MX2015002800A - Sirna y su uso en los metodos y composiciones para el tratamiento y/o prevencion trastornos oculares. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a los métodos, composiciones y dosis que disminuyen la IOP del ojo, que comprende una molécula de RNA bicatenaria de 19 nucleótidos.

Description

siRNA Y SU USO EN LOS METODOS Y COMPOSICIONES PARA EL TRATAMIENTO Y/O PREVENCIÓN TRASTORNOS OCULARES ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El glaucoma es definido como el proceso de la destrucción del tejido ocular ocasionada por una elevación prolongadas de la presión infraocular (IOP) por encima de sus limites fisiológicos normales1. En el glaucoma de ángulo abierto (OAG), la IOP elevada ocasiona una neuropatía óptica progresiva por la pérdida de células ganglionares de la retina que finalmente conducen a la ceguera2. En el glaucoma de ángulo cerrado, la elevación repentina de la IOP a menudo hace que el ojo quede ciego. El glaucoma es la segunda causa de ceguera en el mundo3 y su prevalencia está en aumento a nivel mundial4. La ceguera en el glaucoma es causada por un proceso degenerativo de la retina y el nervio óptico, pero de acuerdo con su función se asocia con daño en el equilibrio entre la secreción y descarga del humor acuoso (AH). El AH es secretado por células de los cuerpos ciliares (CB) y la salida puede ser a través de una de dos vías: la vía de la malla trabecular y la vía uveoescleral5.

El tratamiento actual para el glaucoma no puede restablecer la pérdida de la visión ocasionad por el glaucoma, pero se centra en la disminución de la IOP6. Se ha demostrado que el control de la IOP protege contra daño al nervio óptico en el glaucoma5'7. Hay cinco clases de fármacos que se utilizan actualmente para lograr la disminución de la IOP: agonistas a-adrenérgicos, antagonistas b-adrenérgicos, agonistas colinérgicos, prostaglandinas e inhibidores de la anhidrasa carbónica. Si no se logra la eficacia para disminuir la IOP con cualquiera de estos fármacos, la terapia con luz láser se puede aplicar a la malla trabecular para aumentar la salida del AH. El último recurso terapéutico es un procedimiento quirúrgico para crear una nueva ruta para la salida del HA8.

Los tratamientos actuales para aumentar la IOP asociada con glaucoma tienen relativamente pocos efectos secundarios oculares, pero pueden tener efectos secundarios sistémicos si el compuesto llega a la circulación9,10'11. Los tratamientos que son mejor tolerados por la vía sistémica, como las prostaglandinas, tienen múltiples problemas de tolerancia local12. Este hecho, junto con la frecuencia necesaria de las instilaciones con el fin de mantener niveles adecuados de la IOP hace que el cumplimiento con el tratamiento sea un reto para los pacientes13. El incumplimiento del tratamiento no sólo permite que progrese la enfermedad, sino también puede tener un efecto de reinicio causando aumentos repentinos de la IOP que pueden ser muy perjudiciales para el nervio óptico.

Las prostaglandinas y los bloqueadores beta son los agentes reductores de la IOP preferidos. Las prostaglandinas reducen la IOP extremadamente bien y son sistémicamente seguros, pero se asocian con diversos efectos secundarios oculares,15 es decir, el oscurecimiento del color del iris, el crecimiento de las pestañas, pigmentación periocular e hiperemia. Los efectos secundarios oculares menos frecuentes de esta clase de fármacos son la inflamación infraocular, edema macular quistico y la reactivación de infecciones virales de la córnea ocular causadas por herpes16. Los análogos de prostaglandinas están contraindicados durante el embarazo por el riesgo potencial de un parto prematuro.

La aplicación tópica de los bloqueadores beta reduce la IOP disminuyendo la producción de AH y no por el aumento de su flujo de salida. Los bloqueadores beta administrados por vía tópica son absorbidos a través del epitelio conjuntival, el canal lagrimal, la mucosa nasal y las vías gastrointestinales a la circulación sistémica, lo que induce reacciones adversas sistémicas1719. En el ojo, los receptores adrenérgicos han sido localizados en los vasos sanguíneos que irrigan el cuerpo ciliar y la malla trabecular, donde su principal efecto es la vasoconstricción, aunque también se ha descrito su participación en la secreción del humor acuoso. Estudios previos realizados en los ojos de conejos mostraron una alta densidad de receptores b-adrenérgicos en el epitelio conjuntival, corneal y del cuerpo ciliar. Los receptores b-adrenérgicos también están presentes en el endotelio corneal, el epitelio del cristalino, la coroides y los músculos extraoculares. La mayor parte de los receptores b-adrenérgicos detectados en el ojo pertenecen al tipo El RNA de interferencia (RNAi) es una teenología basada en el principio de que fragmentos de RNA bicatenarios, sintetizados por métodos químicos, diseñados específicamente, pequeños, pueden intervenir en la degradación del RNA mensajero (mRNA) específico en el citoplasma, y por tanto pueden inhibir selectivamente la síntesis de proteínas específicas. Esta tecnología ha surgido como una herramienta muy poderosa para desarrollar nuevos compuestos destinados a bloquear y/o reducir las actividades anómalas en proteínas definidas24,25. Compuestos basados en el RNA de interferencia pueden ser diseñados racionalmente para bloquear la expresión de cualquier gen diana, incluyendo genes para los que no se pueden encontrar inhibidores de moléculas pequeñas tradicionales.26 Los ejemplos del uso satisf ctorio del RNAi en la terapéutica incluyen la inhibición de la replicación del V1H-1 en células humanas27 y el silenciamiento de la proteina tau y la proteína precursora de la apolipoproteína en modelos animales de la enfermedad de Alzheimer.28 Aunque el RNAi fue descubierto hace poco más de una década, algunos de estos compuestos se encuentran ya en fases avanzadas de ensayos clínicos, es decir, el RTP801 (Quark Pharmaceuticals, Fremont, PA, en fase II) para tratar degeneración macular relacionada con la edad, y el compuesto ALN-RSV01 (Alnylam Pharmaceuticals, Cambridge, MA, en fase II) para el tratamiento del virus sincitial respiratorio29,30. El RNA de interferencia es un abordaje muy atractivo para estados crónicos, puesto que tras el cese del tratamiento, la proteína silenciada tiene que ser sintetizada con el fin de recuperar su actividad biológica. Por tanto, los efectos de los compuestos basados en RNA de interferencia, en general, son más prolongados que aquellos de los tratamientos tradicionales 24,31 El ojo es un compartimento tisular relativamente aislado; esta particularidad proporciona varias ventajas al uso de terapias basadas en siRNA. La administración local de compuestos al ojo limita la exposición sistémica y reduce la cantidad necesaria del compuesto. Esto permite el silenciamiento local de un gen y reduce la probabilidad que el silenciamiento se extienda fuera del ojo. Además, el sistema inmune tiene un acceso limitado a los ojos; Por tanto, es menos probable que se produzca una respuesta inmunitaria frente al compuesto32.

Continuando con el trabajo descrito en W02006/021817, hemos desarrollado un siRNA: SYL040012, como se identifica en la ID SEC NO: 2, un oligonucleótido bicatenario de 19 pb, no modificado, sintetizado por métodos químicos, con grupos pendientes dinucleótidos en el extremo 3' de la desoxitimidina, con capacidad para inhibir selectivamente la síntesis del receptor b2-adrenérgico, indicado para el tratamiento de IOP elevada en pacientes con hipertensión ocular, glaucoma de ángulo abierto y otros padecimientos relacionados.

El compuesto ha demostrado eficacia para inhibir la expresión de su diana en cultivos celulares y para disminuir la IOP en conejos normotensos y en un modelo de IOP elevada en conejos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Eficacia in vitro de SYL040012 en células humanas. (A) Inhibición con evolución en el tiempo de ADRB2 en células humanas: células BxPC3 y MDA-MB-231 fueron transfectadas con 100 nM de SYL040012 o 100 nM de una secuencia siRNA revuelta, el RNA fue extraído y se analizó la expresión de ADRB2 a diferentes puntos temporales después de la transíección. (B) Inhibición dependiente de la dosis de ADRB2 en respuesta a SYL040012 en células BxPC3: las células BxPC3 fueron transfectadas con dosis crecientes de SYL040012 y se analizó la expresión de ADRB2 48 h después de la transíección. (C) Expresión de los receptores de la familia adrenérgica en respuesta a SYL040012. Células BxPC3 y MDA-MB-231 tratadas con 100 nM de SYL040012, la secuencia revuelta o vehículo. El * indica el nivel con significado estadístico de p <0,5 con respecto al punto temporal 0.

Figura 2: Estabilidad de SYL040012 en fluidos biológicos.

Se evaluó la estabilidad de SYL040012 en el humor acuoso de conejos y en suero de conejo utilizando HPLC (Cromatografía líquida de alta resolución) natural en diferentes puntos temporales mediante la adición de cantidades conocidas en muestras recién obtenidas de ambos fluidos biológicos con una solución 20 mM de SYL040012 en PBS (Salina amortiguada con fosfato) en el tiempo 0. Los resultados se representan como porcentaje de la cantidad inicial. Los datos representan la media ± SD de 2 análisis independientes.

Figura 3: Reducción de los niveles de eGFP en el cuerpo ciliar después del tratamiento con un compuesto eGFP-siRNA. Ratones transgénicos eGFP fueron tratados con tres dosis de 160 mg/día. 48 horas después de la última administración, los animales fueron sacrificados, los ojos fueron enucleados y procesados para microscopía de fluorescencia. Las imágenes de la izquierda muestran microfotograflas de Nomarski del cuerpo ciliar de un animal tratado con PBS (A) y de un animal tratado con el compuesto eGFP-siRNA (B). Las imágenes intermedias muestran microfotografías de fluorescencia de un animal tratado con PBS (C) y de un animal tratado con eGFP-siRNA (D). Las imágenes de la derecha muestran combinaciones de las microfotografías Nomarski y de fluorescencia. NPE: epitelio no pigmentado; PE: epitelio pigmentado.

Figura 4: Eficacia in vivo de SYL040012 en conejos. (A) Efecto reductor de la IOP de SYL040012: dos grupos de conejos Nueva Zelanda blancos (NZW) fueron tratados con SYL040012 (20 nmol/dia) o PBS durante un periodo de 4 días consecutivos. La IOP fue evaluada cada dos horas hasta 8 horas después de cada administración, el mismo programa se siguió en los días 5-10, pero sin administrar compuestos. (B) Especificidad del efecto de SYL040012: dos grupos de conejos NZW fueron tratados con una solución 100 nM de siRNA revuelto o con PBS. La IOP fue evaluada como se describe antes. (C) El efecto reductor de la IOP a largo plazo del compuesto SYL040012: dos grupos de conejos fueron administrados con 20 nmol/dia de SYL040012 o PBS durante dos periodos de cuatro días separados entre sí por un periodo de 3 días sin fármaco. La IOP fue evaluada como se describe antes desde los días 1-13. Se muestran experimentos representativos .

