CN114302708A - 转染方法 - Google Patents

转染方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114302708A
CN114302708A CN202080059401.8A CN202080059401A CN114302708A CN 114302708 A CN114302708 A CN 114302708A CN 202080059401 A CN202080059401 A CN 202080059401A CN 114302708 A CN114302708 A CN 114302708A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
cell
ultrafine
bubbles
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080059401.8A
Other languages
English (en)
Inventor
村田直之
S·丘阿诺伊
柳井薫雄
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Publication of CN114302708A publication Critical patent/CN114302708A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0002—Galenical forms characterised by the drug release technique; Application systems commanded by energy
    • A61K9/0009—Galenical forms characterised by the drug release technique; Application systems commanded by energy involving or responsive to electricity, magnetism or acoustic waves; Galenical aspects of sonophoresis, iontophoresis, electroporation or electroosmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5138—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyvinyl pyrrolidone, poly(meth)acrylates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

为了提供一种用于将核酸、蛋白质或其他靶物质安全且有效地引入T细胞或其他免疫细胞的新颖方法，本发明提供了一种用于将靶物质递送至免疫细胞的系统，所述系统包含超声波发生装置和超细气泡水溶液或超细气泡水的组合，所述超细气泡水溶液或超细气泡水包括平均直径为200nm或更小且不包含磷脂的超细气泡。本发明尤其提供了一种用于使用超声波和以上提及的超细气泡水等提高核酸或蛋白质至免疫细胞的递送能力的方法。

Description

转染方法
[技术领域]
本发明涉及一种用于将靶物质递送至免疫细胞的系统，所述系统包括含有超细气泡的超细气泡水或超细气泡水溶液和超声发生器的组合；一种用于通过使用所述超细气泡水或水溶液和超声增加核酸或蛋白质至免疫细胞的递送的方法；一种含有核酸或蛋白质和所述超细气泡水或水溶液的组合的制剂，用于通过与超声辐照组合使用将所述核酸或蛋白质递送至免疫细胞；以及一种用于通过使免疫细胞与所述制剂接触并且将所述细胞用超声处理将核酸或蛋白质递送至所述细胞的方法；等。
(背景技术)
超声在医学领域一直主要用作超声成像方式。微气泡作为超声造影剂正在超声诊断中取得划时代的进展。最近，有可能将超声用于诊断以外的目的。例如，将通过将超声能量聚焦在患处并且仅加热所述患处进行的无创癌症热疗在临床上应用于子宫肌瘤和前列腺癌。此外，专注于无创性和易于空间和时间控制的研究也在进行中，以将超声辐照用作将基因和药物递送至靶细胞的药物递送系统(DDS)的工具(声孔效应)。
迄今为止，已经报道了作为其中融合了气泡脂质体和超声技术的用于骨骼肌的基因递送系统的气泡脂质体，其中全氟丙烷被封装在聚乙二醇(PEG)修饰的脂质体中(非专利文献1)。此外，还已经报道了用于杜氏肌营养不良症的治疗性药物，所述治疗性药物用于将表面结合有特定吗啉代寡聚体、封装全氟代烃并且具有50-500nm的平均粒度的PEG修饰的气泡脂质体(气泡脂质多聚复合物(lipopolyplex))施用至肌肉组织或血管内，然后超声辐照体外的肌肉组织，以实现将吗啉代寡聚体高效引入肌肉组织(专利文献1)。还已经报道了，气体封装的微气泡和超声可以用于将药物和基因递送至脑(非专利文献2)。
已经报道了，使用全氟丙烷气体作为填充气体，获得在尺寸方面比使用全氟丁烷气体或氮气气体的气泡脂质体更小的气泡脂质体(非专利文献3)。此外，已经报道了，向ddY小鼠施用作为纳米气泡和质粒的组合的气泡脂质多聚复合物并且超声辐照脑组织可将所述质粒引入血管内皮或血管外区域，并且引入位点根据气体封装效率而变化(非专利文献4)。
然而，害怕使用气泡脂质体会导致由脂质引起的抗原性问题。此外，输出强度为1.5至2.5W/cm2的超声辐照产生对超声诊断的安全性的顾虑，导致实用性方面存在问题。
本发明的诸位发明人已经阐明了以不少于2.0×108个气泡/mL含有不含磷脂的纳米气泡的纳米气泡水具有优异的抗菌作用(专利文献2)。然而，不存在关于通过组合纳米气泡水与超声而将靶物质(诸如核酸、蛋白质等)引入细胞的报道。
使用用嵌合抗原受体(CAR)或源自癌症抗原特异性杀伤T细胞的T细胞受体(TCR)转染的CAR-T细胞或TCR-T细胞进行癌症免疫疗法的研究和开发正在迅速取得进展。目前的CAR-T细胞疗法通常采用这样的方法，其中通过使用病毒载体(诸如慢病毒载体等)将CAR基因离体引入从患者收集的T细胞以产生CAR-T细胞，并且将所述CAR-T细胞施用至所述患者，像在美国批准的Kymriah(商品名)和Yescarta(商品名)。然而，此方法由于细胞培养和病毒载体制备等的成本而存在生产成本高的问题。如果可以将CAR和外源性TCR选择性地引入体内的免疫细胞(诸如T细胞等)，则离体制备变得不必要，并且可以提供生产成本低的CAR-或TCR-免疫细胞疗法。同样，即使在离体中，如果在不使用生产成本高的病毒载体的情况下，也可以将CAR和外源性TCR选择性地引入免疫细胞(诸如T细胞等)，则残留病毒测试等成本变得不必要，并且可以提供生产成本低的CAR-或TCR-免疫细胞疗法。
然而，由于免疫细胞(诸如T细胞等)的细胞分裂次数少，并且是漂浮细胞，因此已知与其他细胞相比转染效率低。因此，需要一种用于将核酸等引入免疫细胞的更有效的方法。迄今为止，还没有关于通过使用声孔效应将编码CAR或外源性TCR的核酸(例如，mRNA、DNA)选择性地引入免疫细胞(诸如T细胞等)的报道。
[文献列表]
[专利文献]
专利文献1：WO 2012/153635
专利文献2：WO 2015/182647
[非专利文献]
非专利文献1：YAKUGAKU ZASSHI 130(11)1489-1496(2010)
非专利文献2：NATURE REVIEWS 12 161-174(2016)
非专利文献3：Drug Delivery 24(1)320-327(2017)
非专利文献4：“Evaluation of pharmacokinetics in the brain byultrasound-responsive nano-bubbles in brain-directed DDS”,Yuki Fuchigami等人,Nagasaki University,Abstracts of the 137th Annual Meeting of thePharmaceutical Society of Japan(2017年3月)
[发明内容]
[技术问题]
本发明的目的是提供一种用于将诸如核酸、蛋白质等靶物质安全且有效地引入免疫细胞(诸如T细胞等)的新颖方法。
[问题的解决方案]
为了实现上文提及的目的，本发明的诸位发明人注意到这样的事实，即本发明的诸位发明人先前开发的具有优异抗菌作用的纳米气泡水(参见上文提及的专利文献2；由于国际标准化组织(ISO)将小于1μm(1000nm)的气泡定义为“超细气泡”(ISO20480-1)，在本说明书中在下文它们被称为“超细气泡”而不是“纳米气泡”)不含磷脂。在此超细气泡水中所含的超细气泡的平均直径不大于200nm，这比常规直径小。通常，认为当破碎时，与微气泡相比，超细气泡对细胞膜的破坏更严重。然而，本发明的诸位发明人敢于将此超细气泡水与超声辐照组合，并且研究将核酸和蛋白质引入T细胞。因此，已出乎意料地显示，超细气泡水可以显著提高通过声孔效应引入核酸的效率，并且在蛋白质引入中，与仅用其中任一种处理相比，超细气泡水和超声的组合可以明显提高引入效率。
基于这些发现，本发明的诸位发明人已经进一步研究并且完成了本发明。
也就是说，本发明涉及
[1]一种用于将靶物质递送至免疫细胞的系统，所述系统包含含有平均直径不大于200nm且不含磷脂的超细气泡的超细气泡水或超细气泡水溶液和超声发生器的组合；
[2]根据[1]所述的系统，其中所述超细气泡水溶液包含选自一种或多种的表面活性剂、亲水性树脂和缓冲液的一种或多种组分，所述一种或多种的表面活性剂选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂；
[3]根据[1]或[2]所述的系统，其中所述超细气泡水溶液由非离子表面活性剂和/或亲水性树脂组成；
[3-1]根据[1]或[2]所述的系统，其中所述超细气泡水溶液由离子表面活性剂和/或亲水性树脂组成；
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的系统，其中所述超细气泡由全氟代烃或空气构成；
[5]根据[1]至[4]中任一项所述的系统，其中所述超细气泡具有50nm-200nm的平均直径；
[6]根据[1]至[5]中任一项所述的系统，其中所述超细气泡具有不大于5的d90/d10比；
[7]根据[1]至[6]中任一项所述的系统，其中在所述超细气泡水或超细气泡水溶液中的所述超细气泡具有不小于1.0×108个气泡/mL的密度；
[8]根据[1]至[7]中任一项所述的系统，其中在所述超声发生器中的超声输出强度不大于720mW/cm2；
[9]根据[1]至[8]中任一项所述的系统，其中在所述超声发生器中，超声输出强度是50-500mW/cm2并且超声频率是0.5-10MHz；
[10]根据[1]至[9]中任一项所述的系统，其中所述靶物质是核酸或蛋白质；
[11]根据[10]所述的系统，其中所述核酸编码嵌合抗原受体或外源性T细胞受体；
[12]根据[1]至[11]中任一项所述的系统，其中所述免疫细胞是T细胞；
[13]根据[11]或[12]所述的系统，用于将核酸递送至免疫细胞；
[14]一种用于增加核酸或蛋白质至免疫细胞的递送的方法，所述方法通过使用包含平均直径不大于200nm且不含磷脂的超细气泡的超细气泡水或超细气泡水溶液和超声；
[15]一种制剂，所述制剂包含核酸或蛋白质和超细气泡水或超细气泡水溶液的组合，所述超细气泡水或超细气泡水溶液包含平均直径不大于200nm且不含磷脂的超细气泡，用于将所述核酸或蛋白质递送至免疫细胞，其中通过与超声辐照组合使用将有效量的所述核酸或蛋白质递送至所述免疫细胞；
[16]一种用于将核酸或蛋白质递送至免疫细胞的方法，所述方法通过使所述细胞与根据[15]所述的制剂接触，并且将它们用超声处理；
等。
[发明的有益效果]
根据本发明的用于将靶物质递送至免疫细胞的系统，通过以不会对活体产生不利影响的输出强度辐照超声，可以将靶物质(诸如核酸、蛋白质等)无创且选择性地引入免疫细胞(诸如T细胞等)。因此，可以提供高度安全的引入系统。在所述系统中，由于不需要使用脂质体，因此不需要添加特殊添加剂(诸如磷脂)，可以实现低成本生产，并且不会出现由磷脂引起的抗原性问题。
通常，认为当破碎时，与微气泡相比，超细气泡对细胞膜的破坏更严重，并且因此不适用于细胞转染。出乎意料地，根据本发明，与使用微气泡的情况相比，使用超细气泡可以显著提高靶物质向细胞的引入效率。
此外，在超细气泡水或超细气泡水溶液中，具有不大于200nm的平均直径的超细气泡是长期稳定的。
[附图说明]
图1显示通过组合超细气泡水溶液与超声提高了质粒向T细胞的引入效率。垂直轴线示出了每个存活细胞的GFP荧光强度。US(超声辐照)：-(无)，+(有)；气泡(超细气泡)：Cat(正电荷)，An(负电荷)，-(无)
图2显示通过组合超细气泡水溶液与超声提高了蛋白质向T细胞的引入效率。垂直轴线示出了每个存活细胞的GFP荧光强度。US(超声辐照)：-(无)，+(有)；气泡(超细气泡)：Cat(正电荷)，An(负电荷)，-(无)
(具体实施方式)
I.本发明的系统
本发明提供了用于将靶物质递送至免疫细胞的系统，所述系统包含含有平均直径不大于200nm且不含磷脂的超细气泡的超细气泡水或超细气泡水溶液和超声发生器的组合(在下文也将被称为“本发明的系统”)。
在本说明书中，“将靶物质递送至免疫细胞”意指原本难以穿过细胞膜的物质(例如，可溶于水且不会被动扩散的化合物、具有大分子量的化合物、不含选择性转运蛋白或受体的化合物)穿过细胞膜并且被转移到细胞中。因此，本发明的系统可以通过任何机制将靶物质递送至细胞，并且所述机制的例子包括但不限于暂时打开细胞膜中的孔。
在本说明书中，“免疫细胞”意指参与免疫反应的细胞，并且例子包括淋巴细胞诸如T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞等，粒细胞诸如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等，单核细胞，巨噬细胞，树突细胞等，以及能够最终分化成它们的单能或多能干细胞或祖细胞(不包括胚胎和其他全能或多能干细胞)。“免疫细胞”可以是分离的特定免疫细胞或包括多种类型的免疫细胞(诸如淋巴细胞)的非均匀细胞群体，只要它是含有任何上文提及的细胞的细胞群体即可。
以上提及的淋巴细胞可以通过从例如人或非人哺乳动物的外周血、骨髓和脐带血收集产生，或者通过本身已知的方法从干细胞(诸如iPS细胞等)分化产生。当将已经通过应用本发明引入靶物质的分离的免疫细胞(例如，T细胞)用于治疗疾病(诸如癌症等)时，优选从将治疗的受试者自身或与将治疗的受试者的MHC类型匹配的供体收集细胞。可替代地，淋巴细胞可以是单个动物中存在的细胞。
在一个优选的实施方案中，“免疫细胞”是分离且纯化的T细胞。在另一个优选的实施方案中，免疫细胞可以是含有T细胞(例如，在单个动物中存在的T细胞等)的细胞群体。
在本说明书中，“T细胞”意指在淋巴器官或外周血等中发现的白细胞类型以及特征在于主要在胸腺中分化和成熟并且表达TCR的一类淋巴细胞。可用于本发明的各种实施方案中的T细胞的例子包括作为CD8阳性细胞的细胞毒性T细胞(CTL)、作为CD4阳性细胞的辅助性T细胞、调节性T细胞、效应T细胞等，并且优选细胞毒性T细胞。
将通过本发明的系统递送至免疫细胞的靶物质没有特别限制，只要它是由于递送至免疫细胞而能够赋予细胞优选的生理活性的物质即可。其例子包括但不限于聚合物化合物[例如，核酸，小RNA/DNA诸如siRNA(例如，FAM-siRNA，由NIPPON GENE CO.,LTD.制造)、ssRNA、shRNA、miRNA、S-寡DNA(硫代磷酸酯)等)、基因(例如，质粒DNA、mRNA等)等、蛋白质(也包括肽)(例如，抗体(例如，IgG(例如，Alexa-IgG，由Invitrogen制造))等)、多糖(例如，右旋糖酐、异硫氰酸荧光素右旋糖酐等)等]、低分子量化合物(例如，荧光素、荧光素钠等)等。其中，可以优选提及聚合物化合物和低分子量化合物。它们进一步优选地是聚合物化合物。它们进一步优选地是核酸和蛋白质。它们特别优选地是核酸和抗体。
在本说明书中，“超细气泡”可以含有具有一般大气压或高于一般大气压的压力的气体，并且超细气泡的内部可以是真空。如本文所用，“真空”意指用压力低于正常大气压的气体填充的空间状态。
在本发明中，“不含磷脂的超细气泡”是指气泡的外壳不形成磷脂双分子层结构的超细气泡。
在本发明中，“超细气泡水”是指含有超细气泡的水。
在本发明中，“超细气泡水溶液”是指含有超细气泡的水溶液。构成超细气泡水溶液的水溶液含有例如选自以下的一种或多种的物质：
1)选自以下的一种或多种的表面活性剂：阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂，
2)亲水性树脂以及
3)缓冲液
作为组分。
本发明中的“阴离子表面活性剂”的例子包括月桂基硫酸钠等。
本发明中的“非离子表面活性剂”的例子包括甘油脂肪酸酯(例如，甘油单硬脂酸酯等)、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如，脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、脱水山梨糖醇单月桂酸酯等)、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯(氢化)蓖麻油、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如，脱水山梨糖醇聚氧乙烯月桂酸酯(例如，聚山梨醇酯20等)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇油酸酯(例如，聚山梨醇酯80等)等)、聚乙二醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基醚(例如，聚氧乙烯月桂基醚等)、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚(例如，聚氧乙烯聚氧丙烯鲸蜡基醚等)、聚氧乙烯烷基苯基醚(例如，聚氧乙烯壬基苯基醚等)、聚乙二醇(macrogol)、聚氧乙烯聚氧丙烯二醇(例如，泊洛沙姆407、泊洛沙姆235、泊洛沙姆188、泊洛沙胺(poloxamine)等)等。其中，优选聚氧乙烯脱水山梨糖醇月桂酸酯(例如，聚山梨醇酯20等)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇油酸酯(例如，聚山梨醇酯80等)。进一步优选聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80，并且特别优选聚山梨醇酯80。
本发明中的“阳离子表面活性剂”的例子包括苯扎氯胺、苄索氯铵、西吡氯铵、十六烷基三甲基溴化铵、地喹氯铵等。
本发明中的“两性表面活性剂”的例子包括椰油酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱等。
可以单独使用上文提及的表面活性剂，或者可以组合使用其两种或更多种。
本发明中的“亲水性树脂”的例子包括丙烯酸树脂(例如，聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯)、乙烯基树脂(例如，聚乙烯吡咯烷酮、聚(乙烯醇)(PVA)、聚乙烯基乙醚)；多糖(例如，黄芪胶、卡拉亚胶(caraya gum)、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、透明质酸、琼脂糖、凝结多糖等)。其中，优选聚(乙烯醇)、羟丙基纤维素。它更优选地是聚(乙烯醇)。
可以单独使用上文提及的亲水性树脂，或者可以组合使用其两种或更多种。
本发明中的“缓冲液”的例子包括酸性缓冲液(例如，乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、稀释的Mclivaine缓冲液)、中性缓冲液(例如，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液、磷酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲盐水(PBS))。作为缓冲液，优选稀释的Mclivaine缓冲液。
作为构成本发明中的“超细气泡水溶液”的水溶液优选地是由以下构成的水溶液等：1)选自以下的一种或多种的表面活性剂：阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂；和/或2)亲水性树脂。其中，例如，优选由非离子表面活性剂和/或亲水性树脂构成的水溶液等。此外，还优选由非离子表面活性剂构成的水溶液等。进一步优选由1)选自聚山梨醇酯80和聚山梨醇酯20的一种或两种和/或2)聚(乙烯醇)构成的水溶液等。进一步优选由聚山梨醇酯80和/或聚(乙烯醇)构成的水溶液等。特别优选由聚山梨醇酯80构成的水溶液。
在另一个优选的实施方案中，作为构成“超细气泡水溶液”的水溶液，例如，可以提及由离子(阴离子或阳离子)表面活性剂和/或亲水性树脂构成的水溶液。
构成本发明中的超细气泡的“气体”的例子包括但不限于选自全氟代烃(例如，全氟丙烷(C3F8)、全氟丁烷等)、空气、氮气、臭氧、氧气、氩气、二氧化碳和氦气等的一种或者两种或更多种的混合物。其中，优选全氟代烃(例如，全氟丙烷、全氟丁烷等)、空气、氮气、臭氧、氧气、氩气。更优选全氟代烃(例如，全氟丙烷、全氟丁烷等)、空气。当使用空气时，可以以低成本容易地产生超细气泡。进一步优选空气。
本发明中的“超细气泡水溶液”优选地是由以下构成的超细气泡水溶液：(A)由非离子表面活性剂和/或亲水性树脂构成的水溶液和(B)由选自全氟代烃、空气等的一种或多种的气体构成的超细气泡。进一步优选由以下构成的超细气泡水溶液：(A)由1)选自聚山梨醇酯80和聚山梨醇酯20的一种或两种和/或2)聚(乙烯醇)构成的水溶液和(B)由选自全氟代烃和空气的一种或多种的气体构成的超细气泡。进一步优选由以下构成的超细气泡水溶液：(A)由聚山梨醇酯80和/或聚(乙烯醇)构成的水溶液和(B)由全氟代烃和/或空气构成的超细气泡。特别优选由以下构成的超细气泡水溶液：聚山梨醇酯80和由空气构成的超细气泡。
本发明中的“超细气泡”不含两亲性磷脂(诸如脂质体等)。因此，可以提供不显示抗原性的更安全的制剂。
本发明中的“超细气泡”具有约不大于200nm的平均直径。平均直径优选地是10nm-200nm，进一步优选地是50nm-200nm，更优选地是100nm-180nm。
本说明书中的“平均直径”意指与最频繁的分布值(个数％的最大值)对应的粒度(众数直径)。
在本说明书中，“超细气泡水”或“超细气泡水溶液”意指具有不大于1000nm的直径的气体粒子(超细气泡)稳定存在的水或水溶液。本发明中的超细气泡水或超细气泡水溶液(在下文也将被称为“本发明中的超细气泡水等”)典型地含有平均直径不大于约200nm的超细气泡。
在本发明中，超细气泡理想地具有均一的尺寸。例如，当与距离基于超细气泡数的分布的小直径侧的累积10％和累积90％对应的超细气泡直径分别是d10和d90时，“d90/d10比”优选不大于5，进一步优选不大于4.5。
在本发明中，超细气泡水等中所含的超细气泡数意指在1mL的超细气泡水或超细气泡水溶液中存在的超细气泡的数目，其在本说明书中有时将被称为“超细气泡密度”。本发明中的超细气泡水等中所含的超细气泡数没有特别限制。“超细气泡密度”的下限是例如不小于1.0×108个气泡/mL，优选不小于2.0×108个气泡/mL，更优选不小于2.5×108个气泡/mL。“超细气泡密度”的上限是例如不大于2.0×109个气泡/mL，优选不大于1.0×109个气泡/mL。本发明中的“超细气泡密度”是例如1.0×108-2.0×109个气泡/mL，优选2.0×108-1.0×109个气泡/mL，进一步优选2.5×108-1.0×109个气泡/mL。
超细气泡直径(包括超细气泡平均直径，下文同)、基于超细气泡数的分布(包括d90/d10比，下文同)和超细气泡数可以通过以下方法测量：基于布朗运动使用激光束散射的方法(例如，NanoSight Ltd，LM20、LM10等)、基于电阻变化的方法(例如，BeckmanCoulter，Multisizer4等)、基于激光衍射散射法的方法(例如，Shimadzu Corporation，SALD-7100H等)、使用米氏散射的方法(例如，NIPPON DENSHOKU INDUSTRIES CO.,LTD.，NP-500T等)等。本发明中使用的超细气泡直径和基于超细气泡数的分布是通过使用由NanoSight Ltd.制造的NanoSight(仪器名称LM10)的激光束散射的追踪方法(追踪方法)或根据所述方法测量的那些。
超细气泡直径、基于超细气泡数的分布和超细气泡数通常可以在超细气泡水等产生后立即测量，或者在长期储存后测量。本发明中的超细气泡水等的超细气泡直径、基于超细气泡数的分布和超细气泡数在极长的时间(例如，约6个月至2年)内稳定保持，并且因此，超细气泡直径、基于超细气泡数的分布和超细气泡数可以在超细气泡水产生后密封储存一定时间后在使用前立即测量。
在本说明书中，含有超细气泡的“水”(以及用作含有超细气泡的“水溶液”的“水”)没有特别限制，并且例如，可以使用自来水、去离子水、蒸馏水、无菌蒸馏水、注射用纯净水、超纯水等。对于注射用途，优选无菌蒸馏水、注射用纯净水等。
本说明书中的含有超细气泡的“水溶液”的例子包括含有一种或多种以上提及的选自一种或多种的表面活性剂(所述表面活性剂选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂)、亲水性树脂和缓冲剂的组分并且进一步含有例如药物制剂领域中常用的任何添加剂的水。“添加剂”的例子包括电解质、赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、增溶剂、助悬剂、分散剂、等渗剂、安抚剂(soothing agent)、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、pH调节剂、稳定剂、酸化剂、调味剂、流化剂等。优选药理学上可接受的添加剂。更优选使用选自助悬剂、稳定剂、分散剂、等渗剂等的一种或多种的添加剂。
可以以适当比率在混合物中使用上文提及的添加剂中的两种或更多种。
这些添加剂(包括选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂的一种或多种的表面活性剂、亲水性树脂和缓冲剂)也可以直接溶解于水中以制备超细气泡水溶液，只要它们不影响超细气泡的产生、稳定性等即可；或者在不含添加剂的水中产生超细气泡以得到超细气泡水，并且当使用时将添加剂溶解以得到超细气泡水溶液。
作为水溶液，可以使用不带电的超细气泡水溶液、带正电的超细气泡水溶液和带负电的超细气泡水溶液中的任一种。它们可以根据靶免疫细胞的种类、它们的周围微环境或靶物质的种类等正确选择。在本发明的用于通过使用超细气泡水溶液和超声将靶物质递送至免疫细胞的方法中，在一些情况下，例如，当靶物质是聚合物化合物(例如，核酸、蛋白质等)时，超细气泡水溶液优选地是带负电的超细气泡水溶液。在另一个实施方案中，在本发明的用于通过使用超细气泡水溶液和超声将靶物质递送至免疫细胞的方法中，在一些情况下，当靶物质是聚合物化合物时，超细气泡水溶液优选地是带正电的超细气泡水溶液。
超细气泡水溶液的电荷可以通过例如将使用的缓冲液的pH适当调整。例如，为了使超细气泡水溶液带正电，超细气泡水溶液的pH优选地是1-4。另一方面，为了使超细气泡水溶液带负电，超细气泡水溶液的pH优选地是7-14。
超细气泡水的产生方法大致分为以下方法：包括在水中同时产生微气泡(具有约1-60μm的直径的气体粒子)和超细气泡，并且将微气泡浮选分离以仅留下超细气泡的方法；以及包括直接产生超细气泡的方法，并且前者是目前的主流。前一种方法包括高速旋流型，其中将气体通过高速旋流破碎以产生大量微气泡，并且将微气泡浮选分离以将超细气泡留在水中；加压溶解型，其中将气体加压至过饱和溶解，将溶液快速减压以产生微气泡和超细气泡，将微气泡浮选分离以将超细气泡留在水中；等。超细气泡水溶液的产生方法与上文提及的相同。
加压溶解型优选用作用于产生本发明中的超细气泡水或超细气泡水溶液的方法。例如，可以提及以下步骤1)至3)；1)在通过加压泵加压至约0.2至0.5MPa的加压容器中，将气体强制溶解于这样的液体中，其中有(i)选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂的一种或多种的表面活性剂，(ii)亲水性树脂和/或(iii)缓冲溶液；2)通过喷嘴进行在水中的闪蒸操作以将减压且过饱和的气体以微气泡或超细气泡释放到废水中，从而产生微气泡水和超细气泡水的混合物；3)停止曝气，并且将混合物静置以允许微泡通过漂浮自然分离。因此，产生了在其中仅剩超细气泡的澄清超细气泡水。
用于产生本发明中的超细气泡水或超细气泡水溶液的超细气泡发生器的例子包括加压溶解型装置(例如，由IDEC制造的nanoGALFTM、由AURA TEC CO.,LTD.制造的OM4-MD5-045、由Nikuni Corporation制造的微气泡发生器等)、高速旋流型装置(例如，由Bi-clean制造的YJ、由AQUA AIR制造的微气泡发生器、由ROYAL ELECTRIC CO.,LTD.制造的MICROBLADE等)等。作为超细气泡发生器，优选加压溶解型装置(例如，由IDEC制造的nanoGALFTM)。
在本发明中，将选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂的一种或多种的表面活性剂、亲水性树脂和/或缓冲溶液用于产生超细气泡水或超细气泡水溶液，从而可以增加在上文提及的超细气泡水或超细气泡水溶液中的超细气泡数。
本发明中使用的选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂的一种或多种的表面活性剂、亲水性树脂和/或缓冲溶液在水中的含量没有特别限制。上限优选不大于50％(W/V)，更优选不大于20％(W/V)，进一步优选不大于10％(W/V)。下限优选不小于0.01％(W/V)，更优选不小于0.05％(W/V)，进一步优选不小于0.1％(W/V)。如本文所用，(W/V)意指g/mL。
当两种或更多种的表面活性剂、亲水性树脂和缓冲溶液组合使用时，其总量即是水中的含量。
将如上文提及产生的本发明中的超细气泡水等紧紧密封在小瓶或安瓿中并且保存。优选在遮荫条件下进行保存。保存温度优选不大于室温，并且更优选的是不大于10℃。
本发明中的超细气泡水或超细气泡水溶液优选在选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂的一种或多种的表面活性剂、亲水性树脂和/或缓冲溶液的存在下产生。因此，可以将超细气泡水等中的超细气泡数维持在不小于1.0×108个气泡/mL持续需要维持本发明中的超细气泡水等的作用效果(例如，当超细气泡水等和超声处理组合使用时对免疫细胞的细胞膜穿孔效果、通过使用超细气泡水等和超声增加靶物质至免疫细胞的递送的效果等)的一段时间(例如，当用作需要将通过细胞膜等递送的靶物质的基质时，持续其有效期(例如，不小于3个月，更优选不小于6个月，进一步优选不小于一年))。
本发明中的超细气泡水等可以通过加热灭菌，并且即使加热灭菌后，超细气泡数也可以维持在不小于1.0×108个气泡/mL。
当本发明中的超细气泡水等中的超细气泡数不小于1.0×108个气泡/mL时，展现优异的抗菌作用和保存效果。因此，它们也可用作多次施用类型的液体药物制剂的基质，所述液体药物制剂在某一时间段内从相同容器重复施用，例如注射(例如，皮下注射、静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、滴注输注、脑内注射、脑脊液内注射、眼内注射等)。
本发明中的超细气泡水等优选在选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂的一种或多种的表面活性剂(优选聚山梨醇酯80和/或聚山梨醇酯20，进一步优选聚山梨醇酯80)的存在下产生，并且在产生的超细气泡水等中的超细气泡具有更小的平均直径和更均一的尺寸(即，d90/d10比小)。因此，在本发明的系统中获得了将靶物质递送至免疫细胞的更安全的效果。
作为本发明的系统中使用的“超声发生器”，可以使用任一种，只要当与本发明中的超细气泡水等组合使用时，它可以产生满足足以将靶物质递送至免疫细胞的条件的超声波即可。例如，可以适当使用在临床环境中通常用于超声诊断的任何装置、可商购的超声基因转移装置(例如，Sonitron GTS(由Nepa Gene Co.,Ltd.制造)等)等。
本发明中的“超声发生器”的条件包括例如超声输出强度(在单位时间内穿过垂直于声波行进方向的单位面积(cm2)的声能)不小于10mW，优选不小于30mW，更优选不小于50mW。没有特别设置输出强度的上限。特别地，当本发明的系统旨在体内转染至哺乳动物(包括人)的免疫细胞时，优选将不会对动物产生不利影响(例如，细胞毒性)的范围作为上限。例如，修订的药事法的第三方认证标准(2005)增加了“不超过720mW/cm2”的要求(与美国FDA的Track 3的上限相同)，并且控制日本的超声诊断装置以便不超过所述上限。因此，本发明的系统中的超声输出强度的上限优选地是720mW/cm2。超声输出强度优选地是50-720mW/cm2，进一步优选地是50-500mW/cm2。用于常规基因转移的超声输出强度显著高于上文提及的用于超声诊断应用的标准(例如，1.5-2.5W/cm2)，因此存在很高的安全性风险。在本发明的系统中，无论靶物质的分子量如何，都可以以小的输出强度(优选50-500mW/cm2)将靶物质有效地递送至免疫细胞，并且它是一种非常安全的递送系统。
作为本发明中的“超声发生器”的条件，超声频率没有特别限制，并且可以适当选择，例如在0.5-10MHz的范围内。目前广泛采用的频率是约1MHz。然而，由于认为较高的频率对身体的不利影响较小，因此可以在1至5MHz、更优选1至3MHz的范围内适当选择频率。
作为使用本发明中的“超声发生器”的条件，超声辐照时间没有特别限制，只要足以将靶物质递送至免疫细胞即可，并且根据超声输出强度变化。例如，即使当输出强度是50mW/cm2时，也可以通过10秒的辐照时间实现靶物质至免疫细胞的递送。超声辐照时间可以是例如1至60秒，优选1至30秒，更优选1至20秒。
作为使用本发明中的“超声发生器”的条件，例如，可以提及(i)50至720mW/cm2(优选50至500mW/cm2)的超声输出强度、(ii)0.5至10MHz的超声频率和(iii)1至60秒的超声辐照时间的组合。其中，优选(i)50至500mW/cm2的超声输出强度、(ii)1至5MHz的超声频率和(iii)1至60秒的超声辐照时间等的组合。
当将本发明的系统用于从动物分离的免疫细胞或通过经由本身已知的方法诱导干细胞(诸如iPS细胞等)的分化而获得的免疫细胞的转染时，它可以包括在转染处理后培养免疫细胞的步骤。因此，本发明的系统可以进一步包括用于培养免疫细胞的工具(例如，培养容器(例如，皿、烧瓶等)、培养基、培养装置(例如，CO2培养箱等))。由于免疫细胞在漂浮状态下增殖，因此优选包被有非粘附性或低粘附性基质的培养容器。上文提及的培养步骤还包括传代培养步骤。当将细胞通过本发明的系统进行传代培养时，可以维持引入细胞的靶物质的表达强度。
II.本发明的增加递送方法
本发明还提供了用于增加核酸或蛋白质至免疫细胞的递送的方法，所述方法通过使用含有平均直径不大于200nm且不含磷脂的超细气泡的超细气泡水或超细气泡水溶液和超声(在下文也将被称为“本发明的增加递送方法”)。所述方法包括将本发明中的超细气泡水等施用至受试者以将其递送至免疫细胞附近，并且对免疫细胞进行超声辐照，从而将核酸或蛋白质递送至免疫细胞。如本文所用，“免疫细胞”的含义与针对上文提及的本发明的系统所定义的相同。
作为将在“本发明的增加递送方法”中使用的超细气泡水或超细气泡水溶液，可以使用上文提及的本发明中的超细气泡水等。“本发明的增加递送方法”中的超声辐照可以在与上文提及的本发明的系统中的超声发生器的使用的条件类似的条件下进行。
通过本发明的增加递送方法增加至免疫细胞的递送的核酸或蛋白质没有特别限制，并且可以是例如由于递送至免疫细胞而能够赋予免疫细胞优选的生理活性的物质。核酸的例子包括但不限于小RNA/DNA诸如siRNA(例如，FAM-siRNA，由NIPPON GENE CO.,LTD.制造)、ssRNA、shRNA、miRNA、S-寡DNA(硫代磷酸酯)等)、基因(例如，质粒DNA、mRNA等)等。蛋白质的例子包括抗体(例如，IgG(例如，Alexa-IgG，由Invitrogen Corp.制造)等)、肽等。其中，优选编码嵌合抗原受体(CAR)或外源性T细胞受体(TCR)等的核酸作为核酸，并且优选抗体等作为蛋白质。
核酸中的核苷酸数和蛋白质的分子量没有特别限制。例如，当核酸是小RNA/DNA(诸如siRNA、反义寡核酸等)时，它是10mer-30mer，优选15mer-25mer，并且当核酸是编码CAR或TCR(质粒DNA)的核酸时，它是1-10kb，优选2-8kb。在蛋白质的情况下，它是25kDa-900kDa，优选25kDa-320kDa。
在一个优选的实施方案中，核酸是编码CAR或外源性TCR的核酸。以下详细描述了编码CAR或外源性TCR的核酸。
(a)编码CAR的核酸
CAR是一种人工构建的杂合蛋白，其含有抗体的与T细胞信号转导结构域连接的抗原结合结构域(例如，scFv)。CAR的特征是能够通过使用其单克隆抗体的抗原结合特性以非MHC限制性方式将T细胞的特异性和反应性转化至选定的靶标。非MHC限制性抗原识别赋予表达CAR的T细胞独立于抗原加工的识别抗原的能力，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞中表达时，CAR不会有利地与内源性TCRα链和β链二聚化。
本发明中使用的CAR包括抗体的可特异性识别将被靶免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞等)识别的表面抗原(例如，癌抗原肽、在癌细胞中上调的表面受体等)的抗原结合结构域；细胞外铰链结构域；跨膜结构域和细胞内T细胞信号转导结构域。
被抗原结合结构域特异性识别的表面抗原的例子包括但不限于在各种癌(例如，急性淋巴细胞癌症、腺泡状横纹肌肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌(例如，髓母细胞瘤)、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性髓细胞性癌症、结直肠癌、食管癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠道类癌瘤、头颈癌(例如，头颈部鳞状细胞癌)、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病(例如，急性淋巴母细胞性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病)、液体瘤、肝癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤)、恶性间皮瘤、肥大细胞瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌；腹膜癌、视网膜癌和肠系膜癌；咽喉癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌症、实体肿瘤、胃癌、睾丸肿瘤、甲状腺癌、输尿管癌等)中上调的表面受体，例如CD19、EGF受体、BCMA、CD30、Her2、ROR1、MUC16、CD20、间皮素、B细胞突变抗原(BCMA)、CD123、CD3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD33、MUC-1、CD138、CD22、GD2、PD-L1、CEA、硫酸软骨素蛋白聚糖-4、IL-13受体α链、IgGκ轻链等；癌抗原肽(例如，源自WT1、GPC3、MART-1、gp100、NY-ESO-1、MAGE-A4等的肽)等。
将在本发明中使用的抗原结合结构域没有特别限制，只要它是可以特异性识别靶抗原的抗体片段即可。考虑到易于CAR生产，希望使用单链抗体(scFv)，其中经由接头肽连接轻链可变区和重链可变区。单链抗体中的轻链可变区和重链可变区的排列没有特别限制，只要二者可以重构功能性抗原结合结构域即可。它们可以按轻链可变区-接头肽-重链可变区(从N末端侧起)的顺序设计。作为接头肽，可以使用本身已知并且通常用于产生单链抗体的接头肽。编码轻链可变区的DNA和编码重链可变区的DNA可以例如通过克隆来自抗体生产细胞的轻链基因和重链基因，并且通过使用它们作为模板进行PCR来制备，或者从现有抗体的序列信息通过化学合成它们来制备。编码单链抗体的DNA可以通过经由适当的方法连接每个获得的DNA片段和编码接头肽的DNA来获得。为了在免疫细胞表面呈递CAR，优选将前导序列进一步添加到抗原结合结构域的N末端侧中。
作为细胞外铰链结构域和跨膜结构域，可以适当使用本领域通常使用的源自T细胞表面分子的结构域，并且其例子包括但不限于源自CD8α和CD28的相应结构域。
细胞内信号转导结构域的例子包括但不限于具有CD3ζ链的那些、在跨膜结构域与CD3ζ链之间进一步具有共刺激转导基序(诸如CD28、CD134、CD137、Lck、DAP10、ICOS、4-1BB等)的那些、具有两个或更多个共刺激转导基序的那些等。可以组合使用本领域通常使用的任何结构域。
编码细胞外铰链结构域、跨膜结构域和细胞内信号转导结构域的核酸序列的信息是本领域熟知的，并且本领域普通技术人员可以基于所述信息容易地从T细胞获得编码相应结构域的DNA片段。
可以通过连接如此获得的分别编码抗原结合结构域、细胞外铰链结构域、跨膜结构域和细胞内信号转导结构域的DNA片段来获得编码CAR的DNA。
可以将如此获得的编码CAR的DNA直接或在添加合适的接头和/或核转移信号等后插入表达载体(优选质粒载体)中，所述表达载体含有在T细胞中起作用的启动子。作为在T细胞中起作用的启动子，可以使用在哺乳动物细胞中是组成型的SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV(巨细胞病毒)启动子、RSV(劳斯肉瘤病毒)启动子、MoMuLV(莫洛尼小鼠白血病病毒)LTR、HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)启动子等，但是不限于这些。此外，也可以使用在T细胞中特异性表达的基因启动子，诸如CD3、CD4、CD8等。
编码CAR的RNA(优选mRNA)可以通过使用含有以上提及的编码CAR的DNA作为模板的表达载体，通过本身已知的体外转录系统转录成mRNA来制备。
(b)编码外源性TCR的核酸
在本说明书中，“T细胞受体(TCR)”意指这样的受体，其由TCR链(α链、β链)的二聚体构成，识别抗原或抗原-HLA(人白细胞型抗原)(MHC；主要组织相容性复合体)复合体，并且将刺激信号传递至T细胞。每条TCR链由可变区和恒定区构成，并且可变区具有三个互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3)。本发明中使用的TCR不仅包括TCR的α链和β链形成异二聚体的那些，还包括它们形成同二聚体的那些。此外，TCR包括缺少部分或全部恒定区的那些、具有重组氨基酸序列的那些、具有可溶性TCR的那些等。
“外源性TCR”意指它对于作为本发明中的靶细胞的T细胞而言是外源性的。外源性TCR的氨基酸序列可以与通过作为本发明中的靶细胞的T细胞所表达的内源性TCR相同或不同。
编码本发明中使用的TCR的核酸是编码TCR的α链和β链的核酸，所述TCR可以特异性识别将被靶T细胞识别的表面抗原(例如，癌抗原肽等)。
核酸可以通过本身已知的方法制备。当靶TCR的氨基酸序列或核酸序列已知时，例如，可以通过基于所述序列化学合成DNA链或RNA链，或者通过使用PCR方法或Gibson组装方法连接合成的部分重叠的短寡DNA链来构建编码本发明的TCR的全长或部分的DNA。
当靶TCR的序列未知时，例如，从含有表达靶TCR的T细胞的细胞群体分离靶T细胞，并且可以从此T细胞获得编码TCR的核酸。具体来说，从活体(例如，人)收集含有T细胞的细胞群体(例如，PBMC)，并且将其在由靶TCR识别的细胞表面抗原的表位的存在下的刺激下培养，并且可以通过使用对表达细胞表面抗原的细胞的特异性并且将细胞表面抗原(诸如CD8、CD4等)作为指示符号通过已知的方法从此细胞群体中选择特异性识别表达细胞表面抗原的细胞的T细胞。T细胞对表达表面抗原的细胞的特异性可以使用例如Dextramer测定、ELISPOT测定、细胞毒性测定等来测量。优选从例如具有许多表达由靶TCR识别的细胞表面抗原的细胞的活体(例如，患有疾病(诸如癌症等)的患者、或与抗原表位接触的含T细胞群体或用表位脉冲的树突细胞)收集以上提及的含有T细胞的细胞群体。
通过以下方式获得本发明的核酸：通过常规方法从以上提及的分离的T细胞中提取DNA，并且通过使用DNA作为模板，基于TCR恒定区的核酸序列扩增并克隆TCR基因。此外，它也可以通过以下方式来制备：通过常规方法从细胞中提取RNA，合成cDNA，并且通过使用cDNA作为模板并使用与编码TCRα链和β链恒定区的核酸互补的反义引物进行5'-RACE(cDNA端快速扩增)。5'-RACE可以通过已知的方法进行，并且可以例如通过使用可商购的试剂盒(诸如SMART PCR cDNA合成试剂盒(由制造Clontech))进行。所获得的编码TCR的α链和β链的DNA可以以与以上提及的编码CAR的DNA相同的方式插入适当的表达载体中。编码α链的DNA和编码β链的DNA可以插入同一载体或分开的载体中。当将它们插入同一载体中时，表达载体可以多顺反子或单顺反子地表达两条链。在前一种情况下，将允许多顺反子表达的间插序列(诸如IRES或FMV 2A)插入编码两条链的DNA之间。
此外，编码TCR的每条链的RNA(优选mRNA)可以例如使用表达载体作为模板并且以与以上提及的编码CAR的RNA相同的方式制备。
III.本发明的制剂
本发明还提供了制剂，所述制剂包含核酸或蛋白质和超细气泡水或超细气泡水溶液的组合，所述超细气泡水或超细气泡水溶液包含平均直径不大于200nm且不含磷脂的超细气泡，用于将核酸或蛋白质递送至免疫细胞，其中通过与超声辐照组合使用将有效量(免疫细胞发挥所需效果的量)的核酸或蛋白质递送至免疫细胞(在下文也将被称为“本发明的制剂”)。如本文所用，“免疫细胞”的含义与针对上文提及的本发明的系统所定义的相同。
在本发明的制剂中，核酸或蛋白质可以是在上文提及的“本发明的增加递送方法”中例示的核酸或蛋白质。作为本发明的制剂中的超细气泡水或超细气泡水溶液，可以使用上文提及的“本发明的系统”中描述的超细气泡水或超细气泡水溶液。
在本发明的配制品中，核酸或蛋白质可以与本发明中的超细气泡水等混合，并且以单一制剂施用至受试者，或者它们可以分开配制并且通过相同或不同的途径在同一时间或不同时间施用，只要它们可以同时与免疫细胞相邻共存即可。
当核酸或蛋白质与本发明中的超细气泡水等分开配制时，可以将核酸或蛋白质与药学上可接受的载体以人或其他哺乳动物可以耐受的量混合。
药学上可接受的载体的例子包括pH调节剂，诸如磷酸一钠、磷酸二钾、磷酸二钠、磷酸一钾、氢氧化钠、盐酸等；抗生素，诸如硫酸卡那霉素、乳糖酸红霉素、青霉素G钾等；稳定剂，诸如乳糖、谷氨酸钾、D-山梨糖醇、氨基乙酸、人血清白蛋白等；着色剂，诸如酚红等；等渗剂，诸如氯化钠、氯化钾等；等。
本发明的制剂中的核酸或蛋白质的含量没有特别限制，只要当通过超声辐照将它们递送至免疫细胞时可以赋予所述细胞优选的特性(诸如所需的生理活性等)即可。例如，当本发明的制剂含有编码CAR或外源性TCR的核酸作为核酸并且施用至哺乳动物(包括人)时，将一次性施用的编码CAR或外源性TCR的核酸的量在0.001mg-10mg/1kg体重的范围内。例如，当施用至人类患者时，将它以0.001-50mg的范围施用至体重60kg的患者。上文提及的剂量是一个例子，并且剂量可以根据将使用的核酸的类型、施用途径、施用的受试者或患者的年龄、体重、症状等适当选择。另一方面，超细气泡水等的量没有特别限制，只要它通过超声辐照足以将核酸或蛋白质递送至免疫细胞即可。例如，允许递送一定量的超细气泡，使得免疫细胞附近的超细气泡密度是1×108-10×108个气泡/mL，优选2×108-5×108个气泡/mL。
IV.本发明的递送方法
本发明还提供了用于将核酸或蛋白质递送至免疫细胞的方法，所述方法包括使细胞与上文提及的本发明的制剂接触，并且将细胞用超声处理。如本文所用，“免疫细胞”的含义与针对上文提及的本发明的系统所定义的相同。
“本发明的增加递送方法”或“本发明的递送方法”所应用的靶标没有特别限制，只要它是从活体收集的免疫细胞(在本说明书中也将被称为“离体免疫细胞”)或含有其的动物组织或体内的免疫细胞(在本说明书中也将被称为“体内免疫细胞”)即可。例如，可以提及人和其他哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、马、猪、猴等)、源自它们或含有它们的组织的免疫细胞等。用于将本发明中的超细气泡水等施用至受试者的手段没有特别限制，只要它是能够将超细气泡递送至免疫细胞附近的施用途径即可。在下面，使用递送编码CAR或外源性TCR的核酸作为核酸的情况作为特定例子，分开描述了离体免疫细胞和体内免疫细胞。
(a)编码CAR或外源性TCR的核酸至离体免疫细胞的递送
根据本发明的递送方法，可以通过以下方式产生表达CAR或外源性TCR的离体免疫细胞：通过组合本发明中的超细气泡水等和超声，将编码CAR或外源性TCR的核酸递送至离体免疫细胞。因此，本发明还提供了通过所述方法获得的离体免疫细胞。此处的“免疫细胞”没有特别限制，只要它是在上文提及的本发明的系统中定义的那些中的具有通过某种作用机制破坏靶细胞(病原细胞)(诸如癌细胞等)的能力的细胞(所谓的免疫效应细胞)即可。其例子包括在获得性免疫中负责细胞免疫的T细胞，负责自然免疫的NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞等，以及作为具有NK细胞特性的T细胞的NKT细胞等。在一个优选的实施方案中，免疫细胞可以是T细胞。从活体收集的T细胞在本说明书中也被称为“离体T细胞”。另一方面，在另一个优选的实施方案中，免疫细胞可以是负责自然免疫的细胞，诸如NK细胞、巨噬细胞、树突细胞等。即使当T细胞具有相同的MHC类型时，仍存在由同种异体(allo)移植引起GVHD的相当大的风险，然而alloNK细胞等被认为不会引起GVHD。因此，当制备各种MHC类型的同种异体离体免疫细胞时，它们可以现成使用。对于CAR-NK细胞，例如，CAR-树突细胞描述于US2016/0096892、Mol Ther.25(8):1769-1781(2017)等中，并且CAR-巨噬细胞等描述于例如WO 2017/019848、eLIFE.2018e36688等中。
通过本发明的制剂引入编码CAR或外源性TCR的核酸的离体免疫细胞可以是分离且纯化的特定免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞等、NKT细胞或其干/祖细胞)或包括多种类型的免疫细胞(诸如淋巴细胞)的不均一细胞群体，只要它是含有上文提及的效应免疫细胞或能够最终分化成它们的单能或多能干细胞或祖细胞(不包括胚胎和其他全能或多能干细胞)的细胞群体即可。分离且纯化的T细胞的例子包括作为CD8阳性细胞的细胞毒性T细胞(CTL)、作为CD4阳性细胞的辅助性T细胞、调节性T细胞、效应T细胞等，并且优选细胞毒性T细胞。
以上提及的淋巴细胞可以从例如人或非人哺乳动物的外周血、骨髓和脐带血收集，或者从干细胞(诸如iPS细胞等)产生。当将已经通过本发明的制剂引入编码CAR或外源性TCR的核酸的离体免疫细胞(例如，离体T细胞)用于治疗疾病(诸如癌症等)时，优选从将治疗的受试者自身或与将治疗的受试者的MHC类型匹配的供体收集细胞群体。
能够最终分化成免疫细胞的单能或多能干细胞或其祖细胞的例子包括造血干细胞、骨髓-淋巴祖(MLP)细胞、骨髓祖(MP)细胞、粒细胞-单核细胞祖(GMP)细胞、巨噬细胞-树突细胞祖(MDP)细胞、树突细胞前体(DCP)细胞等。这些干/祖细胞可以通过本身已知的方法分化成各种免疫细胞，例如E细胞。
用于使本发明的制剂与离体免疫细胞接触的方法没有特别限制，并且例如，可以将本发明的制剂添加到免疫细胞的通用培养基中。由于免疫细胞在不粘附于培养容器的情况下以漂浮状态增殖，因此离体免疫细胞的预培养和与本发明的制剂的接触优选在包被有非粘附性或低粘附性基质的培养容器中进行。通过使用关于本发明的系统描述的超声发生器和辐照条件，可以对离体免疫细胞进行超声辐照。
当本发明的制剂特别含有编码外源性TCR的核酸作为活性成分时，从外源性TCR的表达增加、抑制错配TCR的出现或抑制自我反应性的方面来看，siRNA可以抑制原本由T细胞表达的内源性TCRα链和TCRβ链的表达。当将以上提及的核酸应用于所述方法时，为了避免siRNA对外源性TCR的影响，优选编码TCR的核酸的碱基序列与对应于RNA的碱基序列不同，抑制内源性TCRα链和TCRβ链的表达的siRNA作用于所述RNA(密码子转换型序列)。这些方法描述于例如WO 2008/153029中。以上提及的碱基序列可以通过将沉默突变引入从自然获得的编码TCR的核酸中产生，或者通过化学合成人工设计的核酸产生。可替代地，为了避免与内源性TCR链的错配，编码外源性TCR的核酸的部分或全部恒定区可以用源自人以外的动物(例如，小鼠)的恒定区代替。
(b)编码CAR或外源性TCR的核酸至体内免疫细胞的递送
根据本发明的递送方法，将本发明的制剂施用至哺乳动物(人或其他哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、犬、牛、羊、猴)，优选人)，并且将含有免疫细胞的组织或器官(例如，脾脏、胸腺等)暴露于超声，从而将核酸引入在动物体内的免疫细胞，例如T细胞(在本说明书中也将被称为“体内T细胞”)，从而可以诱导CAR或外源性TCR的表达。体内免疫细胞特异性识别表达由CAR或外源性TCR靶向的表面抗原的癌细胞等，并且杀死病变细胞，从而可以显示出对疾病的预防或治疗效果。
呈例如注射剂形式的本发明的制剂可以通过皮下注射、静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、滴注注射、脑内注射、脑脊液内注射等将核酸和超细气泡水等递送至体内免疫细胞附近。此外，可以通过常规用于超声诊断的操作，通过将靶区域替换为含有体内免疫细胞的组织或器官来进行超声辐照。
当将“本发明的增加递送方法”或“本发明的递送方法”使用本身已知的方法应用于离体免疫细胞(即，从动物分离的免疫细胞或干细胞(诸如iPS细胞等)时，可以包括在转染处理后培养免疫细胞的步骤。可以使用本身已知的培养容器(例如，皿、烧瓶等)和培养装置(例如，CO2培养箱等)在通常用于终末分化的免疫细胞的维持培养或诱导更多的未分化的干/祖细胞分化成终末分化的免疫细胞的培养基中进行培养步骤。由于免疫细胞在不粘附于培养容器的情况下以漂浮状态增殖，因此离体免疫细胞的培养优选在包被有非粘附性或低粘附性基质的培养容器中进行。此外，上文提及的培养步骤还包括传代培养步骤。当将细胞通过“本发明的增加递送方法”或“本发明的递送方法”进行传代培养时，可以维持引入细胞的靶物质的表达强度。
V.含有已经通过本发明引入靶物质的离体免疫细胞的药剂
已经使用本发明的系统或通过本发明的递送方法引入靶物质的离体免疫细胞通过靶物质的作用提供所需的效果(例如，获得新的生理活性)。因此，可以将它直接或通过与已知的药学上可接受的载体(包括赋形剂、稀释剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、表面活性剂等等)、常用的添加剂等混合而配制成药物组合物。赋形剂是本领域技术人员熟知的，并且还可以使用佐剂(诸如润湿剂或乳化剂等)和pH缓冲剂。此外，还可以使用配制佐剂(诸如助悬剂、防腐剂、稳定剂、分散剂等等)。上文提及的药物组合物可以是呈干燥形式，将在使用前用合适的无菌液体重构。药物组合物可以全身或局部口服或肠胃外施用，取决于制剂的形式(口服药剂，诸如片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂等；肠胃外药剂，诸如注射剂、滴注输注剂、外用制剂、栓剂等)等。在肠胃外施用的情况下，静脉内施用、皮内施用、皮下施用、直肠施用、经皮施用等是可能的。此外，当以注射剂形式使用时，还可以添加可接受的缓冲剂、增溶剂、等渗剂等。
例如，当靶物质是编码CAR或外源性TCR的核酸时，已经引入靶物质的离体免疫细胞可以特异性识别表达由CAR或外源性TCR特异性识别的表面抗原的细胞并且杀死它们(例如，诱导细胞凋亡)。因此，当含有编码CAR或外源性TCR(其识别在患病细胞(诸如癌细胞等)中特异性表达或其表达在所述细胞中增强的表面分子)的核酸作为活性成分时，已经引入核酸并且表达CAR或外源性TCR的离体免疫细胞可以用于预防或治疗疾病(诸如癌症)，并且可以安全地施用至人或其他哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、犬、牛、羊、猴)，优选人。
在一个优选的实施方案中，含有已经通过本发明引入靶物质的离体免疫细胞的药剂可以是癌症的预防性药物或治疗性药物。将作为药剂的应用靶标的癌症没有特别限制。其例子包括但不限于急性淋巴细胞癌症、腺泡状横纹肌肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌(例如，髓母细胞瘤)、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性髓细胞性癌症、结直肠癌、食管癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠道类癌瘤、头颈癌(例如，头颈部鳞状细胞癌)、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病(例如，急性淋巴母细胞性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病)、液体瘤、肝癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤)、恶性间皮瘤、肥大细胞瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌；腹膜癌、视网膜癌和肠系膜癌；咽喉癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌症、实体肿瘤、胃癌、睾丸肿瘤、甲状腺癌、输尿管癌等。
作为含有已经通过本发明引入靶物质的离体免疫细胞的药剂的剂量，例如，以范围为0.001mg-10mg/1kg体重的量一次性施用编码CAR或外源性TCR的核酸。例如，对于施用至人类患者，将0.001-50mg施用至体重60kg的患者。上文提及的剂量是一个例子，并且剂量可以根据将使用的核酸的类型、施用途径、施用的受试者或患者的年龄、体重、症状等适当选择。
优选将含有已经通过本发明引入靶物质的离体免疫细胞的药剂肠胃外施用至受试者。肠胃外施用方法包括静脉内、动脉内、肌内、腹膜内和皮下施用方法等。根据受试者的病症、体重、年龄等适当选自剂量。通常，施用它使得每次施用至体重为60kg的受试者时，细胞数通常是1×106-1×1010个细胞，优选1×107-1×109个细胞，更优选5×107-5×108个细胞。此外，它可以一次施用或分多次施用。
以下通过参考实施例和实施例进一步描述本发明；然而，本发明在任何意义上都不限于它们。
除非另有规定，否则在以下参考实施例和实施例中，“％”指示重量/体积％。
[实施例]
参考实施例1：超细气泡水的制备
将聚山梨醇酯80(2g)(0.1％聚山梨醇酯80)溶解于注射用水(2L)或稀释的Mclivaine缓冲液(pH 3.0，2L)中，并且用以下设置使用由IDEC制造的超细气泡发生器(nanoGALFTM FZ1N-02)制备超细气泡水溶液。当使用酸性缓冲液(稀释的Mclivaine缓冲液：pH 3.0)时可以产生带正电的超细气泡，并且当使用注射用水时可以产生带负电的超细气泡。
用于制备的气体：空气
气泡水流量：约4.0L/min
溶解压力：300KPa±5％(s.d.)
