CN107428825A - 治疗及/或预防肿瘤生长、侵袭及/或转移的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种藉由抑制个体中经由自分泌环(autocrine loop)之PD‑L1的过度表现来治疗及/或预防肿瘤生长、侵袭及/或转移的方法。本发明发现，经由TGFβ1/SMAD4路径经PD‑L1调节的p21及VEGF‑C表现是癌症生长、侵袭及转移形成的原因。

Description

治疗及/或预防肿瘤生长、侵袭及/或转移的方法
相关申请案
本发明主张美国临时申请案序号62/062,202的优先权，其申请于2014年10月10日。其内容各以全文引用方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及一种治疗及/或预防个体肿瘤生长及/或转移的方法。特定言之，本发明涉及一种藉由抑制自分泌环作用机制及减弱所述个体中PD-L1的表达来治疗及/或预防肿瘤生长及/或转移的方法。
背景技术
程序化死亡-1(PD-1)为提供T细胞活化中抑制讯号的共刺激分子。相对地，PD-L1于人类肺癌、卵巢癌及结肠癌及于黑色素瘤中大量存在。自癌细胞分泌的PD-L1结合至T细胞膜上的其受体PD-1以经由阻断肿瘤免疫监控来促进肿瘤进展及转移。大量的文献指出，肿瘤部分中的CD+4及CD+8肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)数目会受到PD-L1过度表达而减少，因而促进人类癌症(包括肺癌)的肿瘤恶性及不良预后。已识别出针对PD-1、PD-L1(B7-H1)及PD-L2(B7-DC)的两种配体及所述两种配体为属于B7家族的细胞表面醣蛋白。PD-1藉由其配体连接的主要结果是抑制T细胞受体(TCR)下游讯号传递。因此，讯号经由PD-1转导通常提供抑制讯号给T细胞，从而导致T细胞增殖减慢或T细胞活化的其他降低。据认为PD-1讯号传递需要紧邻由结合至TCR的主要组织兼容性复合体(MHC)呈现的肽抗原与PD-1配体结合。PD-L1(亦称为B7同系物1(B7-H1)或CD274)为引起T细胞中抑制讯号转导的主要PD-1配体。PD-L1以低水平表达于免疫细胞诸如B细胞、树突细胞、巨噬细胞及T细胞上且在活化后上调。PD-L1亦表达于非淋巴器官诸如内皮细胞、心脏、肺、胰脏、肌肉、胶质细胞及胎盘上。于非淋巴组织中的表达显示，PD-L1可调节自反应性T及B细胞及周边组织中的骨髓细胞的功能或可调节目标器官中的发炎性反应。PD-L1表达主要是由1型及2型干扰素调节，这些干扰素为内皮及上皮细胞上PD-L1的主要调节剂。
Konishi等人首先报告在PD-L1-阳性肺部肿瘤中观察到肿瘤浸润淋巴细胞比在PD-L1-阴性肺部肿瘤中更少，表明自肺部肿瘤表达的PD-L1可促进非小细胞肺癌(NSCLC)中抗肿瘤免疫反应的负调节(Konishi J、Yamazaki K、Azuma M等人，B7-1expression onnon-small cell lung cancer cells and its relationship with tumor infiltratinglymphocytes and their PD-1expression.Clin Cancer Res 2004；10:5094-100)。常常发现PD-L1高度表达于许多人类癌症类型中，其在肿瘤中藉由活化关键致癌路径(诸如PI3K、MAPK)被上调及最强烈地藉由由IFN-γ在肿瘤微观环境中上调而引起活性抗肿瘤T细胞反应(Chen,TH、Huang,CC、Yeh KT、Chang SH、Sung WW、Cheng YW及Lee H*(2012)Humanpapillomavirus 16E6oncoprotein associated with p53inactivation in colorectalcancer.World J Gastroenterol,18,4051-4058)。在高度浸润有淋巴细胞的HPV阳性头部及颈部鳞状细胞癌(HNSCC)中，于肿瘤及CD68+肿瘤相关联的巨噬细胞两者上PD-L1的表达定位至淋巴细胞前方的位点，而PD-L1表达的大多数CD8+TIL诱导者在HPV-阳性PD-L1(+)肿瘤中发现。此等结果支持PD-1:PD-L1相互作用在一旦建立肿瘤则产生最初病毒感染及后续适应性免疫抗性的免疫特许位点方面的作用及显示此作用在罹患HPV-阳性HNSCC的患者中进行治疗性阻断的基本原理(Lyford-Pike等人，2013)。已报告肿瘤中PD-L1的表达是与肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)有关且与黑色素瘤中；卵巢癌、乳癌、食管癌、肾脏癌、胃癌、胰脏癌、膀胱癌、肝细胞癌及头部及颈部鳞状细胞癌中及甚至成人T细胞白血病/淋巴瘤中的不良临床预后相关联。在肺部癌症中，PD-L1已证实促进抗肿瘤免疫反应的负调节；然而，手术后存活期与PD-L1表达无关联。
US20110177088涉及一种治疗血液性恶性疾病的方法，所述方法包括对有此需要的个体投与治疗上有效量的PD1的配体的步骤，其中所述PD1的配体选自由PD-L1或其的结合至PD1的片段、PD-L2或其的结合至PD1的片段及抗-PD1抗体或其的结合至PD1的片段组成的群，且其中所述血液性恶性疾病选自由B-细胞来源的慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B-细胞来源的小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、多发性骨髓瘤、急性B细胞白血病及套细胞淋巴瘤组成的群。US 20130149305提供一种可溶性CD80蛋白质，其与程序化死亡配体1(PD-L1)相互作用及由此抑制PD-L1与T细胞表达的程序化死亡1(PD1)受体相互作用及因此将PD-L1介导的免疫抑制最小化。已发现肿瘤浸润T细胞以副分泌方式在肿瘤细胞上上调免疫抑制路径，诸如PD-L1。特定言之，Vamsidhar Velcheti等人指出，PD-L1表达与肿瘤浸润淋巴细胞显着相关联及对罹患非小细胞肺癌的患者的研究显示更大程度的PD-L1蛋白质及mRNA表达与增进的局部淋巴细胞性浸润及更长的存活期相关联(Vamsidhar Velcheti等人,ProgrammedDeath Ligand-1Expression in Non-small Cell Lung Cancer,LaboratoryInvestigation(2014)94,107-116)。
然而，调节肿瘤细胞中PD-L1的表达的机制尚未知晓及使肿瘤消退达到极点的肿瘤微观环境中的事件的确切顺序亦尚未知晓。需要研究PD-L1表达与肿瘤恶性度间的关系。
发明内容
本发明提供一种治疗及/或预防个体的肿瘤生长、侵袭及/或转移的方法，所述方法包括对个体投与PD-1表达抑制剂以减弱所述个体中经由自分泌环的PD-L1的表达。在一个实施例中，所述PD-L1的投与会增强TGF-β1讯号路径，较佳地，增强TGFβ1/SMAD4讯号路径。在一个实施例中，TGFβ1/SMAD4讯号路径的增强会增加p21表达以抑制肿瘤增殖及/或减少VEGF-C表达以抑制肿瘤转移。在一个实施例中，所述肿瘤为与病毒相关联的肿瘤。较佳地，所述病毒为HPV、HIV、EBV、HBV、CMV或HCV。例如，所述肿瘤为与HPV-、HIV-、HCV-、EBV-或HBV相关联的癌症、生殖器官癌症、肾癌(renal cancer)、结肠癌、乳癌、肾脏癌(kidneycancer)、胰脏癌、大肠癌、肺癌、肝癌、脑癌、胃癌、子宫颈癌(uterine cervix cancer)、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、食管癌、白血病、淋巴瘤、纤维肉瘤、肥大细胞瘤或黑色素瘤。在一个实施例中，PD-L1表达抑制剂为PD-L1之小分子干扰RNA(siRNA)、PD-L1的小发夹(sh)RNA或PD-L1的反义RNA或抗PD-L1的单株抗体。在一个实施例中，所述个体为复发或难治个体。较佳地，所述个体为哺乳动物。
本发明提供一种医药组合，其包含与TGF-β1表达抑制剂或VEGF表达抑制剂组合的PD-L1表达抑制剂。在一个实施例中，所述PD-L1表达抑制剂为PD-L1的小分子干扰RNA(siRNA)、PD-L1的小发夹(sh)RNA、PD-L1的反义RNA、抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段。较佳地，所述抗-PD-L1抗体为嵌合、人源化、复合、人类抗体或双特异性抗体。在另一实施例中，所述医药组合进一步包含第二抗癌药物或疗法。
附图说明
图1A-H显示PD-L1表达对肺癌细胞中的群落形成及倍增时间的影响。用小发夹RNAPD-L1(shPD-L1)转染自肺腺癌患者的胸膜积液建立的内源性HPV16-阳性TL-1及TL-2细胞以使PD-L1表达沉默48h。用各种剂量的PD-L1表达载体转染A549及TL-4细胞以使PD-L1过度表达48h。于shPD-L1或PD-L1表达载体转染后，藉由群落形成及MTT试验评估此等细胞的群落形成效率及倍增时间。
图2A-F显示PD-L1对软琼脂生长、侵袭能力及异种移植肺部肿瘤形成的影响。藉由软琼脂生长及侵袭试验评估藉由TL-1及TL-2细胞中PD-L1的减弱表达或A549及TL-4细胞中PD-L1的过度表达所改变的软琼脂生长及侵袭能力。各使用两个PD-L1-减弱表达的TL-1及PD-L1过度表达的TL-4稳定纯系，经尾静脉注射至裸鼠中。60天后，计数裸鼠中肺部肿瘤结节的数量及进一步藉由H&E染色证实肿瘤。具有shPD-L1或PD-L1表达载体转染的不同细胞中基质胶膜上的软琼脂生长群落及侵袭细胞显示于上图中。肺部肿瘤结节及H&E染色显示于中图中。藉由PD-L1减弱表达或PD-L1过度表达改变的软琼脂生长、侵袭能力及肺部肿瘤结节是以柱形图显示。
图3A-H显示TGF-β1表达的减少负责突变EGFR肺腺癌细胞中的PD-L1介导的细胞生长及侵袭能力。H1650及H1975细胞中PD-L1的表达藉由其shRNA(5μg)来减弱且接着进一步藉由两种剂量的shRNA使TGF-β1沉默。藉由西方墨点法评估PD-L1、TGF-β1、VEGF-C及p21的表达。分别藉由MTT及博伊登室(Boyden chamber)试验来评估藉由PD-L1及/或TGF-β1沉默改变的细胞生长及侵袭能力。
具体实施方式
本发明部分地是基于PD-L1的表达/过度表达会促进癌细胞中细胞增殖及致癌潜力的基础上。自肿瘤细胞表达的PD-L1可直接促进肿瘤恶性度及进而导致癌症不良结果。因此，自肿瘤表达的PD-L1可经由自分泌环促进肿瘤生长及转移及癌细胞中PD-L1的内源性表达会促进细胞增殖、生长、侵袭及转移。特定言之，本发明发现在病毒感染的癌症患者中PD-L1表达比在未感染病毒癌症患者中明显更高。本发明显示具有高PD-L1肿瘤的患者展现较具有低PD-L1肿瘤的患者较差的结果。本发明中的研究证实PD-L1经由自分泌环促进肺部癌细胞的细胞增殖、群落形成、软琼脂生长及异种移植肿瘤形成。另外，经由TGFβ1/SMAD4路径经PD-L1调节的p21及VEGF-C表达是负责肿瘤生长、侵袭及转移。尤其在经HPV感染的肺癌患者中，癌肿瘤中的提高的PD-L1表达与肿瘤侵犯性诸如侵袭及转移显着相关联。
本文中所定义的术语具有为本发明相关领域中的一般技术者所普遍了解的含意。术语诸如「一(a)」、「一个(an)」及「所述(the)」无意于仅指单数实体，而是包括阐述所用的特定实例的大类。本文中的术语是用于描述本发明的特定实施例，但除非于申请专利范围中列出，否则其使用并不限制本发明。例如，术语「一个细胞」包括复数个细胞，包括其混合物。
如本文中所使用，术语「肿瘤」及「癌症」可互换使用及是指不具有生理功能且自不受控制的通常快速的细胞增殖产生的组织的新恶性生长。
如本文中可互换使用的术语「过度表达」(「overexpress」)、「经过度表达」(「overexpressed」)及「是过度表达」(「overexpressing」)是指相较于相同组织类型的正常细胞具有可测量的更高的表面上PD-L1水平的癌症或恶性细胞。此过度表达可能是因基因扩增或增加的转录或转译引起。可使用熟知的分析法(例如在活细胞或经溶解细胞上的ELISA、免疫荧光、流式细胞术或放射免疫分析法)来测量PD-L1表达及过度表达。或者或另外，可例如使用荧光原位杂交、南方墨点法或PCR技术测量细胞中编码PD-L1的核酸分子水平。当在细胞表面上PD-L1水平比正常细胞高至少1.2倍时，则PD-L1是过度表达的。
如本文中所使用，术语「TGF-β1讯号传递的抑制」意指TGF-β1无法结合至受体，接着Smad2及Smad3无法进行磷酸化，因而无法与Smad4形成复合体，及因此，所述复合体无法易位至细胞核进而无法调节转录。
如本文中所使用，肿瘤抑制基因smad4与熟习此项技术者已知的相同肿瘤抑制基因的其他名称(包括(但不限于)madh4及dpc4)同义。如习知上，此基因的表达产物在本文中命名为SMAD4，其与此基因的为熟习此项技术者已知的表达产物的对应的其他名称(包括(但不限于)MADH4及DPC4)同义。
如本文中所使用，「癌细胞」或「肿瘤细胞」是指活体内或活体外及在组织培养物中具有不一定涉及新遗传物质的吸收的自发或诱发表型变化的癌细胞、前期癌细胞或转形细胞。虽然转形可因转形病毒感染及新基因组核酸的并入或外源核酸的吸收引起，但其亦可自发引起或在暴露于致癌物后致外源基因突变而引起。转形/癌症可藉由(例如)在适当动物宿主(诸如裸鼠)中细胞的形态学变化、永生化、异常生长控制、病灶形成、增殖、恶性度、肿瘤特异性标记物水平、侵袭度、肿瘤生长或抑制，及在试管内、活体内及活体外类似的情形举例说明。
如本文中所使用，术语「医药上可接受的载剂」是指涵盖任何标准医药载剂，例如，磷酸盐缓冲盐水溶液、水及乳液，诸如油/水或水/油乳液及各种类型的润湿剂。这些组合物亦可包含稳定剂及防腐剂及任何上述载剂，但额外限制条件为将其用于活体内是可接受的。关于载剂、稳定剂及佐剂的实例，请参见Martin REMINGTON'S PHARM.SCI.,第18版，Mack Publ.Co.,Easton,Pa.(1995)及「PHYSICIAN'S DESK REFERENCE」,第58版,MedicalEconomics,Montvale,N.J.(2004)。
如本文中所使用，本文中定义术语「个体」以包括动物，诸如哺乳动物，包括(但不限于)灵长类动物(例如，人类)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠及类似物。在特定实施例中，所述个体为人类。本文中术语「个体」及「患者」当提及例如哺乳动物个体(诸如人类)时可互换使用。
如本文中所使用，术语「治疗」是指根除或改善某一疾病或病症或与所述疾病或病症相关联的一或多种症状。在某些实施例中，所述术语是指由于投与一或多种预防性或治疗性药剂至罹患此疾病或病症的个体而致所述疾病或病症的传布或恶化最小化。在一些实施例中，所述术语是指在特定疾病的症状的诊断或发作后并与或不并与一或多种其他活性剂投与本文中所提供的化合物或抗体或剂型。
如本文中所使用，术语「抗体」意欲包括完整分子以及其包含抗原结合位点的片段二者。此等包括(但不限于)缺少完整抗体的Fc片段的Fab及F(ab')2片段及双特异性抗体。
如本文中所使用，术语「预防」是指预防疾病或病症或其一或多种症状的发作、复发或传布。在某些实施例中，所述术语是指在症状发作前，并与或不并与一或多种其他额外活性剂投与本文中所提供的化合物或抗体或剂型或治疗给尤其处在本文中所提供的疾病或病症风险的患者。所述术语涵盖抑制或减轻特定疾病的症状。于此点上，术语「预防」可与术语「预防性治疗」互换使用。
如本文中所使用，术语「复发」是指在某一疗法后癌症已经缓解的个体具有癌细胞回归的情况。
如本文中所使用，术语「难治」或「抗性」是指个体甚至在强化治疗后体内具有残留癌细胞的情况。
如本文中所使用，术语「耐药性」是指疾病对一或多种药物的治疗无回应的情况。耐药性可是固有性，此意指疾病从未对一或多种药物响应，或其可是获得性，此意指疾病停止对所述疾病先前已响应的一或多种药物回应。
如本文中所使用，术语「抗癌药物」或「癌症治疗剂」意欲包括抗增殖剂及化疗剂。
如本文中所使用，除非另有指示，否则术语「共投与」及「与...组合」包括无特定时间限制内同时、合并或依序投与两种或更多种治疗剂。在一个实施例中，这些治疗剂是呈相同组合物或单位剂型。在其他实施例中，这些治疗剂是呈分开组合物或单位剂型。
在一个态样中，本发明提供一种治疗及/或预防个体的肿瘤生长、侵袭及/或转移的方法，所述方法包括对所述个体投与PD-L1表达抑制剂以减弱个体中经由自分泌环的PD-L1的表达。在另一方面，本发明提供一种PD-L1表达抑制剂的用途，其用于制造适于藉由减弱个体中经由自分泌环的PD-L1的表达来治疗及/或预防所述个体的肿瘤生长、侵袭及/或转移的药物。
在PD-L1-减弱表达的肿瘤细胞中，TGFβ1、SMAD4及p21的水平显着增加，但VEGF-C表达减少。此等分子的增加或减少是藉由PD-L1-减弱表达的肿瘤细胞中使TGFβ1沉默来救援。更有趣的是，PD-L1经由TGFβ1/SMAD4路径调节的p21及VEGF-C表达负责肿瘤细胞中侵袭能力。因此，本发明提供一种治疗及/或预防个体的肿瘤生长、侵袭及/或转移的方法，所述方法包括对所述个体投与PD-L1表达抑制剂及TGF-β1或VEGF表达抑制剂。
转形生长因子-β(TGF-β)在细胞周期停滞、细胞凋亡、稳衡作用、伤口愈合及免疫调节中发挥双重作用。就癌症而言，TGF-β讯号传递发挥情境相关双重作用，既在早期疾病中作为肿瘤抑制因子且在既定癌症中作为肿瘤启动子。Smad4(肿瘤抑制基因)为TGF-β超家族的讯号传递路径中的主要介体。SMAD路径为TGF-β家族成员的典型讯号传递路径。TGF-β结合至III型受体，所述III型受体接着将TGF-β呈现给II型受体，或TGF-β直接结合至II型受体。一旦藉由TGF-β活化，II型受体就募集、结合并转磷酸化I型受体，此导致细胞内效应子蛋白质Smad2及Smad3的募集及磷酸化。经磷酸化的Smad2及Smad3随后结合至Smad4且易位至细胞核以引起基因表达。恶性进展与对TGF-β的抗增殖效应敏感性的损失之间具有强相关性，所述敏感性的损失常常与TGF-β受体的经减少表达或失活相关联。
在一个实施例中，所述肿瘤为与病毒相关联的肿瘤。在一个实施例中，所述病毒为HPV、HIV、EBV、HBV、CMV或HCV。
在一个实施例中，用于本发明方法中的PD-L1表达抑制剂为PD-L1的小分子干扰RNA(siRNA)、PD-L1的小发夹(sh)RNA或PD-L1的反义RNA或抗PD-L1的单株抗体。较佳地，PD-L1的siRNA、PD-L1的shRNA或PD-L1的反义RNA的靶序列为GCTGCACTAATTGTCTATTGG(SEQ IDNO:5)。
在一个实施例中，所述个体为复发或难治性个体。在一个实施例中，所述个体为哺乳动物。较佳地，所述个体为灵长类动物(例如，人类)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠或小鼠。
在一个实施例中，所述肿瘤或癌症包括(但不限于)与HPV-、HIV-、HCV-、EBV-、CMV-或HBV相关联的癌症、肛门癌、生殖器官癌(诸如子宫癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌及乳癌)、肾癌、结肠癌、乳癌、肾脏癌、胰脏癌、大肠癌、肺癌、肝癌、脑癌、胃癌、子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、食管癌、白血病、淋巴瘤、纤维肉瘤、肥大细胞瘤或黑色素瘤。较佳地，所述癌症为白血病、肛门癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、子宫颈癌、头部及颈部癌症(诸如口咽癌及口腔癌症)、肺癌、结肠癌、非黑色素瘤皮肤癌、与HPV相关联的癌症或肝癌。较佳地，所述癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)、与HPV相关联的癌症。
在另一实施例中，本文中所揭示的本发明方法包括进一步投与第二抗癌药物。
在另一态样中，本发明提供一种医药组合，其包含与TGF-β1或VEGF表达抑制剂组合的PD-L1表达抑制剂。
在一个实施例中，本发明提供一种医药组合，其包含PD-L1表达抑制剂及第二抗癌药物。在另一实施例中，本发明提供一种医药组合，其包含视需要与第二抗癌药物组合的PD-L1表达抑制剂及TGF-β1表达抑制剂或VEGF表达抑制剂。
在一个实施例中，所述PD-L1表达抑制剂为PD-L1的小分子干扰RNA(siRNA)、PD-L1的小发夹(sh)RNA或PD-L1的反义RNA、抗-PD-L1抗体或其的结合至PD-1蛋白质的抗原结合片段。较佳地，所述抗-PD-L1抗体为嵌合、人源化、复合、人类抗体或双特异性抗体。
组合疗法可包含第二抗癌药物。本发明PD-L1抗体亦可连同第二抗癌药物、抗-TGFβ细胞介素、抗-VEGF单株抗体或其组合一起投与。
本文中所揭示的第二抗癌药物包括(但不限于)抗代谢产物(例如，5-氟尿嘧啶、甲胺喋呤、氟达拉滨(fludarabine)、阿糖胞苷(cytarabine)(亦称为胞嘧啶阿拉伯糖苷或Ara-C)及高剂量阿糖胞苷)、抗微管剂(例如，长春花生物碱，诸如长春新碱及长春花碱；及紫杉烷，诸如太平洋紫衫醇及多烯紫衫醇)、烷基化剂(例如，氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、美法仑(melphalan)、异环磷酰胺、卡莫司汀(carmustine)、阿札胞苷(azacitidine)、地西他滨(decitabine)、白消安(busulfan)、达喀尔巴嗪(dacarbazine)及亚硝基脲(诸如卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、双氯乙基亚硝基脲及羟基脲))、铂试剂(例如，顺铂、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、赛特铂(satraplatin)(JM-216)及CI-973)、蒽环霉素(例如，多柔比星(doxorubicin)及柔红霉素(daunorubicin))、抗肿瘤抗生素(例如，丝裂霉素、博来霉素(bleomycin)、伊达比星(idarubicin)、阿霉素(adriamycin)、道诺霉素(daunomycin)(亦称为柔红霉素、红比霉素(rubidomycin)或司比定(cerubidine))及米托蒽醌(mitoxantrone))、拓扑异构酶抑制剂(例如，依托泊苷(etoposide)及喜树碱(camptothecin))、嘌呤拮抗剂或嘧啶拮抗剂(例如，6-巯基嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、克罗拉滨(clofarabine)及吉西他滨(gemcitabine))、细胞成熟剂(例如，三氧化二砷及维甲酸(tretinoin))、DNA修复酶抑制剂(例如，鬼臼毒脂素(podophyllotoxine)、依托泊苷、伊立替康(irinotecan)、拓扑替康(topotecan)及替尼泊苷(teniposide))、阻止细胞存活的酶(例如，天冬酰胺酸酶及培门冬酶(pegaspargase))、组蛋白脱乙酰酶抑制剂(例如，伏立诺他(vorinostat))、任何其他细胞毒性剂(例如，雌氮芥磷酸盐(estramustine phosphate)、地塞米松(dexamethasone)、泼尼莫司汀(prednimustine)及丙卡巴肼(procarbazine))、激素(例如，地塞米松、强的松(prednisone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、他莫昔芬(tamoxifen)、亮丙瑞林(leuprolide)、氟他胺(flutamide)及甲地孕酮(megestrol))、单株抗体(例如，吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)、阿来组单抗(alemtuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)及钇-90-替伊莫单抗替坦(ibritumomab tiuxetan))、免疫调节剂(例如，撒利多胺(thalidomide)及来那度胺(lenalidomide))、Bcr-Abl激酶抑制剂(例如，AP23464、AZD0530、CGP76030、PD180970、SKI-606、伊马替尼(imatinib)、BMS354825(达沙替尼(dasatinib))、AMN107(尼勒替尼(nilotinib))及VX-680)、激素激动剂或拮抗剂、部分激动剂或部分拮抗剂、激酶抑制剂、手术、放射疗法(例如，γ辐射、中子束放射疗法、电子束放射疗法、质子疗法、近距离放射疗法及全身放射性同位素)、内分泌疗法、生物反应调节剂(例如，干扰素、介白素及肿瘤坏死因子)、热疗及冷冻疗法及减弱任何不利效应的药剂(例如，止吐药)。在一个实施例中，所述抗癌药物或癌症治疗剂为细胞毒性剂、抗代谢产物、抗叶酸药、HDAC抑制剂(诸如MGCD0103)(又称N-(2-胺基苯基)-4-((4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基胺基)甲基)苯甲酰胺)、DNA嵌入剂、DNA交联剂、DNA烷基化剂、DNA裂解剂、拓扑异构酶抑制剂、CDK抑制剂、JAK抑制剂、抗血管生成剂、Bcr-Abl抑制剂、HER2抑制剂、EGFR抑制剂、VEGFR抑制剂、PDGFR抑制剂、HGFR抑制剂、IGFR抑制剂、c-Kit抑制剂、Ras路径抑制剂、PI3K抑制剂、多靶点激酶抑制剂、mTOR抑制剂、抗雌激素药、抗雄激素药、芳香酶抑制剂、生长抑素类似物、ER调节剂、抗微管蛋白药、长春花生物碱、紫杉烷、HSP抑制剂、Smoothened拮抗剂、端粒酶抑制剂、COX-2抑制剂、抗转移药、免疫抑制剂、生物制剂(诸如抗体)及激素疗法。
本发明医药组合可进一步包含一或多种医药上可接受的载剂、赋形剂及并入调配物中以提供经改良的转移、递送、耐受及类似的其他试剂(本文中统称为「医药上可接受的载剂或稀释剂」)。许多适宜调配物可见于所有医药化学家已知的处方集：Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pa。此等调配物包括(例如)粉末、膏剂、软膏、凝胶剂、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(诸如LIPOFECTIN.TM.)、DNA共轭物、无水吸收膏剂、水包油及油包水乳液、乳液碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶及含碳蜡的半固体混合物。亦可参见Powell等人，「Compendiumof excipients for parenteral formulations」PDA,1998,J Pharm Sci Technol 52:238-311。
因此，可在不需要过度实验下由此项技术中熟知的方法，例如用惰性稀释剂或用食用载剂制得设计用于口服、舌、舌下、颊及颊内投与的组合/组合物。这些组合物可封装于明胶胶囊中或压缩成锭剂。以口服治疗投药的目的而言，可将本发明医药组合物与赋形剂合并且呈锭剂、片剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、芯片、咀嚼口香糖及类似物的形式使用。
锭剂、丸剂、胶囊、片剂及类似物亦可包含黏合剂、受体、崩解剂、润滑剂、增甜剂及矫味剂。黏合剂的一些实例包括微晶纤维素、黄蓍胶或明胶。赋形剂的实例包括淀粉或乳糖。崩解剂的一些实例包括海藻酸、玉米淀粉及类似物。润滑剂的实例包括硬脂酸镁或硬脂酸钾。滑动剂的一个实例为胶态二氧化硅。增甜剂的一些实例包括蔗糖、糖精及类似物。矫味剂的实例包括薄荷、水杨酸甲酯、橙香精及类似物。
可以非经肠诸如(例如)藉由静脉内、肌肉内、鞘内或皮下注射投与本发明组合/组合物。可藉由将本发明组合物并入溶液或悬浮液来达成非经肠投与。此等溶液或悬浮液亦可包含无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂。非经肠调配物亦可包含抗细菌剂(诸如(例如)苄醇或对羟基苯甲酸甲酯)、抗氧化剂(诸如(例如)抗坏血酸或亚硫酸氢钠)及螯合剂(诸如EDTA)。亦可添加缓冲剂(诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐)及用于调整渗透性的试剂(诸如氯化钠或葡萄糖)。非经肠制剂封装可封装于安瓿、可弃式针筒或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
直肠投药包括投与医药组合/组合物至直肠或大肠中。此可使用栓剂或灌肠剂来达成。可由此项技术中已知的方法轻易地制得栓剂调配物。例如，栓剂调配物可如下制得：藉由加热甘油至约120℃，将果胶组合物溶解于所述甘油中，将经加热的甘油混合，此后，可添加纯水，及将热混合物倒入栓剂模具中。
经皮投药包括组合物经由皮肤的经皮吸收。经皮调配物包括贴剂、软膏、霜剂、凝胶、药膏及类似物。
本发明说明在经人类乳头瘤病毒(HPV)16/18感染的患者中PD-L1的表达比在未感染HPV的肺癌患者中明显更高。除此之外，罹患高PD-L1肿瘤的患者展现较罹患低PD-L1肿瘤的患者更差的结果。细胞及动物模型中的研究证实，PD-L1经由自分泌环促进肺癌中的细胞增殖、群落形成、软琼脂生长及异种移植肿瘤形成。本文中源自于肺癌患者的数据显示HPV阳性肿瘤中PD-L1表达比在HPV阴性肿瘤中更高。有趣的是，罹患高PD-L1表达肿瘤的患者展现较其等罹患低PD-L1表达肿瘤的患者更短的总存活期及无复发存活期。惊人地，本文中源自于细胞及动物模型的数据指出，自肺癌细胞表达的PD-L1可直接促进软琼脂生长、侵袭及转移性异种移植肿瘤形成。
提出以下实例以便为一般技术者提供如何制作及使用本发明方法及组合物的充分揭示及描述，而无意于限制本发明者视为其发明的范畴。已致力于确保关于所使用数值(例如，量、温度等)的精确度，但是一些实验误差及偏差应加以考虑。除非另有指示，否则份数为重量份，分子量为平均分子量，温度是以摄氏度计，及压力为大气压或接近大气压。
实例
材料及方法
研究群体。从223位罹患原发性肺癌的患者采集肺部肿瘤样本。所有此等患者是在1998年至2008年间为台湾台中荣民总医院的胸外科室(Department of Thoracic Surgeryat Taichung Veteran's General Hospital,Taiwan)所收治。要求所有患者提交基于机构审查委员会(institutional review board)批准的生物学研究的书面知情同意书。这些个体手术前均未接受过放射疗法或化学疗法。先前已分析所采集的肺部肿瘤中HPV16及/或HPV18 E6蛋白质(16)的存在，及依WHO(1981)分类法组织学上判定肿瘤类型及阶段。处理病理样品以用于习知的组织学程序。
定量实时RT-PCR。使用TRIZOL试剂(Invitrogen)自肺部细胞及肿瘤样本制备总RNA。总RNA(5μg)并与随机引物用于使用Superscript III逆转录酶(Applied Biosystems)的cDNA合成中。使用所得的cDNA(1:20稀释剂)以藉由qPCR检测内源性PD-L1 mRNA的表达。在7500HT实时PCR系统装置(Applied Biosystems,Foster City,CA)中，使用ABsoluteqPCR SYBR Green ROX混合物(Applied Biosystems,Foster City,CA)至少一式三份进行qPCR试验。所使用的引物如下：(a)PD-L1，正向引物5'-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3'(SEQ IDNO:1)及反向引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'(SEQ ID NO:2)；(b)18S rRNA，正向引物5'-GTGAGCGATGGAACTTCGACTT-3'(SEQ ID NO:3)及反向引物5'-GGCGTTTGGAGTGGTAGAAATC-3'(SEQ ID NO:4)。以100ng源自于各个别样品的总RNA用作模板进行无逆转录(无RT)对照来确保扩增不会因污染DNA而引起。在无RT对照中未检测到讯号。由比较Ct法(ΔΔCt)计算得相对mRNA表达。使用18S rRNA供标准化。
质体及转染。PD-L1-RNAi的靶序列为GCTGCACTAATTGTCTATTGG(SEQ ID NO:5)。将RNAi模板选殖至载体pCDNA-HU6中，如Ann Surg Oncol,Epub 2012年6月12日中所述。藉由将全长人类PD-L1cDNA(GenBank寄存编号NM_014143)选殖至亦表达抗新霉素(Neo)基因的pcDNA3.1真核表达载体中来建构含PD-L1表达建构的质体。用TransFast转染试剂(Promega)依制造商方案进行所有转染实验。
软琼脂群落形成试验。在含有1％底层琼脂及0.35％上层琼脂的6孔板上于上述培养基中培养细胞(3000个/孔)且在37℃下培养21天。用0.005％结晶紫染色板1h。使用解剖显微镜计数群落。超过100μm的群落直径算为1个阳性群落。
博伊登室分析。侵袭分析中使用具有8μm孔径的博伊登室(Falcon)。为侵袭分析，用基质胶(Matrigel)(Becton Dickinson Labware)覆盖过滤器的上侧。24小时后，移除过滤器上侧上的细胞及将黏附至膜底侧的细胞固定在95％乙醇中并用10％Giemsa染料染色。使用荧光显微镜(Olympus,Lake Success,NY)计数迁移的细胞数。检视各样品的十个相邻区域以获得跨膜迁移/侵袭的细胞的代表性数量。各条件以一式三份进行分析。
统计分析。使用SPSS统计软件程序(版本11.0SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)进行统计分析。若适宜，则使用皮尔逊卡方(Pearson Chi-Square)或费歇尔(Fisher)精确检验来分析PD-L1与临床病理变量之间的相关性。使用斯皮尔曼(Spearman)等级相关来分析PD-L1与HPV之间的相关性。藉由Kaplan-Meier法估计存活期曲线及由对数等级检验进行比较。使用Cox回归模型进行单变量及多变量分析，包括视作协方差的所有临床病理特征。在肿瘤-淋巴结-转移分类中，吾人分别使用术语肿瘤状态作为T因子，淋巴结状态作为N因子，及转移状态作为M因子。<0.05的P值在统计学上视为显着。
实例1 PD-L1促进在NSCLC细胞中的细胞增殖、群落形成、软琼脂生长及侵袭能力
用于验证细胞模型中PD-L1对肿瘤生长及转移的影响的方法如下：在高PD-L1表达细胞中藉由小发夹(sh)RNA使PD-L1表达沉默；相反地，在低PD-L1细胞中，PD-L1表达藉由其表达载体异位表达。藉由群落形成及博伊登室分析来评估细胞经shRNA或PD-L1的表达载体转染后细胞增殖及侵袭能力相较于其对照细胞的改变。
吾人检查PD-L1是否可增强细胞生长及致癌可能性，在PD-L1减弱表达的TL-1及TL-2细胞中进行倍增时间、群落形成效率、博伊登室及软琼脂分析，且将PD-L1过度表达A549及TL-4细胞与两种非特异性shRNA转染(NC)细胞进行比较。PD-L1减弱表达的TL-1及TL-2细胞的倍增时间相较于其NC细胞显着增加(参见图1A-1D)。相反地，PD-L1过度表达A549及TL-4细胞的倍增时间较两种空载体转染(VC)细胞更短(参见图1E-1H)。群落形成分析进一步证实此等细胞中藉由PD-L1减弱表达及PD-L1过度表达调节的细胞增殖(参见图1)。博伊登室及固着非依赖性软琼脂群落形成分析显示，在PD-L1减弱细胞中侵袭及固着非依赖性软琼脂群落形成的效率相较于其NC及VC细胞以剂量依赖性方式降低而在PD-L1过度表达细胞中以剂量依赖性方式提高(参见图2A-2D)。此等结果清楚地指明，PD-L1经由自分泌环促进NSCLC细胞中的细胞增殖及致癌可能性。
实例2 PD-L1促进裸鼠中的异种移植转移性肺部肿瘤形成
吾人研究PD-L1是否可促进裸鼠中的异种移植转移性肿瘤形成，相较于其等注射TL1/NC及TL4/VC细胞的裸鼠，分别建立PD-L1减弱表达的TL-1稳定纯系#1及#2(TL/#1及TL1/#2)及PD-L1过度表达TL-4稳定纯系#1及#2(TL4/#1及TL4/#2)以注射至裸鼠中。各组十只小鼠经尾静脉注射稳定纯系。55天后，将所有小鼠杀死及测量并计数肺器官中的肿瘤负担。结果证实，发现TL1/NC、TL1/#1及TL/#2组中有10只、5只及4只小鼠具有肺部肿瘤结节。TL1/NC组中的肺部肿瘤结节数显着高于TL1/#1及TL1/#2组(参见图2E)。相反地，观察到TL4/VC、TL4/#1及TL4/#2组中有0只、7只及10只小鼠具有肺部肿瘤结节；TL4/#1及TL/#2组中的肺部肿瘤结节数显着高于TL4/VC组(参见图2F)。TL1/NC、TL4/#1及TL/#2组中此等肺部肿瘤结节的肿瘤尺寸显着大于TL1/#1、TL1/#2及TL4/VC组。此等结果清楚地指明，PD-L1促进裸鼠中的异种移植转移性肺部肿瘤形成(参见图2)。
惊人地，吾人来自于细胞及动物模型的数据显示自肺癌细胞表达的PD-L1可直接促进软琼脂生长、侵袭及转移性异种移植肿瘤形成(参见图1及图2)。
实例3 PD-L1减弱表达的TL-1细胞中细胞周期-及转移相关基因谱
吾人检查哪个细胞周期-及转移相关基因可负责PD-L1介导的细胞增殖及致癌可能性，使用PD-L1减弱表达的TL-1稳定纯系#1以藉由PCR数组评估细胞周期-及转移相关基因表达谱的改变。如表1及2中所显示，在PD-L1减弱表达的TL-1细胞中观察到25个细胞周期相关基因及9个转移相关基因的诱导较TL1/NC细胞超过2倍。此等当中，在PD-L1减弱表达的TL-1细胞中三个细胞周期相关基因(TGFβ1、p21及p53)及两个转移相关基因(SMAD4及Maspin)显着增多，但VEGF-C表达显着降低。已证实P21及VEGF-C藉由TGFβ/SMAD4路径成为标靶。因此，吾人提出p21及VEGF-C可能涉及经由TGFβ1/SMAD4路径经PD-L1介导的肿瘤进展及转移。
表1.籍由PCR数组分析shPD-L1细胞中之细胞周期相关基因表现。
实例4 P21及VEGF-C是负责经由TGFβ1/SMAD4路径经PD-L1介导的软琼脂生长及侵袭
吾人研究藉由PD-L1去调控的p21及VEGF-C可经由TGFβ1/SMAD4路径促进软琼脂生长及侵袭的可能性。收集高PD-L1表达TL-1及CL1-5细胞以减弱PD-L1表达且接着进一步在PD-L1减弱表达的TL-1及CL1-5细胞中使TGFβ1沉默以检查两种细胞中p21、VEGF-C、TGFβ1及SMAD4表达是否藉由PD-L1减弱及进一步的TGFβ1沉默而改变。西方墨点法显示，在TL-1及CL1-5细胞中，由于PD-L1减弱表达所致，TGFβ1、SMAD4及p21的表达相较于两种NC细胞显着升高，但VEGF-C表达明显降低。有趣的是，在PD-L1减弱表达的TL-1及CL1-5细胞中，SMAD4、VEGF-C及p21的表达藉由TGFβ1沉默以剂量依赖性救援。具有PD-L1减弱表达或进一步TGFβ1沉默的TL-1及CL1-5细胞中软琼脂板上的代表性群落生长及基质胶膜上的侵袭细胞显示于图3中。两种细胞的软琼脂生长及侵袭的效率取决于两种细胞中PD-L1介导的p21、TGFβ1、SMAD4表达的降低及VEGF-C表达的升高。此等结果显示，p21及VEGF-C可负责经由TGFβ1/SMAD4路径经PD-L1介导的软琼脂生长及侵袭。
实例5肺癌患者中PD-L1 mRNA表达与临床参数之间的关系
藉由实时PCR评估223个肺部肿瘤中的PD-L1 mRNA表达水平及表达水平的范围在0.1231至8374.391。使用中位值(9.08237)作为截止点以将肿瘤分成高及低PD-L1 mRNA水平组。吾人检查肺部肿瘤中的PD-L1 mRNA表达是否可能与临床病理参数相关联。如表3中所显示，相较于男性、吸烟者、鳞状细胞癌及早期阶段(I、II)患者，在女性、非吸烟者、腺癌及晚期阶段(III)患者中高PD-L1 mRNA水平更常见(性别上，70％相对41％，P<0.001；吸烟状态上，59％相对39％，P＝0.003；组织学类型上，66％相对34％，P<0.001)。此等结果显示PD-L1过度表达可在女性、非吸烟者及腺癌患者的肺部肿瘤进展及转移中发挥更重要的作用。最重要的是，HPV 16/18 E6阳性肿瘤中的PD-L1 mRNA表达较HPV 16/18 E6阴性肿瘤明显更高(P<0.001)。此等结果显示PD-L1可在经HPV感染的肺部肿瘤形成中发挥作用。
表3肺癌患者中PDL-1、TGFβ1、VEGF-C蛋白质表达与临床病理参数之间的关系。
实例6高PD-L1 mRNA水平可独立地预测肺癌患者中的OS及RFS
为验证PD-L1 mRNA水平是否与NSCLC患者中的OS及RFS相关联，使用Kaplain-Meier存活期及多变量Cox回归分析来统计分析。27.2个月的中值随访期，86位患者复发，包括19位具有局部复发，46位具有远程转移，及21位具有局部及远程转移。手术疗法前患者均未接受辅助化学疗法。Kaplain-Meier分析显示，具有高PD-L1 mRNA水平的患者相较于具有低PD-L1 mRNA水平的患者具有更短的OS及RFS(表4)。多变量Cox回归分析显示，具有高PD-L1 mRNA水平的患者中OS及RFS的风险比(HR)分别为彼等具有低PD-L1 mRNA水平的患者的2.54(OS)及2.06(RFS)倍(对于OS，95％CI，1.76至3.66，P<0.001；对于RFS，HR，2.06，95％CI，1.44至2.93，P<0.001，表4)。更有趣的是，4个组当中，具有高PD-L1表达的E6阳性患者具有最差的OS及RFS(参见表4)。此等结果显示PD-L1的诱导可藉由E6调节以促进患者中的恶性度且导致不良的OS及RFS。
表4.HPV16/18 E6、PD-L1及组合效应对肺癌患者中OS及RFS的影响的Cox回归分析。
所有HR系针对年龄、性别、吸烟状态、阶段及类型进行调整。

Claims (17)

1.一种治疗及/或预防个体的肿瘤生长、侵袭及/或转移的方法，其包含投与个体PD-1表达抑制剂以减弱所述个体中经由自分泌环的PD-L1的表达。
2.如权利要求1的方法，其进一步包含投与TGF-β1表达抑制剂的步骤。
3.如权利要求1的方法，其进一步包含投与VEGF表达抑制剂的步骤。
4.如权利要求1的方法，其中所述肿瘤侵袭或转移可被抑制。
5.如权利要求1的方法，其中所述肿瘤为与病毒相关联的肿瘤。
6.如权利要求5的方法，其中所述病毒为HPV、HIV、EBV、HBV、CMV或HCV。
7.如权利要求1的方法，其中所述PD-L1表达抑制剂为PD-L1的小分子干扰RNA(siRNA)、PD-L1的小发夹(sh)RNA或PD-L1的反义RNA。
8.如权利要求1的方法，其中所述个体为复发或难治个体。
9.如权利要求1的方法，其中所述个体为哺乳动物。
10.如权利要求1的方法，其中所述个体为人类。
11.如权利要求1的方法，其中所述肿瘤为与HPV-、HIV-、HCV-、EBV-、CMV或HBV相关联的癌症、肾癌(renal cancer)、结肠癌、肛门癌、生殖器官癌、子宫癌、卵巢癌(ovariancancer)、子宫内膜癌、子宫颈癌(cervical cancer)、阴道癌、外阴癌、乳癌、肾脏癌(kidneycancer)、胰脏癌、大肠癌、肺癌、肝癌、脑肿瘤、胃癌、子宫颈癌(uterine cervix cancer)、卵巢癌(ovary cancer)、前列腺癌、膀胱癌、食管癌、白血病、淋巴瘤、纤维肉瘤、肥大细胞瘤或黑色素瘤。
12.如权利要求11的方法，其中所述肿瘤为白血病、肛门癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、子宫颈癌、头部及颈部癌(诸如口咽癌及口腔癌症)、肺癌、结肠癌、非黑色素瘤皮肤癌、与HPV相关联的癌症或肝癌。
13.如权利要求1的方法，其中所述肿瘤为非小细胞肺癌(NSCLC)或与HPV相关联的癌症。
14.一种医药组合，其包含并与TGF-β1表达抑制剂或VEGF表达抑制剂组合的PD-L1表达抑制剂。
15.如权利要求14的医药组合，其进一步包含第二抗癌药物或疗法。
16.如权利要求14的医药组合，其中所述PD-L1表达抑制剂为PD-L1的小分子干扰RNA(siRNA)、PD-L1的小发夹(sh)RNA、PD-L1的反义RNA、抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段。
17.如权利要求16的医药组合，其中所述抗-PD-L1抗体为嵌合、人源化、复合、人类抗体或双特异性抗体。
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