BRPI0711950A2

BRPI0711950A2 - tratamento para o dobramento inadequado da proteìna

Info

Publication number: BRPI0711950A2
Application number: BRPI0711950-0A
Authority: BR
Inventors: William E Balch; Paul G Lapointe; John D Venable; Xiaodong Wang; John R Yates
Original assignee: Scripps Research Inst
Priority date: 2006-05-19
Filing date: 2007-05-21
Publication date: 2011-12-13
Also published as: CA2653052A1; KR20090019790A; US20080014191A1; WO2007137237A9; WO2007137237A2; AU2007253694A1; MX2008014437A; EP2021352A2; WO2007137239A2; WO2007137237A3; EP2021352A4; JP2009537179A

Abstract

TRATAMENTO PARA O DOBRAMENTO INADEQUADO DA PROTEìNA. A presente invenção é dirigida à prevenção das conseqüências do dobramento inadequado das proteínas, tais como aquelas associadas com as doenças por dobramento inadequado de uma proteína. Proporcionam-se métodos de tratamento que envolvem administrar um agente que diminui o nível do Ahal da ATPase da proteína de choque térmico e/ou moléculas relacionadas com função similar. Tais métodos podem resultar no resgate do dobramento, tráfego, e função das proteínas com cinética de dobramento sub-ótima. Proporcionam-se também métodos de exame para dentificar agentes para o tratamento de doenças por dobramento inadequado de uma proteína.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TRATAMEN- TO PARA O DOBRAMENTO INADEQUADO DA PROTEÍNA".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório U.S. Nº de Série 60/801.840, depositado em 19 de maio de 2006, do Pedido Provisó- rio U.S. Nº de Série 60/815.494, depositado em 21 de junho de 2006, e do Pedido Provisório U.S. Nº de Série 60/859.890, depositado em 17 de no- vembro de 2006, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.

DECLARAÇÃO CONCERNENTE À PESQUISA OU AO DESENVOLVIMEN- TO FEDERALMENTE PATROCINADA

Esta invenção foi feita, em parte, com o suporte do governo sob as Permissões dos Institutos de Saúde GM42336 e GM45678/NIH RR11823. O governo tem certos direitos na invenção.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DO MATERIAL APRESENTADO EM UM DISCO COMPACTO

A Listagem de Seqüências, que é uma parte da presente divul- gação, inclui um arquivo de computador "Sequence Listing_ST25.TXT" ge- rado pelo software Patentln Versão 3.4 do Escritório de Marcas e Patentes dos EUA, compreendendo as seqüências de nucleotídeos e/ou aminoácidos da presente invenção. A matéria da Listagem de Seqüências é incorporada neste documento por referência em sua totalidade. CAMPO

A presente invenção refere-se, em geral, aos métodos para o tratamento de doenças por dobramento inadequado de proteínas. Em parti- cular, a presente invenção diz respeito aos métodos de tratamento usando moduladores do gene Ativador da ATPase da Proteína de Choque Térmico 90 (Aha). Por exemplo, a invenção proporciona composições e métodos de tratar os distúrbios associados com a atividade indesejada do Aha por admi- nistração do RNA de fita dupla (dsRNA), o qual infra-regula a expressão do Aha.

INTRODUÇÃO O retículo endoplasmático (ER) é um ambiente de dobramento especializado, no qual quase um terço das proteínas codificadas por um ge- noma eucariótico é translocado e dobrado como proteínas secretadas do lúmen ou proteínas de transmembrana. As proteínas são exportadas do ER pelo mecanismo do complexo de concatâmero Il (COPII), o qual gera vesícu- las de transporte para a distribuição da carga para o Golgi (Lee e col., Annu. Rev Cell Dev. Biol. 20, 87 (2004)). As vias de dobramento associado ao ER (ERAF) estão também coordenadas com as vias de degradação associada com o ER (ERAD), pelo que as proteínas dobradas inadequadamente são alvejadas para a translocação para o sistema de proteassoma citosólico (Wegele e col., Rev Physiol Biochem Pharmacol 151, 1 (2004); Young e col., Trends Biochem. Sei. 28, 541 (2003)).

Ocorrem diversas doenças por dobramento inadequado, nas quais as variantes da carga do lúmen ou da transmembrana não se dobram adequadamente, não conseguem se acoplar ao mecanismo de exportação pelo COPII e são degradadas no ER, resultando em perda de fenótipo de função. A fibrose cística (CF) é uma doença infantil herdada, desencadeada principalmente por dobramento defeituoso e exportação do regulador da condutância de transmembrana de CF (CFTR; um canal de cloreto regulado por cAMP de múltiplos domínios, encontrado na membrana apical de epité- lios polarizados cobrindo muitos tecidos) a partir do ER (Riordan, Annu. Rev. Physiol. 67, 701 (2005)). O CFTR consiste em dois domínios de transmem- brana (TMD 1 e 2), separados biossinteticamente por domínios NeC termi- nais orientados do citosol, e nos domínios NBD1, R e NBD2 que regulam a condutância do canal. O transporte do CFTR envolve chaperonas que orien- tam o dobramento e a exportação a partir do ER (Amaral, J. Mol. Neurosci. 23, 41 (2004); Wang e col., J. Struct. Biol. 146, 44 (2004)), bem como proteí- nas adaptadoras que orientam o tráfego a partir do Golgi trans (Cheng e col., J. Biol. Chem. 280, 3731 (2005)) e o reciclo através das vias endocíticas pa- ra manter o nível adequado de atividade do canal de cloreto na superfície celular (Gentzsch e col., Mol. Biol. Cell 15, 2684 (2004); Swiatecka-Urban e col., J. Biol. Chem. 280, 36762 (2005)). Mais de 90% dos pacientes com CF carregam pelo menos um alelo da remoção de Phe 508 (AF508) no domínio de ligação ao ATP NBD1 citosólico do CFTR, resultando em formas graves da doença. O AF508 atra- palha o dobramento do CFTR no ER (Qu e col., J. Bioenerg. Biomembr. 29, 483 (1997); Riordan1 supra). O dobramento do AF508 NBD1 é descrito ser cineticamente prejudicado (Qu e col., supra; Qu e col., J. Biol. Chem. 272, 15739 (1997); Qu e Thomas, J. Biol. Chem. 271, 7261 (1996)). Como uma conseqüência deste defeito energético no dobramento, o AF508 não conse- gue obter um duplicação do alelo selvagem no ER, não consegue acoplar-se ao mecanismo de exportação do ER pelo COPII (Wang e col., supra) e é alvejado para a degradação associada com o ER (ERAD) (Nishikawa e col., J Biochem (Tóquio) 137, 551 (2005)). Assim, seria desejável proporcionar algum meio para impedir as conseqüências do dobramento inadequado do CFTR com AF508 no tratamento de CF.

O Ativador da ATPase da Proteína de Choque Térmico 90 (A- ha1) é um ativador da atividade da ATPase da Hsp90 e é capaz de estimular a atividade inerente da Hsp90 da levedura por 12 vezes e da Hsp90 humana por 50 vezes (Panaretou, B., e col., Mol. Cell 2002, 10:1307-1318). Os estu- dos bioquímicos mostraram que o Aha 1 se liga à região do meio da Hsp90 (Panaretou e col., 2002, supra, Lotz, G. P., e col., J. Biol. Chem. 2003, 278:17228-17235), e os estudos estruturais recentes do complexo de núcleo de Aha1-Hsp90 sugerem que a co-chaperona promove uma mudança con- formacional no laço catalítico do segmento do meio (370-390) da Hsp90 que libera o Arg380 catalítico e facilita a sua interação com o ATP no domínio de ligação ao nucleotídeo N terminal (Meyer, P., e col., EMBO J. 2004, 23:511- 519).

A chaperona molecular Proteína de choque térmico 90 (Hsp90) é responsável pela ativação in vivo ou pela maturação de proteínas clientes específicas (Picard, D., Cell Mol. Life Sei. 2002, 59:1640-1648; Pearl, L. H., e Prodromou, C., Adv. Protein Chem. 2002, 59:157-185; Pratt, W. B., e Toft, D. O., Exp. Biol. Med. 2003, 228:111-133; Prodromou, C., e Pearl, L. H., Curr. Câncer Drug Targets 2003, 3:301-323). A atividade da ATPase èssen- cial da Hsp90 é crucial para tal ativação (Panaretou, B., e col., EMBO J. 1998, 17:4829-4836), a qual orienta um ciclo conformacional envolvendo a associação transiente dos domínios de ligação aos nucleotídeos N terminais dentro do dímero de Hsp90 (Prodromou, C., e col., EMBO J. 2000, 19:4383- 4392).

Como uma chaperona molecular, a HSP90 promove a matura- ção e mantém a estabilidade de um grande número de proteínas clientes instáveis de modo conformacional, a maioria das quais está envolvida em processos biológicos que estão freqüentemente desordenados dentro das células de tumor, tais como a transdução de sinal, o progresso do ciclo celu- lar e a apoptose. Como um resultado, e em contraste com as outras subs- tâncias terapêuticas alvejadas moleculares, os inibidores da HSP90 atingem uma atividade anticâncer promissora através do rompimento simultâneo de muitos substratos oncogênicos dentro das células de câncer (Whitesell L, e Dai C., Future Oncol. 2005; 1:529-540; WO 03/067262). Além disso, a HSP90 tem estado implicada na degradação do Regulador da Condutância de Transmembrana de Fibrose Cística (CFTR). As mutações no gene do CFTR resultam no dobramento defeituoso e na ubiquinação da proteína co- mo uma conseqüência da atividade da ATPase da HSP90. Após a ubiquiti- nação, o CFTR é degradado antes que ele possa atingir o seu sítio de ativi- dade. A falta de CFTR ativo então resulta no desenvolvimento de fibrose cística em pacientes humanos tendo tal mutação. Portanto, a inibição da ati- vidade da HSP90 pode ser benéfica para os pacientes sofrendo de câncer ou Fibrose Cística.

A Hsp90 constitui cerca de 1-2% da proteína celular total (Pratt, W. B., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1997, 37:297-326), e a inibição de tais quantidades grandes de proteína por meio de um antagonista ou inibidor potencialmente requereria a introdução de quantidades excessivas do inibi- dor ou antagonista em uma célula. Uma abordagem alternativa é a inibição dos ativadores da atividade da ATPase da HSP90, tais como o Aha1, que estão presentes em quantidades menores. Pela infra-regulação da quantida- de de Ahal presente na célula, a atividade da HSP90 pode ser diminuída substancialmente.

Existe uma homologia de seqüências significativa entre o Aha 1 de Homo sapiens (NM_012111.1), de Mus musculus (NM_146036.1) e de Pan trogloditas (XM_510094.1). Um homólogo de rattus norvegicus claro do Aha 1 não tinha sido identificado; entretanto, há um gene de Rattus norvegi- cus (XM_223680.3) que tinha sido chamado homólogo do ativador da ATPa- se da proteína de choque térmico 2 (Ahsa 2) na base da sua homologia de seqüência com o Ahsa 2 de levedura. A sua seqüência é homóloga ao gene de cDNA RIKEN de mus musculus 1110064P04 (NM_172391.3), o qual é, por sua vez, similar na seqüência ao Aha 1 de Aus musculos, exceto pelo truncamento N terminal. Um Ahsa 2 de homo sapiens (NM_152392.1) tinha também sido predito, porém a homologia da seqüência é limitada. As fun- ções destes três últimos genes não tinham sido suficientemente elucidadas. Entretanto, existe uma região na qual todas as seqüências acima menciona- das são idênticas, e que pode ser usada como o alvo para os agentes de RNAi. Ela pode ser vantajosa para inibir a atividade de mais do que um gene Aha.

Recentemente, o dsRNA foi mostrado bloquear a expressão do gene em um mecanismo regulador altamente conservado, conhecido como RNA interferente (RNAi). O WO 99/32619 (Fire e col.) divulga o uso de um dsRNA de pelo menos 25 nucleotídeos de comprimento para inibir a expres- são dos genes em C. elegans. O dsRNA também foi mostrado degradar o RNA alvo em outros organismos, incluindo as plantas (ver, p.ex., WO 99/53050, Waterhouse e col.; e WO 99/61631, Heifetz e col.), a Drosophila (ver, p.ex., Yang, D., e col., Curr. Biol. (2000) 10:1191-1200), e os mamíferos (ver WO 00/44895, Limmer; e DE 101 00 586.5, Kreutzer e col.). Este meca- nismo natural agora se tornou o foco para o desenvolvimento de uma nova classe de agentes farmacêuticos para tratar os distúrbios que são causados pela regulação anormal ou indesejada de um gene.

Apesar dos avanços significativos no campo do RNAi e dos a- vanços no tratamento de processos patológicos mediados pela HSP90, per- manece uma necessidade por agentes que possam atenuar seletiva ê efici- entemente a atividade da ATPase da HSP90, por exemplo, usando o meca- nismo de RNAi próprio da célula. Tais agentes podem possuir tanto atividade biológica alta quanto estabilidade in vivo, e podem inibir eficazmente a ex- pressão de um gene Aha alvo, tal como o Aha1, para uso no tratamento de processos patológicos mediados direta ou indiretamente pela expressão do Aha, p.ex., expressão do Aha1. Tais agentes podem também inibir efetiva- mente uma atividade da proteína de Ahal funcional, p.ex., a atividade do ativador da ATPase da proteína de choque térmico.

RESUMO

Desse modo, os presentes inventores tiveram êxito em descobrir que os níveis decrescentes de Ahal funcional, uma co-chaperona e ativador da ATPase de proteína de choque térmico (Hsp), podem resultar na estabili- zação energética da variante AF508 do CFTR, associada com a CF. Isto re- sulta em resgate de dobramento, tráfego, e função do AF508.

Assim, a presente invenção inclui composições e métodos para tratar uma doença resultante do dobramento inadequado da proteína. As composições podem geralmente compreender um dsRNA, vetor, RNA de grampo ("hairpin") curto (shRNA), molécula pequena, anticorpo, ácido nu- cléico anti-sentido, aptâmero, ribozima, e qualquer combinação destes para inibir a expressão da proteína de Aha funcional em uma célula.

Por exemplo, o dsRNA pode compreender uma fita sentido e uma fita anti-sentido, onde a dita fita anti-sentido compreende uma região de complementaridade tendo uma seqüência substancialmente complementar a uma seqüência-alvo de Aha, onde a dita seqüência-alvo é menos do que 30 nucleotídeos de comprimento, onde a dita fita sentido é substancialmente complementar à dita fita anti-sentido, e onde o dito dsRNA, no contato com uma célula expressando a proteína de Aha funcional, inibe a expressão da proteína de Aha funcional por pelo menos 20%. Em diversos aspectos, a seqüência-alvo de Aha pode compreender uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12-56. Em um outro aspecto, o dsRNA pode compreender uma fita sentido tendo uma seqüência seleciona- da a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEO ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, e SEQ ID NO: 145; e uma fita anti- sentido complementar à fita sentido tendo uma seqüência selecionada a par- tir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, e SEQ ID NO: 146.

Em um outro exemplo, o vetor para expressar um shRNA para inibir a expressão do Ahal funcional em uma célula pode compreender uma fita sentido, um Iigador de grampo, e uma fita anti-sentido. Em diversos as- pectos, a fita sentido pode compreender uma região de complementaridade tendo uma seqüência substancialmente complementar a uma seqüência- alvo de Aha1 onde a dita seqüência-alvo é menos do que 30 nucleotídeos de comprimento, a fita anti-sentido pode ser substancialmente complementar à dita fita sentido, e o dsRNA, no contato com uma célula expressando a pro- teína de Aha funcional, pode inibir a expressão da proteína de Aha funcional por pelo menos 20%. Em diversos aspectos, a seqüência-alvo de Aha pode compreender uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12-56. Em um outro aspecto, o vetor pode compreender uma fita sentido tendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, e SEQ ID NO: 151; e uma fita anti- sentido tendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, e SEQ ID NO: 152.

Em um outro exemplo, o shRNA para inibir a expressão da pro- teína de Ahal funcional em uma célula, pode compreender uma região de complementaridade tendo uma seqüência substancialmente complementar a uma seqüência-alvo de Aha, onde a dita seqüência-alvo é menos do que 30 nucleotídeos de comprimento, e onde o dito shRNA, no contato com uma célula expressando a proteína de Aha funcional, inibe a expressão da prote- ína de Aha funcional por pelo menos 20%. Em diversos aspectos, a seqüên- cia-alvo de Aha pode compreender uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12-56. Em um outro aspecto, o shRNA pode compreender uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, e SEQ ID NO: 155;

A invenção também proporciona uma célula ou população de células compreendendo o dsRNA, o vetor e/ou o shRNA.

Em um outro exemplo, o anticorpo pode especificamente ligar o Ahal funcional, o sítio de ligação à ATPase da Hsp90 para o Ahal funcional, e/ou o complexo de Ahal funcional-ATPase de Hsp90.

Em mais um outro exemplo, o agente pode incluir qualquer com- binação de uma molécula pequena, um anticorpo, um ácido nucléico anti- sentido, um aptâmero, um dsRNA, e uma ribozima.

A invenção também proporciona um método de tratar uma doen- ça associada com o dobramento inadequado de uma proteína. O método pode compreender a administração a um paciente que necessite dele de uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos um agente que di- minua os níveis intracelulares da proteína de Ahal funcional. Em diversos aspectos, o agente pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em - uma molécula pequena, um anticorpo, um ácido nucléico anti-sentido, um aptâmero, um siRNA, uma ribozima, e suas combinações. Em diversos as- pectos, a doença pode incluir a fibrose cística (CF), a síndrome de Marfan, a doença de Fabry, a doença de Gaucher1 a retinite pigmentosa 3, a doença de Alzheimer1 a diabete Tipo II, a doença de Parkinson e a doença de Creutzfeldt-Jakob. Em um outro aspecto, a proteína dobrada inadequada- mente pode ser um CFTR dobrado inadequadamente. Em mais um outro aspecto, a proteína dobrada inadequadamente pode ser uma proteína de AF508.

O método pode também incluir a administração a um paciente que necessite dele de uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo me- nos um inibidor de dsRNA da expressão do Ahal funcional, o dito dsRNA compreendendo uma fita sentido e uma fita anti-sentido. Em diversos aspec- tos, a fita anti-sentido pode compreender uma região de complementaridade tendo uma seqüência substancialmente complementar a uma seqüência- alvo de Aha, onde a dita seqüência-alvo é menos do que 30 nucleotídeos de comprimento, a fita sentido é substancialmente complementar à dita fita anti- sentido, e o dsRNA, no contato com uma célula expressando a proteína de Aha funcional, inibe a expressão da proteína de Aha funcional por pelo me- nos 20%. Em diversos aspectos, a doença pode incluir a fibrose cística (CF), a síndrome de Marfan, a doença de Fabry, a doença de Gaucher, a retinite pigmentosa 3, a doença de Alzheimer, a diabete Tipo II, a doença de Parkin- son e a doença de Creutzfeldt-Jakob. Em um outro aspecto, a proteína do- brada inadequadamente pode ser um CFTR dobrado inadequadamente. Em mais um outro aspecto, a proteína dobrada inadequadamente pode ser uma proteína de AF508.

O método pode também incluir a administração a um paciente que necessite dele de uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo me- nos um inibidor de dsRNA da expressão do Ahal funcional. Em diversos aspectos, o inibidor de dsRNA pode compreender uma seqüência seleciona- da na base a) do dsRNA compreendendo uma seqüência de fita sentido de cerca de 19 nucleotídeos a cerca de 25 nucleotídeos e uma seqüência de fita anti-sentido de cerca de 19 nucleotídeos a cerca de 25 nuclôstídeosreb) a seqüência de fita sentido ou seqüência de fita anti-sentido compreende não mais do que 15 nucleotídeos contíguos idênticos a uma seqüência con- tígua compreendida por uma região não traduzida em 5', uma região não traduzida em 3', um intron ou um exon de qualquer gene ou mRNA diferente do Ahal funcional. Em diversos aspectos, a doença pode incluir a fibrose cística (CF), a síndrome de Marfan, a doença de Fabry, a doença de Gau- cher, a retinite pigmentosa 3, a doença de Alzheimer, a diabete Tipo II, a doença de Parkinson e a doença de CreutzfeIdt-Jakob. Em um outro aspecto, a proteína dobrada inadequadamente pode ser um CFTR dobrado inade- quadamente. Em mais um outro aspecto, a proteína dobrada inadequada- mente pode ser uma proteína de AF508.

Um método da invenção pode também incluir o exame de um agente para tratar uma doença associada com o dobramento inadequado de uma proteína. Em diversos aspectos, o método pode compreender propor- cionar uma célula ou população de células expressando o Ahal funcional; administrar um agente candidato à célula ou população de células; quantifi- car a atividade do Ahal funcional na célula ou população de células; e de- terminar se o agente candidato diminui a atividade do Ahal funcional na cé- lula ou população de células, pelo que uma diminuição na atividade do Ahal funcional é indicativa da redução do dobramento inadequado da proteína. Em diversos aspectos, o agente candidato pode ser um dsRNA, o qual inibe a expressão do Ahal funcional. Em um outro aspecto, o dsRNA pode com- preender a) uma seqüência de cerca de 19 nucleotídeos a cerca de 25 nu- cleotídeos, e b) a seqüência compreende não mais do que 15 nucleotídeos contíguos idênticos a uma seqüência contígua compreendida por uma região não traduzida em 5', uma região não traduzida em 3', um intron ou um exon de qualquer gene ou mRNA diferente de um gene ou mRNA de Aha. Em diversos aspectos, o gene ou mRNA de Aha é um gene ou mRNA de Aha humano. Em diversos aspectos, a doença pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em fibrose cística (CF), síndrome de Marfan, doença de Fabry, doença de Gaucher, retinite pigmentosa 3, doença de Alzheimer, dia- bete Tipo II, doença de Parkinson e doença* de- Creutzfeldt-Jakob. Em um outro aspecto, a proteína dobrada inadequadamente pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em um CFTR dobrado inadequadamente, uma fibriiina dobrada inadequadamente, uma alfa galactosidase dobrada inade- quadamente, uma beta glicocerebrosidase dobrada inadequadamente, uma rodopsina dobrada inadequadamente, um amilóide beta e tau agregado, uma amilina agregada, uma sinucleína alfa agregada e um priônio agregado. Em mais um outro aspecto, a proteína dobrada inadequadamente pode ser um CFTR dobrado inadequadamente. E em um outro aspecto, a proteína dobrada inadequadamente pode ser uma proteína de AF508.

O método de exame pode também compreender proporcionar uma célula ou população de células que expresse o Ahal funcional; adminis- trar um agente candidato à célula ou população de células; quantificar o complexo de Hsp90/ADP, o complexo de Hsp90/ATP ou uma combinação deles na célula ou população de células; e determinar se o agente candidato diminui a quantidade de complexo de Hsp90/ADP, complexo de Hsp90/ATP ou da combinação deles na célula ou população de células, pelo que uma diminuição na quantidade de complexo de Hsp90/ADP ou complexo de Hsp90/ATP é indicativa da diminuição do dobramento inadequado da proteí- na. Em diversos aspectos, o agente candidato pode ser um dsRNA, o qual inibe a expressão do Ahal funcional. Em um outro aspecto, o dsRNA pode compreender a) uma seqüência de cerca de 19 nucleotídeos a cerca de 25 nucleotídeos, e b) a seqüência compreende não mais do que 15 nucleotí- deos contíguos idênticos a uma seqüência contígua compreendida por uma região não traduzida em 5', uma região não traduzida em 3', um intron ou um exon de qualquer gene ou mRNA diferente de um gene ou mRNA de Aha. Em mais um outro aspecto, o gene ou mRNA de Aha pode ser um gene ou mRNA de Aha humano. Em diversos aspectos, a doença pode ser selecio- nada a partir do grupo que consiste em fibrose cística (CF), síndrome de Marfan, doença de Fabry, doença de Gaucher, retinite pigmentosa 3, doença de Alzheimer, diabete Tipo II, doença de Parkinson e doença de Creutzfeldt- Jakob. Em um outro aspecto, a proteína dobrada inadequadamente pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em um CFTR dobrado inadequa- damente, uma fibrilina dobrada inadequadamente, uma alfa galactosidase dobrada inadequadamente, uma beta glicocerebrosidase dobrada inadequa- damente, uma rodopsina dobrada inadequadamente, um amilóide beta e tau agregado, uma amilina agregada, uma sinucleína alfa agregada e um priônio agregado. Em mais um outro aspecto, a proteína dobrada inadequadamente pode ser um CFTR dobrado inadequadamente. Em um outro aspecto, a pro- teína dobrada inadequadamente pode ser uma proteína de AF508.

Estas e outras características, aspectos e vantagens dos pre- sentes ensinamentos tornar-se-ão melhor entendidos com referência à des- crição, exemplos e reivindicações em anexo que se seguem. DESENHOS

Aqueles de habilidade na técnica entenderão que os desenhos descritos abaixo são para propósitos ilustrativos somente. Os desenhos não são pretendidos para limitar o escopo dos presentes ensinamentos de modo algum.

Figura 1. Representação do interactoma do CFTR.

Figura 2. (A) Representação da rede de dobramento do ER, e (B) imunoblot representando os níveis de expressão da proteína em células que expressam WT e AF508.

Figura 3. Série de gráficos de barras representando o efeito da co-chaperona de Hsp90 p23 sobre o dobramento e a exportação do AF508 a partir do ER.

Figura 4. Série de gráficos de barras representando o efeito da co-chaperona de Hsp90 FKBP8 sobre o dobramento e a exportação do AF508 a partir do ER.

Figura 5. Série de gráficos de barras representando o efeito da co-chaperona de Hsp90 HOP sobre o dobramento e a exportação do AF508 a partir do ER.

Figura 6. Série de gráficos de barras ilustrando que a exportação do AF508 para a superfície da célula pode ser resgatada pela infra- regulação do Ahal funcional.

- Figura-Tr Gráfico de linha e dispersão e um gráfico de barras mostrando o efeito do Ahal de dsRNA sobre o efluxo de iodeto pela linha- gem celular CFBE410-.

Figura 8. Série de representações das interações entre chapero- na/co-chaperona de Hsp90 orientando o dobramento do CFTR.

Figura 9. Ilustração (usando imunoblot) dos efeitos do Ahal de dsRNA sobre a Hsp90.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Abreviações e Definições

Para facilitar o entendimento da invenção, os diversos termos e abreviações como usados neste documento são definidos abaixo, como se segue:

Cada um de "G," "C," "A", "T" e "U" (independente de se escrito em letras maiúsculas ou minúsculas) geralmente significa um nucleotídeo que contém guanina, citosina, adenina, timina, e uracil como uma base, res- pectivamente. Entretanto, será entendido que o termo "ribonucleotídeo" ou "nucleotídeo" pode também se referir a um nucleotídeo modificado, como adicionalmente detalhado abaixo, ou uma porção de substituição represen- tante. A pessoa versada tem bastante consciência que a guanina, a citosina, a adenina, a timina, e o uracil podem ser substituídos por outras porções, sem alterar substancialmente as propriedades de emparelhamento de bases de um oligonucleotídeo compreendendo um nucleotídeo contendo tal porção de substituição. Por exemplo, sem limitação, um nucleotídeo compreenden- do a inosina como a sua base pode emparelhar por base com os nucleotí- deos contendo adenina, citosina, ou uracil. Portanto, os nucleotídeos con- tendo uracil, guanina, ou adenina podem ser substituídos nas seqüências de nucleotídeos da invenção por um nucleotídeo contendo, por exemplo, inosi- na.

Os termos "proteína de Ahal funcional" ou "Ahal funcional", como usados neste documento, são pretendidos incluir um polipeptídeo de Ahal humano (SEQ ID NO: 4) tendo atividade de ativador da ATPase da proteína de choque térmico, bem como as moléculas relacionadas ao Ahal tendo atividade de ativador de ATPase da proteína de choque térmico; Tais moléculas relacionadas ao Ahal humano incluem os polipeptídeos tendo atividade de ativador da ATPase da proteína de choque térmico e pelo me- nos 80% de homologia com o Ahal funcional. Por exemplo, as moléculas relacionadas podem ter 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de homo- logia com o Ahal humano e podem ter atividade de ativador da ATPase da proteína de choque térmico. Tais moléculas podem incluir, por exemplo, a SEQ ID NO: 5, a SEQ ID NO: 6, a SEQ ID NO: 7; e a SEQ ID NO: 8. Além disso, tais moléculas relacionadas ao Ahal humano incluem os polipeptí- deos tendo seqüências de aminoácidos mais longas ou mais curtas e tendo atividade de ativador da ATPase da proteína de choque térmico.

A atividade de ativador da ATPase da proteína de choque térmi- co pode ser determinada usando ensaios padrões, por exemplo, determi- nando a produção de fosfato inorgânico (Pj) pela Hsp90. A produção de Pi pode ser determinada, por exemplo, medindo ou determinando a geração ou a redução de uma molécula relatora. Tal método utiliza um ensaio de ATPa- se de regeneração usando um ensaio ligado à piruvato cinase/lactato desi- drogenase no qual a geração de P, pode ser medida de modo espectrofoto- métrico (Ali e col., Biochemistry (1993) 32:2717-2724). Os outros métodos espectrofotométricos incluem aqueles descritos por Lanzetta e col. (1979) Anal. Biochem. 100, 95-97; Lill e col., (1990) Cell 60, 271-280; e Cogan e col., Anal. Biochem. (1999) 271:29-35. Aqueles de habilidade na técnica re- conhecerão outros métodos de medir a atividade de ativador da ATPase da proteína de choque térmico.

