CN112226434B - 用于抑制GAN基因表达的siRNA的应用 - Google Patents
用于抑制GAN基因表达的siRNA的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112226434B CN112226434B CN202011018311.2A CN202011018311A CN112226434B CN 112226434 B CN112226434 B CN 112226434B CN 202011018311 A CN202011018311 A CN 202011018311A CN 112226434 B CN112226434 B CN 112226434B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gan
- sirna
- seq
- nucleotide sequence
- hct
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
- A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了抑制GAN基因表达的siRNA的应用,属于生物医药技术领域,用于抑制GAN基因表达的siRNA至少为以下两条siRNA中一种:GAN‑siRNA‑1,其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其反应链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;GAN‑siRNA‑3,其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,其反应链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明设计的GAN‑siRNA‑1、GAN‑siRNA‑3在HCT‑116和HCT‑8细胞中均能良好地抑制GAN基因的表达,且GAN‑siRNA和5‑氟脲嘧啶可以联合用于治疗结直肠癌。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,尤其涉及用于抑制GAN基因表达的siRNA的应用。
背景技术
结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,占胃肠道肿瘤的第二位。结直肠癌好发部位为直肠与乙状结肠交界处,占60%;发病多在40岁以后。5-氟尿嘧啶可在细胞内转化成不同的细胞毒性代谢产物,作用于S期,属于抗代谢类抗肿瘤药。
然而,5-氟尿嘧啶的药性有限,还有必要研发出用于治疗结直肠癌的新药物。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术存在的不足,而提供抑制GAN基因表达的siRNA的应用,抑制GAN基因表达的siRNA可降低结肠癌对5-氟尿嘧啶的耐药性。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:用于抑制GAN基因表达的siRNA,至少为以下两条siRNA中一种:
GAN-siRNA-1,其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其反应链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
GAN-siRNA-3,其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,其反应链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
GAN蛋白是直接或间接作用神经丝结构的细胞骨架成分,可能充当E3泛素-蛋白连接酶复合物的底物特异性衔接子,可参与蛋白质泛素化途径和蛋白质修饰。该蛋白的异常是轴突丢失和神经活检组织中充满神经丝的巨大轴突肿胀等神经变性疾病的标志。
另外,本发明还提供GAN-siRNA-1在制备用于治疗结直肠癌药物中的应用,GAN-siRNA-1正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其反应链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
另外,本发明还提供GAN-siRNA-1和5-氟尿嘧啶在制备用于治疗结直肠癌药物中的应用,GAN-siRNA-1正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其反应链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
另外,本发明还提供一种用于治疗结直肠癌药物,其包括GAN-siRNA-1和5-氟尿嘧啶,GAN-siRNA-1正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其反应链的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
另外,本发明还提供GAN-siRNA-3在制备用于治疗结直肠癌药物中的应用,GAN-siRNA-3正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,其反应链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
另外,本发明还提供GAN-siRNA-3和5-氟尿嘧啶在制备用于治疗结直肠癌药物中的应用,GAN-siRNA-1正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,其反应链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
另外,本发明还提供一种用于治疗结直肠癌药物,其包括GAN-siRNA-3和5-氟尿嘧啶,GAN-siRNA-1正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,其反应链的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
本发明有益效果:本发明提供抑制GAN基因表达的siRNA的应用,本发明设计的GAN-siRNA-1、GAN-siRNA-3在HCT-116和HCT-8细胞中均能良好地抑制GAN基因的表达;在GAN-siRNA-1、GAN-siRNA-3转染下,敲低GAN的HCT-116和HCT-8肿瘤细胞对5-FU的耐药作用得到降低。
附图说明
图1显示GAN-siRNA转染HCT-116和HCT-8细胞后,细胞中GAN蛋白的表达量;其中,NC表示阴性对照,GAN-1表示采用GAN-siRNA-1进行转染,GAN-3表示采用GAN-siRNA-3进行转染;
图2显示GAN-siRNA对HCT-116和HCT-8细胞耐药性的影响;其中,GAPDH表示阳性对照,NC-si表示阴性对照,GAN-si01表示采用GAN-siRNA-1进行转染,GAN-si03表示采用GAN-siRNA-3进行转染。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