Figura 5: Eficacia de SYL040012 en un modelo de presión infraocular alta en conejo inducida por sobrecarga oral de agua. (A) Curva dosis-respuesta de SYL040012 en IOP: Se administró a los animales SYL040012 con una de las siguientes dosis: 10, 20, 40 o 60 nmol/ojo/día o PBS durante un periodo de cuatro días.120 min después de la última dosis se indujo hipertensión ocular por sobrecarga oral de agua. La IOP fue evaluada coincidiendo con la última dosis, a los 60 min e inmediatamente antes de la sobrecarga oral de agua, y un total de 10 veces con un intervalo de 25 minutos entre mediciones después de la sobrecarga de agua por vía oral. Los datos representan la media ± el erro típico de la media de 2 animales por grupo. (B) Especificidad de SYL040012 en IOP: Se administró a los animales 40 nmol/ojo/día de SYL040012, un siRNA revuelto o PBS como se menciona antes. La sobrecarga de agua por vía oral y las mediciones de la IOP se hicieron como se menciona en el inciso A. Los datos representan la media ± el error típico de la media de 12 animales para SYL040012; 11 animales para PBS y 2 animales para siRNA revuelto. (C) Reducción de los niveles de ADRB2 en animales tratados con SYL040012. Los animales fueron tratados como se menciona en el inciso B e inmediatamente después de la última medición de la IOP fueron sacrificados, los ojos fueron enucleados y se separó la córnea, la glándula lagrimal y el cuerpo ciliar. Se extrajo el RNA total y se analizó la expresión de ADRB2 por PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) en tiempo real. Los datos representan la media ± el error típico de la media de 3 animales por grupo. Se calculó la significación estadística comparando cada estructura del ojo tratado con su contraparte tratada con PBS utilizando pruebas t de Student no pareada y fue como sigue: *** p <0,001.

Figura 6: Curvas de la IOP en respuesta a las dosis A y B de SYL040012. A. Evolución de la IOP en 12 individuos sanos en respuesta a la administración repetida de la dosis A de SYL040012; B. Evolución de la IOP en el subgrupo de individuos que mostraron disminución de la IOP mayor de 20% en respuesta a la dosis A de SYL040012 (n = 5). C: Evolución de la IOP en 12 individuos sanos en respuesta a las administraciones repetidas de la dosis B de SYL040012. Los datos representan la media ± error típico de la media (SEM) de 12 individuos en A y C, y 5 individuos en B. Se calculó la significación estadística utilizando ANOVA en dos sentidos con medidas repetidas y se hicieron correcciones de Bonferroni para las comparaciones pareadas subsecuentes y fue como sigue: *** p <0,001; ** P <0,01 y * p <0,05.

Figura 7: Moléculas de SiNA [sic] de la invención. Esta figura muestra las secuencias de oligonucleótidos para moléculas de SiNA comprendidas eenn la presente invención .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a los métodos, composiciones y dosis que disminuyen la IOP en el ojo, que consisten en SYL040012, una molécula de RNA bicatenaria de 19 nucleótidos con grupos colgantes dinucleótido de desoxitimidina en el extremo 3'. Las composiciones de la presente invención comprenden SYL040012 en solución salina, como puede ser PBS, y los excipientes farmacéuticos aceptables, permitiendo de este modo su instilación en el ojo, es decir, como gotas oftálmicas. Las dosis de la invención consisten en una instilación diaria de una gota oftálmica de entre aproximadamente 30 mL y aproximadamente 40 pL, conteniendo entre alrededor de 0.6 mg y 0.9 g de SYL040012.

La presente invención se refiere a los métodos, composiciones y dosis que disminuyen la IOP en el ojo.

Las composiciones de la invención contienen moléculas de ácido nucleico interferente, cortas (SiNA) que disminuyen la expresión del gen del receptor adrenérgico beta 2 (ADRB2) el cual, como se indica anteriormente, disminuye la producción del humor acuoso dentro de la cámara anterior del ojo. Las composiciones de la invención pueden utilizarse en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un padecimiento ocular que presente IOP elevada como glaucoma, infección, inflamación, uveitis y retinopatia diabética. Los métodos de la invención consisten en la administración a un paciente que necesite de éste de una cantidad eficaz de uno o más siNA de la invención en un régimen de dosificación eficaz.

Las composiciones de la invención contienen moléculas de ácido nucleico interferente, cortas (siNA) que disminuyen o inhiben la expresión del receptor adrenérgico beta 2 (ADRB2), un gen asociado con la producción de fluido infraocular, es decir, el humor acuoso. La presente invención comprende composiciones y métodos de uso del ácido nucleico interferente corto (siNA) que incluye, más no se limita a, moléculas de RNA interferente corto (siRNA), RNA bicatenario (dsRNA) y RNA de horquilla corto (shRNA) con capacidad para intervenir la interferencia del RNA (RNAi) contra el gen diana, ADRB2. En modalidades preferidas, el siNA que se utiliza en los métodos de la invención son dsRNA. Los siNA de la invención pueden ser no modificados o modificados por métodos químicos.

Los métodos de la invención consisten en la administración a un paciente que necesite de éste, de una cantidad eficaz de un siNA de la invención. En modalidades preferidas, los métodos de la invención proporcionan una disminución sostenida de la IOP si se compara con la duración de la disminución de la IOP que resulta de la administración de fármacos comerciales, como Xalatan, Trusopt y Timoftol.

Los métodos de la invención también comprenden la administración de uno o más siNA de la invención en combinación con uno o más de otros terapéuticos que disminuyen la IOP, como pueden ser, más no se limitan a, los fármacos disponibles en el comercio.

Los métodos de la invención también comprenden la administración de la composición de la invención por instilación sobre la superficie ocular. Cuando el siRNA se administra directamente al ojo, generalmente se administra una cantidad de entre aproximadamente 0.01 g y aproximadamente 100 mg por ojo por día, entre aproximadamente 0.04 mg y aproximadamente 80 mg por ojo por día, entre aproximadamente 0.04 mg y aproximadamente 20 mg por ojo por día, entre aproximadamente 0.08 mg y aproximadamente 10 mg por ojo por día, entre aproximadamente 0.08 mg y aproximadamente 1.2 mg por ojo por día, entre aproximadamente 0.3 y aproximadamente 0.9 mg por ojo por día, o entre aproximadamente 0.08 mg y aproximadamente 0.9 mg por ojo por dia, por dia de siNA.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a los métodos, composiciones y dosis que disminuyen la IOP del ojo. Las composiciones de la invención comprenden moléculas de ácido nucleico interferente cortas (siNA) que disminuyen la expresión del gen del receptor adrenérgico beta 2 (ADRB2), el cual, como se indica anteriormente, el producto de expresión del cual disminuye la producción del humor acuoso dentro de la cámara anterior del ojo. Las composiciones de la invención pueden utilizarse en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un padecimiento ocular que presente IOP elevada como glaucoma. Los métodos de la invención consisten en la administración a un paciente que necesite de éste, de una cantidad eficaz de uno o más siNA de la invención en un régimen de dosificación eficaz.

Diseño de los siNA Los siNA de la invención están diseñados para modular la actividad mediante la disminución o la inhibición de la expresión de ADRB2, afectando asi la IOP. En una modalidad, una disminución en o inhibición de la expresión del gen diana disminuye la producción de fluido infraocular, por ejemplo, el humor acuoso. El número de acceso GenBank para ADRB2, el gen diana de la presente, es NM_000024.

Cuando se utiliza en la presente, el término "siNA" de la invención se refiere a un oligonucleótido bicatenario con capacidad para intervenir en el desdoblamiento o escisión del mRNA diana a través de la interferencia del RNA. Se prefiere el término siRNA para evitar la confusión, dado que es una práctica común en el campo incluir bases no canónicas modificadas dentro de la estructura molecular, y en ocasión un desoxirribonucleótido, incluso grupos colgantes timidina monocatenarios en los extremos de la parte bicatenaria.

Un gen es "elegido" por un siNA de acuerdo con la invención cuando, por ejemplo, la molécuel siNA disminuye o inhibe selectivamente la expresión del gen. La frase "disminuye o inhibe selectivamente", cuando se utiliza en la presente, comprende los siNA que disminuyen la expresión de un gen, asi como aquellos que disminuyen la expresión de más de un gen. En casos donde un siNA disminuye la expresión de más de un gen, el gen que es elegido se disminuye al menos aproximadamente dos veces, aproximadamente tres veces, aproximadamente cuatro veces, aproximadamente cinco veces, aproximadamente diez veces, aproximadamente veinticinco veces, aproximadamente cincuenta veces, o aproximadamente cien veces tanto como cualquier otro gen. De otro modo, un siNA elige un gen cuando el siNA híbrida en condiciones rigurosas al transcrito del gen. Los siNA pueden ser analizados in vi tro o in vivo para determinar la capacidad para dirigirse a un gen.

Un fragmento corto de la secuencia del mRNA del gen diana (por ejemplo, de 19-40 nucleótidos de longitud) se elige para la secuencia del siNA de la invención. En una modalidad, el SINA es un siRNA. En modalidades preferidas, el criterio para elegir un fragmento de secuencia a partir del mRNA del gen diana que será una molécula siRNA candidata incluyen: 1) una secuencia del mRNA del gen diana que sea de al menos 50-100 nucleótidos desde el extremo 5'o 3' de la molécula de mRNA natural, 2) una secuencia del mRNA del gen diana que tenga un contenido de G/C de entre 30% y 70%, más preferiblemente alrededor de 50%, 3) una secuencia del mRNA del gen diana que no contenga secuencias repetidas (por ejemplo, AAA, CCC, GGG, UUU, AAAA, CCCC, GGGG, UUUU), 4) una secuencia del mRNA del gen diana que sea accesible en el mRNA, y 5) una secuencia del mRNA del gen diana que sea única para el gen diana. El fragmento de la secuencia del RNA del gen diana puede cumplir con uno o más de los criterios antes identificados. En las modalidades donde un fragmento del mRNA del gen diana cumple con menos que todos los criterios identificados antes, la secuencia natural puede ser alterada para que el siRNA sea conforme con más de los criterios que el fragmento del mRNA del gen diana. En las modalidades preferidas, el siRNA tiene un contenido G/C por debajo de 60% y/o carece de secuencias repetitivas.

