させた後、約30～約70℃で約1～約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、siRNAの前駆体となるshRNAを合成し、これを、RNA切断タンパク質ダイサー（dicer）を用いて切断することにより調製することもできる。
　対象タンパク質の遺伝子特異的miRNAは、対象タンパク質をコードする遺伝子の翻訳を阻害する限り任意である。例えば、miRNAは、siRNAのように標的mRNAを切断するのではなく、標的の3’非翻訳領域（UTR）に対合してその翻訳を阻害してもよい。miRNAは、pri-miRNA（primary miRNA）、pre-miRNA（precursor miRNA）、及び成熟miRNAのいずれでもよい。miRNAの長さは特に制限されず、pri-miRNAの長さは通常数百～数千塩基であり、pre-miRNAの長さは通常50～80塩基であり、成熟miRNAの長さは通常18～30塩基である。一実施形態において、対象タンパク質の遺伝子特異的miRNAは、好ましくはpre-miRNA又は成熟miRNAであり、より好ましくは成熟miRNAである。このような対象タンパク質の遺伝子特異的miRNAは、公知の手法で合成してもよく、合成RNAを提供する会社から購入してもよい。
　対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸とは、対象タンパク質をコードする遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸であって、該mRNAと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、対象タンパク質合成を抑制する機能を有する核酸である。アンチセンス核酸はDNA、RNA、DNA/RNAキメラのいずれでもよい。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性リボヌクレアーゼH（RNase H）に認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こす。したがって、RNase Hによる分解を指向するアンチセンスDNAの場合、標的配列は、mRNA中の配列だけでなく、対象タンパク質の遺伝子の初期翻訳産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。イントロン配列は、ゲノム配列と、対象タンパク質の遺伝子のcDNA塩基配列とをBLAST、FASTAなどのホモロジー検索プログラムを用いて比較することにより、決定することができる。
　対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果として対象タンパク質への翻訳が阻害されるものであればその長さは制限されない。対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸は、対象タンパク質をコードするmRNAの全配列であっても部分配列であってもよい。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題などを考慮すれば、約10～約40塩基、特に約15～約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、これらに限定されるものではない。より具体的には、対象タンパク質の遺伝子の5’端ヘアピンループ、5’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ORF翻訳終止コドン、3’端非翻訳領域、3’端パリンドローム領域又は3’端ヘアピンループなどをアンチセンス核酸の好ましい標的領域として選択しうるが、それらに限定されるものではない。
　対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸は、対象タンパク質の遺伝子のmRNAや初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるこれらの遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン（antigene））であってもよい。
　上記した対象タンパク質の遺伝子特異的siRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的miRNA、及び対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸を構成するヌクレオチド分子は、安定性（化学的及び／又は対酵素）や比活性（RNAとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含んでもよい。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス核酸を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（phosphorothioate; PS)、メチルホスホネート（methylphosphonate）、ホスホロジチオネート（phosphorodithioate）などの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の2’位の水酸基を、-OR（R=CH3（2’-O-Me）、CH2CH2OCH3（2’-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、又はCH2CH2CNなど）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などを施してもよい。また、siRNAやmiRNAを構成するヌクレオチド分子の一部は、天然型のDNAに置換されていてもよい。
　対象タンパク質の遺伝子特異的siRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的miRNA、及び対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸などは、対象タンパク質の遺伝子のcDNA配列もしくはゲノミックDNA配列に基づいてmRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。また、上記した各種修飾を含むアンチセンス核酸も、いずれも公知の手法により、化学的に合成することができる。
　対象タンパク質の遺伝子特異的siRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的miRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸の発現ベクター、対象タンパク質の発現ベクター等については、対象タンパク質の遺伝子特異的siRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的miRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸、対象タンパク質のmRNA等が発現可能な状態で組み込まれている限りにおいて特に限定されない。典型的には、該発現ベクターは、プロモーター配列、及び対象タンパク質の遺伝子特異的siRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的miRNA、対象タンパク質の遺伝子特異的アンチセンス核酸、又は対象タンパク質のコード配列（必要に応じて、さらに転写終結シグナル配列）を含むポリヌクレオチド、必要に応じて他の配列を含む。プロモーターは、特に制限されず、例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーターなどのRNA polymerase II（polII）系プロモーター；　マウス及びヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーターなどのRNA polymerase III（polIII）系プロモーターなどが挙げられる。他の配列としては、特に制限されず、発現ベクターが含み得る公知の配列を各種採用することができる。このような配列の一例としては、例えば複製起点、薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、薬剤耐性遺伝子の種類及びベクターの種類は上述のものを例示できる。
