KR20150048880A - 눈 컨디션의 치료 및/또는 예방을 위한 조성물 및 방법에 있어서 siRNA 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 19 뉴클레오티드 이중-가닥 RNA 분자를 포함하는, 눈의 IOP를 감소시키는 방법, 조성물 및 투여량에 관한 것이다.
Description
녹내장은, 정상의 생리적 한계 이상 안압 (intra ocular pressure: IOP)의 지속적인 상승으로 유발되는 눈 조직 파열 과정으로 정의된다1. 개방각 녹내장(open angle glaucoma: OAG)에서, 상승된 IOP는 망막 신경절 세포 (retinal ganglion cells)의 손실로 인한 점진적인 시력 신경 장애를 유발하며, 궁극적으로 실명을 이끈다2. 폐쇄각 녹내장(angle closure glaucoma)에서, IOP의 갑작스런 높은 증가는 실명(eye blind)을 만든다. 녹내장은 세계적으로 실명의 2번째 주 원인이며3, 유행이 세계적으로 증가하고 있다4. 녹내장에 있어서 실명은 망막(retina) 및 시신경의 퇴행 과정에 의해 유발되지만, 기능적으로 수양액 (aqueous humor: AH) 분비와 유출(outflow) 사이의 균형 장애와 관련된다. AH는 모양체 (ciliary body: CB)의 세포에 의해 분비되고, 유출은 두 가지 경로 중 하나를 통하여 일어난다: 섬유주 (trabecular meshwork) 경로 및 포도막공막 (uveoscleral) 경로5.
녹내장을 위한 현재 치료는, 녹내장에 의해 유발된 시력-손실을 회복할 수는 없으나, IOP 감소에 집중된다6. IOP를 조절하는 것은 녹내장에서 시신경에 대한 손상을 보호하는 것으로 보여져왔다5,7. IOP 감소를 달성하기 위해 현재 사용되는 5 가지 약물 분류가 있다: α-아드레날린 작용제 (α-adrenergic agonists), β-아드레날린 길항제 (β-adrenergic antagonists), 콜린성 작용제 (cholinergic agonists), 프로스타그란딘 (prostaglandins) 및 탄산무수화 효소 억제제 (carbon anhydrase inhibitors). 이들 약물 중 어느 것으로도 IOP를 감소시키는 것에 효능이 없다면, AH 유출을 증가시키기 위하여 섬유주에 레이저 치료가 적용될 수 있다. 최후의 치료법은 AH 유출을 위한 새로운 경로를 생성하기 위한 외과수술 절차이다8.
녹내장과 연관된 증가된 IOP를 위한 현재 치료는 상대적으로 눈 부작용이 없으나 화합물이 혈류에 도달한다면 조직 부작용이 있을 수 있다9, 10, 11. 프로스타그란딘과 같은, 조직적으로 더 좋은 내성있는 치료가 국부적인 내성 이슈들을 많이 갖는다12. 이러한 사실은, IOP의 적정 레벨을 유지하기 위한 점적물 (instillations)의 필요한 빈도수와 함께, 환자가 치료 준수(treatment compliance)하기 어렵게 만든다13. 치료에 따른 실패는 질병 진행을 허용할 뿐만 아니라, 시신경에 매우 큰 손상을 입힐 수 있는 IOP의 갑작스런 증가를 유발하는 재부팅 효과 (reboot effect)를 가질 수 있다.
프로스타그란딘 및 베타-수용체 차단제(beta-blocker)은 IOP-저감제 (IOP-lowering agents)이다12, 14. 프로스타그란딘은 극단적으로 충분히 IOP를 저감시키고, 조직적으로 안전하지만 몇몇의 눈 관련된 부작용을 가지며15, 예를 들면, 홍채 색의 다크닝, 속눈썹 성장, 눈 주위 색소침착 및 충혈이다. 이러한 약물 분류의 덜 빈번한 눈 부작용은 안구 염증, 낭포 황반 부종 (cystoid macular edema), 및 눈 각막 헤르페스 바이러스 감염의 재활성화이다16. 프로스타그란딘 유사물들은 조기 분만의 잠재적 위험 때문에 임신 중에는 금지된다.
베타수용체 차단제의 국소적인 적용 (Topical application)은, 유출을 증가시키는 것에 의하지 않고 AH 생산을 감소시키는 것에 의하여 IOP를 감소시킨다. 국소적으로 투여된 베타수용체 차단제는, 결막 상피세포, 눈물 채널 (lacrimal channel), 코 점막과 위장관을 통하여 체순환계로 흡수되어 조직적인 부작용을 유발한다17-19. 눈에서, 아드레날린 수용체들은 모양체와 섬유주를 관개하는(irrigate) 혈관에 위치되며, 비록 안구 방수 분비(aqueous humour secretion)에 있어서 이들의 개입이 또한 서술되었지만, 이곳에서 이들의 주요 효과는 혈관 수축이다. 토끼 눈에서의 이전 연구들은, 결막, 각막 및 모양체 프로세스 상피세포 내 β-아드레날린 수용체의 높은 밀도를 보여준다. β-아드레날린 수용체들은 또한 각막 내피세포, 렌즈 상피세포, 맥락막 및 외안근 내에도 존재하였다. β-아드레날린 수용체들의 대부분은 β2-유형에 따른 눈에서 검출되었다20 -23.
RNA 간섭 (RNAi)는, 작고, 특이적으로 디자인되고, 화학적으로 합성된 이중-가닥 RNA 절편이 세포질 내 특이적 메신저 RNA (mRNA) 분해를 조정할 수 있고, 그리하여 선택적으로 특이적 단백질의 합성을 저해할 수 있다는 원리에 기초한 기술이다. 이 기술은, 한정된 단백질들에서 변칙적인 활성을 감소시키거나 및/또는 차단하는 목적으로 새로운 화합물을 개발하기 위한 매우 강력한 도구로 떠오르고 있다24-25. RNA 간섭에 기초한 화합물들은, 어느 타겟 유전자의 발현을 차단하도록 합리적으로 디자인 될 수 있으며, 이는 전형적으로 작은 분자 억제제들(small molecule inhibitors)이 발견될 수 없는 유전자들을 포함한다26. 치료학적으로 RNAi의 성공적인 용도의 예시들은, 인간 세포 내 HIV-1 복제의 저해27 및 알츠하이머 질병의 동물 모델에서의 타우와 아폴리포단백질 전구체 단백질의 녹-다운(knock-down) 28을 포함한다. 비록 RNAi가 겨우 20년 전에 발견되었지만, 이들 화합물의 어느 정도는 이미 진보적인 임상 실험 단계에 있으며, 즉, 노인 황반 변성(age-related macular degeneration) 치료를 위한 RTP801 (Quark Pharmaceuticals, Fremont, PA, phase II), 및 호흡 장애 바이러스(respiratory syncytial virus) 치료를 위한 ALN-RSV01 (Alnylam Pharmaceuticals, Cambridge, MA, phase II) 이다29,30. 침묵당한 단백질 (silenced protein)이 생물학적 활성을 회복하려면 재-합성되어야 하기 때문에, RNA 간섭은 만성적인 컨디션에 매우 흥미로운 접근이다. 따라서, RNA 간섭에 기초한 화합물의 효과는 일반적으로, 종래의 치료법들보다 더 장기적이다24,31.
눈은 상대적으로 분리된 조직 부분이다; 이러한 특징은 siRNA를 기초로 하는 치료의 용도에 몇 가지 이점을 제공한다. 눈에 대한 화합물의 국부적 운반은 조직의 노출을 제한하고 필요로 하는 화합물의 양을 낮춘다. 이러한 점은 유전자의 국부적인 침묵(silencing)을 허용하고, 광범위한 눈 바깥쪽을 침묵시킬 가능성을 낮춘다. 게다가, 면역 시스템은 눈에 제한적인 접근성을 가지므로; 화합물에 대한 면역 반응이 발생할 가능성이 적다32.
WO2006/021817에 기술된 연구에 계속하여, 우리는 siRNA를 발전시켜왔다: 서열번호 2에서 확인되는 것과 같은, SYL040012, 화학적으로 합성되고, 변경되지 않은, 데옥시티미딘의 3' 에서 디뉴클레오티드 돌출부 (overhang)를 갖는 19bp 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 선택적으로 β2-아드레날린 수용체의 합성을 저해할 수 있고, 고안압증 (ocular hypertension), 개방각 녹내장, 및 다른 관련 질환을 갖는 환자 내 증가된 IOP의 치료에 권고된다.
상기 화합물은, 세포 배양에서 타겟의 발현을 억제하는 효능, 및 정상 혈압의 토끼에서와 토끼의 증가된 IOP 모델에서 IOP를 낮추는데 있어서의 효능를 증명해오고 있다.
본 발명은, 3' 에 디뉴클레오티드 데옥시티미딘을 갖는 19 뉴클레오티드 이중-가닥 RNA 분자, SYL040012를 포함하는, 눈의 IOP를 감소시키는 방법, 조성물, 및 투여량에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은, PBS과 같은 생리식염수(saline solution)내 SYL040012 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제(excipients)를 포함하므로, 예를 들면 점안제(eyedrop)로, 이러한 점적물(instillation)을 눈에 허용한다. 본 발명의 투여량은, SYL040012 0.6 mg 과 0.9 mg 사이를 포함하는, 약 30 ㎕와 약 40 ㎕사이의 점안제의 매일 점적물을 포함한다.
본 발명은, 눈의 IOP를 감소시키는 방법, 조성물 및 투여량에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은, 아드레날린 수용체 베타 2(ADRB2) 유전자의 발현을 감소시키는, 짧은 간섭 핵산 분자 (siNA)를 포함하며, 이전에 지시된 바와 같이, 이는 눈의 앞쪽 수방(anterior chamber of the eye) 내 수양액의 생성을 감소시킨다. 본 발명의 조성물은, 녹내장, 감염, 염증, 포도막염 (uveitis) 및 당뇨병성 망막증 (diabetic retinopathy)과 같이, 증가된 IOP를 나타내는 눈 컨디션의 치료를 위한 약물의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은, 유효적인 투여 체제 내에서 본 발명의 하나 이상의 siNA의 유효량을, 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 조성물은, 예를 들면 수양액과 같은 눈 안의 유체(intraocular fluid)의 생산과 관련된 유전자, 아드레날린 수용체 베타 2(ADRB2)의 발현을 감소시키거나 억제하는, 짧은 간섭 핵산 분자 (siNA)를 포함한다. 본 발명은, 타겟 유전자인 ADRB2에 대하여 RNA 간섭 (RNAi)를 매개할 수 있는, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 이중-가닥 RNS (dsRNA), 및 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 분자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 짧은 간섭 핵산 (siNA)의 사용 방법 및 조성물을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 siNA는 dsRNA이다. 본 발명의 siNA는, 비변형되거나 또는 화학적으로 변형될 수 있다.
본 발명의 방법은, 본 발명의 siNA의 유효량을, 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 방법은, 잘라탄 (Xalatan), 트루솝트 (Trusopt) 및 티모프톨 (Timoftol)과 같은 상업적으로 이용 가능한 약물의 투여로부터 기인하는 IOP 감소의 기간과 비교될 때, IOP의 지속적인 감소를 제공한다.
본 발명의 방법은 또한, 상업적으로 이용 가능한 약물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는, IOP를 감소시키는 하나 이상의 치료제와의 조합으로, 본 발명의 하나 이상의 siNA의 투여를 포함한다.
본 발명의 방법은 또한, 눈 표면 상에 점적을 통하여 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. siRNA가 눈에 직접적으로 투여될 때, 일반적으로, 하루에 눈에 (per eye per day) 약 0.01 mg 과 100 mg사이, 하루에 눈에 약 0.04 mg 과 80 mg사이, 하루에 눈에 약 0.04 mg 과 20 mg사이, 하루에 눈에 약 0.08 mg 과 10 mg사이, 하루에 눈에 약 0.08 mg 과 1.2 mg사이, 하루에 눈에 약 0.3 mg 과 0.9 mg사이, 또는 하루에 눈에 약 0.08 mg 과 0.9 mg사이로, 하루에 siNA 가 투여된다.
도 1: 인간 세포 내에서 SYL040012의 생체 밖 효능.
(A) 인간 세포 내 ADRB2 의 시간 경과에 따른 억제: BxPC3 및 MDA-MB-231 세포들은, 스크램블 시퀀스 (scramble sequence) siRNA 100 nM 또는 SYL040012 100 nM 중 어느 하나와 함께 형질감염 되었으며(transfected), RNA는 추출되고, ADRB2의 발현은 형질주입(transfection) 후 다른 시점에서(at different time-points) 분석되었다. (B) BxPC3 세포 내에서 SYL040012 에 대한 ADRB2의 투약-의존적인 억제: BxPC3 세포들은 SYL040012 의 증가하는 투여량과 함께 형질감염 되었으며(transfected), ADRB2의 발현은 형질주입(transfection) 후 48 시간 분석되었다. (C) SYL040012에 대한 아드레날린 패밀리 수용체의 발현. 세포 내 BxPC3 및 MDA-MB-231는, SYL040012 100 nM, 스크램블 시퀀스 또는 매개체(vehicle) 중 어느 하나와 함께 처리하였다. * 는 시점 0에 대하여 통계학적으로 중요한 레벨 p<0.5 를 나타낸다.
