JP6709549B2

JP6709549B2 - Ｔ細胞の機能増強方法

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Publication number: JP6709549B2
Application number: JP2018126310A
Authority: JP
Inventors: 洋珠玖; 裕明池田; 康一岩村; 峰野　純一; 純一峰野; 加藤　郁之進; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Bio Inc; Mie University NUC
Current assignee: Takara Bio Inc; Mie University NUC
Priority date: 2009-03-06
Filing date: 2018-07-02
Publication date: 2020-06-17
Anticipated expiration: 2030-03-05
Also published as: WO2010101249A1; JP2017035090A; JP2018145205A; JP6452118B2; US9181525B2; EP2404997A1; US20160015751A1; US20110318839A1; JPWO2010101249A1; EP2404997A4; CN107090437A; US9603874B2; CN102428179A; EP2404997B1

Description

本発明は、Ｔ細胞におけるＰｒｏｇｒａｍｍｅｄＤｅａｔｈ−１Ｌｉｇａｎｄ１（ＰＤ−Ｌ１）及び／又はＰｒｏｇｒａｍｍｅｄＤｅａｔｈ−１Ｌｉｇａｎｄ２（ＰＤ−Ｌ２）の発現を抑制することによるＴ細胞の機能増強方法などに関する。

Ｂ７：ＣＤ２８共刺激分子ファミリーを介したシグナルはＴ細胞反応の活性化、阻害、調整に深く関与している。Ｂ７：ＣＤ２８共刺激分子ファミリーに属するＰＤ−１（ＰｒｏｇｒａｍｍｅｄＤｅａｔｈ−１）分子は、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２と反応し、Ｔ細胞反応を負に制御することが知られている（非特許文献１）。当初、Ｔ細胞上に発現するＰＤ−１が、抗原提示細胞やがん細胞に発現するＰＤ−Ｌ１や抗原提示細胞上のＰＤ−Ｌ２と反応してＴ細胞の活性化を阻害することが示唆されていた。

一方、ＰＤ−Ｌ１はＴ細胞上にも発現することが知られている。最近、ＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１のみでなくＢ７−１（ＣＤ８０）とも結合することと、Ｔ細胞上に存在するＰＤ−Ｌ１がＴ細胞に負のシグナルを送っている可能性が示された（非特許文献２）。しかしながら、Ｔ細胞上に発現するＰＤ−Ｌ１が免疫反応においてどのような生理的、病理的役割を果たすのかは全く不明である。ＰＤ−Ｌ２については、これまで樹状細胞、マクロファージ、Ｂ１Ｂ細胞及び骨髄由来の肥満細胞に誘導時のみ発現することが知られているのみであり、Ｔ細胞における発現は明らかでない。したがって、Ｔ細胞上に生理的、あるいは強制的に発現するＰＤ−Ｌ２が果たす役割については全く知られていない。

ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１に代表される共刺激分子からの免疫応答阻害シグナルは、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）やＣＤ２８に代表される共刺激分子からの免疫応答活性化シグナルとバランスをとりながら、自己反応性Ｔ細胞の初期のプライミングやエフェクター機能の抑制を介してトレランス（免疫寛容）を誘導することにより、自己反応性Ｔ細胞から組織を守る一方、感染免疫や腫瘍免疫を制御している可能性が示されている。また、ある種の腫瘍やウイルスは、前記の共刺激分子を利用した直接的又は間接的なメカニズムによって、Ｔ細胞の活性化及び増殖を抑制し、自らに対する免疫反応を弱めていると考えられている。更に、Ｔ細胞の機能障害に起因すると考えられている疾患の一部は、前記の共刺激分子の異常がＴ細胞の機能障害の原因であると考えられている。

ＫｅｉｒＭ、他３名、アニュアルレビューオブイムノロジー（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第２６巻、第６７７−７０４頁（２００８）ＢｕｔｔｅＭ、他４名、イムニティ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、第２７巻、第１１１−１２２頁（２００７）

本発明の課題は、Ｔ細胞の機能を増強させる方法、及び機能が増強されたＴ細胞を提供することにある。

本発明者らは、Ｔ細胞のＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２の発現を人為的に制御することにより、Ｔ細胞免疫応答を制御することが可能であることを見出した。特に抗腫瘍性Ｔ細胞におけるＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２の発現を低下させることにより、これらＴ細胞の抗腫瘍効果を増強することを見出し本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、
［１］Ｔ細胞のＰｒｏｇｒａｍｍｅｄＤｅａｔｈ−１Ｌｉｇａｎｄ１（ＰＤ−Ｌ１）及び／又はＰｒｏｇｒａｍｍｅｄＤｅａｔｈ−１１ｉｇａｎｄ２（ＰＤ−Ｌ２）の発現を抑制することを特徴とするＴ細胞の機能増強方法、
［２］Ｔ細胞が細胞障害性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞である［１］記載のＴ細胞の機能増強方法、
［３］調節性Ｔ細胞がヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞又はＴｈ１７細胞である［２］記載のＴ細胞の機能増強方法、
［４］機能増強がＴ細胞インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生増強である［１］記載のＴ細胞の機能増強方法、
［５］ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２に対するｓｉＲＮＡにより、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２の発現を抑制する［１］記載のＴ細胞の機能増強方法、
［６］ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２の発現が抑制された機能増強Ｔ細胞、
［７］Ｔ細胞が細胞障害性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞である［６］記載の機能増強Ｔ細胞、
［８］調節性Ｔ細胞がヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞又はＴｈ１７細胞である［７］記載の機能増強Ｔ細胞、
［９］機能増強がＴ細胞インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生増強である［６］記載の機能増強Ｔ細胞、
［１０］ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２に対するｓｉＲＮＡにより、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２の発現が抑制された［６］記載の機能増強Ｔ細胞、ならびに
［１１］［６］〜［１０］いずれか記載の機能増強Ｔ細胞を有効成分として含有する、前記Ｔ細胞に感受性を示す疾患の治療剤、
に関する。

本発明により、Ｔ細胞の機能増強方法、機能が増強されたＴ細胞などが提供される。このＴ細胞は、がんに対する免疫応答を増強し、有効ながん免疫療法、あるいは感染疾患又は自己免疫疾患の治療又は予防に有用である。

図１は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞のＰＤ−Ｌ１の発現を解析した図である。図２は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞のＰＤ−Ｌ１の発現を解析した図である。図３は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞のＰＤ−Ｌ２の発現を解析した図である。図４は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞のインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）濃度を示す図である。図５は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞のＩＦＮ−γ濃度を示す図である。図６は、ＬＣＬのＰＤ−Ｌ１の発現を解析した図である。図７は、ＬＣＬのＰＤ−Ｌ２の発現を解析した図である。図８は、ＣＤ８陽性テトラマー陽性Ｔ細胞の割合を示す図である。

本明細書において「Ｔ細胞の機能の増強」とは、Ｔ細胞のエフェクター機能が向上することを意味する。Ｔ細胞の機能の増強には、本発明を限定するものではないが、Ｔ細胞の増殖率の向上、サイトカイン産生量の増加、又は細胞傷害性の向上が含まれる。更に、Ｔ細胞の機能の増強には、アネルギー（不応答性）状態、休止状態などの抑制状態にあるＴ細胞のトレランスの解除及び抑制、すなわち、Ｔ細胞を抑制状態から外部の刺激に対して応答する状態へ移行させることが包含される。

本発明において「アネルギー」は、刺激、例えば活性化受容体又はサイトカインによる刺激に対する免疫細胞の不応性を包含する。アネルギーは例えば、免疫抑制剤への暴露又は高用量の抗原への暴露に起因して起こり得る。このようなアネルギーは、一般に抗原特異的であり、寛容化している抗原への暴露が終わった後にも存続する。例えば、Ｔ細胞におけるアネルギーはサイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ）−２を産生しないことにより特徴づけられる。Ｔ細胞アネルギーは、Ｔ細胞が抗原に暴露する際に、第二シグナル（共刺激シグナル）の不存在下で第一シグナル（ＴＣＲ又はＣＤ−３を介するシグナル）を受容する場合に起こる。

本明細書において「ＰＤ−Ｌ１」とは、活性化した単球又は樹状細胞などのいわゆる抗原提示細胞に発現している共刺激分子であるＰＤ−１のリガンド１を意味し、Ｂ７−Ｈ１とも呼ばれる。ヒトＰＤ−Ｌ１の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ２３３５１６、マウスＰＤ−Ｌ１の塩基配列はＮＭ＿０２１８９３で示される（Ｆｒｅｅｍａｎら（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１０２７）。

本明細書において「ＰＤ−Ｌ２」とは、前記ＰＤ−１のリガンド２を意味し、Ｂ７−ＤＣとも呼ばれる。ヒトＰＤ−Ｌ２の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿０２５２３９、マウスＰＤ−Ｌ２の塩基配列はＮＭ＿０２１８９６で示される（ＮａｔｕｒｅＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００１年，第２巻，第３号，ｐ．２６１〜２６７）。

本明細書において「Ｔ細胞」とは、Ｔリンパ球とも呼ばれ、免疫応答に関与するリンパ球のうち胸腺に由来する細胞を意味する。Ｔ細胞にはＣＤ８陽性Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞：ＣＴＬ）、ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）、サプレッサーＴ細胞、制御性Ｔ細胞などの調節性Ｔ細胞、エフェクター細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、α鎖とβ鎖のＴＣＲを発現するαβＴ細胞、又はγ鎖とδ鎖のＴＣＲを発現するγδＴ細胞のいずれもが含まれる。前記Ｔ細胞は、Ｔ細胞への分化が方向づけられたＴ細胞の前駆細胞を包含する。「Ｔ細胞を含有する細胞集団」としては、血液（末梢血、臍帯血など）、骨髄液などの体液の他、これらより採取、単離、精製、誘導された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、血球系細胞、造血幹細胞、臍帯血単核球などを含む細胞集団が例示される。また、Ｔ細胞を含有する血球系細胞由来の種々の細胞集団を本発明に使用できる。これらの細胞はＩＬ−２などのサイトカインにより生体内（イン・ビボ）又は生体外（エクス・ビボ）で活性化されていても良い。これらの細胞は生体から採取されたもの、あるいは生体外での培養を経て得られたもの、例えば本発明の方法により得られたＴ細胞集団をそのままもしくは凍結保存したもののいずれも使用することができる。

本明細書中において「がん」とは悪性腫瘍を意味し、自律的増殖を示し、その結果、制御不能な細胞増殖を特徴とする、異常増殖の表現型又は異常な細胞状態を示す細胞をいう。「腫瘍細胞」は、「悪性腫瘍細胞」又は「良性腫瘍細胞」を含み、「新生物由来の細胞」ともいう。

本明細書において「発現」とは、遺伝子、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド等の核酸からの転写によるｍＲＮＡの生成、又はｍＲＮＡからの転写によるタンパク質、ポリペプチドの生成を意味する。「発現の抑制」とは、抑制しない場合に比べて、転写物又は翻訳物の量が有意に減少することをいう。本明細書における発現の抑制とは、例えば、転写物又は翻訳物の量が３０％以上、好適には５０％以上、より好適には７０％以上、更に好適には９０％以上減少することを示す。

（１）本発明のＴ細胞の機能増強方法及び機能増強Ｔ細胞
本発明のＴ細胞の機能増強方法は、Ｔ細胞のＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２の発現を抑制する工程を含むことを特徴とする方法である。また、本発明の機能増強Ｔ細胞は、本発明のＴ細胞の機能増強方法により得られる細胞である。本発明のＴ細胞の機能増強方法により、Ｔ細胞の増殖率の向上、サイトカイン産生量の増加又は細胞傷害性の向上を含むＴ細胞のエフェクター機能が向上する。更に、アネルギー状態、休止状態などのＴ細胞の抑制状態を解除又は抑制し、外部の刺激に対するＴ細胞の感受性を向上させる。こうして得られる本発明の機能増強Ｔ細胞は、がん、感染疾患又は自己免疫疾患の治療又は予防に有用である。

本発明の方法において、Ｔ細胞のＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２の発現を抑制する工程は、エクス・ビボ又はイン・ビボで実施することができる。

前記工程をエクス・ビボで実施する本発明の方法は、（ａ）Ｔ細胞又はＴ細胞を含む細胞集団を準備する工程、（ｂ）工程（ａ）で得られたＴ細胞のＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２の発現を抑制して機能増強Ｔ細胞を調製する工程を含む。当該方法は、養子免疫療法をはじめとする細胞免疫療法に適用することができ、有用である。工程（ａ）は、生体からＴ細胞又はＴ細胞を含有する細胞集団を分離する工程、又は株化されたＴ細胞又はＴ細胞を含有する細胞集団を準備する工程であってもよい。更に本発明の方法は、細胞集団からＴ細胞を含有する細胞集団を分離して亜細胞集団を調製する工程及び／又は細胞集団を培養、刺激する工程を含んでいてもよい。これらの工程は、工程（ａ）及び工程（ｂ）の前、後、同時の任意の段階で実施することができる。Ｔ細胞のＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２の発現を抑制する工程をエクス・ビボで実施する本発明の方法では、当該方法が適用される細胞の量や種類を適切な手段、例えば亜細胞集団の調製、細胞集団の培養又は刺激を通じてコントロールすることができる。したがって、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２の発現を抑制する物質又はシグナル伝達阻害する物質を生体に投与する場合に懸念される自己免疫などの有害事象を低減させることができ、極めて有用である。

Ｔ細胞を含有する細胞集団ならびに亜細胞集団を分離する工程は、例えば密度勾配遠心分離による単核球画分の分取やＴ細胞の表面マーカーを指標とした分離手段によって実施することができる。前記の表面マーカーとしては、ＣＤ３、ＣＤ８及びＣＤ４が例示でき、これらの表面マーカーに応じた分離方法が当技術分野において知られている。例えば抗ＣＤ８抗体を固定化したビーズ又は培養容器などの担体とＴ細胞を含有する細胞集団とを混合し、前記担体に結合したＣＤ８陽性Ｔ細胞を回収することにより実施される。抗ＣＤ８抗体が固定化されたビーズとしては、例えば、ＣＤ８ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社製）、ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−４５０ＣＤ８（インビトロジェン社製）、Ｅｌｉｇｉｘａｎｔｉ−ＣＤ８ｍＡｂｃｏａｔｅｄｎｉｃｋｅｌｐａｒｔｉｃｌｅｓ（バイオトランスプラント社製）などが好適に使用できる。ＣＤ４を指標として実施する場合も同様であり、例えば、ＣＤ４ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社製）、ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−４５０ＣＤ４（インビトロジェン社製）などが好適に使用できる。

また、Ｔ細胞を含有する細胞集団ならびに亜細胞集団を培養する工程は、細胞集団に応じて適切な公知の培養条件を選択し、実施することができる。また、細胞集団を刺激する工程は、培地に公知のタンパク質や化学成分等を加えて培養を行えばよい。例えば、サイトカイン類、ケモカイン又はその他の成分を培地に加えても良い。本明細書において、サイトカインとは、Ｔ細胞に作用しうるものであれば特に限定はないが、例えばＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−β、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１２、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−２７などが例示される。細胞性免疫を増強させる観点からは、特に好適には、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−１２が使用され、移入されたＴ細胞のイン・ビボでの生存を向上させる観点からは、好適にはＩＬ−７、ＩＬ−１５又はＩＬ−２１が使用される。また、ケモカインとは、Ｔ細胞に作用し遊走活性を示すものであれば特に限定はないが、例えばＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ２１、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＣＣＬ１９、ＣＸＣＬ１２、ＩＰ−１０又はＭＩＧが例示される。また、Ｔ細胞表面に存在する分子、例えばＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４４等に対するリガンド及び／又は前記分子に対する抗体を共存させることで細胞集団の刺激を実施することが可能である。更に、がん抗原由来のペプチドのような標的のペプチドを細胞表面に提示する抗原提示細胞（樹状細胞）などの他のリンパ球と接触させて、細胞集団を刺激することができる。

Ｔ細胞のＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２の発現を抑制する工程をイン・ビボで実施する場合、後述するこれらの発現を特異的に抑制させる手段を生体に投与することにより当該工程が実施される。この際、適当なドラッグデリバリーシステム（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルなど）を利用することができる。また、例えばＴ細胞表面マーカーを指標にしたデリバリーシステムを利用して、Ｔ細胞のＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２の発現を特異的に抑制することができる。

Ｔ細胞のＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２の発現を抑制する手段は、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２に対するｓｉＲＮＡ、アンチセンスヌクレオチド、リボザイムなどの核酸の利用が含まれる。

本発明におけるｓｉＲＮＡの利用は、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２の発現を選択的に抑制することを目的として、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２をコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列に相同な配列と相補的な配列とを有する二本鎖ＲＮＡ分子を利用したＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に基づく。ここで、「ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２をコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列に相同な配列と相補的な配列とを有する」とは、各配列が前記のｍＲＮＡの塩基配列に完全に相同もしくは相補的であることを指すのみではなく、所望の機能が発揮される範囲で実質的に相同もしくは相補的であることを包含する。前記二本鎖ＲＮＡ分子はｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ）と呼ばれる。ｓｉＲＮＡは、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２をコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡの１つの領域に対し相同／相補的な１種類のｓｉＲＮＡであっても良く、異なる領域に対し相同／相補的な複数のＲＮＡ分子を含むｓｉＲＮＡであっても良い。

本発明に使用されるｓｉＲＮＡの鎖長としては、哺乳動物細胞におけるインターフェロン応答抑制の観点から、例えばｓｉＲＮＡを構成する二本鎖の一方が１３〜２９塩基の鎖長を有するもの、好ましくは１５〜２５塩基対の鎖長を有するもの、更に好ましくは、２０〜２５塩基対の鎖長を有するものが例示される。また、前記鎖長の塩基配列の全てがＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２のｍＲＮＡの塩基配列に由来するものであっても良く、その一部が前記の塩基配列に由来するものであっても良い。更に、本発明に使用されるｓｉＲＮＡは、哺乳動物細胞におけるＲＮＡ干渉の有効性の観点から、例えば、３’末端側に２〜４塩基突出した一本鎖領域を有する二本鎖ＲＮＡの形状のもの、更に好ましくは３’末端側に２塩基突出した一本鎖領域を有する二本鎖ＲＮＡの形状のものであっても良い。前記の突出した一本鎖領域として、２〜４塩基の連続するデオキシチミジン残基（ＴＴ、ＴＴＴ又はＴＴＴＴ）が例示される。

本発明に使用されるｓｉＲＮＡは、主にリボヌクレオチドによって構成されるが、その一部にリボヌクレオチド以外のヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドの誘導体、リボヌクレオチドの誘導体等を含んでいても良い。前記のｓｉＲＮＡは、特に限定されないが、公知の化学合成法により合成することができる。また、適切な鋳型核酸を使用して酵素的に（例えばＲＮＡポリメラーゼを用いて）調製しても良い。本発明に使用されるｓｉＲＮＡは、分子内で二本鎖を形成し得る一本鎖ＲＮＡの形態であっても良く、ｓｉＲＮＡ部分をステムとし、任意の配列をループとしたステム−ループ構造（ショートヘアピン構造：ｓｈ構造）の一本鎖ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が例示される。前記の任意の配列としては１〜３０ヌクレオチドの配列が例示されるが、好ましくは１〜２５ヌクレオチド、更に好ましくは５〜２２ヌクレオチドの配列が使用される。

ｓｉＲＮＡの配列は、発現の抑制が望まれる遺伝子配列を基に、適宜設計することができる。多くのｓｉＲＮＡの設計アルゴリズムが報告されており（例えば、国際公開第２００４／０４５５５４３号パンフレット、国際公開第２００４／０４８５６６号パンフレットを参照のこと）、市販のソフトウエアを使用することもできる。また、発現の抑制が望まれる遺伝子配列情報から、ｓｉＲＮＡを設計し、ｓｉＲＮＡを合成して提供する会社が多数存在する。したがって、当業者は発現を抑制する遺伝子配列を基に、容易にｓｉＲＮＡを入手することが可能である。本発明に使用するｓｉＲＮＡは、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２の発現を選択的に抑制するｓｉＲＮＡであれば、いずれも使用できる。特に限定はされないが、例えば、ＰＤ−Ｌ１に対して配列番号１又は配列番号９の塩基配列を含むｓｉＲＮＡが使用でき、ＰＤ−Ｌ２に対して配列番号２又は配列番号１１の塩基配列を含むｓｉＲＮＡが使用できる。

本発明において、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２の発現の抑制にアンチセンスヌクレオチドを使用することができる。アンチセンスヌクレオチドは、例えばＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２のｍＲＮＡ分子の翻訳に直接干渉することによって、ｍＲＮＡのＲＮＡ分解酵素Ｈによる分解によって、ｍＲＮＡの５’キャッピングに干渉することによって、５’キャップのマスキングによって、ｍＲＮＡに対する翻訳因子の結合を防止することによって、又はｍＲＮＡのポリアデニル化を阻害することによって、タンパク質発現を抑制するために使用する。タンパク質発現の抑制は、アンチセンスヌクレオチドとＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２のｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションによって起こる。ｍＲＮＡの安定性を低下させる又は分解するために、アンチセンスヌクレオチドの標的として、前記ｍＲＮＡ上の特異的標的化部位が選択される。１つ又はそれ以上の標的部位を同定したら、当該標的部位に十分相補的な（すなわち生理学的条件下で十分よく、かつ十分な特異性でハイブリダイズする）塩基配列のヌクレオチドを設計する。

本発明の方法において使用されるアンチセンスヌクレオチドは、例えば８〜１００塩基の鎖長、好ましくは１０〜８０塩基、より好ましくは１４〜３５塩基のヌクレオチドが例示される。

本発明においては、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２の発現抑制に使用されるｓｉＲＮＡ、アンチセンスヌクレオチドなどの核酸を直接細胞に導入しても良く、細胞内で前記ｓｉＲＮＡ又は前記アンチセンスヌクレオチドが転写されるよう設計された核酸構築物を細胞に導入しても良い。直接細胞に導入する場合、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（Ｍｉｒｕｓ社製）、ＨｕｍａｎＴＣｅｌｌＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＫｉｔ（Ａｍａｘａ社）等の核酸導入用試薬が好適に使用できる。一方、前記ＲＮＡ分子が転写される核酸構築物を使用する場合、特に本発明を限定するものではないが、Ｔ細胞内で機能を発揮しうるプロモーターの下流に、前記ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスヌクレオチドをコードする核酸の転写が起こりうる状態で、すなわち機能的に接続されているものが使用できる。また、効率の良い遺伝子の転写を達成するために、プロモーター又は転写開始部位と協同する他の調節配列、例えば、エンハンサー配列又はターミネーター配列が核酸構築物内に存在していても良い。また、相同組換えにより導入対象のＴ細胞の染色体へ挿入することを目的として、例えば、該染色体における遺伝子の所望の標的挿入部位の両側にある塩基配列に各々相同性を有する塩基配列からなるフランキング配列の間に前記の遺伝子を配置させても良い。

前記核酸構築物に使用されるプロモーターとしては、哺乳動物細胞内で機能しうるものであれば特に限定はなく、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、人為的に調節可能なプロモーターなどが挙げられる。前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーターなどが挙げられる。また、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ系プロモーターとしては、ｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒストンＨ１プロモーターなどが挙げられる。前記人為的にテトラサイクリンで調節可能なプロモーターとしては、テトラサイクリンにより調節可能なプロモーターが例示され、テトラサイクリン調節型Ｕ６プロモーター、ＴＲプロモーターなどが挙げられる。また、上記プロモーターをＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムと組み合わせることにより、より厳密に転写を制御することもできる。

ｓｉＲＮＡを転写するために使用される核酸構築物は、目的遺伝子の機能を抑制しうる二本鎖ＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖が下記のようなシステムで転写されるように構築することができる：（Ａ）異なる２つのプロモーターの下流にセンスＲＮＡをコードする核酸とアンチセンスＲＮＡをコードする核酸とをそれぞれ接続し、この２つの転写ユニットを順方向に配置した、別個にセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとを転写するタンデムタイプ、（Ｂ）１つのプロモーターの下流にセンスＲＮＡをコードする核酸とアンチセンスＲＮＡをコードする核酸とをそれぞれ順方向に配置した、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとが直接又はループで連結されたステム−ループタイプ（又はショートヘアピンタイプ）のＲＮＡを転写するタイプ、あるいは、（Ｃ）センス鎖及びアンチセンス鎖を（それぞれ両ストランド）でコードする核酸の両端側のそれぞれにプロモーターを配置して、別個のプロモーターで両ＲＮＡ鎖を転写する対向タイプ。本発明では、使用条件、例えば、細胞の種類、センス配列又はアンチセンス配列の種類などに応じ、タンデムタイプ、ステム−ループタイプ又は対向タイプを使い分けることができる。

本発明で使用する核酸構築物は、より安定的に細胞内で効果を発揮しうるように、適切なベクター、例えばプラスミドベクター又はウイルスベクターに組み込まれていても良い。更に、細胞の染色体ＤＮＡ上に本発明の核酸構築物を組み込んでも良い。前記プラスミドベクターとしては、特に限定されないが、例えばＲＮＡ干渉用の核酸を発現させるｐｉＧＥＮＥｔＲＮＡプラスミド（商品名、ｉＧＥＮＥ社製）、ｓｉＬｅｎｔＧｅｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＳＥＣＨｙｇｒｏＶｅｃｔｏｒ（Ａｍｂｉｏｎ社製）などが例示される。プラスミドベクターを細胞に導入するには、リポソーム、リガンド−ポリリジンなどの担体を使用する方法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などを使用することができる。

前記ウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクター、シュードタイプベクターを包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクターなどが使用される。特に好適には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレンチウイルスベクターが使用される。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。また、遺伝子導入の際にレトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）などの遺伝子導入効率を向上させる物質を用いることもできる。市販されているアデノウイルスベクターの例としてＫｎｏｃｋｏｕｔＡｄｅｎｏｖｉｒａｌＲＮＡｉＳｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）が、市販されているレトロウイルスベクターの例としてｐＳＩＮｓｉベクター（タカラバイオ社製）又はｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱＶｅｃｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）が、それぞれ例示される。ウイルスベクターの場合には当該ウイルスの細胞への感染能を利用して、目的の細胞に導入することができる。

本発明の方法において、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２の発現を抑制する手段は、Ｔ細胞に対して実施される。すなわち、前記工程（ｂ）において、例えばヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、α鎖とβ鎖のＴＣＲを発現するαβＴ細胞又はγ鎖とδ鎖のＴＣＲを発現するγδＴ細胞、あるいはこれらの細胞を含む細胞集団、血液（末梢血、臍帯血など）又は骨髄液が使用できる。これらのＴ細胞は、哺乳動物由来であってもよく、ヒト又は非ヒト哺乳動物由来のいずれでもあってもよい。

ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２の発現抑制は、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２タンパク質の定量又はＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２遺伝子から転写されるＲＮＡ量を定量することにより確認することができる。

本発明の方法におけるＴ細胞の機能増強は、サイトカインアッセイ、抗原特異的細胞アッセイ（テトラマーアッセイ）、増殖アッセイ、細胞溶解性細胞アッセイ、あるいは組換え腫瘍関連抗原又は免疫原性フラグメント又は抗原由来のペプチドを用いたイン・ビボ遅延型過敏性試験を用いて、各工程の前後の複数の時点で評価され得る。免疫応答の増加を測定するためのさらなる方法としては、遅延型過敏性試験、ペプチド主要組織適合遺伝子複合体テトラマーを用いたフローサイトメトリー、リンパ球増殖アッセイ、酵素結合免疫吸着検定法、酵素結合免疫スポット検定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔａｓｓａｙ）、サイトカインフローサイトメトリー、直接細胞毒性アッセイ、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応によるサイトカインｍＲＮＡの測定、あるいは限界希釈法のような、Ｔ細胞応答を測定するのに現在用いられているアッセイが挙げられる。

本発明の機能増強Ｔ細胞は、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２の発現が抑制されていない対照のＴ細胞に比べて、Ｔ細胞の機能が増強されている。本発明の機能増強Ｔ細胞は、例えば、ＩＦＮ−γの産生量が対照のＴ細胞に比べて増加する。本発明のＴ細胞は対照のＴ細胞に比較してＩＦＮ−γ産生量が１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上増加している。

本発明の一つの態様として、前記のＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２の発現の抑制に加えて、更なるＴ細胞の機能増強を行う方法が挙げられる。例えば、Ｔ細胞に所望の抗原を認識するＴＣＲをコードする遺伝子を導入することにより、前記抗原に対する特異性が付与され、かつエフェクター機能が向上したＴ細胞を得ることができる。前記の抗原には特に限定はなく、例えば腫瘍抗原や微生物、ウイルス由来の抗原が例示される。種々の抗原に対するＴＣＲについてそのアミノ酸配列や当該配列をコードする遺伝子の塩基配列が知られており、これらの情報をもとにＴＣＲ発現のためのベクターを構築してＴ細胞に導入することにより、抗原特異的に作用を発揮するＴ細胞を作製することができる。この際、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２の発現を抑制するための核酸構築物を同時にＴ細胞に導入する、又は当該構築物をＴＣＲ発現のためのベクターに組み込むことにより、抗原特異的なＴ細胞のエフェクター機能を向上させることができる。

α鎖とβ鎖からなるＴＣＲを人為的にＴ細胞で発現させる場合には、Ｔ細胞自身が有している内在性ＴＣＲ遺伝子由来のα鎖、β鎖との間でミスペアリング等が所望の抗原特異性を付与するうえで障害となりうる。例えば国際公開第２００８／１５３０２９号パンフレットに記載された、導入ＴＣＲ遺伝子のコドン変換やｓｉＲＮＡを利用した内在性ＴＣＲ遺伝子のノックダウンを行うことにより、高い抗原性特異性を獲得したＴ細胞を作製することができる。本発明のＴ細胞の機能増強方法はこのようなＴ細胞の作製にも利用することができる。

（２）本発明の機能増強Ｔ細胞を使用する治療方法又は予防方法
本発明の治療方法又は予防方法は、前記（１）の本発明の機能増強方法により調製されたＴ細胞を生体に投与することを特徴とする。すなわち本発明の治療方法又は予防方法は、（ｃ）工程（ｂ）で得られた機能増強Ｔ細胞を生体に投与する工程、を包含する。本発明の機能増強Ｔ細胞が投与される疾患としては、当該Ｔ細胞に感受性を示す疾患であればよく、特に限定はないが、例えば、がん（白血病、固形腫瘍など）、肝炎、インフルエンザ、ＨＩＶなどのウイルス、細菌、真菌が原因となる感染性疾患、例えば結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、深在性真菌症などが例示される。また、本発明の細胞は、骨髄移植又は放射線照射後の感染症予防、あるいは再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注などにも利用できる。又、制御性Ｔ細胞の機能を向上させ自己免疫疾患の予防又は治療に利用できる。

本発明の方法において、機能増強Ｔ細胞は、対象の皮内、筋肉内、皮下、腹腔内、動脈内、静脈内（留置カテーテルによる方法を含む）、腫瘍内又は輸入リンパ管内に投与され得る。

本発明の治療方法又は予防方法において、投与する機能増強Ｔ細胞は、生体にとって自家の細胞であってもよく、他家由来の細胞であってもよい。

本発明の実施において誘導される免疫応答は、抗原特異的細胞アッセイ、増殖アッセイ、細胞溶解性細胞アッセイ、あるいは組換え腫瘍関連抗原又は免疫原性フラグメント又は抗原由来のペプチドを用いたイン・ビボ遅延型過敏性試験を用いて、本発明の機能増強Ｔ細胞の最初の投与前に、又は処置の開始後の種々の時点で、生体において評価され得る。免疫応答の増加を測定するためのさらなる方法としては、遅延型過敏性試験、ペプチド主要組織適合遺伝子複合体テトラマーを用いたフローサイトメトリー、リンパ球増殖アッセイ、酵素結合免疫吸着検定法、酵素結合免疫スポット検定法、サイトカインフローサイトメトリー、直接細胞毒性アッセイ、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応によるサイトカインｍＲＮＡの測定、又は限界希釈法のような、Ｔ細胞応答を測定するのに現在用いられているアッセイが挙げられる。更に、生体が有する腫瘍の重量、径、悪性度、対象の感染ウイルス量、感染菌量、対象の生存率又は生存期間により、免疫応答を評価することができる。

本発明の方法において、生体に投与する機能増強Ｔ細胞の量に特に限定はないが、例えば、成人一日あたり、好適には１×１０^６〜１×１０^１２ｃｅｌｌｓ／日、より好ましくは、１×１０^７〜５×１０^１１ｃｅｌｌｓ／日、更に好ましくは１×１０^８〜２×１０^１１ｃｅｌｌｓ／日が例示される。
（３）本発明の機能増強Ｔ細胞を含有する疾患の治療剤
前記（１）の本発明の機能増強方法により調製された機能増強Ｔ細胞、ならびに当該Ｔ細胞を有効成分として含有する組成物は、当該Ｔ細胞に感受性を有する疾患、例えば前記のがん、肝炎又は感染性疾患の治療剤として有用である。
本発明の治療剤は製薬分野で公知の方法に従い、例えば、本発明の方法により調製されたＴ細胞を有効成分として、例えば公知の非経口投与に適した有機又は無機の担体、賦形剤、安定剤等と混合することにより調製できる。また、その使用は前記（２）の本発明の治療方法に準じればよい。

以下に、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。

実施例１ＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現の確認
国際公開第２００７／０３２２５５号パンフレットに従い、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＭＡＧＥ−Ａ４_{１４３−１５１}特異的な細胞傷害性ＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン２−２８（ＭｉｙａｈａｒａＹ他１３名クリニカルキャンサーリサーチ（Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．）、第１１巻、第５５８１−５５８９頁（２００５）以下、ＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン２−２８と呼ぶ）とＭＡＧＥ−Ａ４_{１４３−１５１}ペプチドとを調製した。ＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン２−２８を、８０ＧｌｙのＸ線を照射した自己リンパ芽球様細胞株（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄｃｅｌｌｌｉｎｅ：ＬＣＬ）にＭＡＧＥ−Ａ４_{１４３−１５１}ペプチドをパルスしたものを、３７℃で共培養し、０日、１日後、２日後及び３日後の細胞表面のＰＤ−Ｌ１を、抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にて染色を行いフローサイトメーターで解析した。図１にフローサイトメーターによる解析結果を示す。培養１日後においてＰＤ−Ｌ１の発現は最も高かった。

実施例２ＲＮＡ干渉によるＣＤ８陽性Ｔ細胞のＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２発現抑制
配列番号１記載の配列を有するＰＤ−Ｌ１に特異的なｓｉＲＮＡ、配列番号２記載の配列を有するＰＤ−Ｌ２に特異的なｓｉＲＮＡ、もしくはネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、ＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン２−２８にエレクトロポレーションにより導入した。

ＰＤ−Ｌ１に対するｓｉＲＮＡを導入した細胞は、３日間培養した後、８０ＧｌｙのＸ線を照射した自己ＬＣＬにＭＡＧＥ−Ａ４_{１４３−１５１}ペプチドをパルスしたものと、３７℃で共培養した。翌日、抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体にて染色し、細胞表面のＰＤ−Ｌ１の発現をフローサイトメーターで解析した。

ＰＤ−Ｌ２に対するｓｉＲＮＡを導入した細胞は、導入２日後及び３日後に、抗ヒトＰＤ−Ｌ２抗体（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にて細胞内のＰＤ−Ｌ２の発現をフローサイトメーターで解析した。

図２にＰＤ−Ｌ１の解析結果を、図３にＰＤ−Ｌ２の解析結果をそれぞれ示す。ｓｉＲＮＡを導入しなかった細胞（無処理）及びネガティブコントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞（ｓｉｃｏｎｔｒｏｌ）ではＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２の発現抑制は見られなかった。ＰＤ−Ｌ１特異的なｓｉＲＮＡを導入した細胞（ｓｉＰＤ−Ｌ１）、ＰＤ−Ｌ２特異的なｓｉＲＮＡを導入した細胞（ｓｉＰＤ−Ｌ２）において、それぞれＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２の発現抑制が見られた。

実施例３ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２発現ＣＤ８陽性Ｔ細胞の、ＲＮＡ干渉によるＩＦＮ−γの産生促進
ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ、配列番号３記載の配列を有するＰＤ−１に特異的なｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、配列番号１記載の配列を有するＰＤ−Ｌ１に特異的なｓｉＲＮＡ、又は配列番号２記載の配列を有するＰＤ−Ｌ２に特異的なｓｉＲＮＡを、ＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン２−２８にエレクトロポレーションにより導入した。３日間培養した後、この細胞を自己ＬＣＬにＭＡＧＥ−Ａ４_{１４３−１５１}ペプチドをパルスしたものと、４：１もしくは２：１の割合で混合して３７℃で共培養し、翌日、各培養上清中のＩＦＮ−γ濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。

図４に各細胞上清中のＩＦＮ−γ濃度を示す。ＰＤ−１に特異的なｓｉＲＮＡを導入した細胞（ｓｉＰＤ−１）は、どちらの混合比で培養したものもネガティブコントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞と比較してＩＦＮ−γ濃度に変化は見られなかった。ＰＤ−Ｌ１に特異的なｓｉＲＮＡ及びＰＤ−Ｌ２に特異的なｓｉＲＮＡを導入した細胞は、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ及びＰＤ−１に特異的なｓｉＲＮＡを導入した細胞と比較して、それぞれ有意にＩＦＮ−γ濃度の上昇が見られた。

実施例４ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２発現ＣＤ４陽性Ｔ細胞の、ＲＮＡ干渉によるＩＦＮ−γの発現促進
ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ、配列番号３記載の配列を有するＰＤ−１に特異的なｓｉＲＮＡ、配列番号１記載の配列を有するＰＤ−Ｌ１に特異的なｓｉＲＮＡ、又は配列番号２記載の配列を有するＰＤ−Ｌ１に特異的なｓｉＲＮＡを、ＭＡＧＥ−Ａ４_{４６−６６}特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞クローン５にエレクトロポレーションにより導入し、３日間培養した。この細胞を自己ＬＣＬにＭＡＧＥ−Ａ４_{４６−６６}ペプチドをパルスしたものと、２：１で混合して３７℃で培養し、翌日、各培養上清中のＩＦＮ−γ濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。

図５に各細胞上清中のＩＦＮ−γ濃度を示す。ネガティブコントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞及びＰＤ−１に特異的なｓｉＲＮＡを導入した細胞では、ＩＦＮ−γの発現は見られなかった。ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２に特異的なｓｉＲＮＡを導入した細胞では、有意にＩＦＮ−γの発現が見られた。

実施例５ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２発現抑制用ｓｉＲＮＡの選択
ＬＣＬに配列番号８、９記載の配列を有するＰＤ−Ｌ１に特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｈ８３１、ｓｈ８３２）、もしくは配列番号１０、１１記載の配列を有するＰＤ−Ｌ２に特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｈ８３３、ｓｈ８３４）（いずれもタカラバイオ社製）、もしくは実施例２で使用したネガティブコントロールｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションにより導入し、３７℃で２日培養したのち、それぞれの細胞からトータルＲＮＡを抽出して、ＱｕａｎＴｉｔｅｃｔＳＹＢＲＰＣＲＫｉｔ（キアゲン社製）を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲでＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２の発現を測定し、発現抑制力の強いｓｉＲＮＡを選択した。
配列番号１２、１３にＰＤ−Ｌ１の発現測定に使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用プライマー配列を、配列番号１４、１５にＰＤ−Ｌ２の発現測定に使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用プライマー配列を、配列番号１６、１７に発現測定の対象としたヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素）のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用プライマー配列をそれぞれ示す。
図６にＰＤ−Ｌ１のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を、図７にＰＤ−Ｌ２のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。図中、縦軸はヒトＧＡＰＤＨの発現に対するＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２の発現比率を示す。この結果より、ＰＤ−Ｌ１に特異的なｓｉＲＮＡとして配列番号９に示すｓｈ８３２、ＰＤ−Ｌ２に特異的なｓｉＲＮＡとして配列番号１１に示すｓｈ８３４を選択した。

実施例６コドン変換型ＴＣＲ発現レトロウイルスベクターの作製
国際公開第２００８／１５３０２９号パンフレットに従い、ｐＭＳ−Ｍａ２及びｐＭＳ−Ｐｂ２を作製した。これらのベクターはＭＳＣＶ（ＭｕｒｉｎｅＳｔｅｍＣｅｌｌＶｉｒｕｓ）をベースとするレトロウイルスベクターシステムを含む。更に、それぞれ腫瘍抗原ＭＡＧＥ−Ａ４を認識するＴＣＲのα鎖及びβ鎖をコードする遺伝子を含み、これらの遺伝子は後述するＴＣＲに対するｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉により発現が抑制されないようにコドンを変換している（以下、コドンを変換したものをコドン変換型と呼ぶ）。

実施例７コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ発現レトロウイルスベクターの作製
実施例６で作製したｐＭＳ−Ｍａ２から、ＭｌｕＩ及びＢｇｌＩＩによりコドン変換型ＴＣＲα遺伝子を切り出し、ＴＣＲα−ＭｌｕＩ／ＢｇｌＩＩを調製した。配列番号４に示すｓｉＲＮＡクラスター、ＰＤＬ１−ＰＤＬ２−ＴＣＲα−ＴＣＲβ人工合成遺伝子をＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、ＴＣＲα−ＭｌｕＩ／ＢｇｌＩＩと共に、ｐＭＳ−Ｐｂ２のＭｌｕＩ−ＮｏｔＩサイトにクローニングすることにより、ＭＳ−ａＰｂ１−ｓｉＰＤＬ＿１／２＿ｓｉＴＣＲベクター（ベクター１）を調製した。ベクター１は、コドン変換型ＴＣＲを発現し、配列番号９、１１、１８及び１９に示すＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＣＲα及びＴＣＲβに対するｓｉＲＮＡを発現することができる。このうち、ＴＣＲα及びＴＣＲβに対するｓｉＲＮＡは、内在性の野生型ＴＣＲの発現を抑制し、コドン変換型ＴＣＲの発現は抑制しない。

更に、配列番号５に示すｓｉＲＮＡクラスター、ＰＤＬ１−ＰＤＬ２人工合成遺伝子、配列番号６に示すｓｉＲＮＡｃｌｕｓｔｅｒＰＤＬ１人工合成遺伝子、配列番号７に示すｓｉＲＮＡｃｌｕｓｔｅｒＰＤＬ２人工合成遺伝子を調製し、ベクター１と同様にして、ＭＳ−ａＰｂ１−ｓｉＰＤＬ＿１／２ベクター（ベクター２）、ＭＳ−ａＰｂ１−ｓｉＰＤＬ＿１ベクター（ベクター３）、ＭＳ−ａＰｂ１−ｓｉＰＤＬ＿２ベクター（ベクター４）を調製した。各ベクターが発現する遺伝子の概略を表１に示す。

実施例８コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ発現レトロウイルス溶液の作製
実施例７で調製したベクター１〜４により大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、プラスミドＤＮＡをＱＩＡＧＥＮＰｌａｓｍｉｄＭｉｄｉＫｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、トランスフェクション用ＤＮＡとして供した。

ＲｅｔｏｒｏｖｉｒｕｓＰａｃｋａｇｉｎｇＫｉｔＥｃｏ（タカラバイオ社製）を用いて製品プロトコールに従い、調製した各トランスフェクション用ＤＮＡを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、各エコトロピックウイルス上清液を獲得した。この上清液を０．４５μｍフィルター（ＭｉｌｅｘＨＶ、ミリポア社製）にてろ過し、ポリブレンを使用する方法［Ｋａｗａｉら、モレキュラーセルバイオロジー（ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、第４巻、第１１７２頁、（１９８４）］によりＰＧ１３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１０６８６）細胞に感染させ、得られた細胞の培養上清を回収し、０．４５μｍフィルターによりろ過し、レトロウイルス溶液を調製した。

実施例９ヒト末梢血単核球へのコドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ共発現レトロウイルスベクターの感染
レトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）を用いて取扱説明書に従って、ヒト末梢血より分離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に、実施例８で作製したレトロウイルス溶液を２回感染させ、コドン変換型ＴＣＲ及びｓｉＲＮＡ共発現導入末梢血単核球を作製した。２回目ウイルス感染３日後に細胞を回収し、ＦａｓｔＰｕｒｅＤＮＡＫｉｔ（タカラバイオ）によりゲノムを抽出し、ＰｒｏｖｉｒａｌＣｏｐｙＮｕｍｂｅｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎＰｒｉｍｅｒＳｅｔ（タカラバイオ社製）及びＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲＣｏｒｅＫｉｔ（タカラバイオ社製）にて各細胞ゲノム中の平均プロウイルスコピー数を算出した。ベクター１〜４を含むウイルス溶液を感染させたＰＢＭＣのプロウイルスコピー数は、それぞれ４．６ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌ、２．２ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌ、３．２ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌ、４．５ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌであった。次に、２回目のウイルス感染の５日後に細胞を回収し、ＨＬＡ−Ａ２４０２ＭＡＧＥ−Ａ４テトラマー−ＰＥ（ＭＢＬ社製）及びＨｕｍａｎＣＤ８−ＦＩＴＣＣＯＮＪＵＧＡＴＥ（ベクトン・ディッキンソン社製）により染色し、フローサイトメーターによりＣＤ８陽性であって、かつテトラマー陽性である細胞の割合を測定した。

図８にＭＡＧＥ−Ａ４テトラマー陽性細胞率を示す。横軸は、導入したレトロウイルスベクターを示し、縦軸はＭＡＧＥ−Ａ４テトラマー陽性細胞率（％）を示す。図８に示されるように、各レトロウイルスベクター導入により、ヒト末梢血単核球に遺伝子導入した抗ＭＡＧＥ−Ａ４ＴＣＲα／β複合タンパクの発現が確認された。また、レトロウイルスベクターが発現するＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２に対するｓｉＲＮＡの発現は、導入したコドン変換型ＴＣＲの発現に大きく影響を及ぼすことはなかった。更に、ＴＣＲα及びβに対するｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡによる野生型の内在性ＴＣＲ遺伝子の発現抑制効果により、コドン変換型ＴＣＲα／β複合タンパク発現率を増強した。

本発明は、Ｔ細胞の機能増強方法、機能が増強されたＴ細胞を提供する。このＴ細胞は、がんに対する免疫応答を増強し、有効ながん免疫療法、感染疾患又は自己免疫疾患の治療又は予防に利用することができる。

SEQ ID NO:1: siRNA specific for PD-L1
SEQ ID NO:2: siRNA specific for PD-L2
SEQ ID NO:3: siRNA specific for PD-1
SEQ ID NO:4:siRNA cluster PDL1-PDL2-TCR alpha-TCR beta
SEQ ID NO:5:siRNA cluster PDL1-PDL2
SEQ ID NO:6:siRNA cluster PDL1
SEQ ID NO:7:siRNA cluster PDL2
SEQ ID NO:8:siRNA for PD-L1 (sh831)
SEQ ID NO:9:siRNA for PD-L1 (sh832)
SEQ ID NO:10:siRNA for PD-L2 (sh833)
SEQ ID NO:11:siRNA for PD-L2 (sh834)
SEQ ID NO:12:real time PCR F-primer for PD-L1
SEQ ID NO:13:real time PCR R-primer for PD-L1
SEQ ID NO:14:real time PCR F-primer for PD-L2
SEQ ID NO:15:real time PCR R-primer for PD-L2
SEQ ID NO:16:real time PCR F-primer for GAPDH
SEQ ID NO:17:real time PCR R-primer for GAPDH
SEQ ID NO:18:siRNA for TCR alpha
SEQ ID NO:19:siRNA for TCR beta

Claims

ＰｒｏｇｒａｍｍｅｄＤｅａｔｈ−１Ｌｉｇａｎｄ１（ＰＤ−Ｌ１）又はＰｒｏｇｒａｍｍｅｄＤｅａｔｈ−１Ｌｉｇａｎｄ２（ＰＤ−Ｌ２）に対するｓｉＲＮＡによりＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２の発現が抑制され、さらに所望の抗原を認識するＴＣＲをコードする遺伝子を含むＴ細胞を含有する治療剤。
Ｔ細胞が細胞障害性Ｔ細胞又は調節性Ｔ細胞である請求項１記載の治療剤。
調節性Ｔ細胞がヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞又はＴｈ１７細胞である請求項２記載の治療剤。
がん、感染疾患又は自己免疫疾患の治療剤である、請求項１〜３のいずれか１項記載の治療剤。
以下の工程を含有する治療剤の調製方法。
（ａ）生体から分離されたＴ細胞を含む細胞集団を準備する工程、
（ｂ）（ａ）の細胞集団にＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２に対するｓｉＲＮＡを直接導入する工程、又は当該ｓｉＲＮＡを転写する核酸構築物を導入する工程、
（ｃ）（ａ）の細胞集団に所望の抗原を認識するＴＣＲをコードする遺伝子を導入する工程、及び
（ｄ）（ｂ）又は（ｃ）で得られた細胞集団を培養又は刺激して治療剤とする工程。
ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２に対するｓｉＲＮＡを転写する核酸構築物と、所望の抗原を認識するＴＣＲをコードする遺伝子が同じベクターにより導入される、請求項５項記載の方法。
工程（ｄ）の培養又は刺激が、所望の抗原の存在下で実施される、請求項５または６項記載の方法。
所望の抗原が抗原提示細胞に提示される、請求項７項記載の方法。