En una modalidad especifica, la porción del siNA que es complementaria a la región diana es perfectamente complementaria a la región diana. En otra modalidad especifica, la porción del siNA que es complementaria a la región diana no es perfectamente complementaria a la región diana. El siNA con inserciones, deleciones y mutaciones puntuales respecto a la secuencia diana también están comprendidos por la invención. Por tanto, la identidad de la secuencia puede calcularse por algoritmos de comparación y de alineación de secuencias conocidos en la téenica (véase Gribskov y Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press 1991, y las referencias citadas en estas) y el cálculo de la diferencia porcentual entre las secuencias de nucleótidos, por ejemplo, el algoritmo de Smith-Waterman como se aplica en el programa informático BESTFIT utilizando parámetros por defecto (por ejemplo, de la University of Wisconsin Genetic Computing Group). Se prefiere una identidad de las secuencias mayor de 90%, 95% o 99% entre el siNA y la porción del gen diana. De otro modo, la co plementariedad entre el siNA y la molécula de RNA natural puede definirse funcionalmente por hibridación. Una secuencia de siNA de la invención es capaz de hibridar con una porción del transcrito del gen diana en condiciones rigurosas (por ejemplo, NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, 50°C o 70°C durante para la hibridación durante 12-16 horas, seguido por el lavado). Una secuencia de siNA de la invención también puede definirse funcionalmente por su capacidad para disminuir o inhibir la expresión de un gen diana. La capacidad de un siNA para afectar la expresión génica puede determinarse de forma empírica, in vivo o in vitro.

Además de los siNA que dirigen específicamente sólo un gen, degeneran secuencias siNA que pueden ser utilizadas para dirigir regiones homologas de múltiples genes. W02005/045037 describe el diseño de moléculas de siNA para dirigir dichas secuencias homologas, por ejemplo mediante la incorporación de pares de bases no canónicos, por ejemplo, pares de bases mal apareadas y/o cambiantes, que puede proporcionar secuencias diana adicionales. En los casos en que se identifican apareamientos erróneos, los pares de bases no canónicos (por ejemplo, bases mal apareadas y/o cambiantes) se pueden utilizar para generar moléculas de siNA que se dirigen a más de una secuencia del gen. En un ejemplo no limitativo, se utilizan pares de bases no canónicos como los pares de bases UU y CC para generar moléculas de siNA que sean capaces de dirigirse a secuencias para diferentes dianas que compartan homología de secuencia. Como tal, una ventaja del uso de los siNA de la invención es que un solo siNA puede ser diseñado para incluir una secuencia de ácido nucleico que sea complementaria a la secuencia de nucleótidos que se conserva entre genes homólogos. En este enfoque, un solo siNA puede utilizarse para inhibir la expresión de más de un gen en lugar de utilizar más de una molécula de siNA para dirigirse a diferentes genes.

Las moléculas de siNA preferidas de la invención son bicatenarias. En una modalidad, las moléculas de siNA bicatenarias comprenden extremos romos. En otra modalidad, las moléculas de siNA bicatenarias comprenden nucleótidos colgantes (por ejemplo, grupos colgantes de 1-5 nucleótidos, preferiblemente grupos colgantes de 2 nucleótidos). En una modalidad especifica, los nucleótidos colgantes son nucleótidos colgantes del extremo 3'. En otra modalidad especifica, los nucleótidos colgantes son nucleótidos colgantes del extremo 5'. Cualquier tipo de nucleótido puede ser una parte del grupo colgante. En una modalidad, el nucleótido o los nucleótidos colgantes son ácidos ribonucleicos. En otra modalidad, el nucleótido o los nucleótidos colgantes son ácidos desoxirribonucleicos. En una modalidad preferida, el nucleótido o los nucleótidos colgantes son nucleótidos de timidina. En otra modalidad, el nucleótido o los nucleótidos colgantes son nucleótidos modificados o no clásicos. El nucleótido o nucleótidos colgantes pueden tener enlaces internucleótido no clásicos (por ejemplo, diferentes del enlace fosfodiéster).

En modalidades preferidas, las composiciones de siNA de la invención están diseñadas para dirigirse a la ID SEC NO: 1. Otras modalidades se refieren a los siNA identificados por la ID SEC NOS: 1, 2, 3, 4, 5 y 6. En otra modalidad, el siNA preferido de la invención es ID SEC NO: 2 (SYL040012). Este siNA preferido, SYL040012, es una molécula de RNA bicatenaria, no modificada, de 19 nucléotidos de longitud con grupos colgantes dinucleótido en los extremos 3' consistentes en bases de desoxitimidina, como se representa en la Figura 7.

Síntesis de los siNA Los siNA diseñados por los métodos antes descritos pueden ser sintetizados por cualquier método conocido en la téenica. Los RNA preferentemente son sintetizados por métodos químicos utilizando fosforamiditas de ribonucleósido apropiadamente protegidas y un sintetizador de DNA/RNA tradicional. Además, los siRNA se puede obtener de proveedores comerciales de la síntesis del oligonucleótido RNA, que incluye, mas no se limitan a, Proligo (Hamburg, Alemania) , Dharmacon Research (Lafayette, CO, EUA), Glen Research (Sterling, VA, EUA), ChemGenes (Ashland, MA, EUA), y Cruachem (Glasgow, Reino Unido), Qiagen (Alemania), Ambion (EUA) e Invitrogen (Escocia). Alternativamente, las moléculas de siNA de la invención pueden expresarse en células mediante la transfección de las células con vectores que contienen la secuencia de siNA complemento inversa bajo el control de un promotor. Una vez expresado, el siNA puede ser aislado de la célula usando técnicas bien conocidas en la materia.

En modalidades en donde el siRNA es un RNA bicatenario (dsRNA), es necesario un paso de hibridación si se obtienen moléculas de RNA monocatenarias . En resumen, se combinan 30 mL de cada solución del oligonucleótido de RNA 50 mM en acetato de potasio 100 mM, HEPES-KOH 30 mM pH 7,4, acetato de magnesio 2 mM. La solución luego se incuba durante 1 minuto a 90°C, se centrifuga durante 15 segundos, y se incuba durante 1 hora a 37°C.

En modalidades en donde el siRNA es un RNA de horquilla corto (shRNA); las dos cadenas de la molécula de siRNA pueden estar conectadas por una región de unión (por ejemplo, un ligador nucleotidico o un ligador no nucleotidico). 5.3 Modificación química de los siNA Los siNA de la invención pueden contener uno o más enlaces nucleotidicos modificados y/o no fosfodiéster. Las modificaciones químicas bien conocidas en la téenica son capaces de aumentar la estabilidad, disponibilidad y/o captación celular del siNA. El experto se dará cuenta de otro tipo de modificación química que se puede incorporar en moléculas de RNA (véase Publicaciones Internacionales W0031070744 W02005/045037 o WO2008/104978 para una visión general de los tipos de modificaciones) .

En una modalidad, las odificaciones pueden utilizarse para proporcionar una resistencia mejorada a la degradación o captación mejorada. Los ejemplos de tales modificaciones incluyen enlaces fosforotioato internucleotídicos, 2'-O-metil ribonucleótidos (especialmente en la hebra sentido de un siRNA bicatenario), 2'-desoxi-fluoro ribonucleótidos, 2'-desoxi ribonucleótidos, nucleótidos "base universal", 5-C-metil nucleótidos, y la incorporación de residuos desoxiabásicos invertidos (véase, en general, GB 2406568).

En otra modalidad, las modificaciones pueden utilizarse para mejorar la estabilidad del siRNA o para aumentar la eficacia de la dirección. Las modificaciones incluyen reticulación química entre las dos cadenas complementarias de un siRNA, la modificación química de un extremo 3'o 5' de una cadena de un siRNA, modificaciones de azúcares, modificaciones de nucleobases y/o modificaciones de las cadenas principales, ribonucleótidos con modificación en la posición 2'-fluoro y 2'-desoxi ribonucleótidos (véase, en general, la Publicación Internacional W02004/029212).

En otra modalidad, las modificaciones se pueden utilizar para aumentar o disminuir la afinidad por los nucleótidos complementarios en el mRNA diana y/o en la hebra complementaria del siNA (véase, en general, la Publicación Internacional W02005/044976). Por ejemplo, un nucleótido de pirimidina no modificado puede ser sustituido por una 2-tio, 5-alquinilo, 5-metil o 5-propinil pirimidina. Adicionalmente, una purina no modificada puede ser sustituida con una 7-deza, 7-alquil o 7-alquenil-purina.

En otra modalidad, cuando el siNA es un siRNA bicatenario, los nucleótidos colgantes del nucleótido 3'-terminal se sustituyen por desoxirribonucleótidos, véase por ejemplo Elbashir et al33 Demostración de la utilidad terapéutica Las composiciones y métodos de la invención se analizan preferentemente in vi tro, y luego in vivo, para determinar la actividad terapéutica deseada antes de su uso en humanos. Por ejemplo, los ensayos in vi tro que pueden utilizarse para determinar si la administración de un protocolo terapéutico específico está indicada, incluyen ensayos de cultivo celular in vi tro en el que un candidato de siNA es administrado a las células (por ejemplo, células del epitelio ciliar no pigmentado (NPE) de conejo, células del epitelio ciliar (OMDC) humano, o células de riñón embriónicas humanas (HEK293) in vitro y se observa el efecto de tal protocolo en las células, por ejemplo, la expresión disminuida o inhibida del gen diana.

Los compuestos para uso en terapia se pueden analizar en sistemas de modelo animal apropiados antes de probarlos en humanos, estos modelos pueden ser, más no se limitan a, conejos, ratas, ratones, pollos, vacas, monos, hámsters, etc. Por ejemplo, el conejo Nueva Zelanda es el estándar preferido en plataformas experimentales diseñadas para estudiar la IOP. Es fácil de manejar y tiene un gran ojo, similar en tamaño al órgano de un humano. Además, el equipo actual para medir la IOP no es adecuado para su uso en animales con ojos pequeños como ratones o ratas. Por último, los conejos tienen una IOP que puede ser reducida a un 40% de su valor normal (o al valor antes de la administración del fármaco) utilizando medicamentos hipotensores comercial, locales. Por lo tanto, aunque es posible generar modelos de glaucoma en conejo (por ejemplo, bloqueando quirúrgicamente venas de la epiesclerótica u ocluyendo artificialmente la malla trabecular), en general los especialistas prefieren modelos en los que las estructuras oculares permanezcan intactas.

Métodos terapéuticos La presente invención abarca métodos para tratar, prevenir, o manejar un trastorno ocular asociado con el aumento de la IOP en un paciente (por ejemplo, un mamífero, en especial en humanos) que comprende administrar una cantidad eficaz de uno o más siNA de la invención. En una modalidad específica, el trastorno que se va a tratar, prevenir o manejar es glaucoma. Cualquier tipo de glaucoma que esté asociado con la IOP se puede tratar con los métodos de la presente invención, como puede ser, más no se limita, Glaucoma de ángulo abierto (por ejemplo, Glaucoma de ángulo abierto primario, Glaucoma pigmentario y Glaucoma exfoliativo, Glaucoma de tensión baja), Glaucoma de cierre angular (también conocido clínicamente como glaucoma de ángulo cerrado, glaucoma de ángulo estrecho, glaucoma de bloqueo pupilar, y glaucoma de bloqueo ciliar) (por ejemplo, Glaucoma de cierre angular agudo y Glaucoma de cierre angular crónico), Glaucoma anirídico, Glaucoma congénito, Glaucoma juvenil, Glaucoma inducido por el cristalino, Glaucoma neovascular, Glaucoma postraumático, Glaucoma inducido por esteroides, Glaucoma del Síndrome de Sturge-Weber, y Glaucoma inducido por uveitis.

Se espera que los tratamientos terapéuticos con siRNA dirigidos contra los genes diana específicos sean benéficos sobre las gotas oculares tópicas de moléculas pequeñas aumentando el tiempo en el que se observa tal efecto, permitiendo con ello dosificación menos frecuente y un mayor cumplimiento por parte del paciente.

En modalidades preferidas, los siNA que se utilizan en los métodos terapéuticos de la invención disminuyen o inhiben la expresión de los genes que afectan la IOP, tales como los receptores adrenérgicos beta 2. En otras modalidades preferidas de la invención, los siNA que se utilizan en los métodos terapéuticos de la invención están dirigido a la ID SEC NO: 1. En una modalidad preferida específica, el siNA es de 21 a 30 nucleótidos de longitud y comprende la ID SEC NO: 3. Específicamente preferido es SYL040012, con la ID SEC NO: 2 que no tiene modificaciones, es decir, sin bases no canónicas, y que contiene grupos colgantes TT en ambos extremos 3'.

En modalidades preferidas, los métodos de la invención proporcionan una disminución sostenida de la IOP que dura más de 8, 10, 12 o 14 horas , mas preferiblemente durante varios dias (por ejemplo, 2 dias, 3 dias, 4 dias o 5 dias), después de la última administración del siNA. En tales modalidades, el efecto (es decir, la disminución de la IOP) de los siNA administrados de la invención dura más tiempo que la duración de la disminución de la IOP que comúnmente resulta de la administración de fármacos actualmente disponibles en el mercado (por ejemplo, Xalatan, Trusopt y Timoftol). Los siNA de la invención que proporcionan acción de la IOP disminuida, sostenida, se pueden administrar en un régimen tal que la IOP se disminuya continuamente sin la administración diaria del siNA. En una modalidad especifica, un régimen de tratamiento puede incluir ciclos de administración consecutivos (por ejemplo, una dosis de siNA dada al dia durante cuatro dias) y la no administración (por ejemplo, 3 o 4 dias sin dar el tratamiento) mientras que todavía provoca una disminución continua en la IOP.

En una modalidad, un solo tipo de siNA se administra en los métodos terapéuticos de la invención. En otra modalidad, un siNA de la invención se administra en combinación con otro siNA de la invención y/o con uno o más de otros agentes terapéuticos no siNA útiles en el tratamiento, prevención o manejo de un trastorno ocular asociado con aumento de la IOP. El término "en combinación con" no se limita a la administración de agentes terapéuticos en exactamente el mismo tiempo, sino que se entiende que el siNA de la invención y el otro agente se administren a un paciente en una secuencia y dentro de un intervalo de tiempo de manera que el beneficio de la combinación sea mayor que el beneficio si se administraran de otro modo. Por ejemplo, cada agente terapéutico se puede administrar al mismo tiempo o en secuencia en cualquier orden en diferentes puntos de tiempo; sin embargo, si no se administran al mismo tiempo, deben ser administrados lo suficientemente cerca en tiempo para proporcionar el efecto terapéutico deseado. Cada agente terapéutico se puede administrar por separado, en cualquier forma apropiada y por cualquier vía adecuada.

Dosificación Como se utiliza en la presente, una "cantidad eficaz" se refiere a aquella cantidad de un siNA de la invención suficiente para tratar o manejar un trastorno ocular asociado con el aumento de la IOP y, preferentemente, la cantidad suficiente para disminuir la IOP. Para el tratamiento del aumento de la IOP en humanos, se prefiere reducir la IOP de manera que la IOP esté entre aproximadamente 14 y 20 mm Hg. Sin embargo, cualquier reducción de la IOP en comparación con el tratamiento previo de la IOP es ventajosa, si los compuestos de la invención se suministran solos, o en combinación con otro agente terapéutico apropiado (por ejemplo, la invención contempla una disminución de la IOP mayor que aproximadamente el 5%, aproximadamente el 10%, alrededor de 25%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 35%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, o aproximadamente 60% de la IOP antes del tratamiento). En algunas modalidades, los compuestos de la invención pueden provocar una disminución en la IOP que esté entre aproximadamente 1% y aproximadamente 99%, entre aproximadamente 5% y aproximadamente 90%, entre aproximadamente 10% y aproximadamente 80%, entre aproximadamente 20% y aproximadamente 50%, o entre aproximadamente 25% y aproximadamente 45% de la IOP antes del tratamiento. Preferiblemente, la disminución de la IOP está entre aproximadamente 25% y aproximadamente 30%. Una cantidad terapéutica eficaz también puede referirse a la cantidad suficiente de un siNA para retrasar o minimizar la aparición de un trastorno ocular asociado con la IOP. Una cantidad terapéutica eficaz también puede referirse a la cantidad del agente terapéutico que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o manejo de un trastorno ocular asociado con la IOP elevada. Además, una cantidad terapéutica eficaz con respecto a un siNA de la invención significa que la cantidad de agente terapéutico solo, o en combinación con otras terapias, proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o manejo de un trastorno ocular asociado con el aumento de la IOP. Utilizado en relación con una cantidad de un siRNA de la invención, el término puede comprender una cantidad que mejore la terapia global, reduzca o evite los efectos no deseados, o aumente la eficacia terapéutica o efecto sinérgico con otro agente terapéutico. El tratamiento con siNA solo o en combinación debe resultar en una IOP de aproximadamente 14 y 20 m Hg. Sin embargo, cualquier disminución de la IOP en comparación con el tratamiento previo de la IOP es ventajosa (por ejemplo, una disminución de la IOP mayor que 5%, 10%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50% o 60% de la IOP antes del tratamiento).

Un beneficio terapéutico en el tratamiento o manejo de un trastorno ocular asociado con el aumento de la IOP es la disminución sostenida de la IOP inducida por el tratamiento. Cuanto más sostenido sea el descenso, menos probabilidad hay de fuertes aumentos repentinos de la IOP que ocurren cuando se debe dar la siguiente dosis. Es decir, esto es considerado una mejora significativa de la eficacia terapéutica. En algunas modalidades, el tratamiento con siNA solo o en combinación puede resultar en una disminución de la IOP sostenida entre aproximadamente 2 días hasta aproximadamente 7 dias, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 6 dias, y entre aproximadamente 2 dias y aproximadamente 4 dias. En alguna modalidad preferida, la disminución se mantiene entre aproximadamente 2 dias y aproximadamente 3 dias, preferiblemente durante 3 dias.

En consecuencia, en algunas modalidades, la administración de los compuestos de la invención resulta en la prevención, protección contra, o reducción del daño en el nervio óptico causado por el efecto de reinicio de la IOP cuando la siguiente dosis se vence en los casos de mal cumplimiento de los pacientes con esquemas de tratamiento.

La cantidad y el régimen de tratamiento eficaz de una composición de la invención puede ser determinada por téenicas de investigación normales. Por ejemplo, la dosificación de la composición que será eficaz en el tratamiento, prevención o manejo de la enfermedad se puede determinar administrando la composición a un modelo animal como puede ser, por ejemplo, los modelos animales aquí descritos, por ejemplo, el modelo de conejo blanco Nueva Zelanda, o conocido por los expertos en la téenica. Además, los ensayos in vitro opcionalmente se pueden emplear para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. Alternativamente, la dosificación puede determinarse para un individuo por titulación de la dosis hasta que se alcanza un nivel eficaz.

La selección de la cantidad eficaz preferida para ser utilizado en la dosificación puede ser determinada (por ejemplo, a través de ensayos clínicos) por un experto en la técnica basándose en la consideración de varios factores que serán conocidos para un experto normal en la técnica. Tales factores incluyen el trastorno a tratar o prevenir, los síntomas implicados, la masa corporal del paciente, el estado inmunitario del paciente y otros factores conocidos por el experto en la técnica para reflejar la exactitud de las composiciones farmacéuticas administradas.

La dosis precisa a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración y la gravedad del trastorno, y debe decidirse de acuerdo con el juicio del médico y las circunstancias de cada paciente.

Cuando el siRNA se administra directamente en el ojo, generalmente se administra una cantidad de entre aproximadamente 0.01 mg y aproximadamente 100 mg por ojo por día, entre aproximadamente 0.04 mg y aproximadamente 80 mg por ojo por dia, entre aproximadamente 0.04 mg y aproximadamente 20 mg por ojo por dia, entre aproximadamente 0.08 mg y aproximadamente 10 mg por ojo por dia, entre aproximadamente 0.08 mg y aproximadamente 1.2 mg por ojo por dia, entre aproximadamente 0.3 y aproximadamente 0.9 mg por ojo por dia, o entre aproximadamente 0.08 mg y aproximadamente 0.9 mg por ojo por dia, por cada dia de siNA. En modalidades preferidas, el siRNA de la invención se administra en una cantidad de entre aproximadamente 0.08 mg y aproximadamente 0.9 mg por ojo por dia, y entre aproximadamente 0.3 mg y aproximadamente 0.9 mg, y entre aproximadamente 0.3 mg y aproximadamente 0.6, y más preferiblemente entre aproximadamente 0.6 mg y aproximadamente 0.9 mg por ojo por dia. En una modalidad preferida, el siRNA de la invención se formula en una solución salina como PBS. En una modalidad específicamente preferida el siRNA de la invención es SYL040012 y se administra a las dosis antes definidas. En algunas modalidades preferidas, estas dosis pueden administrarse una vez al día, dos veces al día, tres veces al día o cuatro veces al día, y la aplicación a cada ojo toma lugar a diario, cada dos dias, una vez a la semana, dos veces a la semana, tres veces a la semana, cada dos semanas o una vez al mes. En algunas modalidades, las dosis anteriores se pueden administrar al mismo tiempo cada dia o en momentos diferentes cada día. Dado que las patologías que se caracterizan por el aumento de la IOP como el glaucoma son de naturaleza crónica, en una modalidad preferida de la presente invención, la administración de los siNA de la invención también es crónica. En modalidades alternativas de la invención, donde un aumento de la IOP de los pacientes es transitorio, las composiciones de la invención se administrarán mientras que la condición persista.