GAN-siRNA的设计
本发明设计了3个GAN-siRNA,GAN-siRNA的核苷酸序列如表1所示。
表1 GAN-siRNA的核苷酸序列
涉及的实验方法
(1)细胞的培养
结直肠癌细胞系HCT-116,HCT8由中山大学胃肠病学研究所保存,HCT-116用含10%胎牛血清(Invitrogen,Grand Island,NY,USA)的DMEM(Gibco,China)培养基,HCT8用含10%胎牛血清(Invitrogen,Grand Island,NY,USA)的RPMI1640(Gibco,China)培养基,置于含5%二氧化碳、37℃恒温潮湿的培养箱中培养。
(2)瞬时转染细胞
用GAN-siRNA瞬时转染HCT-116,HCT8。当细胞接种于6孔板24小时细胞密度达到50%后,按照生产商说明以脂质体Lipofectamine2000(Invitrogen,USA)为载体用GAN-siRNA和NC-siRNA瞬时转染HCT-116,HCT8,GAN-siRNA和NC-siRNA模拟物最终浓度为10nM。转染8小时后更换含10%FBS的新鲜培养基。为了验证转染效果,提取转染后三天总RNA并通过实时定量PCR验证GAN敲低的表达效果。
(3)GAN表达水平的检测
按照TRIZOL试剂(Invitrogen,USA)的生产商说明书中的步骤提取细胞总RNA。步骤如下:1)吸弃培养基,用1ml的PBS冲洗两次,每孔加入TRIZOL试剂0.5ml,室温放置5min;2)将细胞裂解液全部转移到1.5ml的EP管中,加入0.1ml氯仿,剧烈震荡15s,室温下静置5min,12,000g,4℃离心15min;3)取上层水相转移到另外一个新的无RNase的离心管内,加入等体积的异丙醇,轻柔混匀,室温放置10min,12,000g,4℃离心15min;4)弃上清,加入75%乙醇洗涤RNA沉淀,7,500g,4℃离心10min,弃上清,空气干燥RNA沉淀10min,用DEPC水溶解RNA。用All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit(Gene Copoeia,China)试剂盒进行RT-PCR扩增。所得定量数据由7500software v2.0.6(Applied Biosystems)导出,每个样品的threshold cycle(CT)值代表所测基因的表达水平,由ΔΔCT方法计算出来的值代表GAN与内参基因的差异,最后由2-ΔΔCt方法处理数据,得出数据代表GAN的表达水平。
(4)5-FU耐药试验
将5-FU(Sigma,China)粉剂用DMSO配制成浓度为1M的储存液备用。细胞以106个/孔的密度接种于6孔板后培养24小时,加入5-FU使得终浓度分别为0.01μM,0.1μM,1μM,10μM,100μM,1000μM,分别培养96小时。
(5)细胞存活率的测试(MTS)
按照Cell Titer 96@AQneous One Solution Reagent试剂的生产商说明书中的步骤测细胞存活率。步骤如下:(1)室温溶解,往每个96孔板加入20ul,于37℃培养箱避光孵育2小时;(2)取出培养板,490nm测量细胞吸光度,并统计处理。
实验结果
如图1所示,本发明设计的GAN-siRNA-1和GAN-siRNA-3在HCT-116和HCT8细胞中均能良好地抑制GAN基因的表达。
如图2所示,在一系列5-FU浓度下(0μM,1μM,5μM,10μM,20μM,50μM,100μM,200μM),敲低GAN的HCT-116和HCT-8肿瘤细胞对5-FU的耐药作用得到降低。
实施例1
本实施例提供一种用于治疗结直肠癌药物,其包括GAN-siRNA-1和5-氟尿嘧啶,GAN-siRNA-1正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其反应链的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
实施例2
本实施例提供一种用于治疗结直肠癌药物,其包括GAN-siRNA-3和5-氟尿嘧啶,GAN-siRNA-1正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,其反应链的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
最后所应当说明的是,以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学附属第六医院
<120> 用于抑制GAN基因表达的siRNA的应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 1
gcgagauggu aacuugcaa 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 2
uugcaaguua ccaucucgc 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 3
gcgagauggu aacuugcaa 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 4
uugcaaguua ccaucucgc 19
Claims (1)
1.GAN-siRNA-1和5-氟尿嘧啶在制备用于治疗结直肠癌药物中的应用,其特征在于,所述GAN-siRNA-1正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其反义链的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011018311.2A CN112226434B (zh) | 2020-09-24 | 2020-09-24 | 用于抑制GAN基因表达的siRNA的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011018311.2A CN112226434B (zh) | 2020-09-24 | 2020-09-24 | 用于抑制GAN基因表达的siRNA的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112226434A CN112226434A (zh) | 2021-01-15 |
CN112226434B true CN112226434B (zh) | 2023-01-13 |
Family
ID=74107159
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202011018311.2A Active CN112226434B (zh) | 2020-09-24 | 2020-09-24 | 用于抑制GAN基因表达的siRNA的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN112226434B (zh) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110295171A (zh) * | 2019-06-26 | 2019-10-01 | 中山大学附属第六医院 | 用于抑制NPC1基因表达的siRNA的应用 |
WO2019222329A1 (en) * | 2018-05-15 | 2019-11-21 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for delivery of aav |
WO2020127498A1 (en) * | 2018-12-18 | 2020-06-25 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Compounds for use in the treatment of diseases associated with altered autophagy, altered shh transduction, and/or neurodegenerative diseases |
-
2020
- 2020-09-24 CN CN202011018311.2A patent/CN112226434B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019222329A1 (en) * | 2018-05-15 | 2019-11-21 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for delivery of aav |
WO2020127498A1 (en) * | 2018-12-18 | 2020-06-25 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Compounds for use in the treatment of diseases associated with altered autophagy, altered shh transduction, and/or neurodegenerative diseases |
CN110295171A (zh) * | 2019-06-26 | 2019-10-01 | 中山大学附属第六医院 | 用于抑制NPC1基因表达的siRNA的应用 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Chul Won Yun et al..Hypoxia-induced PGC-1α Regulates Mitochondrial Function and Tumorigenesis of Colorectal Cancer Cells.《Anticancer Res》.2019,第39卷(第9期),4865-4876. * |
Jason Lowery et al..Abnormal intermediate filament organization alters mitochondrial motility in giant axonal neuropathy fibroblasts.《Mol Biol Cell》.2016,第27卷(第4期),608-616. * |
Mysore S Veena et al..p16 Protein and gigaxonin are associated with the ubiquitination of NFκB in cisplatin-induced senescence of cancer cells.《J Biol Chem》.2014,第289卷(第50期),34921-34937. * |
器官移植术后免疫抑制剂的药物基因组学研究进展;李嘉丽等;《药学进展》;20180425(第04期);第243-258页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN112226434A (zh) | 2021-01-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106834290B (zh) | 一种环状rna及其用途 | |
WO2018024034A1 (zh) | 环状RNA circ-NFATC3及其用途 | |
CN107663539B (zh) | 环状RNA circ-PTGR1的用途 | |
CN110295171B (zh) | 用于抑制NPC1基因表达的siRNA的应用 | |
CN112618564B (zh) | hsa_circ_0001400的抑制剂及其在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
CN112226434B (zh) | 用于抑制GAN基因表达的siRNA的应用 | |
CN109966496B (zh) | miRNA-5571在制备抗结直肠肿瘤药物中的应用 | |
CN114934048B (zh) | 一种用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物的circMTMR14及试剂盒和应用 | |
CN114939125A (zh) | 巨噬细胞源外泌体在制备抗腹膜纤维化药物中的应用 | |
CN111020036B (zh) | 人circ-STXBP5L的用途及相关产品 | |
CN114517204A (zh) | 一种用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物的circPOLK及其应用 | |
CN107858351A (zh) | 一种双链siRNA在制备恶性肿瘤的药物中的应用 | |
CN102533982B (zh) | 人klf8基因在肿瘤治疗中的新用途 | |
CN103623427B (zh) | 人usp14基因的用途及其相关药物 | |
CN101270358A (zh) | 一种miRNA序列及其用途 | |
CN112656805A (zh) | 抑制ythdf1活性的物质在制备预防或治疗胃癌产品中的应用 | |
CN110079528B (zh) | 靶向otud7b基因的小干扰rna在胶质瘤靶向治疗中的应用 | |
CN111803513B (zh) | 一种用于制备抑制结肠癌细胞增殖药物的基因抑制剂 | |
CN103667422A (zh) | 人cul4b基因的用途及其相关药物 | |
CN107582525A (zh) | Trim31抑制剂磁性靶向载药微球在制备抑制pdac增殖能力药物中的应用 | |
CN104928353A (zh) | 人dgkz基因的用途及其相关药物 | |
CN113151280B (zh) | 一种小分子非编码rna及宿主基因在胃癌诊断及治疗的应用 | |
CN112280859B (zh) | 一种乳腺癌标志物及应用 | |
CN101787368B (zh) | 抑制人Z38基因表达的siRNA及其在制备抗乳腺肿瘤药物中的应用 | |
CN107502655B (zh) | 一种抑制膀胱癌转移的新靶标及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |