JP5271901B2 - 特異的遺伝子発現方法 - Google Patents
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Description
ジャーナル オブ イムノロジー(J.Immunol.)、第163巻、第507−513頁(1999) ジャーナル オブ イムノロジー、第170巻、第2186−2194頁(2003) ブラッド(Blood)、第103巻、第3530−3540頁(2003) ジーン セラピー(Gene Therapy)、第7巻、第1369−1377頁(2000) ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション(J.Clin.Invest.)、第114巻、第1774−1781頁(2004) キャンサー リサーチ(Cancer Res.)、第66巻、第3331−3337頁(2006)
(a)天然のオリゴマータンパク質を発現し得る細胞に、前記オリゴマータンパク質を構成する内在性ポリペプチドの少なくとも一つに対応する非天然のオリゴマータンパク質を構成する外来性ポリペプチドをコードする遺伝子を導入する工程;及び
(b)前記内在性ポリペプチドの発現を抑制する工程。
(a)天然のオリゴマータンパク質を発現し得る細胞に、前記オリゴマータンパク質を構成する内在性ポリペプチドの少なくとも一つに対応する非天然のオリゴマータンパク質を構成する外来性ポリペプチドをコードする遺伝子を導入する工程;及び
(b)前記内在性ポリペプチドの発現を抑制する工程。
前記の「ポリペプチドの発現の抑制」のための手段には特に限定はない。好ましくは、ポリペプチドの発現を選択的に抑制可能な手段が使用される。例えば、ポリペプチドの立体構造、アミノ酸配列又はポリペプチドをコードする塩基配列特異的に、ポリペプチドの発現を抑制する手段が本発明には好ましい。前記の手段としては、特に限定はされないが、mRNAからのポリペプチドの翻訳を抑制する手段であるRNA干渉、リボザイム、アンチセンスRNAが例示される。
(1)本発明の細胞
本発明の細胞は、天然のオリゴマータンパク質を構成している少なくとも一つの内在性ポリペプチドに対応する外来性ポリペプチドをコードする遺伝子が導入されており、かつ前記の内在性ポリペプチドの発現が抑制されていることにより、非天然のオリゴマータンパク質を発現することができる細胞である。前記の構成により、単純に外来性のポリペプチドを細胞内で発現させた場合に比較して、外来性ポリペプチドを構成ポリペプチドとして含む、所望の機能を有する非天然のオリゴマータンパク質が効率良く形成されるという利点を有している。
発現させようとする非天然オリゴマータンパク質がホモオリゴマーである場合、内在性ポリペプチドの発現を適切な発現抑制手段で抑制し、そのうえで外来性ポリペプチドを発現させれば所望の非天然オリゴマータンパク質が形成される割合が向上する。ヘテロオリゴマーの場合には、構成ポリペプチドの1種のみが外来性のポリペプチドと置換されることでオリゴマータンパク質の機能が変化する場合、構成ポリペプチドのすべてが外来性ポリペプチドに置換される必要のある場合、の2つの場合がある。いずれの場合も、所望の非天然オリゴマータンパク質に取り込まれることが望ましくない、すなわち導入される外来性ポリペプチドに対応する内在性のポリペプチドの発現が抑制されるよう処理される。例えば、ヘテロダイマーであるオリゴマータンパク質を2種類の外来性ポリペプチドで形成させた場合に所望の機能が発揮される場合は、それぞれのポリペプチドに対応する2種類の内在性ポリペプチドの発現を抑制する。また、1種類の外来性ポリペプチドと他の種類の内在性ポリペプチドからなるヘテロダイマーを形成させることが望まれる場合、当該外来性ポリペプチドと競合する内在性ポリペプチドの発現を選択的に抑制する。
また、本発明の細胞は、外来性ポリペプチドの発現と比較して内在性ポリペプチドの発現が選択的に抑制された細胞であれば良いが、発現抑制手段を使用しない場合と比較した内在性ポリペプチドの発現量が20%以上、40%以上、60%以上、80%以上もしくは100%、すなわち完全に抑制されても良い。
本発明におけるRNA干渉では、内在性ポリペプチドの発現を選択的に抑制することを目的として、内在性ポリペプチドをコードする遺伝子から転写されるmRNAの塩基配列に相同なもしくは相補的なRNA分子、又は前記mRNAの塩基配列に相同もしくは相補的な配列の鎖を含む二本鎖RNA分子が利用される。ここで、「内在性ポリペプチドをコードする遺伝子から転写されるmRNAの塩基配列に相同もしくは相補的である」及び「内在性ポリペプチドをコードするmRNAの塩基配列に相同もしくは相補的である」とは、前記のmRNAの塩基配列に完全に相同もしくは相補的であることを指すのみではなく、所望の機能が発揮される範囲で実質的に相同もしくは相補的であることを包含する。また、本発明に使用されるRNA分子はsiRNA(short interfering RNA)と呼ばれる。前記siRNAは、内在性ポリペプチドをコードする遺伝子から転写されるmRNAの1つの領域に対し相同もしくは相補的な1種類のsiRNAであっても良く、複数の領域に対し相同なもしくは相補的な複数の二本鎖RNA分子を含むsiRNAであっても良い。