도 2: 생물학적 유동체 내 SYL040012의 안정성.
SYL040012의 안정성은, 토끼 혈청 및 토끼 수양액 내에서 평가되었으며, 시간 0에서 PBS 내 SYL040012 수용액 20μM 와 함께 새로이 수득된 두 가지 모두의 생물학적 유체샘플들을 섞어서, 다른 시점에서 본래의-HPLC (native-HPLC)에 의한다(Stability of SYL040012 was assessed in rabbit aqueous humor and rabbit serum by native-HPLC at different time-points by spiking freshly obtained samples of both biological fluids with a 20μM solution of SYL040012 in PBS at time 0). 결과들은 초기 양의 퍼센트로 나타내었다. 데이터는 독립 분석 2의 평균 ± S.D. 를 나타낸다.
도 3: eGFP-siRNA로 처리함에 따른 모양체 내 eGFP 레벨의 감소.
eGEP 트렌스제닉 쥐에 160 ㎍/day 의 투여량으로 처리하였다. 48시간 후, 마지막 투여 동물이 희생되었고, 눈이 적출되고 형광 현미경으로 진행되었다. 왼쪽 칸은 PBS 처리된 동물의 (A), 및 eGFP-siRNA 처리된 동물의 (B), 모양체 노마르스키 현미경 사진 (Nomarski microphotographs)을 보여준다. 중간 칸은 PBS 처리된 동물의 (C), 및 eGFP-siRNA 처리된 동물의 (D), 형광 현미경 사진 (Nomarski microphotographs)을 보여준다. 오른쪽 칸은 노르마르스키 및 형광 현미경 사진의 합성을 보여준다. NPE: 비-색소 상피세포(Non-pigmented epithelium); PE: 색소 상피세포.
도 4: 토끼 내 SYL040012의 생체 내 효능.
(A) SYL040012 의 IOP 낮추는 효과: NZW 토끼들 두 그룹은, 연속하는 4일 동안에 걸쳐 SYL040012 (20 nmol/day) 또는 PBS 중 어느 하나로 처리되었다. IOP는 각각의 투여 후 8시간까지 매 2시간마다 측정되었고, 어떠한 화합물이 주어지지 않고 동일한 스케줄이 5 내지 10일 이어졌다. (B) SYL040012 효과의 특이성: NZW 토끼들의 두 그룹은 100nM스크램블 siRNA 또는 PBS 중 어느 하나로 처리되었다. IOP는 위에 기술된 바와 같이 측정되었다. (C) 장기적인 SYL040012의 IOP 낮추는 효과: 토끼들의 두 그룹은, 3일의 약물-프리 기간으로 각각 분리된 4일의 2 기간에 걸쳐, 20 nmol/day SYL040012 또는 PBS 중 어느 하나로 투여되었다. IOP는 위에 기술된 바와 같이 1 내지 13일로부터 측정되었다. 대표적인 실험들이 보여진다.
도 5: 경구 수분 과적(oral water overloading)에 의해 유발되는 높은 안압의 토끼 모델에서 SYL040012의 효과.
(A) IOP 상 SYL040012의 투여 반응: 동물들은 다음 투여량: 10, 20, 40, 또는 60 nmol/eye/day 중 하나의 SYL040012또는 PBS를 4일의 기간에 걸쳐 투여받았다:. 마지막 투여 120분 후 고안압 (ocular hypertension)은 경구 수분 과적으로 유발되었다. IOP는 마지막 투여와 동시에, 60분 및 경구 수분 과적 직전에, 및 경구 수분 과적 후 측정 사이의 25분-간격을 갖고 총 10번 측정되었다. 데이터는 그룹 당 2마리 동물의 평균 ± s.e.m 를 의미한다. (B) IOP에서 SYL040012의 특이성: 동물들은, 위에 언급한 바와 같은 40nmol/eye/day SYL040012, 스크램블 siRNA 또는 PBS 중 하나를 투여받았다. 경구 수분 과적 및 IOP 측정이 A에서 언급된 바와 같이 수행되었다. 데이터는, SYL040012에 대한 12마리 동물들; PBS에 대한 11마리 동물들 및 스크램블 siRNA에 대한 2마리 동물들의 평균 ± s.e.m 를 나타낸다. (C) 동물들 내에서 ADRB2 레벨의 감소가 측정되었다. 동물들은 B에서 언급된 바와 같이 처리되었고, 마지막 IOP 측정 직후에 이들은 희생되었고, 눈이 적출되고, 각막, 눈물샘(lacrimal gland) 및 모양체가 분리되었다. 총 RNA가 추출되었고, ADRB2의 발현은 실시간 PCR로 분석되었다. 데이터는 그룹 당 3마리 동물의 평균 ± s.e.m을 나타낸다. 통계적 유의도는, 독립 스튜던트 t 테스트 (unpaired Student t tests)를 사용하여, PBS 처리된 대응물 (counterpart)과, 각각 처리된 눈 구조를 비교하여 계산되었고, 다음과 같다: ***p<0.001.
도 6: SYL040012 의 투여 A 및 B 에 대한 IOP 곡선.
A. SYL040012의 투여 A의 반복적인 투여에 대하여, 건강한 대상 12 내 IOP 진전; B. SYL040012의 투여 A에 대하여 20% 이상의 IOP 증가를 보인 대상들의 서브그룹 내 IOP 진전 (n=5); C. SYL040012의 투여 B의 반복적인 투여에 대하여, 건강한 대상 12 내 IOP 진전. 데이터는, A와 C의 대상 12 및 B의 대상 5의 평균 (s.e.m)의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다. 통계적 유의도는, 반복적 측정 투-웨이 ANOVA (Repeated Measures two-way ANOVA)로 계산되었고, 본페로니의 보정 (Bonferroni's corrections)이 뒤이은 쌍별 비교(pairwise comparisons)를 위해 만들어졌으며, 다음과 같다: ***p<0.001; **p<0.01 및 *p<0.05.
도 7: 본 발명의 siNA 분자들. 이 그림은 본 발명에 포함된 siNA 분자를 위한 올리고뉴클레오티드 시퀀스를 보여준다.
(A) 인간 세포 내 ADRB2 의 시간 경과에 따른 억제: BxPC3 및 MDA-MB-231 세포들은, 스크램블 시퀀스 (scramble sequence) siRNA 100 nM 또는 SYL040012 100 nM 중 어느 하나와 함께 형질감염 되었으며(transfected), RNA는 추출되고, ADRB2의 발현은 형질주입(transfection) 후 다른 시점에서(at different time-points) 분석되었다. (B) BxPC3 세포 내에서 SYL040012 에 대한 ADRB2의 투약-의존적인 억제: BxPC3 세포들은 SYL040012 의 증가하는 투여량과 함께 형질감염 되었으며(transfected), ADRB2의 발현은 형질주입(transfection) 후 48 시간 분석되었다. (C) SYL040012에 대한 아드레날린 패밀리 수용체의 발현. 세포 내 BxPC3 및 MDA-MB-231는, SYL040012 100 nM, 스크램블 시퀀스 또는 매개체(vehicle) 중 어느 하나와 함께 처리하였다. * 는 시점 0에 대하여 통계학적으로 중요한 레벨 p<0.5 를 나타낸다.
도 2: 생물학적 유동체 내 SYL040012의 안정성.
SYL040012의 안정성은, 토끼 혈청 및 토끼 수양액 내에서 평가되었으며, 시간 0에서 PBS 내 SYL040012 수용액 20μM 와 함께 새로이 수득된 두 가지 모두의 생물학적 유체샘플들을 섞어서, 다른 시점에서 본래의-HPLC (native-HPLC)에 의한다(Stability of SYL040012 was assessed in rabbit aqueous humor and rabbit serum by native-HPLC at different time-points by spiking freshly obtained samples of both biological fluids with a 20μM solution of SYL040012 in PBS at time 0). 결과들은 초기 양의 퍼센트로 나타내었다. 데이터는 독립 분석 2의 평균 ± S.D. 를 나타낸다.
도 3: eGFP-siRNA로 처리함에 따른 모양체 내 eGFP 레벨의 감소.
eGEP 트렌스제닉 쥐에 160 ㎍/day 의 투여량으로 처리하였다. 48시간 후, 마지막 투여 동물이 희생되었고, 눈이 적출되고 형광 현미경으로 진행되었다. 왼쪽 칸은 PBS 처리된 동물의 (A), 및 eGFP-siRNA 처리된 동물의 (B), 모양체 노마르스키 현미경 사진 (Nomarski microphotographs)을 보여준다. 중간 칸은 PBS 처리된 동물의 (C), 및 eGFP-siRNA 처리된 동물의 (D), 형광 현미경 사진 (Nomarski microphotographs)을 보여준다. 오른쪽 칸은 노르마르스키 및 형광 현미경 사진의 합성을 보여준다. NPE: 비-색소 상피세포(Non-pigmented epithelium); PE: 색소 상피세포.
도 4: 토끼 내 SYL040012의 생체 내 효능.
(A) SYL040012 의 IOP 낮추는 효과: NZW 토끼들 두 그룹은, 연속하는 4일 동안에 걸쳐 SYL040012 (20 nmol/day) 또는 PBS 중 어느 하나로 처리되었다. IOP는 각각의 투여 후 8시간까지 매 2시간마다 측정되었고, 어떠한 화합물이 주어지지 않고 동일한 스케줄이 5 내지 10일 이어졌다. (B) SYL040012 효과의 특이성: NZW 토끼들의 두 그룹은 100nM스크램블 siRNA 또는 PBS 중 어느 하나로 처리되었다. IOP는 위에 기술된 바와 같이 측정되었다. (C) 장기적인 SYL040012의 IOP 낮추는 효과: 토끼들의 두 그룹은, 3일의 약물-프리 기간으로 각각 분리된 4일의 2 기간에 걸쳐, 20 nmol/day SYL040012 또는 PBS 중 어느 하나로 투여되었다. IOP는 위에 기술된 바와 같이 1 내지 13일로부터 측정되었다. 대표적인 실험들이 보여진다.
도 5: 경구 수분 과적(oral water overloading)에 의해 유발되는 높은 안압의 토끼 모델에서 SYL040012의 효과.
(A) IOP 상 SYL040012의 투여 반응: 동물들은 다음 투여량: 10, 20, 40, 또는 60 nmol/eye/day 중 하나의 SYL040012또는 PBS를 4일의 기간에 걸쳐 투여받았다:. 마지막 투여 120분 후 고안압 (ocular hypertension)은 경구 수분 과적으로 유발되었다. IOP는 마지막 투여와 동시에, 60분 및 경구 수분 과적 직전에, 및 경구 수분 과적 후 측정 사이의 25분-간격을 갖고 총 10번 측정되었다. 데이터는 그룹 당 2마리 동물의 평균 ± s.e.m 를 의미한다. (B) IOP에서 SYL040012의 특이성: 동물들은, 위에 언급한 바와 같은 40nmol/eye/day SYL040012, 스크램블 siRNA 또는 PBS 중 하나를 투여받았다. 경구 수분 과적 및 IOP 측정이 A에서 언급된 바와 같이 수행되었다. 데이터는, SYL040012에 대한 12마리 동물들; PBS에 대한 11마리 동물들 및 스크램블 siRNA에 대한 2마리 동물들의 평균 ± s.e.m 를 나타낸다. (C) 동물들 내에서 ADRB2 레벨의 감소가 측정되었다. 동물들은 B에서 언급된 바와 같이 처리되었고, 마지막 IOP 측정 직후에 이들은 희생되었고, 눈이 적출되고, 각막, 눈물샘(lacrimal gland) 및 모양체가 분리되었다. 총 RNA가 추출되었고, ADRB2의 발현은 실시간 PCR로 분석되었다. 데이터는 그룹 당 3마리 동물의 평균 ± s.e.m을 나타낸다. 통계적 유의도는, 독립 스튜던트 t 테스트 (unpaired Student t tests)를 사용하여, PBS 처리된 대응물 (counterpart)과, 각각 처리된 눈 구조를 비교하여 계산되었고, 다음과 같다: ***p<0.001.
도 6: SYL040012 의 투여 A 및 B 에 대한 IOP 곡선.
A. SYL040012의 투여 A의 반복적인 투여에 대하여, 건강한 대상 12 내 IOP 진전; B. SYL040012의 투여 A에 대하여 20% 이상의 IOP 증가를 보인 대상들의 서브그룹 내 IOP 진전 (n=5); C. SYL040012의 투여 B의 반복적인 투여에 대하여, 건강한 대상 12 내 IOP 진전. 데이터는, A와 C의 대상 12 및 B의 대상 5의 평균 (s.e.m)의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다. 통계적 유의도는, 반복적 측정 투-웨이 ANOVA (Repeated Measures two-way ANOVA)로 계산되었고, 본페로니의 보정 (Bonferroni's corrections)이 뒤이은 쌍별 비교(pairwise comparisons)를 위해 만들어졌으며, 다음과 같다: ***p<0.001; **p<0.01 및 *p<0.05.
도 7: 본 발명의 siNA 분자들. 이 그림은 본 발명에 포함된 siNA 분자를 위한 올리고뉴클레오티드 시퀀스를 보여준다.
본 발명은, 눈의 IOP를 감소시키는 방법, 조성물 및 투여량에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은, 아드레날린 수용체 베타 2(ADRB2) 유전자의 발현을 감소시키는, 짧은 간섭 핵산 분자 (siNA)를 포함하며, 이전에 지시된 바와 같이, 이는 눈의 앞쪽 수방(anterior chamber of the eye) 내 수양액의 생성을 감소시킨다. 본 발명의 조성물은, 녹내장과 같이, 증가된 IOP를 나타내는 눈 컨디션의 치료를 위한 약물의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은, 유효적인 투여 체제 내에서 본 발명의 하나 이상의 siNA의 유효량을, 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함한다.
siNAs 의 디자인
본 발명의 siNA는 ADRB2의 발현을 감소시키거나 억제하는 작용을 조절하도록 디자인되므로 IOP에 영향을 준다. 일 실시예에서, 타겟 유전자 발현의 감소 또는 억제는, 눈 안의 유체, 예를 들면 수양액의 생성을 감소시킨다. 현재 타겟 유전자인, ADRB에 대한 유전자은행 접근 번호는 NM_000024 이다.
본원에서 사용된 바와 같은 본 발명의 "siNAs"는, RNA 간섭을 통하여 타겟 mRNA 분할을 조절할 수 있는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 혼동을 피하기 위하여 siRNA 용어가 바람직하며, 이는 이중-가닥 일부의 말단에 단일-가닥 티미딘 돌출부 (overhang)를 포함하는 데옥시리보뉴클레오티드의 경우와 분자 구조 내 변형된 비-정규적인 (non-canonical) 염기들을 포함하는 것이 해당 분야 내 일반적인 관습이다.
예를 들면, siNA 분자가 선택적으로 유전자의 발현을 감소시키거나 또는 억제할 때, 유전자는 본 발명에 따른 siRNA에 의하여 "타겟된다". 본원에서 사용되는 바와 같이, "선택적으로 감소시키거나 또는 억제하는" 구절은, 하나의 유전자 발현을 감소시키고 또한 하나 이상의 유전자 발현을 감소시키는, siNA를 포함한다. siNA 가 하나 이상의 유전자 발현을 감소시키는 경우에, 타겟되는 유전자는, 어느 다른 유전자의 적어도 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 10배, 약 25배, 약 50배, 또는 약 100배만큼 감소된다. 대체적으로(Alternatively), siNA가 유전자 전사에 대하여 엄격한 컨디션 하에서 혼성화(hybridize)할 때, siNA는 유전자를 타겟한다. siNA는 유전자를 타겟하는 능력에 대하여 생체 밖에서 또는 생체 내에서 중 어느 하나에서 테스트될 수 있다.
타겟 유전자의 mRNA 시퀀스의 짧은 파편 (예를 들면 19 내지 40 뉴클레오티드 길이)이 본 발명의 siNA의 시퀀스를 위해 선택된다. 일 실시예에서 siNA는 siRNA이다. 바람직한 실시예에서, 후보 siRNA 분자가 될 타겟 유전자 mRNA로부터 시퀀스 파편을 선택하기 위한 기준은, 1) 본래의 mRNA 분자의 5' 또는 3' 말단으로부터 적어도 50 내지 100 뉴클레오티드인, 타겟 유전자 mRNA로부터의 시퀀스, 2) 30 %와 70 % 사이, 더 바람직하게는 50% 근방인, G/C 함량을 갖는, 타겟 유전자 mRNA로부터의 시퀀스, 3) 반복적인 시퀀스 (예를 들면 AAA, CCC, GGG, UUUU, AAAA, CCCC, GGGG, UUUU)를 함유하지 않는, 타겟 유전자 mRNA로부터의 시퀀스, 4) mRNA 내 이용하기 쉬운, 타겟 유전자 mRNA로부터의 시퀀스, 및 5) 타겟 유전자에 대하여 독특한, 타겟 유전자 mRNA로부터의 시퀀스를 포함한다. 타겟 유전자 mRNA로부터의 시퀀스 파편은, 위에서 확인된 하나 이상의 기준을 충족할 것이다. 타겟 유전자 mRNA의 파편이 위에서 확인된 모든 기준 보다는 적게 충족하는 실시예에서, 본래의 시퀀스는, siRNA가 타겟 유전자 mRNA의 파편보다 더 많은 기준을 따르도록, 달라질 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 siRNA는 60% 미만의 G/C 함량을 갖거나, 및/또는 반복 시퀀스가 결핍되어 있다.
구체적인 일 실시예에서, 타겟 지역에 보완적인 siNA의 일부분은 완벽하게 타겟 지역에 보완적이다. 또 다른 구체적인 일 실시예서, 타겟 지역에 보완적인 siNA의 부분은 타겟 지역에 완벽하게 보완적이지는 않다. 타겟 시퀀스에 대하여 삽입, 결실 및 점 돌연변이를 갖는 siNA 또한 본 발명에 포함된다. 따라서 시퀀스 동일성은 해당 기술분야에 알려진 시퀀스 비교 및 정렬 알고리즘 (Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press 1991, 및 본원에 인용된 참고문헌들을 참고하라) 에 의하여 계산되고, 예를 들면, 디폴트 파라미터를 사용하는 BESTFIT 소프트웨어 프로그램에서(예를 들면, University of Wisconsin Genetic Computing Group) 시행되는 것과 같은 스미스-워터만 알고리즘 (Smith-Waterman algorithm) 에 의해, 뉴클레오티드 시퀀스 사이의 차이점 퍼센트를 계산할 것이다. siNA와 타겟 유전자의 일부분 사이의 시퀀스 동일성 90%, 95% 또는 99% 이상이 바람직하다. 대체적으로(alternatively), siNA와 본래의 RNA 분자 사의의 상보성은, 혼성화 (hybridization)로 기능적으로 정의될 수 있다. 본 발명의 siNA 시퀀스는, 엄격한 컨디션 (예를 들면, 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 12 내지 16시간 동안 50 ℃ 또는 70 ℃에서 혼성화 (hybridization); 이어서 세척) 하에서 타겟 유전자 전사의 일부분과 혼성화 할 수 있다. 본 발명의 siNA 시퀀스는, 또한 타겟 유전자의 발현을 감소시키거나 또는 억제할 수 있는 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다. 유전자 발현에 영향을 주는 siNA의 능력은, 생체 내 또는 생체 밖 중 어느 하나에서 실증적으로 측정될 수 있다.
오직 하나의 유전자를 특이적으로 타겟하는 siNA 외에도, 퇴화한 siNA 시퀀스 (degenerate siNA sequences)는 다수의 유전자의 상동 지역들(homologous regions)을 타겟하는데 사용될 수 있다. WO2005/045037는 그러한 상동의 시퀀스들을 타겟하기 위한 siNA 분자의 디자인을 서술하며, 예를 들면, 추가적인 타겟 시퀀스를 제공할 수 있는, 워블 염기 짝들 (wobble base pairs) 및/또는 부정합(mismatches)과 같은, 비-정규적인(non-canonical) 염기 짝들을 결합하는 것에 의한다. 부정합(mismatches)이 확인되는 일 실시예에서, 비-정규적인 염기 짝들 (예를 들면, 부정합 및/또는 워블 염기들)은 하나 이상의 유전자 시퀀스를 타겟하는 siNA 분자들을 생산하는데 사용될 수 있다. 비-제한적인 실시예에서, UU와 CC 염기 짝들과 같은 비정규적인 염기 짝들은, 시퀀스 상동성을 공유하는 다른 타겟들에 대하여, 시퀀스를 타겟할 수 있는 siNA 분자를 생산하는데 사용된다. 이와 같이, 본 발명의 siNA를 사용하는 하나의 이점은, 단일 siNA가, 상동의 유전자 사이에서 보존되는 뉴클레오티드 시퀀스에 대하여 상보적인 핵산 시퀀스를 포함하도록, 디자인 될 수 있다는 점이다. 이러한 접근에서, 단일 siRNA는, 다른 유전자를 타겟하는 하나 이상의 siNA 분자를 사용하는 대신에, 하나 이상의 유전자의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 siNA 분자는 이중-가닥이다. 일 실시예에서, 이중 가닥 siNA 분자는 블런트-말단 (blunt-ends)을 포함한다. 또 다른 일 실시예에서, 이중 가닥 siNA 분자는 돌출부 뉴클레오티드 (예를 들면, 1 내지 5 뉴클레오티드 돌출부, 바람직하게는 2 뉴클레오티드 돌출부)를 포함한다. 구체적인 실시예에서, 상기 돌출부 뉴클레오티드는 3' 돌출부이다. 또 다른 구체적인 실시예에서, 상기 돌출부 뉴클레오티드는 5' 돌출부이다. 뉴클레오티드의 어느 유성은 돌출부의 일부일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 돌출부 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들은 리보핵산이다. 또 다른 실시예에서, 돌출부 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들은 데옥시리보핵산이다. 바람직한 실시예에서, 돌출부 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들은 티미딘 뉴클레오티드이다. 또 다른 실시예에서, 돌출부 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들은 변형되거나 비-전형적인 (non-classical) 뉴클레오티드들이다. 돌출부 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들은 비-전형적인 인터뉴클레오티드 결합을 가질 수 있다 (예를 들면, 포스포디에스테르 결합 외).
바람직한 실시예에서, 본 발명의 siNA 조성물은, 타겟 서열번호 1로 디자인 된다. 다른 실시예는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로 확인되는 siNA 에 관한 것이다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 바람직한 siNA는 서열번호 2 (SYL040012)이다. 이러한 바람직한 siNA SYL040012, 는, 도 7에서 표현된 바와 같은, 데옥시티미딘 염기를 포함하는 3' 말단에 디뉴클레오티드 돌출부를 갖는 19 nt 길이의 비변형된 이중 가닥 RNA 분자이다.
siNA 의 합성
위에 언급된 방법에 의하여 디자인된 siNAs는 해당 분야에 알려진 어느 방법에 의하여 합성될 수 있다. RNA는, 적절하게 보호된 리보뉴클레오사이트 포스포라미디트 (ribonucleoside phosphoramidites) 및 종래의 DNA/RNA 합성제를 사용하여 바람직하게는 화학적으로 합성된다. 추가적으로, siRNA는 상업적인 RNA 올리고 합성물 공급처로부터 얻어질 수 있으며, Proligo (독일, 함부르크), Dharmacon Research (라파예트, CO, 미국), Glen Research (스텔링, VA, 미국), ChemGenes (애슐랜드, MA, 미국), 및 Cruachem (Glasgow, 영국), Qiagen (독일), Ambion (미국) 및 Invitrogen (스코틀랜드)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 대체적으로 (alternatively), 본 발명의 siNA 분자는, 프로모터의 조절 하에서, 역 상보적인 siNA 시퀀스를 포함하는 벡터를 세포에 형질주입하여 (transfecting) 세포 내에서 발현될 수 있다. 발현되면, siNA는 해당 분야에 알려진 기술을 사용하여 세포로부터 분리될 수 있다.
siRNA가 이중-가닥 RNA (dsRNA)인 실시예에서, 만약 단일-가닥 RNA 분자들이 수득된다면, 어닐링 단계가 필요하다. 간단하게, 100 mM 포타슘 아세테이트, 30 mM HEPES-KOH pH 7.4, 2 mM 마그네슘 아세테이트에, 30 ml의 각 RNA 올리고 50 nM 용액을 섞는다. 그런 다음에 용액은 90 ℃에서 1분, 15초 동안 원심분리, 및 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이트 된다.
siRNA가 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)인 실시예에서; siRNA 분자의 두 가닥은 링커 지역(linker region)으로 연결될 수 있다 (예를 들면, 뉴클레오티드 링커 또는 비-뉴클레오티드 링커).
5.3 siRNA의 화학적 변형
본 발명의 siNA는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 비-포스포디에스테르 결합을 포함할 수 있다. 해당 기술분야에 잘 알려진 화학적 변형들은, siNA의 세포 섭취(cell uptake), 유용성 및/또는 안정성을 증가시킬 수 있다. 통상의 기술자는 RNA 분자로 병합될 수 있는 화학적 변형의 다른 유형들을 알고 있을 것이다 (변형의 유형 개관에 대한, 국제 공개 W0031070744 W02005/045037 또는 WO2008/104978 를 참고하라).
일 실시예에서, 변형들은 개선된 섭취(uptake) 또는 분해에 대한 개선된 저항성을 제공하는데 사용될 수 있다. 이러한 변형들의 실시예는 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 결합 (phosphorothioate internucleotide linkages), 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드 (특히 이중 가닥 siRNA의 센스 가닥), 2'-데옥시-플루오로 리보뉴클레오티드, 2'-데옥시 리보뉴클레오티드, "유니버셜 염기 (universal base)" 뉴클레오티드, 5-C-메틸 뉴클레오티드, 및 역 데옥시 비염기 잔기 병합(inverted deoxyabasic residue incorporation)을 포함한다(일반적으로 GB2406568를 참고하라).
또 다른 실시예에서, 변형들은 siRNA의 안정성을 강화하거나 또는 타겟팅 효율성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 변형들은, siRNA의 상보적인 가닥 2개 사이의 화학적 교차 결합, siRNA 가닥의 3' 또는 5' 말단의 화학적 변형, 당 변형, 뉴클레오베이스(nucleobase) 변형 및/또는 백본 변형, 2'-플루오로 변형된 리보뉴클레오티드 및 2'-데옥시리보뉴클레오티드를 포함한다 (일반적으로 국제 공개 W02004/029212를 참고하라).
또 다른 실시예에서, 변형들은, 상보적인 siNA 가닥 안에서 또는 타겟 mRNA 안에서 상보적인 뉴클레오티드에 대한 친화도를 감소시키거나 또는 증가시키는데 사용될 수 있다 (일반적으로 국제 공개 W02005/044976를 참고하라). 예를 들면, 비변형된 피리미딘 뉴클레오티드는, 2-티오(thio), 5-알키닐, 5-메틸, 또는 5-프로피닐 피리미딘으로 치환될 수 있다. 추가적으로, 비변형된 퓨린은 7-데자(deza), 7-알킬 또는 7-알케닐 퓨린과 치환될 수 있다.
또 다른 실시예에서, siNA가 이중-가닥 siRNA일 때, 3'-말단 뉴클레오티드 돌출부 뉴클레오티드는, 데옥시리보뉴클레오티드로 대체되며, 실시예 Elbashir et al 를 참고하라.
치료적 유용성의 입증
본 발명의 조성물 및 방법은, 인간에 사용하기 전에 바람직한 치료적 활성에 대하여, 바람직하게는 생체 밖에서 (in vitro) 테스트되고, 그런 다음에 생체 내에서 (in vivo) 테스트 된다. 예를 들면, 구체적인 치료적 프로토콜의 투여가 적절한지 아닌지 결정하는데 사용될 수 있는, 생체 밖 (in vitro) 어쎄이는, 후보 siNA가 생체 밖에서 세포 (예를 들면, 토끼 비-색소 모양체 상피 세포 (rabbit non-pigmented cilliary epithelium cells: NPE), 인간 모양체 상피 세포 (OMDC), 또는 인간 태아 신장 세포(HEK293)) 투여되는, 생체 밖 세포 배양 어쎄이를 포함하고, 세포에서 그러한 어쎄이의 효과, 예를 들면 타겟 유전자의 발현을 감소시키거나 또는 억제하는지가 관찰된다.
치료에 사용하기 위한 화합물은, 인간에게 테스트하기 전에, 토끼, 쥐, 생쥐, 닭, 소, 원숭이, 햄스터, 등등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는, 적절한 동물 모델 시스템에서 테스트될 수 있다. 예를 들면, 뉴질랜드 토끼는 IOP 연구하도록 디자인된 실험 플랫폼에서 바람직한 표준이다. 이는 다루기 쉽고, 큰 눈을 갖고 있으며, 인간의 기관 크기와 유사하다. 게다가, IOP 측정을 위한 현재 장비는, 쥐나 생쥐와 같은 작은 눈을 갖는 동물에 사용하기에는 적합하지 않다. 마지막으로, 토끼들은, 국부적인 상업적 저혈압 약물을 사용하여 표준 (또는 선-약물) 값을 40 %로 낮출 수 있는 IOP를 갖는다. 따라서, 토끼 녹내장 모델을 생산할 가능성(예를 들면, 섬유 주대를 인공적으로 막거나, 또는 에피스클레로틱 정맥을 수술적으로 막는 것과 같은)이 있음에도 불구하고, 일반적으로 해당 분야에서 눈 구조가 온전하게 남는 바람직한 모델이다 (Thus, although it is possible to generate rabbit glaucoma models (for example, surgically blocking episclerotic veins or artificially occluding the trabecular meshwork), generally those in the field prefer models in which ocular structures remain intact).
치료적인 방법
본 발명은, 환자(예를 들면 포유류, 특히 인간) 내 증가된 IOP에 관련된 눈 질환을 치료하거나, 예방하거나 또는 관리하는 방법을 포함하며, 본 발명의 하나 이상의 siNAs의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 구체적인 실시예에서, 치료되거나, 예방되거나 또는 관리되는 질환은 녹내장이다. IOP에 관련된 녹내장의 어느 유형도 본 발명의 방법으로 치료될 수 있으며, 개방각 녹내장 (예를 들면, 원발 개방각 녹내장 (Primary Open Angle Glaucoma), 색소 녹내장 (Pigmentary Glaucoma), 및 탈락 녹내장 (Exfoliative Glaucoma), 낮은 장력 녹내장 (Low Tension Glaucoma)), 폐쇄각 녹내장 (Angle Closure Glaucoma) (또한, 폐쇄된 각 녹내장, 좁은 각 녹내장, 동공 차단 녹내장 및 섬모 블록 녹내장으로 임상적으로도 알려진) (예를 들면, 급성 폐쇄각 녹내장, 및 만성 페쇄각 녹내장), 아니리딕 녹내장 (Aniridic Glaucoma), 선천성 녹내장 (Congenital Glaucoma), 청소년 녹내장 (Juvenile Glaucoma), 렌즈-유도된 녹내장 (Lens-Induced Glaucoma), 신생혈관 녹내장 (Neovascular Glaucoma), 후-외상 녹내장 (Post-Traumatic Glaucoma), 스테로이드-유발된 녹내장 (Steroid-Induced Glaucoma), 스터지-웨버 녹내장 (Sturge-Weber Syndrome Glaucoma), 및 포도막염-유발된 녹내장 (Uveitis-Induced Glaucoma)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
특이적 타겟 유전자에 대하여 직접 siRNAs로 치료적 처리하는 것은, 효과가 관찰되는 시간의 길이를 증가시키는 것에 의하여 국소적인 눈의 방울이 작은 분자 이상으로 이롭게 되는 것이 기대되며, 그리하여 투여를 덜 빈번하게 하고 환자를 더 많이 협조하게 한다(Therapeutic treatments with siRNAs directed against specific target genes are expected to be beneficial over small molecule topical ocular drops by increasing the length of time that effect is observed, thereby allowing less frequent dosing and greater patient compliance).
바람직한 실시예에서, 본 발명의 치료 방법에서 사용되는 siNAs는, 아드레날린 수용체 베타 2와 같은, IOP에 영향을 주는 유전자들의 발현을 감소시키거나 또는 억제한다. 본 발명의 더 바람직한 실시예에서, 본 발명의 치료 방법에서 사용되는 siNAs는 서열번호 1로 타겟된다. 구체적인 바람직한 실시예에서, siNA는 21 내지 30 뉴클레오티드 길이이고, 서열번호 3을 포함한다. 어떠한 변형을 갖지 않은 서열번호 2를 갖는 SYL040012가 구체적으로 바람직하며, 즉, 어떠한 비 정규적 염기들이 없고, 양 쪽 3' 말단에 TT 돌출부를 포함하는 것이 바람직하다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 방법은, siNA의 마지막 투여 이후에, 8, 10, 12, 또는 14 시간보다 더 길게, 더 바람직하게는 몇 일 동안 (예를 들면 2일, 3일, 4일 또는 5일) 이어지는, IOP 의 지속적인 감소를 제공한다. 이러한 실시예에서, 본 발명의 투여되는 siNAs 효과는, 현재 상업적으로 이용 가능한 약물 (예를 들면, 잘라탄 (Xalatan), 트루솝트 (Trusopt) 및 티모프톨 (Timoftol))의 투여로부터 전형적으로 기인하는 IOP 감소의 기간에 비하여 더 길게 이어진다. 지속적인 IOP 감소 활성을 제공하는 본 발명의 siNAs 는, 섭생(regimen) 내 투여되어 IOP가 siNA의 매일 투여 없이도 계속적으로 감소된다. 구체적인 실시예에서, 치료 섭생 (regimen)은, IOP의 계속적인 감소를 유발하는 것을 유지하면서, 투여의 연속적인 사이클(예를 들면 4일 동안 매일 siNA의 1회 투여가 주어지는) 및 비-투여 (예를 들면 주어지는 어떠한 치료 없이 3 또는 4일) 를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, siNA의 단일 유형은 본 발명의 치료적인 방법으로 투여된다. 또 다른 일 실시예에서, 본 발명의 siNA는 본 발명의 또 다른 siNA와 함께 및/또는 증가된 IOP에 관련된 눈 질환의 치료, 예방 및 관리에 유용한 하나 이상의 다른 비-siNA 치료제와 혼합으로 투여된다. 용어 "함께 혼합"은 정확하게 동시에 치료제를 투입하는 것에 제한되지 않고, 본 발명의 siNAs와 다른 제제들이 순차적으로 시간 간격을 두고 환자에게 투여되더라도 혼합의 이익이 그렇지 않게 투입된 환자들의 이익보다 더 큰 것을 의미한다. 예를 들면, 각각의 치료제들은 동시에 또는 순차적으로 어느 다른 순서에서 다른 시점에서 제 시간에 투여될 수 있다; 하지만 만약 동시에 투여되지 않는다면, 이들은 바람직한 치료적 효과를 제공하기 위하여 제 시간에서 충분하게 가까운 시간 안에 투여되어야 한다. 각각의 치료제는 별도로, 어느 적절한 형태로, 어느 적절한 경로로 투여될 수 있다.
투여량
본원에 사용된 바와 같은, "유효량 (effective amount)"은, 증가된 IOP와 관련된 눈 질환을 치료하거나 관리하는데 충분한, 본 발명의 siNA의 양을 지칭하며, 바람직하게는, IOP를 감소시키는데 충분한 양을 지칭한다. 인간에서 증가된 IOP의 치료를 위하여, IOP는 약 14 와 20 mmHg 사이이기 때문에, IOP를 감소시키는 것이 바람직하다. 하지만, 본 발명의 화합물이 혼자 운반되든, 또는 다른 적합한 치료제와 혼합으로 운반되든, 처리 전 IOP (pretreatment IOP)와 비교하여 IOP의 어떠한 감소도 유익하다 (예를 들면, 본 발명은, 처리 전 IOP의 약 5%, 약 10%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 50% 또는 약 60% 이상으로 IOP 의 감소를 고려한다). 일부 실시예에서, 본 발명의 화합물은, 처리 전 IOP의 약 1 % 와 약 99 %사이, 약 5 %와 약 90 %사이, 약 10 % 와 약 80 %사이, 약 20 %와 약 50%사이, 또는 약 25%와 약 45%사이인, IOP 의 감소를 유발할 수 있다. 바람직하게는, IOP에 있어서 감소는 약 25% 및 약 30%이다. 치료적인 유효량은 또한, IOP와 관련된 눈 질환의 시작을 지연시키거나 최소화하는데 충분한 siNA의 양을 지칭한다. 치료적인 유효량은 또한, 상승된 IOP와 관련된 눈 질환의 치료 또는 관리에 치료적인 이익을 제공하는 치료제의 유효량을 지칭할 수도 있다. 게다가, 본 발명의 siNA와 관련된 치료적으로 유효한 양은, 단독 치료제의 양이거나 또는, 증가된 IOP에 관련된 눈 질환의 치료나 관리에 치료적 이익을 제공하는 다른 치료법과의 조합의 양을 의미한다. 본 발명의 siRNA의 양과 관련되어 사용된, 상기 용어는 전반적인 치료를 개선시키고, 원하지 않는 효과를 감소시키거나 피하고, 또 다른 치료제와의 상승효과 또는 치료적 효과를 상승시키는 양을 포함할 수 있다. 단독 또는 조합으로 siNA 치료는 결과적으로 약 14 와 20 mmHg의 IOP를 초래한다. 하지만, 치료 전 IOP와 비교하여 IOP의 어떠한 감소도 유익하다 (예를 들면, 처리 전 IOP의 약 5%, 약 10%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 50% 또는 약 60% 이상으로 IOP 의 감소).
증가된 IOP에 관련된 눈 질환의 치료나 관리에 있어서 치료적인 이점은, 치료에 따라 유발되는 IOP의 지속적인 감소이다. 더 지속되는 감소는, 다음 투여가 될 때까지 발생할 IOP의 갑작스런 급격한 증가가 있을 가능성을 적게 한다. 치료적인 효능의 중요한 강화가 고려된다. 일부 실시예에서, 단독 또는 조합으로 siNA 치료는, 결과적으로 약 2 와 약7일 사이, 약 2와 약 6일 사이, 및 약 2와 약 4일 사이에 지속되는 IOP의 감소를 초래할 수 있다. 일부 바람직한 실시예에서, 상기 감소는 약 2일과 약 3일 사이, 바람직하게는 3일 동안, 지속된다.
따라서, 일부 실시예에서 본 발명의 화합물의 투여는, 치료 스케쥴에 환자의 협조가 열악한 경우 다음 투여가 예정될 때, IOP 에서 리부팅 효과(reboot effect)로 유발되는 시신경에 대하여 손상을 결과적으로 예방하고, 보호하고 또는 감소시킨다(Consequently, in some embodiments administration of the compounds of the invention results in preventing, protecting against, or reducing the damage to the optic nerve caused by the reboot effect in IOP when the next dose becomes due in cases of patients' poor compliance with treatment schedules).
본 발명의 화합물의 유효량 및 치료 섭생 (regimen)은, 표준 연구 기법으로 측정될 수 있다. 예를 들면, 질환의 치료, 예방 또는 관리에 있어서 유효적일 화합물의 투여량은, 해당 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려지거나 또는 본원에 개시된 동물 모델, 예를 들면 뉴질랜드 흰색 토끼 모델과 같은, 동물 모델에 화합물을 투여하여 측정될 수 있다. 게다가, 생체 밖 어쎄이는 임의적으로, 최선의 투여량 범위를 확인하는데 도움을 제공할 것이다. 대체적으로 (alternatively), 상기 투여량은 유효 레벨이 도달할 때까지 투여를 적정하여, 개별적으로 결정될 것이다.
투여량에 있어서 사용되고자 하는 바람직한 유효량의 선택은, 해당 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려질 것인 몇 가지 요인들의 고려에 기초하여, 통상의 기술자에 의하여 결정될 수 있다. 그러한 요인들은, 치료되거나 예방될 질환, 관련된 징후들, 환자의 몸무게, 환자의 면역 상태 및 투여되는 약제학적 화합물의 정확도를 반영하기 위한 통상의 기술자에게 알려진 다른 요인들을 포함한다.
제형 내 도입될 정확한 투여는 또한, 투여의 경로 및 질환의 심각성에 의존할 것이고, 각 환자의 상황과 의사의 판단에 따라 결정되어야 한다.
siRNA가 눈에 직접적으로 투여될 때, 일반적으로, 하루에 눈에(per eye per day) 약 0.01 mg 과 100 mg사이, 하루에 눈에 약 0.04 mg 과 80 mg사이, 하루에 눈에 약 0.04 mg 과 20 mg사이, 하루에 눈에 약 0.08 mg 과 10 mg사이, 하루에 눈에 약 0.08 mg 과 1.2 mg사이, 하루에 눈에 약 0.3 mg 과 0.9 mg사이, 또는 하루에 눈에 약 0.09 mg 과 0.9 mg사이로, 하루에 siNA 가 투여된다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 siRNA는, 하루에 눈에 약 0.08 mg 과 0.9 mg사이, 하루에 눈에 약 0.3 mg 과 0.9 mg사이, 및 하루에 눈에 약 0.3 mg 과 0.6 mg사이로 투여되며, 가장 바람직하게는 하루에 눈에 약 0.6 mg 과 0.9 mg사이로 투여된다. 바람직한 실시예에서 본 발명의 siRNA는 PBS와 같은 생리식염수 내에서 제형화된다. 구체적으로 바람직한 실시예에서, 본 발명의 siRNA는 SYL040012이고, 위에 정의된 투여량으로 투여된다. 일부 바람직한 실시예에서, 이들 투여량은 하루에 한번, 하루에 두 번, 하루에 세 번 또는 하루에 네 번 투여될 수 있으며, 각 눈에 적용하는 것은 매일, 하루 걸러, 일주일에 한번, 일주일에 두 번, 일주일에 세 번, 격주로 또는 한 달에 한번, 발생할 수 있다. 일부 실시예에서 상기 투여량은, 각 날짜의 동일한 시간에, 또는 각 날짜의 다른 시간에 투여될 수 있다. 녹내장과 같은, 증가된 IOP로 특징지어지는 병리학은 자연에서 만성적이며, 본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명의 siNAs를 투여하는 것은 또한 만성적이다. 본 발명의 대체적인 실시예에서, 환자들의 IOP 증가가 일시적인 곳에서 본 발명의 조성물은 상기 컨디션이 지속되는 동안 투여될 것이다.
투여의 경로와 제형
본 발명의 siNAs는, 해당 기술 내 알려진 종래의 어느 기술에 의한 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다 (예를 들면, Alfonso, G. et al., 1995, in: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing, Easton PA, 19th ed 를 참고하라). 본 발명의 방법에 있어서, 하나 이상의 siNAs를 포함하는 조성물의 용도는, 수많은 형태일 수 있고, 각각의 환자에 특이적인 다양한 요인 (예를 들면 질환의 심각성과 유형, 투여되는 siNA의 유형, 나이, 몸무게, 반응성, 및 환자의 이전 의학적 기록), 제형의 siNAs 유형과 수, 조성물의 형태 (예를 들면 액상, 반-액상 또는 고상), 치료적 섭생 (regimen) (예를 들면 치료제가 매일 한번 시간 오랫동안 투여되는지, 하루에 여러 번 또는 몇 일 마다 한번인지, 및/또는 투여의 경로)에 의존할 수 있다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 조성물은 점안제 (eye drops) 형태로 눈에 직접적으로 운반되어 투여된다. 점안제는, 방울당 약 10㎕와 약 100㎕ 사이, 더 바람직하게는 방울당 약 20 ㎕와 약 50㎕ 사이, 및 더 바람직하게는 방울당 약 30㎕와 약 33㎕사이의 부피로 운반될 수 있다. 추가적으로 바람직한 실시예에서, 상기 점안제는 약 40 ㎕의 부피로 운반된다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 조성물은, PBS와 같은 허용 가능한 용액 내 SYL040012를 포함한다. 일부 바람직한 실시예에서, SYL040012는, 약 7.5 mg/ml 내지 약 22.5 mg/ml의 농도에서, 바람직하게는 약 15 mg/ml 와 22.5 mg/ml 사이의 농도에서 점안제로 하루에 한번 투여된다.
이러한 조성물은, 수성 및 비수성 수용액, 현탁액, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 수성 및 비수성 젤, 크림, 태블릿, 알약, 캡슐, 분말, 지속적인-방출 제형 및 이와 같은, 형태를 취할 수 있다. 본 발명의 siNAs는 또한 운반 제제 내 캡슐화될 수 있고 (리포좀, 마이크로스피어, 미립자, 나노스피어, 나노입자, 생분해성 폴리머, 하이드로젤, 사이클로덱스트린 폴리 (락틱-코-글리코익) 에시드 (PLGA)를 포함하지만 이에 제한되지 않는), 또는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine) 및 이의 유도체들과 함께 복합될 수 있다 (폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-N-에틸갈락토사민 (PEI-PEG-GAL) 또는 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-트리-N-에틸렌갈락토사민 ((PEI-PEG-triGAL) 유도체들과 같은). 본 발명의 바람직한 조성물은 수성 용액이며, 구체적으로 바람직한 것은, 약 7.0 내지 약 7.4의 pH 범위를 갖는, 바람직하게는 7.2 ± 0.5의 pH를 갖는, PBS와 같은 생리식염수이다.
약제학적 운반체, 담체, 부형제 또는 희석제들이 본 발명의 조성물에 포함될 수 있으며, 물, 생리식염수, 바람직하게는 완충된 생리식염수, 오일 (예를 들면, 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 오일), 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크(chalk), 실리카 젤, 스테아르산 나트륨 (sodium stearate), 글리세롤 모노스테아르산 (glycerol monostearate), 탈크, 염화나트륨, 스킴 밀크 (skimmed milk), 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 에탄올, 바이폴리머 (예를 들면, 카르보폴 (carbopol), 히알루론산, 폴리아크릴산, 등등), 덱스트로스, 투과 촉진제 (permeation enhancers) (예를 들면, 지방산, 지방산 에스테르, 지방 알코올 및 아미노산), 및 친수성 폴리머 (예를 들면, 폴리카르보필 (polycarbophil) 및 폴리비닐피롤리돈) 및 이와 같은 것들,을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
적절한 친지방성 용매 또는 담체는, 참기름과 같은 지방유, 또는 에틸올레이트 또는 트리글리세리드와 같은 합성 지방산에스테르, 또는 리포좀을 포함한다. 임의적으로, 상기 현탁액은 또한, 고 농축된 용액의 제조를 허용하도록 화합물의 용해도를 증가시키는, 적절한 안정제 또는 제제를 함유할 수 있다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 조성물은 용액으로, 바람직하게는 PBS와 같은 완충된 생리식염수로, 또는 예를 들면 점안제 형태와 같은, 눈에 국소적인(topical) 투여를 위한 젤로, 제형화된다. 그러한 실시예에서, 제형은 양이온성 에멀전이거나 또는, 폴리(락티드-코-글리코리드), 카르보폴(carbopol), 히알루론산 및 폴리아크릴산을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 바이폴리머를 함유할 수 있다.
구제적인 바람직한 실시예에서, 본 발명의 조성물은 인산염-완충된 생리식염수 (phosphate-buffered saline: PBS)와 같은 용액으로 제형화되며, 이는 또한 임의적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 희석제 및/또는 벤잘코늄 클로라이드 (benzalkonium chloride)와 같은 부형제를 포함할 수 있으며, 이는 바람직하게는 약 30과 약 33 ㎕사이의 점안제 형태로 각막 표면에 눈의 점적물을 허용할 것이다. 상기 바람직한 실시예에서, 투여되는 투여량은, 하루에 눈에 약 0.6 mg과 약 0.9 mg사이이고, 바람직하게는 하루에 한 번 투여된다.
본 발명의 siNAs는 또한, IOP를 감소시키는 다른 치료학적 화합물 (예를 들면, 상업적으로 이용 가능한 약물)과의 조합으로 제형화될 수 있다.
키트
본 발명의 siNA 화합물은 또한, 미리 정해진 부피의 작은 방울 내 siNA 화합물의 구체적인 투여량을 조제하기 위하여 구멍을 갖는 디스펜서를 포함하는 키트로 제공될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 siNA 화합물은 서열번호 1에 대하여 타겟되는 siNAs 이다. 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명의 키트 내부의 디스펜서는 SYL040012를 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 실시예에서, 상기 키트는, 예를 들면 한달 동안 사용될 수 있는, 일회용 디스펜서의 집합을 포함할 수 있으며, 이러한 구체적인 경우에는, 30 개의 일회용 디스펜서를 포함할 것이다. 상기 디스펜서는, 일회용 디스펜서일 수 있으며, 본 발명의 siNA 화합물 약 1 mg과 약 2 mg사이를 포함할 수 있고, 또한 임의적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 및 임의적으로 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 디스펜서 내 함유되는 조성물은, 약 15 mg/ml 내지 약 22.5 mg/ml 사이 농도의 본 발명의 siNA 화합물을 포함할 수 있다. 대체적으로 (alternatively), 상기 디스펜서는 한달 또는 그 이상 사용되도록 디자인 될 수 있으며, 포함되는 부피는 투여에 상당하는 수를 제공하는 것에 따라 증가할 것이다. 본 발명의 키트는 또한, 한 방울 내 약 0.6 mg과 약 0.9 mg 사이의 siNA 화합물의 투여량이 각 눈에 적용된다는 것을 구체화하는 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는, 작은 방울들이 하루에 한 번, 하루에 두 번, 하루에 세 번, 또는 하루에 네 번, 각 눈에 적용되고, 각 눈에 적용하는 것은 매일, 하루 걸러, 일주일에 한 번, 일주일에 두 번, 일주일에 세 번, 격주로, 또는 한 달에 한 번, 발생할 수 있다.
본원에 인용된 모든 공개된 논문, 책, 참고 매뉴얼, 및 초록의 내용은, 본 발명이 속한 기술분야를 더 완전하게 서술하도록 전체로서 본원에 참고문헌으로 인용된다.
다양한 변형들이 본 발명의 범위와 사상으로부터 벗어나지 않고 앞서-언급된 내용으로부터 만들어 질 수 있으며, 모든 내용은 앞선 서술에 포함되거나 청구범위를 한정하고, 본 발명의 서술적이고 설명적인 것으로 이해되는 것으로 의도된다. 본 발명의 변형과 다양성이 앞선 교시에 비추어 가능하다.
실시예
실시예 1: SYL040012 의 생체 내 분석
세포 배양 및 형질주입(transfection)
BxPC3 및 MDA-MB-231 세포들은 American Association of Culture Collection (Rockville, MD, USA)로부터 얻어졌고, 배양 배지에 유지되고 (10% FBS 로 보충된 RPMI-1640 배지(BxPC3 세포들)) 및 10% FBS 보충된 DMEM (MDA-MB-231 세포들)), 37 ℃의 5 % CO2 /95 % 공기의 대기 하에서 습기 있는 인큐베이터에서, 유지되었다. 형질주입을 위하여 세포들은, BxPC3 라인을 위해 106.000 cells/cm2의 밀도로, MDA-MB-231 라인을 위해 200.000 cells/cm2의 밀도로 씨드되었다(For transfections cells were seeded at a density of 106.000 cells/cm2 for BxPC3 line and 200.000 cells/cm2 for MDA-MB-231 line). 세포 배양이 대략 90 % 융합 (confluence)에 도달하면, 세포들은 리포펙타민 2000 (Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Pasley, UK))을 이용하여 100 nM SYL040012와 함께 형질주입된다. 형질주입 효율성은, 형질주입 후 24시간에 대조군 배양 내 세포들 내부에 존재하는 블록-잇-알렉사 플루오르 레드 형광 올리고뉴클레오티드 (Block-it-Alexa fluor red fluorescent oligonucleotide (Invitrogen, Pasley, UK)) 양을 정량화하여 측정되었다.
RNA 분리 및 q실시간-PCR
총 RNA는, RNeasy RNA 추출 키트(Invitrogen, CA, USA)를 사용하여 세포 배양 또는 조직으로부터 분리되었다. 총 RNA의 4 ㎍은, 제작자의 설명서에 따라 고-용량 cDNA 알키브 키트 (High-Capacity cDNA Archive kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA))를 사용하여 역전사되었다.
실시간 PCR은 스테폰 플러스 검출 시스템 (Stepone plus detection system (Applied Biosystems))을 사용하여 수행되었다. 각각의 샘플 500 나노그램은 TaqMan 2X Universal Master Mix 에서, 다음 컨디션 하에서 증폭되었다: 95 ℃에서 10분, 이어서 95 ℃ 에서 15초와 60 ℃에서 1분인 40 순환. 모든 실시간 qRT-PCR 증폭은 3배로(in triplicate) 수행되었고, 5개의 독립적인 실험으로 반복되었으며, 언제나 역전사 대조군을 포함하고 주형 대조군은 포함하지 않았다.
ADRB2 mRNA 레벨은, 상기 서술된 프로토콜에 따라 100 nM SYL040012 형질주입 후 (24, 48, 및 72 시간) 서로 다른 시점에서 qRT-PCR에 의하여 분석되었다. ADRB2 유전자의 정량 데이터는, 토끼 세포와 조직 내 HPRT1 발현으로, 및 양성 증폭 대조군으로서 제공된 인간 세포 내 GAPDH 발현으로 정상화되었다.
세포 생존능력 어쎄이
세포 생존능력(viability)은 MTT 방법에 의하여 평가되었고, 제작자의 설명서에 따라 Cell Titer 96 Aqueous Non Radioactive Cell Proliferation Assay kit (Promega, Mannheim, Germany)를 사용하여 MDA-MB-231 및 BxPC3 내 형질주입 후 다른 시점에서 (24, 48 및 72 시간) 어쎄이되었다.
SYL040012의 효능, 특이성 및 안전성의 생체 밖 분석
ADRB2 mRNA 레벨은, 스크램블 siRNA 또는 SYL040012 100 nM 중 어느 하나와 함께 BxPC3 또는 MDA-MB-231의 세포 배양액을 형질주입(transfecting)한 후에 서로 다른 시점 (24, 48 및 72 시간)에 qPCR으로 분석되었다. ADRB2의 기본 mRNA 레벨의 50 내지 70 % 사이로 다양한 감소(reduction)가 관찰되었으며, 시점에 의존하였다 (도 1A). 두 가지 세포 라인 모두에서, SYL040012의 최대 효과는 형질주입 후 24시간에서 관찰되었으며, 이 시점에서 ADRB2 mRNA 감소는 대략 기본 레벨의 50%였다. BxPC3 세포에서 기본 ADRB2 레벨은 형질주입 후 대략 72시간에 회복되었지만, MDA-MB-231 세포에서 이 시점의 mRNA는 여전히 기본 라인 아래에 머물렀다. 스크램블 RNA 시퀀스의 형질주입은, SYL040012가 특이적이라는 효과를 증명하는 ADRB2 레벨을 조절하지 않았다(Transfection of a scramble RNA sequence did not modulate ADRB2 levels demonstrating that effect the SYL040012 was specific).
만약 ADRB2 레벨에서의 감소가 세포 생존력에 영향을 주는지 평가하기 위하여, MTT 어쎄이가 앞서 언급된 동일한 시점에서 수행되었다. SYL040012는 시간이 지나도 세포 생존력에 어떠한 중요한 영향을 유발하지 않았다 (표 1). 이러한 결과는 SYL040012에 관련된 ADRB2 mRNA 감소가 세포 독성을 유발하지 않는 다는 것을 나타낸다.
표 1: 100 nM SYL040012, 스크램블 시퀀스 100 nM, 또는 PBS로 처리하는 것에 따른 MDA-MB-231 및 BxPC3 세포에서의 세포 생존력. 세포 생존력은 MTT 어쎄이를 사용하여 100 nM SYL040012, 동일한 투여량의 스크램블 시퀀스 siRNA 또는 담체로 처리한 후 24, 42, 및 72 시간에 분석되었다. 데이터는 3 가지 독립적인 실험의 평균 ± s.e.m 를 나타낸다.
RNAi에 기초한 화합물은 내인성 RNAi 기작 (endogenous RNAi machinery)의 활성에 의존한다. RNAi의 어려움 중에 하나는, 외인성 RNA 분자의 많은 양이 추가될 때, 이러한 내인성 시스템이 포화될 수 있다는 것이다. SYL040012의 서로 다른 투여량의 효과를 평가할 목적으로, BxPC3 세포들은 SYL040012 투여량을 증가하여 (0.001 내지 100 nM) 형질주입되었다. 총 RNA는 형질주입 후 24 시간에 분리되었고, ADRB2 mRNA 레벨은 실시간 PCR로 측정되었다 (도 1B). ADRB2 레벨에서 통계학적으로 중요한 감소는 0.5 nM 투여량에서 관찰되었다. 최대 효과는 10 nM 투여량에 대하여 나타났다. 어떠한 중요한 다른 점도 10 과 100 nM의 농도 사이에서는 관찰되지 않았다. 이러한 데이터를 사용하여, 억제 농도 50 (inhibitory concentration 50: IC50) 값이 9.2 nM으로 계산되었다.
이의 타겟을 위한 화합물의 특이성은 임상적인 환경 (clinical setting)에 있어서 부작용을 감소시키는 데 결정적이다. ADRB2에 구조적으로 관련된 단백질들의 mRNA상에서의 영향을 분석하기 위하여, 아드레날린 패밀리 (adrenergic family) 수용체 상에서 SYL040012의 영향을 분석하였다. 아드레날린 수용체 ADRB2, ADRB1, 및 ADRA1B의 mRNA 레벨은 SYL040012와의 처리 후 BxPC3 세포에서 평가되었다. 도 1C는, SYL040012가 ADRB1 또는 ADRA1B의 mRNA 레벨에 중대하게 영향을 주지 않고, 선택적으로 ADRB2 레벨 mRNA 을 감소시킬 수 있었다는 것을 보여준다.
실시예 2: 안정성 연구
방법
토끼 혈청 및 토끼 수양액 내 SYL040012의 안정성이 두 가지 방법으로 평가되었다: 이중-가닥 RNA를 비-하이드리드화된 단일-가닥으로부터 분리시켜 이중구조 RNA (duplex RNA)의 양을 측정하기 위한 본래의 HPLC 방법, 및 단일 가닥의 안정성을 측정하기 위하여 잠재적인 분해 화합물을 검출하고 이중구조 내 단일 가닥 둘 모두의 순도를 측정하기 위한 변성 IEX-HPLC 방법 (denaturing IEX-HPLC method). 외형, pH 및 UV 측정과 같은 추가적인 테스트들이 유럽과 US 조제서의 현재 판(current editions)에 따라 이뤄졌다.
SYL040012의 안정성
RNA 화합물은 RNAses에 의하여 매우 쉽게 분해되고, 이러한 이유로 상기 화합물의 안정성이 이의 담체 (PBS) 내에서, 토끼 혈청 내에서, 및 토끼 수양액 내에서, 평가되었다.
토끼 혈청과 토끼 수양액 내에서 37 ℃에서 24 시간 이상 인큐베이션한 SYL040012 약물 생산물의 안정성 연구 결과는, 도 2에 나타내었다. 이러한 결과는 SYL040012 반감기가 토끼 혈청 내에서 30분 미만인 것에 반하여, 토끼 수양액 내에서는 24시간 이상이라는 점을 증명한다.
실시예 3: GFP 쥐의 눈에서 siRNA 생물학적 분배(biodistribution)
방법
대략 8주된 어른 수컷 토끼 C57BL/6-Tg (ACTbEGFP)가 연구에 사용되었다. 쥐들이 그룹으로 수용되고, 조절된-온도 방에서 12시간 빛/어둠 순환으로, 음식과 물에 대한 자유로운 접근이 유지되었다.
6내지 8주 된 eGFP 형질전환 쥐 (transgenic mice)의 눈은 연속하는 3일 기간에 걸쳐 11.2 nmol/day 투여량의 eGFP-siRNA으로 처리되었다. 이러한 모델은 문헌에 광범위하게 기술되어 있으며, eGFP 단백질을 풍부하게 표현하고, 이러한 것은 형광물질에 의하여 쉽게 검출된다. 사용된 RNAi 타겟 시퀀스는 다음과 같다: EGFP 5'-GGCTACGTCCAGGAGCGCACC-3'. 마지막 적용 이후 48 시간에, 동물들은 희생되고, 두 눈 모두 수집되어 형광 현미경을 위해 처리되었다.
녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein: GFP) 형질전환 쥐에서 siRNA 생물학적 분배
어느 간섭 연구에서 중요한 첫 번째 단계는, 생체 내 siRNA 운반의 컨디션을 최적화하는 것이다. 타겟 개체군 내에서 기능의 상실 또는 표현형의 변형을 검출하는 능력은, siRNA가 타겟 조직으로 운반되는 효율성에 의존한다.
siRNAs가 각막을 통하여 통과하거나 눈의 앞쪽 수방 (anterior chamber)에 접근하는지 조사하기 위하여, 녹색 형광 단백질 특이적 siRNA가 eGFP 형질전환 쥐에서 어쎄이 되었다. eGFP에 특이적으로 디자인된 siRNA의 적용은, 처리되지 않은 쥐에 비교할 때, 모양체 돌기 (ciliary processes) 및 섬유 주대 (trabecular meshwork) 내 형광을 감소시켰다(도 3). 이러한 결과는, 한편으로는 siRNA가 눈의 앞쪽 수방에 접근할 수 있고, 다른 한편으로는, 그곳에서, 모양체 돌기의 세포에 의해 올려지고 타겟 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.
실시예 4: 생체 내 효율성
동물들
대략 10주 된 어른 수컷 뉴질랜드 흰색 토끼(Adult male New Zealand White Rabbits (NZW) (Granja San Bernardo, Spain and Charles River Laboratories))가 모든 실험에 사용되었다. 동물들은, 조절된-온도 방에서 12시간 빛/어둠 순환으로 음식과 물에 대한 자유로운 접근으로, 표준 우리 내 개별적으로 수용되었다. 동물들은 각각의 연구의 끝과 시작 전 한 주 동안 기본적인 눈 검사를 받았다. 다음 파라미터들이 관찰되었다: 눈꺼풀 자극/염증, 눈물 생산, 동공 크기, 각막 외형 및 결합된 자극/염증.
모든 동물들은, 안과 및 시력 연구(Ophthalmic and Vision Research)에서의 동물 사용에 대한 ARVO 표준에 따라 다루어졌다.
IOP 관리
IOP는, 동물을 불안하게 하는 것을 피하고자, 각막에 대하여 Colircusㅽㄾ anestㅹsico (0.4% 테트라카인 + 0.4% 옥시부프로카인 (oxibuprocaine), Alcon)의 국소적인 적용 후에 Applanation Tonometer TONO-PEN AVIATM 를 사용하여 측정되었다. 모든 측정은 3번 수행되었고, 평균 결과를 나타내었다.
경구 수분 부하 고압 모델 (Oral water-loading hypertension model)
각각의 연구를 시작하기 4일 전 5 가지 IOP 측정이, 측정 사이에 2시간 간격으로 기록되었다. 동물들은 그때부터, IOP 값에 따라 동물들을 임의 추출하여 실험군으로 지정되었다. 화합물은, PBS 내 siNA 20 nmol을 함유하는 눈당 40 ㎕의 투여 부피로 4일의 기간에 걸쳐 하루에 한 번 눈에 주입되었다. 투여의 첫 번째 3일 동안 기본적인 IOP 측정이, 담체 투여 또는 아이템을 테스트 하기 전에 기록되었다. IOP는 2시간 간격으로 투여 후에 측정되었다.
연구의 4번째 날에, 기본 IOP 측정이 투여 전, 투여 후 1시간, 및 2시간에 기록되었다. 이러한 시점에, 밤새 단식된 동물들에서 경구 수분-부하 (60 mL/kg)에 의하여 고압 (hypertension)이 유도되었다. 그 후에, IOP는 측정 사이에 25분 간격으로 총 10번 측정되었다. 마지막 측정 이후에, 동물들은 펜토바르비탈 (pentobarbital) 과다투여로 안락사 되었고, 주요한 눈 구조는 수집되어 처리 전까지 RNA later 내에 보관되었다.
SYL040012의 생체 내 효능
SYL040012의 생체 내 효능을 증명하기 위한 첫 번째 단계로 뉴질랜드 흰색 토끼들이, 녹내장에 대하여 현재 가장 중요한 (first-line) 치료인 3 가지 생성물로 처리되었다: 트루솝트 (Trusopt (dorzolamide)), 잘라탄 (Xalatan (latanoprost)) 및 티모프톨 (Timoftol (timolol)). 화합물 각각의 한 방울 (40 ㎕)가 연속하는 4일의 기간에 걸쳐 3 개로 분리된 토끼 그룹의 눈에 주입되었다. IOP 측정은 8시간 동안 매 시간 수득되었으며, 마지막 투여 후 1시간에 시작하였다. 모든 화합물은, 화합물에 따라, 20 내지 35 %의 IOP 감소를 발생시켰으며, 이러한 효과는 대략 6 시간 지속되었다 (데이터에 나타내지 않은). 이러한 실험들은, IOP 조절제에 대한 이의 능력 때문에 이러한 동물 모델의 적합성을 확인해주었다.
IOP 상에서 SYL040012의 효과를 평가하기 위하여, 뉴질랜드 흰색 토끼들은, 하루에 하나의 40 ㎕ 점안제 형태로, 연속하는 4일의 기간에 걸쳐 PBS 또는 SYL040012 0.3 mg/day 중 어느 하나로 주입되었다. 도 4A는, 담체로 주입된 대조군에 비교할 때, IOP의 21.81% ± 1.55% 감소가 있었다는 것을 나타낸다. IOP 에서 SYL040012의 효과는 처리 2 일 후에 검출 가능하였으며, 그 값은 마지막 투여 후 대략 2일 까지 여전히 기본 라인 아래에 머물렀다. 효과의 특이성은, 상기 화합물 대신에 스크램블 시퀀스를 투여하는 동일한 실험을 수행하여 평가되었다. 도 4B에 나타낸 그 결과는 스크램블 siRNA는 IOP에 어떠한 효과를 갖지 않고, 따라서 SYL040012의 효과는 특이적이라는 것을 가리킨다.
SYL040012의 효과 평균 시간은, 회복의 최대 시점의 절반과 IOP 의 최대 효과 절반이 달성되는 시간 사이의 차이로 계산되었다. 이러한 계산의 결과는 표 3에 나타내었으며, Xalatan™ (5.36 시간) 및 Trusopt™ (4.75 시간)에 대한 SYL040012의 효과 평균 시간 (91.6 시간)에서의 차이를 설명한다.
시간이 지남에 따른 SYL040012 효과를 분석하기 위하여, 토끼 그룹은 4 중 2 세트를 하루에 한번 0.3 mg/day의 투여량으로 상기 화합물의 적용을 받았으며, 3 일의 약물 없는 기간으로 각각 분리되었다 (In order to analyze the effect of SYL040012 over time, a group of rabbits received two sets of four once a day applications of the compound at a dose of 0.3 mg/day, separated from each other by a drug free period of three days). 도 4C는, IOP의 19.29 ± 0.89% 감소가 있었고 IOP의 이러한 감소는 시간이 지남에 따라 유지되었다는 것을 나타낸다. IOP의 감소는 마지막 투여 후 대략 48 시간까지 두 번째 적용으로부터 관찰되었으며, 이는 3-일 약물 없는 기간 동안을 포함한다. SYL040012은, 화합물이 72 시간 이상의 기간 동안 투여되지 않을 때 조차, 이러한 동물 모델 내 IOP 레벨 감소를 유지할 수 있다는 사실이 매우 흥미있다. 상업적인 약물이 사용될 때, 유지되는 IOP 의 감소는 약물의 지속적인 적용에 의존한다. 이러한 후자의 특성은, 환자의 협조가 열악한 경우 IOP에서 리부팅 효과로 유발되는 궁극적인 시신경 손상에 대하여 SYL040012가 보호할 수 있다는 점을 암시한다 (This latter feature suggests that SYL040012 can protect against the eventual optic damage caused by a reboot effect in IOP in case of patients' poor compliance with the treatment).
실시예 5: 고안압증 (ocular hypertension)을 갖는 동물 모델에서 생체 내 효능
녹내장에서 관찰되는 병리학적 컨디션에 가까운 컨디션 내에서, SYL040012의 IOP-낮춤 효과를 평가하기 위하여, 뉴질랜드 흰색 토끼들 중에서 경구 수분 과적 (oral water overloading) 모델이 사용되었다. 이러한 모델은 이전에 여러 저자들에 의해 기술된바 있다. 고안압증의 다른 실험적인 모델에 대하여 이러한 모델의 주요한 이점은, 눈에 불쾌한 자극적인 화합물의 투여 또는 기법이 회피된다는 것이고, 이는 눈 구조를 온전하게 남긴다. 이러한 점은 테스트 약물에 대하여 눈이 정상적으로 반응하도록 한다.
첫 번째 실험은, 투여-범위 측정 (dose-range finding)이었으며, 4 가지 다른 투여량의 SYL040012 가 (0.15, 0.3, 0.6 및 0.9 mg/eye/day) 총 3 번 투여되었다: 고압 (hypertension) 유도 전 48, 24, 및 2 시간. 모든 처리는 양 쪽 눈에 적용되었고, IOP는 고압 (hypertension) 유도 전 및 경구 과적 (oral overloading) 후 120 분까지 매 20분 측정되었다. 반복적 측정 투-웨이 ANOVA 분석 (A repeated measures two-way ANOVA analysis) 결과는, 시간 (p<0.001) 과 처리 (p<0.0001) 둘 다의 통계학적 중요한 효과를 보여주지만, 이들 요인들 사이에 어떠한 상호작용은 없었다는 것을 보여준다. 투여량과 PBS 각각의 사이에서 차이점은 두네트의 포스트-혹 테스트 (Dunnett's post-hoc test)와 함께 원-웨이 ANOVA를 사용하여 분석되었다. 도 5A는, SYL04001가 테스트된 모든 투여량에서 IOP의 상승에 대하여 중대한 보호를 제공한다는 것을 보여준다 (모든 경우에서 생리식염수에 대하여 p<0.01 (p < 0.01 vs saline in all cases)). SYL040012로 테스트된 동물들에서 최대 평균 △IOP 값 (수분-부하 후 IOP - 수분-부하 전 IOP)는, 각각의 0.15, 0.30, 0.60 및 0.90 mg/day/eye 투여량에 대하여 6.6 mmHg, 8.2 mmHg, 4.8 mmHg 및 4.3 mm Hg 인 것에 비하여, 대조군 동물에서 최대 △IOP 값 는 15.55 mmHg 였다.
IOP에서 SYL040012의 특이성과 효능을 확인하기 위하여 더 큰 그룹의 동물들이 연속하는 4일의 기간에 걸쳐 고정된 투여량 0.3 mg/day로 처리되었다. 도 5B에서 나타낸 바와 같이, 수분 부하는 PBS로 처리된 동물들에서 고압 (hypertension) 유도 후 처음 한 시간 동안 대략 7 mmHg의 IOP 상승을 유발하였다. 반복적 측정 투-웨이 ANOVA 분석 결과는, 시간과 처리 (두 경우 모두 p<0.0001) 둘 다의 중요한 효과를 보여주지만, 이들 요인들 사이에 어떠한 상호작용은 없었다는 것을 보여준다. 그 밖의 분석은 단일 비교에 대하여 두네트의 포스트-혹 테스트 (Dunnett's post-hoc test)와 함께 원-웨이 ANOVA에 의하여 수행되었다. 이러한 분석의 결과는 SYL040012로 처리하는 것은 PBS 처리된 동물들에 비하여 처음 한 시간 내에 △IOP 값을 현저하게 감소시킨다는 것을 보여준다(p<0.05 vs. PBS). SYL040012의 효과는, 스크램블 시퀀스 siRNA로 처리되는 것이 IOP 상에 어떠한 효과도 갖지 않기 때문에, 특이적이다 (p>0.05 vs. PBS).
IOP 상에서 관찰되는 감소가 ADRB2 mRNA 레벨에서 대응하는 감소의 반영인지 더 확실하게 하기 위해서, 관련 조직이 분석되었다. 위에서 언급된 바와 같이 처리된 동물들은 마지막 IOP 측정 후 즉시 희생되었고, 눈은 적출되고, 각막, 눈물샘 및 모양체는 분리되었다. 총 RNA가 추출되고, ADRB2의 발현은 위에 기술된 바와 같은 실시간 PCR로 분석되었다. 도 5C에서 알 수 있는 바와 같이, ADRB2 mRNA 레벨에서 중요한 감소가 모양체와 눈물샘 둘 다에서 관찰되었다.
실시예 6: 인간 내에서 SYL040012
대상
21 mmHg 미만의 IOP, 20/25이거나 더 좋은 스넬렌 시각적 예리성 (Snellen visual acuity)을 갖고, 적어도 18살인 30 명의 건강한 자원자들이 모집되었다. 모든 대상들은 상기 프로토콜에 따른 연구를 완료하였다. 대상들의 인구학적 파라미터 (demographic parameters)의 평균 ± 표준편차를 표 1에 나타내었다. 포괄적인 신체검사 (physical examination) 및 눈 검사는, 상기 연구에 참가를 위한 대상의 적합성을 확인하기 위하여, 상기 연구로의 허가 전에 수행되었다.
연구 디자인
단일-센터, 평행, 조절된, 오픈-라벨 페이즈 Ⅰ 임상적 연구 (single-center, parallel, controlled, open-label phase I clinical study)가, 점안제로 투여되는 SYL040012의 안정성, 내성 (tolerability) 및 생물학적 이용 가능성을 평가하기 위하여 디자인되었다. 연구의 추가적인 목표는, IOP에서 서로 다른 투여량의 SYL040012의 효과를 측정하는 것이다. 모든 경우에서, 약물은 오직 임의적으로 선택된 한 쪽 눈에 주입되었다; 남은 한쪽 눈은 처리되지 않고, 눈의 내성과 안정성에 대한 대조군으로 제공된다. 양쪽 눈 모두 맹검 방식 (blinded fashion)으로 조사되었다.
처리(치료)
스케쥴
시험용 의약품으로 최초의-인간 임상 실험 (First-in-Human Clinical Trials with Investigational Medicinal Products) (EMEA/CHMP/SWP/28367/07)를 위한 위험을 완화하고 확인하기 위한 전략상의 지침 (the Guidelines on Strategies to Identify and Mitigate Risks)에 따르고, 부작용을 최소화하기 위해, 본 발명의 페이즈 (phase)는 2 개의 간격으로 나뉘었다. 간격 1은, 72 시간 동안 관찰되는 하나의 대상에 SYL040012단일 투여량의 주입으로 시작하였다. 내성은 주입 후 24, 48 및 72 시간에 평가되었다; 내성 기준 (tolerability criterion)이 주입 후 72 시간에 도달할 때, 다음 대상이 투여받았다. 6명의 대상이 투여 받을 때까지, 동일한 절차가 각각의 새로운 대상에 이어졌다. 좋은 내성으로 인하여 다음 지원자를 포함할 가능성은, 일반적인 이상반응 범주 (the Common Terminology Criteria for Adverse Events v3.0 scale.14 Safety) 에서의 등급 3 또는 그 이상의 독성이 없는 것으로 특징지어졌다. 안정성과 내성은 간격 2라 시작하기 전에 평가되었다.
간격 2 동안에, SYL040012는 연속하는 7일에 걸쳐 매일 점적물로 투여되었다. 두 가지 투여가 이러한 간격에서 어쎄이 되었으며, 이들 각각은 12 명 대상에게 투여되었다. 안정상의 이유로, 3명 대상의 초기 그룹은 SYL040012의 낮은 투여량 (600㎍) 를 받았다; 이전에 기술된 내성 기준이 도달되면, 이 투여량으로 배정된 남아있는 대상들은 투여되었다. 동일한 절차가 높은 투여량 (900 ㎍)에 대하여 수행되었다.
모든 대상들은, 병원의 임상적 연구 유닛 (the Clinical Investigation Unit)으로 처리되었으며, 프로토콜 준수를 약속하였다. 표 2는 흐름도 (flow chart diagram)이다.
IOP 관리
간격 1 동안에, IOP는 앉아 있는 대상들에게 골드만 안압측정 (Goldmann tonometry)을 사용하여 주입 후 1, 2, 4, 48 및 72 시간에 측정되었다. 간격 2 동안에, IOP 곡선은, 처음 주입 (스크리닝) 전과 처리의 4일 후에 측정되었다. 두 가지 모두의 경우에서, IOP는 9:00, 12:00, 15:00, 18:00, 및 21:00 시에 측정되었다. IOP는 또한 매시간 측정되었고, 눈의 내성은 간격 1과 간격 2 동안에, 주입 전 1시간, 및 주입 후에 평가되었다. IOP 곡선의 밖에서 수행된 측정은 9:00 과 12:00 사이의 아침에 이뤄졌다.
통계적 분석
SYL040012 처리 이후에 눈과 결막의 국부적인 내성이, 간격 1동안의 주입 후 72시간, 및 간격 2동안의 마지막 주입 후 24시간에, 눈의 부작용의 빈번도와 발생을 분석하여 평가되었다. 비교군들은 눈들 (투여된 vs. 비-투여된) 사이에서 카이-스퀘어 테스트(chi-squared test)를 사용하여 만들어졌다.
한 번 주입된 후 단일의 매일 IOP 값의 분석은, SYL040012 주입 후 얻어진 값을 스크리닝에서 기본적인 값과 비교하여 수행되었다. 간격 2동안에 IOP에서 SYL040012의 효과는, 4일에 얻어진 IOP 곡선과 스크리닝에서 얻어진 것을 비교하여 평가되었다. 통계학적 중요도는 변수의 반복적 측정 투-웨이 분석 ANOVA (repeated measures two-way analysis of variance: ANOVA)로 평가되었고, 이는 변수로 처리 (treatment)와 시간 (time of day) 및 반복적 측정으로 IOP을 사용하고, 각 시점에서의 중요도를 평가하기 위하여 본 페로니 포스트-훅 테스트 (Bonferroni post-hoc test)가 이어졌다. 다른 파라미터들 (임상적 분석, 시력 (visual acuity), 징후 기간)은, 한 쌍의 스튜던트 티 테스트 또는 윌콕손 테스트 (paired Student's t tests or Wilcoxon test)를 사용하여 분석되었으며, 이들은 이러한 통계적 테스트 각각을 사용하는 것을 요구하는 컨디션의 준수를 따른다. P<0.05는 중요하게 고려되었다.
결과: IOP에서 SYL040012의 효과
IOP에서 어떠한 중요한 효과도 스크리닝에서 얻어진 값과 SYL040012의 단일 주입에 따라 얻어진 것들 사이에서 나타나지 않았다. 간격 2동안, 연속하는 7일의 기간에 걸친 반복적인 투여 스케쥴 상에서 SYL040012의 투여는, 사용된 투여량에 관계없이 24명의 건강한 대상 중 15명에서 IOP 값을 감소시켰다. SYL040012의 투여량 600 ㎍은, 투여의 4일 후IOP에서 전반적으로 통계학적으로 중대한 감소를 유발하였다; 포스트 혹 데이터 분석은 15:00 시에 얻어진 측정상에서 SYL040012의 중대한 효과를 보여주었다 (도 6A). 이러한 투여량을 받은 5명의 자원자들은, 스크리닝에서의 값에 비교하여 4일에 20% 초과하는 IOP 값의 평균 감소를 보여주었다. 서브그룹 내에서 분리 분석이 수행되었고, IOP 상에서 전반적으로 통계학적으로 중대한 효과가 발견되었다; 상기 포스트 혹 분석은, 상기 차이점들이 연구된 모든 시점에서 통계학적으로 중대하다는 것을 드러냈다(도 6B). 이들 5명의 대상 중에서 기본적인 IOP 값이 다른 대상들의 기본적인 IOP 값보다 높다는 점 (각각 16.2 ± 2.9 mmHg vs. 14.9 ± 2.8 mmHg)은 주목할 만하다. 더 높은 IOP 값으로 이렇게 증가된 반응성은 다른 항녹내장 약물로 보고되어 왔다.
실시예 7: 성인에서 고안압증 (ocular hypertension) 또는 개방각 녹내장의 치료: 이중-블라인드, 조절된 플라시보, 다중-투여 효과 실험.
환자
좋거나 적당한 일반적인 건강의 총 80명의 남성과 여성 대상자들이 조사자에 의하여 평가되었고, 양쪽 눈에 개방각 녹내장을 갖거나, 갖지 않은 상승된 IOP (≥ 21mmHg)로 새롭게 진단받았거나 이전에 병력이 있는 18 세 이상이 모집되었다. 이 연구에 포함되기 위하여, 이들은 양쪽 눈에서 개방각 녹내장에 대한 다음 평가에서 전형적인 결과를 갖거나, 또는 정상 결과를 갖는다:
- 시야 24-2 또는 동등물 (24-2 험프리 시야 SITA 테스트 (24-2 Humphrey visual field SITA test), 눈당 약 5분)
- 빛 간섭 단층 촬영 (- Optical coherence tomography (OCT))
- 스넬렌 차트에서 최대 시력 ≥ 0.5 (20/40), 또는 ≤0.3 logMAR (Best corrected visual acuity ≥0.5 (20/40) on the Snellen chart, or ≤0.3 logMAR)
- 쉬르머 테스트 (Schirmer test (lacrimation))
- 안저검사 (Funduscopy)
이러한 시험의 주요한 목적은, 처리 14일 동안의 SYL040012 매일 투여 이후의 안압 상의 영향, 및 눈의 표면(각막 및 결막) 상에 내성을 측정하고자 하는 것이다.
두 번째 목적은, 각각의 투여 이후의 국부적인 내성, 조직적인 내성 (실험 파라미터, 신체 검사, 생명징후(vital signs) 및 심전도에 영향을 주는), 및 아마도 시험용 생성물과 관련된 안저(ocular fundus) 또는 시력의 변화 (만약 있다면)의 평가를 포함한다.
기준 기간 (Baseline period)
시험용 생성물의 첫 번째 투여 전 30일 까지 대상들은, 임상 실험의 처리 기간 내 참가할 자격이 등록된다. 만약 항-녹내장 약물이 씻어냄 (washout)을 요구한다면, 이러한 기간은 더 길어질 수 있다. 짧은 씻어냄 (short wash-out)을 요구하는 항-녹내장 약물의 일시적인 처방은 허용된다. 만약 기준 기간의 초기에 환자가 항-녹내장 약물에 몇 주 씻어냄을 갖는다면, (cf. European Glaucoma Society, footnote to the study Flow Chart), 조사자는, 눈에 몇 주 동안 IOP-낮추는 약물 없는 것을 피하도록 짧은 씻어냄을 갖는 또 다른 항-녹내장 약물을 제시할 수 있다.
처리(치료) 기간
1 일에 대상자들은, 점안제로 투여되기 위한, 1:1:1:1 비율의 80 ㎍ SYL040012, 300 ㎍ SYL040012, 900 ㎍ SYL040012 또는 플라시보를 임의로 받는다.
대상자들은 각각의 날에 시험용 생성물 투여와 평가를 위한 곳으로 돌아간다 (공휴일과 주말을 포함하여). 대상자들은 시험용 생성물 1 투여량을 하루에 한번 양쪽 눈에 14일 동안 받는다.
후속 조치 방문 (Follow-up visit)
마지막 평가는, 마지막 시험용 생성물 투여 이후 4일 내지 7일에 발생하는 후속 조치 방문에서 이루어질 것이다 (마지막 투여 후 96 시간으로부터[4 일] + 3일).
환자의 IOP에서 SYL040012의 영향을 측정하기 위하여, IOP 측정의 24 시간 곡선이 골드만 안압측정 (Goldmann tonometer)으로 처리 시작 전날과 14일에 얻어진다. 시점은, IOP 곡선 측정 (09:00, 12:00, 15:00 and 18:00 and at 9:00 next day)을 위한 전형적인 시간표 (classical timetable)에 조절된다. 게다가 단일 IOP 측정은 1, 7 및 15일에 수행되고, 또한 마지막 투여를 받은 후 4일과 7일 사이에 발생하는 후속 조치 방문 동안에 수행된다.
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cauugugcau gugauccagt t 21
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<223> SEQ ID NO: 6 represents the sense strand of a double stranded
molecule
<400> 6
cauugugcau gugauccagu u 21
Claims (27)
- 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 짧은 간섭 핵산 분자 (short interfering nucleic acid molecule: siNA)를 약 0.3 mg과 약 0.9 mg 사이의 투여량으로, 이를 필요로 하는 환자의 눈의 각막 표면에 국소적으로(topically) 투여하는 것을 포함하는, 증가된 안압(increased intraocular pressure: IOP)이 특징인 눈 질환 치료 방법.
- 인산완충식염수 (phosphate buffered saline: PBS)내 SYL040012 를 약 0.3 mg과 약 0.9 mg 사이를 포함하는 조성물을, 이를 필요로 하는 환자의 눈의 각막 표면에 국소적으로 투여하는 것을 포함하는, 증가된 안압 (IOP)이 특징인 눈 질환 치료 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 siNA 는 하루에 한번 투여되는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 siNA는 약 30 ㎕와 약 40 ㎕사이의 부피로 운반되는 것인, 방법.,
- 제1항에 있어서,
상기 siNA는 점안기로(with an eyedropper) 눈에 운반되는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 환자의 IOP는, 상기 siNA의 투여 전 환자의 IOP와 비교하여 약 25%와 약 30% 사이로 감소되는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 siNA는, 상기 siNA 투여 후 24시간 이상 동안 유지되는(last), IOP의 지속적인 감소를 제공하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 IOP의 감소는 적어도 8시간 동안 존재하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 감소된 IOP는 적어도 2일 동안 잔존하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 siNA는 짧은 간섭 리보핵산 (short interfering ribonucleic acid: siRNA)인 것인, 방법.
- 제10항에 있어서,
상기 siRNA는 이중 가닥인(dsRNA) 것인, 방법.
- 제10항에 있어서,
상기 siRNA는 짧은 헤어핀인(shRNA) 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 siNA는 적어도 하나의 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 siNA는, 포스포디에스테르 결합이 아닌 두 개의 뉴클레오티드 사이의, 적어도 하나의 결합을 포함하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 눈 질환은, 개방각 녹내장(open angle glaucoma), 폐쇄각 녹내장(angle closure glaucoma), 및 선천성 녹내장(congenital glaucoma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 siNA는 40 이하의 뉴클레오티드인 것인, 방법.
- 제10항에 있어서,
상기 siNA는, dsRNA를 만들기 위하여 이의 보체에 하이브리드되는 것인, 방법.
- 제10항에 있어서,
상기 dsRNA는, 디뉴클레오티드 3' 돌출부(overhang)를 갖는 것인, 방법.
- 제18항에 있어서,
상기 디뉴클레오티드 돌출부는, 티미딘 뉴클레오티드로 이루어지는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,
하나 이상의 siNA유형이 상기 환자에게 투여되는 것인, 방법.
- 제20항에 있어서,
상기 하나 이상의 siNA 유형은, 동일한 유전자의 발현을 억제하거나 감소시키는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 siNA 분자는 비변형된 것인, 방법.
- 액체 형태의 약제학적 투여량을 조제하기 위한 디스펜서(dispenser)로서,
상기 디스펜서는, 상기 액체를 담고 있는 컨테이너 및 미리 정해진 크기의 상기 액체 방울을 조제하기 위한 구멍을 포함하고,
상기 액체는, 서열번호 3을 포함하는 약 0.3 mg과 약 0.9 mg 사이의 siNA, 및 임의적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 희석제 및 임의적으로 하나 이상의 부형제를 포함하는 것인, 디스펜서.
- 액체 형태의 약제학적 투여량을 조제하기 위한 디스펜서(dispenser)로서,
상기 디스펜서는, 상기 액체를 담고 있는 컨테이너 및 미리 정해진 크기의 상기 액체 방울을 조제하기 위한 구멍을 포함하고,
상기 액체는, 약 7.5 mg/ml와 약 22.5 mg/ml사이의 농도에서, 인산-완충된 식염수를 포함하는 수용액 내 약 0.3 mg과 약 0.9 mg 사이의 SYL040012을 포함하는 것인, 디스펜서.
- (a) 액체 형태의 약제학적 투여량을 조제하기 위한 디스펜서로서, 상기 디스펜서는 상기 액체를 담고 있는 컨테이너 및 미리 정해진 크기의 상기 액체 방울을 조제하기 위한 구멍을 포함하는, 디스펜서; 및
(b) 한 방울의 형태 내, 서열번호 1을 포함하는 siNA의 약 0.3 mg과 약 0.9 mg 사이가 각 눈에 적용되도록, 구체화하는 사용 설명서(written instructions);를 포함하는 키트.
- (a) 액체 형태의 약제학적 투여량을 조제하기 위한 디스펜서로서, 상기 디스펜서는 상기 액체를 담고 있는 컨테이너 및 미리 정해진 크기의 상기 액체 방울을 조제하기 위한 구멍을 포함하는, 디스펜서; 및
(b) 한 방울의 형태 내, PBS 내 약 7.5 mg/ml와 약 22.5 mg/ml사이의 최종 농도에서, 약 0.3 mg과 약 0.9 mg 사이의 SYL040012가 각 눈에 적용되도록, 구체화하는 사용 설명서(written instructions);를 포함하는 키트.
- 증가된 안압(increased intraocular pressure: IOP))이 특징인 눈 질환의 치료를 위한 약물 제조에 있어서, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 짧은 간섭 핵산 분자 (short interfering nucleic acid molecule: siNA)의 용도로서,
상기 siRNA 는 약 0.3 mg과 약 0.9 mg 사이의 투여량으로 이를 필요로 하는 환자의 눈의 각막 표면에 국소적으로 투여되는 것인, 용도.
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