JP2015533792A - ｓｉＲＮＡならびに眼の状態の処置および／または予防のための方法および組成物におけるその使用 - Google Patents
ｓｉＲＮＡならびに眼の状態の処置および／または予防のための方法および組成物におけるその使用 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、１９ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡ分子を含む、眼のＩＯＰを減少させる方法、組成物および投薬に関する。
Description
本発明は、ｓｉＲＮＡならびに眼の状態の処置および／または予防のための方法および組成物におけるその使用に関する。
緑内障は、眼内圧（ＩＯＰ）のその正常な生理学的範囲を超える持続的な上昇によって生じる眼組織破壊の経過として定義される（非特許文献１）。開放隅角緑内障（ＯＡＧ）では、ＩＯＰの上昇は網膜神経節細胞の喪失により、最終的には失明につながる進行性視神経症を生じる（非特許文献２）。閉塞隅角緑内障では、ＩＯＰの急な上昇がしばしば眼を失明させる。緑内障は、世界で二番目に多い失明の原因であり（非特許文献３）、有病率は世界中で増加している（非特許文献４）。緑内障における失明は、網膜および視神経の変性経過によって生じるが、眼房水（ａｑｕｅｏｕｓ ｈｕｍｏｒ）（ＡＨ）分泌と流出との間の均衡における機能障害に機能的には関連する。ＡＨは毛様体（ＣＢ）の細胞によって分泌され、流出は２つの経路：線維柱帯網路およびぶどう膜強膜路の１つを通じて生じ得る（非特許文献５）。
緑内障の現在の処置は、緑内障によって生じた視力喪失を回復させることができず、ＩＯＰ低減を重視している（非特許文献６）。ＩＯＰを制御することは、緑内障において視神経を損傷から保護することが示されている（非特許文献５、７）。ＩＯＰ低減を達成するために現在使用されている５種類の薬物がある：α−アドレナリンアゴニスト、β−アドレナリンアンタゴニスト、コリンアゴニスト、プロスタグランジンおよび炭酸脱水素酵素阻害剤。これらの薬物のいずれでもＩＯＰの低減において有効性が達成されない場合、ＡＨ流出を増加させるためにレーザー療法が線維柱帯網に適用される場合がある。最後の治療用リソースは、ＡＨ流出のための新規経路を作出するための外科的手技である（非特許文献８）。
緑内障に関連するＩＯＰの増大に対する現在の処置は、眼の副作用は比較的少ないが、化合物が血流に達した場合に全身性副作用を有する場合がある（非特許文献９、１０、１１）。プロスタグランジンなどの全身性により許容される処置は、多数の局所耐性の課題を有する（非特許文献１２）。この事実はＩＯＰの適切なレベルを維持するために必要な滴下注入の頻度と共に処置コンプライアンスを患者への課題にする（非特許文献１３）。治療への適合の失敗は、疾患進行を許容できないだけでなく、視神経への重大な損傷になる場合があるＩＯＰの急な増大を生じるリブート効果を有する場合もある。
プロスタグランジンおよびベータ遮断薬は、好ましいＩＯＰ低下剤である（非特許文献１２、１４）。プロスタグランジンは、ＩＯＰを極めて良く低下させ、全身性に安全であるが、いくつかの関連する眼の副作用を有する（非特許文献１５）、すなわち虹彩色の暗色化、睫毛成長、眼周囲色素沈着および充血。この種類の薬物の低頻度の眼の副作用は、眼内炎、嚢胞様黄斑浮腫および眼球角膜ヘルペスウイルス感染の再活性化である（非特許文献１６）。プロスタグランジン類似物は、早産の潜在的危険性のために妊娠中は禁忌である。
ベータ遮断薬の局所適用は、その流出を増大させることによってではなく、ＡＨ産生を減少させることによってＩＯＰを低減する。局所に投与されたベータ遮断薬は、結膜上皮、流涙チャネル（ｌａｃｒｉｍａｌ ｃｈａｎｎｅｌ）、鼻粘膜および胃腸管を介して、体循環に吸収され、全身性の有害反応を誘導する（非特許文献１７〜１９）。眼では、アドレナリン受容体は、眼房水分泌への関与も記載されているがそれらの主な効果が血管収縮である毛様体および線維柱帯網をかん流する血管に位置付けられている。ウサギの眼でのこれまでの研究は、結膜、角膜および毛様体突起上皮での高密度のβ−アドレナリン受容体を示しており、β−アドレナリン受容体は角膜内皮、水晶体上皮、脈絡膜および外眼筋にも存在した。眼で検出されるβ−アドレナリン受容体の大部分はβ２型に属する（非特許文献２０〜２３）。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、小さな、特異的に設計され、化学的に合成された二本鎖ＲＮＡ断片が細胞質中の特異的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分解を媒介できるという原理に基づく技術であり、そのため特異的タンパク質の合成を選択的に阻害する。この技術は、規定のタンパク質における異常な活性を遮断するおよび／または低減する目的の新規化合物を開発するための非常に強力なツールとして現れた（非特許文献２４、２５）。ＲＮＡ干渉に基づく化合物は、伝統的小分子阻害剤を見出すことができない遺伝子を含む任意の標的遺伝子の発現を遮断するように合理的に設計できる（非特許文献２６）。治療でのＲＮＡｉの良好な使用例は、ヒト細胞におけるＨＩＶ−１複製の阻害（非特許文献２７）およびアルツハイマー病の動物モデルにおけるタウおよびアポリポタンパク質前駆体タンパク質のノックダウン（非特許文献２８）を含む。ＲＮＡｉは十年あまり前に発見されたが、これらの化合物のいくつかは既に臨床試験の進行した相にある、すなわち加齢性黄斑変性症を処置するためのＲＴＰ８０１（Ｑｕａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＰＡ、第ＩＩ相）および呼吸器合胞体ウイルスを処置するためのＡＬＮ−ＲＳＶ０１（Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、第ＩＩ相）（非特許文献２９、３０）。ＲＮＡ干渉は、処置中止の際に発現抑制されたタンパク質がその生物学的活性を回復させるために、再合成されなければならないことから慢性状態への非常に魅力的な手法である。このためＲＮＡ干渉に基づく化合物の効果は一般に、従来の処置のものよりもさらに長期に及ぶ（非特許文献２４、３１）。
眼は、比較的単離された組織コンパートメントであり；これはｓｉＲＮＡに基づく治療の使用にいくつかの有利点を具体的に提供する。化合物の眼への局所送達は、全身性の曝露を限定し、必要な化合物の量を低減する。これは、遺伝子の局所的発現抑制を可能にし、眼以外への広範な発現抑制の可能性を低減する。付加的に免疫系は、眼への到達は限定的であり；したがって化合物への免疫応答は生じにくい（非特許文献３２）。
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Ｅｕｒｏｐｅａｎ ａｎｄ ＵＳ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｓ
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ｔｈｅ Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ ｖ３．０ ｓｃａｌｅ．１４
ＷＯ２００６／０２１８１７に記載の研究に継続して、本発明者らはｓｉＲＮＡのＳＹＬ０４００１２を開発した：ＳＹＬ０４００１２は、配列番号２として同定され、化学的に合成された未修飾の１９ｂｐの二本鎖オリゴヌクレオチドであり、デオキシチミジンの３’にジヌクレオチドオーバーハングを含み、β２−アドレナリン受容体の合成を選択的に阻害でき、高眼圧症、開放隅角緑内障および他の関連疾患を有する患者におけるＩＯＰの上昇の処置のために適用される。
斯かる化合物について、細胞培養においてその標的の発現を阻害する効果、ならびに正常圧ウサギおよびＩＯＰが増加したウサギモデルにおいてＩＯＰを低下させる効果を明らかにした。
本発明は、ジヌクレオチドデオキシチミジンオーバーハングを３’に有する１９ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡ分子であるＳＹＬ０４００１２を含む、眼のＩＯＰを減少させる方法、組成物および投薬に関する。本発明の組成物は、ＰＢＳなどの生理食塩水溶液中にＳＹＬ０４００１２および薬学的に許容される賦形剤を含み、それによりそれらの眼での、すなわち点眼剤としての滴下注入を可能にする。本発明の投薬は、ＳＹＬ０４００１２のおよそ０．６ｍｇから０．９ｍｇを含む約３０μ１から約４０μ１の点眼剤の毎日の滴下注入を含む。
本発明は、眼のＩＯＰを減少させる方法、組成物および投薬に関する。本発明の組成物は、アドレナリン受容体ベータ２（ＡＤＲＢ２）遺伝子の発現を減少させる低分子干渉核酸分子（ｓｉＮＡ）を含み、既に示されたとおり、それは眼の前房中の房水の産生を減少させる。本発明の組成物は、緑内障、感染、炎症、ぶどう膜炎および糖尿病性網膜症などのＩＯＰの増大を示す眼の状態の処置のための医薬品の調製において使用できる。本発明の方法は、有効な投与レジメにおける有効量の本発明の１つまたは複数のｓｉＮＡのそれを必要とする患者への投与を含む。
本発明の組成物は、眼内液、すなわち眼房水の産生に関与する遺伝子アドレナリン受容体ベータ２（ＡＤＲＢ２）の発現を減少させるまたは阻害する低分子干渉核酸分子（ｓｉＮＡ）を含む。本発明は、これだけに限らないが標的遺伝子、ＡＤＲＢ２に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を調節できる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）および低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を含む低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）の組成物および使用方法を包含する。好ましい実施形態では、本発明の方法において使用されるｓｉＮＡはｄｓＲＮＡである。本発明のｓｉＮＡは未修飾でもよくまたは化学的に修飾されてよい。
本発明の方法は、有効量の本発明のｓｉＮＡのそれを必要とする患者への投与を含む。好ましい実施形態では、本発明の方法は、Ｘａｌａｔａｎ、ＴｒｕｓｏｐｔおよびＴｉｍｏｆｔｏｌなどの市販で入手できる薬物の投与から生じるＩＯＰ減少の持続時間と比較してＩＯＰの持続的な減少を提供する。
本発明の方法は、これだけに限らないが、市販で入手できる薬物を含むＩＯＰを減少させる１つまたは複数の他の治療との組合せでの１つまたは複数の本発明のｓｉＮＡの投与も包含する。
本発明の方法は、滴下注入を介する眼球表面への本発明の組成物の投与も包含する。ｓｉＲＮＡが眼に直接投与される場合、一般に片眼に１日あたり約０．０１ｍｇから約１００ｍｇの間、片眼に１日あたり約０．０４ｍｇから約８０ｍｇの間、片眼に１日あたり約０．０４ｍｇから約２０ｍｇの間、片眼に１日あたり約０．０８ｍｇから約１０ｍｇの間、片眼に１日あたり約０．０８ｍｇから約１．２ｍｇの間、片眼に１日あたり約０．３から約０．９ｍｇの間、または片眼に１日あたり約０．０８ｍｇから約０．９ｍｇの間の量のｓｉＮＡが１日あたりに投与される。
本発明は、眼のＩＯＰを減少させる方法、組成物および投薬に関する。本発明の組成物は、アドレナリン受容体ベータ２（ＡＤＲＢ２）遺伝子の発現を減少させる低分子干渉核酸分子（ｓｉＮＡ）を含み、既に示されたとおり、その発現産物は眼の前房内の房水の産生を減少させる。本発明の組成物は、緑内障などのＩＯＰの増大を示す眼の状態の処置のための医薬品の調製において使用できる。本発明の方法は、有効な投与レジメにおける有効量の本発明の１つまたは複数のｓｉＮＡのそれを必要とする患者への投与を含む。
ｓｉＮＡの設計
本発明のｓｉＮＡは、ＡＤＲＢ２の発現を減少させるまたは阻害することによって活性を調節し、それによりＩＯＰに影響を与えるように設計される。一実施形態では、標的遺伝子発現の減少または阻害は、眼内液、例えば眼房水の産生を減少させる。本標的遺伝子ＡＤＲＢ２についてのＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿００００２４である。
本発明のｓｉＮＡは、ＡＤＲＢ２の発現を減少させるまたは阻害することによって活性を調節し、それによりＩＯＰに影響を与えるように設計される。一実施形態では、標的遺伝子発現の減少または阻害は、眼内液、例えば眼房水の産生を減少させる。本標的遺伝子ＡＤＲＢ２についてのＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿００００２４である。
本明細書において使用される本発明の「ｓｉＮＡ」は、ＲＮＡ干渉を介して標的ｍＲＮＡ切断を媒介できる二本鎖オリゴヌクレオチドを指す。それは、分子構造内に修飾非標準塩基および時には二本鎖部分の末端に一本鎖チミジンオーバーハングを含むデオキシリボ核酸を含むことが本分野における一般的慣行であることを考慮すると、混乱を避けるために用語ｓｉＲＮＡよりも好ましい。
遺伝子は、例えばｓｉＮＡ分子が遺伝子の発現を選択的に減少させるまたは阻害する場合に本発明によるｓｉＮＡによって「標的化される」。本明細書において使用される句「選択的に減少または阻害」は、２つ以上の遺伝子の発現を減少させるものと同様に１つの遺伝子の発現を減少させるｓｉＮＡを包含する。ｓｉＮＡが２つ以上の遺伝子の発現を減少させる場合、標的化された遺伝子は、任意の他の遺伝子の量の少なくとも約２分の１、約３分の１、約４分の１、約５分の１、約１０分の１、約２５分の１、約５０分の１または約１００分の１に減少する。代替的にｓｉＮＡは、ｓｉＮＡがストリンジェントな条件下で遺伝子転写物にハイブリダイズする場合に遺伝子を標的化している。ｓｉＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで遺伝子を標的化する能力について検査できる。
標的遺伝子のｍＲＮＡ配列の短い断片（例えば長さ１９〜４０ヌクレオチド）は、本発明のｓｉＮＡの配列のために選ばれる。一実施形態では、ｓｉＮＡはｓｉＲＮＡである。好ましい実施形態では、標的遺伝子ｍＲＮＡから候補ｓｉＲＮＡ分子となる配列断片を選ぶための基準は、１）天然ｍＲＮＡ分子の５’または３’末端由来の少なくとも５０〜１００ヌクレオチドである標的遺伝子ｍＲＮＡ由来配列、２）３０％から７０％の間、最も好ましくはおよそ５０％のＧ／Ｃ含有量を有する標的遺伝子ｍＲＮＡ由来配列、３）反復配列（例えばＡＡＡ、ＣＣＣ、ＧＧＧ、ＵＵＵ、ＡＡＡＡ、ＣＣＣＣ、ＧＧＧＧ、ＵＵＵＵ）を含有しない標的遺伝子ｍＲＮＡ由来配列、４）ｍＲＮＡにおいて到達可能である標的遺伝子ｍＲＮＡ由来配列、および５）標的遺伝子に特有である標的遺伝子ｍＲＮＡ由来配列を含む。標的遺伝子ｍＲＮＡ由来配列断片は、上に定義の１つまたは複数の基準に合致できる。標的遺伝子ｍＲＮＡの断片が上記で定義のすべての基準には合致しない実施形態では、ｓｉＲＮＡが標的遺伝子ｍＲＮＡの断片よりも多くの基準に一致するように天然配列は変更されてよい。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、６０％未満のＧ／Ｃ含有量を有するおよび／または反復配列を欠いている。
具体的な一実施形態では、標的領域に相補的であるｓｉＮＡの部分は、標的領域に完全に相補的である。別の具体的な実施形態では、標的領域に相補的であるｓｉＮＡの部分は、標的領域に完全に相補的ではない。標的配列と比較して挿入、欠失および点変異を有するｓｉＮＡも本発明によって包含される。したがって配列同一性は、配列比較および当技術分野において周知の配列比較アルゴリズム（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ １９９１、および文献中で引用の参照文献を参照されたい）ならびにヌクレオチド配列間の差異百分率を、例えば初期パラメーターを使用してＢＥＳＴＦＩＴソフトウェアプログラムを実行するなどＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによって算出することによって算出できる（例えばＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）。ｓｉＮＡと標的遺伝子の部分との間の９０％、９５％または９９％より大きい配列同一性は、好ましい。代替的にｓｉＮＡと天然ＲＮＡ分子との間の相補性は、ハイブリダイゼーションによって機能的に定義できる。本発明のｓｉＮＡ配列は、標的遺伝子転写物の部分とストリンジェントな条件（例えば４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃ハイブリダイゼーション１２〜１６時間；洗浄が続く）下でハイブリダイズできる。本発明のｓｉＮＡ配列は、標的遺伝子の発現を減少させるまたは阻害するその能力によっても機能的に定義できる。遺伝子発現に影響を与えるｓｉＮＡの能力は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかにおいて経験的に決定できる。
１つの遺伝子だけを特異的に標的化するｓｉＮＡに加えて、縮重ｓｉＮＡ配列も複数の遺伝子の相同性領域を標的化するために使用できる。ＷＯ２００５／０４５０３７は、例えば追加的標的配列を提供できる非標準塩基対、例えば不適正塩基対および／またはゆらぎ塩基対を組み込むことによって、そのような相同性配列を標的化するためのｓｉＮＡ分子の設計を記載している。例えば不適正塩基対が同定される場合、非標準塩基対（例えば、不適正塩基対および／またはゆらぎ塩基）が２つ以上の遺伝子配列を標的化するｓｉＮＡ分子を生成するために使用できる。非限定的例ではＵＵおよびＣＣ塩基対などの非標準塩基対が、配列相同性を共有する異なる標的についての配列を標的化できるｓｉＮＡ分子を生成するために使用できる。したがって、本発明のｓｉＮＡを使用する１つの有利点は、単一のｓｉＮＡが相同性遺伝子間で保存されているヌクレオチド配列に相補的である核酸配列を含むように設計できることである。この手法では異なる遺伝子を標的化するために２つ以上のｓｉＮＡ分子を使用する代わりに、単一のｓｉＮＡが２つ以上の遺伝子の発現を阻害するために使用できる。
本発明の好ましいｓｉＮＡ分子は、二本鎖である。一実施形態では、二本鎖ｓｉＮＡ分子は、平滑末端を含む。別の実施形態では、二本鎖ｓｉＮＡ分子は、オーバーハンギングヌクレオチド（例えば１〜５ヌクレオチドオーバーハング、好ましくは２ヌクレオチドオーバーハング）を含む。具体的な実施形態では、オーバーハンギングヌクレオチドは、３’オーバーハングである。別の具体的な実施形態では、オーバーハンギングヌクレオチドは、５’オーバーハングである。任意の種類のヌクレオチドがオーバーハングの部分であってよい。一実施形態では、１つまたは複数のオーバーハンギングヌクレオチドは、リボ核酸である。別の実施形態では、１つまたは複数のオーバーハンギングヌクレオチドは、デオキシリボ核酸である。好ましい実施形態では、１つまたは複数のオーバーハンギングヌクレオチドは、チミジンヌクレオチドである。別の実施形態では、１つまたは複数のオーバーハンギングヌクレオチドは、修飾または非古典的ヌクレオチドである。１つまたは複数のオーバーハンギングヌクレオチドは、非古典的ヌクレオチド間結合（例えばホスホジエステル結合以外）を有する場合がある。
好ましい実施形態では、本発明のｓｉＮＡ組成物は、配列番号１を標的化するために設計される。さらなる実施形態は、配列番号１、２、３、４、５および６によって同定されるｓｉＮＡを参照する。別の実施形態では、本発明の好ましいｓｉＮＡは、配列番号２（ＳＹＬ０４００１２）である。この好ましいｓｉＮＡ ＳＹＬ０４００１２は、図７に示すとおり、デオキシチミジン塩基を含む３’末端にジヌクレオチドオーバーハングを有する１９ｎｔ長の未修飾二本鎖ＲＮＡ分子である。
ｓｉＮＡの合成
上に記載の方法によって設計されたｓｉＮＡは、当技術分野において周知の任意の方法によって合成できる。ＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を使用して好ましくは化学的に合成される。追加的にｓｉＲＮＡは、これだけに限らないがＰｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ、ＵＳＡ）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ、ＵＳＡ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）およびＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ、ＵＫ）、Ｑｉａｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ａｍｂｉｏｎ（ＵＳＡ）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓｃｏｔｌａｎｄ）を含む商業的ＲＮＡオリゴ合成供給者から得ることもできる。代替的に本発明のｓｉＮＡ分子は、逆相補性ｓｉＮＡ配列をプロモーターの制御下に含有するベクターで細胞を形質移入することによって細胞中で発現できる。発現されるとｓｉＮＡは、当技術分野において十分周知の技術を使用して細胞から単離できる。
上に記載の方法によって設計されたｓｉＮＡは、当技術分野において周知の任意の方法によって合成できる。ＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を使用して好ましくは化学的に合成される。追加的にｓｉＲＮＡは、これだけに限らないがＰｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ、ＵＳＡ）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ、ＵＳＡ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）およびＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ、ＵＫ）、Ｑｉａｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ａｍｂｉｏｎ（ＵＳＡ）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓｃｏｔｌａｎｄ）を含む商業的ＲＮＡオリゴ合成供給者から得ることもできる。代替的に本発明のｓｉＮＡ分子は、逆相補性ｓｉＮＡ配列をプロモーターの制御下に含有するベクターで細胞を形質移入することによって細胞中で発現できる。発現されるとｓｉＮＡは、当技術分野において十分周知の技術を使用して細胞から単離できる。
ｓｉＲＮＡが二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である実施形態では、一本鎖ＲＮＡ分子が得られる場合にアニーリングステップが必要である。簡潔には、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム中の各ＲＮＡオリゴの５０ｍＭ溶液３０ｍｌを合わせる。次いで溶液は、１分間、９０℃でインキュベートされ、１５秒間遠心分離され、１時間、３７℃でインキュベートされる。
ｓｉＲＮＡが低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である実施形態では；ｓｉＲＮＡ分子の二本の鎖は、リンカー領域（例えば、ヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカー）によって繋がれてよい。
５．３ ｓｉＮＡの化学的修飾
本発明のｓｉＮＡは、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／またはホスホジエステルではない連結を含有する場合がある。当技術分野において周知の化学的修飾は、ｓｉＮＡの安定性、利用能、および／または細胞取り込みを増大できる。当業者は、ＲＮＡ分子に組み込むことができる他の種類の化学修飾を認識している（修飾の種類の概説について国際公開ＷＯ０３１０７０７４４ ＷＯ２００５／０４５０３７またはＷＯ２００８／１０４９７８を参照されたい）。
本発明のｓｉＮＡは、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／またはホスホジエステルではない連結を含有する場合がある。当技術分野において周知の化学的修飾は、ｓｉＮＡの安定性、利用能、および／または細胞取り込みを増大できる。当業者は、ＲＮＡ分子に組み込むことができる他の種類の化学修飾を認識している（修飾の種類の概説について国際公開ＷＯ０３１０７０７４４ ＷＯ２００５／０４５０３７またはＷＯ２００８／１０４９７８を参照されたい）。
一実施形態では、修飾は、分解への耐性の改善または取り込みの改善を提供するために使用できる。そのような修飾の例は、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（特に二本鎖ｓｉＲＮＡのセンス鎖において）、２’−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチドおよび逆位デオキシ脱塩機残基組み込み（一般にＧＢ２４０６５６８を参照されたい）を含む。