Conforme usado neste documento, o "gene Aha" refere-se a um gene Ativador da ATPase da Proteína de Choque Térmico 90 que pode ex- pressar uma proteína de Ahal funcional. "Aha1" refere-se aos genes Ativa- dor da ATPase da Proteína de Choque Térmico 90 1, cujos exemplos não exaustivos são encontrados sob os números de acesso do Genbank NM_012111.1 (Homo sapiens), NM_146036.1 (Mus musculus), e XM_510094.1 (Pan trogloditas).

Conforme usado neste documento, a "seqüência-alvo" refere-se a uma porção contígua da seqüência de nucleotídeos de uma molécula de mRNA formada durante a transcrição de um gene Aha, incluindo o mRNA que é produzido do processamento de RNA de um produto de transcrição primário. A seqüência-alvo de qualquer agente de RNAi dado da invenção significa uma seqüência de mRNA de X nucleotídeos que é alvejada pelo agente de RNAi em virtude da complementaridade da fita anti-sentido do agente de RNAi com tal seqüência e com a qual a fita anti-sentido pode hi- bridizar quando colocada em contato com o mRNA, onde X é o número de nucleotídeos na fita anti-sentido mais o número de nucleotídeos em uma saliência ("overhang") de fita simples da fita sentido, se alguma.

Conforme usado neste documento, o termo "fita compreendendo uma seqüência" refere-se a um oligonucleotídeo compreendendo uma ca- deia de nucleotídeos que é descrita pela seqüência referida usando a no- menclatura padrão de nucleotídeos.

Conforme usado neste documento, e a não ser que de outro modo indicado, o termo "complementar", quando usado para descrever uma primeira seqüência de nucleotídeos em relação a uma segunda seqüência de nucleotídeos, refere-se à capacidade de um oligonucleotídeo ou polinu- cleotídeo compreendendo a primeira seqüência de nucleotídeos de hibridizar e formar uma estrutura de duplex, sob certas condições, com um oligonucle- otídeo ou polinucleotídeo compreendendo a segunda seqüência de nucleotí- deos, conforme será entendido pela pessoa versada. Tais condições podem, por exemplo, ser condições severas, onde as condições severas podem in- cluir: NaCI a 400 mM, PIPES a 40 mM pH 6,4, EDTA a 1 mM, 50°C ou 70°C por 12-16 horas, seguidos por lavagem. Podem aplicar outras condições, tais como as condições fisiologicamente relevantes conforme possam ser encontradas dentro de um organismo. A pessoa versada será capaz de de- terminar a série de condições mais apropriadas para um teste da comple- mentaridade de duas seqüências de acordo com a aplicação final dos nucle- otídeos hibridizados.

Isto inclui o emparelhamento de bases do oligonucleotídeo ou do polinucleotídeo compreendendo a primeira seqüência de nucleotídeos com o oligonucleotídeo ou o polinucleotídeo compreendendo a segunda seqüência de nucleotídeos, sobre o comprimento inteiro da primeira e da segunda se- qüências de nucleotídeos. Tais seqüências podem ser referidas como "intei- ramente compiementares" em relação uma à outra neste documento. Entre- tanto, onde uma primeira seqüência for referida como "substancialmente complementar" em relação a uma segunda seqüência aqui contida, as duas seqüências podem ser inteiramente compiementares, ou elas podem formar um ou mais, porém geralmente não mais do que 4, 3 ou 2, pares de bases combinados inadequadamente na hibridização, ao mesmo tempo conser- vando a capacidade de hibridizar sob as condições mais relevantes para a sua aplicação final. Entretanto, onde dois oligonucleotídeos forem projetados para formar, na hibridização, uma ou mais saliências de fitas simples, tais saliências não serão consideradas como combinações inadequadas em re- lação à determinação da complementaridade. Por exemplo, um dsRNA compreendendo um oligonucleotídeo de 21 nucleotídeos de comprimento e um outro oligonucleotídeo de 23 nucleotídeos de comprimento, onde o oligo- nucleotídeo mais longo compreende uma seqüência de 21 nucleotídeos que é inteiramente complementar ao oligonucleotídeo mais curto, pode, todavia, ser referido como "inteiramente complementar" para os propósitos da inven- ção.

As seqüências "compiementares", como usadas neste documen- to, podem também incluir, ou ser formadas inteiramente a partir de, pares de bases que não de Watson-Crick e/ou pares de bases formados a partir de nucleotídeos não-naturais e modificados, na medida em que sejam cumpri- das as exigências acima mencionadas com relação à sua capacidade de hibridizar.

Os termos "complementar", "inteiramente complementar" e "substancialmente complementar" aqui contidos podem ser usados com re- lação à combinação de bases entre a fita sentido e a fita anti-sentido de um dsRNA, ou entre a fita anti-sentido de um dsRNA e uma seqüência-alvo, conforme será entendido a partir do contexto de seu uso.

Gonterme-usado neste documento, um polinucleotídeo que é "substancialmente complementar a pelo menos parte de" um RNA mensa- geiro (mRNA) refere-se a um polinucleotídeo que é substancialmente com- plementar a uma porção contígua do mRNA de interesse (p.ex., Ahal de codificação). Por exemplo, um polinucleotídeo é complementar a pelo menos uma parte de um mRNA do Ahal se a seqüência for substancialmente com- plementar a uma porção não interrompida de um Ahal codificando o mRNA.

O termo "RNA de fita dupla" ou "dsRNA", conforme usado neste documento, refere-se a um complexo de moléculas de ácidos ribonucléicos tendo uma estrutura de duplex compreendendo duas fitas de ácidos nucléi- cos antiparalelas e substancialmente complementares, conforme definido aqui. As duas fitas que formam a estrutura de duplex podem ser porções diferentes de uma molécula de RNA maior, ou elas podem ser moléculas de RNA separadas. Onde as duas fitas forem partes de uma molécula maior e, portanto, estiverem ligadas por uma cadeia não interrompida de nucleotí- deos entre a extremidade de 3' de uma fita e a extremidade de 5' da outra fita respectiva formando a estrutura de duplex, a cadeia de RNA de ligação é referida como um "laço de grampo" e a estrutura inteira é referida como um "RNA de grampo curto" ou "shRNA". Onde as duas fitas forem ligadas cova- lentemente por meios diferentes de uma cadeia não interrompida de nucleo- tídeos entre a extremidade de 3' de uma fita e a extremidade de 5' da outra fita respectiva formando a estrutura de duplex, a estrutura de ligação é refe- rida como um "ligador". Nos diversos aspectos, o Iigador pode incluir as se- qüências AUG, CCC, UUCG, CCACC, CTCGAG, AAGCUU, CCACACC, e UUCAAGAGA. As fitas de RNA podem ter um número igual ou diferente de nucleotídeos. O número máximo de pares de bases é o número de nucleotí- deos na fita mais curta do dsRNA menos quaisquer saliências que estejam presentes no duplex. Além da estrutura de duplex, um dsRNA pode compre- ender uma ou mais saliências de nucleotídeos.

Conforme usado neste documento, uma "saliência de nucleotí- deo" refere-se ao nucleotídeo, ou nucleotídeos, não emparelhado que se projeta a partir da estrutura de duplex de um dsRNA quando uma extremida- - -^de- de #' de"uma fita do dsRNA estender-se além da extremidade de 5' da " : f~ outra fita, ou vice versa. "Grosso" ou "extremidade grossa" significa que não há nenhum nucleotídeo não emparelhado nesta extremidade do dsRNA, i.e., nenhuma saliência de nucleotídeo. Um dsRNA "de extremidade grossa" é um dsRNA que não tem nenhuma saliência de nucleotídeo em uma ou em outra extremidade da molécula.

O termo "fita anti-sentido" refere-se à fita de um dsRNA que in- clui uma região que é substancialmente complementar a uma seqüência- alvo. Conforme usado neste documento, o termo "região de complementari- dade" refere-se à região sobre a fita anti-sentido que é substancialmente complementar a uma seqüência, por exemplo, uma seqüência-alvo, como definida aqui. Onde a região de complementaridade não for inteiramente complementar à seqüência-alvo, as combinações inadequadas são mais toleradas nas regiões terminais e, se presentes, estão geralmente em uma região, ou regiões, terminal, p.ex., dentro de 6, 5, 4, 3, ou 2 nucleotídeos da extremidade de 5' e/ou 3'. Em certos aspectos da invenção, as combinações inadequadas podem estar localizadas dentro de 6, 5, 4, 3, ou 2 nucleotídeos da extremidade de 5' da fita anti-sentido e/ou da extremidade de 3' da fita sentido.

O termo "fita sentido", conforme usado neste documento, refere- se á fita de um dsRNA que inclui uma região que é substancialmente com- plementar a uma região da fita anti-sentido.

"Introduzir em uma célula", quando se referindo a um dsRNA, significa facilitar a captação ou a absorção na célula, como é entendido por aqueles versados na técnica. A absorção ou a captação do dsRNA pode o- correr através de processos celulares que se difundem ou ativos não auxilia- dos, ou por agentes ou dispositivos auxiliares. O significado deste termo não está limitado às células in vitro, um dsRNA pode também ser "introduzido em uma célula", onde a célula é parte de um organismo vivo. Em tal situação, a introdução na célula incluirá a distribuição para o organismo. Por exemplo, para a distribuição in vivo, o dsRNA pode ser injetado em um local do tecido ou administrado sistemicamente. A introdução in vitro em uma célula inclui os métodos conhecidos na técnica, tais como a eletroporação e"a lipüfecção: Os termos "diminuir, diminuído ou níveis decrescentes", confor- me usados neste documento, são pretendidos incluir a inibição da atividade de ativador da ATPase da proteína de choque térmico Ahal e a redução da quantidade de proteína de Ahal funcional em uma célula. Por exemplo, um anticorpo ou dsRNA pode diminuir o nível de proteína de Ahal funcional por interferência com a, ou silenciamento da, atividade de ativador da ATPase da proteína de choque térmico, sem remover a proteína de Ahal da célula. Em um outro exemplo, uma ribozima pode clivar a proteína de Ahal funcio- nal para reduzir a quantidade de proteína de Ahal inteira na célula. Em um outro exemplo, um dsRNA pode silenciar a expressão de um gene Aha, p.ex., um gene Aha1, para reduzir a quantidade de mRNA transcrito a partir do gene Aha.

Os termos "silenciar" e "inibir a expressão de", na medida em que eles se referem a um gene Aha, p.ex., um gene Aha1, neste documento, referem-se à supressão pelo menos parcial da expressão de um gene Aha, p.ex., um gene Aha1, como manifestada por uma redução da quantidade de mRNA transcrito a partir de um gene Aha, o qual pode ser isolado de uma primeira célula, ou grupo células, na qual um gene Aha é transcrito e que foi, ou tenha sido, tratada de modo tal que a expressão de um gene Aha seja inibida, em comparação com uma segunda célula, ou grupo de células, substancialmente idêntica à primeira célula, ou grupo de células, porém que não foi, ou tenha sido, assim tratada (células de controle). Em diversos as- pectos da invenção, as células podem ser as células HeLa ou MLE 12. O grau de inibição é normalmente expresso em termos de

(mRNA nas células de controle) - (mRNA nas células tratadas)• 100% (mRNA nas células de controle)

Alternativamente, o grau de inibição pode ser dado em termos de uma redução de um parâmetro que seja funcionalmente ligado à transcri- ção pelo gene Aha, p.ex., a quantidade de proteína codificada por um gene Aha que é secretada por uma célula, ou encontrada em solução após a lise de tais células, ou o número de células mostrando certo fenótipo, p.ex., a- poptose ou CFTR da superfície celular. Em princípioí o silenciamento do ge- ne Aha pode ser determinado em qualquer célula expressando o alvo, de modo constitutivo ou por engenharia genômica, e por qualquer ensaio apro- priado. Entretanto, quando uma referência for necessária para determinar se um dado dsRNA inibe a expressão de um gene Aha por certo grau e, portan- to, está incluído pela presente invenção, os ensaios proporcionados nos E- xemplos abaixo servirão como tal referência.

Por exemplo, em certas situações, a expressão de um gene Aha, p.ex., um gene Aha1, é suprimida por pelo menos 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% OU 50% por administração do oligonucleotídeo de fita dupla da invenção. Em diversos aspectos, um gene Aha, p.ex., um gene Aha1, é suprimido por pelo menos cerca de 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% ou 80% por administração do oligonucleo- tídeo de fita dupla da invenção. Em diversos aspectos, um gene Aha, p.ex., um gene Ahal, é suprimido por pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% por administração do oligonucleotídeo de fita dupla da invenção.

Conforme usados aqui, no contexto da expressão de Aha, p.ex., da expressão de Aha1, os termos "tratar", "tratamento", e similares, referem- se à redução ou ao alívio dos processos patológicos mediados pela expres- são de Aha. No contexto da presente invenção, na medida em que se refe- rem a quaisquer das outras condições descritas neste documento (diferentes dos processos patológicos mediados pela expressão do Aha), os termos "tratar", "tratamento", e similares significam reduzir ou aliviar pelo menos um sintoma associado com tal condição, ou tornar mais lenta ou reverter a pro- gressão de tal condição.

Conforme usadas neste documento, as expressões "quantidade terapeuticamente efetiva" e "quantidade profilaticamente efetiva" referem-se a uma quantidade que^praporciona-um benefício terapêutico no tratamento, na prevenção, ou no controle dos processos patológicos por expressão de Aha ou um sintoma visível de processos patológicos mediados pela expres- são de Aha. A quantidade específica que é terapeuticamente efetiva pode ser prontamente determinada pelo profissional médico comum, ou pode va- riar dependendo de fatores conhecidos na técnica, tais como, p.ex., o tipo de processos patológicos mediados pela expressão de Aha1 a história e a idade do paciente, o estágio de processos patológicos mediados pela expressão de Aha, e a administração de outros processos anti-patológicos mediados por agentes da expressão de Aha.

Conforme usada neste documento, uma "composição farmacêu- tica" compreende uma quantidade farmacologicamente efetiva de um dsRNA e um veículo farmaceuticamente aceitável. Conforme usada neste documen- to, a "quantidade farmacologicamente efetiva", a "quantidade terapeutica- mente efetiva" ou simplesmente a "quantidade efetiva" refere-se àquela quantidade de um RNA efetiva para produzir o resultado farmacológico, te- rapêutico ou preventivo pretendido. Por exemplo, se um dado tratamento clínico for considerado efetivo quando houver pelo menos uma redução de 25% em um parâmetro mensurável associado com uma doença ou distúrbio, uma quantidade terapeuticamente efetiva de um fármaco para o tratamento daquela doença ou distúrbio é a quantidade necessária para efetuar pelo menos uma redução de 25% naquele parâmetro.

O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um veículo para a administração de um agente terapêutico. Tais veículos inclu- em, porém não estão limitados à, solução salina, solução salina tamponada, dextrose, água, glicerol, etanol, e suas combinações. O termo especifica- mente exclui o meio de cultura de células. Para os fármacos administrados oralmente, os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, porém não estão limitados aos excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como os diluentes inertes, os agentes desintegrantes, os agentes aglutinantes, os agentes lubrificantes, os agentes adoçantes, os agentes aromatizantes, os agentes corantes e os conservantes. Os diluentes inertes adequados inclu- em o- carbanatoxte~sódro"e"cálcio, o fosfato de sódio è cálcio, e a lactose, enquanto que o amido de milho e o ácido algínico são agentes desintegran- tes adequados. Os agentes aglutinantes podem incluir o amido e a gelatina, enquanto que o agente lubrificante, se presente, geralmente será o estearato de magnésio, o ácido esteárico ou o talco. Se desejado, os comprimidos po- dem ser revestidos com um material tal como o monoestearato de glicerila ou o diestearato de glicerila, para retardar a absorção no trato gastrointesti- nal.

Conforme usada neste documento, uma "célula transformada" é uma célula na qual um vetor tenha sido introduzido a partir do qual uma mo· lécula de dsRNA pode ser expressa.

Tratamento do Dobramento Inadequado de Proteínas

A presente invenção proporciona métodos para o tratamento de doenças por dobramento inadequado por diminuição dos níveis da proteína de Ahal funcional (p.ex., SEQ ID NO: 4) e/oude outras moléculas relaciona- das com função similar, bem como métodos para o exame de agentes úteis para o tratamento de doenças por dobramento inadequado de uma proteína.

A tecnologia descrita neste documento é baseada, em parte, na observação que os níveis diminuídos de Ahal funcional, um ativador da AT- Pase da Hsp90, podem estabilizar acentuadamente o AF508 (polipeptídeo de AF508 de SEQ ID NO: 3), um mutante de CFTR (mRNA de CFTR de SEQ ID NO: 1; polipeptídeo de CFTR de SEQ ID NO: 2) caracterizado por uma remoção de fenilalanina em 508, em um estado dobrado que seja aces- sível para o mecanismo de exportação pelo COPII para transporte para a superfície celular. Diversas estratégias descritas neste documento são dire- cionadas para a infra-regulação do Ahal funcional e/ou outras moléculas relacionadas com função similar, a recuperação do dobramento inadequado do CFTR com mutante, o resgate do tráfego mediado pela Hsp90 para a su- perfície celular, e pelo menos a restauração das funções dos canais em um paciente.

Agentes que Diminuem o Ahal Funcional

Os agentes que diminuem os níveis de Ahal funcional e/ou ou- tras-moléculas relacionada com função similar podem alvejar o AhaTIuncirF nal e/ou a ATPase da Hsp90, de modo tal que a ligação a um componente ou a ambos os componentes pelo agente efetue uma diminuição na ativida- de de ativador da ATPase da proteína de choque térmico, no estado de ati- vação da ATPase da Hsp90, e/ou no nível de atividade da ATPase da Hsp90 ativada, consequentemente resultando na estabilização das proteínas do- bradas inadequadamente. Uma estrutura de cristal do complexo entre a Hsp90 e o Ahal foi descrita (Meyer e col. (2004) EMBO J. 23, 511-519). Da- do um entendimento estrutural e mecanístico do Ahal, da ATPase da Hsp90 e do complexo de ligação formado entre os dois, está dentro da habilidade da técnica projetar agentes que se liguem, por exemplo, de modo iônico ou covalente, a um ou a ambos os componentes e, com isso, reduzam a ativa- ção da ATPase da Hsp90 pelo Ahal funcional.

As diversas classes de agentes para uso neste documento como agentes que diminuem os níveis de Ahal funcional e/ou moléculas relacio- nadas com função similar geralmente incluem, porém não estão limitadas às, moléculas de RNA interferente, anticorpos, moléculas inorgânicas pequenas, oligonucleotídeos anti-sentido, e aptâmeros.

O RNA interferente (RNAi) pode ser usado para diminuir os ní- veis de Ahal funcional (e/ou de outras moléculas relacionadas com funções similares) (ver, p.ex., os Exemplos 8-10). Os métodos com RNAi podem utili- zar os RNAs de fita dupla, por exemplo, os RNAs interferentes pequenos (siRNA), o RNA de grampo curto (shRNA), e os micro RNAs (miRNA). A dis- cussão a seguir focar-se-á no dsRNA de um modo geral, porém alguém ver- sado na técnica reconhecerá que muitas abordagem estão disponíveis para as outras moléculas de RNAi, tais como o miRNA. As moléculas de RNAi, específicas para o Ahal funcional e/ou as outras moléculas relacionadas de função similar estão também comercialmente disponíveis a partir de uma variedade de fontes (p.ex., dsRNAs Silencer® In Vivo Ready, dsRNA de A- ha1 de N2s de ID 1136422, 136423, 36424, 19683, 19588, 19773, Ambion, TX; Sigma Aldrich, MO; Invitrogen, CA).

Diversos programas de projeto de moléculas de dsRNA usando uma variedade de algoritmos são conhecidos para ra técnrea'\Verrp7ex:, O algoritmo Cenix, Ambion; BLOCK-iT® RNAi Designer, Invitrogen; dsRNA Whitehead Institute Design Tools, Bioinofrmatics & Research Computing). As características que influenciam na definição das seqüências de dsRNA óti- mas incluem o teor de G/C nas extremidades dos dsRNAs, o Tm de domínios internos específicos do dsRNA, o comprimento do dsRNA, a posição da se- qüência-alvo dentro da CDS (região de codificação), e o teor de nucleotídeos das saliências em 3'.

A administração das moléculas de dsRNA específicas para o Ahal funcional, e/ou outras moléculas relacionadas com funções similares, pode efetuar a degradação mediada pelo RNAi do mRNA alvo (p.ex., o A- ha1). Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente efetiva de dsRNA es- pecífico para o Ahal pode ser administrada ao paciente necessitado dela, para tratar uma doença por dobramento inadequado da proteína. Em um aspecto, o dsRNA que efetua os níveis diminuídos de Ahal funcional tem uma seqüência de nucleotídeos incluindo as SEQ ID NOs: 57-146 (ver a Ta- bela 2 abaixo).

Geralmente, uma quantidade efetiva da molécula de dsRNA po- de compreender uma concentração intercelular no, ou próxima ao, local do dobramento inadequado a partir de cerca de 1 nanomolar (nM) até cerca de 100 nM, e em diversos aspectos a partir de cerca de 2 nM até cerca de 50 nM, e em outros aspectos, a partir de cerca de 2,5 nM até cerca de 10 nM. Contempla-se que as quantidades maiores ou menores de dsRNA podem ser administradas.

O dsRNA pode ser administrado ao paciente por qualquer meio adequado para distribuir as moléculas de RNAi para as células de interesse. Por exemplo, as moléculas de dsRNA podem ser administradas por pistola de gene, eletroporação, ou por outras rotas de administração parenterais ou enterais adequadas, tais como a injeção intravítrea. As moléculas de RNAi podem também ser administradas localmente (tecido do pulmão) ou sistemi- camente (sistema circulatório) via distribuição pulmonar. Uma variedade de dispositivos de distribuição pulmonar pode ser efetiva na distribuição das moléculas de RNAi específicas-para O~Aha1~funcional para um paciente (ver abaixo). As moléculas de RNAi podem ser usadas em conjunção com uma variedade de sistemas de distribuição e alvejamento, como descritos em mais detalhe abaixo. Por exemplo, o dsRNA pode ser encapsulado em sis- temas de distribuição poliméricos alvejados, projetados para promover a in- ternalização da carga útil.

O dsRNA pode ser alvejado para qualquer trecho de menos do que 30 nucleotídeos contíguos, geralmente cerca de 19-25 nucleotídeos contíguos, nas seqüências-alvo de mRNA do Ahal funcional (ou outra molé- cula relacionada com função similar), p.ex., as SEQ ID NOs: 12-56 (ver a Tabela 1 abaixo). As buscas do banco de dados do genoma humano (BLAST) podem ser realizadas para assegurar que a seqüência de dsRNA selecionada não alvejará outros transcritos de gene. As práticas para sele- cionar as seqüências-alvo para o dsRNA são conhecidas na técnica (ver, p.ex., Reynolds e col. (2004) Nature Biotechnology 22(3), 326 - 330). Assim, a fita sentido do presente dsRNA pode compreender uma seqüência de nu- cleotídeos idêntica a qualquer trecho contíguo de cerca de 19 a cerca de 25 nucleotídeos no mRNA alvo do Ahal funcional (ou molécula relacionada com função similar). Geralmente, uma seqüência-alvo sobre o mRNA alvo pode ser selecionada a partir de uma seqüência de cDNA dada, correspon- dendo ao mRNA alvo, por exemplo, começando 50 a 100 nt a jusante (i.e., na direção 3') a partir do códon de iniciação. A seqüência-alvo pode, entre- tanto, estar localizada nas regiões não traduzidas em 5' ou 3', ou na região próxima ao códon de iniciação.

O dsRNA da invenção pode compreender uma fita de RNA (a fita anti-sentido) tendo uma região que é menos do que 30 nucleotídeos de comprimento, geralmente 19-25 nucleotídeos de comprimento, e é substan- cialmente complementar a pelo menos parte de um transcrito de mRNA de um gene Aha. O uso destes dsRNAs capacita a degradação alvejada de mRNA de genes que estejam implicados na replicação e ou manutenção das células de câncer em mamíferos, e/ou na degradação do Regulador da Con- dutância de Transmembrana de Fibrose Cística (CFTR) dobrado inadequa- damente. UsaíTdo"ensaios™srbase"de~células e com animais, dosagens muito baixas destes dsRNAs podem específica e eficientemente mediar o RNAi, resultando na inibição significativa da expressão de um gene Aha. Assim, os métodos e as composições da invenção compreendendo estes dsRNAs são úteis para tratar processos patológicos mediados pela expressão de Aha1 p.ex., o dobramento inadequado de uma proteína, incluindo o câncer e/ou a fibrose cística, por alvejamento de um gene envolvido na degradação de pro- teína.

A descrição detalhada a seguir divulga como preparar e usar o dsRNA e as composições contendo dsRNA para inibir a expressão de um gene Aha, bem como composições e métodos para tratar doenças e distúr- bios causados pela expressão de um gene Aha, tais como o câncer e/ou a fibrose cística. As composições farmacêuticas da invenção compreendem um dsRNA tendo uma fita anti-sentido compreendendo uma região de com- plementaridade que é menos do que 30 nucleotídeos de comprimento, ge- ralmente 19-25 nucleotídeos de comprimento, e é substancialmente com- plementar a pelo menos parte de um transcrito de RNA de um gene Aha, com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Desse modo, certos aspectos da invenção proporcionam com- posições farmacêuticas compreendendo o dsRNA da invenção juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável, métodos de usar as composi- ções para inibir a expressão de um gene Aha, e métodos de utilizar as com- posições farmacêuticas para tratar as doenças causadas por expressão de um gene Aha.

