CN109091493B - LncRNA ZEB1-AS1在制备改善卵巢上皮癌耐药药物中的应用 - Google Patents

LncRNA ZEB1-AS1在制备改善卵巢上皮癌耐药药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开药物组合物包括一种或多种活性成分：LncRNA‑ZEB1‑AS1或经过修饰的LncRNA‑ZEB1‑AS1；si‑ZEB1‑AS1或经过修饰的si‑ZEB1‑AS1；表达载体。本发明还公开LncRNAZEB1‑AS1在制备改善卵巢上皮癌耐药药物中的应用。lncRNA ZEB1‑AS1在耐药的卵巢上皮癌细胞A2780/R细胞中低表达，而在敏感卵巢上皮癌细胞A2780高表达，在有紫杉醇或者顺铂存在情况下，使用siRNA敲除ZEB1‑AS1后，卵巢上皮癌细胞A2780明显对紫杉醇和顺铂耐药，使用过表达质粒转染之后，卵巢上皮癌耐药细胞A2780/R明显对紫杉醇和顺铂敏感。

Description

LncRNA ZEB1-AS1在制备改善卵巢上皮癌耐药药物中的应用
技术方案
本发明属于基因工程及生殖医学领域，涉及LncRNA ZEB1-AS1在制备改善卵巢上皮癌耐药药物中的应用。
背景技术
卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，严重威胁妇女生命健康。目前肿瘤细胞减灭术辅以化疗是卵巢癌治疗的主要手段，但由于多数患者被诊断时已届晚期，失去手术机会，因此以铂类为基础联合紫杉醇的化疗成为卵巢癌患者重要的治疗手段。大部分卵巢癌患者在初始化疗时对化疗敏感，短期内尚可获得较高的缓解率，但往往迅速出现腹部或盆腔复发，并进一步发展为耐药，这是卵巢癌患者的生存率一直徘徊在30％的重要原因。因此深入研究卵巢癌的耐药机制，寻找有效干预靶点，成为改善化疗效果和解决耐药问题，最终提高卵巢癌生存率的关键。
过去普遍认为遗传学上的基因突变是肿瘤耐药形成的关键。虽然在针对基因突变也发现了一些与肿瘤耐药关键的基因突变，如p53、BRAF、EGFR等。然而进一步研究发现有些耐药的肿瘤细胞中并没有相关基因突变，而且肿瘤耐药过程是可逆的，周期发生短、现象普遍，跟基因突变不可逆、长期且低频的特点不相符合。因此，表观遗传学在肿瘤耐药中发挥着不可或缺的角色。随着后基因组时代的到来，RNA组学逐渐成为研究的热点。尤其是长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)由于数量、种类以及作用机制远丰富于其他非编码RNA，因此受到极大的关注。目前研究已发现lncRNA HOTAIR、ROR、UCA1等在肿瘤的耐药中均发挥着重要的作用。
因此lncRNA在表观遗传学上的调控肿瘤耐药越来越受到大家的关注。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种药物组合物。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种活性成分的用途。
本发明最后要解决的技术问题是提供了LncRNA ZEB1-AS1在制备改善卵巢上皮癌耐药药物中的应用。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括药学上可接受的载体和有效量的选自下组的一种或多种活性成分：
(1)LncRNA-ZEB1-AS1或经过修饰的LncRNA-ZEB1-AS1；
(2)si-ZEB1-AS1或经过修饰的si-ZEB1-AS1；
(3)表达载体，所述表达载体含有(1)中所述的LncRNA-ZEB1-AS1或(2)中所述的si-ZEB1-AS1或(3)中所述的多核苷酸。
其中，所述LncRNA-ZEB1-AS1的序列和si-ZEB1-AS1的序列参见pubmed中的PMID号为26073087一文中的序列。
其中，所述药物组合物还包括任选的抗肿瘤药物。
本发明内容还包括一种活性成分的用途，其中，所述的活性成分选自下组中的任意一项或几项：
(1)LncRNA-ZEB1-AS1或经过修饰的LncRNA-ZEB1-AS1；
(2)si-ZEB1-AS1或经过修饰的si-ZEB1-AS1；
(3)表达载体，所述表达载体含有(1)中所述的LncRNA-ZEB1-AS1或(2)中所述的si-ZEB1-AS1或(3)中所述的多核苷酸；
所述活性成分用于制备改善卵巢上皮癌耐药药物中的应用。
本发明内容还包括LncRNA ZEB1-AS1在制备改善卵巢上皮癌耐药药物中的应用。
其中，所述应用中采用的药物为紫杉醇或者顺铂。
其中，所述卵巢上皮癌细胞为A2780或A2780/R。本发明的耐药细胞为A2780/R，该耐药细胞A2780/R通过在A2780细胞在37℃、5％CO2的条件下常规培养，每次细胞传代贴壁后加入0.5μl紫杉醇(PTX)于10ml培养基中(PTX终浓度约为0.35nM)，继续培养至下一次传代，同样浓度药物反复诱导，待细胞能耐受该药物浓度，基本无死亡时，递增提高药物浓度，重复诱导，最终紫杉醇的药物浓度递增为终浓度3.5nM，且细胞能够稳定生长基本无死亡，即成为耐药细胞A2780/R，本发明的耐药细胞不仅限于A2780/R，其他通过该方案筛选得到的耐药细胞均可。
有益效果：相对于现有技术，本发明的优越性在于：lncRNA ZEB1-AS1在耐药的卵巢上皮癌细胞A2780/R细胞中低表达，而在敏感卵巢上皮癌细胞A2780高表达，在有紫杉醇或者顺铂存在情况下，使用siRNA敲除ZEB1-AS1后，卵巢上皮癌细胞A2780明显对紫杉醇和顺铂耐药，使用过表达质粒转染之后，卵巢上皮癌耐药细胞A2780/R明显对紫杉醇和顺铂敏感。
附图说明
图1 ZEB1-AS1在卵巢上皮癌敏感细胞A2780和耐药细胞A2780/R中的表达；
图2 ZEB1-AS1过表达质粒构建的图谱；
图3 ZEB1-AS1功能实验验证。
具体实施方式
实验材料：人卵巢上皮癌细胞系A2780购自苏凯基生物技术股份有限公司，
Figure GDA0002616694670000031
RT Master试剂盒购自TAKARA公司、Trizol提取液购自ThermoFisher公司、CCK8试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司、抽提质粒试剂盒为OMEGA质粒中提试剂盒、siRNA干扰试剂盒订购自上海吉玛制药有限公司、紫杉醇由百时美施贵宝(上海)贸易有限公司提供的Corden Pharma Latina S.P.A公司生产的紫杉醇、顺铂购自齐鲁制药有限公司、Lipo2000购自ThermoFisher公司、DMEM培养基购自凯基生物，胎牛血清购自ThermoFisher公司。
实施例1 诱导卵巢上皮癌耐药细胞
1、细胞培养与卵巢癌耐药细胞株的诱导
以卵巢上皮癌敏感株即A2780为亲本株，按照小剂量浓度递增诱导方法，诱导细胞产生耐药。具体步骤如下：A2780细胞在37℃、5％CO2的条件下常规培养，每次细胞传代贴壁后加入0.5μl紫杉醇(PTX)于10ml培养基中(PTX终浓度约为0.35nM)，继续培养至下一次传代，同样浓度药物反复诱导，待细胞能耐受该药物浓度，基本无死亡时，递增提高药物浓度，重复诱导，最终紫杉醇的药物浓度递增为终浓度3.5nM，且细胞能够稳定生长基本无死亡，即成为耐药细胞A2780/R，该细胞在含紫杉醇3.5nM的培养液中传代培养。
实验中所用细胞均培养于37℃、5％CO2培养箱中，所用培养基为含有10％灭活胎牛血清的DMEM培养基。
2、细胞增殖实验(CCK-8实验)检测细胞耐药
利用细胞增殖实验(cell counting kit 8，CCK-8)观察细胞的毒性活力，步骤如下：
a.用96孔板按照每组5个复孔，每孔100μl A2780或A2780/R细胞悬液(细胞数为1x104个)进行铺板；
b.细胞贴壁后将普通培养基换成含有0、2、4、8、16、32nM的紫杉醇或0、15、30、60、120、240nM的顺铂的培养基100μl/孔，继续培养；
c.培养48小时后，将含药培养基换成普通培养基100μl/孔，并加入CCK8溶液10μl/孔，将培养板放入培养箱中继续孵育1小时；
d.用酶标仪测定在450nm处的吸光度。比较不同浓度药物作用下，实验0组与对照组的细胞活力，可间接反映出实验组与对照组细胞对紫杉醇或顺铂的耐药性。我们将未加药的细胞的活力默认为100％。细胞毒性活力(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100％。注：A(加药)：具有细胞、CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度；A(空白)：具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度；A(0加药)：具有细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度，当细胞毒性达到50％时，即为IC50。
实验结果显示A2780对紫杉醇IC50约为1.260±1.050nM，而A2780/R对紫杉醇IC50为16.827±1.027nM，A2780/R耐药指数是A2780的13.355倍。A2780对顺铂IC50为12.050±1.049nM，而A2780/R对顺铂的IC50为84.140±1.037nM，A2780/R耐药指数是A2780的6.983倍，结果见图1A和图1B。
实施例2 ZEB1-AS1在卵巢上皮癌敏感细胞与耐药细胞中的表达
实验步骤：RNA提取及实时定量PCR(RT-qPCR)检测细胞中基因的表达A.RT-qPCR引物(由瑞真生物技术有限公司设计并合成)
Figure GDA0002616694670000041
B.Trizol法提取细胞RNA
a.物品准备：提取RNA所用EP管、枪头等均为无RNA酶器材。
b.待培养基中A2780或A2780/R细胞汇合度达80％-90％时裂解细胞，具体步骤如下：吸弃培养基，用PBS缓缓洗去皿中代谢物并吸净2～3次，向规格10cm的培养皿中加入1mlTrizol提取液，冰上静置10分钟后吹打细胞与Trizol混匀，移至1.5ml无RNA酶EP管中。
c.向EP管中加入1/5Trizol体积即0.2ml氯仿，剧烈震荡15秒后冰浴静置5分钟，离心：4℃，12 000rpm，15min。
d.小心吸取离心所得上清至另一干净的无RNA酶的EP管中，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀后冰浴静置10分钟，离心：4℃，12 000rpm，10min。
e.弃上清，加入与Trizol等体积即1ml的75％乙醇(用DEPC水配制)洗涤沉淀，颠倒混匀后静置5分钟，离心：4℃，7 500rpm，5min。
f.弃上清，置于生物安全柜中静置风干5～10min，加入20-30μl DEPC水溶解(-80℃保存备用)。
C.逆转录反应
a.按下列组份配制RT反应液，加入200μl无核酸酶EP管中(冰上进行)。
Figure GDA0002616694670000051
*20μl反应体系可最大使用1000ng的Total RNA。
b.混匀后用离心机将液体甩至管底。
c.在PCR仪上按照下表中的程序进行逆转录反应。
Figure GDA0002616694670000052
反应后即得相应的cDNA溶液，将其液稀释一倍，加入到下一步的Real TimePCR反应体系中，其加入量不要超过Real Time PCR反应体积的1/10(V/V)量。
D.实时定量聚合酶链反应(Real Time PCR)
a.按下列组份配制PCR反应液(冰上进行)。
Figure GDA0002616694670000053
Figure GDA0002616694670000061
b.混匀后甩至管底，按顺序加入96孔板或384孔板中，每组3个复孔。
c.上样后在96或384孔板上贴上光化学膜，离心机短暂离心。
d.上机：置于ABI ViiA 7实时荧光定量PCR仪中进行扩增，扩增程序：
Figure GDA0002616694670000062
e.反应结束后导出数据，并用2-ΔΔCt方法进行统计，结果显示ZEB1-AS1在卵巢上皮癌耐药细胞A2780/R中降低了9.09倍，实验结果见图1C。
实施例3 ZEB1-AS1功能检测实验
实验方法：ZEB1-AS1干扰RNA与过表达质粒的构建：
ZEB1-AS1的干扰RNA序列由上海吉玛制药技术有限公司设计与合成。
Figure GDA0002616694670000063
ZEB1-AS1过表达质粒pc-ZEB1-AS1由上海捷瑞生物工程有限公司在pcDNA3.1(+)的基础上构建与合成具体图谱见图2，克隆位点为：NheI/NotI。合成后的过表达质粒pc-ZEB1-AS1导入到感受态大肠杆菌中增殖并抽提质粒，抽提过表达质粒pc-ZEB1-AS1的具体步骤如下：
A.菌液活化及摇菌：
将冻存甘油菌(保存在甘油中包含过表达质粒pc-ZEB1-AS1的大肠杆菌)液迅速于室温融化，在超净台中取出10μl菌液，加入到50ml含有氨苄青霉素(终浓度为50～100μg/ml)的LB培养基中(LB培养基提前高温灭菌)，将菌液置于摇床中，37℃，200r/min，摇菌12～15h，至浑浊。
B.质粒提取：按照OMEGA质粒中提试剂盒说明书进行质粒抽提，步骤如下：
a.集菌：将100mL菌液分批倒入50mL圆底离心管中，离心：室温，12000rpm，1min，弃流出液体，打开盖倒置吸水纸上控干。
b.加入2.5mL solution I(提前加入RNase，4℃保存)，涡旋振荡。
c.加入2.5mL solution II，轻柔混匀(颠倒离心管10次)，以获得清亮的裂解物，室温静置2min。(此步主要是碱裂解细菌，使其中的蛋白质和DNA变性，反应时间不能太长，否则容易使大肠杆菌的基因组DNA断裂成小片段，污染质粒DNA)。
d.加入1.25mL冰浴BufferN3，轻柔混匀(颠倒离心管10次)，直至形成白色絮状沉淀试验。
e.离心：4℃，12000rpm，10min，使白色沉淀沉于底部。
f.取出一个Lysate Clearance Filter Syringe，抽出活塞，小心将e步骤中液体全部转移至注射器中(注射器可不放活塞直接直立于d步骤中的离心管中，液体不会出来)，室温静置2min。
g.将f步骤中注射器放置于一新的15mL离心管，轻推注射器活塞，使液体流入离心管中。
h.加入0.1倍体积的ETR(约600μL)至过滤后的液体中，混匀(颠倒离心管10次)，冰浴10min，期间颠倒离心管几次(此期间准备一个Hind-Bind DNA midi Column加入2mL GPSBuffer，室温静置10min，离心：4000rpm，5min)。
i.42℃温浴5min，溶菌液变浑浊，离心：室温，4000rpm，5min，则ETR沉入底部。
j.小心将上层液体转移至一新的15或10mL离心管中，加入0.5倍体积的无水乙醇(约2.5mL)，轻柔混颠倒5-6次，室温静置2min。
k.将j中液体加入柱子中，离心：室温4000rpm离心5min，弃液体，重新装好柱子，直至液体全部滤过。
l.加入3mL Buffer HBC，室温4000rpm离心5min，弃液体。
m.加入3.5mL DNA Wash Buffer，室温，4000rpm，5min，弃液体。
n.重复m步骤。
o.甩洗脱柱，离心：室温，4000rpm，15min。
p.将结合柱置于一新的15mL离心管中，加入70℃预热的500μL Elution Buffer，室温静置2-3min，离心：室温，4000rpm，10min，以洗脱DNA。
q.将洗脱下来的液体置于新的1.5mL EP管中，做好标记，用酶标仪测浓度和纯度并于-20℃保存。
4、si-ZEB1-AS1、过表达质粒pc-ZEB1-AS1分别转染A2780或A2780/R细胞
提前一天将1*105个A2780或A2780/R细胞铺于6孔板中孵育，次日当细胞汇合度达到约70％-90％时，进行转染实验。以六孔板的一个孔为例，具体步骤如下：
a.在100μl的Opti-MEM无血清培养基分别加入100pmol si-ZEB1-AS1、对照si-NC、4μg pc-ZEB1-AS1、对照空载质粒pcDNA3.1，柔和混匀；
b.用100μl无血清的Opti-MEM无血清培养基稀释10μl lipofectamin2000试剂，轻轻混匀，室温放置5分钟；
c.将步骤a中的混合液逐滴分别加入步骤b中，轻柔混匀，室温放置20分钟，以便分别形成siRNA/lipofectamin2000复合物、DNA/lipofectamin2000复合物。
d.分别将200μl siRNA/lipofectamin2000复合物、DNA/lipofectamin2000复合物均匀加到含1.8ml有血清培养基的培养板中，来回轻柔摇晃培养板。
e.孵育4-6小时后，除去复合物，更换培养基，在细胞培养箱中温育24h-48h后，进行后续功能实验。
5、细胞增殖实验(CCK-8实验)检测细胞增殖-毒性
利用细胞增殖实验(cell counting kit 8，CCK-8)观察细胞的毒性活力，大体步骤如下：
a.用96孔板按照每组5个复孔，每孔100μl A2780或A2780/R细胞悬液(细胞数为1x104个)进行铺板；
b.细胞贴壁后将普通培养基换成含有不同浓度的紫杉醇(做ZEB1-AS1干扰实验时在敏感细胞株A2780上做的，加的紫杉醇浓度为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4nM，做过表达实验时，在耐药细胞株A2780/R上做的，加的紫杉醇浓度为0、2、4、8、16、32nM)或顺铂(做ZEB1-AS1干扰实验时在敏感细胞株A2780上做的，加的顺铂浓度为0、2.5、5、10、20、40nM，做过表达实验时，在耐药细胞株A2780/R上做的，加的顺铂浓度为0、20、40、80、160、200nM)的培养基100μl/孔，继续培养；
c.培养48小时后，将含药培养基换成普通培养基100μl/孔，并加入CCK8试剂10μl/孔，将培养板放入培养箱中继续孵育1～2小时；
d.用酶标仪测定在450nm处的吸光度。我们将未加药的细胞的活力默认为100％。细胞毒性活力(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100％。注：A(加药)：具有细胞、CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度；A(空白)：具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度；A(0加药)：具有细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。实验结果如图3所示：图3A使用siRNA干扰ZEB1-AS1表达后，RT-qPCR验证干扰效果，结果显示siRNA干扰效率大于50％，图3B在卵巢上皮癌敏感株A2780中检测对紫杉醇耐药活性，结果显示ZEB1-AS1干扰后显著增加了A2780对紫杉醇的耐药；图3C在卵巢上皮癌敏感株A2780中检测对顺铂耐药活性，结果显示ZEB1-AS1干扰后显著增加了A2780对顺铂的耐药；图3D使用过表达质粒过表达ZEB1-AS1后，RT-qPCR验证过表达效果；图3E在卵巢上皮癌耐药株A2780/R中检测对紫杉醇耐药活性，结果显示ZEB1-AS1过表达后显著降低了A2780/R对紫杉醇的耐药；图3F在卵巢上皮癌耐药株A2780/R中检测对顺铂耐药活性，结果显示ZEB1-AS1过表达显著降低了A2780/R对顺铂的耐药。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
序列表
<110> 南京市妇幼保健院
<120> LncRNAZEB1-AS1在制备改善卵巢上皮癌耐药药物中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> ZEB1-AS1 上游引物(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaccgggat gggaagtgac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> ZEB1-AS1 下游引物(Artificial Sequence)
<400> 2
ggttctacgc gaggaagagg 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> GAPDH 上游引物(Artificial Sequence)
<400> 3
tcatttcctg gtatgacaac g 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> GAPDH 下游引物(Artificial Sequence)
<400> 4
tcttactcct tggaggccat 20
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> Si-ZEB1-AS1 正向干扰RNA序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccaugaauuc cuuccuaaau g 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> Si-ZEB1-AS1 反向干扰RNA序列(Artificial Sequence)
<400> 6
uuuaggaagg aauucauggc c 21

Claims (2)

1.过表达质粒pc- ZEB1-AS1用于制备改善卵巢上皮癌耐药药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用中采用的药物为紫杉醇或者顺铂。
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