別の実施形態では、修飾は、ｓｉＲＮＡの安定性を増強するため、または標的化効率を増大させるために使用できる。修飾は、ｓｉＲＮＡの二本の相補鎖間の化学的架橋、ｓｉＲＮＡの鎖の３’もしくは５’末端の化学的修飾、糖修飾、核酸塩基修飾および／または骨格修飾、２’−フルオロ修飾リボヌクレオチドならびに２’−デオキシリボヌクレオチド（一般に国際公開ＷＯ２００４／０２９２１２を参照されたい）を含む。
別の実施形態では、修飾は、標的ｍＲＮＡ中のおよび／または相補性ｓｉＮＡ鎖中の相補性ヌクレオチドに対する親和性を増大または減少させるために使用できる（一般に国際公開ＷＯ２００５／０４４９７６を参照されたい）。例えば未修飾ピリミジンヌクレオチドは、２−チオ、５−アルキニル、５−メチルまたは５−プロピニルピリミジンに置換できる。追加的に未修飾プリンは、７−デザ、７−アルキルまたは７−アルケニルプリンで置換できる。
ｓｉＮＡが二本鎖ｓｉＲＮＡである別の実施形態では、３’−末端ヌクレオチドオーバーハンギングヌクレオチドは、デオキシリボ核酸によって置き換えられる。例えばＥｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ（非特許文献３３）を参照されたい。
治療的有用性の実証
本発明の組成物および方法は、ヒトでの使用の前に望ましい治療活性についてｉｎ ｖｉｔｒｏで、次いでｉｎ ｖｉｖｏで好ましくは検査される。例えば具体的治療プロトコールの投与が示されるかどうかを決定するために使用できるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、候補ｓｉＮＡが細胞（例えば、ウサギ非色素性毛様体上皮細胞（ｎｏｎ−ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ ｃｉｌｌｉａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｃｅｌｌ）（ＮＰＥ）、ヒト毛様体上皮細胞（ＯＭＤＣ）またはヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３）にｉｎ ｖｉｔｒｏで投与されるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイを含み、そのようなプロトコールの細胞への効果は観察される、例えば、標的遺伝子の発現の減少または阻害。
本発明の組成物および方法は、ヒトでの使用の前に望ましい治療活性についてｉｎ ｖｉｔｒｏで、次いでｉｎ ｖｉｖｏで好ましくは検査される。例えば具体的治療プロトコールの投与が示されるかどうかを決定するために使用できるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、候補ｓｉＮＡが細胞（例えば、ウサギ非色素性毛様体上皮細胞（ｎｏｎ−ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ ｃｉｌｌｉａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｃｅｌｌ）（ＮＰＥ）、ヒト毛様体上皮細胞（ＯＭＤＣ）またはヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３）にｉｎ ｖｉｔｒｏで投与されるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイを含み、そのようなプロトコールの細胞への効果は観察される、例えば、標的遺伝子の発現の減少または阻害。
治療における使用のための化合物は、ヒトでの検査の前に、これだけに限らないがウサギ、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ハムスターなどを含む好適な動物モデル系において検査されてよい。例えばニュージーランドウサギは、ＩＯＰを研究するために設計された実験プラットホームにおける好ましい標準である。それは、扱いが容易で、ヒト器官とサイズが類似する大きな眼を有する。付加的に、ＩＯＰを測定するための現在の装置は、マウスまたはラットなどの小さな眼を有する動物における使用には適していない。最終的にウサギは、局所用の市販の降圧薬物治療を使用してその正常（または薬物の前）値の４０％に低減する場合があるＩＯＰを有する。したがって、ウサギ緑内障モデルを生成することはできる（例えば、上強膜血管を外科的に遮断するまたは線維柱帯網を人工的に閉塞する）が、一般に本分野においては眼球構造が無処置のままであるモデルが好ましい。
治療方法
本発明は、本発明の１つまたは複数のｓｉＮＡの有効量を投与するステップを含む、患者（例えば哺乳動物、特にヒト）におけるＩＯＰの増大に関連する眼の障害を処置、予防または管理するための方法を包含する。具体的な実施形態では、処置、予防または管理される障害は、緑内障である。これだけに限らないが、開放隅角緑内障（例えば、原発性開放隅角緑内障、原発性緑内障および落屑緑内障、低眼圧緑内障）、閉塞隅角緑内障（臨床的には閉塞隅角型（ｃｌｏｓｅｄ ａｎｇｌｅ）緑内障、狭隅角緑内障、瞳孔ブロック緑内障および毛様体ブロック緑内障としても周知）（例えば、急性閉塞隅角緑内障および慢性閉塞隅角緑内障）、無虹彩緑内障、先天性緑内障、若年性緑内障、水晶体原性緑内障、血管新生緑内障、外傷後緑内障、ステロイド誘発緑内障、スタージ−ウエーバー症候群（Ｓｔｕｒｇｅ−Ｗｅｂｅｒ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）緑内障ならびにぶどう膜炎誘発緑内障を含むＩＯＰに関連する任意の種類の緑内障は、本発明の方法で処置できる。
本発明は、本発明の１つまたは複数のｓｉＮＡの有効量を投与するステップを含む、患者（例えば哺乳動物、特にヒト）におけるＩＯＰの増大に関連する眼の障害を処置、予防または管理するための方法を包含する。具体的な実施形態では、処置、予防または管理される障害は、緑内障である。これだけに限らないが、開放隅角緑内障（例えば、原発性開放隅角緑内障、原発性緑内障および落屑緑内障、低眼圧緑内障）、閉塞隅角緑内障（臨床的には閉塞隅角型（ｃｌｏｓｅｄ ａｎｇｌｅ）緑内障、狭隅角緑内障、瞳孔ブロック緑内障および毛様体ブロック緑内障としても周知）（例えば、急性閉塞隅角緑内障および慢性閉塞隅角緑内障）、無虹彩緑内障、先天性緑内障、若年性緑内障、水晶体原性緑内障、血管新生緑内障、外傷後緑内障、ステロイド誘発緑内障、スタージ−ウエーバー症候群（Ｓｔｕｒｇｅ−Ｗｅｂｅｒ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）緑内障ならびにぶどう膜炎誘発緑内障を含むＩＯＰに関連する任意の種類の緑内障は、本発明の方法で処置できる。
特異的標的遺伝子に対して方向付けられたｓｉＲＮＡでの治療処置は、効果が観察される時間の長さを伸ばすことによって、低頻度投与を可能にし、患者コンプライアンスが大きくなり、小分子の局所用眼用滴下剤よりも有益であることが期待されている。
好ましい実施形態では、本発明の治療方法において使用されるｓｉＮＡは、アドレナリン受容体ベータ２などのＩＯＰに作用する遺伝子の発現を減少させるまたは阻害する。本発明のさらに好ましい実施形態では、本発明の治療方法において使用されるｓｉＮＡは、配列番号１に標的化される。具体的な好ましい実施形態では、ｓｉＮＡは、長さ２１から３０ヌクレオチドであり、配列番号３を含む。特に好ましいのは、修飾を有さない、すなわち非標準塩基を有さない配列番号２を含み、両方の３’末端にＴＴオーバーハングを含むＳＹＬ０４００１２である。
好ましい実施形態では、本発明の方法は、ｓｉＮＡの最後の投与後８、１０、１２または１４時間より長く持続する、より好ましくは数日間にわたる（例えば、２日間、３日間、４日間または５日間）ＩＯＰの持続的な減少を提供する。そのような実施形態では、投与された本発明のｓｉＮＡの効果（すなわちＩＯＰの減少）は、現在市販で入手できる薬物（例えば、Ｘａｌａｔａｎ、ＴｒｕｓｏｐｔおよびＴｉｍｏｆｔｏｌ）の投与から典型的に生じるＩＯＰ減少の持続時間よりも長く持続する。持続的なＩＯＰ減少作用を提供する本発明のｓｉＮＡは、ｓｉＮＡの毎日投与なしでＩＯＰが継続的に減少するようなレジメンにおいて投与できる。具体的な実施形態では、処置レジメンは、投与（例えば、４日間について毎日ｓｉＮＡの１用量が与えられる）と、ＩＯＰにおいて連続的減少をまだ誘発しながらの非投与（例えば、処置が与えられない３または４日間）との連続サイクルを含むことができる。
一実施形態では、１種類のｓｉＮＡが本発明の治療方法において投与される。別の実施形態では、本発明のｓｉＮＡは、本発明の別のｓｉＮＡとおよび／またはＩＯＰの増大に関連する眼の障害の処置、予防もしくは管理において有用な１つもしくは複数の他の非ｓｉＮＡ治療剤との組合せで投与される。用語「との組合せで」は、厳密に同時の治療剤の投与には限定せず、むしろ組合せの利益が、それらが他のやり方で投与された場合の利益よりも大きくなるような順番および時間間隔内で患者に本発明のｓｉＮＡおよび他の薬剤が投与されることを意味する。例えば各治療剤は、同時にまたは、任意の順序で異なる時点で連続的に投与できる；しかし同時に投与されない場合、それらは望ましい治療効果をもたらすように十分に近い時間で投与すべきである。各治療剤は、別々に、任意の適切な形態で、任意の好適な経路で投与されてよい。
投薬
本明細書において使用される「有効量」は、ＩＯＰの増大に関連する眼の障害を処置または管理するために十分な本発明のｓｉＮＡの量、好ましくはＩＯＰを減少させるために十分な量を指す。ヒトにおけるＩＯＰの増大の処置のために、ＩＯＰが約１４から２０ｍｍＨｇの間であるようにＩＯＰを低減することは好ましい。しかし、本発明の化合物が単独で送達される、または別の好適な治療との組合せであるかにかかわらず、処置前のＩＯＰと比較したＩＯＰにおけるいかなる低減も有利である（例えば、本発明は処置前のＩＯＰの約５％、約１０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約５０％または約６０％より大きいＩＯＰの減少を期待する）。いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、処置前のＩＯＰの約１％から約９９％の間、約５％から約９０％の間、約１０％から約８０％の間、約２０％から約５０％の間または約２５％から約４５％の間であるＩＯＰの減少を生じることができる。好ましくはＩＯＰにおける減少は、約２５％から約３０％の間である。治療有効量は、ＩＯＰに関連する眼の障害の発症を遅延または最小化するために十分なｓｉＮＡの量も指す場合がある。治療有効量は、ＩＯＰの上昇に関連する眼の障害の処置または管理において治療的利益を提供する治療剤の量も指す場合がある。さらに本発明のｓｉＮＡに関して治療有効量は、ＩＯＰの増大に関連する眼の障害の処置または管理において治療的利益を提供する治療剤単独での、または他の治療との組合せでの量を意味する。本発明のｓｉＲＮＡの量と関係して使用される用語は、治療全体を改善する、望ましくない作用を低減もしくは回避する、または別の治療剤の治療有効性を増強するまたは相乗効果を与える量を包含できる。ｓｉＮＡ単独でのまたは組合せでの処置は、約１４から２０ｍｍＨｇのＩＯＰを生じるべきである。しかし処置前のＩＯＰと比較したＩＯＰにおけるいかなる減少も有利である（例えば、処置前のＩＯＰの５％、１０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％または６０％より大きいＩＯＰの減少）。
本明細書において使用される「有効量」は、ＩＯＰの増大に関連する眼の障害を処置または管理するために十分な本発明のｓｉＮＡの量、好ましくはＩＯＰを減少させるために十分な量を指す。ヒトにおけるＩＯＰの増大の処置のために、ＩＯＰが約１４から２０ｍｍＨｇの間であるようにＩＯＰを低減することは好ましい。しかし、本発明の化合物が単独で送達される、または別の好適な治療との組合せであるかにかかわらず、処置前のＩＯＰと比較したＩＯＰにおけるいかなる低減も有利である（例えば、本発明は処置前のＩＯＰの約５％、約１０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約５０％または約６０％より大きいＩＯＰの減少を期待する）。いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、処置前のＩＯＰの約１％から約９９％の間、約５％から約９０％の間、約１０％から約８０％の間、約２０％から約５０％の間または約２５％から約４５％の間であるＩＯＰの減少を生じることができる。好ましくはＩＯＰにおける減少は、約２５％から約３０％の間である。治療有効量は、ＩＯＰに関連する眼の障害の発症を遅延または最小化するために十分なｓｉＮＡの量も指す場合がある。治療有効量は、ＩＯＰの上昇に関連する眼の障害の処置または管理において治療的利益を提供する治療剤の量も指す場合がある。さらに本発明のｓｉＮＡに関して治療有効量は、ＩＯＰの増大に関連する眼の障害の処置または管理において治療的利益を提供する治療剤単独での、または他の治療との組合せでの量を意味する。本発明のｓｉＲＮＡの量と関係して使用される用語は、治療全体を改善する、望ましくない作用を低減もしくは回避する、または別の治療剤の治療有効性を増強するまたは相乗効果を与える量を包含できる。ｓｉＮＡ単独でのまたは組合せでの処置は、約１４から２０ｍｍＨｇのＩＯＰを生じるべきである。しかし処置前のＩＯＰと比較したＩＯＰにおけるいかなる減少も有利である（例えば、処置前のＩＯＰの５％、１０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％または６０％より大きいＩＯＰの減少）。
ＩＯＰの増大に関連する眼の障害の処置または管理における治療的利益は、処置によって誘導されるＩＯＰの持続的な減少である。減少がより持続的になるほど、次の投与時期が来るときにＩＯＰにおける突発的な増大が生じにくくなる。これは、治療有効性の顕著な増強と考えられる。いくつかの実施形態では、ｓｉＮＡ単独または組合せでの処置は、約２日間から約７日間の間、約２から約６日間の間および約２日間から約４日間の間の持続的なＩＯＰの減少を生じることができる。いくつかの好ましい実施形態では、減少は、約２日間から約３日間の間、好ましくは３日間持続される。
結果的に、いくつかの実施形態では、発明の化合物の投与は、処置スケジュールで患者のコンプライアンスが低下している場合に次回投与が来るときのＩＯＰにおけるリブート効果によって生じる視神経への損傷を予防する、それから保護するまたは低減する。
本発明の組成物の有効量および処置レジメンは、標準的研究技術によって決定できる。例えば障害の処置、予防または管理において有効である組成物の投薬量は、例えば本明細書に開示の動物モデル、例えばニュージーランド白ウサギモデルまたは当業者に周知のものなどの動物モデルに組成物を投与することによって決定できる。付加的にｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、最適な投薬量範囲の同定を補助するために場合により用いられてもよい。代替的に投薬量は、有効レベルに達するまで用量を滴定することによって個体について決定されてもよい。
投薬において使用される好ましい有効量の選択は、当業者に周知のいくつかの要因を考慮することに基づいて当業者によって（例えば臨床試験を介して）決定できる。そのような要因は、処置または予防される障害、関連する症状、患者の体重、患者の免疫状態および投与される医薬組成物の適切さを反映する当業者によって周知の他の要因を含む。
製剤中に用いられる正確な用量は、投与の経路および障害の重症度にも依存し、開業医の判断および各患者の状況に応じて判断されるべきである。
ｓｉＲＮＡが眼に直接投与される場合、一般に片眼に１日あたり約０．０１ｍｇから約１００ｍｇの間、片眼に１日あたり約０．０４ｍｇから約８０ｍｇの間、片眼に１日あたり約０．０４ｍｇから約２０ｍｇの間、片眼に１日あたり約０．０８ｍｇから約１０ｍｇの間、片眼に１日あたり約０．０８ｍｇから約１．２ｍｇの間、片眼に１日あたり約０．３から約０．９ｍｇの間、または片眼に１日あたり約０．０８ｍｇから約０．９ｍｇの間の量のｓｉＮＡが１日あたり投与される。好ましい実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡは、片眼に１日あたり約０．０８ｍｇから約０．９ｍｇの間、および片眼に１日あたり約０．３ｍｇから約０．９ｍｇの間、および片眼に１日あたり約０．３ｍｇから約０．６ｍｇの間、最も好ましくは片眼に１日あたり約０．６ｍｇから約０．９ｍｇの間の量で投与される。好ましい実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡはＰＢＳなどの生理食塩水溶液中に製剤される。具体的な好ましい実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡはＳＹＬ０４００１２であり、上に規定の用量で投与される。いくつかの好ましい実施形態では、これらの用量は、１日１回、１日２回、１日３回または１日４回で投与される場合があり、各眼への適用は毎日、１日おき、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回、１週間おき、または１カ月に１回行われる。いくつかの実施形態では、上記の用量は、毎日同じ時刻にまたは毎日異なる時刻に投与されてよい。緑内障などのＩＯＰの増大によって特徴付けられる病態が事実上長期的であることを考慮すると、本発明の好ましい実施形態では、本発明のｓｉＮＡの投与も長期的である。本発明の代替的実施形態では、患者のＩＯＰにおける増大が一時的である場合、本発明の組成物は状態が続く間投与されることになる。
製剤および投与の経路
本発明のｓｉＮＡは、当技術分野において周知の任意の従来の技術によって医薬組成物に製剤することができる（例えば、Ａｌｆｏｎｓｏ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．、１９９５：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ、第１９版を参照されたい）。本発明の方法における使用のための１つまたは複数のｓｉＮＡを含む製剤は、多数の形態であってよく、各患者に特異的な種々の要因（例えば、患者の障害の種類および重症度、ｓｉＮＡ投与の種類、年齢、体重、反応および過去の病歴）、製剤中のｓｉＮＡの数および種類、組成物の形態（例えば、液体、半液体または固形）、治療レジメ（例えば治療剤が１日１回、１日数回もしくは数日ごとに１回経時的に投与されるかどうか、および／または投与の経路）に依存する場合がある。
本発明のｓｉＮＡは、当技術分野において周知の任意の従来の技術によって医薬組成物に製剤することができる（例えば、Ａｌｆｏｎｓｏ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．、１９９５：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ、第１９版を参照されたい）。本発明の方法における使用のための１つまたは複数のｓｉＮＡを含む製剤は、多数の形態であってよく、各患者に特異的な種々の要因（例えば、患者の障害の種類および重症度、ｓｉＮＡ投与の種類、年齢、体重、反応および過去の病歴）、製剤中のｓｉＮＡの数および種類、組成物の形態（例えば、液体、半液体または固形）、治療レジメ（例えば治療剤が１日１回、１日数回もしくは数日ごとに１回経時的に投与されるかどうか、および／または投与の経路）に依存する場合がある。
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、点眼剤の形態で投与され、眼に直接送達される。点眼剤は、１滴あたり容量約１０μｌから約１００μｌの間、より好ましくは１滴あたり容量約２０μｌから約５０μｌの間、最も好ましくは１滴あたり容量約３０μｌから約３３μｌの間で送達されてよい。追加的な好ましい実施形態では、点眼剤は、容量約４０μｌで送達される。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、ＰＢＳなどの許容される溶液中にＳＹＬ０４００１２を含む。いくつかの好ましい実施形態では、ＳＹＬ０４００１２は、約７．５ｍｇ／ｍｌから約２２．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１５ｍｇ／ｍｌから２２．５ｍｇ／ｍｌの間の濃度、点眼剤中で１日１回投与される。
これらの組成物は、水性および非水性溶液、懸濁液、乳液、マイクロ乳剤、水性および非水性ゲル、クリーム、錠剤、丸剤、カプセル、粉剤、徐放性製剤などの形態をとってよい。本発明のｓｉＮＡは、送達剤（これだけに限らないが、リポソーム、ミクロスフェア、微粒子、ナノスフェア、ナノ粒子、生分解性ポリマー、ハイドロゲル、シクロデキストリン、乳酸グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ）ａｃｉｄ）（ＰＬＧＡ）を含む）中に封入、またはポリエチレンイミンおよびその誘導体（ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）またはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−トリＧＡＬ）誘導体など）と複合体化されてもよい。本発明の好ましい組成物は、水性溶液であり、特に好ましいのは、約７．０から約７．４のｐＨ範囲、好ましくは７．２±０．５のｐＨを有するＰＢＳなどの生理食塩水溶液である。
医薬用担体、ビヒクル、賦形剤または希釈剤は、本発明の組成物に含まれてよく、これだけに限らないが、水、生理食塩水、好ましくは緩衝生理食塩水、油（例えば、石油、動物性、植物性または合成油）、デンプン、グルコース、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、イネ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、エタノール、バイオポリマー（例えばカーボポール、ヒアルロン酸、ポリアクリル酸など）、ブドウ糖、透過促進剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコールおよびアミノ酸）ならびに親水性ポリマー（例えばポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）などを含む。必要に応じて組成物は、少量の湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝液剤も含有してよい。
好適な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドもしくはリポソームなどの合成脂肪酸エステルを含む。場合により懸濁剤は、好適な安定化剤、もしくは高濃度溶液の調製を可能にするために化合物の溶解度を増大させる薬剤も含む場合がある。
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、溶液、好ましくはＰＢＳなどの緩衝生理食塩水に、または眼への局所投与のためのゲルに、例えば点眼剤の形態などで製剤される。そのような実施形態では、製剤は陽イオン性乳液であってよく、かつ／またはこれだけに限らないが乳酸グリコール酸共重合体、カーボポール、ヒアルロン酸およびポリアクリル酸を含むバイオポリマーを含有する場合もある。
具体的な好ましい実施形態では、本発明の組成物は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの溶液中に製剤され、場合により１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤およびまたは塩化ベンザルコニウムなどの賦形剤も含む場合もあり、点眼剤の形態で好ましくは約３０から約３３μｌの間で角膜表面への点眼を可能にする。そのような好ましい実施形態では、投与される用量は、片眼に１日あたり約０．６ｍｇから約０．９ｍｇの間であり、好ましくは１日１回投与される。
本発明のｓｉＮＡは、ＩＯＰを減少させる他の治療用化合物（例えば、市販で入手できる薬物）との組合せでも製剤できる。
キット
本発明のｓｉＮＡ化合物は、所定の容量の液滴でｓｉＮＡ化合物の特定の投薬量を分注するための開口部を有する分注器を含むキットで提供されてもよい。好ましい実施形態では、本発明のｓｉＮＡ化合物は、配列番号１に対して標的化されたｓｉＮＡである。さらに好ましい実施形態では、本発明のキット内の分注器は、ＳＹＬ０４００１２を含む組成物を提供する。別の実施形態では、キットは、例えば１カ月間の使用のための一群の使い捨て分注器を含んでよく、この具体的な場合では、容器は、３０個の使い捨て分注器を含有する。液滴は容量約５０μｌから約１００μｌの範囲であってよい。分注器は、使い捨て分注器であってよく、約１ｍｇから約２ｍｇの間の本発明のｓｉＮＡ化合物、および場合により１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤および場合により１つまたは複数の賦形剤を含む。分注器中に含有される組成物は、約１５ｍｇ／ｍｌから約２２．５ｍｇ／ｍｌの間の濃度の本発明のｓｉＮＡ化合物を含んでよい。代替的に分注器は、１カ月以上の使用のために設計されてよく、含有される容量は用量の同等数を提供するために増大する。本発明のキットは、１滴の液滴で約０．６ｍｇから約０．９ｍｇの間の投薬量のｓｉＮＡ化合物が各眼に適用されることを明記する説明書も含んでよい。説明書は、液滴が各眼に１日１回、１日２回、１日３回または１日４回適用され、各眼への適用が毎日、１日おき、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回、１週間おきまたは１カ月に１回行われることをさらに明記してよい。
本発明のｓｉＮＡ化合物は、所定の容量の液滴でｓｉＮＡ化合物の特定の投薬量を分注するための開口部を有する分注器を含むキットで提供されてもよい。好ましい実施形態では、本発明のｓｉＮＡ化合物は、配列番号１に対して標的化されたｓｉＮＡである。さらに好ましい実施形態では、本発明のキット内の分注器は、ＳＹＬ０４００１２を含む組成物を提供する。別の実施形態では、キットは、例えば１カ月間の使用のための一群の使い捨て分注器を含んでよく、この具体的な場合では、容器は、３０個の使い捨て分注器を含有する。液滴は容量約５０μｌから約１００μｌの範囲であってよい。分注器は、使い捨て分注器であってよく、約１ｍｇから約２ｍｇの間の本発明のｓｉＮＡ化合物、および場合により１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤および場合により１つまたは複数の賦形剤を含む。分注器中に含有される組成物は、約１５ｍｇ／ｍｌから約２２．５ｍｇ／ｍｌの間の濃度の本発明のｓｉＮＡ化合物を含んでよい。代替的に分注器は、１カ月以上の使用のために設計されてよく、含有される容量は用量の同等数を提供するために増大する。本発明のキットは、１滴の液滴で約０．６ｍｇから約０．９ｍｇの間の投薬量のｓｉＮＡ化合物が各眼に適用されることを明記する説明書も含んでよい。説明書は、液滴が各眼に１日１回、１日２回、１日３回または１日４回適用され、各眼への適用が毎日、１日おき、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回、１週間おきまたは１カ月に１回行われることをさらに明記してよい。
本明細書に引用するすべての発表された論文、書籍、参照マニュアルおよび抄録の内容は、本発明が属する分野の状況をさらに十分に記載するために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の範囲および精神から逸脱することなく種々の変更が上に記載の主題に作製できることから、上の記載に含まれるまたは添付の特許請求の範囲に定義されるすべての主題は、本発明の説明および例示であるとして解釈されることが意図される。上記教示を考慮すると本発明の改変および変更が可能である。
（実施例１）
ＳＹＬ０４００１２のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析
細胞培養および形質移入
ＢｘＰＣ３およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）から得て、培養培地（１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＢｘＰＣ３細胞）および１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）中で加湿したインキュベーターにおいて、５％ ＣＯ２／９５％空気の雰囲気下、３７℃で維持した。形質移入のために細胞をＢｘＰＣ３株について細胞１０６，０００個／ｃｍ２およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１株について細胞２００，０００個／ｃｍ２の密度で播種した。細胞培養がおよそ９０％コンフルエンスに達したときに、細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｓｌｅｙ、ＵＫ）を用いて１００ｎＭ ＳＹＬ０４００１２で形質移入した。形質移入効率は形質移入２４時間後の対照培養物において細胞内に存在するＢｌｏｃｋ−ｉｔ−Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｓｌｅｙ、ＵＫ）の量を定量することによって推定した。
ＳＹＬ０４００１２のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析
細胞培養および形質移入
ＢｘＰＣ３およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）から得て、培養培地（１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＢｘＰＣ３細胞）および１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）中で加湿したインキュベーターにおいて、５％ ＣＯ２／９５％空気の雰囲気下、３７℃で維持した。形質移入のために細胞をＢｘＰＣ３株について細胞１０６，０００個／ｃｍ２およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１株について細胞２００，０００個／ｃｍ２の密度で播種した。細胞培養がおよそ９０％コンフルエンスに達したときに、細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｓｌｅｙ、ＵＫ）を用いて１００ｎＭ ＳＹＬ０４００１２で形質移入した。形質移入効率は形質移入２４時間後の対照培養物において細胞内に存在するＢｌｏｃｋ−ｉｔ−Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｓｌｅｙ、ＵＫ）の量を定量することによって推定した。
ＲＮＡ単離およびｑＲｅａｌ Ｔｉｍｅ−ＰＣＲ
総ＲＮＡを細胞培養物または組織からＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して単離した。総ＲＮＡ ４μｇをＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を製造元の説明書に従って使用して逆転写した（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）。
総ＲＮＡを細胞培養物または組織からＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して単離した。総ＲＮＡ ４μｇをＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を製造元の説明書に従って使用して逆転写した（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）。
リアルタイムＰＣＲをＳｔｅｐｏｎｅ ｐｌｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。各試料５００ナノグラムをＴａｑＭａｎ ２Ｘ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘで次の条件下で増幅した：９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を４０サイクル。すべてのリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲ増幅は３回反復で実施し、５回の独立した実験で反復し、常に逆転写対照および鋳型不含有対照を含めた。
ＡＤＲＢ２ ｍＲＮＡレベルを、１００ｎＭ ＳＹＬ０４００１２での形質移入後のさまざまな時点（２４、４８および７２時間）で上に記載のプロトコールに従ってｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＡＤＲＢ２遺伝子の定量データを、ウサギ細胞および組織におけるＨＰＲＴ１発現ならびに陽性増幅対照として使用するヒト細胞におけるＧＡＰＤＨ発現に対して標準化した。
細胞生存率アッセイ
細胞生存率をＭＴＴ方法によって評価し、形質移入後のさまざまな時点（２４、４８および７２時間）でＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＢｘＰＣ３においてＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造元の説明書に従って使用してアッセイした。
細胞生存率をＭＴＴ方法によって評価し、形質移入後のさまざまな時点（２４、４８および７２時間）でＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＢｘＰＣ３においてＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造元の説明書に従って使用してアッセイした。
ＳＹＬ０４００１２の有効性、特異性および安全性のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析
ＡＤＲＢ２ ｍＲＮＡレベルを１００ｎＭ ＳＹＬ０４００１２またはスクランブルｓｉＲＮＡのいずれかでＢｘＰＣ３またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１の細胞培養物を形質移入した後のさまざまな時点（２４、４８および７２時間）でｑＰＣＲによって分析した。ＡＤＲＢ２の基底ｍＲＮＡレベルの５０〜７０％の間で変動する低減が時点に依存して観察された（図１Ａ）。両細胞株において、ＳＹＬ０４００１２の最大効果が形質移入２４時間後に観察され、この時点でＡＤＲＢ２ ｍＲＮＡの低減は、基底レベルのおよそ５０％であった。ＢｘＰＣ３細胞では基底ＡＤＲＢ２レベルは、形質移入後およそ７２時間で回復した一方で、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞ではこの時点のｍＲＮＡレベルは基底ライン未満のままであった。スクランブルＲＮＡ配列の形質移入は、ＡＤＲＢ２レベルを調節せず、ＳＹＬ０４００１２の効果が特異的であったことを実証している。
ＡＤＲＢ２ ｍＲＮＡレベルを１００ｎＭ ＳＹＬ０４００１２またはスクランブルｓｉＲＮＡのいずれかでＢｘＰＣ３またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１の細胞培養物を形質移入した後のさまざまな時点（２４、４８および７２時間）でｑＰＣＲによって分析した。ＡＤＲＢ２の基底ｍＲＮＡレベルの５０〜７０％の間で変動する低減が時点に依存して観察された（図１Ａ）。両細胞株において、ＳＹＬ０４００１２の最大効果が形質移入２４時間後に観察され、この時点でＡＤＲＢ２ ｍＲＮＡの低減は、基底レベルのおよそ５０％であった。ＢｘＰＣ３細胞では基底ＡＤＲＢ２レベルは、形質移入後およそ７２時間で回復した一方で、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞ではこの時点のｍＲＮＡレベルは基底ライン未満のままであった。スクランブルＲＮＡ配列の形質移入は、ＡＤＲＢ２レベルを調節せず、ＳＹＬ０４００１２の効果が特異的であったことを実証している。
ＡＤＲＢ２レベルにおける低減が細胞生存率に影響を有するかどうかを評価するために、ＭＴＴアッセイを上の記載と同じ時点で実施した。ＳＹＬ０４００１２は、経時的な細胞生存率にいかなる顕著な効果も生じなかった（表１）。この結果は、ＳＹＬ０４００１２への応答におけるＡＤＲＢ２ ｍＲＮＡ低減が細胞毒性を生じないことを示唆する。
表1:100nM SYL040012、100nMのスクランブル配列またはPBSのいずれかでの処置後のMDA-MB-231およびBxPC3細胞における細胞生存率。細胞生存率はMTTアッセイを使用して100nM SYL040012、同じ用量のスクランブル配列siRNAまたはビヒクルでの処置後24、42および72時間で分析した。データは3回の独立した実験の平均±s.e.mを表す。
ＲＮＡｉに基づく化合物は、内在性ＲＮＡｉ機構の活性に依存する。ＲＮＡｉの隠れた危険の１つは、大量の外来性ＲＮＡ分子が加えられた場合に内在性の系が飽和する場合があることである（非引用文献２２）。さまざまな用量のＳＹＬ０４００１２の効果を評価する目的で、ＢｘＰＣ３細胞を漸増する用量のＳＹＬ０４００１２（０．００１から１００ｎＭ）で形質移入した。総ＲＮＡを形質移入２４時間後に単離し、ＡＤＲＢ２ ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによって決定した（図１Ｂ）。０．５ｎＭ用量でＡＤＲＢ２レベルにおける統計的に有意な低減を観察した。最大効果は、１０ｎＭ用量への応答において見られた。濃度１０と１００ｎＭとの間に有意差は観察されなかった。これらのデータを使用して、阻害濃度５０（ＩＣ５０）値は９．２ｎＭであると算出された。
その標的に対する化合物の特異性は、臨床設定での副作用の低減において極めて重大である。本発明者らは、アドレナリンファミリーの受容体でのＳＹＬ０４００１２の効果をＡＤＲＢ２に構造的に関連するタンパク質のｍＲＮＡへの効果を分析するために分析した。アドレナリン受容体ＡＤＲＢ２、ＡＤＲＢ１およびＡＤＲＡ１ＢのｍＲＮＡレベルをＳＹＬ０４００１２での処置後にＢｘＰＣ３細胞で評価した。図１Ｃは、ＳＹＬ０４００１２がＡＤＲＢ１またはＡＤＲＡ１ＢのｍＲＮＡレベルに顕著な影響を与えることなくＡＤＲＢ２レベルｍＲＮＡを選択的に減少させることができたことを示す。
その標的に対する化合物の特異性は、臨床設定での副作用の低減において極めて重大である。本発明者らは、アドレナリンファミリーの受容体でのＳＹＬ０４００１２の効果をＡＤＲＢ２に構造的に関連するタンパク質のｍＲＮＡへの効果を分析するために分析した。アドレナリン受容体ＡＤＲＢ２、ＡＤＲＢ１およびＡＤＲＡ１ＢのｍＲＮＡレベルをＳＹＬ０４００１２での処置後にＢｘＰＣ３細胞で評価した。図１Ｃは、ＳＹＬ０４００１２がＡＤＲＢ１またはＡＤＲＡ１ＢのｍＲＮＡレベルに顕著な影響を与えることなくＡＤＲＢ２レベルｍＲＮＡを選択的に減少させることができたことを示す。
（実施例２）
安定性研究
方法
ウサギ血清およびウサギ眼房水中でのＳＹＬ０４００１２の安定性を２つの方法によって評価した：ハイブリダイズしていない一本鎖から二本鎖ＲＮＡを分離することによって二重鎖ＲＮＡの量を測定する未変性ＨＰＬＣ法、および二重鎖中の両方の一本鎖の純度を評価し、一本鎖の安定性を評価するために潜在的な分解化合物を検出する変性ＩＥＸ−ＨＰＬＣ法。外観、ｐＨおよびＵＶ測定などの追加的検査はＥｕｒｏｐｅａｎ ａｎｄ ＵＳ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｓの最新版に従って行った。
安定性研究
方法
ウサギ血清およびウサギ眼房水中でのＳＹＬ０４００１２の安定性を２つの方法によって評価した：ハイブリダイズしていない一本鎖から二本鎖ＲＮＡを分離することによって二重鎖ＲＮＡの量を測定する未変性ＨＰＬＣ法、および二重鎖中の両方の一本鎖の純度を評価し、一本鎖の安定性を評価するために潜在的な分解化合物を検出する変性ＩＥＸ−ＨＰＬＣ法。外観、ｐＨおよびＵＶ測定などの追加的検査はＥｕｒｏｐｅａｎ ａｎｄ ＵＳ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｓの最新版に従って行った。
ＳＹＬ０４００１２の安定性
ＲＮＡ化合物はＲＮＡｓｅによって非常に容易に分解される、このため化合物の安定性をそのビヒクル（ＰＢＳ）中、ウサギ血清中およびウサギ眼房水中で評価した。
ＲＮＡ化合物はＲＮＡｓｅによって非常に容易に分解される、このため化合物の安定性をそのビヒクル（ＰＢＳ）中、ウサギ血清中およびウサギ眼房水中で評価した。
ＳＹＬ０４００１２薬物生成物の２４時間まで、３７℃、ウサギ血清およびウサギ眼房水中でのインキュベーションでの安定性研究の結果を図２に示す。これらの結果は、ＳＹＬ０４００１２半減期がウサギ眼房水では２４時間を超える一方で、ウサギ血清中での半減期は３０分間未満であることを実証する。
（実施例３）
ＧＦＰマウスの眼におけるｓｉＲＮＡ生体内分布
方法
およそ８週のＣ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＡＣＴｂＥＧＦＰ）成体オスウサギを研究に使用した。マウスはグループで飼育し１２時間明／暗サイクル、餌および水の自由摂取で、調節された室温で維持した。
ＧＦＰマウスの眼におけるｓｉＲＮＡ生体内分布
方法
およそ８週のＣ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＡＣＴｂＥＧＦＰ）成体オスウサギを研究に使用した。マウスはグループで飼育し１２時間明／暗サイクル、餌および水の自由摂取で、調節された室温で維持した。
６〜８週齢ｅＧＦＰ遺伝子導入マウスの眼を１１．２ｎｍｏｌ／日の用量のｅＧＦＰ−ｓｉＲＮＡで３日連続の期間にわたって処置した。このモデルは、文献３４において詳しく記載されており、蛍光によって容易に検出されるｅＧＦＰタンパク質を豊富に発現する。使用したＲＮＡｉ標的配列は次のとおり：ＥＧＦＰ ５’−ＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣ−３’。最後の適用の４８時間後、動物を屠殺し、両眼を回収し、蛍光顕微鏡のために処理した。
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子導入マウスでのｓｉＲＮＡ生体内分布
いかなる干渉研究においても重要な最初のステップは、ｉｎ ｖｉｖｏでのｓｉＲＮＡ送達の条件を最適化することである。標的集団において表現型の変化または機能の喪失を検出する能力は、ｓｉＲＮＡが標的組織に送達される効率に依存する。
いかなる干渉研究においても重要な最初のステップは、ｉｎ ｖｉｖｏでのｓｉＲＮＡ送達の条件を最適化することである。標的集団において表現型の変化または機能の喪失を検出する能力は、ｓｉＲＮＡが標的組織に送達される効率に依存する。
ｓｉＲＮＡが角膜を通過し、眼の前房に到達できるかどうかを調査するために、緑色蛍光タンパク質特異的ｓｉＲＮＡをｅＧＦＰ遺伝子導入マウスにおいてアッセイした。ｅＧＦＰに特異的に設計されたｓｉＲＮＡの適用は、未処置マウスと比較して毛様体突起および線維柱帯網において蛍光を減少させた（図３）。この結果は、ｓｉＲＮＡが一方では眼の前房に到達でき、他方ではそこで毛様体突起の細胞によって取り込まれ、標的遺伝子の発現を低減できることを示唆している。
（実施例４）
ｉｎ ｖｉｖｏ有効性
動物
およそ１０週の成体オスニュージーランド白ウサギ（ＮＺＷ）（Ｇｒａｎｊａ Ｓａｎ Ｂｅｒｎａｒｄｏ、Ｓｐａｉｎ ａｎｄ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をすべての実験について使用した。動物を個別に標準的ケージで調節された室温において、１２時間明／暗サイクル、餌および水の自由摂取で飼育した。動物を各研究の開始前１週間から終了まで基礎眼科検査に供した。次のパラメーターを観察した：眼瞼過敏／炎症、涙産生、瞳孔サイズ、角膜外観および結膜過敏／炎症。
ｉｎ ｖｉｖｏ有効性
動物
およそ１０週の成体オスニュージーランド白ウサギ（ＮＺＷ）（Ｇｒａｎｊａ Ｓａｎ Ｂｅｒｎａｒｄｏ、Ｓｐａｉｎ ａｎｄ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をすべての実験について使用した。動物を個別に標準的ケージで調節された室温において、１２時間明／暗サイクル、餌および水の自由摂取で飼育した。動物を各研究の開始前１週間から終了まで基礎眼科検査に供した。次のパラメーターを観察した：眼瞼過敏／炎症、涙産生、瞳孔サイズ、角膜外観および結膜過敏／炎症。
すべての動物はｔｈｅ ＡＲＶＯ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈに従って扱った。
ＩＯＰ測定
ＩＯＰを動物の不快感を回避するためのＣｏｌｉｒｃｕｓｉ（登録商標）ａｎｅｓｔｅｓｉｃｏ（０．４％テトラカイン＋０．４％オキシブプロカイン、Ａｌｃｏｎ）の角膜への局所適用後にｔｈｅ Ａｐｐｌａｎａｔｉｏｎ Ｔｏｎｏｍｅｔｅｒ ＴＯＮＯ−ＰＥＮ ＡＶＩＡ（商標）を使用して測定した。すべての測定は、３回反復によって実施し、平均結果を示す。
ＩＯＰを動物の不快感を回避するためのＣｏｌｉｒｃｕｓｉ（登録商標）ａｎｅｓｔｅｓｉｃｏ（０．４％テトラカイン＋０．４％オキシブプロカイン、Ａｌｃｏｎ）の角膜への局所適用後にｔｈｅ Ａｐｐｌａｎａｔｉｏｎ Ｔｏｎｏｍｅｔｅｒ ＴＯＮＯ−ＰＥＮ ＡＶＩＡ（商標）を使用して測定した。すべての測定は、３回反復によって実施し、平均結果を示す。
経口水負荷高血圧モデル
各研究の開始４日前に５回のＩＯＰ測定を測定間隔２時間で記録した。次いで動物をＩＯＰ値に応じて無作為化して動物を実験群に割り当てた。化合物をＰＢＳ中に２０ｎｍｏｌのｓｉＮＡを含有している片眼あたり４０μＬの投与容量で１日１回４日間にわたって眼に滴下注入した。ＰＢＳを陰性対照として使用した。投与の最初の３日間では基底ＩＯＰ測定は、検査品またはビヒクルの投与より前に記録した。ＩＯＰは２時間間隔で投与後に４回測定した。
各研究の開始４日前に５回のＩＯＰ測定を測定間隔２時間で記録した。次いで動物をＩＯＰ値に応じて無作為化して動物を実験群に割り当てた。化合物をＰＢＳ中に２０ｎｍｏｌのｓｉＮＡを含有している片眼あたり４０μＬの投与容量で１日１回４日間にわたって眼に滴下注入した。ＰＢＳを陰性対照として使用した。投与の最初の３日間では基底ＩＯＰ測定は、検査品またはビヒクルの投与より前に記録した。ＩＯＰは２時間間隔で投与後に４回測定した。
研究４日目に、基底ＩＯＰ測定を投与前ならびに投与後１および２時間で記録した。この時点で高血圧を一晩絶食した動物での経口水負荷（６０ｍＬ／ｋｇ）の手段によって誘導した。その後ＩＯＰを測定間隔２５分で合計１０回測定した。最後の測定後、動物をペントバルビタールの過剰投与によって安楽死させ、主な眼球構造を回収し、ＲＮＡｌａｔｅｒ中に処理まで保存した。
ＳＹＬ０４００１２のｉｎ ｖｉｖｏ有効性
ＳＹＬ０４００１２のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を実証するための最初のステップとして、ニュージーランド白ウサギを、緑内障に対する現在の一次処置である３種の生成物で処置した：Ｔｒｕｓｏｐｔ（ドルゾラミド）、Ｘａｌａｔａｎ（ラタノプロスト）およびＴｉｍｏｆｔｏｌ（チモロール）。化合物それぞれの１滴（４０μＬ）を３個の別々の群のウサギの眼に４日連続の期間にわたって滴下注入した。ＩＯＰ測定値を最後の投与の１時間後に開始して１時間ごとに８時間かけて得た。すべての化合物は化合物に応じて２０〜３５％の間のＩＯＰ低減を生じ、この効果はおよそ６時間持続した（データ未記載）。これらの実験は、ＩＯＰ制御因子に応答するその能力によってこの動物モデルの適合性を確認した。
ＳＹＬ０４００１２のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を実証するための最初のステップとして、ニュージーランド白ウサギを、緑内障に対する現在の一次処置である３種の生成物で処置した：Ｔｒｕｓｏｐｔ（ドルゾラミド）、Ｘａｌａｔａｎ（ラタノプロスト）およびＴｉｍｏｆｔｏｌ（チモロール）。化合物それぞれの１滴（４０μＬ）を３個の別々の群のウサギの眼に４日連続の期間にわたって滴下注入した。ＩＯＰ測定値を最後の投与の１時間後に開始して１時間ごとに８時間かけて得た。すべての化合物は化合物に応じて２０〜３５％の間のＩＯＰ低減を生じ、この効果はおよそ６時間持続した（データ未記載）。これらの実験は、ＩＯＰ制御因子に応答するその能力によってこの動物モデルの適合性を確認した。
ＩＯＰへのＳＹＬ０４００１２の効果を評価するために、ニュージーランド白ウサギに０．３ｍｇ／日のＳＹＬ０４００１２またはＰＢＳのいずれかを１日あたり１回点眼剤４０μｌの形態で４日連続の期間にわたって滴下注入した。図４Ａは、ビヒクルを滴下注入した対照群と比較して２１．８１％±１．５５％のＩＯＰ低減があったことを示す。ＩＯＰへのＳＹＬ０４００１２の効果は、処置の２日後に検出でき、値は最後の適用のおよそ２日後まで基底レベル未満のままであった。効果の特異性を化合物の代わりにスクランブル配列を投与する同じ実験を実施することによって評価した。図４Ｂに示す結果は、スクランブル化ｓｉＲＮＡがＩＯＰに効果を有さず、したがってＳＹＬ０４００１２の効果が特異的であったことを示唆する。
ＳＹＬ０４００１２の効果平均時間を回復の最大半量の時点とＩＯＰでの最大半量効果が達成された時間との間の差異として算出した。これらの算出の結果を表３に示し、ＳＹＬ０４００１２（９１．６時間）対Ｘａｌａｔａｎ（商標）（５．３６時間）およびＴｒｕｓｏｐｔ（商標）（４．７５時間）の効果平均時間における差異を例示する。
経時的なＳＹＬ０４００１２の効果を分析するために、１群のウサギは、３日間の休薬期間によって互いに隔てられた、２セットの０．３ｍｇ／日の用量、１日１回を４回で化合物の適用を受けた。図４Ｃは、１９．２９±０．８９％のＩＯＰ低減があり、このＩＯＰの減少が経時的に維持されたことを示す。ＩＯＰにおける低減は、２回目の適用から最後の適用のおよそ４８時間後まで３日間の休薬期間を含んで観察された。化合物が７２時間の期間まで投与されない場合でもＳＹＬ０４００１２がこの動物モデルにおいてＩＯＰレベルにおける低減を維持できるという事実は、非常に魅力的である。市販薬物が使用される場合ＩＯＰの低減の持続は薬物の継続的な適用に依存する。この後者の特性はＳＹＬ０４００１２が、患者の処置コンプライアンスが低下している場合に、ＩＯＰにおけるリブート効果によって生じる最終的な視神経への損傷を保護できることを示唆する。
（実施例５）
高眼圧症を有する動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ有効性
緑内障において観察される病的状態に近い状態でのＳＹＬ０４００１２のＩＯＰ低下作用を評価するために、ニュージーランド白ウサギでの経口水過負荷モデルを使用した。このモデルは数名の著者によって以前記載されている（非引用文献３５〜３８）。高眼圧症の他の実験モデルを超えるこのモデルの主な有利点は、眼に外傷性である刺激性化合物または技術の投与が回避されていることであり、眼球構造を無処置のままにしている。これは眼が検査薬物に通常通りに応答するようにする（非引用文献３８）。
高眼圧症を有する動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ有効性
緑内障において観察される病的状態に近い状態でのＳＹＬ０４００１２のＩＯＰ低下作用を評価するために、ニュージーランド白ウサギでの経口水過負荷モデルを使用した。このモデルは数名の著者によって以前記載されている（非引用文献３５〜３８）。高眼圧症の他の実験モデルを超えるこのモデルの主な有利点は、眼に外傷性である刺激性化合物または技術の投与が回避されていることであり、眼球構造を無処置のままにしている。これは眼が検査薬物に通常通りに応答するようにする（非引用文献３８）。
最初の実験は、用量範囲認定であり、ＳＹＬ０４００１２の４つの異なる用量（０．１５、０．３、０．６および０．９ｍｇ／眼／日）を合計３回投与した：高血圧誘導の４８、２４および２時間前。すべての処置は両眼に適用され、ＩＯＰを高血圧誘導の前、経口過負荷後２０分間ごとに１２０分間まで、測定した。結果の、反復のある二元配置ＡＮＯＶＡは、時間（ｐ＜０．００１）および処置（ｐ＜０．０００１）の両方で統計的に有意な効果を示したが、これらの要因の間に相互作用は示さなかった。各投与とＰＢＳとの間の差異を、ダネットの事後検査を含む一元配置ＡＮＯＶＡを使用して分析した。図５Ａは、ＳＹＬ０４００１２が検査したすべての用量でＩＯＰの上昇に対して有意な保護を提供することを示している（すべての場合においてｐ＜０．０１対生理食塩水）。最大平均ΔＩＯＰ値（水負荷後ＩＯＰ−水負荷前ＩＯＰ）は、対照動物（ビヒクルで処置）における最大ΔＩＯＰ １５．５５ｍｍＨｇに対して、ＳＹＬ０４００１２で処置した動物において０．１５、０．３０、０．６０および０．９０ｍｇ／日／眼の用量でそれぞれ６．６ｍｍＨｇ、８．２ｍｍＨｇ、４．８ｍｍＨｇおよび４．３ｍｍＨｇであった。
ＩＯＰでのＳＹＬ０４００１２の有効性および特異性を確認するために、より大きな群の動物を０．３ｍｇ／日の固定用量で４日連続の期間にわたって処置した。図５Ｂにおいて見られるとおり、水負荷は、ＰＢＳで処置した動物での高血圧誘導後１時間の内におよそ７ｍｍＨｇのＩＯＰの増大を生じた。結果の、反復測定二元配置ＡＮＯＶＡは、時間および処置の両方に有意な効果を示す（両方の場合にｐ＜０．０００１）が、これらの要因の間に相互作用は示さない。さらなる分析を単一の比較についてのダネットの事後検査を含む一元配置ＡＮＯＶＡによって実施した。この分析の結果はＳＹＬ０４００１２での処置が、ＰＢＳ処置動物と比較して１時間内にΔＩＯＰ値を有意に低減したことを示す（対ＰＢＳ ｐ＜０．０５）。スクランブル配列ｓｉＲＮＡでの処置がＩＯＰに効果を有さなかった（ｐ＞０．０５対ＰＢＳ）ことから、ＳＹＬ０４００１２の効果は特異的であった。
ＩＯＰでの観察された減少が、ＡＤＲＢ２ ｍＲＮＡのレベルの対応する減少の反映であったことをさらに確実にするために、関連組織を分析した。動物を上に記載のとおり処置し、最後のＩＯＰ測定の直後に屠殺し、眼を眼球除去し、角膜、涙腺および毛様体を単離した。総ＲＮＡを抽出し、ＡＤＲＢ２の発現をリアルタイムＰＣＲで上に記載のとおり分析した。図５Ｃに見られるとおり、ＡＤＲＢ２ ｍＲＮＡレベルにおける有意な減少が毛様体および涙腺の両方において観察された。
（実施例６）
ヒトにおけるＳＹＬ０４００１２
対象
２１ｍｍＨｇ未満のＩＯＰ、２０／２５またはより良いスネレン視力を有し、少なくとも１８歳である３０名の健常者が採用された。すべての対象は、プロトコールに従って研究を終了した。対象の人口動態的パラメーターの平均±標準偏差を表１に示す。研究への参加について対象の適合性を確実にするために、総合的な健康診断および眼の試験を研究への受け入れの前に実施した。
ヒトにおけるＳＹＬ０４００１２
対象
２１ｍｍＨｇ未満のＩＯＰ、２０／２５またはより良いスネレン視力を有し、少なくとも１８歳である３０名の健常者が採用された。すべての対象は、プロトコールに従って研究を終了した。対象の人口動態的パラメーターの平均±標準偏差を表１に示す。研究への参加について対象の適合性を確実にするために、総合的な健康診断および眼の試験を研究への受け入れの前に実施した。
研究設計
単一センター、並行、対照、非盲検第Ｉ相臨床試験を点眼剤として投与されたＳＹＬ０４００１２の安全性、忍容性および生物学的利用能を評価するために設計した。研究の追加的目的は、ＩＯＰでのＳＹＬ０４００１２のさまざまな用量の効果を決定することであった。すべての場合において、薬物は無作為に選んだ１つの眼だけに滴下注入し；もう片方の眼は未処置のままとし、眼球耐性および安全性についての対照として使用した。両眼を盲検のやり方でモニターした。
単一センター、並行、対照、非盲検第Ｉ相臨床試験を点眼剤として投与されたＳＹＬ０４００１２の安全性、忍容性および生物学的利用能を評価するために設計した。研究の追加的目的は、ＩＯＰでのＳＹＬ０４００１２のさまざまな用量の効果を決定することであった。すべての場合において、薬物は無作為に選んだ１つの眼だけに滴下注入し；もう片方の眼は未処置のままとし、眼球耐性および安全性についての対照として使用した。両眼を盲検のやり方でモニターした。
処置スケジュール
有害作用の危険を最小にするためおよびｔｈｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ Ｉｄｅｎｔｉｆｙ ａｎｄ Ｍｉｔｉｇａｔｅ Ｒｉｓｋｓ ｆｏｒ Ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−Ｈｕｍａｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｗｉｔｈ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ／ＳＷＰ／２８３６７／０７）に従って、介入相を２つの区間に分けた。区間１は、７２時間観察された１人の対象へのＳＹＬ０４００１２の単一用量の滴下注入で開始した。忍容性を滴下注入２４、４８および７２時間後に評価し；忍容性基準が滴下注入７２時間後に合致した場合、次の対象に投与した。同じ手順を、対象６名が投与されるまで各新規対象に対して続けた。良好な耐性およびそれにより次の志願者を含める可能性は、ｔｈｅ Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ ｖ３．０ ｓｃａｌｅ．１４でのグレード３またはより高い毒性の欠如として定義された。区間２を開始する前に安全性および忍容性を評価した。
有害作用の危険を最小にするためおよびｔｈｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ Ｉｄｅｎｔｉｆｙ ａｎｄ Ｍｉｔｉｇａｔｅ Ｒｉｓｋｓ ｆｏｒ Ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−Ｈｕｍａｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｗｉｔｈ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ／ＳＷＰ／２８３６７／０７）に従って、介入相を２つの区間に分けた。区間１は、７２時間観察された１人の対象へのＳＹＬ０４００１２の単一用量の滴下注入で開始した。忍容性を滴下注入２４、４８および７２時間後に評価し；忍容性基準が滴下注入７２時間後に合致した場合、次の対象に投与した。同じ手順を、対象６名が投与されるまで各新規対象に対して続けた。良好な耐性およびそれにより次の志願者を含める可能性は、ｔｈｅ Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ ｖ３．０ ｓｃａｌｅ．１４でのグレード３またはより高い毒性の欠如として定義された。区間２を開始する前に安全性および忍容性を評価した。
区間２の間に、ＳＹＬ０４００１２を７日間連続して毎日滴下注入で投与した。この区間で２つの用量をアッセイし、それぞれを対象１２名に投与した。安全上の理由のため、対象３名の最初の群はＳＹＬ０４００１２の低容量（６００μｇ）を受けた；以前記載された忍容性基準が合致した場合に、この用量に割り当てられた残りの対象に投与した。同じ手順を高用量（９００μｇ）についても実施した。
すべての対象は、プロトコールコンプライアンスを保証した病院の臨床試験において処置した。表２はフローチャート図を示す。
すべての対象は、プロトコールコンプライアンスを保証した病院の臨床試験において処置した。表２はフローチャート図を示す。
ＩＯＰ測定
区間１の間に、滴下注入１、２、４、４８、および７２時間後にＧｏｌｄｍａｎｎ眼圧測定を使用して座位の対象でＩＯＰを測定した。区間２の間に、最初の滴下注入前（スクリーニング）および４日間の処置後にＩＯＰ曲線を決定した。両方の場合においてＩＯＰを９：００、１２：００、１５：００、１８：００および２１：００に測定した。ＩＯＰは、区間１および２の間に眼球耐性を測定するたび、滴下注入前後１時間にも測定した。ＩＯＰ曲線の外で実施された測定は９：００から１２：００の間の午前中に入れた。
区間１の間に、滴下注入１、２、４、４８、および７２時間後にＧｏｌｄｍａｎｎ眼圧測定を使用して座位の対象でＩＯＰを測定した。区間２の間に、最初の滴下注入前（スクリーニング）および４日間の処置後にＩＯＰ曲線を決定した。両方の場合においてＩＯＰを９：００、１２：００、１５：００、１８：００および２１：００に測定した。ＩＯＰは、区間１および２の間に眼球耐性を測定するたび、滴下注入前後１時間にも測定した。ＩＯＰ曲線の外で実施された測定は９：００から１２：００の間の午前中に入れた。
統計解析
ＳＹＬ０４００１２処置後の眼球および結膜の局所耐性を、区間１について滴下注入７２時間後および区間２の間の最後の滴下注入２４時間後に眼球有害作用の発生率および頻度を分析することによって評価した。（投与された対投与されていない）眼の間をカイ二乗検定を使用して比較した。１回滴下注入後の１日１回のＩＯＰ値の分析を、ＳＹＬ０４００１２滴下注入後に得られた値とスクリーニング時の基底値とを比較することによって実施した。統計的有意性を対応のあるスチューデントのｔ検定によって評価した。区間２の間のＩＯＰへのＳＹＬ０４００１２の効果を４日目に得られたＩＯＰ曲線をスクリーニング時に得られたものと比較することによって評価した。統計的有意性を処置と時刻とを変数とし、ＩＯＰを反復測定値として使用して反復測定二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって評価し、各時点での有意性を評価するためのボンフェローニ事後検定が続いた。他のパラメーター（臨床分析、視力、症状持続時間）を対応のあるスチューデントのｔ検定またはウィルコクソン検定を、これらそれぞれの統計的検定を使用するために必要な条件のコンプライアンスに応じて使用して分析した。Ｐ＜０．０５を有意とした。
ＳＹＬ０４００１２処置後の眼球および結膜の局所耐性を、区間１について滴下注入７２時間後および区間２の間の最後の滴下注入２４時間後に眼球有害作用の発生率および頻度を分析することによって評価した。（投与された対投与されていない）眼の間をカイ二乗検定を使用して比較した。１回滴下注入後の１日１回のＩＯＰ値の分析を、ＳＹＬ０４００１２滴下注入後に得られた値とスクリーニング時の基底値とを比較することによって実施した。統計的有意性を対応のあるスチューデントのｔ検定によって評価した。区間２の間のＩＯＰへのＳＹＬ０４００１２の効果を４日目に得られたＩＯＰ曲線をスクリーニング時に得られたものと比較することによって評価した。統計的有意性を処置と時刻とを変数とし、ＩＯＰを反復測定値として使用して反復測定二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって評価し、各時点での有意性を評価するためのボンフェローニ事後検定が続いた。他のパラメーター（臨床分析、視力、症状持続時間）を対応のあるスチューデントのｔ検定またはウィルコクソン検定を、これらそれぞれの統計的検定を使用するために必要な条件のコンプライアンスに応じて使用して分析した。Ｐ＜０．０５を有意とした。
結果：ＩＯＰへのＳＹＬ０４００１２の効果
スクリーニング時に得られた値とＳＹＬ０４００１２の単回滴下注入に続いて得られたものとの間にＩＯＰにおける統計的有意差は見られなかった。区間２の間に、７日間にわたる反復投与スケジュールでのＳＹＬ０４００１２の投与は、使用した用量に関わらず健康な対象２４名のうち１５名においてＩＯＰ値を低減させた。ＳＹＬ０４００１２の６００μｇ用量は、４日間の投与後に全般的に統計的に有意なＩＯＰの減少を生じた；事後データ分析は、１５：００に得られた測定値へのＳＹＬ０４００１２の有意な効果を示した（図６Ａ）。この用量を受けた５名の志願者は、スクリーニング時の値と比較して４日目に２０％を超えるＩＯＰ値の平均低減を示した。本発明者らは、このサブグループにおいて個別分析を実施し、ＩＯＰへの全般的に統計的に有意な効果を見出した；事後分析は研究したすべての時点で差異が統計的に有意であったことを明らかにした（図６Ｂ）。これら５名の対象における基底ＩＯＰ値が他の対象における基底ＩＯＰ値より高いことは注目に値する（それぞれ１６．２±２．９ｍｍＨｇ対１４．９±２．８ｍｍＨｇ）。高いＩＯＰ値を伴うこの応答の増大は、他の抗緑内障薬物についても報告されている（非特許文献３９）。
スクリーニング時に得られた値とＳＹＬ０４００１２の単回滴下注入に続いて得られたものとの間にＩＯＰにおける統計的有意差は見られなかった。区間２の間に、７日間にわたる反復投与スケジュールでのＳＹＬ０４００１２の投与は、使用した用量に関わらず健康な対象２４名のうち１５名においてＩＯＰ値を低減させた。ＳＹＬ０４００１２の６００μｇ用量は、４日間の投与後に全般的に統計的に有意なＩＯＰの減少を生じた；事後データ分析は、１５：００に得られた測定値へのＳＹＬ０４００１２の有意な効果を示した（図６Ａ）。この用量を受けた５名の志願者は、スクリーニング時の値と比較して４日目に２０％を超えるＩＯＰ値の平均低減を示した。本発明者らは、このサブグループにおいて個別分析を実施し、ＩＯＰへの全般的に統計的に有意な効果を見出した；事後分析は研究したすべての時点で差異が統計的に有意であったことを明らかにした（図６Ｂ）。これら５名の対象における基底ＩＯＰ値が他の対象における基底ＩＯＰ値より高いことは注目に値する（それぞれ１６．２±２．９ｍｍＨｇ対１４．９±２．８ｍｍＨｇ）。高いＩＯＰ値を伴うこの応答の増大は、他の抗緑内障薬物についても報告されている（非特許文献３９）。
（実施例７）
成人における高眼圧症または開放隅角緑内障の処置：二重盲検、プラセボ対照、複数回投与有効性試験
患者
調査者によって評価された優れたまたは良い全体的健康状態にあり、年齢≧１８歳、両眼に開放隅角緑内障を伴うまたは伴わないＩＯＰの上昇（≧２１ｍｍＨｇ）の既往歴または新たな診断を有する合計８０名の男性および女性対象を採用する。この研究に含まれるためには、両眼において次の判定に正常結果または開放隅角緑内障に典型的な結果を有さなければならない：
− 視野２４−２または同等（２４−２ハンフリー視野ＳＩＴＡ検査、片眼あたり約５分間）
− 光干渉断層撮影（ＯＣＴ）
− スネレン視力表での最高矯正視力≧０．５（２０／４０）、または≦０．３ ｌｏｇＭＡＲ
− シルマー検査（流涙）
− 眼底検査
この試験の主な目的は、眼球表面（角膜および結膜）での忍容性および１４日間の処置の間のＳＹＬ０４００１２の毎日投与後の眼内圧への効果を決定することである。
成人における高眼圧症または開放隅角緑内障の処置：二重盲検、プラセボ対照、複数回投与有効性試験
患者
調査者によって評価された優れたまたは良い全体的健康状態にあり、年齢≧１８歳、両眼に開放隅角緑内障を伴うまたは伴わないＩＯＰの上昇（≧２１ｍｍＨｇ）の既往歴または新たな診断を有する合計８０名の男性および女性対象を採用する。この研究に含まれるためには、両眼において次の判定に正常結果または開放隅角緑内障に典型的な結果を有さなければならない：
− 視野２４−２または同等（２４−２ハンフリー視野ＳＩＴＡ検査、片眼あたり約５分間）
− 光干渉断層撮影（ＯＣＴ）
− スネレン視力表での最高矯正視力≧０．５（２０／４０）、または≦０．３ ｌｏｇＭＡＲ
− シルマー検査（流涙）
− 眼底検査
この試験の主な目的は、眼球表面（角膜および結膜）での忍容性および１４日間の処置の間のＳＹＬ０４００１２の毎日投与後の眼内圧への効果を決定することである。
第二の目的は、各投与後の局所忍容性、全身性忍容性（実験室パラメーター、物理的試験、生命徴候および心電図への効果）、ならびに調査用生成物に関連する可能性がある眼底または視力の変化（ある場合）の評価を含む。
ベースライン期間
調査用生成物の最初の投与３０日前までに、対象は、臨床試験の処置期間に参加するための適格性に登録される。抗緑内障薬物療法が休薬期間を必要とする場合、この期間はさらに長い場合がある。短い休薬期間を必要とする抗緑内障薬物療法の一時的処方は許容される。ベースライン期間の始めに患者が数週間の休薬期間を伴う抗緑内障薬物療法にある場合（参照、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｇｌａｕｃｏｍａ Ｓｏｃｉｅｔｙ、研究フローチャートへの脚注）、調査者は眼が数週間ＩＯＰ−低下薬物療法を受けないことにならないように短い休薬期間を有する別の抗緑内障薬物療法を処方できる。
調査用生成物の最初の投与３０日前までに、対象は、臨床試験の処置期間に参加するための適格性に登録される。抗緑内障薬物療法が休薬期間を必要とする場合、この期間はさらに長い場合がある。短い休薬期間を必要とする抗緑内障薬物療法の一時的処方は許容される。ベースライン期間の始めに患者が数週間の休薬期間を伴う抗緑内障薬物療法にある場合（参照、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｇｌａｕｃｏｍａ Ｓｏｃｉｅｔｙ、研究フローチャートへの脚注）、調査者は眼が数週間ＩＯＰ−低下薬物療法を受けないことにならないように短い休薬期間を有する別の抗緑内障薬物療法を処方できる。
処置期間
８０μｇ ＳＹＬ０４００１２、３００μｇ ＳＹＬ０４００１２、９００μｇ ＳＹＬ０４００１２またはプラセボが１：１：１：１の比で点眼剤中に投与されるように１日目に対象を無作為化した。
８０μｇ ＳＹＬ０４００１２、３００μｇ ＳＹＬ０４００１２、９００μｇ ＳＹＬ０４００１２またはプラセボが１：１：１：１の比で点眼剤中に投与されるように１日目に対象を無作為化した。
対象は、調査用生成物投与および判定のための場所に毎日（公休日および週末を含む）戻る。対象は、調査用生成物の１用量を１日１回両眼に１４日間受ける。
追跡調査来院
最終判定は、最後の調査用生成物投与の４から７日間後（最後の投与の９６時間後［４日間］＋３日間）に行われる追跡調査来院で行われる。
最終判定は、最後の調査用生成物投与の４から７日間後（最後の投与の９６時間後［４日間］＋３日間）に行われる追跡調査来院で行われる。
患者のＩＯＰへのＳＹＬ０４００１２の効果を決定するために、ＩＯＰ測定値の２４時間曲線を処置開始の前日、および１４日目にＧｏｌｄｍａｎｎ眼圧計で得た。時点はＩＯＰ曲線測定値についての古典的時間表（０９：００、１２：００、１５：００および１８：００ならびに翌日の９：００）に合わせた。さらに単回ＩＯＰ測定を１、７および１５日目ならびに最後の投与を受けた４から７日間後に行われる追跡調査来院の際にも実施した。
Claims (27)
- 配列番号３のヌクレオチド配列を含む低分子干渉核酸分子（ｓｉＮＡ）を約０．３ｍｇから約０．９ｍｇの間の用量でそれを必要とする患者の眼の角膜表面に局所投与するステップを含む、眼内圧（ＩＯＰ）の増大によって特徴付けられる眼の障害を処置する方法。
- リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に約０．３ｍｇから０．９ｍｇの間のＳＹＬ０４００１２を含む組成物を、それを必要とする患者の眼の角膜表面に局所投与するステップを含む、眼内圧（ＩＯＰ）の増大によって特徴付けられる眼の障害を処置する方法。
- ｓｉＮＡが１日１回投与される、請求項１に記載の方法。
- ｓｉＮＡが約３０μｌから約４０μｌの間の容量で送達される、請求項１に記載の方法。
- ｓｉＮＡが点眼器で眼に送達される、請求項１に記載の方法。
- ｓｉＮＡの投与前の患者のＩＯＰと比較して患者のＩＯＰが約２５％から約３０％の間で低減する、請求項１に記載の方法。
- ｓｉＮＡがｓｉＮＡの投与後２４時間より長く持続するＩＯＰの持続的な減少をもたらす、請求項１に記載の方法。
- ＩＯＰの減少が少なくとも８時間存在する、請求項１に記載の方法。
- 減少したＩＯＰが少なくとも２日間続く、請求項１に記載の方法。
- ｓｉＮＡが低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１に記載の方法。
- ｓｉＲＮＡが二本鎖（ｄｓＲＮＡ）である、請求項１０に記載の方法。
- ｓｉＲＮＡが低分子ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）である、請求項１０に記載の方法。
- ｓｉＮＡが少なくとも１つの修飾オリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
- ｓｉＮＡがホスホジエステル連結ではない２個のヌクレオチド間の少なくとも１つの連結を含む、請求項１に記載の方法。
- 眼の障害が開放隅角緑内障、閉塞隅角緑内障および先天性緑内障からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
- ｓｉＮＡが４０ヌクレオチド以下である、請求項１に記載の方法。
- ｓｉＮＡがｄｓＲＮＡを作るようにその相補体にハイブリダイズする、請求項１０に記載の方法。
- ｄｓＲＮＡがジヌクレオチド３’オーバーハングを有する、請求項１０に記載の方法。
- ジヌクレオチドオーバーハングがチミジンヌクレオチドから作られている、請求項１８に記載の方法。
- ２つ以上の種類のｓｉＮＡが患者に投与される、請求項１に記載の方法。
- ２つ以上の種類のｓｉＮＡが同じ遺伝子の発現を減少させるまたは阻害する、請求項２０に記載の方法。
- 前記ｓｉＮＡ分子が未修飾である、請求項１に記載の方法。
- 液体形態の医薬投薬量を分注するための分注器であって、前記液体の分量を保持するための容器および所定のサイズの前記液体の液滴を分注するための開口部を含み、前記液体が、配列番号３を含む約０．３ｍｇから約０．９ｍｇの間のｓｉＮＡおよび場合により１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤および場合により１つまたは複数の賦形剤を含む分注器。
- 液体形態の医薬投薬量を分注するための分注器であって、前記液体の分量を保持するための容器および所定のサイズの前記液体の液滴を分注するための開口部を含み、前記液体が、約７．５ｍｇ／ｍｌから約２２．５ｍｇ／ｍｌの間の濃度で、リン酸緩衝生理食塩水を含む溶液中に約０．３ｍｇから約０．９ｍｇの間のＳＹＬ０４００１２を含む分注器。
- （ａ）液体形態の医薬投薬量を分注するための分注器であって、前記液体の分量を保持するための容器および所定のサイズの前記液体の液滴を分注するための開口部を含む分注器と、
（ｂ）１滴の液滴の形態で配列番号１を含む約０．３ｍｇから約０．９ｍｇの間のｓｉＮＡが各眼に適用されることを明記する書面による説明書と
を含むキット。 - （ａ）液体形態の医薬投薬量を分注するための分注器であって、前記液体の分量を保持するための容器および所定のサイズの前記液体の液滴を分注するための開口部を含む分注器と、
（ｂ）１滴の液滴の形態でＰＢＳ中に約７．５ｍｇ／ｍｌから約２２．５ｍｇ／ｍｌの間の最終濃度の約０．３ｍｇから約０．９ｍｇの間のＳＹＬ０４００１２が各眼に適用されることを明記する書面による説明書と
を含むキット。 - 眼内圧（ＩＯＰ）の増大によって特徴付けられる眼の障害の処置のための医薬品の製造における配列番号３のヌクレオチド配列を含む低分子干渉核酸分子（ｓｉＮＡ）の使用であって、前記ｓｉＲＮＡが約０．３ｍｇから約０．９ｍｇの間の用量でそれを必要とする患者の眼の角膜表面に局所投与される使用。
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