Um aspecto da presente invenção proporciona moléculas de dsRNA para inibir a expressão de um gene Aha, p.ex., um gene Aha1, em uma célula ou mamífero, onde o dsRNA compreende uma fita anti-sentido compreendendo uma região de complementaridade, a qual é complementar a pelo menos uma parte de um mRNA formado na expressão de um gene Aha, p.ex., um gene Aha1, e onde a região de complementaridade é menos do que 30 nucleotídeos de comprimento, geralmente 19-25 nucleotídeos de comprimento. O dsRNA pode ser idêntico a um dos dsRNAs mostrados na Tabeía-2rocrele-pode efetuar a clivagem de um mRNA codificando um gene" Aha dentro da seqüência-alvo de um dos dsRNAs mostrados na Tabela 2. Tabela 1: Seqüências-Alvo de mRNA do Ahal de Homo sapiens (Posição da Seqüência com Base na Seqüência de Codificação do N2 de Acesso do GenBank NM_012111.1 (SEQ ID NO: 11; Relatório de Gene Ensembl N2 ENSG00000100591))

1. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAATTGGTCCACGGATAAGCT: AAAUUGGUCCACGGAUAAGCU (SEQ ID NO: 12) Posição na seqüência do gene: 99

2. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAGCTGAAAACACTGTTCCTG:

AAGCUGAAAACACUGUUCCUG (SEQ ID NO: 13) Posição na seqüência do gene: 115

3. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAAACACTGTTCCTGGCAGTG:

AAAACACUGUUCCUGGCAGUG (SEQ ID NO: 14) Posição na seqüência do gene: 121

4. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAAATGAAGAAGGCAAGTGTG:

AAAAUGAAGAAGGCAAGUGUG (SEQ ID NO: 15) Posição na seqüência do gene: 149

5. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AATGAAGAAGGCAAGTGTGAG:

AAUGAAGAAGGCAAGUGUGAG (SEQ ID NO: 16) Posição na seqüência do gene: 151

6. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAGAAGGCAAGTGTGAGGTGA:

AAGAAGGCAAGUGUGAGGUGA (SEQ ID NO: 17) Posição na seqüência do gene: 155

7. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAGTGAGTAAGCTTGATGGAG:

AAGUGAGUAAGCUUGAUGGAG (SEQ ID NO: 18) Posição na seqüência do gene: 179

8. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AACAATCGCAAAGGGAAACTT: AACAAUCGCAAAGGGAAACUU (SEQ ID NO: 19) Posição na seqüência do gene: 211

9. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AATCGCAAAGGGAAACTTATC: AAUCGCAAAGGGAAACUUAUC (SEQ ID NO: 20)

Posição na seqüência do gene: 214

10. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAAGGGAAACTTATCTTCTTT: AAAGGGAAACUUAUCUUCUUU (SEQ ID NO: 21)

Posição na seqüência do gene: 220

11. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAACTTATCTTCTTTTATGAA:

AAACUUAUCUUCUUUUAUGAA (SEQ ID NO: 22) Posição na seqüência do gene: 226

12. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AATGGAGCGTCAAACTAAACT:

AAUGGAGCGUCAAACUAAACU (SEQ ID NO: 23) Posição na seqüência do gene: 245

13. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAACTAAACTGGACAGGTACT:

AAACUAAACUGGACAGGUACU (SEQ ID NO: 24) Posição na seqüência do gene: 256

14. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAACTGGACAGGTACTTCTAA:

AAACUGGACAGGUACUUCUAA (SEQ ID NO: 25)

Posição na seqüência do gene: 261

15. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAGTCAGGAGTACAATACAAA:

AAGUCAGGAGUACAAUACAAA (SEQ ID NO: 26) Posição na seqüência do gene: 280

16. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AATACAAAGGACATGTGGAGA: AAUACAAAGGACAUGUGGAGA (SEQ ID NO: 27)

Posição na seqüência do gene: 293

17. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AATTTGTCTGATGAAAACAGC: AAUUUGUCUGAUGAAAACAGC (SEQ ID NO: 28)

Posição na seqüência do gene: 319

18. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAAACAGCGTGGATGAAGTGG: AAAACAGCGUGGAUGAAGUGG (SEQ ID NO: 29)

Posição na seqüência do gene: 332

19. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAGTGGAGATTAGTGTGAGCC:

AAGUGGAGAUUAGUGUGAGCC (SEQ ID NO: 30)

Posição na seqüência do gene: 347

20. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAAGATGAGCCTGACACAAAT:

AAAGAUGAGCCUGACACAAAU (SEQ ID NO: 31)

Posição na seqüência do gene: 373

21. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAATCTCGTGGCCTTAATGAA: AAAUCUCGUGGCCUUAAUGAA (SEQ ID NO: 32)

Posição na seqüência do gene: 390

22. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AATGAAGGAAGAAGGGGTGAA: AAUGAAGGAAGAAGGGGUGAA (SEQ ID NO: 33)

Posição na seqüência do gene: 405 23. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAGGAAGAAGGGGTGAAACTT: AAGGAAGAAGtS1GGUGAAACUU (SEQ ID NO: 34) Posição na seqüência do gene: 409

24. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene

Aha AAGAAGGGGTGAAACTTCTAA:

AAGAAGGGGUGAAACUUCUAA (SEQ ID NO: 35)

Posição na seqüência do gene: 413

25. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene

Aha AAGGGGTGAAACTTCTAAGAG:

AAGGGGUGAAACUUCUAAGAG (SEQ ID NO: 36)

Posição na seqüência do gene: 416

26. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene

Aha AAACTTCTAAGAGAAGCAATG:

AAACUUCUAAGAGAAGCAAUG (SEQ ID NO: 37)

Posição na seqüência do gene: 424

27. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene

Aha AAGAGAAGCAATGGGAATTTA:

AAGAGAAGCAAUGGGAAUUUA (SEQ ID NO: 38)

Posição na seqüência do gene: 432

28. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene

Aha AAGCAATGGGAATTTACATCA:

AAGCAAUGGGAAUUUACAUCA (SEQ ID NO: 39)

Posição na seqüência do gene: 437

29. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene

Aha AATGGGAATTTACATCAGCAC:

AAUGGGAAUUUACAUCAGCAC (SEQ ID NO: 40)

Posição na seqüência do gene: 441

30. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene

Aha AATTTACATCAGCACCCTCAA:

AAUUUACAUCAGCACCCUCAA (SEQ ID NO: 41)

Posição na seqüência do gene: 447

31. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene

Aha AATGAATGGAGAGTCAGTAGA:

AAUGAAUGGAGAGUGAGUAGA (SEQ ID NO: 42) Posição na seqüência do gene: 501

32. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AATGGAGAGTCAGTAGACCCA: AAUGGAGAGUCAGUAGACCCA (SEQ ID NO: 43)

Posição na seqüência do gene: 505

33. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAGCCTGCTCCTTCAAAAACC: AAGCCUGCUCCUUCAAAAACC (SEQ ID NO: 44)

Posição na seqüência do gene: 565 34. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAAATCCCCACTTGTAAGATC: AAAAUCCCCACUUGUAAGAUC (SEQ ID NO: 45)

Posição na seqüência do gene: 607

35. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AATCCCCACTTGTAAGATCAC:

AAUCCCCACUUGUAAGAUCAC (SEQ ID NO: 46)

Posição na seqüência do gene: 609

36. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAGATCACTCTTAAGGAAACC:

AAGAUCACUCUUAAGGAAACC (SEQ ID NO: 47)

Posição na seqüência do gene: 622

37. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAGGAAACCTTCCTGACGTCA: AAGGAAACCUUCCUGACGUCA (SEQ ID NO: 48)

Posição na seqüência do gene: 634

38. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AACATTAGAAGCAGACAGAGG: AACAUUAGAAGCAGACAGAGG (SEQ ID NO: 49)

Posição na seqüência do gene: 720

39. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAGCAGACAGAGGTGGAAAGT: AAGCAGACAGAGGUGGAAAGU (SEQ ID NO: 50) Posição na seqüência do gene: 728

40. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAAGTTCCACATGGTAGATGG: AAAGUUCCACAUGGUAGAUGG (SEQ ID NO: 51)

Posição na seqüência do gene: 744

41. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AACGTCTCTGGGGAATTTACT: AACGUCUCUGGGGAAUUUACU (SEQ ID NO: 52)

Posição na seqüência do gene: 766

42. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AATTTACTGATCTGGTCCCTG: AAUUUACUGAUCUGGUCCCUG (SEQ ID NO: 53) Posição na seqüência do gene: 779

43. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAACATATTGTGATGAAGTGG: AAACAUAUUGUGAUGAAGUGG (SEQ ID NO: 54) Posição na seqüência do gene: 802

44. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAGTGGAGGTTTAAATCTTGG:

AAGUGGAGGUUUAAAUCUUGG (SEQ ID NO: 55) Posição na seqüência do gene: 817

45. Seqüência-Alvo de mRNA com Base na Seqüência do Gene Aha AAACAGACCTTTGGCTATGGC: AAACAGACCUUUGGCUAUGGC (SEQ ID NO: 56)

Posição na seqüência do gene: 982

Tabela 2: Agentes de dsRNA para a infra-regulação da Expressão da Prote- ína de Aha Funcional de Homo sapiens

1. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 1 dsRNA de fita sentido: AUUGGUCCACGGAUAAGCU (SEQ ID NO: 57)

dsRNA de fita anti-sentido: AGCUUAUCCGUGGACCAAU (SEQ ID NO: 58)

2. dsRNA com' base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 2 dsRNA de fita sentido: GCUGAAAACACUGUUCCUG (SEQ ID NO: 59) dsRNA de fita anti-sentido: CAGGAACAGUGUUUUCAGC (SEQ ID NO: 60)

dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 3 dsRNA de fita sentido: AACACUGUUCCUGGCAGUG (SEQ ID NO: 61) dsRNA de fita anti-sentido: CACUGCCAGGAACAGUGUU (SEQ ID NO: 62)

dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 4

dsRNA de fita sentido: AAUGAAGAAGGCAAGUGUG (SEQ ID NO: 63)

dsRNA de fita anti-sentido: CACACUUGCCUUCUUCAUU (SEQ ID NO: 64)

dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 5

dsRNA de fita sentido: UGAAGAAGGCAAGUGUGAG (SEQ ID NO: 65)

dsRNA de fita anti-sentido: CUCACACUUGCCUUCUUCA (SEQ ID NO: 66)

dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 6

dsRNA de fita sentido: GAAGGCAAGUGUGAGGUGA (SEQ ID NO: 67)

dsRNA de fita anti-sentido: UCACCUCACACUUGCCUUC (SEQ ID NO: 68)

dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 7

dsRNA de fita sentido: GUGAGUAAGCUUGAUGGAG (SEQ ID NO: 69)

dsRNA de fita anti-sentido: CUCCAUCAAGCUUACUCAC (SEQ ID NO: 70)

dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 8

dsRNA de fita sentido: CAAUCGCAAAGGGAAACUU (SEQ ID NO: 71)

dsRNA de fita anti-sentido: AAGUUUCCCUUUGCGAUUG (SEQ ID NO: 72)

dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 9

dsRNA de fita sentido: UCGCAAAGGGAAACUUAUC (SEQ ID NO: 73)

dsRNA de fita anti-sentidar GAUAAGUUUCCCUUUGCGA (SEQ ID NO: 74)

10. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 10

dsRNA de fita sentido: AGGGAAACUUAUCUUCUUU (SEQ ID NO: 75)

dsRNA de fita anti-sentido: AAAGAAGAUAAGUUUCCCU (SEQ ID NO: 76)

11. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 11

dsRNA de fita sentido: ACUUAUCUUCUUUUAUGAA (SEQ ID NO: 77)

dsRNA de fita anti-sentido: UUCAUAAAAGAAGAUAAGU (SEQ ID NO: 78)

12. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 12

dsRNA de fita sentido: UGGAGCGUCAAACUAAACU (SEQ ID NO: 79)

dsRNA de fita anti-sentido: AGUUUAGUUUGACGCUCCA (SEQ ID NO: 80)

13. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 13

15 dsRNA de fita sentido: ACUAAACUGGACAGGUACU (SEQ ID NO: 81)

dsRNA de fita anti-sentido: AGUACCUGUCCAGUUUAGU (SEQ ID NO: 82)

14. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 14

dsRNA de fita sentido: ACUGGACAGGUACUUCUAA (SEQ ID NO: 83)

dsRNA de fita anti-sentido: UUAGAAGUACCUGUCCAGU (SEQ ID NO: 84)

15. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 15

dsRNA de fita sentido: GUCAGGAGUACAAUACAAA (SEQ ID NO: 85)

dsRNA de fita anti-sentido: UUUGUAUUGUACUCCUGAC (SEQ ID NO: 86)

16. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 16

dsRNA de fita sentido: UACAAAGGACAUGUGGAGA (SEQ ID NO: 87)

dsRNA de fita anti-sentido: UCUCCACAUGUCCUUUGUA (SEQ ID NO: 88)

17. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 17

dsRNA de fita sentido: UUUGUCUGAUGAAAACAGC (SEQ ID NO: 89)

dsRNAide fita~anti=sentido: GCUGUUUUCAUCAGACAAA (SEQ ID NO: 90)

18. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 18 dsRNA de fita sentido: AACAGCGUGGAUGAAGUGG (SEQ ID NO: 91) dsRNA de fita anti-sentido: CCACUUCAUCCACGCUGUU (SEQ ID NO: 92)

19. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 19 dsRNA de fita sentido: GUGGAGAUUAGUGUGAGCC (SEQ ID NO: 93)

dsRNA de fita anti-sentido: GGCUCACACUAAUCUCCAC (SEQ ID NO: 94)

20. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 20 dsRNA de fita sentido: AGAUGAGCCUGACACAAAU (SEQ ID NO: 95) dsRNA de fita anti-sentido: AUUUGUGUCAGGCUCAUCU (SEQ ID NO: 96)

21. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 21 dsRNA de fita sentido: AUCUCGUGGCCUUAAUGAA (SEQ ID NO: 97) dsRNA de fita anti-sentido: UUCAUUAAGGCCACGAGAU (SEQ ID NO: 98)

22. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 22 dsRNA de fita sentido: UGAAGGAAGAAGGGGUGAA (SEQ ID NO: 99) dsRNA de fita anti-sentido: UUCACCCCUUCUUCCUUCA (SEQ ID NO: 100)

23. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 23 dsRNA de fita sentido: GGAAGAAGGGGUGAAACUU (SEQ ID NO: 101)

dsRNA de fita anti-sentido: AAGUUUCACCCCUUCUUCC (SEQ ID NO: 102)

24. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 24 dsRNA de fita sentido: GAAGGGGUGAAACUUCUAA (SEQ ID NO: 103)

dsRNA de fita anti-sentido: UUAGAAGUUUCACCCCUUC (SEQ ID NO: 104) 25. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 25 dsRNA de fita sentido: GGGGUGAAACUUCUAAGAG (SEQ ID NO: 105)

dsRNA de fita anti-sentido: CUCUUAGAAGUUUCACCCC (SEQ ID NO: 106)

26. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 26 dsRNA de fita sentido: ACUUCUAAGAGAAGCAAUG (SEQ ID NO: 107)

dsRNA de fita anti-sentido: CAUUGCUUCUCUUAGAAGU (SEQ ID NO: 108)

27. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 27 dsRNA de fita sentido: GAGAAGCAAUGGGAAUUUA (SEQ ID NO: 109)

dsRNA de fita anti-sentido: UAAAUUCCCAUUGCUUCUC (SEQ ID NO: 110)

28. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 28 dsRNA de fita sentido: GCAAUGGGAAUUUACAUCA (SEQ ID NO: 111)

dsRNA de fita anti-sentido: UGAUGUAAAUUCCCAUUGC (SEQ ID NO: 112)

29. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 29 dsRNA de fita sentido: UGGGAAUUUACAUCAGCAC (SEQ ID NO: 113)

dsRNA de fita anti-sentido: GUGCUGAUGUAAAUUCCCA (SEQ ID NO: 114)

30. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 30 dsRNA de fita sentido: UUUACAUCAGCACCCUCAA (SEQ ID NO: 115)

dsRNA de fita anti-sentido: UUGAGGGUGCUGAUGUAAA (SEQ ID NO: 116)

31. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 31 dsRNA de fita sentido: UGAAUGGAGAGUCAGUAGA- (SEQ~ID~NO: 117)

dsRNA de fita anti-sentido: UCUACUGACUCUCCAUUCA (SEQ ID NO: 118)

32. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 32 dsRNA de fita sentido: UGGAGAGUCAGUAGACCCA (SEQ ID NO: 119)

dsRNA de fita anti-sentido: UGGGUCUACUGACUCUCCA (SEQ ID NO: 120)

33. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 33 dsRNA de fita sentido: GCCUGCUCCUUCAAAAACC (SEQ ID NO: 121)

dsRNA de fita anti-sentido: GGUUUUUGAAGGAGCAGGC (SEQ ID NO: 122)

34. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 34 dsRNA de fita sentido: AAUCCCCACUUGUAAGAUC (SEQ ID NO: 123)

dsRNA de fita anti-sentido: GAUCUUACAAGUGGGGAUU (SEQ ID NO: 124)

35. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 35 dsRNA de fita sentido: UCCCCACUUGUAAGAUCAC (SEQ ID NO: 125)

dsRNA de fita anti-sentido: GUGAUCUUACAAGUGGGGA (SEQ ID NO: 126)

36. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 36 dsRNA de fita sentido: GAUCACUCUUAAGGAAACC (SEQ ID NO: 127)

dsRNA de fita anti-sentido: GGUUUCCUUAAGAGUGAUC (SEQ ID NO: 128)

37. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 37 dsRNA de fita sentido: GGAAACCUUCCUGACGUCA (SEQ ID NO: 129)

dsRNA de fita anti-sentido: UGASGUCAGGAAGGUUUCC (SEQ ID NO: 130)

38. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 38 dsRNA de fita sentido: CAUUAGAAGCAGACAGAGG (SEQ ID NO: 131)

dsRNA de fita anti-sentido: CCUCUGUCUGCUUCUAAUG (SEQ ID NO: 132)

39. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 39 dsRNA de fita sentido: GCAGACAGAGGUGGAAAGU (SEQ ID NO: 133)

dsRNA de fita anti-sentido: ACUUUCCACCÜCUGUCUGC (SEQ ID NO: 134)

40. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 40 dsRNA de fita sentido: AGUUCCACAUGGUAGAUGG (SEQ ID NO: 135)

dsRNA de fita anti-sentido: CCAUCUACCAUGUGGAACU (SEQ ID NO: 136)

41. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 41 dsRNA de fita sentido: CGUCUCUGGGGAAUUUACU (SEQ ID NO: 137)

dsRNA de fita anti-sentido: AGUAAAUUCCCCAGAGACG (SEQ ID NO: 138)

42. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 42 dsRNA de fita sentido: UUUACUGAUCUGGUCCCUG (SEQ ID NO: 139)

dsRNA de fita anti-sentido: CAGGGACCAGAUCAGUAAA (SEQ ID NO: 140)

43. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 43 dsRNA de fita sentido: ACAUAUUGUGAUGAAGUGG (SEQ ID NO: 141)

dsRNA de fita anti-sentido: CCACUUCAUCACAAUAUGU (SEQ ID NO: 142)

44. dsRNA com-basema^Seqüência-Alvo do Gene Aha 44 dsRNA de fita sentido: GUGGAGGUUUAAAUCUUGG (SEQ ID NO: 143)

dsRNA de fita anti-sentido: CCAAGAUUUAAACCUCCAC (SEQ ID NO:

144)

45. dsRNA com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 45 dsRNA de fita sentido: ACAGACCUUUGGCUAUGGC (SEQ ID NO:

145) dsRNA de fita anti-sentido: GCCAUAGCCAAAGGUCUGU (SEQ ID NO:

146) Tabela 3: Primers para o shRNA de Transcrição em Vetor para a infra- regulação da Expressão da Proteína Aha Funcional de Homo sapiens 1. Primer com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 1 (SEQ ID NO: 12) Fita sentido:

GATCCATTGGTCCACGGATAAGCTTTCAAGAGAAGCTTATCCGTGGACC AAT Illlll GGAAA (SEQ ID NO: 147) Fita anti-sentido:

AGCTTTTCCAAAAAAATTGGTCCACGGATAAGCTTCTCTTGAAAGCTTAT CCGTGGACCAATG (SEQ ID NO: 148)

2. Primer com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 7 (SEQ ID NO: 18) Fita sentido:

GATCCGTGAGTAAGCTTGATGGAGTTCAAGAGACTCCATCAAGCTTACT CACTTTTTTGGAAA (SEQ ID NO: 149) Fita anti-sentido:

AGCTTTTCCAAAAAAGTGAGTAAGCTTGATGGAGTCTCTTGAACTCCATC AAGCTTACTCACG (SEQ ID NO: 150)

3. Primer com base na Seqüência-Alvo do Gene Aha 13 (SEQ ID NO: 24) Fita sentido:

GATCCACTAAACTGGACAGGTACTTTCAAGAGAAGTACCTGTCCAGTTT AGTTTTTTTGGAAA (SEQ ID NO: 151) Fita anti-sentido:

AGCTTTTCCAAAAAAACTAAACTGGACAGGTACTTCTCTTGAAAGTACCT GTeeAGTTTASTGtSEG ID NO: 152) Tabela 4: Seqüências de shRNA Transcritas pelo Vetor de Codificação

1. GAUCCAUUGGUCCACGGAUAAGCUUUCAAGAGAAGCUUAUCCGU GGACCAAUUUUUUUGGAAA (SEQ ID NO: 153)

2. GAUCCGUGAGUAAGCUUGAUGGAGUUCAAGAGACUCCAUCAAGCU UACUCACUUUUUUGGAAA (SEQ ID NO: 154)

3. GAUCCACUAAACUGGACAGGUACUUUCAAGAGAAGUACCUGUCCA GUUUAGUUUUUUUGGAAA (SEQ ID NO: 155)

Em diversos aspectos da presente invenção, o dsRNA pode ter pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 18, ou pelo me- nos 20 nucleotídeos contíguos por fita em comum com pelo menos uma fita, e em diversos aspectos ambas as fitas, de um dos dsRNAs mostrados na Tabela 2. Os dsRNAs alternativos que alvejam alhures na seqüência-alvo de um dos dsRNAs proporcionados na Tabela 2 podem prontamente ser deter- minados usando a seqüência-alvo e a seqüência de Ahal de flanqueio.

O dsRNA compreende duas fitas de RNA que são complementa- res para hibridizar para formar uma estrutura de duplex. Uma fita do dsRNA (a fita anti-sentido) compreende uma região de complementaridade que é substancialmente complementar, e geralmente inteiramente complementar, a uma seqüência-alvo, derivada da seqüência de um mRNA formado duran- te a expressão de um gene Aha, a outra fita (a fita sentido) compreende uma região que é complementar à fita anti-sentido, de modo tal que as duas fitas hibridizam e formam uma estrutura de duplex quando combinadas sob con- dições adequadas. Geralmente, a estrutura de duplex é entre 15 e 30, mais geralmente entre 18 e 25, ainda mais geralmente entre 19 e 24, e mais ge- ralmente de todos entre 19 e 21 pares de bases de comprimento. Similar- mente, a região de complementaridade à seqüência-alvo é entre 15 e 30, mais geralmente entre 18 e 25, ainda mais geralmente entre 19 e 24, e mais geralmente de todos entre 19 e 21 nucleotídeos de comprimento. O dsRNA da invenção pode adicionalmente compreender uma ou mais saliências de nucleotídeos de fita simples. Por exemplo, a seqüência de desoxirribonu- cleotídeos "tt" ou a seqüência de ribonucleotídeos "UU" pode ser ligada à extremidade de 3' de ambas as fitas sentido e anti-sentido paraHormãras" saliências. O dsRNA pode ser sintetizado por métodos padrões conhecidos na técnica, conforme adicionalmente discutidos abaixo, p.ex., através do uso de um sintetizador de DNA automatizado, tal como estão comercialmente disponíveis, por exemplo, da Biosearch, Applied Biosystems, Inc. Em um aspecto da presente invenção, um gene Aha pode ser um gene Ahal huma- no.

Em diversos aspectos, o dsRNA compreende pelo menos duas seqüências selecionadas a partir deste grupo, onde uma das pelo menos duas seqüências é complementar a uma outra das pelo menos duas se- qüências, e uma das pelo menos duas seqüências é substancialmente com- plementar a uma seqüência de um mRNA gerado na expressão de um gene Aha, p.ex., um gene Ahal.

A pessoa versada tem bastante consciência que os dsRNAs compreendendo uma estrutura de duplex de entre 20 e 23, porém especifi- camente 21, pares de bases têm sido aclamados como particularmente efe- tivos na inibição do RNA interferente (Elbashir e col., EMBO 2001, 20:6877- 6888). Entretanto, outros verificaram que os dsRNA mais curtos ou mais longos podem ser efetivos também.

O dsRNA da invenção pode conter uma a três combinações ina- dequadas com a seqüência-alvo. Se a fita anti-sentido do dsRNA contiver combinações inadequadas com uma seqüência-alvo, é preferível que a área de combinação inadequada não esteja localizada no centro da região de complementaridade. Se a fita anti-sentido do dsRNA contiver combinações inadequadas com a seqüência-alvo, é preferível que a combinação inade- quada esteja restrita a 5 nucleotídeos a partir de uma ou outra extremidade, por exemplo, 5, 4, 3, 2, ou 1 nucleotídeo a partir da extremidade de 5' ou de 3' da região de complementaridade, e preferivelmente a partir da extremida- de de 5'. Por exemplo, para uma fita de dsRNA de 23 nucleotídeos que seja complementar a uma região de um gene Aha, o dsRNA geralmente não con- tém nenhuma combinação inadequada dentro dos 13 nucleotídeos centrais. Em um outro aspecto, a fita anti-sentido do dsRNA não contém nenhuma combinação inadequada na região a partir das'posiçõess=l7Cia'2ráté~as posi- ções 9, ou 10, da fita anti-sentido (contando 5'-3'). Os métodos descritos dentro da invenção podem ser usados para determinar se um dsRNA con- tendo uma combinação inadequada com uma seqüência-aivo é efetivo na inibição da expressão de um gene Aha. A consideração da eficácia dos ds- RNAs com as combinações inadequadas na inibição da expressão de um gene Aha é importante, especialmente se a região particular de complemen- taridade em um gene Aha for sabida ter variação de seqüência polimórfica dentro da população.

Em um aspecto, pelo menos uma extremidade do dsRNA tem uma saliência de nucleotídeo de fita simples de 1 a 4, geralmente 1 ou 2 nu- cleotídeos. Os dsRNAs tendo pelo menos uma saliência de nucleotídeo têm propriedades inibitórias inesperadamente maiores do que os seus corres- pondentes de extremidade grossa. Além disso, os presentes inventores des- cobriram que a presença de somente uma saliência de nucleotídeo reforça a atividade de interferência do dsRNA, sem afetar a sua estabilidade global. O dsRNA tendo somente uma saliência provou ser particularmente estável e efetivo in vivo, bem como em uma variedade de células, meios de culturas de células, sangue, e soro. Geralmente, a saliência de fita simples está loca- lizada na extremidade 3' terminal da fita anti-sentido ou, alternativamente, na extremidade 3' terminal da fita sentido. O dsRNA pode também ter uma ex- tremidade grossa, geralmente localizada na extremidade de 5' da fita anti- sentido. Tais dsRNAs têm estabilidade e atividade inibitória aperfeiçoadas, assim permitindo a administração em baixas dosagens, i.e., menos do que 5 mg/kg de peso do corpo do receptor por dia. Geralmente, a fita anti-sentido do dsRNA tem uma saliência de nucleotídeo na extremidade de 3', e a ex- tremidade de 5' é grossa. Em um outro aspecto, um ou mais dos nucleotí- deos na saliência é substituído com um tiofosfato de nucleosídeo. Agentes de RNAi codificados em vetores

O dsRNA da invenção pode também ser expresso a partir de vetores virais recombinantes intracelularmente in vivo. Os vetores virais re- combinantes da invenção compreendem seqüências codificando o dsRNA - da invenção e qualquer proimitorpara-expressar as seqüências de dsRNA. Os promotores adequados incluem, por exemplo, as seqüências promotoras de RNA poli III U6 ou H1 e o promotor de citomegalovírus. A seleção dos outros promotores está dentro da habilidade na técnica. Os vetores virais recombinantes da invenção podem também compreender promotores capa- zes de serem induzidos ou regulados para a expressão do dsRNA em um tecido particular ou em um ambiente intracelular particular. O uso de vetores virais recombinantes para distribuir o dsRNA da invenção para as células in vivo é discutido em mais detalhe abaixo.

O dsRNA da invenção pode ser expresso a partir de um vetor viral recombinante como duas moléculas de RNA complementares, separa- das, ou como uma molécula de RNA individual com duas regiões comple- mentares.

Aqueles de habilidade na técnica reconhecerão que pode ser usado qualquer vetor viral capaz de aceitar as seqüências de codificação para a(s) molécula(s) de dsRNA a ser(em) expressa(s), por exemplo, os ve- tores derivados de adenovírus (AV); vírus adeno-associado (AAV); retrovírus (p.ex., Ientivirus (LV)1 Rhabdovírus, vírus da leucemia de murino); vírus da herpes, e similares. O tropismo dos vetores virais pode ser modificado por pseudotipagem dos vetores com cápsulas protéicas ou outros antígenos de superfície a partir de outros vírus, ou por substituição de diferentes proteínas dos capsídios virais, conforme apropriado.

Por exemplo, os vetores Ientivirais da invenção podem ser pseu- dotipados com proteínas de superfície a partir do vírus da estomatite vesicu- Iar (VSV), raiva, Ébola, Mokola, e similares. Os vetores de AAV da invenção podem ser preparados para alvejar diferentes células por engenharia dos vetores para expressar diferentes serótipos das proteínas dos capsídios. Por exemplo, um vetor de AAV expressando um capsídio de serótipo 2 sobre um genoma do serótipo 2 é chamado AAV 2/2. Este gene de capsídio de seróti- po 2 no vetor de AAV 2/2 pode ser substituído por um gene de capsídio de serótipo 5 para produzir um vetor de AAV 2/5. As técnicas para construir os vetores de AAV que expressam diferentes serótipos de proteínas dos capsí- dios estãO-deTííixrda habilidade na técnica; ver, p.ex., Rabinowitz JEe col. (2002), J Virol 76:791-801, cuja divulgação inteira é incorporada neste do- cumento por referência.

A seleção dos vetores virais recombinantes adequados para uso na invenção, os métodos para inserir as seqüências de ácidos nucléicos pa- ra expressar o dsRNA no vetor, e os métodos de distribuir o vetor viral para as células de interesse estão dentro da habilidade na técnica. Ver, por e- xemplo, Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechniques 6: 608-614; MiIIerA D (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; An- derson W F (1998), Nature 392: 25-30; e Rubinson DAe col., Nat. Genet. 33: 401-406, cujas divulgações inteiras são incorporadas neste documento por referência. Por exemplo, o dsRNA da invenção é expresso como duas moléculas de RNA de fita simples complementares, separadas, a partir de um vetor de AAV recombinante compreendendo, por exemplo, os promoto- res de RNA U6 ou H1, ou o promotor de citomegalovírus (CMV). Um vetor de AV adequado para expressar o dsRNA da invenção, um método para construir o vetor de AV recombinante, e um método para a distribuição do vetor para células-alvo são descritos em Xia H e col. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010. Os vetores de AAV adequados para expressar o dsRNA da invenção, os métodos para construir o vetor de AV recombinante, e os mé- todos para a distribuição dos vetores para as células-alvo são descritos em Samulski R e col. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J e col. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R e col. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; Pat. U.S. N- 5.252.479; Pat. U.S. N- 5.139.941; Pedido de Patente Internacional N2 WO 94/13788; e Pedido de Patente Internacional N2 WO 93/24641, cujas divulgações são incorporadas neste documento por referência.