前記核酸構築物に使用されるプロモーターとしては、哺乳動物細胞内で機能しうるものであれば特に限定はなく、例えば、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーター、テトラサイクリンで調節可能なプロモーターなどが挙げられる。また、組織特異的プロモーターを用いることは、所望の細胞、部位、臓器などにおいて特異的に内在性ポリペプチドの機能の抑制が可能となる点で有利である。特に限定は無いが、例えば、前記RNAポリメラーゼIIプロモーターとしては、CMVプロモーターなどが挙げられる。また、前記RNAポリメラーゼIII系プロモーターとしては、tRNAプロモーター、U6snRNAプロモーター、ヒストンH1プロモーターなどが挙げられる。前記テトラサイクリンで調節可能なプロモーターとしては、テトラサイクリン調節型U6プロモーター、TRプロモーターなどが挙げられる。また、上記プロモーターをCre−loxPシステムと組み合わせることにより、より厳密にRNAの転写を制御することもできる。
内在性TCRのV領域のアミノ酸配列は個々のT細胞によって異なるのに対し、C領域のアミノ酸配列は個々のT細胞に共通の配列で同じ塩基配列の遺伝子にコードされているため、siRNAの標的とするのに好適である。更に、内在性ポリペプチドをコードする遺伝子にsiRNAが作用する領域において、外来性ポリペプチドをコードする遺伝子を変換(置換)して、すなわち、前記コドン変換型遺伝子とし、非作用領域とすることにより、内在性ポリペプチドの発現を抑制し、外来性ポリペプチドの発現を効率よく行うことができる。
前記の「ポリペプチドの発現の抑制」のための手段に使用される核酸、例えばsiRNA又はsiRNAを含むRNAが転写される核酸構築物と、前記の外来性ポリペプチドをコードする遺伝子は、別々に細胞に導入することができ、また、同一のベクターにより細胞に導入することができる。
本発明の細胞の製造方法及び内在性と外来性のポリペプチドの混成によるオリゴマー形成の抑制方法は、以下の工程を実施することを特徴とする。
(a)オリゴマータンパク質を発現する細胞に、前記オリゴマータンパク質を構成する少なくとも一つの内在性ポリペプチドに対応する外来性ポリペプチドをコードする遺伝子を導入する工程;及び
(b)前期内在性ポリペプチドの発現を抑制する工程。
本発明の細胞の製造方法は、前記(1)に記載する本発明の細胞の製造方法である。当該方法で得られる細胞は、外来性のポリペプチドを含む非天然のオリゴマータンパク質の形成に関して、内在性ポリペプチドによる干渉が低減されているため、単純に外来性のポリペプチドを細胞内で発現させた場合に比較して、所望の機能を有する非天然のオリゴマータンパク質が効率良く形成される。
前記工程(a)と工程(b)の順序は、特に限定はなく、どちらが先であっても良く、同時に実施されても良い。本発明の方法で実施される工程に、内在性ポリペプチドの発現が抑制された細胞を分離もしくは単離する工程を加えて、前記細胞を含有する細胞集団を誘導、培養もしくは単離することができ、更にこれらの細胞を含有する細胞集団を製造する方法も本発明の方法に含まれる。この分離もしくは単離工程は、適切な非天然のオリゴマータンパク質を構成する外来性ポリペプチドの発現を指標に実施することができる。
また、本明細書に記載の操作のうち、基本的な操作については2001年、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行、T.マニアティス(T.Maniatis)ら編集、モレキュラー クローニング:ア ラボラトリー マニュアル第3版(Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd ed.)に記載の方法によった。
コドン変換型のヒト抗MAGE−A4 TCRα遺伝子を、野生型の遺伝子の一部を変換して作製した。この遺伝子を含む核酸断片を、pPCR−Script(Stratagene社)のKpnI−XhoIサイトにクローニングした。コドン変換型のヒト抗MAGE−A4 TCRα遺伝子を含む核酸断片の配列を配列表の配列番号1に示す。
コドン変換型のヒト抗MAGE−A4 TCRβ遺伝子を、野生型の遺伝子の一部を変換して作製した。この遺伝子を含む核酸断片を、pPCR−ScriptのKpnI−XhoIサイトにクローニングした。コドン変換型のヒト抗MAGE−A4 TCRβ遺伝子を含む核酸断片の配列を配列表の配列番号2に示す。
ヒト末梢血より分離した末梢血単核球(PBMC)へ、Human T Cell Nucleofector Kit(Amaxa社)を用いて、配列番号3及び4をアニールさせて作製した野生型TCRαに対する二本鎖siRNA(siTCR−A)50pmol及び、配列番号5及び6をアニールさせて作製した野生型TCRβに対する二本鎖siRNA(siTCR−B)50pmolを混合し、製品説明書の手順に従って導入した。ネガティブコントロールとして配列番号7及び8をアニールさせて作製したsiRNA(siNC)を100pmol導入した。導入2日後に細胞を回収し、QIAGEN RNeasy Micro Kit(キアゲン社製)にて全RNAの抽出及びDNAseI処理を行った。抽出した全RNAをランダムプライマー(6mer)を用いて、M−MLV−RTaseにて逆転写反応を行い、SYBR Premix Ex Taq及び配列番号9、10の野生型TCRα増幅用プライマー、配列番号13、14の野生型TCRβ増幅用プライマーを用いてリアルタイムPCRを行い、野生型TCRα、野生型TCRβ遺伝子発現量の相対値を算出した。全RNA量の補正は配列番号17、18のβ−アクチン遺伝子増幅用プライマーを用いて行った。
実施例2にて二本鎖siRNAを導入したヒト末梢血単核球を、二本鎖siRNA導入3日後に、PE−anti human TCR 抗体(BD Pharmingen社製)にて染色し、フローサイトメーターにてTCR陽性細胞率、及びTCR陽性細胞のPEの蛍光強度を測定した。図2にTCR陽性細胞率を示し、図3にTCR陽性細胞のPEの蛍光強度を示す。横軸は、導入したsiRNAを示す。縦軸は図2ではTCR陽性細胞率を示し、図3ではTCR陽性細胞のPEの蛍光強度を示す。図2及び3に示されるように、野生型TCRα及びβに対する二本鎖siRNAの導入により、ヒト末梢血単核球の内在性の野生型TCRα/β複合タンパクの発現率及び発現量の低下がみられた。
まず、マウスゲノムを鋳型に配列番号25記載のpPGK5プライマー及び配列番号26記載のpPGK3プライマーでPCRを行い、PGKプロモーターを含むDNA断片を取得した。この断片をpT7 Blueベクター(MERCK社製)にTAクローニングした。
次に、このプラスミドからNotIとBamHIでPGKプロモーター部位を切り出し、pBlueScript−SK+ベクター(Stratagene社製)のNotIとBamHIサイトにクローニングしpBS−PPGKを作製した。
pMSCVneo(Clontech社製)を鋳型に配列番号27記載の3MSCV5プライマー及び配列番号28記載の3MSCV3プライマーでPCRを行いCMV3‘LTR部位を増幅し、XhoIとEcoRIで切断し、pMTベクター[ジーン セラピー 第7巻、第797−804頁(2000)に記載されているpMベクター]のXho−EcoRIサイトにクローニングし、pMSMCを作製した。
次に、pBS−Pb2からSacIIとXhoIでPGKプロモーター+変換型TCRβ遺伝子を切り出し、pMSMCのSacII−XhoIサイトにクローニングし、pMS−Pb2を作製した。
実施例1のコドン変換型TCRα遺伝子をクローニングしたプラスミドから、NotIでコドン変換型TCRα遺伝子を切り出し、pMSMCのNotIサイトにクローニングしpMS−Ma2を作製した。
次に、pMS−Ma2からNotIでコドン変換型TCRα遺伝子を切り出し、pMS−Pb2のNotIサイトにクローニングし、pMS−aPb1を得た。
調製したpMS−aPb1ベクターを293T細胞に、Retorovirus Packaging Kit Eco(タカラバイオ社製)を用いて製品プロトコールに従いトランスフェクションし、各種アンフォトロピックウイルス上清液を獲得し、0.45μmフィルター(Milex HV、ミリポア社製)にてろ過し、PG13細胞(ATCC CRL−10686)細胞にポリブレンを使用する方法により感染させ、限界稀釈法により細胞のクローン化を行った。得られたクローン細胞の培養上清を回収し、0.45μmフィルターによりろ過し、MS−aPb1コドン変換型TCR発現レトロウイルス溶液とした。
ヒト末梢血より分離した末梢血単核球(PBMC)に、実施例4で作製したコドン変換型TCR発現レトロウイルスを、レトロネクチンを用いた標準的な方法で2回感染を行い、変換型TCR発現導入末梢血単核球を作製した。感染3日後に、Human T Cell Nucleofector Kit(Amaxa社)を用いて、実施例2及び3にて遺伝子抑制効果が確認された野生型TCRαに対するsiTCR−A 50pmol及び野生型TCRβに対するsiTCR−B 50pmolを混合し、製品説明書の手順に従って導入した。ネガティブコントロールとしてsiNCを100pmol導入した。各実験群は、例数2にて行った。siRNA導入2日後に細胞を回収し、QIAGEN RNeasy Micro Kit(キアゲン社製)にて全RNAの抽出及びDNaseI処理を行った。抽出した全RNAをランダムプライマー(6mer)を用いて、M−MLV−RTase(タカラバイオ社製)にて逆転写反応を行い、SYBR Premix Ex Taq(タカラバイオ社製)及び配列番号9、10の野生型TCRα増幅用プライマー、配列番号11、12のコドン変換型TCRα増幅用プライマー、配列番号13、14の野生型TCRβ増幅用プライマー、配列番号15、16のコドン変換型TCRβ増幅用プライマーを用いてリアルタイムPCRを行い、野生型TCRα、変換型TCRα、野生型TCRβ、変換型TCRβ遺伝子発現量の相対値を算出した。全RNA量の補正は配列番号17、18のβ−アクチン遺伝子増幅用プライマーを用いて行った。
対照実験群の野生型TCRα、変換型TCRα、野生型TCRβ、変換型TCRβ遺伝子発現相対値に対する各実験群での発現相対値の割合を算出することによって遺伝子抑制効果を評価した。図4にTCRα、図5にTCRβの結果を示す。図中、縦軸は野生型TCRα、変換型TCRα、野生型TCRβ、又は変換型TCRβ遺伝子発現量についてネガティブコントロールを100としたときの相対値で示す。横軸は、導入したsiRNAを示す。図4及び5に示されるように、野生型TCRαかつβに対する二本鎖siRNAの導入により、PBMCにおいて野生型TCRα及びβ遺伝子発現を抑制するが、変換型TCRα及びβ遺伝子発現の抑制は起こっていない。
実施例5において、コドン変換型TCR導入したヒト末梢血単核球へsiRNAを導入して3日後に、HLA−A2402 MAGE−A4 テトラマー−PE(MBL社製)及びHuman CD8 TRI−COLOR CONJUGATE (CALTAG Lavoratories)により染色し、フローサイトメーターによりCD8陽性であって、かつテトラマー陽性である細胞の割合を測定した。各実験群は、例数2にて行った。図6にMAGE−A4テトラマー陽性細胞率を示す。横軸は、導入したsiRNAを示し、縦軸はMAGE−A4テトラマー陽性細胞率を示す。図6に示されるように、野生型TCRα及びβに対する二本鎖siRNAの導入により、ヒト末梢血単核球に遺伝子導入した変換型抗MAGE−A4TCRα/β複合タンパクの発現率の増強が見られた。
pSINsi−hU6ベクター(タカラバイオ社製)のBamHI−ClaIサイトに配列番号29及び30をアニールさせて作製した2本鎖DNAをクローニングして、pSINsi−hU6−TCRAを作製した。また、pBAsi−mU6ベクター(タカラバイオ社製)のBamHI−HindIIIサイトに配列番号31及び32をアニールさせて作製した2本鎖DNAをクローニングして、pBAsi−mU6−TCRBを作製した。
図7に示すように、作製したpBAsi−mU6−TCRBをEcoRVにて切り出して得られた、mU6−TCRB insertをpSINsi−hU6−TCRAのPmeIサイトにクローニングし、pSINsi−Rm/Fhを得た。作製したpSINsi−Rm/FhをNheI及びClaIにて消化し、末端の平滑化を行うことにより、Rm/Fh insertを得た。
図8に示すように、実施例4にて作製したpMS−aPb1ベクターをMluIにて消化し、末端の平滑化を行い、前記Rm/Fh insertをクローニングしてT3ベクターを作製した。
また、図9に示すように、実施例4にて作製したpMS−aPb1ベクターのをClaIにて消化し、末端の平滑化を行い、Rm/Fh insertをクローニングしてT7ベクターを作製した。
次に、図10に示すように、配列番号33に示す人工合成遺伝子をMluI及びSacIIにて消化して得たTCR−loop−MluI/SacIIを、実施例4にて作製したpMS−aPb1のMluI−SacIIサイトにクローニングすることにより、T15ベクターを得た。
さらに、図11に示すように、pSINsi−hH1ベクター(タカラバイオ社製)をClaI消化後に平滑末端化を行い、NotIにて消化して得られた断片をpSINsi−hU6(タカラバイオ社製)のPmeI−NotIサイトにクローニングし、pSINsi−hH/hUを作製した。
図12に示すように、pSINsi−hH/hUをBamHIにて消化して得られた断片を前記pSINsi−Rm/FhをBamHIにて消化したサイトにクローニングを行いpSINsi−RHB/FUAを作製し、これをNheI及びClaIにて消化し、平滑末端化を行って、HB/UA insertを得た。
図13に示すように実施例4にて作製したpMS−aPb1ベクターをMluIにて消化し、末端の平滑化を行い、HB/UA insertをクローニングして、TN1ベクターを作製した。
図14に示すようにT15ベクターをNotIにて消化後、末端平滑化を行って、α1−blunt insertを作製した。また、T15ベクターをNotIにて消化し、ベクターのセルフライゲーションを行って得られたpMS−loop−Pb1ベクターをMluI消化後、平滑末端化を行ったサイトにα1−blunt insertをクローニングすることによりTN5ベクターを作製した。
図15に示すように実施例4にて作成したpMS−aPb1ベクターをNotIにて消化して、α1 Not insertを作製した。また、pMS−aPb1ベクターをNotIにて消化後、末端平滑化を行った後、ClaIにて消化してPGK+β1 insertを作製した。さらに、pSINsi−hU6−TCRAベクターをClaIにて消化後、平滑末端を行った後、NotIにて消化して、hU6−TCRA insertを得た。pMS−aPb1のNotI−ClaIサイトにPGK+β1 insert及びhU6−TCRA insertをクローニングすることによりpMS−hURA−Pb1を作製後、NotIにて消化し、α1 Not insertをクローニングすることにより、pMS−a−hUTCRA−Pb1を作製した。
図16に示すように、pSINsi−RHB/FUAをEcoRI及びHindIIIにて消化後末端平滑化を行って、hH1−TCRB−blunt insertを得た。pMS−a−hUTCRA−Pb1をClaI消化後、末端平滑化を行ってhH1−TCRB−blunt insertをクローニングすることにより、TN9ベクター及びTN11ベクターを作製した。
プラスミドベクターpMS−aPb1、T3、T7、T15、TN1、TN5、TN9ベクターにより大腸菌JM109を形質転換し、プラスミドDNAをQIAGEN Plasmid Midi Kit(キアゲン社製)を用いて精製し、トランスフェクション用DNAとして供した。
調製したpMS−aPb1、T3、T7、T15、TN1、TN5、TN9ベクターを293T細胞に、Retorovirus Packaging Kit Eco(タカラバイオ社製)を用いて製品プロトコールに従いトランスフェクションし、各種アンフォトロピックウイルス上清液を獲得し、0.45μmフィルター(Milex HV、ミリポア社製)にてろ過し、PG13細胞(ATCC CRL−10686)細胞にポリブレンを使用する方法により感染させ、細胞の培養上清を回収し、0.45μmフィルターによりろ過し、MS−aPb1、T3、T7、T15、TN1、TN5、TN9レトロウイルス溶液とした。
ヒト末梢血より分離した末梢血単核球(PBMC)に、実施例7で作製したT3、T7、T15コドン変換型TCR及びsiRNA共発現レトロウイルス及びコントロールとしてコドン変換型TCR発現pMS−aPb1ベクターを、レトロネクチンを用いた標準的な方法で2回感染を行い、コドン変換型TCR及びsiRNA共発現導入末梢血単核球を作製した。2回目ウイルス感染3日後に細胞を回収し、QIAGEN RNeasy Mini Kit(キアゲン社製)にて全RNAの抽出及びDNaseI処理を行った。抽出した全RNAをPrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)(タカラバイオ社製)にて逆転写反応を行い、SYBR Premix Ex Taq II(タカラバイオ社製)及び配列番号9、10の野生型TCRα増幅用プライマー、配列番号11、12のコドン変換型TCRα増幅用プライマー、配列番号13、14の野生型TCRβ増幅用プライマー、配列番号15、16のコドン変換型TCRβ増幅用プライマーを用いてリアルタイムPCRを行い、野生型TCRα、変換型TCRα、野生型TCRβ、変換型TCRβ遺伝子発現量の相対値を算出した。全RNA量の補正は配列番号34、35のGAPDH遺伝子増幅用プライマーを用いて行った。
対照実験群の野生型TCRα、変換型TCRα、野生型TCRβ、変換型TCRβ遺伝子発現相対値に対する各実験群での発現相対値の割合を算出することによって野生型TCR遺伝子抑制効果及び変換型TCR遺伝子発現量を評価した。図17に結果を示す。図中、縦軸は野生型TCRα、変換型TCRα、野生型TCRβ、又は変換型TCRβ遺伝子発現量について遺伝子導入なしのネガティブコントロールを100としたときの相対値で示す。横軸は、導入したレトロウイルスを示す。図17に示されるように、野生型TCRαかつβに対するsiRNAの導入により、PBMCにおいて野生型TCRα及びβ遺伝子発現を抑制する。T3、T7、T15ではpMS−aPb1に比べて、変換型TCRα及びβ遺伝子発現は低い。
実施例8において、T3、T7、T15コドン変換型TCR及びsiRNA共発現レトロウイルス2回目感染3日後に細胞を回収し、実施例6の同様の方法によりCD8陽性であって、かつテトラマー陽性である細胞の割合を測定した。図18にMAGE−A4テトラマー陽性細胞率を示す。横軸は、導入したレトロウイルスを示し、縦軸はMAGE−A4テトラマー陽性細胞率を示す。図18に示されるように、T15コドン変換型TCR及びsiRNA共発現レトロウイルスベクター導入により、ヒト末梢血単核球に遺伝子導入した変換型抗MAGE−A4TCRα/β複合タンパクの発現率がコントロールのコドン変換型TCR発現pMS−aPb1と比較して向上した。実施例8に示されるように、siRNA発現ユニットの挿入により、コドン変換型TCR遺伝子の発現量はpMS−aPb1に比べて低いものの、siRNAによる野生型TCR遺伝子の発現抑制効果により、コドン変換型抗MAGE−A4TCRα/β複合タンパク発現率の増強が見られた。
ヒト末梢血より分離した末梢血単核球(PBMC)に、実施例8と同様にコドン変換型TCR及びsiRNA共発現導入末梢血単核球を作製した。ウイルス感染7日後に全RNAの抽出及びDNaseI処理を行った。実施例8と同様の方法でリアルタイムPCRを行い、野生型TCRα、変換型TCRα、野生型TCRβ、変換型TCRβ遺伝子発現量の相対値を算出した。
対照実験群の野生型TCRα、変換型TCRα、野生型TCRβ、変換型TCRβ遺伝子発現相対値に対する各実験群での発現相対値の割合を算出することによって野生型TCR遺伝子抑制効果及び変換型TCR遺伝子発現量を評価した。図19に結果を示す。図中、縦軸は野生型TCRα、変換型TCRα、野生型TCRβ、又は変換型TCRβ遺伝子発現量について遺伝子導入なしのネガティブコントロールを100としたときの相対値で示す。横軸は、導入したレトロウイルスを示す。図19に示されるように、野生型TCRαかつβに対するsiRNAの発現により、PBMCにおいて野生型TCRα及びβ遺伝子発現を抑制する。また、ウイルス感染3日後の実施例8の結果よりも、7日後で野生型TCR遺伝子の発現抑制効果が高くなっている。しかし、野生型siRNA発現ユニットの挿入によりpMS−aPb1に比べて、変換型TCRα及びβ遺伝子発現は低い。
実施例10において、T3、T7、T15コドン変換型TCR及びsiRNA 共発現レトロウイルス2回目感染7日後に細胞を回収し、実施例6と同様の方法によりCD8陽性であって、かつテトラマー陽性である細胞の割合を測定した。図20にMAGE−A4テトラマー陽性細胞率を示す。横軸は、導入したレトロウイルスを示し、縦軸はMAGE−A4テトラマー陽性細胞率を示す。図20に示されるように、T3、T7コドン変換型TCR及びsiRNA共発現レトロウイルスベクター導入により、ヒト末梢血単核球に遺伝子導入した変換型抗MAGE−A4TCRα/β複合タンパクの発現率が、コントロールのコドン変換型TCR発現pMS−aPb1と比較して向上した。実施例10に示されるように、siRNA発現ユニットの挿入により、コドン変換型TCR遺伝子の発現量は低下するものの、siRNAによる野生型TCR遺伝子の発現抑制効果により、コドン変換型抗MAGE−A4TCRα/β複合タンパク発現率の増強が見られた。
T2細胞株(ATCC CRL−1992)にHLA−A2402 cDNAを遺伝子導入して作製されたT2A24細胞へ、MAGE−A4143−151ペプチドをパルスしたT2A24(+)細胞又は、ペプチドをパルスしていないT2A24(−)細胞と、実施例10における、T3、T7、T15、MS−aPb1導入細胞3日後の細胞を混合した細胞、及び、導入3日後の細胞にPMAとイオノマイシンにて抗原非特異的に刺激した細胞へ、Breferdin Aを添加したのち一晩37℃にてインキュベートした後、IntraPrep(Beckman Coulter)を用いて、CD8−FITC抗体(BD Biosciences)及びIO Test IFNγ−PE(Beckman Coulter)にてCD8染色及び細胞内IFNγ染色を行い、フローサイトメーターによりCD8陽性であって、かつIFNγ陽性である細胞の割合を測定した。図21に細胞内IFNγ陽性細胞率を示す。横軸は、導入したレトロウイルスを示し、縦軸はIFNγ陽性細胞率を示す。図21に示されるように、T3、T7、T15コドン変換型TCR及びsiRNA共発現レトロウイルスベクター導入により、MAGE−A4抗原特異的IFNγ産生能がコントロールであるMS−aPb1導入細胞と同程度であることが確認された。
ヒト末梢血より分離した末梢血単核球(PBMC)に、実施例7で作製したTN1、TN5、TN9コドン変換型TCR及びsiRNA共発現レトロウイルス及びコントロールとしてコドン変換型TCR発現pMS−aPb1ベクターを、レトロネクチンを用いた標準的な方法で2回感染を行い、コドン変換型TCR及びsiRNA 共発現導入末梢血単核球を作製した。2回目ウイルス感染5日後及び11日後に細胞を回収し、実施例8と同様の方法でリアルタイムPCRを行い、野生型TCRα、変換型TCRα、野生型TCRβ、変換型TCRβ遺伝子発現量の相対値を算出した。
対照実験群の野生型TCRα、変換型TCRα、野生型TCRβ、変換型TCRβ遺伝子発現相対値に対する各実験群での発現相対値の割合を算出することによって野生型TCR遺伝子抑制効果及び変換型TCR遺伝子発現量を評価した。図22に感染5日後の結果を、図23に感染11日後の結果を示す。図中、縦軸は野生型TCRα、変換型TCRα、野生型TCRβ、又は変換型TCRβ遺伝子発現量についてMS−aPb1導入細胞を100としたときの相対値で示す。横軸は、導入したレトロウイルスを示す。図22及び図23に示されるように、野生型TCRαかつβに対するsiRNAの発現により、PBMCにおいて野生型TCRα及びβ遺伝子発現を抑制する。
実施例13において、TN1、TN5、TN9コドン変換型TCR及びsiRNA共発現レトロウイルス2回目感染4日後に細胞を回収し、実施例6と同様の方法によりCD8陽性であって、かつテトラマー陽性である細胞の割合を測定した。図24にウイルス感染4日後のMAGE−A4テトラマー陽性細胞率を示す。横軸は、導入したレトロウイルスを示し、縦軸はMAGE−A4テトラマー陽性細胞率を示す。図24に示されるように、TN5、TN9コドン変換型TCR及びsiRNA共発現レトロウイルスベクター導入により、ヒト末梢血単核球に遺伝子導入した変換型抗MAGE−A4TCRα/β複合タンパクの発現率が、コントロールのコドン変換型TCR発現MS−aPb1に比べて向上した。実施例13に示されるように、siRNA発現ユニットの挿入により、変換型TCRβの遺伝子発現はコントロールのMS−aPb1導入細胞と比べて低いものの、siRNAによる野生型TCR遺伝子の発現抑制効果により、変換型抗MAGE−A4TCRα/β複合タンパク発現率の増強が見られた。
実施例12と同様の方法により、実施例13におけるTN1、TN5、TN9、MS−aPb1導入細胞4日後の細胞を使用して、CD8陽性であって、かつIFNγ陽性である細胞の割合を測定した。図25に細胞内IFNγ陽性細胞率を示す。横軸は、導入したレトロウイルスを示し、縦軸はIFNγ陽性細胞率を示す。図25に示されるように、TN1、TN5、TN9コドン変換型TCR及びsiRNA 共発現レトロウイルスベクター導入により、MAGE−A4抗原特異的IFNγ産生能がMS−aPb1導入細胞と比べて同程度以上であることが確認された。
ヒト末梢血より分離した末梢血単核球(PBMC)に、実施例7で作製したTN5、TN9コドン変換型TCR及びsiRNA共発現レトロウイルス及びコントロールとしてコドン変換型TCR発現pMS−aPb1ベクターを、レトロネクチンを用いた標準的な方法で2回感染を行い、コドン変換型TCR及びsiRNA 共発現導入末梢血単核球を作製した。
2回目感染4日後に細胞を回収した。TN5、TN9、MS−aPb1導入細胞の細胞あたりのベクターの平均コピー数は、それぞれ3.64、2.21、9.15copy/cellであった。また、実施例6と同様の方法によりCD8陽性であって、かつテトラマー陽性である細胞の割合を測定した。図26にウイルス感染4日後のMAGE−A4テトラマー陽性細胞率を示す。横軸は、導入したレトロウイルスを示し、縦軸はMAGE−A4テトラマー陽性細胞率を示す。図26に示されるように、TN5、TN9コドン変換型TCR及びsiRNA共発現レトロウイルスベクター導入により、細胞あたりのベクターのコピー数がMS−aPb1より少ないにもかかわらず、ヒト末梢血単核球に遺伝子導入した変換型抗MAGE−A4TCRα/β複合タンパクの発現率が、コントロールのコドン変換型TCR発現MS−aPb1と同等であった。
実施例16にてヒト末梢血より分離した末梢血単核球(PBMC)に、コドン変換型TCR及びsiRNA共発現導入末梢血単核球を作製した。ウイルス感染5日後にMAGE−A4テトラマーにて染色を行い、Anti−PE MicroBeads(Miltenyi Biotec)にて、MAGE−A4テトラマー陽性細胞のみを分取した。分取した細胞より、全RNAの抽出及びDNaseI処理を行った。実施例8と同様の方法でリアルタイムPCRを行い、野生型TCRα、変換型TCRα、野生型TCRβ、変換型TCRβ遺伝子発現量の相対値を算出した。
対照実験群の野生型TCRα、変換型TCRα、野生型TCRβ、変換型TCRβ遺伝子発現相対値に対する各実験群での発現相対値の割合を算出することによって野生型TCR遺伝子抑制効果及び変換型TCR遺伝子発現量を評価した。図27に結果を示す。図中、縦軸は野生型TCRα、変換型TCRα、野生型TCRβ、又は変換型TCRβ遺伝子発現量についてMS−aPb1導入細胞を100としたときの相対値で示す。横軸は、導入したレトロウイルスを示す。図27に示されるように、野生型TCRαかつβに対するsiRNAの発現により、PBMCにおいて野生型TCRα及びβ遺伝子発現を抑制する。また、TN5およびTN9ではpMS−aPb1に比べて、変換型TCRα及びβ遺伝子発現は低いにもかかわらず、野生型のTCRαかつβに対するsiRNAの発現による内在性TCR遺伝子の抑制により、図26に示すようにTN5、TN9コドン変換型TCR及びsiRNA共発現レトロウイルスベクター導入により、ヒト末梢血単核球に遺伝子導入した変換型抗MAGE−A4TCRα/β複合タンパクの発現率が、コントロールのコドン変換型TCR発現MS−aPb1と同等まで上昇した。
SEQ ID NO:2: Codon modified anti-MAGE A4 TCR beta chain.
SEQ ID NO:3: Synthetic chimera oligonucleotide for siRNA-A. Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides
SEQ ID NO:4: Synthetic chimera oligonucleotide for siRNA-A. Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides
SEQ ID NO:5: Synthetic chimera oligonucleotide for siRNA-B. Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides
SEQ ID NO:6: Synthetic chimera oligonucleotide for siRNA-B. Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides
SEQ ID NO:7: Synthetic chimera oligonucleotide for siRNA-C. Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides
SEQ ID NO:8: Synthetic chimera oligonucleotide for siRNA-C. Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides
SEQ ID NO:9: Synthetic oligonucleotide primer for wild-type TCR alpha chain.
SEQ ID NO:10: Synthetic oligonucleotide primer for wild-type TCR alpha chain.
SEQ ID NO:11: Synthetic oligonucleotide primer for codon-modified TCR alpha chain.
SEQ ID NO:12: Synthetic oligonucleotide primer for codon-modified TCR alpha chain.
SEQ ID NO:13: Synthetic oligonucleotide primer for wild-type TCR beta chain.
SEQ ID NO:14: Synthetic oligonucleotide primer for wild-type TCR beta chain.
SEQ ID NO:15: Synthetic oligonucleotide primer for codon-modified TCR beta chain.
SEQ ID NO:16: Synthetic oligonucleotide primer for codon-modified TCR beta chain.
SEQ ID NO:17: Synthetic oligonucleotide primer for beta-actin.
SEQ ID NO:18: Synthetic oligonucleotide primer for beta-actin.
SEQ ID NO:19: Portion of TCR alpha chain.
SEQ ID NO:20: Portion of codon-modified TCR alpha chain.
SEQ ID NO:21: Portion of TCR alpha chain.
SEQ ID NO:22: Portion of TCR beta chain.
SEQ ID NO:23: Portion of codon-modified TCR beta chain.
SEQ ID NO:24: Portion of TCR beta chain.
SEQ ID NO:25: Synthetic oligonucleotide primer pPGK5.
SEQ ID NO:26: Synthetic oligonucleotide primer pPGK3.
SEQ ID NO:27: Synthetic oligonucleotide primer 3MSCV5.
SEQ ID NO:28: Synthetic oligonucleotide primer 3MSCV3.
SEQ ID NO:29: Synthetic oligonucleotide for pSINsi-hU6-TCRA.
SEQ ID NO:30: Synthetic oligonucleotide for pSINsi-hU6-TCRA.
SEQ ID NO:31: Synthetic oligonucleotide for pBAsi-mU6-TCRB.
SEQ ID NO:32: Synthetic oligonucleotide for pBAsi-mU6-TCRB.
SEQ ID NO:33: Synthetic oligonucleotide for TCR-loop-MluI/SacII.
SEQ ID NO:34: Oligonucleotide primer for amplification of GAPDH gene.
SEQ ID NO:35: Oligonucleotide primer for amplification of GAPDH gene.
Claims (9)
- 非天然のオリゴマータンパク質を発現する細胞であって、天然のオリゴマータンパク質を構成する内在性ポリペプチドの少なくとも一つに対応する非天然のオリゴマータンパク質を構成する外来性ポリペプチドをコードする遺伝子及び前記内在性のポリペプチドの発現を抑制するsiRNAが導入されており、ここに、前記内在性ポリペプチドの発現は前記siRNAにより抑制されており、かつ前記外来性ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列が、前記siRNAの作用を受けない配列に変換されていて、前記外来性ポリペプチドの発現は前記siRNAによって抑制されていないことを特徴とする細胞であって、ここに、
前記外来性ポリペプチドをコードする遺伝子が、コードされるアミノ酸配列が変わらずに塩基配列が変換されており、
前記オリゴマータンパク質が可変領域と定常領域で構成されており、前記オリゴマータンパク質を構成する内在性ポリペプチドの発現が当該ポリペプチドの定常領域に対応するmRNAの配列を標的とするRNA干渉によって抑制されており、
前記外来性ポリペプチドが前記内在性ポリペプチドと同じアミノ酸配列の定常領域を有しており、かつ前記外来性ポリペプチドのmRNAの塩基配列を前記内在性ポリペプチドのmRNAの塩基配列と相異させることにより、前記内在性ポリペプチドの発現が抑制されている、細胞。 - オリゴマータンパク質が抗原認識レセプターである請求項1記載の細胞。
- 抗原認識レセプターがT細胞受容体(TCR)である請求項2記載の細胞。
- 以下の工程:
(a)天然のオリゴマータンパク質を発現し得る細胞に、前記オリゴマータンパク質を構成する内在性ポリペプチドの少なくとも一つに対応する非天然のオリゴマータンパク質を構成する外来性ポリペプチドをコードする遺伝子及び前記内在性のポリペプチドの発現を抑制するsiRNAを導入する工程;及び
(b)前記siRNAにより前記内在性ポリペプチドの発現を抑制する工程を含み、
ここに、前記外来性ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列は、前記siRNAの作用を受けない配列に変換されていて、前記外来性ポリペプチドの発現は、前記siRNAにより抑制されないことを特徴とする、非天然のオリゴマータンパク質を発現する細胞の製造方法であって、ここに、
前記外来性ポリペプチドをコードする遺伝子が、コードされるアミノ酸配列が変わらずに塩基配列が変換されており、
前記オリゴマータンパク質が可変領域と定常領域で構成されており、前記オリゴマータンパク質を構成する内在性ポリペプチドの発現を当該ポリペプチドの定常領域に対応するmRNAの配列を標的とするRNA干渉によって抑制し、
前記外来性ポリペプチドが前記内在性ポリペプチドと同じアミノ酸配列の定常領域を有しており、かつ前記外来性ポリペプチドのmRNAの塩基配列を前記内在性ポリペプチドのmRNAの塩基配列と相異させることにより、前記内在性ポリペプチドの発現を抑制する、方法。 - オリゴマータンパク質が抗原認識レセプターである請求項4記載の方法。
- 抗原認識レセプターがTCRである請求項5記載の方法。
- 以下の工程:
(a)天然のオリゴマータンパク質を発現し得る細胞に、前記オリゴマータンパク質を構成する内在性ポリペプチドの少なくとも一つに対応する非天然のオリゴマータンパク質を構成する外来性ポリペプチドをコードする遺伝子及び前記内在性のポリペプチドの発現を抑制するsiRNAを導入する工程;及び
(b)前記siRNAにより前記内在性ポリペプチドの発現を抑制する工程を含み、
ここに、前記外来性ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列は、前記siRNAの作用を受けない配列に変換されていて、前記外来性ポリペプチドの発現は、前記siRNAにより抑制されないことを特徴とする、非天然のオリゴマータンパク質の形成方法であって、ここに、
前記外来性ポリペプチドをコードする遺伝子が、コードされるアミノ酸配列が変わらずに塩基配列が変換されており、
前記オリゴマータンパク質が可変領域と定常領域で構成されており、前記オリゴマータンパク質を構成する内在性ポリペプチドの発現を当該ポリペプチドの定常領域に対応するmRNAの配列を標的とするRNA干渉によって抑制し、
前記外来性ポリペプチドが前記内在性ポリペプチドと同じアミノ酸配列の定常領域を有しており、かつ前記外来性ポリペプチドのmRNAの塩基配列を前記内在性ポリペプチドのmRNAの塩基配列と相異させることにより、前記内在性ポリペプチドの発現を抑制する、方法。 - オリゴマータンパク質が抗原認識レセプターである請求項7記載の方法。
- 抗原認識レセプターがTCRである請求項8記載の方法。
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