Formulaciones y vías de administración El siNA de la invención puede formularse en composiciones farmacéuticas mediante cualquiera de las téenicas tradicionales conocidas en el tema (véase, por ejemplo, Alfonso, G. et al, 1995, en: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing, Easton PA, 19ed 19a.). Las formulaciones que comprenden uno o más siNA para su uso en los métodos de la invención pueden estar en numerosas formas, y pueden depender de los diversos factores específicos para cada paciente (por ejemplo, el tipo y la gravedad del trastorno, el tipo de siNA administrado, edad, peso corporal, respuesta y historia médica pasada del paciente), el número y tipo de los siNA en la formulación, la forma de la composición (por ejemplo, en forma líquida, semi-líquida o sólida), el régimen terapéutico (por ejemplo, si el agente terapéutico agente se administra con el tiempo una vez al día, varias veces al día o una vez cada algunos días y/o la vía de administración).

En una modalidad preferida, las composiciones de la invención se administran en forma de gotas oftálmicas directamente en el ojo. Las gotas oftálmicas pueden ser suministradas en un volumen de entre aproximadamente 10 pL y aproximadamente 100 mL por gota, más preferentemente entre aproximadamente 20 pL y aproximadamente 50 pL por gota, y más preferiblemente entre aproximadamente 30 pL y aproximadamente 33 pL por gota. En una modalidad adicionalmente preferida, las gotas oftálmicas se suministran en un volumen de aproximadamente 40 pL. En una modalidad preferida, la composición de la invención comprende SYL040012 en una solución aceptable, como puede ser PBS. En algunas modalidades preferidas SYL040012 se administra una vez al día en gotas oftálmicas a una concentración desde aproximadamente 7,5 mg/mL hasta aproximadamente 22.5 mg/mL, preferentemente entre aproximadamente 15 mg/mL y 22.5 mg/mL.

Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones acuosas y no acuosas, suspensiones, emulsiones, microemulsiones, geles acuosos y no acuosos, cremas, tabletas, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida, y similares. El siNA de la invención también se puede encapsular en un agente de suministro (que incluye, más no se limita a, liposomas, microesferas, micropartículas, nanoesferas, nanopartículas, polímeros biodegradables, hidrogeles, ciclodextrinas poli ácido (láctico-co-glicólico) (PLGA)) o acomplejado con polietilenimina y derivados de estos (como polietilenimina-polietilenglicol-N-acetilgalactosamina (PEI-PEG-GAL) o derivados de polietilenimina-polietilenglicol-tri-N-acetilgalactosamina (PEI-PEG- Trigal)). Las composiciones preferidas de la invención son soluciones acuosas, específicamente preferidas son soluciones salinas como PBS, con un intervalo de pH de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 7.4, preferentemente con un pH de 7.2 ± 0.5.

Los portadores, vehículos, excipientes, o diluyentes farmacéuticos se pueden incluir en las composiciones de la invención que incluyen, más no se limitan a, agua, soluciones salinas, preferiblemente soluciones salinas amortiguadas, aceites (por ejemplo, petróleo, aceites animal, vegetal o sintético), almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, gis, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada seca, glicerol, propileno, glicol, etanol, biopolimeros (por ejemplo, carbopol, ácido hialurónico, ácido poliacrílico, etc.), dextrosa, potenciadores de permeación (por ejemplo, ácidos grasos, ásteres de ácidos grasos, alcoholes grasos y aminoácidos), y polímeros hidrofílicos (por ejemplo, policarbófilo y polivinilpirrolidona) y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes amortiguadores de pH.

Los disolventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos como aceite de ajonjolí, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Como una opción, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumenten la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.

En modalidades preferidas, las composiciones de la invención se formulan en una solución, preferiblemente una solución salina amortiguada como PBS, o un gel para la administración tópica en el ojo, como puede ser, por ejemplo, en la forma de gotas oftálmicas. En tales modalidades, las formulaciones pueden ser emulsiones catiónicas y/o contener biopolimeros que incluyen, más no se limitan a, poli(lactida-co-glicolida), carbopol, ácido hialurónico y ácido poliacrilico.

En una modalidad especifica preferida, las composiciones de la invención se formulan en una solución como solución salina amortiguada con fosfato (PBS), que puede, como una opción, comprender también uno o más diluyentes y/o excipientes aceptados para uso farmacéutico como cloruro de benzalconio, el cual permitirá la instilación ocular sobre la superficie de la córnea en la forma de una gota en el ojo preferentemente de entre aproximadamente 30 y aproximadamente 33 pL. En tales modalidades preferidas, la dosis administrada es entre aproximadamente 0.6 mg y aproximadamente 0.9 mg por ojo por dia, preferentemente administrada una vez al dia.

El siNA de la presente invención también puede ser formulado en combinación con otros compuestos terapéuticos que disminuyan la IOP (por ejemplo, fármacos disponibles en el mercado).

Kits Los compuestos de siNA de la invención también se pueden proporcionar en kits que contengan un dispensador con un orificio para dispensar dosis especificas del compuesto siNA en una gota de volumen predeterminado. En una modalidad preferida, los compuestos siNA de la invención son siNA dirigidos contra la ID SEC NO: 1. En una modalidad preferida adicional, los dispensadores dentro del kit de la invención proporcionan una composición que contenga SYL040012. En otra modalidad referida, el kit puede comprender una colección de dispensadores para un solo uso, por ejemplo para su uso durante un mes, en este caso especifico, la caja contendría 30 dispensadores para un solo uso. La gota puede abarcar desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 100 mL de volumen. El dispensador puede ser un dispensador par un solo uso y puede contener entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 2 g de los compuestos siNA de la invención, y como una opción también contener uno o más diluyentes farmacéuticos aceptables, y como una opción uno o más excipientes. La composición contenida en el dispensador puede comprender una concentración de entre aproximadamente 15 mg/mL hasta aproximadamente 22.5 mg/mL del compuesto siNA de la invención. De otro modo, el dispensador puede ser diseñado para utilizarlo durante un mes o más, y los volúmenes contenidos aumentarán en consecuencia para proporcionar el número de dosis equivalente. Los kits de la invención también pueden comprender las instrucciones que especifiquen que una dosis del compuesto siNA de entre aproximadamente 0.6 mg y aproximadamente 0.9 mg en 1 gota tiene que ser aplicada a cada ojo. Las instrucciones además pueden especificar que las gotas se apliquen a cada ojo una vez al día, dos veces al día, tres veces al día, o cuatro veces al día, y que la aplicación a cada ojo se llevar a cabo diario, cada dos días, una vez a la semana, dos veces a la semana, tres veces a la semana, cada dos semanas o una vez al mes.

El contenido de todos los artículos publicados, libros, manuales de referencia y resúmenes mencionados en el presente documento, se incorporan por referencia en su totalidad para describir más completamente el estado de la téenica a la que pertenece la invención.

En vista de que pueden hacerse diversos cambios en el tema antes descrito sin apartarse del alcance y espíritu de la presente invención, se prevé que todo el tema contenido en la descripción anterior, o definido en las reivindicaciones adjuntas, se interprete como descriptivo e ilustrativo de la presente invención. Modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles a la luz de las enseñanzas anteriores.

EJEMPLOS Ejemplo 1: En análisis in vitro de SYL040012 Cultivo celular y transfeccionesn Células BxPC3 y MDA-MB-231 fueron obtenidas de American Association of Culture Collection (Rockville, MD, EUA) y se mantuvieron en medio de cultivo (medio RPMI-1640 suplementado con FBS al 10%, células (BxPC3) y medio DMEM (células MDA-MB-231) suplementado con 10% BFS en un incubador humidificado a una atmósfera de 5% CO2/95% aire a 37°C. Para las transíecciones se sembraron células a una densidad de 106,000 células/cm2 para la línea de células BxPC3 y 200,000 células/cm2 para la línea MDA-MB-231. Cuando los cultivos celulares alcanzaron aproximadamente 90% de confluencia, las células fueron transfectadas con solución 100 nM de SYL040012 utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Paslcy, Reino Unido). La eficiencia de la transfección se estimó cuantificando la cantidad de oligonucleótido fluorescente rojo Block-it-Alexa Fluor (Invitrogen, Paslcy, Reino Unido) presente dentro de las células de los cultivos testigo 24 horas después de la transíección .

Aislamiento del RNA y PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) Se aisló RNA total de los cultivos celulares o tejidos utilizando el kit para extracción de RNA RNeasy (Invitrogen, CA, EUA) 4 g de RNA total fueron retrotranscritos utilizando el kit High-Capacity cDNA Archive (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EUA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se hizo la PCR en tiempo real utilizando el sistema de detección Stepone plus (Applied Biosystems). 500 nanogramos de cada muestra fueron amplificados en una mezcla TaqMan 2X Universal Master Mix utilizando las siguientes condiciones: 95°C durante 10 min, seguido por 40 ciclos de 95°C durante 15 s y 60°C durante 1 min. Todas las amplificaciones qRT-PCR en tiempo real se hicieron por triplicado y se repitieron en cinco diferentes experimentos, incluyendo siempre testigos de transcripción inversa y sin testigos modelo.

Los niveles de nRMA de ADRB2 fueron analizados por qRT-PCR en diferentes puntos temporales después de la transfección con una solución 100 nM de SYL040012 (24, 48 y 72 horas) de acuerdo con el protocolo antes descrito. Los datos de la cuantificación del gen ADRB2 fueron normalizados para la expresión de HPRT1 en células y tejidos de conejo y para la expresión de GAPDH en células humanas que sirvieron como un testigo positivo de la amplificación.

Ensayos de la viabilidad celular La viabilidad celular fue ensayada siguiendo el método de MTT y se ensayó en diferentes puntos temporales (24, 48 y 72 horas) después de la transfección en células MDA-MB-231 y BxPC3 utilizando el kit Cell Titer 96 Aqueous Non Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega, Mannheim, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Análisis in vi tro de la eficacia , especificidad y seguridad de SYL040012 Los niveles del mRNA de ADRB2 fueron analizados por qPCR en diferentes puntos temporales (24, 48 y 72 horas) después de la transfección de cultivos celulares de células BxPC3 o MDA-MB-231, con solución 100 nM de SYL040012 o un siRNA revuelto. Se observó una disminución que varió entre 50-70% de los niveles básales de mRNA de ADRB2, dependiendo del punto temporal (Figura 1A). En ambas líneas de células, el efecto máximo de SYL040012 fue observado 24 h después de la transfección, en este punto temporal la disminución del mRNA de ADRB2 fue de aproximadamente 50% de los niveles básales. En las células BxPC3 los niveles básales de ADRB2 fueron recuperados aproximadamente 72 h después de la transfección, mientras que en células MDA-MB-231 los niveles de mRNA en este punto se mantuvieron por debajo de los valores básales. La transfección de una secuencia revuelta de RNA no moduló los niveles ADRB2, demostrando que el efecto de SYL040012 fue especifico.

Con el fin de evaluar si la reducción en los niveles de ADRB2 tuvo un efecto sobre la viabilidad celular, se hizo un ensayo MTT en los mismos puntos temporales antes mencionados. SYL040012 no provocó algún efecto importante sobre la viabilidad celular con el tiempo (Tabla 1). Este resultado indica que la reducción de mRNA de ADRB2 en respuesta a SYL040012 no ocasionó toxicidad celular.

I : ' Tabla 1: Viabilidad celular de células MDA-MB-231 y BxPC3 después del tratamiento con una solución 100 nM de SYL040012, una solución 100 nM de una secuencia revuelta o PBS. La viabilidad celular se analizó utilizando un ensayo MTT a las 24, 42 y 72 h después del tratamiento con la solución 100 nM de SYL040012, la misma dosis de la secuencia siRNA revuelta o vehículo. Los datos representan la media ± error típico de la media de tres experimentos independientes.

Los compuestos basados en RNAi dependen de la actividad de la maquinaria del RNAi endógeno. Uno de los escollos del RNAi es que este sistema endógeno puede saturarse cuando se adiciona una cantidad grande de moléculas de RNA exógeno22. Con el objeto de evaluar el efecto de diferentes dosis de SYL040012, células BxPC3 fueron transíectadas con dosis crecientes de SYL040012 (0.001 a 100 nM). El RNA total fue aislado 24 horas después de la transfección y se determinaron los niveles de mRNA de ADRB2 por PCR en tiempo real (Figura IB). Una reducción con significado estadístico en los niveles ADRB2 se observó a una dosis de 0.5 nM. El efecto máximo se observó en respuesta a una dosis 10 nM. No se observaron diferencias significativas entre las concentraciones de 10 y 100 nm. Utilizando estos datos, se calculó el valor de la concentración inhibitoria 50 (IC50) de 9.2 nM.

La especificidad de un compuesto para su diana es crucial para la disminución de sus efectos secundarios en el entorno clínico. Se analizó el efecto de SYL040012 en los receptores de la familia adrenérgica para analizar su efecto sobre el mRNA de las proteínas que están relacionadas estructuralmente con el ADRB2. Los niveles de mRNA de los receptores adrenérgicos ADRB2, ADRB1 y ADRAlB fueron evaluados en células BxPC3 después del tratamiento con SYL040012. La Figura 1C muestra que SYL040012 puede disminuir selectivamente los niveles de mRNA de ADRB2 sin afectar significativamente los niveles de mRNA de ADRB1 o ADRAlB.

EJEMPLO 2: Estudios de estabilidad Metodos La estabilidad de SYL040012 en suero de conejo y humor acuoso de conejo se evaluó siguiendo dos métodos: un método HPLC nativo para medir la cantidad del RNA dúplex separando el RNA bicatenario a partir de cadenas sencillas no hibridadas, y un método IEX-HPLC desnaturalizante para evaluar la pureza de las cadenas sencillas dúplex y para detectar los compuestos de degradación potenciales con el fin de evaluar la estabilidad de las cadenas sencillas. Se hicieron otras pruebas como el aspecto, medición del pH y UV de acuerdo a las ediciones actuales de Farmacopeas Europea y Estados Unidos.

Estabilidad de SYL040012 Compuestos de RNA son muy fácilmente degradados por las ARNasas, por esta razón, la estabilidad del compuesto fue evaluada en su vehículo (PBS), en 1 suero de conejo y en humor acuoso de conejo.

Los resultados del estudio de estabilidad del producto medicinal SYL040012 luego de la incubación durante 24 horas a 37°C en suero de conejo y humor acuoso de conejo se muestran en la Figura 2. Estos resultados demuestran que la vida media de SYL040012 es arriba de 24 horas en el humor acuoso de conejo, mientras que la vida media en el suero de conejo es por debajo de 30 minutos.

EJEMPLO 3: Biodistribución de siRNA en el ojo de ratones GFP Metodos Conejos adultos macho [sic] C57BL/6-Tg (ACTbEGFP) de aproximadamente 8 semanas de nacidos se utilizaron para el estudio. Los ratones fueron alojados en grupos y se mantuvieron en una sala de temperatura controlada con un ciclo de 12h luz/oscuridad y acceso libre a comida y agua.

Los ojos ratones transgénicos eGFP de 6-8 semanas de nacidos fueron tratados con una dosis de 11.2 nmol/dia de siRNA de eGFP durante un periodo de tres días consecutivos. Este modelo se ha descrito ampliamente en la literatura34 y expresa abundantemente la proteína eGFP, que se detecta fácilmente por fluorescencia. La secuencia diana de RNAi utilizada fue la siguiente: 5'-EGFP GGCTACGTCCAGGAGCGCACC-3'. 48 horas después de la última aplicación, los animales fueron sacrificados y se recolectaron los ojos y se procesaron para microscopía de fluorescencia.

Biodistribución de siRNA en ra tones transgenicos de proteína verde fluorescente (GFP) Un primer paso importante en cualquier estudio de interferencia es optimizar las condiciones de la entrega de siRNA in vivo. La capacidad para detectar cambios fenotipicos o la pérdida de función en una población diana depende de la eficiencia con la que se entrega el siRNA en el tejido diana.

Para investigar si los siRNA pueden pasar a través de la córnea y acceder a la cámara anterior del ojo, un siRNA especifico de la proteina verde fluorescente fue ensayado en ratones transgénicos eGFP. La aplicación de un siRNA diseñado específicamente para eGFP, disminuyó la fluorescencia en los procesos ciliares y la red trabecular cuando se comparó con ratones no tratados (Figura 3). Este resultado indica que, por un lado, el siRNA puede acceder a la cámara anterior del ojo y, por otro lado, una vez allí, es tomado por las células de los procesos ciliares y puede disminuir la expresión del gen diana .

EJEMPLO 4: Eficacia in vivo Animales Conejos Nueva Zelanda blancos (NZW) machos, adultos (Granja San Bernardo, España y Charles River Laboratories) de aproximadamente 10 semanas se utilizaron en todos los experimentos. Los animales fueron alojados individualmente en jaulas normales en una sala de temperatura controlada con un ciclo de 12h luz/oscuridad con acceso libre a comida y agua. Los animales fueron sometidos a un examen oftálmico básico durante la semana anterior al inicio y al final de cada estudio. Se observaron los siguientes parámetros: irritación/inflamación del párpado, producción de lágrimas, tamaño de la pupila, aspecto de la córnea e irritación/inflamación de la conjuntiva.

Todos los animales fueron manejados de acuerdo con la declaración ARVO para el uso de animales en Investigación Oftálmica y de la Visión.

Medición de la IOP Se midió la IOP utilizando el tonómetro Applanation Tonometer TONO-PEN AVIA™ después de la aplicación tópica del anestésico Colircusi® (tetracaina al 0.4% + oxibuprocaina al 0.4%, Alcon) a la córnea, para evitar la incomodidad de los animales. Cada medición se realizó por triplicado y se muestra el promedio de los resultados.

Modelo de hipertensión por carga de agua por vía oral Cuatro dias antes de comenzar cada estudio se registraron cinco mediciones de la IOP con intervalos de 2 h entre mediciones. Los animales fueron posteriormente asignados a grupos experimentales distribuyendo al azar a los animales de acuerdo con los valores de la IOP. Se instilaron los compuestos en el ojo una vez al día durante un periodo de 4 dias con un volumen de dosis de 40gL por ojo que contenia 20 nmol de siNA en PBS. Se utilizó PBS como testigo negativo. Durante los primeros tres dias de la administración se registraron las mediciones básales de la IOP antes de la administración del articulo a ensayar o el vehículo. Se midió la IOP cuatro veces después de la administración con un intervalo de 2 horas.

En el cuarto dia del estudio, se registraron las mediciones básales de la IOP antes de la administración y 1 y 2 horas después de la administración. En este punto, la hipertensión fue inducida por medio de carga de agua por vía oral (60 mL/kg) en los animales en ayuno durante la noche. Después de midió la IOP un total de 10 veces con un intervalo de 25 minutos entre las mediciones.

Después de la última medición, los animales fueron sacrificados con una sobredosis de pentobarbital y es recolectaron las principales estructuras oculares y se preservaron en RNA [sic] después hasta su procesamiento.

Eficacia in vivo de SYL040012 Como primer paso para demostrar la eficacia in vivo de SYL040012, conejos Nueva Zelanda blancos fueron tratados con tres de los productos que se encuentran actualmente en tratamiento de primera linea para el glaucoma: Trusopt (dorzolamida), Xalatan (latanoprost) y timoftol (timolol). Una sola gota (40 pL) de cada uno de los compuestos se instiló en los ojos de tres grupos de conejos durante un periodo de cuatro dias consecutivos. Se obtuvieron las mediciones de la IOP cada hora durante 8 horas, comenzando una hora después de la última administración. Todos los compuestos causaron una disminución de la IOP de entre 20-35%, dependiendo del compuesto, y este efecto duró aproximadamente 6 horas (datos no mostrados). Estos experimentos confirmaron la idoneidad de este modelo animal debido a su capacidad para responder a los reguladores de la IOP.

Para evaluar el efecto de SYL040012 sobre la IOP, conejos Nueva Zelanda blancos fueron instilados con 0.3 mg/dia de SYL040012 o PBS durante un periodo de 4 dias consecutivos, en la forma de una gota de 40 mL por dia. La Figura 4A muestra que hubo una reducción de la IOP de 21.81% ± 1.55% en comparación con el grupo testigo instilado con vehículo. El efecto de SYL040012 sobre la IOP fue detectable después de dos dias de tratamiento y los valores se mantuvieron por debajo de los niveles básales hasta aproximadamente dos días después de la última aplicación. La especificidad del efecto fue evaluada haciendo el mismo experimento, administrando una secuencia revuelta en lugar del compuesto. Los resultados, que se muestran en la Figura 4B, indican que el siRNA revuelto no tuvo efecto sobre la IOP, por tanto el efecto de SYL040012 fue especifico.

La media del efecto temporal de SYL040012 se calculó como la diferencia entre la mitad del punto temporal máximo de recuperación y el tiempo en el que se logró la mitad del efecto máximo en la IOP. Los resultados de estos cálculos se muestran en la Tabla 3 e ilustran la diferencia en la media del efecto temporal de SYL040012 (91.6 h) contra Xalatan™ (5.36 h) y Trusopt™ (4.75 h).

Con el fin de analizar el efecto de SYL040012 con el tiempo, un grupo de conejos recibió dos series de cuatro aplicaciones una vez al día del compuesto a una dosis de 0.3 mg/dia, separados entre si por un periodo de tres dias libre de medicamento. La Figura 4C muestra que hubo una reducción de la IOP de 19.29 ± 0.89% y que esta disminución de la IOP se mantuvo durante el tiempo. La reducción de la IOP fue observada desde la segunda aplicación hasta aproximadamente 48 h después de la última aplicación, incluso durante el periodo libre de fármaco de tres dias. El hecho de que SYL040012 puede mantener la reducción de los niveles de IOP en este modelo animal, aún cuando no se administre el compuesto durante un periodo de hasta 72 horas es muy atractivo. Cuando se utilizan medicamentos comerciales, la reducción sostenida de IOP depende de la aplicación continua de los fármacos. Esta última característica sugiere que SYL040012 puede proteger contra el daño óptica eventual ocasionado por un efecto de reinicio de la IOP en caso de mal cumplimiento de los pacientes con el tratamiento.

EJEMPLO 5: Eficacia in vivo en un modelo animal con hipertensión ocular Para evaluar el efecto reductor de la IOP de SYL040012 en condiciones más cercanas a las condiciones patológicas observadas en glaucoma, se utilizó un modelo de sobrecarga agua por via oral en conejos Nueva Zelanda blancos. Este modelo ha sido previamente descrito por diversos autores3538. La principal ventaja de este modelo sobre otros modelos experimentales de hipertensión ocular es que se evita la administración de compuestos irritantes o téenicas que sean traumáticas para el ojo, dejando intactas las estructuras oculares. Esto permite que el ojo responda normalmente a los fármacos experimentales38.

El primer experimento fue una búsqueda del intervalo de la dosis en el que cuatro dosis diferentes de SYL040012 (0.15, 0.3, 0.6 y 0.9 mg/ojo/día) se administraron un total de 3 veces: 48, 24 y 2 horas antes de la inducción de hipertensión. Todos los tratamientos fueron aplicados en ambos ojos y se midió la IOP antes de la inducción de la hipertensión y cada 20 minutos hasta 120 minutos después de la sobrecarga por via oral. Un análisis ANOVA de dos sentidos, de mediciones repetidas de los resultados mostró un efecto con significado estadístico del tiempo (p <0.001) y del tratamiento (p <0.0001), pero no la interacción entre estos factores. Las diferencias entre cada una de las dosis y la PBS se analizaron utilizando ANOVA de un sentido con la prueba de Dunnett post-hoc. La Figura 5A muestra que SYL040012 proporciona protección significativa contra el aumento de la IOP en todas las dosis animalizadas (p <0.01 contra salina en todos los casos). El valor máximo de la media de DIOR (IOP después de la carga de agua - IOP antes de la carga de agua) en los animales tratados con SYL040012 fue de 6.6 Hg, 8.2 mHg, 4.8 m Hg y 4.3 mmHg para las dosis de 0.15, 0.30, 0.60 y 0.90 mg/dia/ojo, respectivamente contra una DI0R máxima en los animales testigo (tratados con vehículo) de 15.55 mmHg.

Con el fin de confirmar la eficacia y la especificidad de SYL040012 sobre la IOP, un grupo más grande de animales fue tratado con una dosis fija de 0.3 mg/día durante un periodo de cuatro días consecutivos. Como se observa en la Figura 5B, la carga de agua provocó un aumento de la IOP de aproximadamente 7 mmHg durante la primera hora después de la inducción de la hipertensión en animales tratados con PBS. El análisis ANOVA de 2 sentidos de mediciones repetidas de los resultados muestra un efecto importante tanto del tiempo como del tratamiento (p <0.0001 en ambos casos), pero sin interacción entre estos factores. Se hizo otro análisis por un ANOVA de un sentido con prueba de Dunnett post-hoc para comparaciones simples. Los resultados de este análisis muestran que el tratamiento con SYL040012 redujo significativamente el valor de DIOR dentro de la primera hora en comparación con los animales tratados con PBS (p <0.05 contra PBS). El efecto de SYL040012 fue especifico, ya que el tratamiento con una secuencia de siRNA revuelta no tuvo efecto sobre la IOP (p> 0.05 contra PBS).

Para garantizar más que la disminución observada en la IOP fue un reflejo de una disminución correspondiente en los niveles de mRNA de ADRB2, se analizaron los tejidos pertinentes. Los animales tratados como ya se describió fueron sacrificados inmediatamente después de la última medición de la IOP, los ojos fueron enucleados y la córnea, glándula lagrimal y cuerpo ciliar fueron separados. El RNA total fue extraído y se analizó la expresión de ADRB2 por PCR en tiempo real como se describe antes. Como se puede observar en la Figura 5C, se observó una disminución significativa en los niveles de mRNA de ADRB2 tanto en el cuerpo ciliar como en la glándula lagrimal.

EJEMPLO 6: SYL040012 en los seres humanos Individuos Treinta voluntarios sanos que tenían una IOP por debajo de 21 mmHg, agudeza visual Snellen de 20/25 o mejor y que eran de al menos 18 años de edad fueron reclutados. Todos los individuos completaron el estudio de acuerdo con el protocolo. La media ± desviación estándar de los parámetros demográficos de los individuos se muestran en la Tabla 1. Un amplio examen físico y un examen ocular se llevaron a cabo antes de la admisión en el estudio para asegurar la idoneidad de los individuos para participar en el estudio.

Diseño del estudio Se diseño un estudio clínico fase I con etiqueta a la vista, comparativo, de grupos paralelos, unicéntrico para evaluar la seguridad, tolerabilidad y biodisponibilidad de SYL040012 administrado como gotas oftálmicas. Otro objetivo del estudio fue determinar el efecto de diferentes dosis de SYL040012 sobre la IOP. En todos los casos, el fármaco fue instilado en un solo ojo elegido al azar; el otro ojo se mantuvo sin tratar y sirvió como testigo para determinar la tolerancia ocular y la seguridad. Ambos ojos fueron vigilados en un modo enmascarado.

Horario del tra tamiento Para llevar al mínimo el riesgo de oacsionar efectos adversos y de acuerdo con las Directrices sobre estrategias para identificar y mitigar riesgos para ensayos clínicos primero en humano con productos medicinales en investigación (EMEA/CHMP/SWP/28367/07), la fase de intervención se dividió en dos intervalos. El Intervalo 1 comenzó con la instilación de una dosis única de SYL040012 a un individuo que fue observado durante 72 horas. Se evaluó la tolerabilidad a las 24, 48 y 72 horas después de la instilación; cuando se cumplió el criterio de tolerabilidad 72 horas después de la instilación, se dosificó al siguiente individuo. Se siguió el mismo procedimiento para cada nuevo individuo hasta que se había administrado a seis individuos. La buena tolerabilidad y por tanto la posibilidad de incluir al siguiente voluntario fue definida como ausencia de toxicidad grado 3 o mayor de acuerdo con la escala de los Criterios de Terminología Común para Eventos Adversos v3.0. 14 se evaluó la seguridad y la tolerabilidad antes de comenzar el intervalo 2.

Durante el intervalo 2 se administró SYL040012 en instilaciones diarias durante 7 dias consecutivos. Se ensayaron dos dosis en este intervalo, cada una de las cuales fue administrada a 12 individuos. Por razones de seguridad, un primer grupo de tres individuos recibió una dosis baja (600 mg) de SYL040012; cuando se cumplió el criterio de tolerabilidad descrito previamente, se administró a los individuos restantes asignados a esta dosis. El mismo procedimiento se hizo para la dosis alta (900 g).

Todos los individuos fueron tratados en la Unidad de Investigación Clínica del hospital, lo que garantiza el cumplimiento del protocolo. La Tabla 2 muestra el diagrama de flujo.

Mediciones de la IOP Durante el intervalo 1, se midió la IOP a las 1, 2, 4, 48, y 72 horas después de la instilación utilizando tonometría de Goldmann con los individuos sentados. Durante el intervalo 2, se determinaron las curvas de la IOP antes de la primera instilación (exploración) y después de 4 días de tratamiento. En ambos casos, se midió la IOP a las 9:00, 12:00, 15:00, 18:00 y 21:00 horas. También se midió la IOP cada vez que se evaluaba la tolerancia durante los intervalos 1 y 2, 1 hora antes y después de la instilación. Las mediciones realizadas fuera de una curva de IOP se tomaron en la mañana entre 9:00 y 12:00.

Análisis estadístico La tolerancia local ocular y conjuntival después del tratamiento con SYL040012 fue evaluada enlizando la presencia y frecuencia de efectos adversos oculares 72 horas después de la instilación para el intervalo 1, y 24 horas después de la última instilación durante el intervalo 2. Las comparaciones se hicieron entre los ojos (con administración contra sin administración) utilizando la prueba de chi cuadrada. El análisis de los valores de la IOP únicos diarios después de una instilación se hizo comparando los valores obtenidos tras la instilación de SYL040012 frente al valor basal durante la exploración. El significado estadístico fue evaluado mediante la prueba t de Student pareada. El efecto de SYL040012 sobre la IOP durante el intervalo 2 fue evaluado mediante la comparación de la curva de la IOP obtenida en el día 4 con la obtenida durante la expiración. El significado estadístico fue evaluado utilizando el análisis de varianza (ANOVA) de dos sentidos, de dosis repetidas, utilizando tratamiento y hora del día como las variables y la IOP como la medida repetida seguido por una prueba de Bonferroni post hoc para evaluar el significado en cada intervalo de tiempo. Se analizaron otros parámetros (análisis clínicos, agudeza visual, duración de los síntomas) utilizando la prueba t de Student pareada o la prueba de Wilcoxon dependiendo del cumplimiento de las condiciones requeridas para utilizar cada una de estas pruebas estadísticas. P <0.05 fue considerado significativo.

Resultados : Efecto de SYL040012 sobre la IOP No se observaron diferencias importantes en la IOP entre los valores obtenidos durante la exploración y aquellos obtenidos después de una sola instilación de SYL040012. Durante el intervalo 2, la administración de SYL040012 en un horario de dosis repetidas durante un periodo de 7 dias redujo los valores de la IOP en 15 de 24 individuos sanos, independientemente de la dosis utilizada. La dosis de 600 mg de SYL040012 ocasionó una disminución general con significado estadístico de la IOP después de 4 días de la administración; el análisis de datos post hoc mostró un efecto importante de SYL040012 sobre las mediciones obtenidas a las 15:00 horas (Fig. 6a). Cinco voluntarios que recibieron esta dosis mostraron una media de la reducción de los valores de IOP que superaron el 20% en el día 4 en comparación con los valores durante la exploración. Se realizó un análisis por separado en este subgrupo y se encontró un efecto con significado estadístico global sobre la IOP; el análisis post hoc reveló que las diferencias fueron estadísticamente significativas en todos intervalos de tiempo estudiados (Fig.6B). Vale la pena señalar que el valor de la IOP basal en estos cinco individuos fue superior a los valores básales de la IOP en otros individuos (16.2 ± 2.9 mmHg contra 14.9 ± 2.8 mmHg, respectivamente). Esta mayor respuesta con mayores valores de IOP ha sido reportada para otros fármacos anti glaucoma.39 EJEMPLO 7: Tratamiento de hipertensión ocular o glaucoma de ángulo abierto en adultos: un ensayo de la eficacia de múltiples dosis, con placebo como comparativo, doble enmascarado Pacientes Se reclutó un total de 80 individuos varones y mujeres en buen o regular estado general de salud, tal y como lo evaluó el investigador, en edad > 18 años, con un historial previo o recién diagnosticados con IOP elevada (> 21 mmHg) con o sin glaucoma de ángulo abierto en ambos ojos. Para ser incluidos en este estudio debían tener un resultado normal, o resultado típico para glaucoma de ángulo abierto de las siguientes evaluaciones en ambos ojos: - Campo visual 24-2 o equivalente (prueba SITA de campo visual de Humphrcy 24-2, aproximadamente 5 minutos por ojo).

- Tomografia de coherencia óptica (OCT).

- Mejor agudeza visual corregida >0.5 (20/40) en la tabla de Snellen, o <0.3 logMAR.

- Prueba de Schirmer (lagrimación).

- Fundoscopia.

El principal objetivo de este ensayo es determinar la tolerabilidad sobre la superficie ocular (córnea y conjuntiva) y efecto sobre la presión intraocular después de una dosis diaria de SYL040012 durante 14 dias de tratamiento.

Los objetivos secundarios incluyen la evaluación de la tolerabilidad local después de cada dosis, tolerabilidad sistémica (efecto sobre los parámetros de laboratorio, examen físico, signos vitales y electrocardiograma), y cambios (si los hay) del fondo ocular o agudeza visual, posiblemente relacionada con el producto en investigación.

Periodo basal Hasta 30 días antes de la primera administración del producto en investigación, los individuos se inscriben para su elegibilidad para participar en el periodo de tratamiento del ensayo clínico. Si un medicamento anti-glaucoma requiere lavado, este periodo puede ser más largo. Se permite la prescripción temporal de la medicación anti-glaucoma que requiera un lavado corto. Si al comienzo del periodo de referencia el paciente está con medicamento anti glaucoma con lavado de varias semanas (véase la Sociedad Europea de Glaucoma, nota al pie del diagrama de flujo del estudio), el investigador puede prescribir otro medicamento anti-glaucoma con un tiempo de lavado corto con el fin de evitar que los ojos estén sin medicamento reductor de la IOP durante varias semanas.

Periodo de tra tamiento En el Día 1 los individuos se asignaron al azar para recibir 80 mg de SYL040012, 300 pg de SYL040012, 900 pg de SYL040012 o placebo en una relación de 1:1:1:1 para administrarlos en gotas oftálmicas.

Los individuos regresan cada día (incluyendo días festivos y fines de semana) al sitio para la administración y evaluación del producto en investigación. Los individuos reciben 1 dosis del producto en investigación una vez al día en ambos ojos durante 14 dias.

Visita de seguimiento La evaluación final se llevará a cabo en la visita de seguimiento que se lleva a cabo 4 a 7 dias después de la última administración del producto en investigación (a partir de 96 horas después de la última administración [4 dias] + 3 dias).

Para determinar el efecto de SYL040012 sobre la IOP de los pacientes, se obtiene una curva de 24 horas de las mediciones de la IOP con un tonómetro de Goldmann el dia anterior al comienzo del tratamiento, y en el dia 14. Los intervalos temporales se ajustan a una tabla de tiempos tradicional para mediciones de la curva de la IOP (09:00, 12:00, 15:00 y 18:00 y a las 9:00 el dia siguiente). Además se hacen mediciones de IOP simples en el dia 1, 7 y 15, y también durante la visita de seguimiento que tiene lugar entre el 4 y 7 dias después de recibir la última administración.

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Claims (26)

1. REIVINDICACIONES Un método para tratar un trastorno ocular caracterizado por elevación de la presión intraocular (IOP) que coneiste en administrar por via tópica a la superficie de la córnea del ojo de un paciente que necesite de éste una molécula de ácido nucleico interferente corta (siNA) que comprende la secuencia de nucleótidos de ID SEC NO: 3 a una dosis de entre aproximadamente 0.3 mg y aproximadamente 0.9 mg. Un método para tratar un trastorno ocular caracterizado por elevación de la presión intraocular (IOP), que consiste en administrar por via tópica a la superficie de la córnea del ojo de un paciente en necesidad de éste, una composición que comprende entre aproximadamente 0.3 mg y 0.9 mg de SYL040012 en salina amortiguada con fosfato (PBS). El método de la reivindicación 1 en donde el siNA se administra una vez por día. El método de la reivindicación 1 en donde el siNA se administra en un volumen de entre aproximadamente 30 pL y aproximadamente 40 pL. 5. El método de la reivindicación 1 en donde el siNA se entrega al ojo con un gotero. 6. El método de la reivindicación 1 en donde la IOP del paciente se reduce entre aproximadamente 25% y aproximadamente 30% en comparación con la IOP del paciente antes de la administración del siNA. 7. El método de la reivindicación 1, en donde el siNA proporciona una disminución sostenida de la IPO que dura más de 24 horas después de la administración del siNA. El método de la reivindicación 1, en donde la disminución de la IOP está presente durante al menos 8 horas. 9. El método de la reivindicación 1 en donde la disminución de la IOP persiste durante al menos 2 dias. 10. El método de la reivindicación 1, en donde el siNA es ácido ribonucleico interferente corto (siRNA). 11. El método de la reivindicación 10, en donde el siRNA se RNA bicatenario (dsRNA). 12. El método de la reivindicación 10, en donde el siRNA es RNA de horquilla corto (shRNA). 13. El método de la reivindicación 1, en donde el siNA comprende al menos un oligonucleótido modificado. 14. El método de la reivindicación 1, en donde el siNA comprende al menos un enlace entre dos nucleótidos que no es un enlace fosfodiéster. 15. El método de la reivindicación 1, en donde el trastorno ocular se selecciona del grupo que consiste en glaucoma de ángulo abierto, glaucoma de cierre angular y glaucoma congénito. 16. El método de la reivindicación 1, en donde el siNA es de 40 nucleótidos o menos. 17. El método de la reivindicación 10, en donde el siNA se híbrida con su complemento para formar un dsRNA. 18. El método de la reivindicación 10, en donde el dsRNA tiene un dinucleótido en el extremo 3' colgante. 19. El método de la reivindicación 18, en donde el dinucleótido colgante se forma de nucleótidos de timidina. 20. El método de la reivindicación 1, en donde más de un tipo de siNA se administra al paciente. 21. El método de la reivindicación 20, en donde el más de un tipo de siNA disminuye o inhibe la expresión del mismo gen. 22. El método de la reivindicación 1, en donde dicha molécula siNA es no modificada. 23. Un dispensador para dispensar una dosis farmacéutica en forma liquida, dicho dispensador consistiendo en un envase para contener una carga de dicho liquido, y un orificio para dispensar una gota de dicho liquido de tamaño predeterminado, en donde dicho liquido comprende entre aproximadamente 0.3 mg y aproximadamente 0.9 mg de un siNA que comprende una ID SEC NO: 3, y como una opción, uno o más diluyentes farmacéuticamente aceptables y como una opción uno o más excipientes. 24. Un dispensador para dispensar una dosis farmacéutica en forma liquida, el dispensador consiste en un envase para contener una carga de dicho liquido y un orificio para dispensar una gota de dicho liquido de tamaño predeterminada, en donde dicho liquido contiene entre aproximadamente 0.3 mg y aproximadamente 0.9 mg de un SYL040012 en una solución que comprende salina amortiguada con fosfato a una concentración de entre aproximadamente 7.5 mg/mL y aproximadamente 22.5 mg/mL. 25. Un kit que comprende: (A) un dispensador para dispensar una dosis farmacéutica en forma liquida, dicho dispensador consistiendo en un envase para contener una carga de dicho liquido y un orificio para dispensar una gota de dicho liquido de tamaño predeterminada; y (B) las instrucciones escritas que especifican que entre aproximadamente 0.3 mg y aproximadamente 0.9 mg de un siNA que comprende la ID SEC NO: 1, en forma de una gota, ha de aplicarse a cada ojo. 26. Un kit que comprende: (A) un dispensador para dispensar una dosis farmacéutica en forma liquida, dicho dispensador consistiendo en un envase para contener una carga de dicho liquido y un orificio para dispensar una gota de dicho liquido de tamaño predeterminada; y (B) las instrucciones escritas que especifiquen que entre aproximadamente 0.3 mg y aproximadamente 0.9 mg de SYL040012 en una concentración final de entre aproximadamente 7.5 mg/mL y aproximadamente 22.5 mg/mL en PBS, en forma de una gota, debe aplicarse a cada ojo. El uso de una molécula de ácido nucleico interferente corto (siNA) que comprende una secuencia nucleotidica de ID SEC NO: 3 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno ocular caracterizado por elevación de la presión intraocular (IOP) en donde dicho siRNA se administra por vía tópica a la superficie corneal del ojo de un paciente en necesidad del mismo a una dosis de entre aproximadamente 0.3 mg y aproximadamente 0.9 mg. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a los métodos, composiciones y dosis que disminuyen la IOP del ojo, que comprende una molécula de RNA bicatenaria de 19 nucleótidos.