Agentes que não são de dsRNA

Os anticorpos podem ser usados para diminuir os níveis do A- ha1 funcional e/ou de outras moléculas relacionadas com função similar. Por exemplo, os anticorpos podem diminuir os níveis de Ahal funcional Iigando- se especificamente ao Ahal funcional, ao sítio de ligação à ATPase da Hsp90 para o Ahal funcional, e/ou ao complexo de Ahal funcional-ATPase da Hsp90. Os anticorpos dentro do escopo da invenção incluem, por exetTF pio, os anticorpos policlonais, os anticorpos monoclonais, os fragmentos de anticorpos, e as moléculas de fusão à base de anticorpos. A engenharia, a produção, o exame, a purificação, a fragmentação, e o uso terapêutico dos anticorpos são bastante conhecidos na técnica (ver, de um modo geral, Car- ter (2006) Nat Rev Immunol. 6(5), 343-357; Coligan (2005) Short Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, ISBN 0471715786); Teillaud (2005) Expert Opin Biol Ther. 5(Supl. 1) S15-27; Subramanian, ed. (2004) Antibodies : Vo- lume 1: Production and Purification, Springer, ISBN 0306482452; Brente col., ed. (2003) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, ISBN 047150338X; Lo, ed. (2003) Antibody Engineering Methods and Proto- cols, Humana Press, ISBN 1588290921; Ausubel e col., ed. (2002) Short Protocols in Molecular Biology 5â Ed., Current Protocols, ISBN 0471250929). Diversos tipos de anticorpos específicos para o Ahal funcional podem tam- bém ser obtidos a partir de uma variedade de fontes comerciais. A meia-vida terminal dos anticorpos no plasma pode ser regulada sobre uma ampla faixa, por exemplo, diversos minutos a diversas semanas, para adaptar os objeti- vos clínicos para o tratamento de doenças por dobramento inadequado de uma proteína (ver, p.ex., Carter e col. (2006) Nat Rev Immunol. 6(5), 343- 357, 353). Os MAbs quiméricos, humanizados, e totalmente humanos po- dem superar efetivamente as limitações potenciais sobre o uso dos anticor- pos derivados de fontes não-humanas para tratar as doenças por dobramen- to inadequado de uma proteína, assim proporcionando imunogenicidade di- minuída com funções efetoras otimizadas (ver, p.ex., Teillaud (2005) Expert Opin. Biol. Ther. 5(1), S15-S27; Tomizuka e col. (2000) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 97, 722-727; Carter e col. (2006) Nat Rev Immunol. 6(5), 343-357, 346- 347). Os anticorpos podem ser alterados ou selecionados de modo a obter a internalização eficiente do anticorpo. Como tais, os anticorpos podem intera- gir mais efetivamente com as moléculas-alvo intracelulares, tais como o A- ha1 funcional e/ou as moléculas relacionadas com funções similares, ou os complexos que incluem estes. Ademais, os conjugados de anticorpo- fármaco podem aumentar a eficiência da internalização do anticorpo. A in- ternalização eficiente do anticorpo pode ser desejáveInprara corpos específicos para o Ahal funcional para o ambiente intracelular, de modo a recuperar o dobramento defeituoso e o trânsito das proteínas, carac- terizados por energética de dobramento subótima. A conjugação dos anti- corpos a uma variedade de agentes que podem facilitar a internalização ce- lular dos anticorpos é conhecida na técnica (ver, de um modo geral, Wu e col. (2005) Nat Biotechnol. 23(9), 1137-1146; McCarron e col. (2005) Mol Interv 5(6), 368-380; Niemeyer (2004) Bioconjugation Protocols, Strategies and Methods, Humana Press, ISBN 1588290980; Hermanson (1996) Bioconjuga- te Techniques, Academie Press, ISBN 0123423368).

As moléculas orgânicas pequenas que interagem especificamen- te com as co-chaperonas de proteína de choque térmico, tais como a co- chaperona de Hsp90 Aha1, podem ser usadas para diminuir os níveis de Ahal funcional e/ou outras moléculas relacionadas com funções similares. A identificação de um inibidor farmacêutico ou de molécula pequena do Ahal funcional pode ser prontamente efetuada através de métodos padrões de exame de alta produtividade. Além disso, as abordagens padrões da química medicinal podem ser aplicadas a estes agentes para aumentar ou modificar a sua atividade, de modo a produzir agentes adicionais.

Os aptâmeros purificados que reconhecem especificamente e se ligam aos nucleotídeos ou proteínas de Ahal funcional (ou outras moléculas relacionadas com função similar) podem ser usados para diminuir o nível de Ahal funcional (e/ou outras moléculas relacionadas com funções similares). Os aptâmeros são ácidos nucléicos ou moléculas de peptídeos selecionadas a partir de uma grande reunião de seqüências aleatórias para se ligarem à molécula-alvo específica. O pequeno tamanho dos aptâmeros os torna mais fáceis de sintetizar e modificar quimicamente e os capacita a acessar epíto- pos que de outro modo poderiam estar bloqueados ou escondidos. E os ap- tâmeros são geralmente antígenos nâo-tóxicos e traços por causa de sua semelhança próxima às moléculas endógenas. A geração, a seleção, e a distribuição de aptâmeros estão dentro da habilidade da técnica (ver, p.ex., Lee e col. (2006) Curr Opin Chem Biol. 10, 1-8; Yan e col. (2005) Front Bios- ci 10, 1802-1827; Hoppe-Seyler e" Btriz (20Õ0>xJ-Mol Med. 78(8), 426-430). Os procedimentos de seleção negativa podem produzir aptâmeros que po- dem distinguir perfeitamente entre as variantes moleculares. Por exemplo, os procedimentos de seleção negativa podem produzir aptâmeros que po- dem distinguir entre Hsp90/ADP e Hsp90/ATP; ou podem distinguir entre o Ahal funcional, a ATPase da Hsp90, e o complexo de ligação de Ahal fun- cional-ATPase da Hsp90. Os aptâmeros podem também ser usados para regular temporal e espacialmente a função da proteína (p.ex., a função do Ahal funcional) em células e organismos. Por exemplo, o sistema de peptí- deo regulado por ligante (LiRP) proporciona um método geral onde a ativi- dade de ligação dos peptídeos intracelulares é controlada por um aptâmero de peptídeo por sua vez regulado por uma molécula pequena permeável à célula (ver, p.ex., Binkowski (2005) Chem & Biol. 12(7), 847-55). Usando o LiRP ou um sistema de distribuição similar, a atividade de ligação do Ahal funcional poderia ser controlada por uma molécula pequena permeável à célula que interage com o aptâmero de proteína específico para o Ahal fun- cional intracelular introduzido. Assim, os aptâmeros podem proporcionar um meio efetivo de diminuir os níveis de Ahal funcional, por exemplo, direta- mente ligando o mRNA do Ahal funcional, a proteína expressa do Ahal fun- cional, o sítio de ligação à ATPase da Hsp90 para o Ahal funcional, e/ou o complexo de Ahal funcional-ATPase da Hsp90.

Os ácidos nucléicos anti-sentido purificados que especificamente reconhecem e se ligam aos ribonucleotídeos codificando o Ahal funcional (e/ou outras moléculas relacionadas com função similar) podem ser usados para diminuir os níveis de Ahal funcional (e/ou outras moléculas relaciona- das com funções similares). As moléculas de ácidos nucléicos anti-sentido dentro da invenção são aquelas que hibridizam especificamente (p.ex., se ligam), sob condições celulares, ao mRNA celular e/ou ao DNA genômico codificando, por exemplo, a proteína de Ahal funcional, em um modo que inibe a expressão daquela proteína, p.ex., por inibição da transcrição e/ou da tradução. As moléculas anti-sentido, efetivas para diminuir os níveis de Ahal funcional, podem ser projetadas, produzidas, e administradas por métodos comumente conhecidos para a tecnica(ver, p.ex., Chan e col. (2006) Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 33(5-6), 533-540).

As moléculas de ribozimas projetadas para clivar cataliticamente os transcritos-alvo de mRNA podem também ser usadas para diminuir os níveis de Ahal funcional e/ou moléculas relacionadas com atividade similar.

As moléculas de ribozimas específicas para o Ahal funcional podem ser pro- jetadas, produzidas, e administradas por métodos comumente conhecidos para a técnica (ver, p.ex., Fanning e Symonds (2006) Handbook Experimen- tal Pharmacology 173, 289-303G, revendo o uso terapêutico de ribozimas cabeça de martelo e RNA de grampo pequeno). Os oligonucleotídeos for- madores de triplex podem também ser usados para diminuir os níveis de Ahal funcional e/ou moléculas relacionadas com atividade similar (ver, de um modo geral, Rogers e col. (2005) Current Medicinal Chemistry 5(4), 319- 326).

Administração

Os agentes para uso nos métodos descritos neste documento podem ser distribuídos em uma variedade de meios conhecidos na técnica. Os agentes podem ser usados terapeuticamente como materiais exógenos ou como materiais endógenos. Os agentes exógenos são aqueles produzi- dos ou manufaturados fora do corpo e administrados ao corpo. Os agentes endógenos são aqueles produzidos ou manufaturados dentro do corpo por algum tipo de dispositivo (biológico ou outro) para a distribuição dentro dos, ou para outros, órgãos no corpo.

Os agentes descritos neste documento podem ser formulados por qualquer maneira convencional, usando um ou mais veículos e/ou exci- pientes farmaceuticamente aceitáveis, como descritos em, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 21â edição, ISBN: 0781746736 (2005), incorporado aqui por referência em sua totalidade. Tais formulações conterão uma quantidade terapeuticamente efetiva do a- gente, preferivelmente na forma purificada, junto com uma quantidade ade- quada de veículo, de modo a proporcionar a forma para a administração a- propriada ao paciente. A formulação deve satisfazer o modo de administra- çêor Os agentes de uso-com a presente invenção'podem ser formulados por métodos conhecidos para a administração a um paciente usando diversas rotas, as quais incluem, porém não estão limitadas à, parenteral, pulmonar, oral, tópica, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcu- tânea, intranasal, epidural, oftálmica, bucal, e retal. Os agentes individuais podem também ser administrados em combinação com um ou mais agentes adicionais da presente invenção e/ou juntamente com outros agentes biolo- gicamente ativos ou biologicamente inertes. Tais agentes biologicamente ativos ou inertes podem estar em comunicação fluida ou mecânica com o(s) agente(s) ou unidos ao(s) agente(s) por forças iônicas, covalentes, de Van der Waals, hidrofóbicas, hidrofílicas ou outras forças físicas.

Quando usada nos métodos da invenção, uma quantidade tera- peuticamente efetiva de um dos agentes descritos neste documento pode ser empregada na forma pura ou, onde tal forma existir, na forma de sal far- maceuticamente aceitável e com ou sem um excipiente farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, os agentes da invenção podem ser administrados, em uma razão razoável entre benefício/risco aplicável a qualquer tratamento médico, em uma quantidade suficiente para resgatar o tráfego intracelular e/ou extracelular de uma proteína caracterizado por energética de dobra- mento subótima e/ou pelo menos parcialmente restaurar as funções dos ca- nais em um paciente.

A toxicidade e a eficácia terapêutica de tais agentes podem ser determinadas por procedimentos padrões farmacêuticos em culturas de cé- lulas e/ou animais experimentais, para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente efetiva em 50% da população). A razão de doses entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o ín- dice terapêutico que pode ser expresso como a razão LD50/ED50, onde são preferidos os grandes índices terapêuticos.

A quantidade de um agente que pode ser combinado com um veículo farmaceuticamente aceitável, para produzir uma forma de dosagem única, variará dependendo do hospedeiro tratado e do modo particular de administração. Será apreciado por aqueles versados na técnica que o teor de-unidade de agente contido em uma dose individual de cada^rmK'de-chcF" sagem não necessita por si mesmo constituir uma quantidade terapeutica- mente efetiva, visto que a quantidade terapeuticamente efetiva necessária poderia ser atingida por administração de diversas doses. A administração do agente pode ocorrer como um evento único ou durante um curso de tem- po do tratamento. Por exemplo, um agente pode ser administrado diariamen- te, semanalmente, bi-semanalmente, ou mensalmente. Para algumas condi- ções, o tratamento poderia estender-se de diversas semanas até diversos meses ou mesmo um ano ou mais.

O nível específico de dose terapeuticamente efetiva para qual- quer paciente particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo o distúrbio que está sendo tratado e a gravidade do distúrbio; a atividade do agente específico empregado; a composição específica empregada; a idade, o peso do corpo, a saúde geral, o sexo e a dieta do paciente; a hora da ad- ministração; a rota de administração; a taxa de excreção do agente específi- co empregado; a duração do tratamento; os fármacos usados em combina- ção ou coincidentes com o agente específico empregado e fatores similares, bastante conhecidos nas técnicas médicas. Será entendido por um profis- sional versado que o uso diário total dos agentes para uso na presente in- venção será decidido pelo médico que acompanha, dentro do escopo do julgamento correto médico.

Os agentes que diminuem o nível do Ahal funcional, ou de ou- tras moléculas relacionadas com função similar, podem também ser usados em combinação com outras modalidades terapêuticas. Assim, além das te- rapias descritas neste documento, pode-se também fornecer ao paciente outras terapias sabidas serem eficazes para doenças particulares por do- bramento inadequado de uma proteína.

As preparações de liberação controlada (ou liberação continua- da) podem ser formuladas para prolongar a atividade do agente e reduzir a freqüência da dosagem. As preparações de liberação controlada podem também ser usadas para provocar o tempo do início da ação ou outras ca- racterísticas, tais como os níveis sangüíneos do agente, e consequentemen- te afetar a ocorrência dos efeitos colateraisr As preparações de liberação controlada podem ser projetadas para inicialmente liberar uma quantidade de um agente que produz o efeito terapêutico desejado, e gradual e continuamente liberar outras quantidades do agente para manter o nível do efeito terapêutico durante um período de tempo prolongado. Para manter um nível quase constante de um agente no corpo, o agente pode ser liberado da forma de dosagem em uma taxa que substituirá a quantidade de agente que está sendo metabolizado e/ou excre- tado do corpo. A liberação controlada de um agente pode ser estimulada por diversos indutores, p.ex., alteração no pH, alteração na temperatura, enzi- mas, água, ou outras condições fisiológicas ou moléculas.

Os sistemas de liberação controlada podem incluir, por exemplo, uma bomba de infusão, a qual pode ser usada para administrar o agente em um modo similar àquele usado para a distribuição de insulina ou quimiotera- pia para órgãos ou tumores específicos. Tipicamente, usando tal sistema, o agente é administrado em combinação com um implante polimérico biode- gradável, biocompatível (ver abaixo), que libera o agente durante um período de tempo controlado, em um local selecionado. Os exemplos de materiais poliméricos incluem os polianidridos, os poliortoésteres, o poli(ácido glicóli- co), o poli(ácido láctico), o polietileno acetato de vinila, e os copolímeros e as suas combinações. Além disso, um sistema de liberação controlada pode ser colocado em proximidade de um alvo terapêutico, assim requerendo somen- te uma fração de uma dosagem sistêmica.

Os agentes da invenção podem ser administrados por outros meios de liberação controlada ou dispositivos de distribuição, que são bas- tante conhecidos para aqueles de habilidade comum na técnica. Estes inclu- em, por exemplo, a hidroxipropilmetil celulose, outras matrizes poliméricas, géis, membranas permeáveis, sistemas osmóticos, revestimentos de múlti- plas camadas, micropartículas, lipossomos, microesferas, ou similares, ou uma combinação de quaisquer dos acima descritos, para proporcionar o per- fil de liberação desejado, em proporções variadas (ver abaixo). Os outros métodos de distribuição com liberação controlada dos agentes serão conhe- cidos para o profissional vesOado e estão-dentro tio-escopo da invenção. Os agentes que diminuem os níveis de Ahal funcional e/ou ou- tras moléculas relacionadas com funções similares podem ser administrados através de uma variedade de rotas bastante conhecidas nas técnicas. Os exemplos incluem os métodos envolvendo a injeção direta (p.ex., sistêmica ou estereotática), o implante de células engenheiradas para secretar o fator de interesse, os biomateriais que liberam fármacos, os dispositivos de matriz implantáveis, as bombas implantáveis, os géis e os hidrogéis injetáveis, os lipossomos, as micelas (p.ex., até 30 μιτι), as nanoesferas (p.ex., menos do que 1 μm), as microesferas (p.ex., 1-100 μιτι), os dispositivos de reservató- rios, etc.

A distribuição pulmonar de macromoles e/ou fármacos, tais co- mo os agentes descritos neste documento, proporciona uma administração não invasiva, relativamente fácil, ao tecido local dos pulmões ou ao sistema circulatório para a circulação sistêmica (ver, p.ex., Cryan (2004) AAPS J. 7(1) artigo 4, E20-41, que proporciona uma revisão da tecnologia de distribu- ição pulmonar). As vantagens da distribuição pulmonar incluem a não invasi- vidade, uma grande área de superfície para a absorção (-75 m2), um epité- Iio alveolar fino (-0,1 a 0,5 μm) que permite a rápida absorção, a ausência do metabolismo de primeira etapa, a atividade proteolítica diminuída, o início rápido de ação, e a alta biodisponibilidade. As formulações de fármacos para a distribuição pulmonar, com ou sem excipientes e/ou um líquido dispersável, são conhecidas na técnica. Os sistemas à base de veículos para a distribui- ção da biomolécula, tais como os sistemas de distribuição poliméricos, os lipossomos, e os carboidratos micronizados, podem ser usados em conjun- ção com a distribuição pulmonar. Os intensificadores da penetração (p.ex., tensoativos, sais biliares, ciclodextrinas, inibidores de enzimas (p.ex., qui- mostatina, leupeptina, bacitracina), e veículos (p.ex., microesferas e lipos- somos) podem ser usados para aumentar a captação através das células epiteliais alveolares para a distribuição sistêmica. São conhecidos na técnica diversos dispositivos de distribuição por inalação, tais como os inaladores de doses medidas, os nebulizadores, e os inaladores de pós secos, que podem ser usade?3~para-distribuir as ~b io moIécuIas descritas neste documento, (p.ex., AErx (Aradigm, CA); Respimat (Boehringer, Alemanha); AeroDose (Aerogen Inc., CA)). Como sabido na técnica, a seleção do dispositivo pode depender do estado da biomolécula (p.ex., solução ou pó seco) a ser usada, do méto- do e do estado de armazenagem, da escolha dos excipientes, e das intera- ções entre a formulação e o dispositivo. Os dispositivos de inalação de pós secos são particularmente preferidos para a distribuição pulmonar de agen- tes à base de proteínas (p.ex., Spinhaler (Fisons Pharmaceuticals, NY); Ro- tohaler (GSK, NC); Diskhaler (GSK, NC); Spiros (Dura Pharmaceuticals, CA); Nektar (Nektar Pharmaceuticals, CA)). É conhecida para aqueles ver- sados na técnica a formulação de pós secos do ingrediente biológico ativo para proporcionar bom escoamento, capacidade de dispersão, e estabilida- de,.

Os agentes que efetuam uma diminuição nos níveis de Ahal funcional podem ser encapsulados e administrados em uma variedade de sistemas de distribuição de veículos. Os exemplos de sistemas de distribui- ção de veículos incluem as microesferas, os hidrogéis, os implantes polimé- ricos, os veículos poliméricos inteligentes, e os lipossomos. Os sistemas à base de veículos para a distribuição do agente biomolecular podem: propor- cionar uma distribuição intracelular; regular as taxas de liberação de biomo- léculas/agentes; aumentar a proporção de biomolécula que atinge o seu lo- cal de ação; melhorar o transporte do fármaco para o seu local de ação; permitir a deposição co-localizada com outros agentes ou excipientes; me- lhorar a estabilidade do agente in vivo; prolongar o tempo de residência do agente em seu local de ação por redução da depuração; diminuir a distribui- ção não específica do agente para os tecidos que não sejam alvos; diminuir a irritação causada pelo agente; diminuir a toxicidade devida às altas doses iniciais do agente; alterar a imunogenicidade do agente; diminuir a freqüên- cia da dosagem, melhorar o sabor do produto; e/ou melhorar a vida útil do produto.

As microesferas poliméricas podem ser produzidas usando po- límeros de ocorrência natural ou sintéticos e são sistemas particulados na faixa-de· tamanhos de 0,1 a 500 μιη. As micelas poliméricas e os polimertF mas são veículos de distribuição poliméricos com características similares às microesferas e podem também facilitar a encapsulação e a distribuição das biomoléculas descritas neste documento. A fabricação, a encapsulação, e a estabilização das microesferas para uma variedade de cargas úteis de bio- moléculas estão dentro da habilidade da técnica (ver, p.ex., Varde e Pack (2004) Expert Opin. Biol. 4(1) 35-51). A taxa de liberação das microesferas pode ser ajustada pelo tipo de polímero, peso molecular do polímero, com- posição do copolímero, excipientes adicionados à formulação de microesfe- ras, e tamanho das microesferas. Os materiais de polímeros úteis para a formação de microesferas incluem PLA, PLGA, PLGA revestido com DPPC, DPPC, DSPC, EVAc, gelatina, albumina, quitosano, dextrana, DL-PLG, S- DLMs, PEG (p.ex., ProMaxx), hialuronato de sódio, derivados de dicetopipe- razina (p.ex., Technosphere), partículas de fosfato de cálcio-PEG, e DPPG de derivado de oligossacarídeo (p.ex., Solidose). A encapsulação pode ser efetuada, por exemplo, usando um método de emulsão única de água/óleo, uma emulsão dupla de água-óleo-água, ou a liofilização. Diversas tecnologi- as de encapsulação comerciais estão disponíveis (p.ex., ProLease®, Alker- me). As microesferas que encapsulam os agentes descritos neste documen- to podem ser administradas em uma variedade de meios, incluindo parente- ral, oral, pulmonar, implantação, e dispositivo de bombeamento.

Os hidrogéis poliméricos, compostos de polímeros hidrofílicos, tais como colágeno, fibrina, e alginato, podem também ser usados para a liberação continuada de agentes que diminuem os níveis de Ahal funcional e/ou outras moléculas relacionadas com função similar (ver, de um modo geral, Sakiyama e col. (2001) FASEB J. 15, 1300-1302).

Os implantes poliméricos tridimensionais, na escala de milíme- tros até centímetros, podem ser carregados com os agentes que diminuem os níveis de Ahal funcional e/ou outras moléculas relacionadas com função similar (ver, de um modo geral, Teng e col (2002) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 99, 3024-3029). Um implante polimérico tipicamente proporciona um depósito maior do fator bioativo. Os implantes podem também ser fabricados em suportes estruturais, ajustando a geometria (p.ex., o formato, o tamanho, a porosidade) à aplicação. Os sistemas de distribuição à base de matrizes implantáveis estão também comercialmente disponíveis em uma variedade de tamanhos e perfis de distribuição (p.ex., Innovative Research of America, Sarasota, FL).

Os veículos poliméricos "inteligentes" podem ser usados para administrar os agentes que diminuem os níveis de Ahal funcional e/ou ou- tras moléculas relacionadas com função similar (ver, de um modo geral, Stayton e col. (2005) Orthod Craniofacial Res 8, 219-225; Wu e col. (2005) Nature Biotech (2005) 23(9), 1137-1146). Os veículos deste tipo utilizam po- límeros que são hidrofílicos e como secretos no pH fisiológico, porém tor- nam-se hidrofóbicos e desestabilizadores da membrana após captação no compartimento endossômico (i.e., estímulos ácidos a partir do gradiente de pH endossômico), onde eles aumentam a liberação da molécula de carga para o citoplasma. O projeto do veículo polimérico inteligente pode incorpo- rar funcionalidades sensíveis ao pH, grupos desestabilizadores de membra- na hidrofóbicos, conjugação versátil e/ou elementos de formação de comple- xos para permitir a incorporação do fármaco, e um componente de alveja- mento de célula opcional. A carga macromolecular terapêutica potencial in- clui os peptídeos, as proteínas, os anticorpos, os polinucleotídeos, o DNA de plasmídio (pDNA), os aptâmeros, os oligodessoxinucleotídeos anti-sentido, o RNA silenciador, e/ou as ribozimas que efetuam uma diminuição nos níveis de Ahal funcional e/ou moléculas relacionadas com função similar. Como um exemplo, os veículos poliméricos inteligentes, internalizados através da endocitose mediada por receptor, podem aumentar a distribuição citoplásmi- ca de dsRNA alvejado para o Ahal funcional, e/ou outros agentes descritos neste documento. Os veículos poliméricos incluem, por exemplo, a família de polímeros de poli(ácido alquilacrílico), os exemplos específicos incluindo o poli(ácido metilacrílico), o poli(ácidoetilacrílico) (PEAA), o po- li(ácidopropilacrílico) (PPAA), e o poli(ácido butilacrílico) (PBAA), onde o grupo alquila progressivamente aumentou por um grupo metileno. Os veícu- los poliméricos inteligentes com atividade desestabilizadora de membrana, sensíveis ao pH, potente, podem set^rojetados-para^estarem abaixo do Iimi- te de tamanho de excreção renal. Por exemplo, os polímeros poli(EAA-co- BA-co-PDSA) e poli(PAA-co-BA-co-PDSA) exibem alta atividade hemolíti- ca/desestabilizadora de membrana nos pesos moleculares baixos de 9 e 12 kDa, respectivamente. Diversas químicas de Iigadores estão disponíveis pa- ra proporcionar locais de conjugação degradáveis para as proteínas, os áci- dos nucléicos, e/ou as porções de alvejamento. Por exemplo, o monômero de piridil dissulfeto acrilato (PDSA) permite as reações de conjugação efici- entes através das ligações de dissulfeto que podem ser reduzidas no cito- plasma após a translocação endossômica das substâncias terapêuticas.

Os Iipossomos podem ser usados para administrar os agentes que diminuem os níveis de Ahal funcional e/ou outras moléculas relaciona- das com função similar. A capacidade de carregamento e a taxa de liberação de fármaco dos Iipossomos podem depender da composição do lipídio, do tamanho, da carga, da razão entre fármaco/lipídio, e do método de distribui- ção. Os Iipossomos convencionais são compostos de lipídios neutros ou a- niônicos (naturais ou sintéticos). Os lipídios comumente usados são as Ieci- tinas, tais como as (fosfatidil colinas), as fosfatidil etanolaminas (PE), a es- fingomielinas, as fosfatidil serinas, os fosfatidil gliceróis (PG), e os fosfatidil inositóis (PI). Os métodos de encapsulação de Iipossomos são comumente conhecidos nas técnicas (Galovic e col. (2002) Eur. J. Pharm. Sei. 15, 441- 448; Wagner e col. (2002) J. Liposome Res. 12, 259-270). Os Iipossomos alvejados e os Iipossomos reativos podem também ser usados para distribuir as biomoléculas da invenção. Os Iipossomos alvejados têm Iigantes de alve- jamento, tais como os anticorpos monoclonais ou as lectinas, unidos à sua superfície, permitindo a interação com receptores e/ou tipos de células es- pecíficos. Os Iipossomos reativos ou polimórficos incluem uma ampla faixa de lipossomos, cuja propriedade comum é a sua tendência a alterar sua fase e estrutura em uma interação particular (p.ex., lipossomos sensíveis ao pH) (ver, p.ex., Lasic (1997) Liposomes in Gene Delivery1 CRC Press, FL).

Diversos outros sistemas de distribuição são conhecidos na téc- nica e podem ser usados para administrar os agentes da invenção. Além disso, estes enji^Tos~sisiemas~"de~disiTibuição podem ser combinados e/ou modificados para otimizar a administração dos agentes da presente inven- ção.

Composições farmacêuticas compreendendo o dsRNA

Em diversos aspectos, a invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo um dsRNA, como descrito neste documento, e um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica com- preendendo o dsRNA é útil para tratar uma doença ou distúrbio associado com a expressão ou a atividade de um gene Aha1 tal como os processos patológicos mediados pela expressão do Ahal. Tais composições farmacêu- ticas são formuladas com base no modo de distribuição. Um exemplo são as composições que são formuladas para a administração sistêmica via distri- buição parenteral.

As composições farmacêuticas da invenção são administradas em dosagens suficientes para inibir a expressão de um gene Aha. A presen- te invenção verificou que, por causa de sua eficiência melhorada, as compo- sições compreendendo o dsRNA da invenção podem ser administradas em dosagens surpreendentemente baixas. Uma dosagem máxima de 5 mg de dsRNA por quilograma de peso do corpo de receptor por dia é suficiente pa- ra inibir ou completamente suprimir a expressão de um gene Aha.

Em geral, uma dose adequada de dsRNA estará na faixa de 0,01 micrograma a 5,0 miligramas por quilograma de peso do corpo do re- ceptor por dia, geralmente na faixa de 1 micrograma a 1 mg por quilograma de peso do corpo por dia. A composição farmacêutica pode ser administrada uma vez ao dia, ou o dsRNA pode ser administrado como duas, três, ou mais sub-doses em intervalos apropriados por todo o dia ou mesmo usando infusão contínua ou distribuição através de uma formulação de liberação controlada. Neste caso, o dsRNA contido em cada sub-dose deve ser cor- respondentemente menor para atingir a dosagem diária total. A unidade de dosagem pode também ser combinada para a distribuição durante diversos dias, p.ex., usando uma formulação de liberação continuada convencional, a qual proporciona a liberação continuada do dsRNA durante um período de diversos dias. As formulações de liberação continuada são bastante conhe- cidas na técnica e são particularmente úteis para a distribuição vaginal dos agentes, tal como poderia ser usada com os agentes da presente invenção. Nos diversos aspectos, a unidade de dosagem contém um múltiplo corres- pondente da dose diária.

O técnico versado apreciará que certos fatores podem influenci- ar a dosagem e o momento requeridos para tratar efetivamente um paciente, incluindo, porém não limitados à, gravidade da doença ou do distúrbio, tra- tamentos prévios, saúde geral e/ou idade do paciente, e outras doenças pre- sentes. Além disso, o tratamento de um paciente com uma quantidade tera- peuticamente efetiva de uma composição pode incluir um único tratamento ou uma série de tratamentos. As estimativas das dosagens efetivas e as meias-vidas in vivo para os dsRNAs individuais incluídos pela invenção po- dem ser feitas usando metodologias convencionais ou na base de teste in vivo usando um modelo de animal apropriado, como descrito alhures neste documento.

Os avanços na genética do camundongo geraram diversos mo- delos de camundongos para o estudo de diversas doenças humanas, tais como os processos patológicos mediados pela expressão do Aha. Tais mo- delos são usados para o teste in vivo do dsRNA, bem como para determinar uma dose terapeuticamente efetiva.

A presente invenção também inclui as composições e as formu- lações farmacêuticas que incluem os compostos de dsRNA da invenção. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas em diversos modos, dependendo de se o tratamento local ou sistêmico for desejado e da área a ser tratada. A administração pode ser tópica, pulmonar, p.ex., por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo por nebuli- zador; intra-traqueal, intranasal, epidérmica e transdérmica, oral ou parente- ral. A administração parenteral inclui a injeção ou a infusão intravenosa, in- tra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular; ou a administração intracraniana, p.ex., intratecal ou intraventricular.

As composições e as formulações farmacêuticas para a adminis- tração tópica podem incluir os emplastros transdérmicos, os t-iTgüentosras loções, os cremes, os géis, as gotas, os supositórios, os sprays, os líquidos e os pós. Os veículos farmacêuticos, as bases aquosas, em pós ou oleosas, os espessantes convencionais e similares podem ser necessários ou dese- jáveis. As camisinhas revestidas, as luvas e similares podem também ser úteis. Por exemplo, as formulações tópicas incluem aquelas nas quais os dsRNAs da invenção estão em mistura com um agente de distribuição tópica, tal como os lipídios, os lipossomos, os ácidos graxos, os ésteres de ácidos graxos, os esteróides, os agentes quelantes e os tensoativos. Em diversos aspectos, os lipídios e os lipossomos podem incluir os neutros (p.ex., diole- oilfosfatidil etanolamina = DOPE, dimiristoilfosfatidil colina = DMPC, diestea- rolifosfatidil colina) os negativos (p.ex., dimiristoilfosfatidil glicerol = DMPG ) e os catiônicos (p.ex., dioleoiltetrametilaminopropil = DOTAP e dioleoilfosfa- tidil etanolamina = DOTMA). Os dsRNAs da invenção podem ser encapsula- dos dentro de lipossomos ou podem formar complexos com os mesmos, em particular com os lipossomos catiônicos. Alternativamente, os dsRNAs po- dem formar complexos com os lipídios, em particular com os lipídios catiôni- cos. Em diversos aspectos, os ácidos graxos e os ésteres podem incluir, po- rém não estão limitados, o ácido araquidônico, o ácido oléico, o ácido eico- sanóico, o ácido láurico, o ácido caprílico, o ácido cáprico, o ácido mirístico, o ácido palmítico, o ácido esteárico, o ácido linoléico, o ácido linolênico, o dicaprato, o tricaprato, a monooleína, a dilaurina, o 1-monocaprato de gliceri- la, a 1-dodecilazacicloeptan-2-ona, uma acilcarnitina, uma acilcolina, ou um éster de C-M0 alquila (p.ex., o miristato de isopropila IPM), o monoglicerídeo, o diglicerídeo ou seu sal farmaceuticamente aceitável.

Aqueles de habilidade na técnica reconhecerão que as composi- ções e as formulações para a administração oral podem incluir os pós ou os grânulos, os microparticulados, os nanoparticulados, as suspensões ou as soluções em água ou os meios não aquosos, as cápsulas, as cápsulas gela- tinosas, os sachês, os comprimidos ou os minicomprimidos. Os espessantes, os agentes aromatizantes, os diluentes, os emulsificantes, os auxiliares de dispersão ou os aglutinantes podem ser desejáveis. As formulações orais podem ser aquelas nas quais os dsRNAs'darinvenção sãa administrados em conjunção com um ou mais intensificadores da penetração, tensoativos, e quelantes. Os tensoativos podem incluir os ácidos graxos e/ou os ésteres ou os sais deles, os ácidos biliares e/ou os sais deles. Os ácidos biliares/sais preferidos incluem o ácido quenodessoxicólico (CDCA) e o ácido ursodesso- xiquenodessoxicólico (UDCA), o ácido cólico, o ácido desidrocólico o ácido dessoxicólico, o ácido glucólico, o ácido glicólico, o ácido glicodessoxicólico, o ácido taurocólico, o ácido taurodessoxicólico, o tauro-24,25-diidro-fusidato de sódio e o glicodiidrofusidato de sódio. Os ácidos graxos podem incluir o ácido araquidônico, o ácido undecanóico, o ácido oléico, o ácido láurico, o ácido caprílico, o ácido cáprico, o ácido mirístico, o ácido palmítico, o ácido esteárico, o ácido linoléico, o ácido linolênico, o dicaprato, o tricaprato, a monooleína, a dilaurina, o 1-monocaprato de glicerila, a 1- dodecilazacicloeptan-2-ona, uma acilcarnitina, uma acilcolina, ou um mono- glicerídeo, um diglicerídeo ou um seu sal farmaceuticamente aceitável (p.ex., sódio). As combinações de intensificadores da penetração, por exemplo, ácidos graxos/sais em combinação com ácidos biliares/sais, podem ser úteis. Por exemplo, uma combinação pode ser o sal sódico de ácido láurico, ácido cáprico e UDCA. Os intensificadores da penetração adicionais podem incluir o éter polioxietileno-9-laurílico, o éter polioxietileno-20-cetílico.

Aqueles de habilidade na técnica também reconhecerão que os dsRNAs da invenção podem ser distribuídos oralmente, na forma granular, incluindo as partículas secas pulverizadas, ou como complexos para formar micro ou nanopartículas. Os agentes de formação de complexos de dsRNA incluem os poli-aminoácidos; as poliiminas; os poliacrilatos; os poli(acrilatos de alquila), os polioxetanos, os poli(cianoacrilatos de alquila); as gelatinas cationizadas, as albuminas, os amidos, os acrilatos, os polietilenoglicóis (PEG) e os amidos; os poli(cianoacrilatos de alquila); as poliiminas derivadas de DEAE, os polulanos, as celuloses e os amidos. Os agentes formadores de complexos podem incluir o quitosano, o N-trimetilquitosano, a poli-L-lisina, a poliistidina, a poliornitina, as poliesperminas, a protamina, a polivinilpiridina, o politiodietilaminometiletileno P(TDAE), o poliaminoestireno (p.ex., p-amino), o poli(cianoacrilato de^metila")?-—poiitctarroacrilato de etila), o po- li(cianoacrilato de butila), o poli(cianoacrilato de isobutila), o poli(cianoacrilato de isoexila), o metacrilato de DEAE1 o hexilacrilato de DEAE, a DEAE- acrilamida, a DEAE-albumina e a DEAE-dextrana, o poli(acrilato de metila), o poli(acrilato de hexila), o poli(ácido D,L-láctico), o poli(ácido DL-láctico-co- glicólico) (PLGA), o alginato, e o polietilenoglicol (PEG).

As composições e as formulações para a administração parente- ral, intratecal ou intraventricular podem incluir as soluções aquosas estéreis, as quais podem também conter tampões, diluentes e outros aditivos ade- quados, tais como, porém não limitados aos, intensificadores da penetração, compostos veículos e outros veículos ou excipientes farmaceuticamente a- ceitáveis.

As composições farmacêuticas da presente invenção incluem, porém não estão limitadas às, soluções, emulsões, e formulações contendo lipossomos. Estas composições podem ser geradas a partir de uma varieda- de de componentes que incluem, porém não estão limitados aos, líquidos pré-formados, sólidos auto-emulsificantes e semi-sólidos auto-emulsificantes.

As formulações farmacêuticas da presente invenção, as quais podem convenientemente ser apresentadas na forma de dosagem de unida- de, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais bastante conhecidas na indústria farmacêutica. Tais técnicas incluem a etapa de colo- car em associação os ingredientes ativos com o(s) veículo(s) ou o(s) excipi- ente(s) farmacêutico(s). Em geral, as formulações são preparadas colocando em associação, uniforme e intimamente, os ingredientes ativos com os veí- culos líquidos ou os veículos sólidos finamente divididos ou ambos, e então, se necessário, moldando o produto.

As composições da presente invenção podem ser formuladas em quaisquer das muitas formas de dosagens possíveis, tais como, porém não limitadas aos, comprimidos, cápsulas, cápsulas gelatinosas, xaropes líquidos, géis moles, supositórios, e enemas. As composições da presente invenção podem também ser formuladas como suspensões em meios aquo- sos, não aquosos ou mistos. As suspensões aquosas podem adicionalmente conter^substâneías-qae^aurrrentam a viscosidade da suspensão, incluindo, por exemplo, a carboximetilcelulose sódica, o sorbitol e/ou a dextrana. A suspensão pode também conter estabilizantes.

Em diversos aspectos da presente invenção, as composições farmacêuticas podem ser formuladas e usadas como espumas. As espumas farmacêuticas incluem as formulações tais como, porém não limitadas às, emulsões, microemulsões, cremes, geléias e lipossomos. Embora basica- mente similares na natureza, estas formulações variam nos componentes e na consistência do produto final. A preparação de tais composições e formu- lações é geralmente conhecida para aqueles versados nas técnicas farma- cêuticas e de formulação e pode ser aplicada à formulação das composições da presente invenção. Exame

Um outro aspecto da invenção é dirigido a um sistema para e- xaminar os agentes candidatos para as ações sobre o Ahal funcional e/ou outras moléculas relacionadas com funções similares, os quais podem ser úteis para o desenvolvimento de composições para o tratamento terapêutico ou profilático de doenças por dobramento da proteína. Os ensaios podem ser efetuados sobre células vivas de mamíferos, as quais mais intimamente se assemelham aos efeitos de um nível particular de fármaco no soro, no corpo. As linhagens celulares expressando uma proteína com características de dobramento energeticamente desfavorável seriam úteis para avaliar a atividade dos agentes bioativos potenciais sobre o Ahal funcional e/ou ou- tras moléculas relacionadas com função similar, ou sobre os extratos prepa- rados a partir das linhagens celulares cultivadas. Os estudos usando extra- tos oferecem a possibilidade de uma determinação mais rigorosa das intera- ções diretas entre agente/enzima.

Assim, a presente invenção pode proporcionar um método para avaliar um agente para diminuir o nível de Ahal funcional e/ou outras molé- culas relacionadas com funções similares, e assim estabilizar o dobramento das proteínas com características de dobramento energeticamente desfavo- rável em um hospedeiro mamífero, por exemplo, um hospedeiro humano. Este ensato-pode compreender o contato da linhagem celular trasgenica que expressa a proteína dobrada inadequadamente ou um extrato dela com uma quantidade pré-selecionada do agente, em um meio de cultura ou tam- pão adequado, e a medição do nível de Ahal funcional e/ou de outras molé- culas relacionadas com funções similares, em comparação com uma Iinha- gem celular de controle ou parte do extrato na ausência do dito agente e/ou uma linhagem celular de controle expressando uma variante não dobrada inadequadamente da proteína de interesse. Por exemplo, os métodos de exame podem identificar os agentes que diminuem os níveis de Ahal fun- cional, diminuem a ligação do Ahal intracelular à Hsp90, diminuem a ativa- ção da ATPase da Hsp90, diminuem os níveis intracelulares de Hsp90/ATP, e/ou diminuem os níveis intracelulares de Hsp90/ADP.

Mais especificamente, um agente candidato para o tratamento de uma doença por dobramento inadequado de uma proteína pode ser exa- minado, proporcionando uma célula expressando estavelmente uma proteí- na dobrada inadequadamente de interesse, em um meio de cultura ou tam- pão adequado, administrando o agente candidato à célula, medindo os ní- veis de Ahal funcional na célula, e determinando se o agente candidato di- minui o nível de Ahal funcional intracelular. Alternativamente, um agente candidato para o tratamento de uma doença por dobramento inadequado de uma proteína pode ser examinado, proporcionando uma célula estavelmente expressando uma proteína dobrada inadequadamente de interesse, em um meio de cultura ou tampão adequado, administrando o agente candidato à célula, medindo os níveis de ligação do Ahal intracelular à Hsp90 e/ou a ativação da ATPase da Hsp90, e determinando se o agente candidato dimi- nui tal ligação e/ou ativação. Os candidatos desejáveis geralmente possuirão a capacidade de diminuir os níveis de Ahal funcional na célula. O forneci- mento de uma célula estavelmente expressando uma proteína dobrada ina- dequadamente está dentro da habilidade da técnica (ver, p.ex., os Exemplos 1-11).

Qualquer método adequado para detectar os níveis de Ahal funcional e/ou moléculas relacionadas com função similar, ou complexos formados com eles; pode ser empregado para níveisTesaltaníesTla atírrrinis- tração do agente candidato (ver, p.ex., os Exemplos 5-9). Entre os métodos tradicionais que podem ser empregados estão a co-imunoprecipitação, a reticulação, a co-purificação através de gradientes ou colunas cromatográfi- cas, e os ensaios de atividade relacionados à função do Ahal. A utilização de procedimentos tais como estes permite a identificação das proteínas e/ou dos complexos de interesse.

Os agentes identificados no exame geralmente demonstrarão a capacidade de interagir com o Ahal funcional e/ou as moléculas relaciona- das com função similar em uma forma tal de modo a efetuar uma estabiliza- ção das proteínas com cinética de dobramento subótima, de modo a resultar no trânsito aumentado da proteína. Por exemplo, os agentes identificados podem diminuir os níveis de Ahal funcional, diminuir a ligação do Ahal in- tracelular à Hsp90, diminuir a ativação da ATPase da Hsp90, diminuir os ní- veis intracelulares de Hsp90/ATP, e/ou aumentar os níveis intracelulares de Hsp90/ADP. Estes agentes podem incluir, porém não estão limitados aos, ácidos nucléicos, polipeptídeos, dsRNAs, moléculas anti-sentido, aptâmeros, ribozimas, hélices triplas, anticorpos, e moléculas inorgânicas pequenas.

Além disso, os métodos de exame descritos acima podem em- pregar uma outra célula estavelmente expressando uma variante protéica não dobrada inadequadamente. Pela administração do agente candidato, em um modo substancialmente similar em relação à outra célula (expressando uma proteína com cinética de dobramento subótima), e medição do nível de trânsito da proteína não dobrada inadequadamente, pode-se determinar se o agente candidato diminui substancialmente o nível de trânsito da proteína não dobrada inadequadamente. De preferência, os agentes identificados não interferem substancialmente com o dobramento e/ou o trânsito da proteína não dobrada inadequadamente. Também, uma célula expressando estavel- mente outras proteínas pode ser usada similarmente para determinar se o agente afeta o dobramento e/ou o trânsito de outras proteínas relacionadas ou não relacionadas. Por exemplo, um agente identificado que diminui os níveis de Ahal funcional preferivelmente não prejudica significativamente o trânsito de outras proteínas com^siobrameTitosrTnais "energeticamente está- veis.

A invenção também inclui os métodos para identificar os agentes que especificamente se ligam ao Ahal funcional e/ou às outras moléculas relacionadas com função similar. Tal método envolve as etapas de propor- cionar a proteína de Ahal funcional purificada imobilizada e pelo menos um agente de teste, contatar a proteína imobilizada com o agente de teste, re- mover por lavagem os agentes não ligados à proteína imobilizada; e detectar se o agente de teste está ligado ou não à proteína imobilizada. Estes agen- tes que permanecem ligados à proteína imobilizada são aqueles que intera- gem especificamente com a proteína de Ahal funcional.

A presente invenção também compreende o uso do Ahal fun- cional (e/ou de outras moléculas com função similar) nos esforços de desco- berta de fármacos para elucidar as relações que existem entre o Ahal fun- cional (e/ou outras moléculas com função similar) e um estado de doença, fenótipo, ou condição, tal como as doenças por dobramento inadequado de uma proteína. Estes métodos incluem detectar ou diminuir os níveis de poli- nucleotídeos de Ahal compreendendo o contato de uma amostra, tecido, célula, ou organismo com os agentes da presente invenção, a medição do nível de ácido nucléico ou proteína do Ahal funcional, e/ou um ponto final fenotípico ou químico relacionado em algum tempo após o tratamento, e op- cionalmente a comparação do valor medido com uma amostra não tratada ou amostra tratada com um agente adicional da invenção. Estes métodos podem também ser efetuados em paralelo ou em combinação com outros experimentos, para determinar a função de genes desconhecidos para o processo de validação do alvo ou para determinar a validade de um produto de gene particular como um alvo para o tratamento ou a prevenção de uma doença, condição, ou fenótipo particular. Tratamento Terapêutico

Um aspecto da invenção proporciona métodos de tratamento para doenças por dobramento da proteína. Sem estar ligado por uma teoria particular, é possível que a diminuição dos níveis de Ahal funcional e, por- tanto, a dimrrrisçãO^ía^atividade da~ATPase da Hsp90, possa" permitir um tempo adicional para o mutante de AF508 cineticamente provocado utilizar a chaperoma de resgate para criar um dobramento adequado de mais expor- tação. O dobramento da proteína pode, portanto, ser tratado em um paciente necessitado dele por administração de um agente que diminua o nível de Ahal funcional e/ou outras moléculas relacionadas tendo função similar.

Ademais, e novamente sem estar ligado por uma teoria particu- lar, é possível que o estado de Hsp90-ADP favoreça uma ligação das vias de carga e ERAD, enquanto que o estado de Hsp90-ATP proporcione o aco- plamento ao COPII com base na resposta do Ahal funcional (ver, p.ex, a figura 8B, X) ou da p23 (ver, p.ex., a figura 8B, Y) dadas as suas proprieda- des bioquímicas conhecidas. Assim, uma outra abordagem para o tratamen- to profilático ou terapêutico de uma doença por dobramento inadequado de uma proteína pode envolver a administração a um paciente necessitado dele de um agente que diminua a ligação de um Ahal funcional à ATPase da Hsp90 e/ou diminua os níveis de ativação resultantes que resultam da liga- ção do Ahal funcional à ATPase da Hsp90.

De preferência, a administração do agente não interfere subs- tancialmente com o dobramento e/ou o trânsito das outras proteínas intrace- lulares. Por exemplo, a administração de uma agente que diminua os níveis de Ahal funcional, diminua a ligação do Ahal funcional à ATPase da Hsp90, e/ou diminuía os níveis de ativação resultantes que resultam da ligação do Ahal funcional à ATPase da Hsp90, para tratar uma doença por dobramento inadequado de uma proteína, de preferência não prejudica significativamente o trânsito das outras proteínas, por exemplo, das outras proteínas com do- bramentos mais energeticamente estáveis.

Os estados de doença ou as condições indicativas de uma ne- cessidade por terapia no contexto da presente invenção, e/ou receptivas às metodologias de tratamento descritas neste documento, incluem as doenças por dobramento inadequado de uma proteína, tais como a CF, a síndrome de marfan, a doença de Fabry, a doença de Gaucher, a retinite pigmentosa 3, a doença de Alzheimer, a diabete Tipo II, a doença de Parkinson, as encefa- lopaíiss-espongiformes, tais como a doença de Creutzfeldt-Jakob, a amiloi- dose sistêmica primária, a amiloidose sistêmica secundária, a amiloidose sistêmica senil, a polineuropatia amilóide familiar I, a angiopatia amilóide cerebral hereditária, a amiloidose relacionada à hemodiálise, a polineuropa- tia amilóide familiar III, a amiloidose sistêmica hereditária de Finnish, o carci- noma medular da tireóide, a amiloidose atrial, a amiloidose sistêmica não- neuropática hereditária, a amiloidose localizada por injeção, e a amiloidose renal hereditária. Por exemplo, as doenças por dobramento inadequado de uma proteína, tratáveis de acordo com os métodos descritos neste docu- mento, incluem aquelas doenças onde as proteínas dobradas inadequada- mente resultam no trânsito diminuído da proteína a partir do ER e na degra- dação aumentada da proteína, tais como a CF, a síndrome de marfan, a do- ença de Fabry, a doença de Gaucher, e a retinite pigmentosa 3. Como um outro exemplo, as doenças por dobramento inadequado de uma proteína, tratáveis de acordo com os métodos descritos neste documento, incluem aquelas doenças onde as proteínas dobradas inadequadamente resultam na deposição de agregados insolúveis, tais como a doença de Alzheimer, a dia- bete Tipo II, a doença de Parkinson, e as encefalopatias espongiformes (p.ex., a doença de Creutzfeldt-Jakob). As doenças por dobramento inade- quado de uma proteína, listadas acima, podem ser causadas, pelo menos em parte, por dobramento inadequado de GFTR, fibrilina, alfa galactosidase, beta glicocerebrosidase, rodopsina, amilóide beta e tau (polipeptídeo amilói- de da ilhota), amilina, sinucleína alfa, priônio, cadeia leve da imunoglobulina, amilóide do soro A, transtiretina, cistatina C, p2-microglobulina, apolipoprote- ína A-1, gelsolina, calcitonina, fator natriurético atrial, lisozima, insulina, e fibrinogênio.

Uma determinação da necessidade por tratamento tipicamente será avaliada por uma história e exame físico consistentes com a doença. Por exemplo, a diagnose de CF pode envolver uma combinação de critérios clínicos e análise dos valores de Cl no suor. Além disso, a análise do DNA para o AF508 pode ser efetuada. Tal diagnose da CF está dentro da habili- dade da técnica (ver, p.ex., Cutting (2005) Annu Rev Genomics Hum Genet -6, 237-260, revendo a CF). Os pacientes com uma necessidade identificada de terapia incluem aqueles com uma doença por dobramento inadequado de uma proteína diagnosticada ou uma indicação de uma doença por dobra- mento inadequado de uma proteína receptiva ao tratamento terapêutico des- crito neste documento, e os pacientes que tenham sido tratados, estão sen- do tratados, ou serão tratados para uma doença por dobramento inadequado de uma proteína. O paciente é preferivelmente um animal, incluindo, porém não limitado aos, mamíferos, répteis, e aves, mais preferivelmente os cava- los, as vacas, os cães, os gatos, as ovelhas, os porcos, e as galinhas, e mais preferivelmente ainda o ser humano.

Um outro aspecto da invenção é dirigido para o resgate de uma célula dos efeitos do dobramento inadequado de uma proteína. Tal aborda- gem é dirigida à função celular e pode ser efetuada in vitro, in vivo, ou ex vivo. Como um exemplo, o resgate de uma célula do efeito do dobramento inadequado de uma proteína pode ocorrer em uma célula de uma linhagem celular cultivada. Como um outro exemplo, o resgate de uma célula do efeito do dobramento inadequado de uma proteína pode ocorrer em uma célula removida de um paciente e então subseqüentemente introduzida novamente no paciente. Como um exemplo adicional, o resgate de uma célula do efeito do dobramento inadequado de uma proteína pode ocorrer em uma célula do paciente in situ. A administração de um agente que diminui os níveis de A- ha1 funcional e/ou moléculas relacionadas com função similar a uma célula onde ocorre o dobramento inadequado de uma proteína pode facilitar a es- tabilização dos dobramentos energeticamente instáveis, resultando no res- gate do trânsito intracelular e/ou extracelular prejudicado da proteína. Por exemplo, a administração a uma célula que expressa o CFTR com AF508 dobrado inadequadamente de um agente que reduz os níveis da co- chaperona de Hsp90 e do Ahal funcional pode aumentar a estabilidade do AF508 no ER1 resgatar o tráfego do AF508 para a superfície celular, aumen- tar a disponibilidade de AF508 da superfície celular, e/ou pelo menos parci- almente restaurar a função do canal (ver, p.ex., o Exemplo 10). De preferên- cia, a administração de um agente para diminuir os níveis de Ahal funcional, para resgatar uma célula dos efeitos"cto^dobramentonnadequado de uma proteína, preferivelmente não interfere de modo substancial com o dobra- mento e/ou o trânsito das outras proteínas intracelulares. Tratamento Terapêutico Usando o dsRNA

A invenção refere-se, em particular, ao uso de um dsRNA ou uma composição farmacêutica preparada a partir dele para o tratamento de Fibrose Cística. Devido ao efeito inibitório sobre a expressão do Ahal, um dsRNA de acordo com a invenção, ou uma composição farmacêutica prepa- rada a partir dele, pode aumentar a qualidade de vida dos pacientes com Fibrose Cística.

Além disso, a invenção refere-se ao uso de um dsRNA ou de uma composição farmacêutica da invenção pretendida para o tratamento de câncer, p.ex., para a inibição do crescimento do tumor e da metástase do tumor. Por exemplo, o dsRNA, ou uma composição farmacêutica preparada a partir dele, pode ser usado para o tratamento de tumores sólidos, como o câncer de mama, o câncer de pulmão, o câncer de cabeça e pescoço, o câncer do cérebro, o câncer abdominal, o câncer do cólon, o câncer colorré- tal, o câncer do esôfago, o câncer gastrointestinal, o glioma, o câncer do fí- gado, o câncer da língua, o neuroblastoma, o osteossarcoma, o câncer ova- riano, o câncer pancreático, o câncer da próstata, o retinoblastoma, o tumor de Wilm, o mieloma múltiplo, e para o tratamento de câncer da pele, como o melanoma, para o tratamento de Iinfomas e câncer do sangue. A invenção adicionalmente refere-se ao uso de um dsRNA de acordo com a invenção, ou uma composição farmacêutica preparada a partir dele, para inibir a ex- pressão do Ahal e/ou para inibir o acúmulo de fluidos de ascite e efusão pleural em diferentes tipos de câncer, p.ex., o câncer de mama, o câncer de pulmão, o câncer da cabeça, o câncer do pescoço, o câncer do cérebro, o câncer abdominal, o câncer do cólon, o câncer colorretal, o câncer do esôfa- go, o câncer gastrointestinal, o glioma, o câncer do fígado, o câncer da lín- gua, o neuroblastoma, o osteossarcoma, o câncer ovariano, o câncer pan- creático, o câncer da próstata, o retinoblastoma, o tumor de Wilm, o mieloma múltiplo, o câncer da pele, o melanoma, os Iinfomas e o câncer do sangue. Devido ao efeito inibitófio"sobre=a~HxpressãO"do Aha1, o dsRNA de acordo com a invenção, ou uma composição farmacêutica preparada a partir dele, pode aumentar a qualidade de vida dos pacientes com câncer.

A invenção, além disso, se refere ao uso de um dsRNA ou de uma composição farmacêutica dele, p.ex., para o tratamento de Fibrose Cis- tica ou câncer, ou para prevenir a metástase do tumor, em combinação com outras substâncias químicas e/ou outros métodos terapêuticos, p.ex., com substâncias químicas conhecidas e/ou métodos terapêuticos conhecidos, tais como, por exemplo, aqueles que são atualmente empregados para tratar a Fibrose Cística ou o câncer e/ou para prevenir a metástase do tumor. On- de a composição farmacêutica tiver em vista o tratamento de Fibrose cística, a composição pode ser, por exemplo, dada a uma combinação com a fisiote- rapia do tórax diária, as enzimas pancreáticas oralmente aplicadas, os anti- bióticos orais ou inalados diários para deter a infecção do pulmão, a terapia antiasma inalada, os comprimidos de corticosteróides, os suplementos de vitaminas dietéticos, especialmente A e D, a inalação de Pulmozyme®, os medicamentos para aliviar a constipação ou para melhorar a atividade dos suplementos de enzimas, a insulina para diabete relacionada à CF, a medi- cação para doença do fígado associada à CF, e o oxigênio para auxiliar com a respiração.

Onde a composição farmacêutica tiver em vista o tratamento de câncer e/ou a prevenção da metástase do tumor, a composição pode ser, por exemplo, dada a uma combinação com a terapia de radiação e os agen- tes quimioterapêuticos, tais como a cisplatina, a ciclofosfamida, o 5- fluorouracil, a adriamicina, a daunorrubicina ou o tamoxifeno.

A invenção pode também ser praticada por inclusão com um agente de RNAi específico uni outro agente quimioterapêutico anticâncer, tal como qualquer agente quimioterapêutico convencional. A combinação de um agente de ligação específico com tais outros agentes pode potencializar o protocolo quimioterapêutico. Diversos protocolos quimioterapêuticos se a- presentarão na mente do praticante versado como sendo capazes de incor- poração no método da invenção. Qualquer agente quimioterapêutico pode ser-usador-írrcItitndo-OS-agentes alquilantes, os antimetabólitos, os hormô- nios e os antagonistas, os radioisótopos, bem como os produtos naturais. Por exemplo, o composto da invenção pode ser administrado com os antibió- ticos, tais como a doxorrubicina e outros análogos de antraciclina, as mos- tardas nitrogenadas, tais como a ciclofosfamida, os análogos de pirimidina, tais como o 5-fluorouracil, a cisplatina, a hidroxiuréia, o taxol e os seus deri- vados naturais e sintéticos, e similares. Como um outro exemplo, no caso dos tumores mistos, tais como o adenocarcinoma da mama, onde os tumo- res incluírem células dependentes da gonadotropina e independentes da gonadotropina, o composto pode ser administrado em conjunção com Ieu- prolida ou goserelina (análogos de peptídeos sintéticos de LH-RH). Os ou- tros protocolos antineoplásticos incluem o uso de um composto de tetracicli- na com uma outra modalidade de tratamento, p.ex., cirurgia, radiação, etc., também referidas neste documento como "modalidades antineoplásticas adjuntas". Assim, o método da invenção pode ser empregado com tais regi- mes convencionais com o benefício de reduzir os efeitos colaterais e aumen- tar a eficácia.

EXEMPLOS

Os aspectos dos presentes ensinamentos podem ser adicional- mente entendidos levando-se em consideração os exemplos a seguir, os quais não devem ser interpretados como limitando o escopo dos presentes ensinamentos de modo algum.

Exemplo 1: Interactoma do CFTR

Para definir as interações globais entre proteínas, envolvidas no tráfego e função do CFTR nas vias exocíticas e endocíticas, os complexos de proteínas contendo o CFTR foram imunoisolados de linhagens celulares expressando o CFTR do tipo selvagem (ver, p.ex., a figura 1), digeridos com proteases, e a composição da mistura de peptídeos determinada usando a tecnologia de identificação de proteína multidimensional (MudPIT) (Lin e col., Biochim Biophys Acta 1646, 1 (2003)).