　対象タンパク質の遺伝子発現抑制剤の別の例としては、対象タンパク質の遺伝子特異的リボザイムなどが挙げられる。「リボザイム」とは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するRNAを意味するが、本願では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する。リボザイム核酸として最も汎用性の高いものは、ウイロイドやウイルソイドなどの感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型などが知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約10塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイム核酸は、RNAのみを基質とするので、ゲノムDNAを攻撃することがないという利点を有する。対象タンパク質の遺伝子のmRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、RNAヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のRNAモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、tRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。
　本発明の薬剤の適用対象は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカなどの種々の哺乳類動物などが挙げられる。
　本発明の薬剤の形態は、特に限定されず、本発明の薬剤の用途に応じて、各用途において通常使用される形態をとることができる。
　形態としては、用途が医薬、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメントなど）などである場合は、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口摂取に適した製剤形態（経口製剤形態）、点鼻剤、吸入剤、肛門坐剤、挿入剤、浣腸剤、ゼリー剤、注射剤、貼付剤、ローション剤、クリーム剤などの非経口摂取に適した製剤形態（非経口製剤形態）が挙げられる。
　形態としては、用途が食品組成物の場合は、液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、粉末状または液状の乳製品、パン、クッキーなどが挙げられる。
　形態としては、用途が口腔用組成物である場合は、例えば液体（溶液、乳液、懸濁液など）、半固体（ゲル、クリーム、ペーストなど）、固体（錠剤、粒子状剤、カプセル剤、フィルム剤、混練物、溶融固体、ロウ状固体、弾性固体など）などの任意の形態、より具体的には、歯磨剤（練歯磨、液体歯磨、液状歯磨、粉歯磨など）、洗口剤、塗布剤、貼付剤、口中清涼剤、食品（例えば、チューインガム、錠菓、キャンディ、グミ、フィルム、トローチなど）などが挙げられる。
　本発明の薬剤は、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば医薬、食品組成物、口腔用組成物、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメントなど）などに配合され得る成分である限り特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤などが挙げられる。
　本発明の薬剤の対象タンパク質の抑制剤及び亢進剤の合計含有量は、抑制剤及び亢進剤の種類、用途、使用態様、適用対象、適用対象の状態などに左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001～100重量％、好ましくは0.001～50重量％とすることができる。
　本発明の組成物の適用（例えば、投与、摂取、接種など）量は、薬効を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、有効成分の重量として、一般に一日あたり0.1～1000 mg/kg体重である。上記投与量は1日1回又は2～3回に分けて投与するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。
　6．肺線維化疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法
　本発明は、その一態様において、被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、タンパク質群（C）、タンパク質群（D）、タンパク質群（E）、並びにタンパク質群（F）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、肺線維化疾患の予防又は治療剤の有効成分（又はその候補物質）のスクリーニング方法（本明細書において、「本発明の有効成分スクリーニング方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　体液、細胞外小胞、血液試料、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、タンパク質群（C）、タンパク質群（D）、タンパク質群（E）、タンパク質群（F）、肺線維化疾患、対象タンパク質の量又は濃度の測定等については、上記「1．肺線維化疾患の検査方法」における定義と同様である。
　動物の生物種は特に制限されない。動物の生物種としては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類動物が挙げられる。
　被検物質としては、天然に存在する化合物又は人工に作られた化合物を問わず広く使用することができる。また、精製された化合物に限らず、多種の化合物を混合した組成物や、動植物の抽出液も使用することができる。化合物には、低分子化合物に限らず、タンパク質、核酸、多糖類等の高分子化合物も包含される。
　本発明の有効成分スクリーニング方法は、より具体的には、タンパク質群（A）、タンパク質群（C）、及びタンパク質群（E）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質に関する前記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における対応タンパク質の量又は濃度よりも低い場合に、前記被検物質を織線維化疾患の予防又は治療剤の有効成分として選択する工程、並びに
タンパク質群（B）、タンパク質群（D）、及びタンパク質群（F）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質に関する前記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における対応タンパク質の量又は濃度よりも高い場合に、前記被検物質を織線維化疾患の予防又は治療剤の有効成分として選択する工程
からなる群より選択される少なくとも1種の工程を含む。
　対応タンパク質とは、指標としている対象タンパク質と同じタンパク質を意味する。
　「低い」とは、例えば指標の値が、対照値の1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100であることを意味する。
　「高い」とは、例えば指標の値が、対照値の2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍であることを意味する。
　7．肺線維化疾患の誘発性又は増悪性の評価方法
　本発明は、その一態様において、被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、タンパク質群（C）、タンパク質群（D）、タンパク質群（E）、並びにタンパク質群（F）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、肺線維化疾患の誘発性又は増悪性の評価方法（本明細書において、「本発明の毒性評価方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　体液、細胞外小胞、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、タンパク質群（C）、タンパク質群（D）、タンパク質群（E）、タンパク質群（F）、肺線維化疾患、対象タンパク質の量又は濃度の測定、動物の生物種、被検物質等については、上記「1．肺線維化疾患の検査方法」及び「6．肺線維化疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法」における定義と同様である。
　本発明の毒性評価方法は、より具体的には、タンパク質群（A）、タンパク質群（C）、及びタンパク質群（E）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質に関する前記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における対応タンパク質の量又は濃度よりも高い場合に、前記被検物質を肺線維化疾患の誘発性又は増悪性があると判定する工程、及び
タンパク質群（B）、タンパク質群（D）、及びタンパク質群（F）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質に関する前記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における対応タンパク質の量又は濃度よりも低い場合に、前記被検物質を肺線維化疾患の誘発性又は増悪性があると判定する工程
からなる群より選択される少なくとも1種の工程を含む。
　対応タンパク質とは、指標としている対象タンパク質と同じタンパク質を意味する。
　「高い」とは、例えば指標の値が、対照値の2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍であることを意味する。
　「低い」とは、例えば指標の値が、対照値の1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100であることを意味する。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　試験例1．細胞外小胞画分の調製1
　特発性肺線維症（IPF）であると診断されたヒト被検体（145名）それぞれの血清、及び健常ヒト被検体（34名）それぞれの血清から細胞外小胞画分を調製した。細胞外小胞画分の調製は、各検体の血清の容量を揃えて、細胞外小胞調製キット（MagCaptur（商標） エクソソームアイソレーションキット PS、富士フイルム和光純薬社製）を用いて行った。
　続いて、得られた細胞外小胞画分について、細胞外小胞の粒子数及び粒子径を測定した。具体的には、ナノサイト（日本カンタム・デザイン株式会社、Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) Version 2.3 Build 0025）を使用して測定した。これは、粒子径ごとのブラウン運動速度の違いをもとに解析するものであり、画面に映る散乱光１つ１つの動きを追尾（トラッキング）し、各々の移動速度（拡散係数）から液中における粒子径（流体力学径）を算出することができる。
　さらに、細胞外小胞を免疫電子顕微鏡法によって観察した。具体的には、次のようにして行った。固定済み細胞外小胞溶液を5～8μLずつグリッドへ載せ15分静置して、グリッドのフォルムバールへ細胞外小胞を定着させた。PBSで3回洗浄した後、ブロッキング反応（1%BSA/PBS、10分）を行い、続いて一次抗体反応（Invitrogen AHS0902  Mouse (monoclonal) Anti-Human Leukemia and Platelet Associated Antigen CD9 Clone: MM2/57、100倍希釈、2時間半、室温）を行った。PBSで6回洗浄した後、二次抗体反応（CRL EMGMHL10 Anti-IgG (H＋L), Mouse, Goat-Poly, Gold 10 nm, EM、200倍希釈、1時間、室温）を行った。PBSで6回洗浄した後、1%GA/PBSで15分間処理し、さらにPBSで3回洗浄した。水洗し、0.5% UA（酢酸ウラニル）で処理して、乾燥させて、電子顕微鏡で観察した。
　またさらに、細胞外小胞画分について、エクソソームマーカーに対する抗体（抗CD9抗体及び抗CD63抗体）を用いて、ウェスタンブロットした。
　上記解析の結果、得られた画分にはエクソソームが存在していることが確認できた。
　試験例2．プロテオミクス解析（DIAプロテオーム解析）1
　試験例1で得られた細胞外小胞画分中のタンパク質の定量を、DIAプロテオーム解析により行った。具体的には以下のようにして行った。
　エクソソームの溶出液に、500mM NH4HCO3、120mM デオキシコール酸ナトリウム、120mM N-ラウロイルサルコシン酸ナトリウムからなる10×相間移動界面活性剤（PTS）緩衝液を加え、95℃、5分間煮沸した。このサンプルを10mM TCEPで37℃で30分処理した後、20mM ヨードアセトアミドで37℃で30分、暗所でアルキル化し、続いて2mAU LysC（和光ケミカル、東京、日本）および1μg Trypsin（和光ケミカル、東京、日本）で37℃で一晩消化した。消化液を1%TFAで酸性化し、20,000gで10分間遠心分離して、界面活性剤を沈殿させた。消化されたペプチドを含む上清をC18-SCX StageTipを用いて脱塩し、遠心エバポレーターを用いて乾燥させた後、乾燥したペプチドを2% ACNと1% TFAに溶解した。
　LC-MS/MSは、UltiMate 3000 Nano LCシステム（Thermo Scientific, Bremen, Germany）とHTC-PALオートサンプラー（CTC Analytics, Zwingen, Switzerland）をOrbitrap Fusion Lumos質量分析計（Thermo Scientific）に結合して行った。ペプチドは分析カラム（75 μm × 20 cm, ReproSil-Pur C18-AQ, 1.9 μm resin, Dr. Maisch, Ammerbuch, Germany）で、溶媒B5%から30%までの45分間のグラジエント（溶媒A, 0.1% FA; 溶媒B, 0.1% FA and 99.9% acetonitrile）を用いて280 nL/minの流速で分離した。Orbitrap Fusion Lumos質量分析計は、ライブラリ取得時は418-494、490-566、562-638、634-710、706-782 m/z（5xGPF）をカバーする5GPF（gas-phase fractionation）-DIAモード（プレカーサー分解能120,000、フラグメント分解能50,000、AGCターゲット1e6および2e5、最大IIT 250msおよび86ms、NCE 30、プレカーサー分離窓2m/z）で動作させた。個々のサンプルは、DIAモード（プリカーサー分解能120,000、フラグメント分解能30,000、AGCターゲットはMS1が4e5、MS2が2e5、最大IITはMS1が100ms、MS2が54ms、NCEは30、8m/zのプリカーサー分離ウィンドウ）で分析した。
　DIAデータは，DIA-NN（バージョン1.7.12）を用いて解析した。DIA-NNは、デフォルトの設定（自動質量精度公差およびスキャンウィンドウ設定）を使用した。MSファイルは、uniprotヒトデータベースを使用して以下の条件で検索した。実験データ検索酵素：トリプシン／P、最大ミス切断部位：2、最大可変修飾：5、静的修飾：システインのカルバミドメチル化、可変修飾：N-term Mの切除。タンパク質同定の閾値は、プリカーサーとタンパク質のFDRの両方を1%以下に設定した。
　ロジスティック回帰分析（共変量：年齢、性別）を行い、特発性肺線維症（IPF）被検体と健常被検体とを比較し、2つの群間で有意に離れた発現レベルを示すタンパク質として、14個、抽出した。
　（結果）
　抽出した特発性肺線維症（IPF）バイオマーカーの内、特発性肺線維症（IPF）被検体の発現レベルが健常被検体の発現レベルよりも高かったタンパク質を、表１に示す。表１中、「Fold change」は、特発性肺線維症（IPF）被検体の発現量平均値を健常被検体の発現量平均値で除した値（特発性肺線維症（IPF）被検体の発現量平均値／健常被検体の発現量平均値）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　抽出した特発性肺線維症（IPF）バイオマーカーの内、特発性肺線維症（IPF）被検体の発現レベルが健常被検体の発現レベルよりも低かったタンパク質を、表２に示す。表２中、「Fold change」は、特発性肺線維症（IPF）被検体の発現量平均値を健常被検体の発現量平均値で除した値（特発性肺線維症（IPF）被検体の発現量平均値／健常被検体の発現量平均値）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　試験例3．細胞外小胞画分の調製2
　進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）であると診断されたヒト被検体（41名）それぞれの血清から細胞外小胞画分を調製した。具体的には、試験例1と同様にして行った。
　試験例4．プロテオミクス解析（DIAプロテオーム解析）2
　試験例3で得られた細胞外小胞画分中のタンパク質の定量を、DIAプロテオーム解析により行った。具体的には、試験例2と同様にして行った。
　マンホイットニーのU検定(FDR<0.1を有意とした), Fold change(>1.5または<2/3を有意とした)による評価を行い、進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）の中の特発性間質性肺疾患被検体と健常被検体（測定データは試験例2で得られたデータ）とを比較し、2つの群間で有意に離れた発現レベルを示すタンパク質として、237個、抽出した。同様に、進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）の中のIPAF(interstitial pneumonia with autoimmune features)および膠原病関連間質性肺疾患被検体と健常被検体とを比較し181個、進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）の中のその他の間質性肺疾患被検体と健常被検体を比較し335個抽出した。それらの共通項として47個のバイオマーカーを抽出した。
　（結果）
　抽出した進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）バイオマーカーの内、進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）被検体の発現レベルが健常被検体の発現レベルよりも高かったタンパク質を、表３に示す。表３中、「Fold change」は、進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）被検体の発現量平均値を健常被検体の発現量平均値で除した値（進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）被検体の発現量平均値／健常被検体の発現量平均値）を示す。FC(Fold Change)、P値は、進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）被検体全体と健常被検体を比較して得られた値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　抽出した進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）バイオマーカーの内、進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）被検体の発現レベルが健常被検体の発現レベルよりも低かったタンパク質を、表４に示す。表４中、「Fold change」は、進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）被検体の発現量平均値を健常被検体の発現量平均値で除した値（進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）被検体の発現量平均値／健常被検体の発現量平均値）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　試験例5．細胞外小胞画分の調製3
　進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）ではない間質性肺疾患（non PF-ILD）と診断されたヒト被検体（55名）それぞれの血清から細胞外小胞画分を調製した。具体的には、試験例1と同様にして行った。
　試験例6．プロテオミクス解析（DIAプロテオーム解析）3
　試験例5で得られた細胞外小胞画分中のタンパク質の定量を、DIAプロテオーム解析により行った。具体的には、試験例2と同様にして行った。
　マンホイットニーのU検定(FDR<0.1を有意とした)による評価を行い、進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）被検体（測定データは試験例4で得られたデータ）とnon PF-ILD被検体とを比較し、2つの群間で有意に離れた発現レベルを示すタンパク質として、5個、抽出した。
　（結果）
　抽出した進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）バイオマーカーの内、進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）被検体の発現レベルがnon PF-ILD被検体の発現レベルよりも高かったタンパク質を、表５に示す。表５中、「Fold change」は、進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）被検体の発現量平均値をnon PF-ILD被検体の発現量平均値で除した値（進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）被検体の発現量平均値／non PF-ILD被検体の発現量平均値）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　抽出した進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）バイオマーカーの内、進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）被検体の発現レベルがnon PF-ILD被検体の発現レベルよりも低かったタンパク質を、表６に示す。表６中、「Fold change」は、進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）被検体の発現量平均値をnon PF-ILD被検体の発現量平均値で除した値（進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）被検体の発現量平均値／non PF-ILD被検体の発現量平均値）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　試験例7．特発性肺線維症（IPF）バイオマーカーの評価1
　試験例2の定量結果に基づき、BPI fold-containing family B member 1（BPIFB1）、Pulmonary surfactant-associated protein B（SFTPB）、及びPulmonary surfactant-associated protein A2; Pulmonary surfactant-associated protein A1（SFTPA）をそれぞれ単独で特発性肺線維症（IPF）バイオマーカーとして使用した際のROC曲線を作成した。また、ポジティブコントロールとして、同じ被検体についての血清中のKL6を特発性肺線維症（IPF）バイオマーカーとして使用した際のROC曲線を作成した。具体的には、縦軸を感度（陽性率）とし、横軸を1から特異度を減じた値（1－特異度）（偽陽性率）とするROC曲線を統計ソフトRを用いて作成した。結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　試験例8．特発性肺線維症（IPF）バイオマーカーの評価2
　特発性肺線維症（IPF）バイオマーカーと病態との関連を調べた。試験例1の各被検体それぞれについて、肺CT画像に基づいて、医師により、被検体を、3グループ（10％＜（間質性陰影の範囲が10％未満）、10-50％（間質性陰影の範囲が10～50％）、50％≦（間質性陰影の範囲が50％以上））に分類した。試験例2の結果に基づいて、BPI fold-containing family B member 1（BPIFB1）、及びPulmonary surfactant-associated protein A2; Pulmonary surfactant-associated protein A1（SFTPA）それぞれについて、各分類群（上記3グループ＋HC（Healthy Control（健常者）群））における量を表した。また、ポジティブコントロールとして、血清中のKL6についても、各分類群における量を表した。結果を図１～３に示す。
　BPIFB1及びSFTPAは、血清KL6と同様に間質性陰影の範囲との関連が認められた。
　試験例9．特発性肺線維症（IPF）バイオマーカーの評価3
　特発性肺線維症（IPF）バイオマーカーと呼吸機能との関連を調べた。試験例1の各被検体それぞれについて、呼吸機能（％FVC）をスパイロメーターで測定した。試験例2の結果に基づいて、線形回帰分析（共変量：年齢、性別）により、BPI fold-containing family B member 1（BPIFB1）、Pulmonary surfactant-associated protein B（SFTPB）、及びPulmonary surfactant-associated protein A2; Pulmonary surfactant-associated protein A1（SFTPA）それぞれについて呼吸機能との関連を調べた。また、ポジティブコントロールとして、血清中のKL6についても、同様にして呼吸機能との関連を調べた。結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　調べたすべてのバイオマーカーについて、タンパク質量が増加するほど、呼吸機能が低下することが分かった。また、SFTPBは血清K6より呼吸機能との関連が強かった。
　試験例10．特発性肺線維症（IPF）バイオマーカーの評価4
　試験例1の特発性肺線維症（IPF）に加えて、様々な呼吸器疾患（HC：健常、BA：気管支喘息、COPD：慢性閉塞性肺疾患、CHP：慢性過敏性肺炎、SAR：サルコイドーシス）におけるPulmonary surfactant-associated protein B（SFTPB）の量を試験例2と同様に測定した。結果を図４に示す。
　IPF、CHPといった線維化の強い病態でSFTPBの発現量が増加していた。
　試験例11．進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）バイオマーカーの評価1
　試験例4及び6の定量結果に基づき、LDL receptor related protein 1（LRP1）、Pulmonary surfactant-associated protein B（SFTPB）、S100 calcium binding protein A13（S100A13）、及びCD34 molecule（CD34）をそれぞれ単独で進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）バイオマーカーとして使用した際のROC曲線を作成した。また、ポジティブコントロールとして、同じ被検体についての血清中のKL6及びSP-Dそれぞれを特発性肺線維症（IPF）バイオマーカーとして使用した際のROC曲線を作成した。具体的には、縦軸を感度（陽性率）とし、横軸を1から特異度を減じた値（1－特異度）（偽陽性率）とするROC曲線を統計ソフトJMPを用いて作成した。結果を表９及び１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　試験例12．進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）バイオマーカーの評価2
　進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）バイオマーカーと病態との関連を調べた。試験例3の各被検体それぞれについて、肺CT画像に基づいて、医師により、被検体を、3グループ（10％＜（間質性陰影の範囲が10％未満）、10-50％（間質性陰影の範囲が10～50％）、50％≦（間質性陰影の範囲が50％以上））に分類した。試験例4の結果に基づいて、Pulmonary surfactant-associated protein B（SFTPB）について、各分類群（上記3グループ＋Control（健常者）群）における量を表した。結果を図５に示す。
　SFTPBは間質性陰影の範囲との関連が認められた。
　試験例13．進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）バイオマーカーの評価3
　進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）バイオマーカーと呼吸機能との関連を調べた。試験例3の各被検体それぞれについて、呼吸機能（％FVC、及び％Dlco）をスパイロメーターで測定した。試験例4及び6の結果に基づいて、線形回帰分析（共変量：年齢、性別）により、LDL receptor related protein 1（LRP1）、Pulmonary surfactant-associated protein B（SFTPB）、S100 calcium binding protein A13（S100A13）、及びCD34 molecule（CD34）それぞれについて呼吸機能との関連を調べた。また、ポジティブコントロールとして、血清中のKL6及び血清中のSP-Dについても、同様にして呼吸機能との関連を調べた。％FVCとの関連の結果を表１１に示し、％Dlcoとの関連の結果を表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　試験例13．バイオマーカーの評価
　ILD患者（nonIPF）206例それぞれについて、LDL receptor related protein 1（LRP1）、Pulmonary surfactant-associated protein B（SFTPB）の血清細胞外小胞画分中の量と生命予後との関連を調べた。
　SFTPBおよびLRP1は, ILD患者の生命予後と有意な関連を示した。結果を図６に示す
　試験例14．進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）バイオマーカーの評価4
　試験例4及び6の定量結果に基づき、Pulmonary surfactant-associated protein B（SFTPB）を単独で間質性肺疾患の進行性を予測するバイオマーカーとして使用した際のROC曲線を作成した。また、ポジティブコントロールとして、同じ被検体についての血清中のKL6及びSP-Dそれぞれを特発性肺線維症（IPF）バイオマーカーとして使用した際のROC曲線を作成した。具体的には、縦軸を感度（陽性率）とし、横軸を1から特異度を減じた値（1－特異度）（偽陽性率）とするROC曲線を統計ソフトJMPを用いて作成した。結果を表１３に示す。なお、進行性の定義は1年後%FVC低下率>10%、1年以内の急性増悪、1年以内の死亡のいずれかを満たすものとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　試験例15．バイオマーカーの評価
　ELISA kit (SEB622Hu, Cloud Clone corp.)を用いて血清中SFTPBを定量した。IPFやPF-ILD患者では、健常者に比べ血清中SFTPBが増加していた。また、ELISA kit (SEB010Hu, Cloud Clone corp.)を用いて血清中LRP1を定量した結果、IPFやPF-ILD患者では、健常者に比べ血清中LRP1が増加していた。結果を図７及び図８に示す。
　試験例16．バイオマーカーの評価
　IPF患者およびコントロールの肺検体をAnti-Surfactant Protein B (Mature) antibody [RM370] ab271345、およびAnti-LRP1 antibody[EPR3724] ab92544を用いて免疫染色した。特にSFTPBは肺胞上皮細胞で、LRP1は線維芽細胞やマクロファージで強く発現していることを確認した。結果を図９に示す。
　試験例17．バイオマーカーの評価
　健常者及び各疾患の患者の血清由来細胞外小胞画分サンプル中の、SP-B（surfactant protein B：SFTPB）の発現量をイムノブロットで定量した。具体的には以下のようにして行った。
　タンパク質サンプルは、NuPAGE 4-12% Bis-Tris ゲル (Invitrogen) にロードした。イムノブロット分析のために、ゲルをポリビニリデン・ジフルオリド膜（Bio-Rad）にエレクトロブロッティングした。膜はBlocking One (Nacalai Tesque)で60分間室温でブロックし、特異的一次抗体とインキュベートし、次に適切な二次抗体とインキュベートした。イムノブロットには以下の一次抗体を使用した。マウス抗ヒトSP-B (sc-133143; Santa Cruz Biotechnology, Inc., TX, USA) をcan get signal solution1 (TOYOBO) で1：100に希釈し、室温で120分間反応させた。SuperSignal West Atto Ultimate Sensitivity Maximum Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific) を用いて免疫反応性シグナルを可視化し、ChemiDoc Touch (Bio-Rad) 上で検出した。デンシトメトリー解析には ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) を使用した。
　結果を図１０に示す。SP-Bは線維化疾患、特に突発性肺線維症で発現増加を示すことが分かった。 

Claims (15)

  1. 肺線維化疾患を検査する方法であって、
    （1）被検体から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、タンパク質群（C）、タンパク質群（D）、タンパク質群（E）、並びにタンパク質群（F）：
    （A）ATP-dependent RNA helicase DDX55、Secretoglobin family 3A member 1、BPI fold-containing family B member 1、Pulmonary surfactant-associated protein B、Protein argonaute-2、Pulmonary surfactant-associated protein A2; Pulmonary surfactant-associated protein A1、Testin、Copine-2、Sorting nexin-18、Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3、及びC-C motif chemokine 18からなるタンパク質群、
    （B）Cyclin-dependent kinase 11B; Cyclin-dependent kinase 11A、Secretogranin-1、及びPeptidyl-prolyl cis-trans isomerase Aからなるタンパク質群、
    （C）Surfactant protein B、BPI fold containing family B member 1、Argonaute 2, RISC catalytic component、Small integral membrane protein 1 (Vel blood group)、Secretoglobin family 3A member 1、Sorting nexin 18、Myelin protein zero like 1、Alpha hemoglobin stabilizing protein、Glycoprotein nmb、Yip1 interacting factor homolog B, membrane trafficking protein、Synaptogyrin 1、LDL receptor related protein 1、Cysteine rich transmembrane module containing 1、Testin LIM domain protein、Endoplasmic reticulum protein 29、Erythrocyte membrane protein band 4.2、Reticulon 4、Synaptogyrin 2、及びSpectrin alpha, erythrocytic 1からなるタンパク質群、
    （D）Cyclin dependent kinase 11A, B、FYN proto-oncogene, Src family tyrosine kinase、Peptidylprolyl isomerase A、Serpin family B member 6、Tubulin alpha 8、Sorbitol dehydrogenase、Chromogranin B、Claudin 3、Metallo-beta-lactamase domain containing 2、Inositol polyphosphate-5-phosphatase A、NGFI-A binding protein 2、BRICK1, SCAR/WAVE actin nucleating complex subunit、Tropomyosin 1、PX domain containing serine/threonine kinase like、Galectin like、Tandem C2 domains, nuclear、YKT6 v-SNARE homolog、Plexin B2、Nectin cell adhesion molecule 2、Glutathione peroxidase 4、SH3 domain binding glutamate rich protein like 2、C-C motif chemokine receptor 4、S100 calcium binding protein A13、CD69 molecule、Spleen associated tyrosine kinase、D-tyrosyl-tRNA deacylase 1、Acyl-CoA dehydrogenase very long chain、及びCoagulation factor VIIからなるタンパク質群、
    （E）Surfactant protein B、及びLDL receptor related protein 1からなるタンパク質群、並びに
    （F）CD34 molecule、S100 calcium binding protein A13、及びFamily with sequence similarity 49 member Bからなるタンパク質群、
    からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質を検出する工程を含む、検査方法。
  2. 前記肺線維化疾患が間質性肺疾患（ILD）である、請求項１に記載の検査方法。
  3. 前記肺線維化疾患が特発性肺線維症（IPF）である、請求項１又は２に記載の検査方法。
  4. 検出するタンパク質が、タンパク質群（A）及びタンパク質群（B）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質を含む、請求項３に記載の検査方法。
  5. 検出したタンパク質が、タンパク質群（A）より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質A’）を含む場合、さらに、
    （2A）前記工程（1）で検出されたタンパク質A’の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が特発性肺線維症（IPF）に罹患している、IPFの予後が悪い、又はIPFが進行性であると判定する工程、
    を含む、請求項３又は４に記載の検査方法。
  6. 検出したタンパク質が、タンパク質群（B）より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質B’）を含む場合、さらに、
    （2B）前記工程（1）で検出されたタンパク質B’の量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体が特発性肺線維症（IPF）に罹患している、IPFの予後が悪い、又はIPFが進行性であると判定する工程、
    を含む、請求項３～５のいずれかに記載の検査方法。
  7. 前記肺線維化疾患が進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）である、請求項１又は２に記載の検査方法。
  8. 検出するタンパク質が、タンパク質群（C）、タンパク質群（D）、タンパク質群（E）、及びタンパク質群（F）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質を含む、請求項７に記載の検査方法。
  9. 検出したタンパク質が、タンパク質群（C）及びタンパク質群（E）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質CE’）を含む場合、さらに、
    （2CE）前記工程（1）で検出されたタンパク質CE’の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体が進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）に罹患している、PF-ILDの予後が悪い、又はPF-ILDが進行性であると判定する工程、
    を含む、請求項７又は８に記載の検査方法。
  10. 検出したタンパク質が、タンパク質群（D）及びタンパク質群（F）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質（タンパク質DF’）を含む場合、さらに、
    （2DF）前記工程（1）で検出されたタンパク質DF’の量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体が進行性線維化を伴う間質性肺疾患（PF-ILD）に罹患している、PF-ILDの予後が悪い、又はPF-ILDが進行性であると判定する工程、
    を含む、請求項７～９のいずれかに記載の検査方法。
  11. 前記被検体がヒトである、請求項１～１０のいずれかに記載の検査方法。
  12. タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、タンパク質群（C）、タンパク質群（D）、タンパク質群（E）、並びにタンパク質群（F）：
    （A）ATP-dependent RNA helicase DDX55、Secretoglobin family 3A member 1、BPI fold-containing family B member 1、Pulmonary surfactant-associated protein B、Protein argonaute-2、Pulmonary surfactant-associated protein A2; Pulmonary surfactant-associated protein A1、Testin、Copine-2、Sorting nexin-18、Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3、及びC-C motif chemokine 18からなるタンパク質群、
    （B）Cyclin-dependent kinase 11B; Cyclin-dependent kinase 11A、Secretogranin-1、及びPeptidyl-prolyl cis-trans isomerase Aからなるタンパク質群、
    （C）Surfactant protein B、BPI fold containing family B member 1、Argonaute 2, RISC catalytic component、Small integral membrane protein 1 (Vel blood group)、Secretoglobin family 3A member 1、Sorting nexin 18、Myelin protein zero like 1、Alpha hemoglobin stabilizing protein、Glycoprotein nmb、Yip1 interacting factor homolog B, membrane trafficking protein、Synaptogyrin 1、LDL receptor related protein 1、Cysteine rich transmembrane module containing 1、Testin LIM domain protein、Endoplasmic reticulum protein 29、Erythrocyte membrane protein band 4.2、Reticulon 4、Synaptogyrin 2、及びSpectrin alpha, erythrocytic 1からなるタンパク質群、
    （D）Cyclin dependent kinase 11A, B、FYN proto-oncogene, Src family tyrosine kinase、Peptidylprolyl isomerase A、Serpin family B member 6、Tubulin alpha 8、Sorbitol dehydrogenase、Chromogranin B、Claudin 3、Metallo-beta-lactamase domain containing 2、Inositol polyphosphate-5-phosphatase A、NGFI-A binding protein 2、BRICK1, SCAR/WAVE actin nucleating complex subunit、Tropomyosin 1、PX domain containing serine/threonine kinase like、Galectin like、Tandem C2 domains, nuclear、YKT6 v-SNARE homolog、Plexin B2、Nectin cell adhesion molecule 2、Glutathione peroxidase 4、SH3 domain binding glutamate rich protein like 2、C-C motif chemokine receptor 4、S100 calcium binding protein A13、CD69 molecule、Spleen associated tyrosine kinase、D-tyrosyl-tRNA deacylase 1、Acyl-CoA dehydrogenase very long chain、及びCoagulation factor VIIからなるタンパク質群、
    （E）Surfactant protein B、及びLDL receptor related protein 1からなるタンパク質群、並びに
    （F）CD34 molecule、S100 calcium binding protein A13、及びFamily with sequence similarity 49 member Bからなるタンパク質群、
    からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の検出剤を含む、肺線維化疾患の検査薬。
  13. タンパク質群（A）、タンパク質群（C）、並びにタンパク質群（E）：
    （A）ATP-dependent RNA helicase DDX55、Secretoglobin family 3A member 1、BPI fold-containing family B member 1、Pulmonary surfactant-associated protein B、Protein argonaute-2、Pulmonary surfactant-associated protein A2; Pulmonary surfactant-associated protein A1、Testin、Copine-2、Sorting nexin-18、Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3、及びC-C motif chemokine 18からなるタンパク質群、
    （C）Surfactant protein B、BPI fold containing family B member 1、Argonaute 2, RISC catalytic component、Small integral membrane protein 1 (Vel blood group)、Secretoglobin family 3A member 1、Sorting nexin 18、Myelin protein zero like 1、Alpha hemoglobin stabilizing protein、Glycoprotein nmb、Yip1 interacting factor homolog B, membrane trafficking protein、Synaptogyrin 1、LDL receptor related protein 1、Cysteine rich transmembrane module containing 1、Testin LIM domain protein、Endoplasmic reticulum protein 29、Erythrocyte membrane protein band 4.2、Reticulon 4、Synaptogyrin 2、及びSpectrin alpha, erythrocytic 1からなるタンパク質群、並びに
    （E）Surfactant protein B、及びLDL receptor related protein 1からなるタンパク質群、
    からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の抑制剤、並びに
    タンパク質群（B）、タンパク質群（D）、並びにタンパク質群（F）：
    （B）Cyclin-dependent kinase 11B; Cyclin-dependent kinase 11A、Secretogranin-1、及びPeptidyl-prolyl cis-trans isomerase Aからなるタンパク質群、
    （D）Cyclin dependent kinase 11A, B、FYN proto-oncogene, Src family tyrosine kinase、Peptidylprolyl isomerase A、Serpin family B member 6、Tubulin alpha 8、Sorbitol dehydrogenase、Chromogranin B、Claudin 3、Metallo-beta-lactamase domain containing 2、Inositol polyphosphate-5-phosphatase A、NGFI-A binding protein 2、BRICK1, SCAR/WAVE actin nucleating complex subunit、Tropomyosin 1、PX domain containing serine/threonine kinase like、Galectin like、Tandem C2 domains, nuclear、YKT6 v-SNARE homolog、Plexin B2、Nectin cell adhesion molecule 2、Glutathione peroxidase 4、SH3 domain binding glutamate rich protein like 2、C-C motif chemokine receptor 4、S100 calcium binding protein A13、CD69 molecule、Spleen associated tyrosine kinase、D-tyrosyl-tRNA deacylase 1、Acyl-CoA dehydrogenase very long chain、及びCoagulation factor VIIからなるタンパク質群、並びに
    （F）CD34 molecule、S100 calcium binding protein A13、及びFamily with sequence similarity 49 member Bからなるタンパク質群、
    からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の亢進剤
    からなる群より選択される少なくとも1種の薬剤を含有する、肺線維化疾患の予防又は治療剤。
  14. 被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、タンパク質群（C）、タンパク質群（D）、タンパク質群（E）、並びにタンパク質群（F）：
    （A）ATP-dependent RNA helicase DDX55、Secretoglobin family 3A member 1、BPI fold-containing family B member 1、Pulmonary surfactant-associated protein B、Protein argonaute-2、Pulmonary surfactant-associated protein A2; Pulmonary surfactant-associated protein A1、Testin、Copine-2、Sorting nexin-18、Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3、及びC-C motif chemokine 18からなるタンパク質群、
    （B）Cyclin-dependent kinase 11B; Cyclin-dependent kinase 11A、Secretogranin-1、及びPeptidyl-prolyl cis-trans isomerase Aからなるタンパク質群、
    （C）Surfactant protein B、BPI fold containing family B member 1、Argonaute 2, RISC catalytic component、Small integral membrane protein 1 (Vel blood group)、Secretoglobin family 3A member 1、Sorting nexin 18、Myelin protein zero like 1、Alpha hemoglobin stabilizing protein、Glycoprotein nmb、Yip1 interacting factor homolog B, membrane trafficking protein、Synaptogyrin 1、LDL receptor related protein 1、Cysteine rich transmembrane module containing 1、Testin LIM domain protein、Endoplasmic reticulum protein 29、Erythrocyte membrane protein band 4.2、Reticulon 4、Synaptogyrin 2、及びSpectrin alpha, erythrocytic 1からなるタンパク質群、
    （D）Cyclin dependent kinase 11A, B、FYN proto-oncogene, Src family tyrosine kinase、Peptidylprolyl isomerase A、Serpin family B member 6、Tubulin alpha 8、Sorbitol dehydrogenase、Chromogranin B、Claudin 3、Metallo-beta-lactamase domain containing 2、Inositol polyphosphate-5-phosphatase A、NGFI-A binding protein 2、BRICK1, SCAR/WAVE actin nucleating complex subunit、Tropomyosin 1、PX domain containing serine/threonine kinase like、Galectin like、Tandem C2 domains, nuclear、YKT6 v-SNARE homolog、Plexin B2、Nectin cell adhesion molecule 2、Glutathione peroxidase 4、SH3 domain binding glutamate rich protein like 2、C-C motif chemokine receptor 4、S100 calcium binding protein A13、CD69 molecule、Spleen associated tyrosine kinase、D-tyrosyl-tRNA deacylase 1、Acyl-CoA dehydrogenase very long chain、及びCoagulation factor VIIからなるタンパク質群、
    （E）Surfactant protein B、及びLDL receptor related protein 1からなるタンパク質群、並びに
    （F）CD34 molecule、S100 calcium binding protein A13、及びFamily with sequence similarity 49 member Bからなるタンパク質群、
    からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、肺線維化疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法。
  15. 被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞又は血液試料における、タンパク質群（A）、タンパク質群（B）、タンパク質群（C）、タンパク質群（D）、タンパク質群（E）、並びにタンパク質群（F）：
    （A）ATP-dependent RNA helicase DDX55、Secretoglobin family 3A member 1、BPI fold-containing family B member 1、Pulmonary surfactant-associated protein B、Protein argonaute-2、Pulmonary surfactant-associated protein A2; Pulmonary surfactant-associated protein A1、Testin、Copine-2、Sorting nexin-18、Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3、及びC-C motif chemokine 18からなるタンパク質群、
    （B）Cyclin-dependent kinase 11B; Cyclin-dependent kinase 11A、Secretogranin-1、及びPeptidyl-prolyl cis-trans isomerase Aからなるタンパク質群、
    （C）Surfactant protein B、BPI fold containing family B member 1、Argonaute 2, RISC catalytic component、Small integral membrane protein 1 (Vel blood group)、Secretoglobin family 3A member 1、Sorting nexin 18、Myelin protein zero like 1、Alpha hemoglobin stabilizing protein、Glycoprotein nmb、Yip1 interacting factor homolog B, membrane trafficking protein、Synaptogyrin 1、LDL receptor related protein 1、Cysteine rich transmembrane module containing 1、Testin LIM domain protein、Endoplasmic reticulum protein 29、Erythrocyte membrane protein band 4.2、Reticulon 4、Synaptogyrin 2、及びSpectrin alpha, erythrocytic 1からなるタンパク質群、
    （D）Cyclin dependent kinase 11A, B、FYN proto-oncogene, Src family tyrosine kinase、Peptidylprolyl isomerase A、Serpin family B member 6、Tubulin alpha 8、Sorbitol dehydrogenase、Chromogranin B、Claudin 3、Metallo-beta-lactamase domain containing 2、Inositol polyphosphate-5-phosphatase A、NGFI-A binding protein 2、BRICK1, SCAR/WAVE actin nucleating complex subunit、Tropomyosin 1、PX domain containing serine/threonine kinase like、Galectin like、Tandem C2 domains, nuclear、YKT6 v-SNARE homolog、Plexin B2、Nectin cell adhesion molecule 2、Glutathione peroxidase 4、SH3 domain binding glutamate rich protein like 2、C-C motif chemokine receptor 4、S100 calcium binding protein A13、CD69 molecule、Spleen associated tyrosine kinase、D-tyrosyl-tRNA deacylase 1、Acyl-CoA dehydrogenase very long chain、及びCoagulation factor VIIからなるタンパク質群、
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    からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の量又は濃度を指標とする、肺線維化疾患の誘発性又は増悪性の評価方法。 
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