在121℃-124℃下，适当地使用高压釜使制备的超细气泡水溶液经受高压蒸汽灭菌30min。在灭菌后，通过利用使用LM10(NanoSight Ltd.)的激光束散射的追踪方法测量超细气泡平均直径、超细气泡密度和d90/d10比。
结果在下文中示出。
超细气泡平均直径：120nm±16nm
超细气泡密度：4×108个气泡/mL
d90/d10比：3.3
实施例1基因向T细胞的引入
将在含10％FBS的RPMI 1640培养基中的Jurkat E6.1(3×104个细胞，0.5mL)接种在48个孔中。在去除培养基后，添加0.5mL的含5μg的pGFP的超细气泡/RPMI培养基。将通过以下方式制备的超细气泡/RPMI培养基用作转染培养基：将在参考实施例1中制备的1L的超细气泡水溶液添加到RPMI培养基粉末中，并且添加2g/L NaHCO3和10％FBS。
在添加含pGFP的培养基后，使用超声发生器(NEPAGENE)以1MHz的频率和0.5W/cm2的输出强度进行超声辐照持续10s。将细胞培养2h，然后去除转染培养基，并且将细胞在RPMI培养基(培养培养基)中培养48h。此后，将细胞收集，用0.15mL的细胞裂解溶液完全裂解，并且用荧光分光光度计测量GFP的荧光强度。还测量了存活细胞的数目，将其转换为每个存活细胞的荧光强度，并且进行比较。
结果在图1中示出。
实施例2蛋白质向T细胞的引入
将在含10％FBS的RPMI 1640培养基中的Jurkat E6.1(3×104个细胞，0.5mL)接种在48个孔中。在去除培养基后，添加0.5mL的含有5μg的IgG-FITC的超细气泡/RPMI培养基(将4mL的超细气泡/RPMI培养基添加到40μL的IgG-FITC中)。将通过以下方式制备的超细气泡/RPMI培养基用作转染培养基：将在参考实施例1中制备的1L的超细气泡水溶液添加到RPMI培养基粉末中，并且添加2g/L NaHCO3和10％FBS。
在添加含IgG-FITC的培养基后，使用超声发生器(NEPAGENE)以1MHz的频率和0.5W/cm2的输出强度进行超声辐照持续10s。将细胞培养2h，然后去除转染培养基，并且将细胞在RPMI培养基(培养培养基)中培养48h。用荧光分光光度计测量IgG-FITC的荧光强度。还测量了存活细胞的数目，将其转换为每个存活细胞的荧光强度，并且进行比较。
结果在图2中示出。
[工业实用性]
本发明的系统可以通过低输出强度的超声辐照将靶物质(诸如核酸、蛋白质等)有效地递送至免疫细胞，并且因此可以提供用于将药物递送至免疫细胞的高度安全的系统。与使用常规微气泡相比，使用超细气泡可以明显提高靶物质向细胞的引入效率。此外，由于所述系统不需要使用脂质体，因此它可以以低成本制造并且是高度安全的。综上所述，本发明的系统尤其可用作进入免疫细胞的新颖DDS。
本申请基于在日本提交的专利申请号2019-119164(申请日：2019年6月26日)，将其内容全部并入本文。

Claims (16)

1.一种用于将靶物质递送至免疫细胞的系统，所述系统包含含有平均直径不大于200nm且不含磷脂的超细气泡的超细气泡水或超细气泡水溶液和超声发生器的组合。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述超细气泡水溶液包含选自一种或多种的表面活性剂、亲水性树脂和缓冲液的一种或多种组分，所述一种或多种的表面活性剂选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂。
3.根据权利要求1所述的系统，其中所述超细气泡水溶液由非离子表面活性剂和/或亲水性树脂组成。
4.根据权利要求1所述的系统，其中所述超细气泡由全氟代烃或空气构成。
5.根据权利要求1所述的系统，其中所述超细气泡具有50nm-200nm的平均直径。
6.根据权利要求1所述的系统，其中所述超细气泡具有不大于5的d90/d10比。
7.根据权利要求1所述的系统，其中在所述超细气泡水或超细气泡水溶液中的所述超细气泡具有不小于1.0×108个气泡/mL的密度。
8.根据权利要求1所述的系统，其中在所述超声发生器中的超声输出强度不大于720mW/cm2。
9.根据权利要求1所述的系统，其中在所述超声发生器中，超声输出强度是50-500mW/cm2并且超声频率是0.5-10MHz。
10.根据权利要求1所述的系统，其中所述靶物质是核酸或蛋白质。
11.根据权利要求10所述的系统，其中所述核酸编码嵌合抗原受体或外源性T细胞受体。
12.根据权利要求1所述的系统，其中所述免疫细胞是T细胞。
13.根据权利要求11所述的系统，用于将核酸递送至免疫细胞。
14.一种用于增加核酸或蛋白质至免疫细胞的递送的方法，所述方法通过使用包含平均直径不大于200nm且不含磷脂的超细气泡的超细气泡水或超细气泡水溶液和超声。
15.一种制剂，所述制剂包含核酸或蛋白质和超细气泡水或超细气泡水溶液的组合，所述超细气泡水或超细气泡水溶液包含平均直径不大于200nm且不含磷脂的超细气泡，用于将所述核酸或蛋白质递送至免疫细胞，其中通过与超声辐照组合使用将有效量的所述核酸或蛋白质递送至所述免疫细胞。
16.一种用于将核酸或蛋白质递送至免疫细胞的方法，所述方法通过使所述细胞与根据权利要求15所述的制剂接触，并且将它们用超声处理。
CN202080059401.8A 2019-06-26 2020-06-25 转染方法 Pending CN114302708A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019119164 2019-06-26
JP2019-119164 2019-06-26
PCT/JP2020/025035 WO2020262540A1 (ja) 2019-06-26 2020-06-25 トランスフェクション方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114302708A true CN114302708A (zh) 2022-04-08

Family

ID=74061003

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080059401.8A Pending CN114302708A (zh) 2019-06-26 2020-06-25 转染方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20220251576A1 (zh)
EP (1) EP3991746A4 (zh)
JP (1) JPWO2020262540A1 (zh)
CN (1) CN114302708A (zh)
WO (1) WO2020262540A1 (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160166716A1 (en) * 2014-10-02 2016-06-16 Purdue Research Foundation Nanobubbles
US20170189943A1 (en) * 2014-05-28 2017-07-06 Takeda Pharmaceutical Company Limited Antibacterial water
WO2018053350A1 (en) * 2016-09-15 2018-03-22 Labcyte Inc. High-efficiency transfection of biological cells using sonoporation

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9051391B2 (en) 2007-06-11 2015-06-09 Takara Bio Inc. Method for expression of specific gene
BRPI0911612A2 (pt) * 2008-04-28 2015-12-15 Revalesio Corp composições e métodos para o tratamento da esclerose múltipla.
MX2013001749A (es) * 2010-08-13 2014-03-05 Revalesio Corp Composiciones y metodos para tratar enfermedades cardiovasculares.
JP5850519B2 (ja) 2011-05-09 2016-02-03 ネッパジーン株式会社 モルフォリノ搭載バブルリポソームを有効成分としてなる筋ジストロフィー治療薬
EP2674172B1 (en) * 2012-06-11 2017-02-15 Ludwig Boltzmann Gesellschaft Pharmaceutical formulation for ultrasound transfection
WO2014030601A1 (ja) * 2012-08-20 2014-02-27 国立大学法人京都大学 アニオン性を有する新規ナノバブルポリ－リポ・プレックスの製造方法
BR112017001242A2 (pt) 2014-07-21 2017-12-05 Novartis Ag tratamento de câncer usando um receptor antigênico quimérico a cd33
CN115747168A (zh) 2015-07-28 2023-03-07 宾夕法尼亚大学董事会 表达嵌合抗原受体的修饰单核细胞/巨噬细胞及其用途
JPWO2019131723A1 (ja) * 2017-12-27 2021-01-14 武田薬品工業株式会社 薬物の投与方法
JP2019119164A (ja) 2018-01-10 2019-07-22 コニカミノルタ株式会社 画像形成装置及び情報処理装置
CN114269385A (zh) * 2019-06-26 2022-04-01 武田药品工业株式会社 转染方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170189943A1 (en) * 2014-05-28 2017-07-06 Takeda Pharmaceutical Company Limited Antibacterial water
US20160166716A1 (en) * 2014-10-02 2016-06-16 Purdue Research Foundation Nanobubbles
WO2018053350A1 (en) * 2016-09-15 2018-03-22 Labcyte Inc. High-efficiency transfection of biological cells using sonoporation

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2020262540A1 (zh) 2020-12-30
WO2020262540A1 (ja) 2020-12-30
US20220251576A1 (en) 2022-08-11
EP3991746A1 (en) 2022-05-04
EP3991746A4 (en) 2023-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6944497B2 (ja) 新規に単離された細胞の治療組成物の操作および送達
Gao et al. Engineering nanoparticles for targeted remodeling of the tumor microenvironment to improve cancer immunotherapy
ES2961346T3 (es) Procedimiento para tratar cáncer con células T modificadas genéticamente
JP2023502503A (ja) ＤｕｏＣＡＲによりがんを処置するための組成物および方法
Lin et al. CAR T cell therapy in primary brain tumors: current investigations and the future
US10314854B2 (en) Methods for treating tumors in situ including intratumor injection of cytotoxic particles and immune checkpoint blockade therapy
CN109963564A (zh) 用于核酸递送的解体型细胞穿透性复合物
Bronshtein et al. Cell derived liposomes expressing CCR5 as a new targeted drug-delivery system for HIV infected cells
Ye et al. In vitro engineering chimeric antigen receptor macrophages and T cells by lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery
CN108135938A (zh) 基因修饰的抗第三方中央型记忆t细胞及其在免疫疗法中的用途
US20180126014A1 (en) Compositions for enhancing delivery of agents across the blood brain barrier and methods of use thereof
Casey et al. Sonoporation mediated immunogene therapy of solid tumors
Kowalczuk et al. In vivo gene transfer into the ocular ciliary muscle mediated by ultrasound and microbubbles
JP2022130502A (ja) 固形腫瘍細胞及びエスケープバリアントを治療するための足場
Wang et al. Polydopamine as the antigen delivery nanocarrier for enhanced immune response in tumor immunotherapy
CN109718380A (zh) 肿瘤抗原呈递系统及其在制备抗肿瘤药物中的应用、免疫系统激活剂和抗肿瘤组合物
JP2023106442A (ja) 抗ｃｄ２２免疫療法によってがんを処置するための組成物および方法
Han et al. Image-guided in situ cancer vaccination with combination of multi-functional nano-adjuvant and an irreversible electroporation technique
Hocevar et al. PEGylated gold nanoparticles target age-associated b cells in vivo
CN114302708A (zh) 转染方法
JP7314270B2 (ja) トランスフェクション方法
Fath et al. Recent advancements to engineer mesenchymal stem cells and their extracellular vesicles for targeting and destroying tumors
CN116829178A (zh) 小分子药物缀合物和表达car的细胞毒性淋巴细胞的组合及使用其治疗癌症的方法
CN115066248A (zh) 嵌合抗原受体树突状细胞(car-dc)及其制备和使用方法
Schoen et al. Cell ghosts: cellular membranes for drug delivery

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination