KR101363928B1 - 특이적 유전자 발현 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비천연 올리고머 단백질을 발현하는 세포로서, 천연 올리고머 단백질을 구성하는 적어도 1개의 내재성 폴리펩티드에 상응하는 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 도입되어 있으며, 또한 상기 내재성 폴리펩티드의 발현이 억제되는 것을 특징으로 하는 세포를 제공한다.

Description

특이적 유전자 발현 방법{METHOD FOR EXPRESSION OF SPECIFIC GENE}

본 발명은 의료분야에 있어서 유용한 비천연 올리고머 단백질을 발현하는 세포, 그의 제조방법 및 비천연 올리고머 단백질의 형성방법에 관한 것이다.

생체는 주로 면역응답에 의해 이물로부터 보호되고 있으며, 면역 시스템은 다양한 세포와 그것들이 만들어내는 가용성 인자에 의해 이루어지고 있다. 그　중에서도 중심적인 역할을 하고 있는 것이 백혈구, 특히 림프구이다. 이 림프구는 B림프구(이하, ‘B세포’라고 하는 경우가 있다)와 T 림프구(이하, ‘T 세포’라고 하는 경우가 있다)라는 2종류의 주요한 타입으로 나눌 수 있고, 어느 것이나 항원을 특이적으로 인식하고, 이것에 작용해서 생체를 방어한다.

T 세포는 말초에서는 CD(Cluster of Differentiation: 분화 클로스터) 4마커를 발현하는 CD4 양성 T 세포와 CD마커를 발현하는 CD8 양성 T 세포가 대부분을 차지한다. CD4 양성 T 세포의 대부분은 헬퍼 T 세포(이하, ‘T_H’라고 기재한다)라고 불리며, 항체생산의 보조나 여러 종류의 면역응답의 유도에 관여하고, 항원자극에 의해 생산하는 사이토카인의 종류가 서로 다른 Th1형 혹은 Th2형으로 분화된다. CD8 양성 T 세포의 대부분은 항원자극에 의해 세포 독성을 나타내는 세포 독성 T 세포[Tc: 세포 독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte), 별명: 킬러 T 세포, 이하, ‘CTL’이라고 기재하는 경우가 있다]로 분화된다.

외과수술, 화학요법, 방사선 요법에 이은 제 4의 암 치료법으로서, 면역요법이 최근 관심을 모으고 있다. 면역요법은 원래 인간이 가지는 면역력을 이용하기 때문에, 환자에 대한 육체적 부담이 다른 치료법과 비교해서 가볍다고 한다. 면역요법에는 체외에서 유도한 CTL이나 말초혈액 림프구 등으로부터 여러 종류의 방법으로 확대 배양해서 수득되는 림포카인 활성화 세포, NKT 세포, γδT 세포 등을 이입하는 요법, 체내에서의 항원특이적 CTL의 유도를 기대하는 수상세포 이입요법이나 펩티드 백신 요법, Th1세포요법, 추가로 이들 세포에 여러 가지 효과를 기대할 수 있는 유전자를 체외에서 도입해서 체내에 이입하는 면역 유전자 치료법 등이 알려져 있다.

세포 독성 T 세포(CTL)에는, 주요 조직 적합성 항원 유전자 복합체(major histocompatibility gene complex; 이하, ‘MHC’라고 약칭한다)에 코딩되는 주요 조직 적합성 항원 분자(MHC분자, 인간의 경우 인간 백혈구 항원이라고 불리며, 이하, ‘HLA’라고 약칭한다)와 항원 펩티드와의 결합물인 복합체를, α쇄와 β쇄의 헤테로다이머로 이루어지는 특이적인 T 세포 수용체(T cell receptor; 이하, ‘TCR’이라고 약칭한다)에 의해 인식하고, 그 복합체를 세포표면에 제시하고 있는 세포를 상해시킬 수 있는 것이 있다.

목적 항원을 인식하는 TCR 유전자를 CTL을 비롯한 세포독성 활성을 가지는 T 세포에 도입하는 것에 의해, 목적 항원에 특이적인 세포독성 활성을 T 세포에 부여하는 것을 기대할 수 있다. 이것에 의거하여, MART1(비특허문헌 1), gp100(비특허문헌 2) 및 mHAG HA-2항원(비특허문헌 3) 등, 여러 가지 항원을 표적으로 한 TCR 유전자에 의한 유전자 치료가 시도되고 있다. 그렇지만, 예를 들면 목적 항원을 인식하는 α쇄 및 β쇄로 이루어지는 TCR 유전자를 T 세포에 도입하면, T 세포가 원래 발현하는 내재성 TCRα쇄와 TCRβ쇄가 도입한 목적 항원을 인식하는 TCR의 β쇄와 α쇄 사이에서 잘못 짝지움(mispairing)을 발생한다. 즉, α과 β를 발현하고 있는 세포에, α'과 β'을 도입하면, αβ, αβ', α'β, α'β'의 각 헤테로다이머가 발생한다. 이것으로 적정한 헤테로다이머를 형성해서 목적 항원을 인식하는 TCR이 감소하고, 또 예기하지 않은 항원을 인식하는 헤테로다이머가 발생할 가능성이 문제가 되고 있었다.

이 문제의 해결 방법으로서, 내재성 TCR과 헤테로다이머를 형성하지 않는 싱글-스트랜드 TCR을 T 세포에 도입하는 방법(비특허문헌 4), 목적 항원을 인식하는 항체와의 키메라 수용체(T-body)를 T 세포에 도입하는 방법(비특허문헌 5)이 시도되고 있다. 그러나, 이들 방법으로 수득되는 T 세포는 내재성 TCR과 도입 TCR의 양쪽을 가지므로, 2종류의 항원을 인식하는 경우를 생각할 수 있다. 또 재조합 TCR은 천연에는 존재하지 않는 TCR이기 때문에, T 세포로의 시그널 전달, 안전성 등을 확인할 필요가 있다. 또 다른 방법으로서, TCR의 α쇄 및 β쇄를 발현하지 않는 T 세포, 예를 들면 γ쇄 및 δ쇄를 발현하는 T 세포(γδT 세포)에 목적 항원을 인식하는 TCR의 β쇄와 α쇄를 도입하는 방법이 있다(비특허문헌 6). 그러나, 이 방법으로 수득되는 T 세포도 상기 재조합 TCR을 사용하는 방법과 동일한 문제가 존재한다.

상기 TCR에 의해 예시한 바와 같이, 올리고머 단백질을 발현하는 세포에, 구성 폴리펩티드로서 상기 단백질에 삽입될 수 있는 외래성 폴리펩티드를 도입하면, 내재성 폴리펩티드와 외래성 폴리펩티드가 뒤섞인, 소망의 기능을 발현할 수 없는 올리고머 단백질이 발생하거나, 내재성 폴리펩티드와 외래성 폴리펩티드의 경합에 의해 소망의 기능을 발현하는 올리고머 단백질이 감소하는 경우가 문제가 되고 있었다.

J. Immunol., 제163권, 제507-513쪽(1999) J. Immunol., 제170권, 제2186-2194쪽(2003) : Blood, 제103권, 제3530-3540쪽(2003) Gene Therapy, 제7권, 제1369-1377쪽(2000) J. Clin. Invest, 제114권, 제1774-1781쪽(2004) Cancer Res, 제66권, 제3331-3337쪽(2006).

본 발명의 목적은 올리고머 단백질을 발현하는 세포에 상기 올리고머 단백질을 구성할 수 있는 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 도입하였을 때에 발생하는 내재성과 외래성 폴리펩티드의 혼성에 의한 원치않는 올리고머 형성이 억제된 세포 및 상기 올리고머 형성의 억제방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 제 1 발명은 비천연 올리고머 단백질을 발현하는 세포로서, 천연 올리고머 단백질을 구성하는 내재성 폴리펩티드의 적어도 하나에 상응하는 비천연 올리고머 단백질을 구성하는 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 도입되고 있으며, 또한 상기 내재성 폴리펩티드의 발현이 억제되고 있는 것을 특징으로 하는 세포에 관한 것이다.

본 발명의 제 1 발명에 있어서, 올리고머 단백질이 가변영역과 불변영역으로 구성될 수도 있고, 올리고머 단백질이 항원 인식 수용체, 특히, 당해 항원 인식 수용체가 T 세포 수용체(TCR)일 수도 있다. 또, 내재성 폴리펩티드의 발현이 RNA 간섭에 의해 억제될 수도 있고, 올리고머 단백질이 가변영역과 불변영역으로 구성되고 있고, 상기 올리고머 단백질을 구성하는 내재성 폴리펩티드의 발현이 당해 폴리펩티드의 불변영역에 상응하는 mRNA의 서열을 표적으로 하는 RNA 간섭에 의해 억제될 수도 있다. 또, 외래성 폴리펩티드가 내재성 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열의 불변영역을 가지고 있으며, 또한 외래성 폴리펩티드의 mRNA의 염기서열을 내재성 폴리펩티드의 mRNA의 염기서열과 달리하여, 내재성 폴리펩티드의 발현이 억제될 수도 있다.

본 발명의 제 2 발명은 이하의 공정을 실시하는 것을 특징으로 하는 비천연 올리고머 단백질을 발현하는 세포의 제조방법에 관한 것이다.

(a) 천연 올리고머 단백질을 발현할 수 있는 세포에, 상기 올리고머 단백질을 구성하는 내재성 폴리펩티드의 적어도 하나에 상응하는 비천연 올리고머 단백질을 구성하는 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 도입하는 공정; 및

(b) 상기 내재성 폴리펩티드의 발현을 억제하는 공정.

본 발명의 제 2 발명에 있어서, 올리고머 단백질이 가변영역과 불변영역으로 구성될 수도 있고, 올리고머 단백질이 항원 인식 수용체, 특히, 당해 항원 인식 수용체가 TCR일 수도 있다. 또, RNA 간섭에 의해 내재성 폴리펩티드의 발현이 억제될 수도 있고, 올리고머 단백질이 가변영역과 불변영역으로 구성되고 있고, 상기 올리고머 단백질을 구성하는 내재성 폴리펩티드의 발현을 당해 폴리펩티드의 불변영역에 상응하는 mRNA의 서열을 표적으로 하는 RNA 간섭에 의해 억제될 수도 있다. 또, 외래성 폴리펩티드가 내재성 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열의 불변영역을 가지고 있으며, 또한, 외래성 폴리펩티드의 mRNA의 염기서열을 내재성 폴리펩티드의 mRNA의 염기서열과 달리하여, 내재성 폴리펩티드의 발현이 억제될 수도 있다.

본 발명의 제 3 발명은 이하의 공정을 실시하는 것을 특징으로 하는 비천연 올리고머 단백질의 형성방법에 관한 것이다.

(a) 천연 올리고머 단백질을 발현할 수 있는 세포에, 상기 올리고머 단백질을 구성하는 내재성 폴리펩티드의 적어도 하나에 상응하는 비천연 올리고머 단백질을 구성하는 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 도입하는 공정; 및

(b) 상기 내재성 폴리펩티드의 발현을 억제하는 공정.

본 발명의 제 3 발명에 있어서, 올리고머 단백질이 가변영역과 불변영역으로 구성될 수도 있고, 올리고머 단백질이 항원 인식 수용체, 특히, 당해 항원 인식 수용체가 TCR일 수도 있다. 또, RNA 간섭에 의해 내재성 폴리펩티드의 발현을 억제될 수도 있고, 올리고머 단백질이 가변영역과 불변영역으로 구성되고 있고, 상기 올리고머 단백질을 구성하는 내재성 폴리펩티드의 발현을 당해 폴리펩티드의 불변영역에 상응하는 mRNA의 서열을 표적으로 하는 RNA 간섭에 의해 억제될 수도 있다. 또, 외래성 폴리펩티드가 내재성 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열의 불변영역을 가지고 있으며, 또한 외래성 폴리펩티드의 mRNA의 염기서열을 내재성 폴리펩티드의 mRNA의 염기서열과 달리하여, 내재성 폴리펩티드의 발현이 억제될 수도 있다.

본 발명에 의해, 적어도 하나의 내재성 폴리펩티드가 외래성 폴리펩티드로 치환된 원하는 기능을 유지하는 올리고머 단백질을 높은 비율로 발현하는 세포가 제공된다. 당해 세포는 세포의료에 의한 질병의 치료에 매우 유용하다.

도 1은 TCR 유전자의 발현을 나타내는 도면이다.
도 2는 TCR 양성 세포율을 나타내는 도면이다.
도 3은 TCR 양성세포의 PE의 형광강도를 나타내는 도면이다.
도 4는 TCRα 유전자의 발현을 나타내는 도면이다.
도 5는 TCRβ 유전자의 발현을 나타내는 도면이다.
도 6은 MAGE-A4 테트라머 양성 세포율을 나타내는 도면이다.
도 7은 Rm/Fh 삽입물 작제의 플로우차트를 나타내는 도면이다.
도 8은 T3 벡터 작제의 플로우차트를 나타내는 도면이다.
도 9는 T7 벡터 작제의 플로우차트를 나타내는 도면이다.
도 10은 T15 벡터 작제의 플로우차트를 나타내는 도면이다.
도 11은 pSINsi-hH/hU 작제의 플로우차트를 나타내는 도면이다.
도 12는 HB/UA 삽입물 작제의 플로우차트를 나타내는 도면이다.
도 13은 TN1 벡터 작제의 플로우차트를 나타내는 도면이다.
도 14는 TN5 벡터 작제의 플로우차트를 나타내는 도면이다.
도 15는 pMS-a-hUTCRA-Pb1 작제의 플로우차트를 나타내는 도면이다.
도 16은 TN9 벡터 및 TN11 벡터 작제의 플로우차트를 나타내는 도면이다.
도 17은 TCR 유전자의 발현을 나타내는 도면이다.
도 18은 MAGE-A4 테트라머 양성 세포율을 나타내는 도면이다.
도 19는 TCR 유전자의 발현을 나타내는 도면이다.
도 20은 MAGE-A4 테트라머 양성 세포율을 나타내는 도면이다.
도 21은 세포내 IFNγ 양성 세포율을 나타내는 도면이다.
도 22는 TCR 유전자의 발현(감염 5일 후)을 나타내는 도면이다.
도 23은 TCR 유전자의 발현(감염 11일 후)을 나타내는 도면이다.
도 24는 MAGE-A4 테트라머 양성 세포율을 나타내는 도면이다.
도 25는 세포내 IFNγ 양성 세포율을 나타내는 도면이다.
도 26은 MAGE-A4 테트라머 양성 세포율을 나타내는 도면이다.
도 27은 TCR 유전자의 발현을 나타내는 도면이다.

본 명세서에 있어서 「올리고머 단백질」은 복수의 구성 폴리펩티드(서브 유닛)로 구성된 단백질을 의미한다. 상기 올리고머 단백질은 동일한 폴리펩티드가 복수 조합된 호모 올리고머, 복수 종의 폴리펩티드로 구성되는 헤테로 올리고머의 어느 쪽일 수도 있다. 또, 구성요소인 폴리펩티드의 수에도 특별하게 한정은 없고, 2량체(다이머), 3량체(트리머), 4량체(테트라머), 추가로 다수의 폴리펩티드로 구성되는 올리고머의 어느 것에 대해서도 본 발명을 적용할 수 있다. 올리고머 단백질은 폴리펩티드 간의 디설피드 결합(SS결합) 등의 공유결합, 정전결합 등에 의해 형성된다.

본 명세서에 기재된 「내재성 폴리펩티드」는 세포내에서 본래의 유전자로부터 천연의 상태로 발현되는 폴리펩티드를 의미한다. 이에 대해 「외래성 폴리펩티드」는 인위적으로 외부로부터 도입된 폴리펩티드를 의미하고, 물리적으로 세포에 도입된 폴리펩티드, 도입되는 세포에 원래 존재하지 않는 외래 유전자로부터 발현되는 폴리펩티드가 예시된다. 또, 「비천연 올리고머 단백질」은 당해 단백질을 구성하는 내재성 폴리펩티드의 적어도 1개가 외래성 폴리펩티드로 치환된 올리고머 단백질이고, 외래성 폴리펩티드만으로 구성되는 올리고머 단백질, 내재성 폴리펩티드와 외래성 폴리펩티드를 양쪽 포함하는 올리고머 단백질의 어느 것이나 포함된다. 본 발명을 특별하게 한정하는 것은 아니지만, 통상, 외래성 폴리펩티드는 올리고머 단백질을 형성할 수 있는 범위에서 내재성 폴리펩티드와 다른 아미노산 서열을 가지고 있다.

본 명세서에 있어서 「폴리펩티드의 발현 억제」는 당해 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터의 전사 및/또는 번역을 방해하는 것에 의해, 최종적인 폴리펩티드의 생성을 억제하는 것, 즉, 생성물로서의 폴리펩티드량이 감소하는 것을 의미한다. 따라서 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터의 전사반응이 억제되지 않는 경우라도, 전사 산물(mRNA)이 신속하게 분해되고, 단백질의 생성이 억제되어 있으면 「발현의 억제」에 포함된다. 본 발명에서는 바람직하게는 발현 억제가 희망되는 내재성 폴리펩티드의 발현이 선택적으로 억제된다.

상기의 「폴리펩티드의 발현 억제」를 위한 수단에는 특별하게 한정은 없다. 바람직하게는 폴리펩티드의 발현을 선택적으로 억제할 수 있는 수단이 사용된다. 예를 들면, 폴리펩티드의 입체구조, 아미노산 서열 또는 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열 특이적으로, 폴리펩티드의 발현을 억제하는 수단이 본 발명에 바람직하다. 상기의 수단으로서는 특별하게 한정은 되지 않지만, mRNA로부터의 폴리펩티드의 번역을 억제하는 수단인 RNA 간섭, 리보자임, 안티센스 RNA가 예시된다.

본 명세서에 있어서 「항원 인식 수용체」는 항원을 특이적으로 인식하는 단백질을 의미한다. 항원 인식 수용체로서 인간 유래의 T 세포 수용체(TCR), 인간 이외의 생물 유래의 TCR이 예시된다. TCR은 α쇄와 β쇄로 이루어지는 헤테로다이머, γ쇄와 δ쇄로 이루어지는 헤테로다이머가 알려져 있지만, 본 발명에 있어서는 어느 것이나 적합하게 사용할 수 있다.

본 명세서에 있어서 「T 세포」는 T 림프구 라고도 불리고, 면역응답에 관여하는 림프구 중 흉선에서 유래하는 세포를 의미한다. T 세포에는 헬퍼 T 세포, 서프레서 T 세포, 제어성 T 세포, CTL, 네이브 T 세포, 메모리 T 세포, α쇄와 β쇄의 TCR을 발현하는 αβT 세포, γ쇄와 δ쇄의 TCR를 발현하는 γδT 세포가 포함된다. 「T 세포를 함유하는 세포집단」으로서는 혈액(말초혈, 제대혈 등), 골수액 이외에, 이들로부터 채취, 분리, 정제, 유도된 말초혈액 단핵세포(PBMC), 혈구계 세포, 조혈간 세포, 제대혈 단핵구 등을 포함하는 세포집단이 예시된다. 또, T 세포를 함유하는 혈구계 세포 유래의 여러 가지의 세포집단을 본 발명에 사용할 수 있다. 이들의 세포는 IL-2등의 사이토카인에 의해 생체 내(in vivo)이나 생체 외(ex vivo)에서 활성화될 수 있다. 이들의 세포는 생체로부터 채취된 것, 혹은 생체 외에서의 배양을 거쳐서 수득된 것, 예를 들면 본 발명의 방법에 의해 수득된 T 세포집단을 그대로 혹은 동결 보존한 것 어느 것이나 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

(1) 본 발명의 세포

본 발명의 세포는 천연 올리고머 단백질을 구성하고 있는 적어도 하나의 내재성 폴리펩티드에 상응하는 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 도입되고 있으며, 또한 상기의 내재성 폴리펩티드의 발현이 억제되는 것에 의해, 비천연 올리고머 단백질을 발현할 수 있는 세포이다. 상기의 구성에 의해, 단순하게 외래성 폴리펩티드를 세포 내에서 발현시켰을 경우와 비교해서, 외래성 폴리펩티드를 구성 폴리펩티드로서 포함하는, 소망의 기능을 가지는 비천연 올리고머 단백질이 고효율로 형성된다는 이점을 가지고 있다.

발현시키려고 하는 비천연 올리고머 단백질이 호모 올리고머인 경우, 내재성 폴리펩티드의 발현을 적절한 발현 억제 수단으로 억제하고, 그렇게 한 다음, 외래성 폴리펩티드를 발현시키면 소망하는 비천연 올리고머 단백질의 형성 비율이 향상된다. 헤테로 올리고머의 경우에는, 구성 폴리펩티드의 1종만이 외래성 폴리펩티드와 치환됨으로써 올리고머 단백질의 기능이 변화되는 경우와, 구성 폴리펩티드의 전부가 외래성 폴리펩티드로 치환될 필요가 있는 경우의 2 가지의 경우가 있다. 어느 쪽의 경우도, 소망하는 비천연 올리고머 단백질에 삽입되는 것이 바람직하지 않은, 즉 도입되는 외래성 폴리펩티드에 상응하는 내재성 폴리펩티드의 발현이 억제되도록 처리된다. 예를 들면, 헤테로다이머인 올리고머 단백질을 2종류의 외래성 폴리펩티드로 형성시켰을 경우에 소망하는 기능이 발휘되는 경우는, 각각의 폴리펩티드에 상응하는 2종류의 내재성 폴리펩티드의 발현을 억제한다. 또, 1종류의 외래성 폴리펩티드와 다른 종류의 내재성 폴리펩티드로 이루어지는 헤테로다이머를 형성시키는 것이 소망되는 경우, 당해 외래성 폴리펩티드와 경합하는 내재성 폴리펩티드의 발현을 선택적으로 억제한다.

또, 본 발명의 세포는 외래성 폴리펩티드의 발현과 비교해서 내재성 폴리펩티드의 발현이 선택적으로 억제된 세포일 수 있지만, 발현 억제 수단을 사용하지 않는 경우와 비교한 내재성 폴리펩티드의 발현량이 20% 이상, 40% 이상, 60% 이상, 80% 이상 혹은 100%, 즉 완전하게 억제될 수도 있다.

본 발명이 적용되는 올리고머 단백질에는 특별하게 한정은 없고, 구조 단백질, 효소, 전사인자, 수용체, 항체가 예시된다. 또, 본 발명에 있어서, 올리고머 단백질은 세포표면 단백질(막 단백질) 일 수도 있고, 실시예에 예시된 항원 인식 수용체, 예를 들면 T 세포 수용체(TCR)에로의 적용이 특히 바람직하다.

본 발명의 세포는 천연 올리고머 단백질을 구성하는 내재성 폴리펩티드의 발현이 억제되고 있기 때문에, 외래성 폴리펩티드와 내재성 폴리펩티드와의 경합이 억제되고, 발현이 기대되는 외래성 폴리펩티드를 포함하는 적절한 올리고머 단백질이 형성된다.

본 발명에서 사용되는 세포는 올리고머 단백질을 발현하는 세포라면 특별하게 한정은 없고, 동물세포, 식물세포, 미생물의 어느 것일 수 있다. 특별하게 한정은 되지 않지만, 인간 또는 인간 이외의 동물 유래의 T 세포는 헤테로다이머를 형성하는 TCR을 발현시키므로, 상기 TCR의 개변을 목적으로 하여 본 발명에 사용할 수 있다. 본 발명의 세포는 외래성 폴리펩티드를 도입할 때에, 내재성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 결실시키는 것이나, 내재성 폴리펩티드가 발현하지 않도록 분화 유도하는 것을 필요로 하지 않고, 내재성 폴리펩티드를 발현하고 있는 세포를 이용할 수 있기 때문에 유용하다.

본 발명에서는 폴리펩티드의 발현을 억제하는 수단의 하나의 형태로서, RNA 간섭(RNA interference, RNAi)이 이용된다. 1998년에 보고된 RNA 간섭은, 더블-스트랜드 RNA에 의해서 서열 특이적인 mRNA의 분해가 발생하는 것에 의한 유전자 발현의 억제현상으로서 주목받고 있다. 상기 RNA 간섭은 장쇄 더블-스트랜드 RNA가 Dicer라 불리는 RNaseIII 타입의 활성에 의해 siRNA라고 불리는 21∼25 뉴클레오티드의 단쇄 RNA에 분해되고, 이어서, 그 siRNA가, RISC(RNA-유도 침묵 복합체)라고 불리는 리보핵산 단백질 복합체에 삽입되고, 표적 RNA에 ATP 의존적으로 결합하고, 표적 RNA를 분해한다는 메커니즘에 의해 발생되는 것으로 생각되고 있다.

본 발명에 있어서의 RNA 간섭에서는 내재성 폴리펩티드의 발현을 선택적으로 억제하는 것을 목적으로, 내재성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 전사되는 mRNA의 염기서열에 상동한 혹은 상보적인 RNA 분자, 또는 상기 mRNA의 염기서열에 상동 혹은 상보적인 서열의 쇄를 포함하는 더블-스트랜드 RNA 분자가 이용된다. 여기에서, 「내재성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 전사되는 mRNA의 염기서열에 상동 혹은 상보적이다」 및 「내재성 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 염기서열에 상동 혹은 상보적이다」는 상기의 mRNA의 염기서열에 완전하게 상동 혹은 상보적인 것을 가리킬 뿐만 아니라, 소망하는 기능이 발휘되는 범위에서 실질적으로 상동 혹은 상보적인 것을 포함한다. 또, 본 발명에 사용되는 RNA 분자는 siRNA(short interfering RNA)라고 불린다. 상기 siRNA는 내재성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 전사되는 mRNA의 1개 영역에 대해서 상동 혹은 상보적인 1종류의 siRNA일 수도 있고, 복수의 영역에 대해서 상동인 혹은 상보적인 복수의 더블-스트랜드 RNA 분자를 포함하는 siRNA일 수도 있다.

본 발명에 사용되는 siRNA의 쇄길이로서는 포유 동물세포에 있어서의 인터페론 응답억제의 관점에서, 예를 들면, 13∼29염기의 쇄길이를 가지는 것, 바람직하게는 15∼25염기쌍의 쇄길이를 가지는 것, 더 바람직하게는 20∼25염기쌍의 쇄길이를 가지는 것이 예시된다. 또, 상기 쇄길이의 염기서열의 전부가 내재성 폴리펩티드의 mRNA의 염기서열에 유래하는 것 일 수 있고, 그 일부가 상기의 염기서열에 유래하는 것일 수도 있다. 또, 본 발명에 사용되는 siRNA는 포유 동물세포에 있어서의 RNA 간섭의 유효성의 관점에서, 예를 들면 3'-말단측으로 2∼4 염기 돌출한 싱글-스트랜드 영역을 가지는 더블-스트랜드 RNA의 형상의 것, 더 바람직하게는 3'-말단측으로 2염기 돌출한 싱글-스트랜드 영역을 가지는 더블-스트랜드 RNA의 형상의 것일 수 있다. 상기의 돌출한 싱글-스트랜드 영역으로서 2∼4 염기가 연속하는 데옥시티미딘 잔기(TT, TTT, TTTT)가 예시된다.

본 발명에 사용되는 siRNA는 주로 리보뉴클레오티드에 의해서 구성되지만, 그 일부에 데옥시리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드의 유도체 및/또는 리보뉴클레오티드의 유도체를 포함할 수 있다. 본 발명의 RNA는 특별하게 한정되지 않지만, 공지의 화학합성법에 의해 합성할 수 있다. 또, 적절한 주형핵산을 사용해서 효소적으로(예를 들면, RNA 폴리머라아제를 사용) 제조할 수 있다. 본 발명에 사용되는 siRNA는 분자 내에서 더블-스트랜드를 형성할 수 있는 싱글-스트랜드 RNA에 유래하는 것일 수도 있고, siRNA 부분을 스템으로 하고, 임의의 서열을 루프로 한 스템-루프 구조(쇼트헤어핀 구조: sh구조)의 싱글-스트랜드 RNA(shRNA)가 예시된다. 상기의 임의의 서열로서는 1∼30 뉴클레오티드의 서열이 예시되지만, 바람직하게는 1∼25 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 5∼22 뉴클레오티드의 서열이 사용된다.

본 발명에 사용되는 siRNA는 siRNA 또는 siRNA를 포함하는 RNA 분자를, 직접 세포에 도입할 수도 있다. 세포 내에서 상기 siRNA 또는 siRNA를 포함하는 RNA 분자가 전사되는 핵산 작제물을 세포에 도입할 수 있다. 직접 세포에 도입하는 경우, TransIT-TKO (Mirus사 제품), 인간 T 세포 뉴클레오펙터 키트(Amaxa사 제품)를 적합하게 사용할 수 있다. 한편, 상기 RNA 분자가 전사되는 핵산 작제물을 사용하는 경우, 특별히 본 발명을 한정하는 것은 아니지만, 포유 동물세포 내에서 기능을 발휘할 수 있는 프로모터의 하류에, 상기 siRNA 또는 siRNA를 포함하는 RNA를 코딩하는 핵산이 상기 siRNA가 전사될 수 있는 상태에서, 즉 기능적으로 접속되어 있는 것을 사용할 수 있다. 바람직한 형태로서 내재성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현을 억제할 수 있는 더블-스트랜드 RNA를 구성하는 RNA쇄를 코딩하는 핵산이 각각 프로모터의 하류에 배치되어 있는 작제물이 예시된다.

상기 핵산 작제물에 사용되는 프로모터로서는 포유동물 세포 내에서 기능할 수 있는 것이라면 특별하게 한정은 없고, 예를 들면, RNA폴리머라아제II 프로모터, RNA 폴리머라아제III 프로모터, 테트라사이클린으로 조절 가능한 프로모터 등을 들 수 있다. 또, 조직 특이적 프로모터를 사용하는 것은 소망의 세포, 부위, 장기 등에 있어서 특이적으로 내재성 폴리펩티드의 기능의 억제가 가능하게 되는 점에서 유리하다. 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 상기 RNA 폴리머라아제II 프로모터로서는 CMV 프로모터 등을 들 수 있다. 또, 상기 RNA 폴리머라아제III계 프로모터로서는 tRNA 프로모터, U6snRNA프로모터, 히스톤 HI 프로모터 등을 들 수 있다. 상기 테트라사이클린으로 조절 가능한 프로모터로서는 테트라사이클린 조절형 U6 프로모터, TR프로모터 등을 들 수 있다. 또, 상기 프로모터를 Cre-loxP 시스템과 조합함으로써, 보다 엄밀하게 RNA의 전사를 제어할 수도 있다.

본 발명에서 사용되는 핵산 작제물의 작제에는 특별하게 한정은 없다. 예를 들면 목적 유전자의 기능을 억제할 수 있는 더블-스트랜드 RNA의 센스, 안티센스쇄가 하기와 같은 시스템에서 전사되도록 작제할 수 있다: (A) 서로 다른 2개의 프로모터의 하류에 센스 RNA를 코딩하는 핵산과 안티센스 RNA를 코딩하는 핵산을 각각 접속하고, 이 2개의 전사 유닛을 순방향으로 배치한, 별개로 센스 RNA와 안티센스 RNA를 전사하는 탠덤타입, (B) 1개의 프로모터의 하류에 센스 RNA를 코딩하는 핵산과 안티센스 RNA를 코딩하는 핵산을 각각 순방향으로 배치한 센스 RNA와 안티센스 RNA가 직접 또는 루프로 연결된 스템-루프 타입(또는 쇼트헤어핀 타입)의 RNA를 전사하는 타입, 혹은, (C) 센스쇄 및 안티센스쇄를 (각각 양 스트랜드)로 코딩하는 핵산의 양단측의 각각에 프로모터를 배치하여, 별개의 프로모터로 양쪽 RNA쇄를 전사하는 대향 타입. 본 발명에서는 사용조건, 예를 들면 포유동물 세포의 종류, 센스서열과 안티센스서열의 종류 등에 따라서, 탠덤 타입, 스템-루프 타입, 대향 타입을 구별할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 핵산 작제물은 보다 안정적으로 세포 내에서 효과를 발휘할 수 있도록, 적절한 벡터, 예를 들면 플라스미드 벡터나 바이러스 벡터에 삽입될 수 있다. 추가로, 세포의 염색체 DNA 상에 본 발명의 핵산 작제물을 결합할 수도 있다. 상기 플라스미드 벡터로서는 특별하게 한정되지 않지만, 예를 들면 RNA 간섭용 핵산을 발현시키는 piGENE tRNA 플라스미드(상품명, iGENE사 제품), siLentGene(Promega사 제품), pSEC Hygro 벡터(Ambion사 제품), pBAsi 벡터(다카라바이오사 제품) 등이 예시된다. 바이러스 벡터로서는 아데노바이러스 벡터, 아데노수반바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 들 수 있다. 시판되고 있는 아데노바이러스 벡터의 예로서는 Knockout Adenoviral RNAi System(C1ontech사 제품)이 예시되고, 시판되고 있는 레트로바이러스 벡터의 예로서는 pSINsi 벡터(다카라바이오사 제품), pSIREN-RetroQ 벡터(Clontech사 제품)이 각각 예시된다.

제작된 벡터는 당해 벡터에 적합한 적절한 방법, 예를 들면 플라스미드 벡터의 경우에는 일렉트로포레이션법이나 리포펙션법 등에 의해, 또 바이러스 벡터의 경우에는 당해 바이러스의 세포로의 감염능을 이용하여, 소망하는 세포에 도입할 수 있다.

본 발명에 있어서, 비천연 올리고머 단백질에 포함되는 외래성 폴리펩티드는 상기 외래성 폴리펩티드에 상응하는 내재성 폴리펩티드와 공존하는 경우, 양자는 올리고머 단백질의 형성에 대해서 경합하는 동시에, 외래성 폴리펩티드, 내재성 폴리펩티드의 각각이 포함되는 복수 종의 올리고머 단백질이 형성된다. 본 발명의 세포에서 발현되는 외래성 폴리펩티드는 내재성 폴리펩티드와 비교하여, 사용되는 발현 억제수단에 의해 발현이 억제되기 어려운 폴리펩티드, 적합하게는 억제되지 않는 폴리펩티드라면 특별하게 한정되지 않는다. 예를 들면 발현 억제수단으로서, siRNA를 사용하는 경우, 도입하는 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 그것으로부터 전사되는 RNA가 상기 siRNA와 높은 상동성 혹은 상보성을 가지지 않는 염기서열, 즉, 상기 siRNA의 작용을 받지 않는 서열인 것이 바람직하다. siRNA가 작용하는 RNA상의 영역이, 내재성 폴리펩티드와 외래성 폴리펩티드와 동일한 경우, 외래성 폴리펩티드에 대해서, 코딩되는 아미노산 서열을 바꾸지 않고 염기서열을 변환시킬 수 있다. 유전자 상에서 아미노산을 지정하는 코돈(3개의 염기의 조합)은 아미노산의 종류별로 1∼6 종류씩이 존재하는 것이 알려져 있다. 적절한 코돈의 선택에 의해, 코딩되는 아미노산 서열에는 변화를 제공하지 않고, 염기를 변환(‘침묵 돌연변이’이라 불린다)시킬 수 있다. 즉, 염기서열은 상이하지만 아미노산 서열은 동일하다. 침묵 돌연변이는 코돈의 3번째의 염기를 변환시키는 경우가 많다. 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 이 침묵 돌연변이를 도입하면, 내재성 폴리펩티드의 발현을 억제하는 siRNA가 상기 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 전사되는 RNA에 작용하지 않고, 발현의 억제가 감소된다. 이에 따라 외래성 폴리펩티드의 발현과 비교해서 내재성 폴리펩티드의 발현을 선택적으로 억제할 수 있다. 이하, 본 명세서에 있어서, 상기한 바와 같이 침묵 돌연변이를 도입한 유전자를 「코돈 변환형」유전자라고 부르는 경우가 있다. 상기 염기서열의 변환 시에는, 특별히 본 발명을 한정하는 것은 아니지만, 사용되는 숙주에 있어서 사용빈도가 높은 코돈이나 번역효율을 상승시키는 서열을 선택해서 염기서열을 변환하는 것에 의해, 외래성 폴리펩티드의 발현효율의 향상이 기대된다.

또, siRNA에 의해 내재성 폴리펩티드의 발현을 억제하는 별도의 형태로서, 상기 siRNA가 작용하는 RNA의 영역에 상응하는 외래성 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대해서, 외래성 폴리펩티드의 기능을 손상시키지 않는 범위에 있어서, 다른 아미노산의 치환, 예를 들면 유사한 아미노산으로의 치환에 의해 아미노산 서열을 변화시킬 수 있다. 유사한 아미노산이란 물리화학적 성질에 있어서 유사한 아미노산을 의미하며, 예를 들면 방향족 아미노산(Phe, Trp, Tyr), 지방족 아미노산(Ala, Leu, Ile, Val), 극성 아미노산(Gln, Asn), 염기성 아미노산(Lys, Arg, His), 산성 아미노산(Glu, Asp), 수산기를 가지는 아미노산(Ser, Thr), 측쇄가 작은 아미노산(Gly, Ala, Ser, Thr, Met) 등과 같은 그룹으로 분류되는 아미노산을 들 수 있다. 이러한 유사 아미노산에 의한 치환은 폴리펩티드의 표현형에 변화를 가져오지 않는(즉 보존적 아미노산 치환임) 것이 예측된다. 보존적 아미노산 치환의 구체예는 당해 기술분야에서 주지이며, 여러 문헌에 기재되어 있다(예를 들면 Bowie들, Science, 제247권, 제1306-1310쪽(1990)을 참조). 보존적 아미노산 치환을 외래성 폴리펩티드에 도입하는 것에 의해, 내재성 폴리펩티드의 발현을 억제하는 siRNA가, 상기 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 전사되는 RNA에 작용하지 않고, 발현의 억제가 감소된다. 이에 따라 외래성 폴리펩티드의 발현과 비교해서 내재성 폴리펩티드의 발현을 선택적으로 억제할 수 있다.

T 세포 수용체(T 세포 수용체: TCR)는 α쇄와 β쇄로 이루어지는 헤테로다이머(헤테로 2량체), γ쇄와 δ쇄로 이루어지는 헤테로다이머의 2종류가 존재한다. TCR의 각 쇄 모두 가변(V)영역, 결합(J)영역, 불변(C)영역으로 이루어진다. TCR의 V영역의 다양성은 DNA의 재편성에 의한 V영역을 코딩하는 유전자 세그먼트의 조합과 재편성 결합부위의 미끄러짐, 및 결합부위에로의 N서열의 삽입에 의해 발생한다. α쇄와 β쇄의 V영역에는 아미노산 서열의 돌연변이가 특히 높은 초가변 영역(CDR)이 인정된다.

본 발명의 1형태로서, 비천연의 TCR을 발현하는 세포로서, 상기 비천연 TCR을 구성하는 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 도입되고 있으며, 또한 상기 외래성 폴리펩티드에 상응하는 내재성 폴리펩티드의 발현이 억제된 T 세포를 들 수 있다. 예를 들면 소망의 항원을 인식하는 TCR을 외래성 TCR로서 T 세포에 도입하는 경우, 내재성 TCR의 발현이 억제되는 본 발명의 T 세포에서는, 외래성 폴리펩티드와 내재성 폴리펩티드의 잘못 짝지움이 감소하고, 목적으로 하는 외래성 폴리펩티드를 함유하는 TCR 헤테로다이머의 분자수가 증가한다. 또 내재성 TCR의 발현이 억제되므로, 세포표면에 존재하는 TCR 중, 비천연 TCR이 차지하는 비율이 증가하고, 비천연의 TCR만을 발현하는 1가의 T 세포가 증가한다. 따라서, 항원에 대한 특이성이 향상하여, 세포치료 등의 분야에 있어서 유용하다. 또 내재성 TCR을 발현하는 세포에 외래성 TCR을 도입할 때, 내재성 TCR과 외래성 TCR의 유전자 발현이 경합하여, 외래성 TCR의 발현이 저하될 가능성이 있다. 또, 잘못 짝지워진 TCR에 의한 이식편대숙주병(GVHD) 등의 부작용이 발생할 가능성이 있다. 본 발명의 세포는 상기의 외래성 TCR의 발현저하나 GVDH를 비롯한 부작용을 회피할 수 있다.

내재성 TCR의 V영역의 아미노산 서열은 개개의 T 세포에 따라 다른데 대해서, C 영역의 아미노산 서열은 개개의 T 세포에 공통인 서열에서 동일한 염기서열의 유전자에 코딩되어 있기 때문에, siRNA의 표적으로 하는데 적합하다. 또, 내재성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 siRNA가 작용하는 영역에 있어서, 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 변환(치환) 하고, 즉, 상기 코돈 변환형 유전자로 하고, 비작용 영역으로 하는 것에 의해, 내재성 폴리펩티드의 발현을 억제하고, 외래성 폴리펩티드의 발현을 효율적으로 실시할 수 있다.

예를 들면, 내재성 TCR의 발현을 억제하는 경우, 특별하게 한정은 되지 않지만 TCR을 코딩하는 유전자의 C영역 중, 내재성 α쇄의 염기서열 AGTAAGGATTCTGATGTGTAT(서열번호 19)를, 외래성 α쇄는 염기서열 AGCAAGGACAGCGACGTGTAC(서열번호 20)에 코돈 변환할 수 있다. 상기 2개의 염기서열이 코딩하는 아미노산 서열은, SKDSDVY(서열번호 21)에서 공통이지만, 서열번호 3 및 서열번호 4에 기재되는 RNA를 어닐링시켜서 제작되는 더블-스트랜드 siRNA에 의해, 내재성 TCR의 α쇄가 선택적으로 억제된다. 외래성 TCRα쇄의 일례로서, 서열번호 1에 기재되는 염기서열에 코딩되는 폴리펩티드를 들 수 있다. 서열번호 1에 있어서, 염기번호 68∼883의 염기서열이 TCRα쇄를 코딩한다. 이 중, 염기번호 68∼401이 V영역을, 염기번호 406∼461이 J영역을, 염기번호 462∼883이 C영역을 각각 코딩한다. 서열번호 1의 염기번호 569∼589이, 상기 서열번호 20에 상당하고, 내재성 TCRα쇄와 서열이 다르다.

또, 내재성 β쇄의 염기서열 GCCACCATCCTCTATGAGATC(서열번호 22)를, 외래성 β쇄는 염기서열 GCCACCATCCTGTACGAGATC(서열번호 23)에 코돈 변환할 수 있다. 상기 2개의 염기서열이 코딩하는 아미노산 서열은 ATILYEI(서열번호 24)에서 공통이지만, 서열번호 5 및 서열번호 6에 기재되는 RNA를 어닐링시켜서 제작되는 더블-스트랜드 siRNA에 의해, 내재성 TCR의 β쇄가 선택적으로 억제된다. 외래성 TCRβ쇄의 일례로서, 서열번호 2에 기재되는 염기서열에 코딩되는 폴리펩티드를 들 수 있다. 서열번호 2에 있어서, 염기번호 68∼1006의 염기서열이 TCRβ쇄를 코딩한다. 이 중, 염기번호 68∼414이 V영역을, 염기번호 427∼470이 J영역을, 염기번호 471∼1006이 C영역을 각각 코딩한다. 서열번호 2의 염기번호 902∼922이, 상기 서열번호 23에 상응하고, 내재성 TCRβ쇄와 서열이 다르다.

본 발명의 외래성 TCR이 도입된 T 세포가 투여되는 질병으로서는 당해 T 세포에 감수성을 나타내는 질병일 수 있고, 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 암(백혈병, 고형 종양 등), 간염이나, 인플루엔자, HIV 등의 바이러스, 세균, 진균이 원인이 되는 감염성 질병, 예를 들면 결핵, MRSA, VRE, 심재성 진균증이 예시된다. 또 본 발명의 세포는 골수이식이나 방사선조사 후의 감염증 예방, 재발 백혈병의 완화를 목적으로 한 도너 림프구수주 등에도 이용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 도입수단에는 특별하게 한정은 없고, 공지의 유전자도입 방법에 의해 적절한 것을 선택해서 사용할 수 있다. 상기의 유전자도입방법으로서는 바이러스 벡터를 사용하는 방법, 그 벡터를 사용하지 않는 방법의 어느 것이나 본 발명에 사용할 수 있다. 이들 방법의 상세내용에 대해서는 이미 많은 문헌이 공표되어 있다.

상기 바이러스 벡터에는 특별하게 한정은 없고, 통상, 유전자도입방법에 사용되는 공지의 바이러스 벡터, 예를 들면 레트로바이러스 벡터(렌티바이러스 벡터, 슈도타입 벡터를 포함한다), 아데노바이러스 벡터, 아데노수반바이러스 벡터, 시미안바이러스 벡터, 백시니아바이러스 벡터 또는 센다이바이러스 벡터 등이 사용된다. 특히 적합하게는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 상기 바이러스 벡터로서는 감염된 세포 중에서 자기 복제할 수 없도록 복제능을 결손시킨 것이 적합하다. 또 유전자도입 시에 레트로넥틴(등록상표, 다카라바이오사 제품) 등의 유전자도입 효율을 향상시키는 물질을 사용할 수도 있다.

바이러스 벡터를 사용하지 않는 유전자도입방법으로서는, 본 발명을 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 리포솜, 리간드-폴리리신 등의 담체를 사용하는 방법이나 인산 칼슘법, 일렉트로포레이션법, 파티클 건(particle gun)법 등을 사용할 수 있다. 이 경우에는 플라스미드 DNA, 직쇄상 DNA나 RNA에 도입된 외래유전자가 삽입된다.

레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터는 당해 벡터가 도입되는 세포의 염색체 DNA 중에 그 벡터에 삽입되어 있는 외래유전자를 안정적으로 결합할 수 있고, 유전자 치료 등의 목적으로 사용되고 있다.

외래성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는, 예를 들면 적당한 프로모터의 제어 하에 발현되도록 벡터나 플라스미드 등에 삽입해서 사용할 수 있다. 또, 효율이 좋은 유전자의 전사를 달성하기 위해서, 프로모터나 전사 개시부위와 협동하는 다른 조절서열, 예를 들면 인핸서 서열이나 터미네이터 서열이 벡터 내에 존재할 수도 있다. 또 상동 재조합에 의해 도입 대상의 T 세포의 염색체에 삽입하는 것을 목적으로서, 예를 들면 그 염색체에 있어서의 유전자의 소망의 표적 삽입부위의 양측에 있는 염기서열에 각각 상동성을 가지는 염기서열로 이루어지는 플랭킹 서열 사이에 상기의 유전자를 배치시켜도 좋다.

상기의 「폴리펩티드의 발현 억제」를 위한 수단에 사용되는 핵산, 예를 들면 siRNA 또는 siRNA를 포함하는 RNA가 전사되는 핵산 작제물 및 상기 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 각각 세포에 도입할 수 있고, 또 동일한 벡터에 의해 세포에 도입될 수 있다.

(2) 본 발명의 세포의 제조방법 및 비천연 올리고머 단백질의 형성방법

본 발명의 세포의 제조방법 및 내재성과 외래성 폴리펩티드의 혼성에 의한 올리고머 형성의 억제 방법은 이하의 공정을 실시하는 것을 특징으로 한다.

(a) 올리고머 단백질을 발현하는 세포에, 상기 올리고머 단백질을 구성하는 적어도 하나의 내재성 폴리펩티드에 상응하는 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 도입하는 공정; 및

(b) 상기　내재성 폴리펩티드의 발현을 억제하는 공정.

본 발명의 세포 제조방법은 상기 (1)에 기재하는 본 발명의 세포 제조방법이다. 당해 방법으로 수득되는 세포는 외래성 폴리펩티드를 포함하는 비천연 올리고머 단백질의 형성에 대해서, 내재성 폴리펩티드에 의한 간섭을 감소시키기 때문에, 단순하게 외래성 폴리펩티드를 세포 내에서 발현시켰을 경우에 비하여, 소망의 기능을 가지는 비천연 올리고머 단백질이 고효율로 형성된다.

상기 공정(a)와 공정(b)의 순서는, 특별하게 한정은 없고, 어느 쪽이 먼저일 수도 있고, 동시에 실시될 수도 있다. 본 발명의 방법에서 실시되는 공정에, 내재성 폴리펩티드의 발현이 억제된 세포를 분리 혹은 분리하는 공정을 첨가하고, 상기 세포를 함유하는 세포집단을 유도, 배양 혹은 분리할 수 있고, 추가로 이들의 세포를 함유하는 세포집단을 제조하는 방법도 본 발명의 방법에 포함된다. 이 분리 혹은 분리 공정은 적절한 비천연 올리고머 단백질을 구성하는 외래성 폴리펩티드의 발현을 지표로 실시할 수 있다.

또, 본 발명의 방법의 공정에, 공지의 단백질이나 화학성분을 첨가할 수도 있고, 예를 들면 T 세포의 경우, 사이토카인류, 케모카인, 기타의 성분을 첨가할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 사이토카인이란 T 세포에 작용하여 활성화할 수 있는 것이라면 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 IL-2, IFN-γ, TGF-β, IL-15, IL-7, IFN-α, IL-12, CD40L, IL-27 등이 예시되고, 세포성 면역을 증강시키는 관점에서 특히 적합하게는, IL-2, IFN-γ, IL-12가 예시된다. 또 케모카인이란 T 세포에 작용하여 유주활성을 나타내는 것이라면 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 RANTES, CCL21, MIP1α, MIP1β, CCL19, CXCL12, IP-10, MIG가 예시된다.

( 실시예 )

이하에 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이하의 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.

또, 본 명세서에 기재된 조작 중, 기본적인 조작에 대해서는 문헌[2001년, Cold Spring Harbor Laboratory 발행, T. Maniatis 등이 편집, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed.]에 기재된 방법에 따랐다.

실시예 1: 야생형 및 코돈 변환형 인간 T 세포 수용체 α 및 β 유전자의 제작

코돈 변환형의 인간 항MAGE-A4 TCRα 유전자를, 야생형 유전자의 일부를 변환해서 제작하였다. 이 유전자를 함유하는 핵산 단편을 pPCR-Script(Stratagene사 제품)의 KpnI-XhoI 부위에 클로닝하였다. 코돈 변환형의 인간 항MAGE-A4 TCRα 유전자를 포함하는 핵산단편의 서열을 서열목록의 서열번호 1에 나타낸다

　코돈 변환형의 인간 항MAGE-A4 TCRβ 유전자를, 야생형의 유전자의 일부를 변환해서 제작하였다. 이 유전자를 함유하는 핵산 단편을, pPCR-Script의 KpnI-XhoI 부위에 클로닝하였다. 코돈 변환형의 인간 항MAGE-A4 TCRβ 유전자를 포함하는 핵산단편의 서열을 서열목록의 서열번호 2에 나타낸다.

실시예 2: siRNA에 의한 인간 말초혈액 단핵구에 있어서의 유전자 억제효과의 확인

인간 말초혈액에서 분리한 말초혈액 단핵구(PBMC)에, 인간 T 세포 뉴클레오펙터 키트(Amaxa사 제품)를 사용하여, 서열번호 3 및 4를 어닐링시켜서 제작한 야생형 TCRα에 대한 더블-스트랜드 siRNA(siTCR-A) 50pmol 및, 서열번호 5 및 6을 어닐링시켜서 제작한 야생형 TCRβ에 대한 더블-스트랜드 siRNA(siTCR-B) 50pmol을 혼합하고, 제품 설명서의 순서에 따라 도입하였다. 음성 대조군으로서 서열번호 7 및 8을 어닐링시켜서 제작한 siRNA(siNC)를 100pmol 도입하였다. 도입 2일후에 세포를 회수하고, QIAGEN RNeasy Micro Kit(퀴아젠사 제품)로 전체 RNA의 추출 및 DNAseI 처리를 실시하였다. 추출한 전체 RNA를 랜덤 프라이머(6mer)을 사용하여, M-MLV-RTase로 역전사 반응을 실시하고, SYBR Premix Ex Taq 및 서열번호 9, 10의 야생형 TCRα 증폭용 프라이머, 서열번호 13, 14의 야생형 TCRβ 증폭용 프라이머를 사용해서 실시간 PCR를 실시하고, 야생형 TCRα, 야생형 TCRβ 유전자 발현량의 상대값을 산출하였다. 전체 RNA량의 보정은 서열번호 17, 18의 β-액틴 유전자 증폭용 프라이머를 사용해서 수행하였다.

대조 실험군의 야생형 TCRα, 야생형 TCRβ 유전자 발현 상대값에 대한 각 실험군에서의 발현 상대값의 비율을 산출하는 것에 의해 유전자억제 효과를 평가하였다. 도 1에 결과를 나타낸다. 도 1 중, 종축은 야생형 TCRα 및 야생형 TCRβ 유전자 발현량에 대해서 음성 대조군을 100으로 하였을 때의 상대값으로 나타낸다. 횡축은 도입한 siRNA를 나타낸다. 도 1에 나타내는 바와 같이, 야생형 TCRα 및 β에 대한 더블-스트랜드 siRNA의 도입에 의해, 야생형 TCRα 및 β 유전자 발현 억제효과가 나타났다.

실시예 3: siRNA에 의한 인간 말초혈액 단핵구에 있어서의 단백질 발현 억제효과 확인

실시예 2에서 더블-스트랜드 siRNA를 도입한 인간 말초혈액 단핵구를, 더블-스트랜드 siRNA 도입 3일 후에, PE-항인간 TCR항체(BD Pharmingen사 제품)로 염색하고, 유세포측정기로 TCR 양성 세포율, 및 TCR 양성세포의 PE의 형광강도를 측정하였다. 도 2에 TCR 양성 세포율을 나타내고, 도 3에 TCR 양성세포의 PE의 형광강도를 나타낸다. 횡축은 도입한 siRNA를 나타낸다. 종축은 도 2에서는 TCR 양성 세포율을 나타내고, 도 3에서는 TCR 양성세포의 PE의 형광강도를 나타낸다. 도 2 및 3에 나타내는 바와 같이, 야생형 TCRα 및 β에 대한 더블-스트랜드 siRNA의 도입에 의해, 인간 말초혈액 단핵구의 내재성 야생형 TCRα/β복합 단백질의 발현율 및 발현량의 저하가 관찰되었다.

실시예 4: 코돈 변환형 TCR 발현 레트로바이러스 벡터의 제작

우선, 마우스 게놈을 주형에 서열번호 25에 기재된 pPGK5 프라이머 및 서열번호 26에 기재된 pPGK3 프라이머로 PCR를 실시하고, PGK 프로모터를 포함하는 DNA 단편을 취득하였다. 이 단편을 pT7 Blue 벡터(MERCK사 제품)에 TA 클로닝하였다.

다음에, 이 플라스미드로부터 NotI와 BamHI로 PGK 프로모터 부위를 잘라내고, pBlueScript-SK+벡터(Stratagene사 제품)의 NotI와 BamHI 부위에 클로닝하여 pBS-PPGK를 제작하였다.

pMSCVneo(Clontech 사 제품)을 주형에 서열번호 27에 기재된 3MSCV5 프라이머 및 서열번호 28에 기재된 3MSCV3 프라이머로 PCR를 실시하여 CMV3' LTR 부위를 증폭하고, XhoI 과 EcoRI로 절단하고, PMT 벡터[진세러피 제7권, 제797-804쪽(2000)에 기재되어 있는 PM벡터]의 Xho-EcoRI 부위에 클로닝하여 pMSMC를 제작하였다.

실시예 1의 코돈 변환형 TCRβ 유전자를 클로닝한 플라스미드로부터, PstI로 코돈 변환형 TCRβ 유전자를 잘라내고, pBS-PPGK 의 PstI 부위에 클로닝하여 pBS-Pb2를 제작하였다.

다음에, pBS-Pb2로부터 SacII와 XhoI로 PGK 프로모터+ 변환형 TCRβ 유전자를 잘라내고, pMSMC 의 SacII-XhoI 부위에 클로닝하고, pMS-Pb2를 제작하였다.

실시예 1의 코돈 변환형 TCRα 유전자를 클로닝한 플라스미드로부터, NotI로 코돈 변환형 TCRα 유전자를 잘라내고, pMSMC의 NotI 부위에 클로닝하여 pMS-Ma2를 제작하였다.

다음에, pMS-Ma2로부터 NotI로 코돈 변환형 TCRα 유전자를 잘라내고, pMS-Pb2 의 NotI 부위에 클로닝하여, pMS-aPb1을 얻었다.

플라스미드 벡터 pMS-aPb1에 의해 대장균 JM 109를 형질전환하고, 플라스미드 DNA를 QIAGEN Plasmid Midi Kit(퀴아젠사 제품)를 사용해서 정제하고, 트랜스펙션용 DNA로서 제공하였다.

제작한 pMS-aPb1 벡터를 293T 세포에, 레트로바이러스 페케징 키트 Eco(다카라바이오사 제품)을 사용해서 제품 프로토콜에 따라 트랜스펙션 하고, 각종 양생(amphotropic) 바이러스 상청액을 획득하고, 0.45 ㎛ 필터(Milex HV, 밀리포어사 제품)로 여과하고, PG13 세포(ATCC CRL-10686) 세포에 폴리브렌을 사용하는 방법에 의해 감염시켜, 한계희석법에 의해 세포의 클론화를 실시하였다. 수득된 클론세포의 배양 상청액을 회수하고, 0.45 ㎛ 필터에 의해 여과하고, MS-aPb1 코돈 변환형 TCR 발현 레트로바이러스 용액으로 하였다.

실시예 5: 인간 말초혈액 단핵구로의 코돈 변환형 TCR발현 레트로바이러스의 감염 및 siRNA의 도입

인간 말초혈액에서 분리한 말초혈액 단핵구(PBMC)에, 실시예 4에서 제작한 코돈 변환형 TCR 발현 레트로바이러스를 레트로넥틴을 사용한 표준적인 방법으로 2회 감염을 실시하고, 변환형 TCR 발현 도입 말초혈액 단핵구를 제작하였다. 감염 3일 후에, 인간 T 세포 뉴클레오펙터 키트(Amaxa사 제품)을 사용하여, 실시예 2 및 3에서 유전자 억제효과가 확인된 야생형 TCRα에 대한 siTCR-A 50pmol 및 야생형 TCRβ에 대한 siTCR-B 50pmol을 혼합하고, 제품설명서의 순서에 따라서 도입하였다. 음성 대조군으로서 siNC를 100pmol 도입하였다. 각각 2 실험군으로 실시하였다. siRNA 도입 2일 후에 세포를 회수하고, QIAGEN RNeasy Micro Kit(아젠사 제품)로 전체 RNA의 추출 및 DNaseI 처리를 실시하였다. 추출한 전체 RNA를 랜덤 프라이머(6mer)을 사용하여, M-MLV-RTase(다카라바이오사 제품)로 역전사 반응을 실시하고, SYBR Premix Ex Taq( 다카라바이오사 제품) 및 서열번호 9, 10의 야생형 TCRα증폭용 프라이머, 서열번호 11, 12의 코돈 변환형 TCRα증폭용 프라이머, 서열번호 13, 14의 야생형 TCRβ 증폭용 프라이머, 서열번호 15, 16의 코돈 변환형 TCRβ 증폭용 프라이머를 사용해서 실시간 PCR를 실시하고, 야생형 TCRα, 변환형 TCRα, 야생형 TCRβ, 변환형 TCRβ 유전자 발현량의 상대값을 산출하였다. 전체 RNA량의 보정은 서열번호 17, 18의 β-액틴 유전자 증폭용 프라이머를 사용해서 수행하였다.

대조 실험군의 야생형 TCRα, 변환형 TCRα, 야생형 TCRβ, 변환형 TCRβ 유전자 발현 상대값에 대한 각 실험군에서의 발현 상대값의 비율을 산출 하는 것에 의해 유전자 억제효과를 평가하였다. 도 4에 TCRα, 도 5에 TCRβ의 결과를 나타낸다. 도 중, 종축은 야생형 TCRα, 변환형 TCRα, 야생형 TCRβ, 또는 변환형 TCRβ 유전자 발현량에 대해서 음성 대조군을 100으로 하였을 때의 상대값으로 나타낸다. 횡축은 도입한 siRNA를 나타낸다. 도4 및 5에 나타내는 바와 같이, 야생형 TCRα 또한 β에 대한 더블-스트랜드 siRNA의 도입에 의해, PBMC에 있어서 야생형 TCRα 및 β 유전자 발현을 억제하지만, 변환형 TCRα 및 β 유전자 발현의 억제는 발생하지 않는다.

실시예 6: 코돈 변환형 TCR 도입 인간 말초혈액 단핵구로의 siRNA 도입에 따른 코돈 변환형 TCR 단백질 발현 효과

실시예 5에 있어서, 코돈 변환형 TCR을 도입한 인간 말초혈액 단핵구에 siRNA를 도입하여 3일 후에, HLA-A2402 MAGE-A4 테트라머-PE(MBL사 제품) 및 인간 CD8 TRI-COLOR CONJUGATE(CALTAG Lavoratories)에 의해 염색하고, 유세포측정기에 의해 CD8 양성이며, 또한 테트라머 양성인 세포의 비율을 측정하였다. 각각 2 실험군으로 실시하였다. 도 6에 MAGE-A4 테트라머 양성 세포율을 나타낸다. 횡축은 도입한 siRNA를 나타내고, 종축은 MAGE-A4 테트라머 양성 세포율을 나타낸다. 도 6에 나타내는 바와 같이, 야생형 TCRα 및 β에 대한 더블-스트랜드 siRNA의 도입에 의해, 인간 말초혈액 단핵구에 유전자 도입한 변환형 항MAGE-A4 TCRα/β 복합 단백질의 발현율 증강이 관찰되었다.

실시예 7: 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현(coexpression) 레트로바이러스 벡터의 제작

pSINsi-hU6 벡터(다카라바이오사 제품)의 BamHI-ClaI 부위에 서열번호 29 및 30을 어닐링시켜서 제작한 더블-스트랜드 DNA를 클로닝하고, pSINsi-hU6-TCRA를 제작하였다. 또 pBAsi-mU6벡터(다카라바이오사 제품)의 BamHI-HindIII 부위에 서열번호 31 및 32을 어닐링시켜서 제작한 더블-스트랜드 DNA를 클로닝하고, pBAsi-mU6-TCRB를 제작하였다.

도 7에 나타내는 바와 같이, 제작한 pBAsi-mU6-TCRB를 EcoRV로 잘라내서 수득된 mU6-TCRB 삽입물을 pSINsi-hU6-TCRA의 PmeI 부위에 클로닝하고, pSINsi-Rm/Fh 을 얻었다. 제작한 pSINsi-Rm/Fh를 NheI 및 ClaI로 소화하고, 말단의 평활화를 실시하는 것에 의해, Rm/Fh 삽입물을 얻었다.

도 8에 나타내는 바와 같이, 실시예 4에서 제작한 pMS-aPb1 벡터를 MluI로 소화하고, 말단의 평활화를 실시하고, 상기 Rm/Fh 삽입물을 클로닝해서 T3 벡터를 제작하였다.

또, 도 9에 나타내는 바와 같이, 실시예 4에서 제작한 pMS-aPb1 벡터를 ClaI로 소화하고, 말단의 평활화를 실시하고, Rm/Fh 삽입물을 클로닝해서 T7 벡터를 제작하였다.

다음에, 도 10에 나타내는 바와 같이, 서열번호 33에 나타내는 인공합성 유전자를 MluI 및 SacII로 소화해서 얻은 TCR-1oop-MluI/SacII를, 실시예 4에서 제작한 pMS-aPbl의 MluI-SacII 부위에 클로닝하는 것에 의해, T15 벡터를 얻었다.

또, 도 11에 나타내는 바와 같이, pSINsi-hH1 벡터(다카라바이오사 제품)을 ClaI 소화 후에 평활 말단화를 실시하고, NotI로 소화해서 수득된 단편을 pSINsi-hU6(다카라바이오사 제품)의 PmeI-NotI 부위에 클로닝하고, pSINsi-hH/hU 을 제작하였다.

도 12에 나타내는 바와 같이, pSINsi-hH/hU를 BamHI로 소화해서 수득된 단편을 상기 pSINsi-Rm/Fh를 BamHI로 소화한 부위에 클로닝을 실시하여 pSINsi-RHB/FUA를 제작하고, 이것을 NheI 및 ClaI로 소화하고, 평활 말단화를 실시하고, HB/UA 삽입물을 얻었다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 실시예 4에서 제작한 pMS-aPb1 벡터를 MluI로 소화하고, 말단의 평활화를 실시하고, HB/UA 삽입물을 클로닝하고, TN1 벡터를 제작하였다.

도 14에 나타낸 바와 같이, T15 벡터를 NotI로 소화후, 말단 평활화를 실시하고, α1-블런트(blunt) 삽입물을 제작하였다. 또 T15 벡터를 NotI로 소화하고, 벡터의 자가 라이게이션을 실시해서 수득된 pMS-1oop-Pb1 벡터를 MluI 소화 후, 평활 말단을 실시한 부위에 α1-블런트 삽입물을 클로닝하는 것에 의해 TN5 벡터를 제작하였다.

도 15에 나타낸 바와 같이, 실시예 4에서 제작한 pMS-aPb1 벡터를 NotI로 소화하고, α1 Not 삽입물을 제작하였다. 또 pMS-aPb1 벡터를 NotI로 소화후, 말단 평활화를 실시한 후, ClaI로 소화해서 PGK+β1 삽입물을 제작하였다. 또, pSINsi-hU6-TCRA 벡터를 ClaI로 소화후, 평활 말단을 실시한 후, NotI로 소화하고, hU6-TCRA 삽입물을 얻었다. pMS-aPb1 의 NotI-ClaI 부위에 PGK+β1 삽입물 및 hU6-TCRA 삽입물을 클로닝하는 것에 의해 pMS-hURA-Pb1을 제작한 후, NotI로 소화하고, α1 Not 삽입물을 클로닝하는 것에 의해, pMS-a-hUTCRA-Pb1을 제작하였다.

도 16에 나타내는 바와 같이, pSINsi-RHB/FUA를 EcoRI 및 HindIII로 소화후 말단 평활화를 실시하고, hH1-TCRB-블런트 삽입물을 얻었다. pMS-a-hUTCRA-Pb1을 ClaI로 소화 후, 말단 평활화를 실시해서 hH1-TCRB-블런트 삽입물을 클로닝하는 것에 의해, TN9 벡터 및 TN11 벡터를 제작하였다.

플라스미드 벡터 pMS-aPb1, T3, T7, T15, TN1, TN5 또는 TN9 벡터에 의해 대장균 JM109을 형질전환하고, 플라스미드 DNA를 QIAGEN Plasmid Midi Kit(퀴아젠사 제품)을 사용해서 정제하고, 트랜스펙션용 DNA로서 제공하였다.

제작한 pMS-aPb1, T3, T7, T15, TN1, TN5 또는 TN9 벡터를 293T 세포에, Retorovirus Packaging Kit Eco(다카라바이오사 제품)을 사용해서 제품 프로토콜에 따라 트랜스펙션하고, 각종 양생 바이러스 상청액을 획득하고, 0.45 ㎛ 필터(Milex HV, 밀리포어사 제품)로 여과하고, PG13 세포(ATCC CRL-10686)에 폴리브렌을 사용하는 방법에 의해 감염시켜, 세포의 배양 상청액을 회수하고, 0.45 ㎛ 필터에 의해 여과하고, MS-aPb1, T3, T7, T15, TN1, TN5 또는 TN9 레트로바이러스 용액으로 하였다.

실시예 8: 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 레트로바이러스 벡터로 인간 말초혈액 단핵구의 감염 1

인간 말초혈액에서 분리한 말초혈액 단핵구(PBMC)에, 실시예 7에서 제작한 T3, T7 또는 T15 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 레트로바이러스 및 대조군으로서 코돈 변환형 TCR 발현 pMS-aPb1 벡터를, 레트로넥틴을 사용한 표준적인 방법으로 2회 감염을 실시하고, 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 도입 말초혈액 단핵구를 제작한 2번째 바이러스감염 3일 후에 세포를 회수하고, QIAGEN RNeasy Mini Kit(퀴아젠사 제품)로 전체 RNA의 추출 및 DNaseI 처리를 실시하였다. 추출한 전체 RNA를 PrimeScript RT 시약 키트(Perfect Real Time)(다카라바이오사 제품)로 역전사 반응을 실시하고, SYBR Premix Ex Taq II(다카라바이오사 제품) 및 서열번호 9, 10의 야생형 TCRα 증폭용 프라이머, 서열번호 11, 12의 코돈 변환형 TCRα 증폭용 프라이머, 서열번호 13, 14의 야생형 TCRβ 증폭용 프라이머, 서열번호 15, 16의 코돈 변환형 TCRβ 증폭용 프라이머를 사용해서 실시간 PCR를 실시하고, 야생형 TCRα, 변환형 TCRα, 야생형 TCRβ, 변환형 TCRβ 유전자 발현량의 상대값을 산출하였다. 전체 RNA량의 보정은 서열번호 34, 35의 GAPDH 유전자 증폭용 프라이머를 사용해서 수행하였다.

대조 실험군의 야생형 TCRα, 변환형 TCRα, 야생형 TCRβ, 변환형 TCRβ 유전자 발현 상대값에 대한 각 실험군에서의 발현 상대값의 비율을 산출하는 것에 의해 야생형 TCR 유전자 억제효과 및 변환형 TCR 유전자 발현량을 평가하였다. 도 17에 결과를 나타낸다. 도 중, 종축은 야생형 TCRα, 변환형 TCRα, 야생형 TCRβ, 또는 변환형 TCRβ 유전자 발현량에 대해서 유전자 도입하지 않은 음성 대조군을 100으로 하였을 때의 상대값으로 나타낸다. 횡축은 도입한 레트로바이러스를 나타낸다. 도 17에 나타내는 바와 같이, 야생형 TCRα 또한 β에 대한 siRNA의 도입에 의해, PBMC에 있어서 야생형 TCRα 및 β 유전자 발현을 억제한다. T3 , T7 및 T15에서는 pMS-aPb1에 비해서, 변환형 TCRα 및 β 유전자 발현은 낮다.

실시예 9: 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 레트로바이러스 벡터 도입에 의한 코돈 변환형 TCR 단백질 발현 효과 1

실시예 8에 있어서, T3, T7, T15 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 레트로바이러스 2번째 감염 3일 후에 세포를 회수하고, 실시예 6과 같은 방법에 의해 CD8 양성이며, 또한 테트라머 양성인 세포의 비율을 측정하였다. 도 18에 MAGE-A4 테트라머 양성 세포율을 나타낸다. 횡축은 도입한 레트로바이러스를 나타내고, 종축은 MAGE-A4 테트라머 양성 세포율을 나타낸다. 도 18에 나타내는 바와 같이, T15 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 레트로바이러스 벡터 도입에 의해, 인간 말초혈액 단핵구에 유전자도입한 변환형 항MAGE-A4 TCRα/β복합 단백질의 발현율이 대조군의 코돈 변환형 TCR 발현 pMS-aPb1과 비교해서 향상하였다. 실시예 8에 나타내는 바와 같이, siRNA 발현 유닛의 삽입에 의해, 코돈 변환형 TCR 유전자의 발현량은 pMS-aPb1에 비해서 낮지만, siRNA에 의한 야생형 TCR 유전자의 발현 억제효과에 의해, 코돈 변환형 항MAGE-A4 TCRα/β 복합 단백질 발현율의 증강이 관찰되었다.

실시예 10: 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 레트로바이러스 벡터로 인간 말초혈액 단핵구 감염 2

인간 말초혈액에서 분리한 말초혈액 단핵구(PBMC)에, 실시예 8과 동일하게 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 도입말초혈액 단핵구를 제작하였다. 바이러스감염 7일 후에 전체 RNA의 추출 및 DNaseI 처리를 실시하였다. 실시예 8과 동일한 방법으로 실시간 PCR를 실시하고, 야생형 TCRα, 변환형 TCRα, 야생형 TCRβ 및 변환형 TCRβ 유전자 발현량의 상대값을 산출하였다.

대조 실험군의 야생형 TCRα, 변환형 TCRα, 야생형 TCRβ, 변환형 TCRβ 유전자 발현 상대값에 대한 각 실험군에서의 발현 상대값의 비율을 산출하는 것에 의해서 야생형 TCR 유전자 억제효과 및 변환형 TCR 유전자 발현량을 평가하였다. 도 19에 결과를 나타낸다. 도 중, 종축은 야생형 TCRα, 변환형 TCRα, 야생형 TCRβ, 또는 변환형 TCRβ 유전자 발현량에 대해서 유전자 도입하지 않은 음성 대조군을 100으로 하였을 때의 상대값으로 나타낸다. 횡축은 도입한 레트로바이러스를 나타낸다. 도 19에 나타내는 바와 같이, 야생형 TCRα 또한 β에 대한 siRNA의 발현에 의해, PBMC에 있어서 야생형 TCRα 및 β 유전자 발현을 억제한다. 또 바이러스감염 3일 후의 실시예 8의 결과보다도, 7일 후에서 야생형 TCR 유전자의 발현 억제효과가 높게 되어 있다. 그러나, 야생형 siRNA 발현 유닛의 삽입에 의해 pMS-aPb1에 비해서, 변환형 TCRα 및 β 유전자 발현은 낮다.

실시예 11: 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 레트로바이러스 벡터 도입에 따른 코돈 변환형 TCR 단백질 발현 효과 2

실시예 10에 있어서, T3, T7, T15 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 레트로바이러스 2번째 감염 7일 후에 세포를 회수하고, 실시예 6과 동일한 방법에 의해 CD8 양성이며, 또한 테트라머 양성인 세포의 비율을 측정하였다. 도 20에 MAGE-A4 테트라머 양성 세포율을 나타낸다. 횡축은 도입한 레트로바이러스를 나타내고, 종축은 MAGE-A4 테트라머 양성 세포율을 나타낸다. 도 20에 나타내는 바와 같이, T3, T7 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 레트로바이러스 벡터 도입에 의해, 인간 말초혈액 단핵구에 유전자 도입한 변환형 항MAGE-A4 TCRα/β 복합 단백질의 발현율이, 대조군의 코돈 변환형 TCR 발현 pMS-aPb1과 비교해서 향상하였다. 실시예 10에 나타내는 바와 같이, siRNA 발현 유닛의 삽입에 의해, 코돈 변환형 TCR 유전자의 발현량은 저하하지만, siRNA에 의한 야생형 TCR 유전자의 발현 억제효과에 의해, 코돈 변환형 항MAGE-A4 TCRα/β 복합 단백질 발현율의 증강이 관찰되었다.

실시예 12: 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 레트로바이러스 벡터 도입에 따른 코돈 변환형 TCR 복합체의 항원 특이적 사이토카인 생산능 1

T2 세포주(ATCC CRL-1992)에 HLA-A2402 cDNA를 유전자 도입해서 제작된 T2A24 세포에, MAGE-A4_143-151 펩티드를 펄스한 T2A24 (+) 세포 또는, 펩티드를 펄스하지 않은 T2A24 (-) 세포와, 실시예 10에 있어서의, T3, T7, T15, MS-aPb1 도입세포 3일 후의 세포를 혼합한 세포, 및, 도입 3일 후의 세포에 PMA와 이노마이신(ionomycin)으로 항원 비특이적으로 자극한 세포에, 브레페르딘(Breferdin) A를 첨가한 후, 하룻밤 37℃에서 인큐베이션한 후, IntraPrep(Beckman Coutter)을 사용하여, CD8-FITC 항체(BD Biosciences) 및 IO Test IFNγ-PE(Beckman Coulter)로 CD8 염색 및 세포내 IFNγ 염색을 실시하고, 유세포측정기에 의해 CD8 양성이며, 또한 IFNγ 양성인 세포의 비율을 측정하였다. 도 21에 세포 내 IFNγ 양성 세포율을 나타낸다. 횡축은 도입한 레트로바이러스를 나타내고, 종축은 IFNγ 양성 세포율을 나타낸다. 도 21에 나타내는 바와 같이, T3, T7, T15 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 레트로바이러스 벡터 도입에 의해, MAGE-A4 항원 특이적 IFNγ 생산능이 대조군인 MS-aPb1 도입세포와 동일한 정도인 것으로 확인되었다.

실시예 13: 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 레트로바이러스 벡터로 인간 말초혈액 단핵구의 감염 3

인간 말초혈액에서 분리한 말초혈액 단핵구(PBMC)에, 실시예 7에서 제작한 TN1, TN5, TN9 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 레트로바이러스 및 대조군으로서 코돈 변환형 TCR 발현 pMS-aPb1 벡터를, 레트로넥틴을 사용한 표준적인 방법으로 2회 감염을 실시하고, 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 도입 말초혈액 단핵구를 제작하였다. 2번째 바이러스 감염 5일 후 및 11일 후에 세포를 회수하고, 실시예 8과 동일한 방법으로 실시간 PCR를 실시하고, 야생형 TCRα, 변환형 TCRα, 야생형 TCRβ, 변환형 TCRβ 유전자 발현량의 상대값을 산출하였다.

대조 실험군의 야생형 TCRα, 변환형 TCRα, 야생형 TCRβ, 변환형 TCRβ 유전자 발현 상대값에 대한 각 실험군에서의 발현 상대값의 비율을 산출 하는 것에 의해 야생형 TCR 유전자 억제효과 및 변환형 TCR 유전자 발현량을 평가하였다. 도 22에 감염 5일 후의 결과를, 도 23에 감염 11일 후의 결과를 나타낸다. 도 중, 종축은 야생형 TCRα변환형 TCRα, 야생형 TCRβ, 또는 변환형 TCRβ 유전자 발현량에 대해서 MS-aPb1 도입세포를 100으로 하였을 때의 상대값으로 나타낸다. 횡축은 도입한 레트로바이러스를 나타낸다. 도 22 및 도 23에 나타내는 바와 같이, 야생형 TCRα 또한 β에 대한 siRNA의 발현에 의해, PBMC에 있어서 야생형 TCRα 및 β 유전자 발현을 억제한다.

실시예 14: 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 레트로바이러스 벡터 도입에 따른 코돈 변환형 TCR 단백질 발현 효과 3

실시예 13에 있어서, TN1, TN5, TN9 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 레트로바이러스 2번째 감염 4일 후에 세포를 회수하고, 실시예 6과 동일한 방법에 의해 CD8 양성이며, 또한 테트라머 양성인 세포의 비율을 측정하였다. 도 24에 바이러스감염 4일 후의 MAGE-A4 테트라머 양성 세포율을 나타낸다. 횡축은 도입한 레트로바이러스를 나타내고, 종축은 MAGE-A4 테트라머 양성 세포율을 나타낸다. 도 24에 나타내는 바와 같이, TN5, TN9 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 레트로바이러스 벡터 도입에 의해, 인간 말초혈액 단핵구에 유전자 도입항 변환형 항MAGE-A4 TCRα/β 복합 단백질의 발현율이, 대조군의 코돈 변환형 TCR 발현 MS-aPb1에 비해서 향상되었다. 실시예 13에 나타내는 바와 같이, siRNA 발현 유닛의 삽입에 의해, 변환형 TCRβ의 유전자 발현은 대조군의 MS-aPb1 도입세포와 비교해서 낮지만, siRNA에 의한 야생형 TCR 유전자의 발현 억제효과에 의해, 변환형 항MAGE-A4 TCRα/β 복합 단백질 발현율의 증강이 관찰되었다.

실시예 15: 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 레트로바이러스 벡터 도입에 따른 코돈 변환형 TCR 복합체의 항원 특이적 사이토카인 생산능 2

실시예 12와 동일한 방법에 의해, 실시예 13에 있어서의 TN1, TN5, TN9, MS-aPb1 도입세포 4일 후의 세포를 사용하여, CD8 양성이며, 또한 IFNγ 양성인 세포의 비율을 측정하였다. 도 25에 세포 내 IFNγ 양성 세포율을 나타낸다. 횡축은 도입한 레트로바이러스를 나타내고, 종축은 IFNγ 양성 세포율을 나타낸다. 도 25에 나타내는 바와 같이, TN1, TN5, TN9 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 레트로바이러스 벡터 도입에 의해, MAGE-A4 항원 특이적 IFNγ 생산능이 MS-aPb1 도입세포와 비교해서 동일 정도 이상임을 확인하였다.

실시예 16: 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 레트로바이러스 벡터로 인간 말초혈액 단핵구의 감염 4

인간 말초혈액에서 분리한 말초혈액 단핵구(PBMC)에, 실시예 7에서 제작한 TN5, TN9 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 레트로바이러스 및 대조군으로서 코돈 변환형 TCR 발현 pMS-aPb1 벡터를, 레트로넥틴을 사용한 표준적인 방법으로 2회 감염을 실시하고, 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 도입 말초혈액 단핵구를 제작하였다.

2 번째 감염 4일 후에 세포를 회수하였다. TN5, TN9, MS-aPb1 도입세포의 세포당의 벡터의 평균 카피 수는, 각각 3.64, 2.21, 9.15 카피/세포이었다. 또 실시예 6과 동일한 방법에 의해 CD8 양성이며, 또한 테트라머 양성인 세포의 비율을 측정하였다. 도 26에 바이러스감염 4일 후의 MAGE-A4 테트라머 양성 세포율을 나타낸다. 횡축은 도입한 레트로바이러스를 나타내고, 종축은 MAGE-A4 테트라머 양성 세포율을 나타낸다. 도 26에 나타내는 바와 같이, TN5, TN9 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 레트로바이러스 벡터 도입에 의해, 세포당의 벡터의 카피수가 MS-aPb1보다 적은데도 불구하고, 인간 말초혈액 단핵구에 유전자 도입한 변환형 항MAGE-A4 TCRα/β복합 단백질의 발현율이 대조군의 코돈 변환형 TCR 발현 MS-aPb1과 동등하였다.

실시예 17: 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 레트로바이러스 벡터로 인간 말초혈액 단핵구의 감염 4

실시예 16에서 인간 말초혈액에서 분리한 말초혈액 단핵구(PBMC)에, 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 도입말초혈액 단핵구를 제작하였다. 바이러스 감염 5일 후에 MAGE-A4 테트라머로 염색을 실시하고, Anti-PE MicroBeads(Miltenyi Biotec) 로, MAGE-A4 테트라머 양성 세포만을 분취하였다. 분취한 세포에서, 전체 RNA의 추출 및 DNaseI 처리를 실시하였다. 실시예 8과 동일한 방법으로 실시간 PCR를 실시하고, 야생형 TCRα, 변환형 TCRα, 야생형 TCRβ, 변환형 TCRβ 유전자 발현량의 상대값을 산출하였다.

대조 실험군의 야생형 TCRα, 변환형 TCRα, 야생형 TCRβ, 변환형 TCRβ 유전자 발현 상대값에 대한 각 실험군에서의 발현 상대값의 비율을 산출하는 것에 의해 야생형 TCR 유전자 억제효과 및 변환형 TCR 유전자 발현량을 평가하였다. 도 27에 결과를 나타낸다. 도 중, 종축은 야생형 TCRα, 변환형 TCRα, 야생형 TCRβ, 또는 변환형 TCRβ 유전자 발현량에 대해서 MS-aPb1 도입세포를 100으로 하였을 때의 상대값으로 나타낸다. 횡축은 도입한 레트로바이러스를 나타낸다. 도 27에 나타내는 바와 같이, 야생형 TCRα 또한 β에 대한 siRNA의 발현에 의해, PBMC에 있어서 야생형 TCRα 및 β 유전자 발현을 억제한다. 또 TN5 및 TN9에서는 pMS-aPb1에 비해서, 변환형 TCRα 및 β 유전자 발현이 낮음에도 불구하고, 야생형의 TCRα 또한 β에 대한 siRNA의 발현에 의한 내재성 TCR 유전자의 억제에 의해, 도 26에 나타낸 바와 같이 TN5, TN9 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 레트로바이러스 벡터 도입에 의해, 인간 말초혈액 단핵구에 유전자 도입한 변환형 항MAGE-A4 TCRα/β 복합 단백질의 발현율이, 대조군의 코돈 변환형 TCR발현 MS-aPb1과 동등한 정도까지 상승하였다.

(산업상의 이용가능성)

본 발명에 의해, 의료분야에 있어서 유용한 올리고머 단백질을 발현하는 세포, 특히 T 세포 및 당해 T 세포를 제조하는 방법이 제공된다.

(서열표 자유 텍스트)

서열번호 1: 코돈 변환형 항-MAGE A4 TCR 알파 쇄.

서열번호 2: 코돈 변환형 항-MAGE A4 TCR 베타 쇄.

서열번호 3: siRNA-A를 위한 합성 키메라 올리고뉴클레오티드. 뉴클레오티드 1 내지 19는 리보뉴클레오티드이고 - 기타 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다.

서열번호 4: siRNA-A를 위한 합성 키메라 올리고뉴클레오티드. 뉴클레오티드 1 내지 19는 리보뉴클레오티드이고 - 기타 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다.

서열번호 5: siRNA-B를 위한 합성 키메라 올리고뉴클레오티드. 뉴클레오티드 1 내지 19는 리보뉴클레오티드이고 - 기타 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다.

서열번호 6: siRNA-B를 위한 합성 키메라 올리고뉴클레오티드. 뉴클레오티드 1 내지 19는 리보뉴클레오티드이고 - 기타 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다.

서열번호 7: siRNA-C를 위한 합성 키메라 올리고뉴클레오티드. 뉴클레오티드 1 내지 19는 리보뉴클레오티드이고 - 기타 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다.

서열번호 8: siRNA-C를 위한 합성 키메라 올리고뉴클레오티드. 뉴클레오티드 1 내지 19는 리보뉴클레오티드이고 - 기타 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다.

서열번호 9: 야생형 TCR 알파 쇄를 위한 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머.

서열번호 10: 야생형 TCR 알파 쇄를 위한 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머.

서열번호 11: 코돈 변환형 TCR 알파 쇄를 위한 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머.

서열번호 12: 코돈 변환형 TCR 알파 쇄를 위한 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머.

서열번호 13: 야생형 TCR 베타 쇄를 위한 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머.

서열번호 14: 야생형 TCR 베타 쇄를 위한 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머.

서열번호 15: 코돈 변환형 TCR 베타 쇄를 위한 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머.

서열번호 16: 코돈 변환형 TCR 베타 쇄를 위한 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머.

서열번호 17: 베타-액틴을 위한 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머.

서열번호 18: 베타-액틴을 위한 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머.

서열번호 19: TCR 알파 쇄 부분.

서열번호 20: 코돈 변환형 TCR 알파 쇄 부분.

서열번호 21: TCR 알파 쇄 부분.

서열번호 22: TCR 베타 쇄 부분.

서열번호 23: 코돈 변환형 TCR 베타 쇄 부분.

서열번호 24: TCR 베타 쇄 부분.

서열번호 25: 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 pPGK5.

서열번호 26: 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 pPGK3.

서열번호 27: 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 3MSCV5.

서열번호 28: 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 3MSCV3.

서열번호 29: pSINsi-hU6-TCRA를 위한 합성 올리고뉴클레오티드.

서열번호 30: pSINsi-hU6-TCRA를 위한 합성 올리고뉴클레오티드.

서열번호 31: pBAsi-mU6-TCRB를 위한 합성 올리고뉴클레오티드.

서열번호 32: pBAsi-mU6-TCRB를 위한 합성 올리고뉴클레오티드.

서열번호 33: TCR-loop-MluI/SacII를 위한 합성 올리고뉴클레오티드.

서열번호 34: GAPDH 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머.

서열번호 35: GAPDH 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (21)

1. (i) 가변영역 및 불변영역을 갖는 천연 T 세포 수용체(TCR)를 구성하는 적어도 하나의 내재성 폴리펩티드에 상응하는 비천연 TCR을 구성하는 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 도입 유전자, 및
   (ii) RNA 간섭(interference)에 의해 내재성 폴리펩티드의 발현을 억제하는 도입 siRNA를 포함하고;
   상기 내재성 폴리펩티드의 발현은 siRNA에 의해 억제되며,
   상기 외래성 폴리펩티드의 발현은 siRNA에 의해 억제되지 않고,
   상기 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열은 코딩되는 아미노산 서열에는 변화없이 변성되거나, 또는 상기 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열은 상기 외래성 폴리펩티드의 아미노산 서열에 보존적 아미노산 치환을 도입하도록 변성되어 siRNA가 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 작용하지 않으며,
   상기 TCR을 구성하는 내재성 폴리펩티드의 발현은 상기 폴리펩티드의 불변영역에 상응하는 mRNA의 서열을 표적으로 하는 RNA 간섭에 의해 억제되고,
   상기 외래성 폴리펩티드는 내재성 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열의 불변영역을 가지며, 상기 외래성 폴리펩티드의 mRNA의 염기서열을 상기 내재성 폴리펩티드의 mRNA의 염기서열과 달리하여 내재성 폴리펩티드의 발현이 억제되는 비천연 TCR을 발현하는 세포.
2. (a) 천연 TCR을 발현할 수 있는 세포에, (i) 가변영역 및 불변영역을 갖는 천연 TCR을 구성하는 적어도 하나의 내재성 폴리펩티드에 상응하는 비천연 TCR을 구성하는 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 및 (ii) RNA 간섭에 의해 내재성 폴리펩티드의 발현을 억제하는 siRNA를 도입하고,
   (b) siRNA에 의해 내재성 폴리펩티드의 발현을 억제하는 공정을 실시하는 것을 포함하며;
   상기 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열은 코딩되는 아미노산 서열에는 변화없이 변성되거나, 또는 상기 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열은 상기 외래성 폴리펩티드의 아미노산 서열에 보존적 아미노산 치환을 도입하도록 변성되어 외래성 폴리펩티드의 발현이 siRNA에 의해 억제되지 않고,
   상기 TCR을 구성하는 내재성 폴리펩티드의 발현은 폴리펩티드의 불변영역에 상응하는 mRNA의 서열을 표적으로 하는 RNA 간섭에 의해 억제되며,
   상기 외래성 폴리펩티드는 내재성 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열의 불변영역을 갖고, 상기 외래성 폴리펩티드의 mRNA의 염기서열을 상기 내재성 폴리펩티드의 mRNA의 염기서열과 달리하여 내재성 폴리펩티드의 발현이 억제되는 비천연 TCR을 발현하는 세포의 제조방법.
3. (a) 천연 TCR을 발현할 수 있는 세포에, (i) 가변영역 및 불변영역을 갖는 천연 TCR을 구성하는 적어도 하나의 내재성 폴리펩티드에 상응하는 비천연 TCR을 구성하는 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 및 (ii) RNA 간섭에 의해 내재성 폴리펩티드의 발현을 억제하는 siRNA를 도입하고,
   (b) siRNA에 의해 내재성 폴리펩티드의 발현을 억제하는 공정을 실시하는 것을 포함하며;
   상기 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열은 코딩되는 아미노산 서열에는 변화없이 변성되거나, 또는 상기 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열은 상기 외래성 폴리펩티드의 아미노산 서열에 보존적 아미노산 치환을 도입하도록 변성되어 외래성 폴리펩티드의 발현이 siRNA에 의해 억제되지 않고,
   상기 TCR을 구성하는 내재성 폴리펩티드의 발현은 폴리펩티드의 불변영역에 상응하는 mRNA의 서열을 표적으로 하는 RNA 간섭에 의해 억제되며,
   상기 외래성 폴리펩티드는 내재성 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열의 불변영역을 갖고, 상기 외래성 폴리펩티드의 mRNA의 염기서열을 상기 내재성 폴리펩티드의 mRNA의 염기서열과 달리하여 내재성 폴리펩티드의 발현이 억제되는 비천연 TCR의 형성방법.
4. 제1항에 있어서, 프로모터, 및 세포 내의 핵산 작제물로부터 전사된 siRNA를 코딩하는 핵산을 함유하는 핵산 작제물을 포함하는 세포.
5. 제1항에 있어서, 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 siRNA를 코딩하는 핵산 작제물이 싱글 벡터에 의해 세포에 도입되는 세포.
6. 제2항에 있어서, 프로모터, 및 세포 내의 핵산 작제물로부터 전사된 siRNA를 코딩하는 핵산을 함유하는 핵산 작제물을 도입하는 것을 포함하는 방법.
7. 제2항에 있어서, 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 siRNA를 코딩하는 핵산 작제물이 싱글 벡터에 의해 세포에 도입되는 방법.
8. 제3항에 있어서, 프로모터, 및 세포 내의 핵산 작제물로부터 전사된 siRNA를 코딩하는 핵산을 함유하는 핵산 작제물을 도입하는 것을 포함하는 방법.
9. 제3항에 있어서, 외래성 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 siRNA를 코딩하는 핵산 작제물이 싱글 벡터에 의해 세포에 도입되는 방법.
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