O CFTR foi imunoprecipitado das linhagens celulares BHK está- veis superexpressando o CFTR com alelo selvagem ou AF508, ou das Iinha- gens-cefcrlares Calu-3, HT29 e T84 expressando o CFTR com alelo selva gem. As células do Rim de Hamster Bebê (BHK) estavelmente expressando o CFTR com wt ou AF508 foram mantidas em DMEM suplementado com F12, 5% de soro bovino fetal (FBS), 100 unidades/ml, cada, de penicilina e estreptomicina (Pen/Estrep), e metotrexato a 500 μΜ (Xanodyne Pharmacal1 Inc., Florence, KY). As células BHK parentais não expressando o CFTR fo- ram cultivadas no mesmo meio, exceto sem metotrexato. A linhagem celular de pulmão humana Calu-3, e as linhagens celulares intestinais humanas HT29 e T84, todas expressando o CFTR com wt endógeno, foram adquiridas da ATCC e mantidas de acordo com as instruções do fabricante.

O CFTR e as proteínas de co-imunoprecipitação em Iisados de- tergentes de células inteiras foram ligados aos glóbulos de Sepharose aco- plados com o anticorpo monoclonal anti-CFTR M3A7. Para capturar as inte- rações transientes ou fracas que ocorrem à medida que o CFTR transita a- través de diferentes compartimentos subcelulares, as imunoprecipitações foram realizadas na ausência ou na presença do propionato de ditiobissucci- nimidila (DSP) reticulador químico capaz de ser clivado, que foi adicionado às células intactas antes da Iise das células. Para controlar a ligação não- específica das proteínas aos glóbulos, foram usadas diversas condições pa- ra indicar as recuperações de base, incluindo a incubação dos Iisados de células na presença de glóbulos sozinhos, ou glóbulos acoplados a um anti- corpo monoclonal dirigido contra a VSV-G, uma proteína somente encontra- da em células infectadas com o vírus da estomatite vesicular (conjuntos de dados de Calu-3, T84 e H89). No caso das células BHK, os imunoprecipita- dos das linhagens celulares estáveis que expressam o alelo selvagem e o AF508 foram comparados diretamente com a linhagem celular de origem não expressando o CFTR. Nos conjuntos de dados proporcionados nos ar- quivos Excel, as proteínas recuperadas a partir de ambos os métodos não reticulados e reticulados são reunidas.

Após a imunoprecipitação, os complexos protéicos foram digeri- dos por desnaturação das proteínas em guanidina HCI a 8 M recentemente preparada por diluição para 2 Μ. A endoproteinase LysC foi usada para dige- rir as proteínas por 8 horas, seguida por diluição p&fa'~guanidinarH€t'a~11\/t e digestão com tripsina usando os glóbulos de tripsina Porozyme TM. Todas as digestões são efetuadas a 37gC.

Os complexos imunes digeridos com proteases foram submeti- dos à análise por LC/LC/MS/MS usando a MudPIT. Esta abordagem tinha sido descrita em detalhe por diversos autores (Link e col., 1999 Nat Biotech- nol 17, 676-682; MacCoss e col., 2002, Proc Natl Acad Sci U S A 99, 7900- 7905; MacCoss e col., 2002, Anal Chem 74, 5593-5599; McDonald e col., 2002 Int J Mass Spect 219, 245-251; Washburn e col., 2001 Nat Biotechnol 19, 242-247). Resumidamente, as proteínas desnaturadas, reduzidas e al- quiladas foram divididas em três frações e digeridas durante a noite, a 37eC, com três proteases diferentes (tripsina, subtilisina e elastase). A mistura de peptídeos resultante foi acidificada com ácido fórmico (5%). Subseqüente- mente, uma coluna microcapilar de três fases foi construída acondicionando uma pasta ~7 cm de material Aqua C18 de 5 μιτι (Aqua, Phenomimex) em um capilar de sílica fundida, que tinha sido previamente preso a uma ponta de diâmetro de ~5 μηη usando um prendedor a laser Sutter Instruments (Sut- ter Manufacturing, Novato, CA). A seguir, 3 cm de resina de troca catiônica forte Partisphere de 5 μιτι (Partisphere, Whatman), seguidos por outros 3 cm de material de cromatografia Aqua C18 de 5 μηι, foram acondicionados na coluna. A coluna foi então equilibrada com 5% de acetonitrila / 0,1% de ácido fórmico por -30 min, antes da mistura de peptídeos ser carregada para a extremidade posterior de uma coluna de cromatografia trifásica usando uma célula de pressão alta.

Após a carga dos digestos de peptídeos, a coluna foi colocada em linha com uma HPLC quaternária Agilent 1100 e analisada usando uma separação de 6 etapas modificada. As soluções de tampão eram 5% de ace- tonitrila/0,1% de ácido fórmico (tampão A), 80% de acetonitrila/0,1% de áci- do fórmico (tampão B), e acetato de amónio a 500 mM/5% de acetonitri- la/0,1% de ácido fórmico (tampão C). A etapa 1 consistia em um gradiente de 100 min a partir de 0-100% de tampão B. As etapas 2-5 tinham o seguin- te perfil: 3 min de 100% de tampão A, 2 min de X% de tampão C, um gradi- ente de 10 min a partir de 0-1-5%-de tampãcrBre urrrgradiente de 97 min a partir de 15-45% de tampão B. As porcentagens do tampão C (X) em 2 min foram 10, 20, 30, 40%, respectivamente, para a análise de 6 etapas. Na eta- pa final, o gradiente continha: 3 min de 100% de tampão A, 20 min de 100% de tampão C, um gradiente de 10 min a partir de 0-15% de tampão B, e um gradiente de 107 min a partir de 15-70% de tampão B.

À medida que os peptídeos eluíam da coluna microcapilar, eles eram eletropulverizados diretamente em um espectrômetro de massa LCQ- Deca com a aplicação de uma voltagem de pulverização de 2,4 kV distai. Um ciclo de um espectro de massa de varredura total (400-1400 m/z) segui- do por 3 espectros de MS/MS dependentes dos dados em uma energia de colisão normalizada de 35% foi repetido continuamente ao longo de cada etapa da separação multidimensional. A aplicação das funções de varredura do espectrômetro de massa e dos gradientes dos solventes da HPLC é con- trolada pelo sistema de dados Xcalibur.

Os espectros de massa em série foram analisados seqüencial- mente usando o protocolo a seguir. Primeiro, um algoritmo de software (2para3) foi usado para determinar o estado de carga apropriado (+2 ou +3) a partir dos espectros de massa dos peptídeos carregados múltiplos, e re- mover os espectros de qualidade insatisfatória (Sadygov e col., 2002, J Pro- teome Res 1, 211-215). Os espectros de MS/MS após o 2para3 foram pes- quisados usando uma versão da máquina virtual paralela (PVM) de SE- QUEST® (Yates e col., 1995, Anal Chem 67, 3202-3210; Yates e col., 1995, Anal Chem 67, 1426-1436) correndo sobre um aglomerado de computadores Beowolf (-75 cpu's) contra um banco de dados de proteínas construído a partir dos bancos de dados combinados de seres humanos, camundongos e ratos (HMR) da Seqref. Os resultados da busca no banco de dados foram filtrados, armazenados, e exibidos usando o programa DTASeIect (Tabb e col., 2002, J Proteome Res 1, 21-26). Os critérios predeterminados do DTA- Select foram empregados (i.e., +1 1,8, +2 2,5, +3 3,5, ACN 0,08, e pelo me- nos dois peptídeos por loco).

Os componentes protéicos identificados a partir das imunopreci- pitações enrréplica-foram-combinados e o conjunto de dados resultante foi então anotado com o GO_Annotation usando o programa de análise EASE fornecido pelo NIH (Hosack e col., 2003, Genome Biol 4, R70). A partir do proteoma subtraído do controle, eliminaram-se as proteínas que foram ano- tadas pelo GO_Molecular_Function como pertencendo à ligação do ácido nucléico, ou categorias estruturais que eram contaminantes comuns a partir dos experimentos proteômicos de células inteiras A lista resultante de prote- ínas principalmente incluía as chaperonas citoplásmicas, as proteínas do lúmen do retículo endoplasmático (ER)1 os componentes tardios da via se- cretária, os interadores da superfície celular, e os componentes do proteas- soma/ubiquitinação.

A figura 1 é um cartum representando os componentes que compreendem o interactoma do CFTR (ovais claros, interações previamente estabelecidas, ovais escuros, novas interações recuperadas no estudo atual) como nodos na rede e são divididos em super-redes que potencialmente facilitam o dobramento da proteína no ER (I), a ERAD (II), o tráfego da membrana (III), e os reguladores e os efetores após o ER (IV). As linhas es- curas são linhas de interseção na rede que mostram as interações protéicas diretas ou indiretas entre o CFTR e o componente indicado identificado pela MudPIT. As linhas cinzas-claras ilustram as linhas de interseção que defi- nem as interações baseadas no banco de dados de co-expressão de Tmm, acessado usando a plataforma Cytoscape. A Tabela 7 mostra os resultados de um arranjo conduzido sobre proteínas recuperadas usando a tecnologia de identificação de proteína multidimensional (MudPIT) nos tipos de células indicados que expressam o CFTR com alelo selvagem, arranjados na ordem de cobertura da seqüência fracionária por espectrometria de massa.

Os resultados mostraram que a proteína identificada gera uma rede de interações protéicas que definem o proteoma ou o interactoma do CFTR (ver, p.ex., a figura 1). As proteínas compreendendo o interactoma do CFTR podem ser divididas em sub-redes que coletivamente definem os gru- pos funcionais que incluem os componentes requeridos para o dobramento e a exportação a partir do ER (ver, p.ex., a figura 1-1), que mediam a ERAD (vePf-pTexTerfigara-1-ΙΙ), que orientam o transporte entre os compartimentüS' exocíticos e endocíticos (ver, p.ex., a figura 1 -III), e os componentes que são pares de ligação potenciais envolvidos na função e na regulação do CFTR na superfície celular (ver, p.ex., a figura 1B-IV).

Diversas interações protéicas verificadas para o CFTR com alelo selvagem maduro encontrado na superfície celular validam o banco de da- dos (ver, p.ex, a Tabela 8). Por exemplo, o CFTR é um canal de cloreto com acesso cuja atividade é regulada por cinases protéicas dependentes do cAMP e fosfatases protéicas (Guggino and Banks-Schlegel, 2004). A fosfa- tase protéica 2A (PP2A) ou PP2C tem uma função na desfosforilação do CFTR e na infra-regulação da atividade do CFTR em uma variedade de tipos de células. Embora as cinases não fossem detectadas como um par de inte- ração estável em qualquer linhagem celular examinada, presumivelmente por causa de sua interação muito transiente, o CFTR com alelo selvagem em quase todas as linhagens celulares mostrou interação forte com a PP2A - ambas as unidades reguladoras e catalíticas (Thelin e col., 2005; Vastiau e col., 2005). Além da PP2A, os reguladores da isoforma 3 trocadora de sódio- hidrogênio (NHE) 1 e 3 (NHERF-1/3) (Mohler e col., 1999; Yun e col., 1997) foram recuperados no proteoma do CFTR. Os NHERFs estão localizados na superfície apical das células do pulmão e são bem documentados interagi- rem com o CFTR através dos domínios C terminais PDZ (Guggino e Banks- Schlegel, 2004, Am J Respir Crit Care Med 170, 815-820). Um interador desconhecido anterior inclui a calgranulina B (S 100-A8), um membro da família divergente S 100 das proteínas de ligação ao Ca" citosólicas conten- do o EF-hand (Donato, 2003, Microsc Res Tech 60, 540-551; Heizmann, 2002, Methods Mol Biol 172, 69-80). A calgranulina B tem estado implicada nas vias inflamatórias de CF (Fanjul e col., 1995, Am J Physiol 268, C1241- 1251; Renaud e col., 1994, Biochem Biophys Res Commun 201, 1518-1525; Xu e col., 2003, J Biol Chem 278, 7674-7682), sugerindo uma função modu- ladora possível relacionada à patofisiologia do pulmão de CFTR.

Os resultados também mostraram que, geralmente, a identifica- ção de múltiplos componentes endocíticos do tráfego ilustram a importância -da internalização e do reciclo do CFTR na função normal:HJm^se"gi3ndcrgríF po de componentes destaca as interações diretas ou indiretas do CFTR com alelo selvagem com o mecanismo de tráfego da membrana (ver, p.ex., a Ta- bela 7). Estes incluem o receptor relacionado à sortilina L (SORL1), o homó- logo descapacitado 2 (Dab2), a proteína contendo o domínio Eps associada à RaIBPI (Reps 1), a ARF4, a cadeia leve da clatrina, a proteína de seleção vacuolar 4 (Vps4p), a entoprotina, e as nexinas de seleção (SNX) 4 e 9. O SORL1 tem um único domínio de transmembrana, está localizado nos en- dossomas de reciclo e envolvido na internalização de Iigantes múltiplos (Ja- cobsen e col., 2001, J Biol Chem 276, 22788-22796). O Dab2 funciona como um adaptador de clatrina endocítico seletivo para a carga (Bonifacino e Traub, 2003, Annu Rev Biochem 72, 395-447; Mishra e col., 2002, Embo J 21, 4915-4926), enquanto que a Repsl é capaz de se ligar a proteínas con- tendo o motivo de internalização de NPF encontrado no CFTR (Yamaguchi e col., 1997, J Bio! Chem 272, 31230-31234) e acoplar-se à família Rab11- FlP2 de reguladores de GTPase endocíticos (Bilan e col., 2004, J Cell Sci 117, 1923-1935; Cullis e col., 2002, J Biol Chem 277, 49158-49166; Gentzs- ch e col., 2004, Mol Biol Cell 15, 2684-2696; Swiatecka-Urban e col., 2005, J Biol Chem 280, 36762-36772) por um mecanismo de seleção de carga con- tendo AP2, Dab2. A ARF4 é uma GTPase pequena implicada nos comparti- mentos endocíticos/de reciclo (Donaldson e Honda, 2005, Biochem Soc Trans 33, 639-642; Langhorst e col., 2005, Cell Mol Life Sci 62, 2228-2240; Morrow e Parton, 2005, Traffic 6, 725-740), enquanto que a VPS4 provavel- mente funciona no transporte de proteínas de compartimentos endossômi- cos finais para o Iisossomo (Bowers e col., 2004, Traffic 5, 194-210; Hislop e col., 2004, J Biol Chem 279, 22522-22531; Scheuring e col., 2001, J Mol Biol 312, 469-480; Scott e col., 2005, Embo J 24, 3658-3669). A entoprotina inte- rage com o adaptador de clatrina API, com a proteína de ligação à ARF, con- tendo γ-ear localizado no Golgi (McPherson e Ritter1 2005, Mol Neurobiol 32, 73-87; Wasiak e col., 2003, FEBS Lett 555, 437-442; Wasiak e col., 2002, J Cell Biol 158, 855-862), e através de seu domínio carboxila terminal, com o domínio terminal da cadeia pesada da clatrina para estimular a formação de vesícula revestida com clatrina (KalthOíf^col:r2©02rMo|-Bioi'€ell 13, 4060- 4073; Wasiak e col., 2003, supra; Wasiak e col., 2002, supra), consistente com a recuperação da cadeia leve da clatrina (Ybe e col., 2003, Traffic 4, 850-856) e a função estabelecida para a clatrina no reciclo do CFTR (Cheng e col., 2004, J Biol Chem 279, 1892-1898; Hu e col., 2001, Biochem J 354, 561-572; Lukacs e col., 1997, Biochem J 328 ( Pt 2), 353-361; Peter e col., 2002, J Biol Chem 277, 49952-49957; Picciano e col., 2003, Am J Physiol Cell Physiol 285, C1009-1018; Weixel e Bradbury, 2000, J Biol Chem 275, 3655-3660; Weixel e Bradbury, 2001, Pflugers Arch 443 Supl 1, S70-74; Weixel e Bradbury, 2001, J Biol Chem 276, 46251-46259). Os adaptadores adicionais identificados no interactoma incluem a Snx4 e a Snx9 (Carlton e col., 2005, Traffic 6, 75-82; Lundmark e Carlsson, 2003, J Biol Chem 278, 46772-46781; Wasiak e col., 2003, J Cell Biol 158, 855-862). A Snx9 liga o domínio de complemento β de AP2 e auxilia a AP2 em sua função na mem- brana plasmática na internalização mediada por clatrina e dinamina (Lin e col., 2002, supra; Lundmark e Carlsson, 2003, supra; Lundmark e Carlsson, 2004, J Biol Chem 279, 42694-42702; Lundmark e Carlsson, 2005, Methods Enzymol 404, 545-556; Soulet e col., 2005, Mol Biol Cell 16, 2058-2067; Te- asdale e col., 2001, Biochem J 358, 7-16). A Snx4 tem sido descrita interagir com a anfifisina para facilitar o tráfego endocítico da transferrina e outros componentes de reciclo (Hettema e col., 2003, Embo J 22, 548-557; Leprin- ce e col., 2003, J Cell Sci 116, 1937-1948).

Embora os resultados acima descritos concentrem-se nos com- ponentes efetores e de tráfego, ambos os CFTR com alelo selvagem e com AF508 são degradados pelas vias da ERAD que envolvem tanto a ubiquitina quanto os componentes do proteassoma (Amaral, 2004, J Mol Neurosci 23, 41-48) (ver, p.ex., a Tabela 8). O proteassoma a partir de células que ex- pressam o CFTR tanto com o alelo selvagem quanto com o AF508 contém componentes envolvidos na ERAD. Estes incluem o canal de transloca- ção/deslocamento Sec61 e a VCP/p97/Cdc48, uma chaperona que orienta a distribuição para o proteassoma. A função do proteassoma é indicada pelo enriquecimento em subunidades de proteassoma 26S e componentes da via de ubiquitinação no^Tieractoroa~tver,-p7ex.—a Tabela 8). De modo interes- sante, a proteína de ubiquitinação-conjugação E3A recuperada no proteoma mostra interação com Ubc6, uma classe de ubiquitina E2-enzimas de conju- gação freqüentemente invocada para a ERAD, incluindo o CFTR (Lenk e col., 2002, J Cell Sci 115, 3007-3014).

Se estas Iigases estão somente envolvidas na ERAD no nível do ER, ou também participam na infra-regulação do CFTR na superfície celular através das vias de objetivação endocíticas/lisossômicas, permanece para ser determinado (Gentzsch e col., 2004, Mol Biol Cell; Sharma e col., 2004, J Cell Biol 164, 923-933; Swiatecka-Urban e col., 2005, supra). Além destes exemplos discutidos acima, componentes adicionais são preditos terem inte- rações diretas ou indiretas com o CFTR (ver, p.ex., as Tabelas 1 e 2).

O acima descrito é uma abordagem de biologia de sistemas au- xiliada pela sensibilidade da tecnologia de proteômico MudPIT usada para identificar as interações transientes que contribuem para as vias de dobra- mento e tráfego do CFTR, o interactoma do CFTR. Embora algumas proteí- nas que tenham sido mostradas interagir com o CFTR nos compartimentos após o ER não sejam identificadas, isto pôde refletir limitações da técnica de espectrometria de massa, das condições de imunoprecipitação otimizadas para consistência dentro do estudo, e o fato que o interactoma é composto provavelmente de interações muito dinâmicas e, portanto, transientes, que são difíceis de capturar e altamente dependentes do tipo de célula e das condições de crescimento. O interactoma incluindo todas as interações co- nhecidas (ver, p.ex., a figura 1) pode proporcionar uma nova linha de base para começar a avaliar os complexos protéicos muito diferentes, necessários para o CFTR atingir e manter-se funcionalmente na superfície celular apical. Tabela 5: Proteínas de interação do CFTR após o ER de função conhecida*

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São mostrados a porcentagem de cobertura da seqüência (% de cober- tura), o número de espectros de peptídeos únicos (únicos), e o número de espectros de peptídeos totais (totais) como identificados por espec- trometria de massa.

São mostrados os dados dos peptídeos para as células BHK. Aqueles para HT29 são 11%, 2, 2.

*** São mostrados os dados de peptídeos para as células Calu-3. Aqueles para HT29 são 20%, 7, 10.

Tabela 6: Proteoma de degradação associado com o CFTR

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# Proteínas recuperadas das linhagens celulares BHK (CFTR com alelo selvagem), Calu-3, HT29, T84

São mostrados a porcentagem de cobertura da seqüência (A), o núme- ro de espectros de peptídeos únicos (B), e o número de espectros de peptídeos totais (C) como identificados por espectrometria de massa. Tabela 7: Proteoma do CFTR para linhagens celulares expressando o CFTR com alelo selvagem

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Tabela 8: Comparação do proteoma de BHK do CFTR com alelo selvagem e

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Exemplo 2: Ligação dos Espectros de CFTR

A partir da riqueza de interações observadas no interactoma (ver o Exemplo 1), a base para a perda de exportação do AF508 a partir do ER foi examinada como um meio de entender a forma mais comum de CF. Uma alteração na energética do dobramento de uma proteína (Sekijima e col., 2005, Cell 121, 73-85; Strickland e Thomas, 1997, J Biol Chem 272, 25421- 25424) em resposta à remoção da Phe 508 resulta na falha do CFTR com AF508 de acoplar-se ao mecanismo que se desenvolve do COPIi (Wang e col., 1998, FEBS Lett 427, 103), resultando na degradação associada com o ER (ERAD) (Nishikawa 2005, J Biochem (Tokyo) 137, 551). Os componen- tes da chaperona que são atualmente acreditados afetar significativamente o dobramento do CFTR através das vias de ERAD (Sekijima e col., 2005, su- pra) incluem a calnexina (Farinha e Amaral, 2005, Mol Cell Biol 25, 5242; Okiyoneda e col., 2004, Mol Biol Cell 15, 563; Pind e col., 1994, J Biol Chem 269, 12784) encontrada no lúmen do ER, bem como os complexos de cha- peronas citosólicos Hsc-Hsp70/40 e Hsp90 (Albert e col., 2004, Mol Biol Cell 15, 4003; Amaral, 2004, supra; Loo e col., 1998, Embo J 17, 6879; Meacham e col., 1999, Embo J 18, 1492; Meacham e col., 2001, Nat Cell Biol 3, 100; Strickland e col., 1997, J Biol Chem 272, 25421; Younger e col., 2004, supra).

Consistentes com estes resultados, os proteomas das células que expressam o CFTR com alelo selvagem (ver, p.ex., a figura 1) mostra- ram forte ligação com base nos espectros totais recuperados (ver, p.ex., a Tabela 7) com calnexina, chaperonas citosólicas Hsc-Hsp70/40 e Hsp90. Estes componentes de chaperona provavelmente definem mecanismos de núcleo (figura 2) que facilitam o dobramento do CFTR com alelo selvagem, como tem sido observado para as outras proteínas (McCIeIIan e col., 2005, Nat Cell Biol 7, 736-741).

Os resultados mostraram que os proteomas das células que ex- pressam o CFTR com alelo selvagem (figura 1) mostraram ligação forte com base nos espectros totais recuperados (ver, p.ex., a Tabela 7) com calnexina, chaperonas citosólicas Hsc-Hsp70/40 e Hsp90. Estes resultados estão con- sistentes com os relatórios que os componentes de chaperona atualmente acreditados afetar significativamente o dobramento do CFTR através das vias de ERAF (Sekijima e col., 2005, supra) incluem a calnexina (Farinha e Amaral, 2005, supra; Okiyoneda e col., 2004, supra; Pind e col., 1994, J Biol Chem 269, 12784-12788) encontrada no lúmen do ER, bem como os com- plexos de chaperonas citosólicos Hse-Hsp70/40 e Hsp90 (Albert e col., 2004, supra; Amaral, 2004, supra; Loo e col., 1998, supra; Meacham e col., 1999, supra; Meacham e col., 2001, supra; Strickland e col., 1997, supra; Younger e col., 2004, supra).

Estes componentes de chaperona provavelmente definem os mecanismos de núcleo (ver, p.ex., a figura 2A) que facilitam o dobramento do CFTR com alelo selvagem, conforme tem sido observado para as outras proteínas (McCIeIIan e col., 2005, supra).

Tabela 9: Proteoma de dobramento associado ao ER do CFTR *

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São indicadas as proteínas de interação nas células BHK, a sua por- centagem de cobertura da seqüência (A), o número de espectros úni- cos (B) e o número de espectros totais (C) como detectados por espec- trometria de massa nas linhagens celulares examinadas (figura 1).

3Chaperonas do lúmen do ER.

Exemplo 3: Localização e Interações do CFTR e do AF508

Para identificar os componentes no interactoma que podem es- tar envolvidos na falha do AF508 em acoplar-se ao mecanismo de exporta- ção do ER1 foram comparados os proteomas do CFTR com alelo selvagem e AF508 imunoprecipitados das células BHK. A linhagem celular BHK de ori- gem não expressando o CFTR foi usada como um controle negativo para as interações não específicas (ver, p.ex., a figura 2).

A figura 2 é uma série de representações da rede de dobramen- to do ER. A Tabela 8 mostra os resultados de um arranjo de proteínas recu- peradas usando MudPIT em células BHK não expressando o CFTR (contro- le), ou aquelas expressando o CFTR com AF508 ou com alelo selvagem, arranjado na ordem de cobertura de seqüência fracionária por espectrome- tria de massa.

A figura 2A é um cartum representando uma vista compósita da rede compreendendo os proteomas de dobramento e degradação do CFTR do ER. As linhas de interseção cinzas-claras indicam as interações potenci- ais diretas ou indiretas com o CFTR, as linhas de interseção escuras indicam as interações físicas conhecidas entre os componentes com base em dados a partir dos bancos de dados de interação das proteínas HPRD1 BIND1 e In- tAct. O círculo verde-claro indica as chaperonas de dobramento de núcleo, o círculo rosa-claro indica as co-chaperonas reguladoras e os componentes da ERAD. A figura 2B é uma imagem de um imunoblot por SDS-PAGE mos- trando os níveis típicos em estado estacionário das bandas BeC observa- das nas células que expressam o CFTR com alelo selvagem e AF508. Quan- to a uma informação adicional da metodologia, ver o Exemplo 1.

Para o SDS-PAGE e o imunoblotting, as células foram lavadas duas vezes com 500 μΙ de PBS gelada e Iisadas por adição de 45 μΙ de TBS recentemente preparada (Tris-HCI a 50 mM pH 7,0, NaCI a 150 mM) suple- mentada com coquetel de 1% de Triton X-100 e inibidor de protease (Pierce) em 2 mg/ml de tampão de Iise e incubadas sobre gelo, por 30 min, com agi- tação ocasional. Os Iisados foram coletados e girados a 16.000 χ g por 20 min, a 4QC, e os sobrenadantes foram coletados e analisados quanto à con- centração de proteína. Os Iisados (25 μg de proteína total por caminho) fo- ram separados por SDS-PAGE e transferidos para nitrocelulose para a aná- lise por Western blot. O imunoblotting para a actina (Chemicon, Temecula, CA) foi usado como um controle interno adicional para a consistência da carga de amostra (não mostrado). O CFTR foi detectado com um anticorpo monoclonal (ascite de M3A7) contra um epítopo na extremidade C terminal do segundo domínio de ligação ao nucleotídeo (Kartner e col., 1992). A p23 foi detectada com o ascite de p23 (JJ3, Abcam, Cambridge, MA), a HOP com um soro policlonal de coelho, a FKBP8 com um soro policlonal de coe- lho, e o Ahal com um soro policlonal de Ahal de coelho. Foi também usado um anticorpo monoclonal (P5D4) contra a extremidade citoplásmica C termi- nal da glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSV-G). A quantidade de cada proteína de interesse foi quantificada por densitometria usando um Alphalnnotech Fluorochem SP (Alphalnnotech, San Leandro, CA). Os expe- rimentos foram conduzidos em triplicatas, e a média e o erro padrão da mé- dia determinados usando um teste t bilateral não emparelhado-. _ Os resultados mostraram que, na temperatura fisiológica (375C), o CFTR com alelo selvagem está principalmente (>80-90%) na glicoforma processada do Golgi de banda C, encontrada na superfície celular, com o CFTR restante detectado na glicoforma glicosilada do núcleo associada ao ER de banda B (ver, p.ex., a figura 2B). Em contraste, nas células que ex- pressam o AF508 a 37SC, geralmente somente 5-20% da proteína (refletindo o tipo de célula e as condições de crescimento) podem ser detectados na banda C, devido à estabilidade e ao dobramento significativamente reduzi- dos para a exportação. Neste caso, a proteína está grandemente restrita à glicoforma do ER de banda B glicosilada do núcleo imatura (ver, p.ex., a fi- gura 2B), onde ela é alvejada para a ERAD (Jensen e col., 1995, Cell 83, 129-135; Ward e Kopito, 1994, J Biol Chem 269, 25710-25718; Ward e col., 1995, Cell 83, 121-127). Além dos componentes provavelmente envolvidos na ERAD (Tabela 6), o interactoma do dobramento do ER (ver, p.ex., a figu- ra 2A) revelou que o AF508, como o CFTR com o alelo selvagem, mostrou fortes interações com a calnexina do lúmen e os componentes citosólicos Hsc-Hsp70/40 e Hsp90 citosólicos (ver, p.ex., a Tabela 7). Estes resultados indicam que o AF508 interage com o mecanismo de núcleo que orienta o dobramento do CFTR com alelo selvagem (ver, p.ex., a figura 2A).

Exemplo 4: Componentes da Co-Chaperona de Hsp90 no interactoma do AF508 do ER

O interactoma do AF508 do ER foi analisado quanto à presença de componentes de co-chaperona de Hsp90. O dobramento dependente da Hsp90 de uma variedade de proteínas clientes é transientemente regulado por co-chaperonas (Picard, 2002, Cell Mol Life Sci 59, 1640-1648; Young e col., 2003, supra; Young e col., 2001, supra). Os estudos anteriores sugeri- ram que o dobramento do AF508 é cineticamente prejudicado (Qu e col., 1997, J Bioenerg Biomembr 29, 483-490; Qu e col., 1997, J Biol Chem 272, 15739-15744; Qu e Thomas, 1996, J Biol Chem 271, 7261-7264). Portanto, as proteínas encontradas no interactoma do AF508 seriam esperadas incluir aquelas associadas com o(s) intermediário(s) de dobramento sensível(is) à remoção da Phe 508 que podem acumular-se em resposta a um defeito ci- nético na via de dobramento.

Os resultados mostraram que diversos componentes de co- chaperona de Hsp90 no interactoma do AF508 do ER não eram geralmente detectados no proteoma do alelo selvagem (ver, p.ex., a figura 2a). Esta veri- ficação está consistente com a predição de intermediário(s) de dobramento acumulado(s) sensível(is) à remoção da Phe 508 no AF5008. Os componen- tes de co-chaperona de Hsp90 no interactoma do AF508 do ER que não e- ram geralmente detectados no proteoma do alelo selvagem incluíram a pro- teína organizadora Hsc-Hsp70/Hsp90 (HOP)1 a p23, a Cdc37, a imunofilina FKBP8 e o Ahal. As co-chaperonas de Hsp90 têm sido estudadas quanto as suas funções como reguladoras das interações entre Hsp90-cliente para modular a dobra das proteínas clientes metaestáveis, incluindo os recepto- res dos hormônios esteróides (SHRs) e as cinases de sinalização (Wegele, e col., 2004, supra). Os outros reguladores de chaperona detectados incluíram o BAG-2/3 que tinha sido estudo quanto a sua função na regulação da fun- ção de Hsc-Hsp70 na degradação do CFTR (Arndt e col., 2005, Mol Biol Cell; Dai e col., 2005, J Biol Chem 280, 37634), a Hsp105 e a chaperonina de dobramento TCP1.

A rede das interações conhecidas entre Hsc-Hsp70/40, Hsp90 e proteínas potencialmente envolvidas em sua regulação ilustra a complexida- de potencial das vias de dobramento do CFTR com AF508 e alelo selvagem para e exportação do ER (ver, p.ex., a figura 2A).

Exemplo 5: Efeito da Co-Chaperona p23 sobre o Dobramento do AF508 nas células HEK293

A função do regulador-chave de co-chaperona p23 (Pratt e Toft, 2003, Exp Biol Med (Maywood) 228, 111-133; Prodromou e Pearl, 2003, Curr Câncer Drug Targets 3, 301-323; Wegele e col., 2004, supra) nas célu- las HEK293 estavelmente expressando o AF508 foi examinada em diversas temperaturas. A p23, juntamente com HOP e FKBP8, afeta as etapas de dobramento dependentes do ATP na via de interação entre Hsp90-cliente cíclica.

Para começara- definira função da Hsp90 no dobramento e na exportação do CFTR com AF508, o dsRNA e a transfecção transiente foram usados para controlar o nível de expressão protéica de co-chaperonas de Hsp90 selecionadas, incluindo p23 (ver o Exemplo 5), HOP (ver o Exemplo 6) e FKBP8 (ver o Exemplo 7), que afetam as etapas de dobramento depen- dentes do ATP na via de interação entre Hsp90-cliente cíclica. Após o reco- nhecimento de uma molécula cliente, tal como o CFTR1 pelo complexo de Hsc-Hsp70/40, a co-chaperona ubíqua HOP liga o complexo de Hsc- Hsp70/40-cliente nascente à Hsp90 (Johnson e col., 1998, J Biol Chem 273, 3679-3686). Subseqüentemente, o regulador de co-chaperona p23, na pre- sença de ATP, desloca Hsc-Hsp70/40 e HOP para formar o complexo de Hsp90-p23-cliente maduro no estado ligado ao ATP (Wegele e col., 2004, supra). A ciclização dos complexos de Hsp90-cliente contendo p23 é regula- da por imunofilinas (Johnson e Toft, 1994, J Biol Chem 269, 24989-24993; Wu e col., 2004, Proc Natl Acad Sci U S A 101, 8348-8353). A perda da imu- nofilina FKBP52 no caso do receptor do hormônio esteróide (SHR), o cliente de Hsp90 prototípico (Pratt e Toft, 2003, Exp Biol Med (Maywood) 228, 111- 133; Prodromou e Pearl, 2003, supra), desestabiliza o complexo de chape- rona Hs 90-cliente intermediário, impedindo a carga de hormônio (Cheung- Flynn e col., 2005, Mol Endocrinol 19, 1654-1666).

As células HEK293 foram mantidas em DMEM suplementado com 10% de FBS e Pen/Estrep, como acima descrito. As células HEK293 estavelmente expressando o CFTR com AF508 foram mantidas no mesmo meio como acima mencionado, mais 150 μg/ml de higromicina B.

O dsRNA e a transfecção transiente foram usados para controlar o nível de expressão protéica de p23. Os clones de cDNA para p23 foram adquiridos da ATCC (Manassas, VA) e foram subclonados no vetor de ex- pressão de pcDNA, e a seqüência da região de codificação foi verificada por análise de seqüenciamento de DNA. As soluções de dsRNA foram prepara- das misturando-se DMEM sem soro e antibiótico ou MEM-α com o dsRNA indicado em uma concentração de trabalho de 0,6 μΜ (p23 humana, Ambion (Austin TX) N2 do Cat. 16704 ID 18391) e 6 μΙ de HiPerFect (Qiagen, Valen- cia,CA)por poco de piaca de 12 poços. O dsRNA de controle (Dhar- macon N2 do Cat. CONJB-000015) foi adicionado em concentração igual ao dsRNA que estava sendo testado. A mistura de dsRNAs (100 μΙ) foi adicio- nada às células contendo 1,1 ml do meio apropriado em uma concentração final de 50 nM e cultivada a 379C/5% de CO2 por 48 h. No término desta in- cubação, o meio foi removido e substituído com 1,1 ml de meio completo novo e 100 μΙ de solução de dsRNA recentemente preparada e cultivado por umas 33 h adicionais a 37QC/5% de CO2. Onde indicado, as células foram subseqüentemente transferidas para uma incubadora a 30 sC/5% de CO2 ou mantidas a 37QC/5% de CO2, por umas 15 h adicionais de incubação.

A superexpressão da p23 humana foi efetuada por co- transfecção de HEK293 com plasmídios expressando CFTR AF508 e p23 por infecção com o vírus da vacínia, como anteriormente descrito (Wang e col., 2004, supra). Para as amostras analisadas na temperatura permissiva, as células foram modificadas para 30eC por 15 h antes da coleta.

O SDS-PAGE e o imunoblotting são como descritos no Exemplo 3.

A figura 3 é uma série de gráficos de barras representando o efeito da co-chaperona de Hsp90 p23 sobre o dobramento e a exportação do AF508 a partir do ER. A figura 3A é um par de gráficos de barras mostrando a porcentagem de níveis máximos para a união em estado estacionário de AF508 da glicoforma do ER (B), AF508 da glicoforma da superfície celular (C), e expressão de p23. O dsRNA humano para p23 (painel da esquerda) foi usado para reduzir a expressão da proteína indicada a 37QC. O dsRNA misturado foi usado como um controle. O cDNA humano para p23 (painel da direita) foi usado para superexpressar a proteína indicada a 37eC. As inser- ções são imagens de um SDS-PAGE imunoblot para a união em estado es- tacionário da glicoforma do ER (banda B) e da glicoforma da superfície celu- lar (banda C). As uniões em estado estacionário das bandas BeC toram determinadas usando imunoblotting. A figura 3B é conforme descrita para a figura 3A, exceto que as células foram incubadas na temperatura permissiva (30-) para promover o dobramento e a exportação do ER. Os asteriscos (*) indrcam-significado estatístico (p < 0,05). Os experimentos foram repsiidcir independentemente em triplicata pelo menos três vezes, com os resultados representativos mostrados. Quanto a uma informação adicional sobre a me- todologia, ver o Exemplo 5.

Os resultados mostraram que a redução pelo dsRNA dos níveis de p23 em -70% resultou em uma redução comparável (60-70%) nas uniões em estado estacionário de ambas a glicoforma do ER de banda Bea união pequena da glicoforma da superfície celular de banda C quando comparada ao controle falso misturado (ver, p.ex., a figura 3A, painel da esquerda). In- versamente, a superexpressão (3-5 vezes) estabilizou parcialmente a banda B, porém não resultou em um aumento significativo na banda C (ver, p.ex., a figura 3A, painel da direita). De modo interessante, a redução pelo dsRNA de p23 teve um efeito similar sobre a estabilidade do CFTR com alelo selva- gem de banda tanto B quanto C em HEK293 (não mostrado), sugerindo que a p23 afeta a dinâmica de dobramento normal.

Porque o CFTR com AF508 é um mutante de dobramento sensí- vel à temperatura (Denning e col., 1992, Nature 358, 761-764), a incubação das células na temperatura permissiva (30Q) em vez de 37SC proporciona um ambiente de dobramento mais energeticamente favorável, resultando em níveis significativos de AF508 localizado na superfície celular.

Os resultados mostraram que, no estado estacionário (15 h após mudança da temperatura de 37gC para 30QC), 40-50% da união total de AF508 nas células HEK293 são tipicamente verificados na banda C (Den- ning e col., 1992, supra) (ver, p.ex., a figura 3B, painel da esquerda). Nota- velmente, mesmo na temperatura de dobramento permissiva (30QC), a redu- ção pelo dsRNA de p23 resultou em uma diminuição significativa na estabili- dade da banda B e um processamento para a banda C (ver, p.ex., a figura 3B, painel da esquerda). A 30QC, a superexpressão não teve nenhum efeito sobre a banda B, porém impediu o processamento para a banda C (ver, p.ex., a figura 3B, painel da direita). Um efeito negativo dominante similar da superexpressão de p23 tinha sido observado para outras vias de sinalização dependentes de Hsp90, refletindo a estabilização excessiva do complexo de cliente maduro (Pratte Toft, 2003, supra). Assim, consistente com os efeitos sobre o CFTR com alelo sel- vagem, a p23 é um componente modular do dobramento que afeta a estabi- lidade do AF508 do ER nas condições de dobramento tanto restritivas quan- to permissivas. Estes resultados enfatizam a função diferencial potencial do ambiente de chaperona local sobre a dobra do AF508 cineticamente prejudi- cada.

Exemplo 6: Efeito da Co-Chaperona FKBP8 sobre o Dobramento do AF508 nas células HEK293

A função do regulador de co-chaperona FKBP8 nas células HEK293 estavelmente expressando o AF508 foi examinada. Embora incapaz de identificar a FKBP52 que está envolvida no dobramento do SHR (Cheung-Flynn e col., 2005, supra) no proteoma do CFTR com AF508, o membro da família de imunofilina FKPB8 (Nielsen e col., 2001, Genomics 83, 181-192; Pedersen e col., 1999, Electrophoresis 20, 249-255) foi detectado. O FKBP8 é uma imunofilina associada à membrana que foi descrita estar localizada tanto na mitocôndria quanto no ER (Kang e col., 2005, FEBS Lett 579, 1469-1476; Shirane e Nakayama, 2003, Nat Cell Biol 5, 28-37; Weiwad e col., 2005, FEBS Lett 579, 1591-1596).

O dsRNA e a transfecção transiente foram usados para controlar o nível de expressão protéica de FKBP8. Os clones de cDNA para FKBP8 foram adquiridos da ATCC (Manassas, VA) e foram subclonados no vetor de expressão de pcDNA, e a seqüência da região de codificação foi verificada por análise de seqüenciamento de DNA. As soluções de dsRNA foram pre- paradas como no Exemplo 5, porém com a FKBP8 humana, Ambion N2 do Cat. 16704 ID 45182. A superexpressão da FKBP8 humana foi efetuada por co-transfecção de HEK293 com plasmídios expressando CFTR AF508 e FKBP8 por infecção com o vírus da vacínia, como anteriormente descrito (Wang e col., 2004, supra). Para as amostras analisadas na temperatura permissiva, as células foram modificadas para 30°C por 15 h antes da coleta. O SDS-PAGE e o imunoblotting foram como descritos no Exemplo 3.

A figura 4 é uma série de gráficos de barras representando o eleito da co-chaperona de Hsp90 FKBP8 sobre o dobramento e a exporta- ção do AF508 a partir do ER. A figura 4A é um par de gráficos de barras mostrando a porcentagem de níveis máximos para a união em estado esta- cionário de AF508 da glicoforma do ER (Β), ΔΡ508 da glicoforma da superfí- cie celular (C), e expressão de FKBP8. O dsRNA humano para FKBP8 (pai- nel da esquerda) foi usado para reduzir a expressão da proteína indicada a 37°C. O dsRNA misturado foi usado como um controle. O cDNA humano para FKBP8 (painel da direita) foi usado para superexpressar a proteína in- dicada a 37gC. As inserções são imagens de um SDS-PAGE imunoblot para a união em estado estacionário da glicoforma do ER (banda B) e da glico- forma da superfície celular (banda C). A figura 4B (B) é conforme descrita para a figura 4A, exceto que as células foram incubadas na temperatura permissiva (30Q) para promover o dobramento e a exportação do ER. Os asteriscos (*) indicam significado estatístico (p < 0,05). Os experimentos fo- ram repetidos independentemente em triplicata pelo menos três vezes, com os resultados representativos mostrados. Quanto a uma informação adicio- nal sobre a metodologia, ver o Exemplo 6.

Os resultados mostraram que a FKBP8 tem sobreposição subs- tancial com a proteína marcadora do ER calnexina (não mostrado), um resul- tado consiste com os relatórios anteriores. Similar ao efeito do dsRNA da p23, foi observada uma desestabilização significativa do AF508 em resposta à redução pelo dsRNA da FKBP8 a 37QC (ver, p.ex., a figura 4A, painel da esquerda). De modo interessante, a superexpressão a 37QC também deses- tabilizou o CFTR (ver, p.ex., a figura 4A, painel da direita), aumentando a possibilidade que a função da FKBP8 esteja ligada à concentração em esta- do estacionário da Hsp90. Em contraste, a redução pelo dsRNA da expres- são da FKBP8 reduziu (30-40%) a estabilidade do CFTR com AF508 a 30°C, com uma redução correspondente no nível de banda C (-50%) (ver, p.ex., a figura 4B, painel da esquerda), ao passo que a superexpressão a 30°C teve somente um efeito modesto sobre a estabilidade, todavia ela interferiu com o processamento para a banda C (ver, p.ex., a figura 4B, painel da direita).

Estes resultados sugerem que a co-chaperona de Hsp90 FKBP8, como a p23 atoa como um moduladar do dobramento para controlar a esta- bilidade do ΔF508 no ER. Estes resultados enfatizam a função diferencial potencial do ambiente de chaperona local sobre a dobra do ΔF508 cinetica- mente prejudicada.

Exemplo 7: Efeito da Co-Chaperona HOP sobre o Dobramento do ΔF508 nas células HEK293

A função do regulador de co-chaperona HOP nas células HEK293 estavelmente expressando o ΔF508 foi examinada. O dsRNA e a transfecção transiente foram usados para controlar o nível de expressão pro- téica de HOP. Os clones de cDNA para HOP foram adquiridos da ATCC (Manassas, VA) e foram subclonados no vetor de expressão de pcDNA, e a seqüência da região de codificação foi verificada por análise de seqüencia- mento de DNA. As soluções de dsRNA foram preparadas como no Exemplo 5, porém com a HOP humana, Ambion N2 do Cat. 16704 ID 18719. A super- expressão da HOP humana foi efetuada por co-transfecção de HEK293 com plasmídios expressando CFTR ΔF508 e HOP por infecção com o vírus da vacínia, como anteriormente descrito (Wang e col., 2004, supra). Para as amostras analisadas na temperatura permissiva, as células foram modifica- das para 30QC por 15 h antes da coleta. O SDS-PAGE e o imunoblotting fo- ram como descritos no Exemplo 3.

A figura 5 é uma série de gráficos de barras representando o efeito da co-chaperona de Hsp90 HOP sobre o dobramento e a exportação do AF508 a partir do ER. A figura 5A é um par de gráficos de barras mos- trando a porcentagem de níveis máximos para a união em estado estacioná- rio de AF508 da glicoforma do ER (B), ΔF508 da glicoforma da superfície celular (C), e expressão de HOP. O dsRNA humano para HOP (painel da esquerda) foi usado para reduzir a expressão da proteína indicada a 375C. O dsRNA misturado foi usado como um controle. O cDNA humano para HOP (painel da direita) foi usado para superexpressar a proteína indicada a 37°C. As inserções são imagens de um SDS-PAGE imunoblot para a união em estado estacionário da glicoforma do ER (banda B) e da glicoforma da su- perfície celular (banda C). A figura 5B é conforme descrita para a figura 5A, exceto-qtae-as céluicrs foram incubadas na temperatura permissiva (30°) para promover o dobramento θ a exportação do ER. Os asteriscos (*) indicam significado estatístico (p < 0,05). Os experimentos foram repetidos indepen- dentemente em triplicata pelo menos três vezes, com os resultados repre- sentativos mostrados. Quanto a uma informação adicional sobre a metodo- logia, ver o Exemplo 7.

Os resultados mostraram que, em contraste com os efeitos da redução pelo dsRNA tanto de p23 quanto de FKBP8, a redução máxima da HOP em resposta ao dsRNA observado nas células HEK293 (40-60%) pro- duziu pouca alteração na estabilidade da banda B ou no nível da banda C (ver, p.ex., a figura 5A, painel da esquerda), enquanto que a superexpressão (~4 vezes) parcialmente desestabilizou tanto B quanto C (ver, p.ex., a figura 5A, painel da direita). Novamente, o dsRNA da HOP não efetuou o dobra- mento ou a exportação do AF508 a 30-C (ver, p.ex., a figura 5B, painel da esquerda). Entretanto, a superexpressão desestabilizou significativamente a proteína, sugerindo que uma ligação prolongada ao Hsc-Hsp 70/40 sob con- dições de dobramento permissivas favorece o alvejamento para a degrada- ção (ver, p.ex., a figura 5B, painel da direita).

Estes resultados sugerem que a HOP facilita uma ligação entre a função de CFTR com AF508 e Hsc-Hsp70/40 na degradação (Arndt e col., 2005, supra; Meacham e col., 1999, supra; Meacham e col., 2001, supra; Younger e col., 2004, supra). Estes resultados enfatizam a função diferencial potencial do ambiente da chaperona local sobre a dobra de AF508 cinetica- mente prejudicada.

Exemplo 8: Efeito da Co-Chaperona Ahal sobre o Dobramento do AF508 nas células HEK293

A função do regulador de co-chaperona Ahal nas células HEK293 estavelmente expressando o AF508 foi examinada. O membro mais recentemente reconhecido da família de co-chaperona de Hsp90 é o Aha1. O Ahal liga o domínio do meio de Hsp90 e é proposto funcionar como uma proteína ativadora da ATPase, regulando o ciclo de ATP da Hsp90 (Harst e col., 2005, Biochem J 387, 789-796; Mayer e col., 2002, Mol Cell 10, 1255- -1-256; Meyer, 2004, Embo J~23, 1402-1410; Meyer e col.,2003,Mol Cell 11, 647-658; Panaretou e col., 2002, Mol Cell 10, 1307-1318; Siligardi e col., 2004, J Biol Chem 279, 51989-51998).

O dsRNA e a transfecção transiente foram usados para controlar o nível de expressão protéica do Aha1. O clone de cDNA para Ahal foi am- plificado por PCR com uma marca myc C-terminal e clonado no pCDNA3.1 + e a seqüência verificada por seqüenciamento. As soluções de dsRNA foram preparadas como no Exemplo 5, porém com Ahal humano a 2 μΜ usando 1 μΜ cada de dois dsRNAs (Dharmacon, Lafyette, CO) dirigidos para as se- qüências de Ahal humanas attggtccacggataagct (SEQ ID NO: 9; transcrito de mRNA SEQ ID NO: 12) e gtgagtaagcttgatggag (SEQ ID NO: 10; transcrito de mRNA SEQ ID NO: 18), e 6 μΙ de HiPerFect (Qiagen, Valencia, CA) por poço de uma placa de 12 poços. O dsRNA de controle (Dharmacon N2 do Cat. CONJB-000015) foi adicionado em concentração igual ao dsRNA do Ahal. A superexpressão do Ahal humano foi efetuada por co-transfecção de HEK293 com plasmídios expressando CFTR AF508 e Ahal por infecção com o vírus da vacínia, como anteriormente descrito (Wang e col., 2004, su- pra). Para as amostras analisadas na temperatura permissiva, as células foram modificadas para 30eC por 15 h antes da coleta. O SDS-PAGE e o imunoblotting foram como descritos no Exemplo 3.

A figura 6 é uma série de gráficos de barras ilustrando que a ex- portação do AF508 para a superfície celular pode ser resgatada por infra- regulação do Ahal funcional. A figura 6A é uma série de gráficos de barras mostrando a porcentagem de níveis máximos para a união em estado esta- cionário de AF508 da glicoforma do ER (B), AF508 da glicoforma da superfí- cie celular (C), e expressão de Aha1. O dsRNA humano para Ahal (painéis da esquerda) ou o cDNA humano para Ahal (painéis da direita) foram usa- dos para reduzir ou superexpressar, respectivamente, o Ahal nas células HEK293 expressando o AF508 a 37eC (painéis superiores) ou 30SC (painéis inferiores). As inserções são imagens de um SDS-PAGE imunoblot para a união em estado estacionário da glicoforma do ER (banda B) e da glicoforma da superfície celular (banda C). A figura 6B é conforme descrita para 5A, exceto que o dsRNA humano para Aha1ie;rüsatio"para"reduzir a~expressão de Aha1 nas células CFBE41o- expressando o ∆F508 a 37°C (painel da es- querda) ou 30°C (painel da direita). Os asteriscos (*) indicam significado es- tatístico (p ≤ 0,05) usando um teste t bilateral, não emparelhado (amostras em triplicata). Resultados representativos mostrados em triplicata a partir de 4 experimentos independentes. Quanto a uma informação adicional sobre a metodologia, ver os Exemplos 8-9.

Os resultados mostraram que a redução pelo dsRNA do nível endógeno de Ahal nas células HEK293 em 50-70% efetuou uma estabiliza- ção acentuada de 3 a 4 vezes da banda B de AF508 (ver, p.ex., a figura 6A, painel da esquerda superior). Uma estabilização ainda mais pronunciada (4 a 5 vezes) foi observada a 30°C (ver, p.ex., a figura 6A, painel da esquerda inferior). De modo impressionante, tanto em 37SC quanto em 30SC, a estabi- lização esteve associada com um aumento correspondente na banda C, re- fletindo uma distribuição significativa da superfície celular (ver, p.ex., a figura 6A, painéis da esquerda), um resultado não observado com as outras co- chaperonas (ver, p.ex., as Figs. 3-5). Porque o nível de expressão da co- chaperona de Hsp90 pode afetar o dobramento e a exportação do ∆F508 em ambas as temperaturas de dobramento permissivas (30°C) e restritivas (37°C), o CFTR com ∆F508 pode ser cineticamente imobilizado em (um) es- tado(s) dobrado(s) metaestável(is), na via, em resposta à união citosólica endógena das co-chaperonas de Hsp90 que normalmente facilitam o do- bramento do CFTR com alelo selvagem. A banda C resgatada era resistente ao processamento pela endoglicosidase H (não mostrado), uma característi- ca distintiva do transporte através do complexo de Golgi. Em contraste com os efeitos do dsRNA, a superexpressão (4 vezes) de Ahal nas células HEK293 expressando o ∆F508 desestabilizou significativamente a banda B tanto em 37°C (-60%) quanto em 30°C (>90%), com uma perda correspon- dente de processamento para a banda C (ver, p.ex., a figura 6A, painéis da direita). Sob estas condições, a alteração nas uniões totais de Hsc-Hsp70 ou BIP não foi detectada, indicando que é improvável que uma resposta de es- tresse do ER geral (Schroder e Kaufman, 2005, Annu Rev Biochem 74, 739- 789) fosse induzida por uma redução "modesta do Aha1 (resultados não mostrados).

Por analogia na função dinâmica da Hsp90 nas vias de dobra- mento conhecidas (Wegele e col., 2004, supra; Pratt e Toft, 2003, Exp Biol Med (Maywood) 228, 111-133; Prodromou e Pearl, 2003, supra), os resulta- dos acima descritos sugerem que a regulação da interação de CFTR cliente com Hsp90 através de interação seqüencial com co-chaperonas pode tem- porariamente coordenar as etapas no dobramento intradomínios e/ou coor- denar o dobramento inter-domínios para evitar a ERAD no processo de ob- tenção da conformação do tipo selvagem. A necessidade de coordenar o dobramento intra- e interdomínios está consistente com a evidência que o AF508 não pode atingir as interações interdomínios adequadas de NBD1 com TMD1 para produzir uma dobra estável (Riordan, 2005, supra; Du e col., 2005, Nat Struct Mol Biol 12, 17-25). Além disso, o domínio de NBD2, nova- mente temporariamente separado por síntese de TMD2 (Riordan, 2005, su- pra), é dobrado inadequadamente nas células expressando o CFTR com AF508 e deve dimerizar com o domínio de NBD1 para ativar um dos bolsos de ligação de nucleotídeos para a função do canal (Lewis, 2004, Embo J 23, 282-293). Os intermediários bloqueados na via de dobramento do AF508 são alvos prováveis para o recrutamento de componentes tais como CHIP e seus fatores reguladores HsPBI e Bag-1/2 que ligam o complexo de Hsc- Hsp70/40 e alvo de CFTR para a ERAD (Alberti e col., 2004, Mol Biol Cell 15, 4003-4010, ; Meacham e col., 2001, supra). É agora provavelmente a abun- dância relativa e talvez o balanço de reguladores específicos e componentes de co-chaperona para ambos Hsc-Hsp70/40 e Hsp90 que significativamente influenciam a capacidade do CFTR com alelo selvagem e AF508 de dobrar para a exportação a partir do ER. Esta conclusão está consistente com a observação geral que a estabilidade do ER e a disponibilidade da superfície celular de AF508 são altamente variáveis entre os diferentes tipos de células. Exemplo 9: Efeito da Co-Chaperona Ahal sobre o Dobramento do AF508 nas células CFBE41o-

Porque as células HEK293 normalmente não expressam o ΔΡ5Ό8^eTTDOTtarrtorpocIeTTrrepresentar uma condição especial que é única- mente sensível ao nível de atividade do Ahal (ver o Exemplo 8), o efeito do dsRNA para Ahal a 37QC foi examinado em 1 linhagem celular de pulmão (CFBE410-) que expressa os níveis endógenos de AF508.

A linhagem celular bronquial humana CFBE410-, derivada de um paciente com CF homozigoto para o CFTR com AF508, e a linhagem celular HBE corrigida foram mantidas em MEM suplementado com 10% de FBS1 Pen/Estrep, glutamina a 2 mM extra, e 2 μg/ml de puromicina. A preparação de dsRNA e a transfecção, as soluções de dsRNA e a superexpressão do Ahal foram como descritas no Exemplo 8. O SDS-PAGE e o imunoblotting foram como descritos no Exemplo 3.

Similar ao resultado observado nas células HEK293, a redução do Ahal resultou na estabilização da banda B (4 vezes) em comparação com o controle misturado, com um aumento de 4 a 5 vezes correspondente da banda C a 37°C (ver, p.ex., a figura 6B, painel da esquerda) ou 30eC (ver, p.ex., a figura 6B, painel de direita), um nível maior do que aquele observado na linhagem celular CFBE410- corrigida (HBE) que expressa o CFTR com o alelo selvagem (Bruscia e col., 2002, Gene Ther 9, 683-685) (ver abaixo). A análise de perseguição de pulso na CFBE41o- que expressa o AF508 reve- lou uma estabilização de 2-3 vezes da banda B no ER precedendo a expor- tação para a superfície celular (não mostrado). Em contraste, nenhum efeito do dsRNA para Ahal foi observado sobre a estabilização do CFTR com o alelo selvagem usando a análise de perseguição de pulso (não mostrado) ou os níveis da superfície celular em estado estacionário da banda C usando a linhagem celular HBE, sugerindo que é o mutante de AF508 que requer um ajuste para a união de Ahal endógeno para promover a exportação mais eficiente.

A estabilização da banda Bea recuperação da banda C do AF508 em resposta aos níveis alterados de Ahal sugerem que a atividade do Ahal reduzida pode regular a dinâmica da chaperona de Hsp90 para promover o acoplamento do AF508 ao mecanismo de exportação do ER pelo COPII.

Exempto-IO: Projeto de siRNA para o Silenciamento do Ahal As seqüências de shRNA candidatas para alvejar o gene Ahal foram obtidas a partir de uma ferramenta de busca do Ambion (http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html). A seqüência de cDNA do hAhal (Ensembl N2 de Acesso ENSG00000100591) foi usada para gerar a listagem ilustrativa. As seqüências proporcionam um teor de GC de menos do que 50% e evitam quatro ou mais Gs ou Cs em uma fileira. A lis- tagem completa é proporcionada na Tabela 1.

Cada shRNA foi pesquisado por BLAST contra o genoma huma- no, para identificar possíveis sítios fora dos alvos em outros genes. Foram selecionados três dsRNAs escolhidos tendo um teor de GC em torno de 40% e alguns sítios fora dos alvos em outros genes: 99 (SEQ ID NO: 12), 179 (SEQ ID NO: 18) e 256 (SEQ ID NO: 24). Cada uma destas três seqüências de 19 pares de bases não tinha mais do que 15 identidades consecutivas com quaisquer regiões não traduzidas em 5' ou 3', introns ou exons de quaisquer outros genes. As três seqüências foram clonadas no vetor pSilen- cer (Ambion) para preparar linhagens Hela estáveis com expressão do hA- hal reduzida. Os dsRNAs correspondendo às seqüências 99 e 179 acima mencionadas foram criados (Dharmacon e Qiagen) para os experimentos proporcionados neste documento.

Exemplo 11: Efeito do dsRNA para o Aha 1 sobre a Condutância de Haloge- neto nas Células CFBE41o- Que Expressam o AF508

Embora o processamento para a glicoforma de banda C resis- tente à endo H seja uma característica distintiva do transporte a partir do ER para os compartimentos de Golgi cis/mediais (ver, p.ex., os Exemplos 8-9), é possível que a proteína resgatada seja imobilizada nos compartimentos de Golgi trans e endocíticos finais, refletindo a(s) contribuição(ões) não anteci- pada^) da remoção da Phe 508 para a seleção anormal nas vias após o ER (ver, p.ex., a figura 1) (Gentzsch e col., 2004a; Sharma e col., 2004; Swia- tecka-Urban e col., 2005). Para testar esta possibilidade, as células CF- BE41o- que expressam o AF508 foram tratadas com o dsRNA para Ahal e a condutância de halogeneto de superfície medida usando um ensaio de eflu- xo de iodeto (Looe-col., 2005, supra). Como um controle positivo, examinou-se a condutância de halo- geneto da linhagem celular HBE corrigida que expressa o CFTR com alelo selvagem. Para o ensaio de efluxo de iodeto, as células CFBE41o- de alelo selvagem e AF508 foram semeadas em uma densidade de 5,0 χ 105 células por placa de 60 mm e desenvolvidas sob as condições listadas acima, por 5 dias, com uma troca de meio de cultura a cada 2 dias. O tratamento com dsRNA foi efetuado conforme indicado acima com 20 μΙ de HiPerFect (Qia- gen) por placa de 60 mm. As células CFBE41o- foram alteradas para a tem- peratura permissiva de 309C por 15 h, antes da análise de efluxo de iodeto (Hughes e col., 2004). As células foram lavadas 5X com tampão de carga (Nal a 136 mM; KNO3 a 3 mM; Ca(N03)2 a 2 mM; Hepes a 20 mM e glicose a 11 mM) e incubadas por 1 h na temperatura ambiente com 2,5 ml de tam- pão de carga. As células foram subseqüentemente lavadas 15X com tampão de efluxo (NaNO3 a 136 mM; KNO3 a 3 mM; Ca(NO3)2 a 2 mM; Hepes a 20 mM e glicose a 11 mM) e incubadas com 2,5 ml de tampão de efluxo por 1 minuto, na temperatura ambiente, e o meio coletado para análise. Esta incu- bação foi repetida por um total de 4 min. As células foram subseqüentemen- te incubadas com 2,5 ml de tampão de estímulo (tampão de efluxo contendo forscolina a 10 μΜ (Sigma) e genisteína a 50 μΜ (Sigma)) por 1 min, na temperatura ambiente, e o meio coletado para análise. Esta incubação foi repetida por um total de 4 min. As células foram então incubadas com 2,5 ml de tampão de efluxo por 1 min, na temperatura ambiente, e o meio coletado para análise. Esta incubação foi repetida por um total de 12 min. As amos- tras foram analisadas quanto ao teor de iodeto usando um eletrodo seletivo para iodeto (Analytical Sensors & Instruments) e um medidor de pH Beck- man modelo 360 (VWR). A quantidade de iodeto do meio coletado foi deter- minada por extrapolação a partir de uma curva padrão de concentrações de Nal conhecidas. O SDS-PAGE e o imunoblotting foram como descritos no Exemplo 3.

A figura 7 é um gráfico de linha e dispersão e um gráfico de bar- ras mostrando o efeito do Aha 1 de dsRNA sobre o efluxo de iodeto pela li- nhagem celular CFBE410-. A figura 7A-é um" gráfico de linha e dispersão representando o efluxo de iodeto com o tempo. O efluxo de iodeto foi moni- torado nas células HBE que expressam o CFTR com alelo selvagem (caixas fechadas) ou nas células CFBE41o- que expressam o AF508 que tinham sido incubadas a 379C, ou onde indicado, na temperatura permissiva de 30QC (15 h finais) (círculos fechados), e transfectadas com Ahal (círculos abertos) ou dsRNA misturado (controle) (caixas abertas). Os canais de CF- TR foram ativados por adição de forscolina a 10 μΜ e genisteína a 50 μΜ durante um período de 4 min, começando em 1 min, e subseqüentemente removidos por lavagem com tampão de efluxo. O efeito da mudança de tem- peratura e do dsRNA sobre a maturação do CFTR (glicoformas de banda B para banda C) e a estabilidade do Ahal é mostrado na inserção. A figura 7B é um gráfico de barras representando a razão de condutância de halogeneto antes da adição de forscolina/genisteína (0 min) e em 2 min, o período de pico de fluxo de halogeneto. Os asteriscos (*) indicam significado estatístico (p < 0,05) usando o teste t bilateral, não emparelhado (amostras em triplica- ta), entre as células CFBE41o- corrigidas na temperatura (caminho a) e tra- tadas com dsRNA (caminho c) em comparação com o controle tratado com dsRNA misturado (caminho b). Não houve nenhuma diferença estatistica- mente significativa entre a condutância de iodeto para as células CFBE410- corrigidas na temperatura (caminho a) e corrigidas com dsRNA (caminho c) (p = 0,2). Os experimentos foram repetidos independentemente pelo menos três vezes, com os resultados representativos mostrados. Quanto a uma in- formação adicional sobre a metodologia, ver o Exemplo 10.

Os resultados mostraram que o tratamento da linhagem celular CFBE41o- com o dsRNA para Ahal resultou em -70-80% de redução do Ahal endógeno, resultando na estabilização da banda B e C de AF508 em níveis -1,5 vezes o controle corrigido na temperatura para 30QC e em uma estabilização de 4 vezes da banda B sobre as células tratadas com o dsRNA misturado (ver, p.ex., a figura 7A, inserção). Enquanto que as células HBE mostraram forte condutância de halogeneto, nenhuma condutância foi detec- tada nas células CFBE41o- de controle que foram tratadas com o dsRNA misturado (ve,p.exr, a figtrra 7Α). A-mudança de CFBE41o- para 309C re- sultou na recuperação de 80-90% da condutância observada nas células HBE (ver, p.ex., a figura 7A). De modo impressionante, as células CFBE41o- tratadas com dsRNA, porém não misturadas, mostraram 50-80% de recupe- ração da condutância de halogeneto comparada àquela observada nas célu- Ias corrigidas na temperatura (ver, p.ex., a figura 7B). Estes resultados de- monstram que o dsRNA para Ahal restaura a condutância de halogeneto para as células CFBE41o- que expressam o AF508, desse modo obtendo o resgate funcional do CFTR.

A figura 8 é uma série de cartuns representando as interações entre chaperona/co-chaperona de Hsp90 que orientam o dobramento do CFTR. A figura 8A é um cartum destacando os componentes envolvidos no dobramento do CFTR com alelo selvagem e AF508. Eles consistem em cha- peronas do lúmen (1), e um sistema citosólico de dois estados que inclui os componentes de núcleo Hsc-Hsp70/40 (2) e Hsp90 (3), bem como diversos reguladores de co-chaperona de Hsc-Hsp70 (2) e Hsp90 (3). As chaperonas adicionais, tais como TCP1 (Spiess e col., 2004, supra) e Hsp105/S100 (3a), podem também contribuir para o dobramento. Uma ou mais destas intera- ções entre proteínas são cineticamente rompidas pela remoção de Phe 508, resultando no rompimento do ciclo da ATPase da Hsp90 e na patofisiologia da CF. A figura 8B é uma ilustração da função potencial da Hsp90 e das co- chaperonas no dobramento e resgate do CFTR com AF508. O ciclo de ATP/ADP que regula o dobramento para a exportação através do ERAF ou o alvejamento para a ERAD pode ser dinamicamente controlado por regulado- res de co-chaperona (X e Y), para ajustar a cinética do ciclo da chaperona à cinética e energética da via de dobramento. Por exemplo, a infra-regulação da atividade de ATPase do Ahal pelo dsRNA (X) favoreceria a estabilização do AF508 para a exportação por redução da atividade da ATPase da Hsp90, enquanto que a infra-regulaçâo da p23 (Y) favoreceria a desestabilização, resultando na ERAD. A figura 8C é um gráfico ilustrando a relação entre a concentração de (co)chaperona no citosol (eixo X), uma 'pontuação da esta- bilidade do dobramento' hipotética, definida pela energética global da proteí- na (©ekijtma-e~*col7, 2005, Cell 121, 73-85) (eixo Z), e a 'eficiência da expo"R tação' que reflete o nível de transporte para a superfície celular (eixo Y). En- quanto que o CFTR com o alelo selvagem mais energeticamente estável (curva tracejada) responde à atividade de dobramento da resposta do CFTR da chaperoma à concentração normal do Ahal (caixa tendo a rede, 'chape- roma normal'), a energética de dobramento reduzida do AF508 (curva sólida da esquerda) é instável neste ambiente de dobramento e não consegue ser exportada. Uma alteração no ponto de ajuste do ciclo de ATP/ADP da Hsp90 proporcionada pela infra-regulação do Ahal (caixa cinza, 'chaperoma de resgate') proporciona um solvente mais produtivo, por ajuste da capacidade de dobramento da chaperoma (caixa com rede) ao dobramento do AF508 (curva da esquerda), ao mesmo tempo mantendo a funcionalidade da dobra do CFTR com alelo selvagem (curva sólida da direita, caixa de rede). A gel- danamicina (GA), um inibidor da Hsp90, bloqueia o dobramento e a exporta- ção do CFTR com alelo selvagem e AF508 ligando-se diretamente à Hsp90 e interrompendo o ciclo de dobramento (canto esquerdo inferior) (Loo e col., 1998, supra).

Em resumo, os resultados acima mencionados sugerem que o defeito intrínseco de dobramento no CFTR com mutante está cineticamente ligado á atividade do ciclo de ATPase da Hsp90 sensível ao Aha1. O modelo de trabalho desenvolvido a partir dos resultados aqui contidos enfatiza um não acoplamento sensível ao ambiente a partir das vias de dobramento celu- lares normais. Nesta concepção, a taxa intrínseca do ciclo de ATP/ADP da Hsp90 que controla as interações do complexo de Hsp90-cliente é coorde- nada com a energética de dobramento do CFTR com alelo selvagem através da atividade da co-chaperona. Enquanto que a energética de dobramento que orienta a exportação do CFTR com alelo selvagem é otimizada em rela- ção à união de chaperonas celular normal (figura 8), uma alteração nas ati- vidades do Aha1, e potencialmente de outras cochaperonas, pode alterar estas (figura 8) e a capacidade da via de dobramento/exportação da chape- rona. No caso do Ahal, a redução da atividade da ATPase da Hsp90 pode permitir um tempo adicional para o mutante AF508 cineticamente provocado (figura 8) empregar uma união de chaperonas de 'resgate (figüra 8) parra" favorecer a estabilidade e o dobramento para a exportação. Porque a redu- ção parcial da união de Ahal não prejudica significativamente a dobra do alelo selvagem mais energeticamente estável (figura 8), estes resultados enfatizam que a energética de dobramento da remoção de Phe 508 pode situar-se fora dos limites de dobramento com chaperonas normais. A capa- cidade de uma população local única de chaperonas de modular o dobra- mento está consistente com as observações recentes que as chaperonas de dobramento são agora verificadas regularem as vias de dobramento de pro- teínas celulares específicas (Albanese e col., 2006, Cell 124, 75-88), em vez de simplesmente funcionarem como inibidoras da agregação protéica (Wick- ner e col., 1999, Science 286, 1888-1893).

A partir de uma perspectiva evolucionária, os modificadores ge- néticos (Qu e Thomas, 1996, supra) são agora prováveis de incluir chapero- nas de dobramento que proporcionam um ambiente genético ou epigenético (Cowen e Lindquist, 2005, Science 309, 2185; Queitsch e col., 2002, Nature 417, 618) para a função reduzida do mutante, todavia valor de sobrevivência quando provocadas com agonistas, tais como a toxina da cólera, onde a função do canal de cloreto reduzida diminuiria a possibilidade de desidrata- ção e morte quando comparada com a população do tipo selvagem (Gabriel e col., 1994, Science 266, 107; Thiagarajah e Verkman, 2005, Trends Phar- macol Sci 26, 172). Assim, a atividade das uniões de chaperonas pode defi- nir a diferença entre um polimorfismo tolerado e uma mutação deletéria na CF e outras doenças por dobramento inadequado de uma proteína. Exemplo 12: A ligação da Hsp90 ao CFTR é sensível à atividade do Ahal

Para determinar o efeito da redução do Ahal sobre a interação do AF508 com a Hsp90, nós analisamos a recuperação da Hsp90 ligada ao CFTR após o tratamento das células com o dsRNA para Aha1. As células que expressam o AF508 a 379C foram incubadas na presença de dsRNA misturado ou para Aha1. As células foram coletadas, o CFTR imunoprecipi- tado, e a quantidade de Hsp90 associada com o AF508 quantificada por i- munoblotting. Para estes experimentos, nós analisamos a razão de Hsp90 para CFTR recuperado no imunoprecipHa"do para~determinara quantidade relativa de Hsp90 ligada ao CFTR sob condições de controle ou redução.

A figura 9 ilustra os efeitos do Ahal de dsRNA sobre a Hsp90. As células HEK293 que expressam o AF508 a 37QC foram incubadas na au- sência ou na presença de dsRNA para Ahal. As células foram coletadas, o CFTR imunoprecipitado e a quantidade de Hsp90 recuperada com AF508 foi quantificada por imunoblotting. Painel da esquerda: Razão de Hsp90 para CFTR recuperado no imunoprecipitado. Painel da direita: fração de Ahal que permanece nas células após o tratamento com dsRNA para Ahal em comparação com o controle misturado.

Sob as condições nas quais nós observamos uma redução de -60% do Ahal (figura 9, painel da direita), nós observamos uma diminuição de 50-60% da Hsp90 ligada em níveis reduzidos de Ahal (figura 9, painel da esquerda). Em contraste, sob estas condições, nós não detectamos nenhu- ma alteração nos níveis celulares de calnexina, BiP, Hsp40, Hsc-Hsp70, Hsp90, HOP FKBP8/38 e p23 em comparação com o controle misturado, indicando que uma redução no Ahal pode alterar a união em estado esta- cionário de AF508 associado com a Hsp90 no ER. Este resultado está con- sistente com a observação que a recuperação de Hsp90 e co-chaperona de Hsp90 no interactoma do CFTR do tipo selvagem é reduzida em relação ao interactoma do AF508, apesar dos níveis comparáveis de banda B. Os resul- tados demonstram que a diminuição do nível do regulador de co-chaperona Ahal pode modificar as interações cinéticas do AF508 com a Hsp90 para facilitar a progressão mais eficiente através da via de dobramento, com isso favorecendo a exportação.

Outros Aspectos

A descrição detalhada apresentada acima é proporcionada para auxiliar aqueles versados na técnica na prática da presente invenção. Entre- tanto, a invenção descrita e reivindicada neste documento não é para ser limitada no escopo pelos aspectos específicos aqui divulgados, porque estes aspectos são pretendidos como ilustração dos diversos aspectos da inven- ção. Quaisquer aspectos equivalentes são pretendidos estarem dentro do escopo desta invençã@.«De fator as-diversas-modificações da invenção,"além daquelas mostradas e descritas neste documento, tornar-se-ão aparentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição precedente, as quais não saiam do espírito ou do escopo da presente descoberta inventiva. Tais modificações são também pretendidas incidirem no escopo das reivindica- ções em anexo.

Referências Citadas

A citação de uma referência neste documento não será interpre- tada como uma admissão que tal seja uma técnica anterior à presente in- venção. A publicação a seguir é especificamente pretendida estar dentro do escopo da presente invenção, e incorporada aqui por referência em sua tota- lidade para todos os propósitos: Wang, X. e col., Hsp90 cochaperone Ahal downregulation rescues misfolding of CFTR in cystic fibrosis, Cell (17 de nov. de 2006) 127(4):673-5.

Claims

1. Um dsRNA para inibir a expressão da proteína de Aha funcio- nal em uma céluia, o dito dsRNA compreendendo uma fita sentido e uma fita anti-sentido, onde a dita fita anti-sentido compreende uma região de comple- mentaridade tendo uma seqüência substancialmente complementar a uma seqüência-alvo de Aha1 onde a dita seqüência-alvo é menos do que 30 nu- cleotídeos de comprimento, onde a dita fita sentido é substancialmente complementar à dita fita anti-sentido, e onde o dito dsRNA, no contato com uma célula expressando a proteína de Aha funcional, inibe a expressão da proteína de Aha funcional por pelo menos 20%.

2. Um dsRNA de acordo com a reivindicação 1, onde a dita se- qüência-alvo de Aha compreende uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12-56.

3. Um dsRNA de acordo com a reivindicação 1, onde o dito ds- RNA compreende uma fita sentido tendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: -123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, e SEQ ID NO: 145; e uma fita anti-sentido complementar à fita sentido tendo uma se- qüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ iD NO: 68; SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: -104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: -138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, e SEQ ID NO: -146.

4. Um dsRNA de acordo com a reivindicação 1, onde o dito ds- RNA compreende uma fita sentido tendo uma seqüência de SEQ ID NO: 57 e uma fita anti-sentido complementar à fita sentido tendo uma seqüência de SEQ ID NO: 58.

5. Um dsRNA de acordo com a reivindicação 1, onde o dito ds- RNA compreende uma fita sentido tendo uma seqüência de SEQ ID NO: 69 e uma fita anti-sentido complementar à fita sentido tendo uma seqüência de SEQ ID NO: 70.

6. Um dsRNA de acordo com a reivindicação 1, onde o dito ds- RNA compreende uma fita sentido tendo uma seqüência de SEQ ID NO: 81 e uma fita anti-sentido complementar à fita sentido tendo uma seqüência de SEQ ID NO: 82.

7. Um vetor para expressar um shRNA para inibir a expressão do Ahal funcional em uma célula, o dito vetor compreendendo uma fita sen- tido, um Iigador de grampo, e uma fita anti-sentido, onde a dita fita sentido compreendendo uma região de comple- mentaridade tendo uma seqüência substancialmente complementar a uma seqüência-alvo de Aha1 onde a dita seqüência-alvo é menos do que 30 nu- cleotídeos de comprimento, onde a dita fita anti-sentido é substancialmente complementar à dita fita sentido, e onde o dito dsRNA, no contato com- ama célula^xpressando a proteína de Aha funcional, inibe a expressão da proteína de Aha funcional por pelo menos 20%.

8. Um vetor de acordo com a reivindicação 7, onde a dita se- qüência-alvo de Aha compreende uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12-56.

9. Um vetor de acordo com a reivindicação 7, onde o dito vetor compreende uma fita sentido tendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, e SEQ ID NO: 151; e uma fita anti-sentido tendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, e SEQ ID NO:152.

10. Um shRNA para inibir a expressão da proteína de Ahal fun- cional em uma célula, o dito shRNA compreendendo uma região de com- plementaridade tendo uma seqüência substancialmente complementar a uma seqüência-alvo de Aha, e onde a dita seqüência-alvo é menos do que nucleotídeos de comprimento, e onde o dito shRNA, no contato com uma célula expressando a proteína de Aha funcional, inibe a expressão da proteína de Aha funcional por pelo menos 20%.

11. Um shRNA de acordo com a reivindicação 10, onde a dita seqüência-alvo de Aha compreende uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12-56.

12. Um shRNA de acordo com a reivindicação 10, onde o dito shRNA compreende uma seqüência selecionada a partir do grupo consistin- do em SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, e SEQ ID NO: 155.

13. Uma célula ou população de células compreendendo um dsRNA de acordo com a reivindicação 1.

14. Uma célula ou população de células compreendendo um vetor de acordo com a reivindicação 7.

15. Uma célula ou população de células compreendendo um shRNA de acordo com a reivifi<$caçãa1<0r

16. Um anticorpo isolado que especificamente liga o Ahal fun- cional, o sítio de ligação à ATPase da Hsp90 para o Ahal funcional, e/ou o complexo de Ahal funcional-ATPase da Hsp90.

17. Um agente que diminui os níveis intracelulares da proteína de Ahal funcional, o dito agente selecionado a partir do grupo que consiste em uma molécula pequena, um anticorpo, um ácido nucléico anti-sentido, um aptâmero, um dsRNA, uma ribozima e qualquer combinação destes.

18. Um método de tratar uma doença associada com o dobra- mento inadequado de uma proteína, o método compreendendo a adminis- tração a um paciente que necessite dele de uma quantidade terapeutica- mente efetiva de pelo menos um agente que diminua os níveis intracelulares da proteína de Ahal funcional, onde o dito agente é selecionado a partir do grupo que consiste em uma molécula pequena, um anticorpo, um ácido nu- cléico anti-sentido, um aptâmero, um siRNA, uma ribozima, e suas combina- ções.

19. Um método de acordo com a reivindicação 18, onde a doen- ça é selecionada a partir do grupo que consiste em fibrose cística (CF), sín- drome de Marfan, doença de Fabry, doença de Gaucher, retinite pigmentosa -3, doença de Alzheimer1 diabete Tipo II, doença de Parkinson e doença de Creutzfeldt-Jakob.

20. Um método de acordo com a reivindicação 18, onde a doen- ça é a CF.

21. Um método de acordo com a reivindicação 18, onde a prote- ína dobrada inadequadamente é um CFTR dobrado inadequadamente.

22. Um método de acordo com a reivindicação 18, onde a prote- ína dobrada inadequadamente é uma proteína de AF508.

23. Um método de tratar uma doença associada com o dobra- mento inadequado de uma proteína, o método compreendendo a adminis- tração a um paciente que necessite dele de uma quantidade terapeutica- mente efetiva de pelo menos um inibidor de dsRNA da expressão do Ahal funcional, o dito dsRNA compreendendo uma fita sentido e uma fita anti- sentido, onde a dita fita anti-sentido compreende uma região de comple- mentaridade tendo uma seqüência substancialmente complementar a uma seqüência-alvo de Aha1 onde a dita seqüência-alvo é menos do que 30 nu- cleotídeos de comprimento, onde a dita fita sentido é substancialmente complementar à dita fita anti-sentido, e onde o dito dsRNA, no contato com uma célula expressando a proteína de Aha funcional, inibe a expressão da proteína de Aha funcional por pelo menos 20%.

24. Um método de acordo com a reivindicação 23, onde a doen- ça é selecionada a partir do grupo que consiste em fibrose cística (CF), sín- drome de Marfan, doença de Fabry, doença de Gaucher, retinite pigmentosa -3, doença de Alzheimer, diabete Tipo II, doença de Parkinson e doença de Cre utzfe Idt-J akob.

25. Um método de acordo com a reivindicação 23, onde a doen- ça é a CF.

26. Um método de acordo com a reivindicação 23, onde a prote- ína dobrada inadequadamente é um CFTR dobrado inadequadamente.

27. Um método de acordo com a reivindicação 23, onde a prote- ína dobrada inadequadamente é uma proteína de AF508.

28. Um método de tratar uma doença associada com o dobra- mento inadequado de uma proteína, o método compreendendo a adminis- tração a um paciente que necessite dele de uma quantidade terapeutica- mente efetiva de pelo menos um inibidor de dsRNA da expressão do Ahal funcional, onde o inibidor de dsRNA compreende uma seqüência seleciona- da na base a) do dsRNA compreendendo uma seqüência de fita sentido de cerca de 19 nucleotídeos a cerca de 25 nucleotídeos e uma seqüência de fita anti-sentido de cerca de 19 nucleotídeos a cerca de 25 nucleotídeos; e b) a seqüência de fita sentido ou a seqüência de fita anti-sentido compreende não mais do que 15 nucleotídeos contíguos idênticos a uma seqüência contígua compreendida por uma'região não traduzida em 5'runw região não traduzida em 3', um intron ou um exon de qualquer gene ou mFI- NA diferente do Ahal funcional.

29. Um método de acordo com a reivindicação 28, onde a doen- ça é selecionada a partir do grupo que consiste em fibrose cística (CF), sín- drome de Marfan, doença de Fabry, doença de Gaucher1 retinite pigmentosa -3, doença de Alzheimer, diabete Tipo II, doença de Parkinson e doença de Creutzfeldt-Jakob.

30. Um método de acordo com a reivindicação 28, onde a doen- ça é a CF.

31. Um método de acordo com a reivindicação 28, onde a prote- ína dobrada inadequadamente é um CFTR dobrado inadequadamente.

32. Um método de acordo com a reivindicação 28, onde a prote- ína dobrada inadequadamente é uma proteína de AF508.

33. Um método de examinar um agente para tratar uma doença associada com o dobramento inadequado de uma proteína, o método com- preendendo: proporcionar uma célula ou população de células expressando o Ahal funcional; administrar um agente candidato à célula ou população de célu- las; quantificar a atividade do Ahal funcional na célula ou população de células; e determinar se o agente candidato diminui a atividade do Ahal funcional na célula ou população de células, pelo que uma diminuição na atividade do Ahal funcional é indicativa da redução do dobramento inade- quado da proteína.

34. Um método de acordo com a reivindicação 33, onde o agen- te candidato é um dsRNA que inibe a expressão do Ahal funcional.

35. Um método de acordo com a reivindicação 34, onde o dsR- NA compreende a) uma seqüência de cerca de 19 nucleotídeos a cerca de -25 nucleotídeos, e b) a seqüência compreende não mais do que 15 nucleotí- deos contíguos idênticos a uma seqüência contígua contpreendiiia-pOrTjma região não traduzida em 5', uma região não traduzida em 3', um intron ou um exon de qualquer gene ou mRNA diferente de um gene ou mRNA de Aha.

36. Um método de acordo com a reivindicação 35, onde o gene ou mRNA de Aha é um gene ou mRNA de Aha humano.

37. Um método de acordo com a reivindicação 33, onde a doen- ça é selecionada a partir do grupo que consiste em fibrose cística (CF), sín- drome de Marfan, doença de Fabry, doença de Gaucher, retinite pigmentosa -3, doença de Alzheimer, diabete Tipo II, doença de Parkinson e doença de Creutzfeldt-Jakob.

38. Um método de acordo com a reivindicação 33, onde a doen- ça é a CF.

39. Um método de acordo com a reivindicação 33, onde a prote- ína dobrada inadequadamente é selecionada a partir do grupo que consiste em um CFTR dobrado inadequadamente, uma fibrilina dobrada inadequa- damente, uma alfa galactosidase dobrada inadequadamente, uma beta gli- cocerebrosidase dobrada inadequadamente, uma rodopsina dobrada inade- quadamente, um amilóide beta e tau agregado, uma amilina agregada, uma sinucleína alfa agregada e um priônio agregado.

40. Um método de acordo com a reivindicação 33, onde a prote- ína dobrada inadequadamente é um CFTR dobrado inadequadamente.

41. Um método de acordo com a reivindicação 33, onde a prote- ína dobrada inadequadamente é uma proteína de AF508.

42. Um método de examinar um agente para tratar uma doença associada com o dobramento inadequado de uma proteína, o método com- preendendo: proporcionar uma célula ou população de células que expresse o Ahal funcional; administrar um agente candidato à célula ou população de célu- las; quantificar o complexo de Hsp90/ADP, o complexo de Hsp90/ATP ou uma combinação deles na célula ou população de células; e determinar se o agente cawslidato-cHminura quantidade de com- plexo de Hsp90/ADP, complexo de Hsp90/ATP ou da combinação deles na célula ou população de células, pelo que uma diminuição na quantidade de complexo de Hsp90/ADP ou complexo de Hsp90/ATP é indicativa da diminu- ição do dobramento inadequado da proteína.

43. Um método de acordo com a reivindicação 42, onde o agen- te candidato é um dsRNA que inibe a expressão do Ahal funcional.

44. Um método de acordo com a reivindicação 43, onde o dsR- NA compreende a) uma seqüência de cerca de 19 nucleotídeos a cerca de nucleotídeos, e b) a seqüência compreende não mais do que 15 nucleotí- deos contíguos idênticos a uma seqüência contígua compreendida por uma região não traduzida em 5', uma região não traduzida em 3', um intron ou um exon de qualquer gene ou mRNA diferente de um gene ou mRNA de Aha.

45. Um método de acordo com a reivindicação 44, onde o gene ou mRNA de Aha é um gene ou mRNA de Aha humano.

46. Um método de acordo com a reivindicação 42, onde a doen- ça é selecionada a partir do grupo que consiste em fibrose cística (CF), sín- drome de Marfan, doença de Fabry, doença de Gaucher, retinite pigmentosa -3, doença de Alzheimer, diabete Tipo II, doença de Parkinson e doença de Creutzfeldt-Jakob.

47. Um método de acordo com a reivindicação 42, onde a doen- ça é a CF.

48. Um método de acordo com a reivindicação 42, onde a prote- ína dobrada inadequadamente é selecionada a partir do grupo que consiste em um CFTR dobrado inadequadamente, uma fibrilina dobrada inadequa- damente, uma alfa galactosidase dobrada inadequadamente, uma beta gli- cocerebrosidase dobrada inadequadamente, uma rodopsina dobrada inade- quadamente, um amilóide beta e tau agregado, uma amilina agregada, uma sinucleína alfa agregada e um priônio agregado.

49. Um método de acordo com a reivindicação 42, onde a prote- ína dobrada inadequadamente é um CFTR dobrado inadequadamente.

50. Um método de acordo com a reivindicação 42, onde a prote- ína dobrada inadequadamente é uma proteina de ∆F508: