CN115066248A - 嵌合抗原受体树突状细胞(car-dc)及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

在本公开内容的各个方面中提供了制备修饰的嵌合抗原受体树突状细胞(CAR‑DC)的组合物和方法及其使用方法。CAR‑DC可以用于治疗肿瘤和癌症，特别是实体瘤(以及液体肿瘤、血液癌症和转移癌)。

Description

嵌合抗原受体树突状细胞(CAR-DC)及其制备和使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年12月16日提交的美国临时申请序列号62/948,612的权益，所述美国临时申请通过引用以其整体并入本文。

政府权利

本发明在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的OD026427下由政府支持完成。政府在本发明中拥有一定的权利。

技术领域

本文公开的是在受试者中产生适应性免疫应答的组合物和方法。具体地，本公开内容涉及经遗传修饰以表达一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的树突状细胞，以及使用所述细胞治疗癌症的方法。

序列表的引用

本申请含有序列表，所述序列表已经由EFS-Web以ASCII格式提交，并且在此通过引用以其整体并入。于2020年12月14日创建的ASCII副本命名为675958_ST25，且大小为7.64KB字节。

背景技术

利用生物体的免疫系统来对抗疾病例如癌症是一种有力的方法。最近的工作已鉴定了在T细胞的表面上展示的两种关键免疫检查点蛋白。这些细胞表面受体结合在其它细胞如抗原呈递细胞(APC)上展示的某些配体，并且将它们识别为自身，这导致T细胞活性的减弱并对免疫应答施加制动。研究人员在数十年的工作过程中已显示了，阻止T细胞上的这些受体结合其在APC或肿瘤细胞上的配体解除阻断，并且触发对肿瘤细胞的攻击。

对于T细胞的完全激活，对负免疫调节的这种制动是必要的，但并不足够。另一种表面受体T细胞受体(TCR)也需要识别且结合特异性地衍生自肿瘤细胞并在APC上展示的配体。目前存在如果患者具有抗肿瘤T细胞，则转移性癌症有时可治愈的证据。对于抗肿瘤T细胞“释放制动”的检查点抑制剂，在高达10-15%的转移性黑色素瘤和其它几种类型的癌症中诱导完全应答(CR)，其中一些是持久的。

嵌合抗原受体(CAR)疗法已实现了针对血液系统恶性肿瘤的巨大的临床成功。它基于具有抗原识别和信号转导功能两者的合成受体。CAR中的单链可变片段(scFv)保留了其来自原始单克隆抗体的重链和轻链可变区的抗原识别特异性。同时，CAR构建体的信号转导在很大程度上依赖原始免疫受体的信号传导结构域。CAR T细胞在终末期复发性急性成淋巴细胞性白血病(ALL)患者中显示出显著的80-100% CR，但在实体瘤中显示出1% CR。

理解且克服每种疗法的失败可能有助于对剩余的癌症患者带来持久的缓解。失败的原因是多方面的，但如果患者并未首先具有适应性抗肿瘤T细胞应答(这在具有较高突变负荷的肿瘤中更可能)，则检查点抑制剂在基线时无效。如果不是所有细胞都表达靶抗原，则实体瘤逃避CAR T识别。在患者中成功地产生适应性免疫应答将克服两类免疫疗法的失败。然而，这仍然难以实现。

因此，本领域需要用于特异性地靶向各种癌症或肿瘤细胞，同时通过利用抗肿瘤T细胞产生适应性免疫应答的组合物和方法。

发明内容

在本公开内容的各个方面中提供了嵌合抗原受体树突状细胞(CAR-DC)以及制备和使用CAR-DC的方法。

本公开内容的一个方面提供了包含嵌合抗原受体(CAR)的修饰的细胞，其中所述CAR包含：抗原结合结构域；跨膜结构域；包含FMS样酪氨酸激酶3 (Flt3)信号传导结构域的细胞内结构域；和/或所述修饰的细胞是树突状细胞或其前体或祖细胞。

本公开内容的另一个方面提供了嵌合抗原受体(CAR)构建体，其包含：(i)抗原结合结构域；(ii)跨膜结构域；和/或(iii)包含FMS样酪氨酸激酶3 (Flt3)信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，其中所述CAR构建体能够在树突状细胞(DC)或其前体或祖细胞中表达或发挥功能。

在一些实施方案中，树突状细胞选自cDC1细胞或其前体或祖先。

本公开内容的另一个方面提供了修饰的细胞，其包含编码CAR的第一核酸序列，或编码抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域的第二核酸序列。

在一些实施方案中，第一细胞内核酸序列编码包含Flt3的蛋白质产物或基于Flt3的蛋白质产物，或后续的细胞内核酸序列编码包含Flt3的蛋白质产物或基于Flt3的蛋白质产物。

在一些实施方案中，CAR进一步包含信号肽或另外的细胞外结构域。

在一些实施方案中，修饰的细胞是常规1型树突状细胞(cDC1)。

在一些实施方案中，修饰的细胞能够进行抗原交叉呈递、适应性抗肿瘤免疫应答或激活抗肿瘤T细胞。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含抗体或其片段。

在一些实施方案中，抗体对肿瘤细胞抗原具有结合亲和力。

在一些实施方案中，肿瘤细胞抗原是EphA2。

在一些实施方案中，抗原结合结构域针对选自以下的疾病相关抗原：EphA2、EGFRviii、AFP、CEA、CA-125、MUC-1、CD123、CD30、SlamF7、CD33、EGFRvIII、BCMA、GD2、CD38、PSMA、B7H3、EPCAM、IL-13Ra2、PSCA、间皮素、Her2、CD19、CD20、CD22、sial-LewisA、LewisY、CIAX或另一种肿瘤富集蛋白质。

在一些实施方案中，修饰的细胞能够选择性地吞食肿瘤细胞、交叉呈递肿瘤抗原和/或激活T细胞，以响应肿瘤抗原。

在一些实施方案中，修饰的细胞能够交叉呈递肿瘤抗原(或具有肿瘤抗原交叉呈递)，其中抗原交叉呈递是细胞在I型主要组织相容性复合物分子(MHC I)上呈递内化抗原的能力，其对于针对肿瘤细胞的有效适应性免疫应答是必需的。

在一些实施方案中，修饰的细胞能够消除CAR靶向的抗原阳性(Ag+)肿瘤，并且通过表位扩散间接消除Ag-实体瘤细胞(不被CAR识别)。

本公开内容的另一个方面是包含本文所述的修饰的细胞的药物组合物。

本公开内容的另一个方面是在受试者中刺激适应性抗肿瘤T细胞应答的方法，其包括：向受试者施用治疗有效量的包含嵌合抗原受体树突状细胞(CAR-DC)的药物组合物；其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域；所述细胞内结构域包含FMS样酪氨酸激酶3 (Flt3)信号传导结构域；并且所述细胞是树突状细胞或其祖细胞。

在一些实施方案中，受试者患有增生性疾病、病症或病况(例如，癌症)。

在一些实施方案中，所述方法诱导对受试者中癌细胞的吞噬作用。

在一些实施方案中，CAR-DC交叉引发抗肿瘤T细胞应答。

在一些实施方案中，CAR-DC产生消除肿瘤的免疫应答。

在一些实施方案中，增生性疾病、病症或病况是恶性肿瘤、实体瘤或液体肿瘤。

在一些实施方案中，修饰的细胞直接靶向CAR抗原阳性(Ag+)肿瘤细胞用于消除；或通过交叉呈递和表位扩散间接靶向CAR抗原阴性(Ag-)肿瘤细胞用于消除。

本公开内容的另一个方面提供了制备修饰的免疫细胞(例如DC、cDC1)群体的方法，其包括：(i)提供或已提供来自受试者的细胞群体(例如，来自循环、脐带或骨髓的单核细胞或干细胞)；(ii)在包含FMS样酪氨酸激酶3 (Flt3)激动剂的培养基中，将细胞群体培养至少约一天；(iii)将基于Flt3的嵌合抗原受体(CAR)引入来自(ii)的细胞内；和/或(iv)在包含FMS样酪氨酸激酶3 (Flt3)激动剂的培养基中，将来自(iii)的细胞培养足以形成修饰的细胞的时间量，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，所述细胞内结构域包含FMS样酪氨酸激酶3 (Flt3)信号传导结构域。

在一些实施方案中，足以形成修饰的细胞的时间量为约2天至约15天。

在一些实施方案中，将CAR引入骨髓细胞内包括将编码包含Flt3或Flt3样细胞内结构域的蛋白质产物的细胞内核酸序列引入细胞内。

在一些实施方案中，修饰的细胞能够进行抗原交叉呈递、适应性抗肿瘤免疫应答或激活抗肿瘤T细胞。

在一些实施方案中，修饰的细胞是树突状细胞或常规1型树突状细胞(cDC1)。

其它目的和特征部分是显而易见的并且部分在下文中指出。

附图说明

申请文件含有至少一幅彩色绘图。带有彩色附图的本专利申请公开的副本将在请求和支付必要的费用后由专利局提供。

图1A-1E显示了CAR巨噬细胞发挥局部肿瘤杀死，但不生成临床上显著的全身抗肿瘤应答。图1A是示意图，其显示了小鼠在双侧胁腹中用同源肿瘤进行注射，并且一旦建立，将FcR CAR巨噬细胞注射到一个肿瘤内。图1B显示了靶向且吞食Ag+肿瘤细胞的CAR表达细胞的卡通图。图1C是显示了在两个注射的肿瘤中随着时间过去测量肿瘤负荷的图。图1D是显示了在两个未注射的肿瘤中随着时间过去测量肿瘤负荷的图。图1E是显示了一只小鼠在注射部位处显示出完全应答的图；这只小鼠用肿瘤进行重新注射，以测试抗肿瘤免疫。

图2显示了CAR设计：CAR载体含有驱动表面表达的信号肽(SP)，随后为肿瘤抗原结合结构域(此处，来自识别EphA2的抗体的scFv)，随后为细胞外结构域(EC)和跨膜结构域(TM；此处，衍生自CD8)和细胞内结构域，随后为P2A切割序列和RFP，以评价转导效率。细胞内结构域在这些实验中根据CAR改变，并且包括来自Fc受体(顶部)、TLR4 (第二个)或Flt3(第三个)的信号传导结构域。底部构建体是对照CAR，其缺乏细胞内信号传导结构域。

图3显示了CAR表达。用空载体、基于Fc受体的CAR、基于Flt3L的CAR、基于TLR4的CAR或缺乏细胞内结构域的对照CAR转导骨髓细胞。FACS分析(顶行)证实了在y轴上的CAR表达，以及在x轴上的RFP表达。荧光显微镜检查进一步确认了RFP转导标记物(底行)的表达。

图4A和图4B显示了表达Ova抗原的同源肿瘤与所示CAR一起共温育12小时，随后加入CFSE标记的OT1 T细胞。三天后，通过流式细胞术评价抗原交叉呈递诱导的T细胞增殖。图4A是显示了T细胞增殖的定量的图。“对照CAR”是缺乏细胞内结构域的非信号传导CAR。图4B是显示了CD3+ CD8+ T细胞的CFSE增殖直方图的流程图。图4C显示了CAR转导的骨髓细胞，其对于RFP阳性进行分选，并且以1:1的比率与表达zsGreen的肿瘤细胞一起温育。指示已使绿色肿瘤内化的红色转导细胞的红色/绿色双阳性细胞，在指示时间点通过实时视频显微镜检查自动地进行定量。

图5A和图5B显示了表达GFP+ Ova抗原的同源肿瘤分别以2:1:1的比率与指示的CAR加上OT1 T细胞一起温育。图5A是显示了在十天后定量肿瘤面积的图。图5B显示了以低倍放大率(2.5x)显示的各个孔；肿瘤是绿色的。

图6A和图6B显示了HoxB8多潜能细胞用对照非信号传导CAR或Flt3 CAR进行转导，对于CAR阳性进行分选，然后在不存在外源Flt3配体下与肿瘤细胞共培养。图6A显示了在共培养两天后定量活的HoxB8细胞。图6B显示了代表性图像，其证实了在用肿瘤替换Flt3L后两天，对照CAR HoxB8细胞的一致死亡，其中Flt3 CAR HoxB8细胞存活并在肿瘤周围聚集。

图7A和图7B显示了基于Flt3的CAR改善CAR-cDC1的生成。图7A显示了骨髓细胞用指示的CAR进行转导并分化成DC。CAR转导的cDC1百分比通过流式细胞术进行定量，并且与原代、非CAR转导的DC进行比较。图7B显示了所示的流式细胞术主要门控策略，其中cDC是B220-、CD11c+、MHC-II+，并且cDC1和cDC2分别通过CD24和Sirpa阳性进行进一步区分。

图8A-8C显示了Flt3 CAR DC诱导全身性抗肿瘤适应性应答，其消除疾病的局部和远端部位，并且保护免于肿瘤再次攻击。将肉瘤原位注射到同源小鼠的双侧胁腹内，并且一旦建立，每只小鼠中的两个肿瘤之一用对照或Flt3 CAR DC进行注射。图8A显示了对于治疗的肿瘤测量的肿瘤负荷。图8B显示了对于未治疗的肿瘤测量的肿瘤负荷。虽然所有对照CAR和未治疗的小鼠双侧进展，但Flt3 CAR DC治疗的肿瘤在局部治疗之后1-2周开始双侧缓慢消退。图8C显示了显示出完全肿瘤应答的Flt3 CAR DC治疗的小鼠用肿瘤进行重新注射，并且未观察到肿瘤再生长。

具体实施方式

本公开内容至少部分基于以下发现：已进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的树突状细胞，能够通过T细胞交叉引发靶向肿瘤细胞用于吞噬作用和细胞毒性。如本文所示，CAR树突状细胞(CAR-DC)可以用于治疗各种癌症和恶性肿瘤，包括实体瘤。先前描述的CAR巨噬细胞(CAR-M)在吞噬或胞饮肿瘤细胞后并未成功地交叉引发T细胞，并且并未在体内成功地消除实体瘤。本公开内容描述了生成功能性CAR-DC的方法，其选择性地吞食肿瘤细胞，并且以交叉引发肿瘤抗原反应性T细胞的方式交叉呈递内源性肿瘤抗原。本公开内容证实了衍生自基于Flt3的CAR的CAR-DC能够成功地生成cDC1细胞，而引入髓样前体细胞内的传统的基于Fc受体的CAR并不形成cDC1，而是形成巨噬细胞，即使当它们在DC分化细胞因子Flt3L的存在下生长时。基于非Flt3的CAR无法成功地生成DC似乎是由于来自CAR的基础信号传导，其损害了对cDC1表型的正确分化。因此，本公开内容提供了使用CAR DC用于产生适应性免疫应答的组合物和方法。所生成的适应性免疫应答可用于靶向且杀死CAR-Ag⁺和CAR-Ag^-肿瘤细胞或癌细胞两者，以及产生预防肿瘤细胞或癌细胞复发的免疫记忆。

除CAR-DC之外，本公开内容的组合物可以任选地包含一种或多种另外的药物或治疗活性剂。本公开内容的组合物可以进一步包含药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。进一步地，本公开内容的组合物可以含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、盐(本发明的物质本身可以以药学上可接受的盐的形式提供)、缓冲剂、包被剂或抗氧化剂。

下文更全面地描述了本发明的其它方面和迭代。

I. 组合物

如本文所述，CAR构建体首次允许生成功能性CAR-DC，其选择性地吞食肿瘤细胞，并且以交叉引发内源性肿瘤抗原反应性T细胞的方式交叉呈递内源性肿瘤抗原，以在体外和体内消除剩余的肿瘤。

先前的工作已描述了CAR-巨噬细胞。如同树突状细胞，巨噬细胞可以吞噬物质，并且可以呈递抗原。然而，在体内，巨噬细胞不能有效地交叉呈递肿瘤抗原，并且不能通过T细胞交叉引发而产生消除肿瘤的免疫应答。在体内，DC且特别是称为cDC1的DC亚群，是能够进行肿瘤抗原交叉呈递和T细胞交叉引发的唯一细胞；如果没有cDC1，则无法实现适应性抗肿瘤应答，不能产生抗肿瘤免疫应答，并且不能通过体内免疫系统消除肿瘤。因此，在概念上，CAR-巨噬细胞可以实现直接肿瘤吞噬作用或可能直接细胞毒性的目标。然而，它们不能实现抗原交叉呈递的目标，并且不能产生有效的适应性抗肿瘤T细胞应答。

已通过将诱导吞噬作用的各种巨噬细胞受体(例如fc受体、toll样受体或者其它基于巨噬细胞或T细胞的受体)的细胞内结构域与识别肿瘤的scFv细胞外结构域融合，来产生CAR-巨噬细胞。迄今为止，还没有成功地产生赋予细胞DC能力(即，特别是在体内交叉引发有效抗肿瘤T细胞应答的能力)的CAR。

(a) CAR树突状细胞(CAR-DC)

本公开内容提供了带有嵌合抗原受体的树突状细胞(CAR-DC)、包含其的药物组合物以及用于治疗癌症或肿瘤的免疫治疗方法。CAR-DC是表达嵌合抗原受体(CAR)的树突状细胞。如本文所述，可以修饰树突状细胞或其前体或祖先，以形成CAR树突状细胞(CAR-DC)。嵌合抗原受体(CAR)是重组融合蛋白，其包含：1)细胞外配体结合结构域，即抗原识别结构域，2)跨膜结构域，和3)信号传导转导结构域。

包含基于Flt3的CAR构建体的CAR-DC能够以CAR依赖性方式功能性吞噬肿瘤细胞，并且通过肿瘤摄取和抗原交叉呈递来交叉引发抗肿瘤T细胞，而CAR-巨噬细胞不能。因此，该术语包括启动免疫应答和/或将抗原呈递给T淋巴细胞和/或为T细胞提供刺激适应性免疫应答所需的任何其它激活信号的DC。

如本文所述，CAR-DC可以通过使分离的树突状细胞祖先暴露于DC增殖刺激物如Flt3L来生成，所述树突状细胞祖先例如干细胞(多能干细胞、多潜能干细胞、造血干细胞或其它干细胞)、多潜能祖先、共同髓系祖先(CMP)、髓样树突状细胞祖先(MDP)、共同树突状细胞祖先(CDP)、骨髓单核细胞、外周血单核细胞(PBMC)或脾细胞。细胞然后可以用目的CAR进行转导，并且在治疗前进一步暴露于DC分化因子Flt3L足以生成树突状细胞样细胞(DC样细胞)的时间量。例如，细胞可以暴露于Flt3L约2至15天以促进分化。

本公开内容提供了修饰的树突状细胞(DC)以及DC的修饰的前体和修饰的祖先。DC是这样的免疫细胞，其能够进行抗原交叉呈递，并且在启动特别是针对肿瘤的适应性免疫应答中是关键的。众多研究证实了，DC在肿瘤微环境中且甚至是一般而言的癌症患者中是有限的。进一步地，即使存在DC，它们也可以诱导抗原的耐受或排斥，或者根本没有效应，因为它们一般没有指导它们肿瘤细胞是外来或威胁性的并且需要被消除的强信号。

树突状细胞可以是树突状细胞的亚群。例如，DC的亚群可以是例如浆细胞样DC(pDC)、髓样/常规/经典DC1 (cDC1)、髓样/常规/经典DC2 (cDC2)或单核细胞衍生的DC(moDC)。

祖先可以是能够分化成DC的任何细胞。例如，DC祖先可以是干细胞(多能干细胞、多潜能干细胞、造血干细胞或其它干细胞)、多潜能祖先、共同髓系祖先(CMP)、髓样和树突状细胞祖先(MDP)、淋巴引发的多潜能祖先(LMPP)、共同树突状细胞祖先(CDP)、骨髓单核细胞、外周血单核细胞(PBMC)或脾细胞。

DC的前体可以是如上所述的祖先，或者可以被诱导或重编程以分化成DC的任何细胞，例如成纤维细胞。例如，DC的前体可以是干细胞、单核细胞、髓样前体细胞、髓样衍生的前体细胞、外周血单核细胞(PBMC)或骨髓单核细胞(BMM)。

CAR-DC可以是自体的，意味着它们从受试者的自身细胞进行改造，或同种异体的，意味着细胞源自健康供体，并且在许多情况下，这样进行改造以便不引起宿主抗移植物或移植物抗宿主反应。供体细胞也可以源自脐带血或由诱导的多能干细胞生成。

本公开内容提供了修饰的常规I型树突状细胞(cDC1)，其可以通过使CAR-DC分化而生成。如本文所述，在体内，DC且特别是称为cDC1的DC亚群，是能够进行有效肿瘤抗原交叉引发的唯一免疫细胞。抗原交叉引发指通过抗原呈递细胞将抗原特异性幼稚细胞毒性CD8 T细胞刺激成活化的细胞毒性CD8 T细胞，所述抗原呈递细胞已获得并交叉呈递细胞外抗原，在这种情况下从肿瘤获得。抗原交叉呈递指细胞在I型主要组织相容性复合物分子(MHC I)上呈递内化抗原的能力。已知抗原交叉呈递和交叉引发对于针对肿瘤细胞的有效适应性免疫应答是必需的。

如果没有cDC1，则无法实现适应性抗肿瘤应答，不能产生抗肿瘤免疫应答，并且不能通过体内免疫系统消除肿瘤，参见例如下文实施例。

如本文所述，用基于Flt3的CAR转导树突状细胞或其前体能够独特地产生真正的、可编程的和功能性的cDC1，其在以前并未得到证实。引入髓样前体细胞内的传统的基于Fc受体的CAR并不形成cDC1，而是形成巨噬细胞或cDC2，即使当它们在cDC1分化细胞因子Flt3L中生长时。基于非Flt3的CAR无法成功地生成DC似乎是由于来自CAR的基础信号传导，其损害了对cDC1表型的正确分化。因此，基于Flt3的CAR可以被称为“CAR-DC”，其能够与其它CAR (基于Fc受体或者其它炎症或巨噬细胞受体结构域)区别开，当在祖细胞中表达时，所述其它CAR产生具有明显较差的交叉引发T细胞的能力的CAR-巨噬细胞(CAR-M)。与CAR-M或cDC1不同，CAR-DC具有选择性地吞食肿瘤细胞、交叉呈递肿瘤抗原且激活T细胞的优越能力，以响应肿瘤抗原。

如本文所述，cDC1可以基于流式细胞术就特异性表面蛋白表达标记进行鉴定，并且通过其针对吞食的细胞相关抗原交叉引发T细胞的功能能力进行确认。例如，cDC表面表达谱可以是谱系阴性的B220^-、CD11c⁺和MHC-II⁺，并且cDC1和cDC2可以通过CD24和Sirpa表达进行进一步区分。

(b)基于Flt3的CAR构建体

CAR设计一般对于每种细胞类型进行定制。本公开内容涉及树突状细胞，但可以用于其它免疫细胞类型。本文公开的是进行改造以表达嵌合抗原受体(CAR)的树突状细胞。

CAR以模块方式进行设计，其包含细胞外靶结合结构域(例如，抗原结合结构域、肿瘤结合结构域)、铰链区、将CAR锚定至细胞膜的跨膜结构域、以及传递激活信号的一种或多种细胞内结构域。本公开内容的嵌合抗原受体(CAR)包含CAR的信号转导结构域或细胞内信号传导结构域，其负责在细胞外配体结合结构域与靶结合之后的细胞内信号转导，导致免疫细胞的激活和免疫应答。换言之，信号转导结构域负责激活CAR在其中表达的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。例如，树突状细胞的效应子功能可以是增加的存活、分化、吞噬作用和/或抗原交叉呈递。因此，术语“信号转导结构域”指转导效应子信号功能信号并指导细胞执行专门功能的蛋白质的一部分。在CAR T细胞的情况下，取决于共刺激结构域的数目，CAR可以分类成第一代CAR (仅CD3z)、第二代CAR (一个共刺激结构域 + CD3z)或第三代CAR (多于一个共刺激结构域 + CD3z)。本CAR DC中利用的共刺激结构域可以类似地用于增加或降低细胞的功能、持久性或增殖。这些结构域可以包括但不限于衍生自Fc受体、TLR、CSF1R、CD40、PD-1、41BB、CD28、OX40、ICOS、SR-A1、SR-A2、SR-CL2、SR-C、SR-E、MARCO、dectin 1、DEC-205、DEC-206、DC-SIGN或具有信号传导功能的其它蛋白质的结构域。将CAR分子引入DC内成功地重定向了具有另外抗原特异性的DC，并且提供了驱动完全DC激活和功能的必需信号。

在一个实施方案中，核酸序列编码具有细胞内信号传导组分的CAR，所述细胞内信号传导组分与来自蛋白质Flt3的细胞内结构域包含至少50%序列同一性、至少60%序列同一性、至少70%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性。FMS样酪氨酸激酶3 (FLT-3) (也称为分化抗原簇135 (CD135)、受体型酪氨酸蛋白激酶Flt3或胎肝激酶2 (Flk2))是在人中由FLT3基因编码的蛋白质。Flt3是属于受体酪氨酸激酶III类的细胞因子受体。Flt3是细胞因子Flt3配体(FLT3L)的受体。Flt3由五个细胞外免疫球蛋白样结构域、细胞外结构域、跨膜结构域、近膜结构域和酪氨酸激酶结构域构成，所述酪氨酸激酶结构域由通过酪氨酸激酶插入物连接的2个叶组成。细胞质Flt3经历糖基化，其促进受体定位至膜。核酸序列和肽序列可以在可公开获得的数据库中找到，包括例如Entrez基因登录号2322和UniProt登录号P36888。

Ftl3酪氨酸蛋白激酶充当细胞因子FLT3L的细胞表面受体，并且调控造血祖细胞和树突状细胞的分化、增殖和存活。Flt3促进SHC1和AKT1的磷酸化，以及下游效应物MTOR的激活。它促进RAS信号传导的激活和下游激酶包括MAPK1/ERK2和/或MAPK3/ERK1的磷酸化。它还已显示了促进FES、FER、PTPN6/SHP、PTPN11/SHP-2、PLCG1和STAT5A和/或STAT5B的磷酸化。野生型FLT3的激活仅引起STAT5A或STAT5B的边缘激活。

在一个实施方案中，CAR-DC的组合物是：信号肽-靶结合结构域-铰链结构域-跨膜结构域-Flt3细胞内结构域。

发现Flt3细胞内结构域对于有效的CAR-DC生成是关键的。SEQ ID NO：1是人Flt3结构域的实例：HKYKKQFRYESQLQMVQVTGSSDNEYFYVDFREYEYDLKWEFPRENLEFGKVLGSGAFGKVMNATAYGISKTGVSIQVAVKMLKEKADSSEREALMSELKMMTQLGSHENIVNLLGACTLSGPIYLIFEYCCYGDLLNYLRSKREKFHRTWTEIFKEHNFSFYPTFQSHPNSSMPGSREVQIHPDSDQISGLHGNSFHSEDEIEYENQKRLEEEEDLNVLTFEDLLCFAYQVAKGMEFLEFKSCVHRDLAARNVLVTHGKVVKICDFGLARDIMSDSNYVVRGNARLPVKWMAPESLFEGIYTIKSDVWSYGILLWEIFSLGVNPYPGIPVDANFYKLIQNGFKMDQPFYATEEIYIIMQSCWAFDSRKRPSFPNLTSFLGCQLADAEEAMYQNVDGRVSECPHTYQNRRPFSREMDLGLLSPQAQVEDS。

可用于本发明中的Flt3结构域的另一个非限制性实例是小鼠Flt3结构域：HKYKKQFRYESQLQMIQVTGPLDNEYFYVDFRDYEYDLKWEFPRENLEFGKVLGSGAFGRVMNATAYGISKTGVSIQVAVKMLKEKADSCEKEALMSELKMMTHLGHHDNIVNLLGACTLSGPVYLIFEYCCYGDLLNYLRSKREKFHRTWTEIFKEHNFSFYPTFQAHSNSSMPGSREVQLHPPLDQLSGFNGNSIHSEDEIEYENQKRLAEEEEEDLNVLTFEDLLCFAYQVAKGMEFLEFKSCVHRDLAARNVLVTHGKVVKICDFGLARDILSDSSYVVRGNARLPVKWMAPESLFEGIYTIKSDVWSYGILLWEIFSLGVNPYPGIPVDANFYKLIQSGFKMEQPFYATEGIYFVMQSCWAFDSRKRPSFPNLTSFLGCQLAEAEEAMYQNMGGNVPEHPSIYQNRRPLSREAGSEPPSPQAQ。

在一些实施方案中，使用的Flt3结构域与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性、至少99%序列同一性。

此外，CAR构建体部分或组分可以与接头可操作地连接。接头可以是能够连接本文所述部分的任何核苷酸序列。例如，接头可以是适合于此目的的任何氨基酸序列(例如，具有8 - 80个氨基酸的长度，取决于所使用的靶结合结构域)。

各种细胞内结构域在不同的细胞类型中具有不同的功能。本公开内容提供了可用于DC中的细胞内信号传导结构域。如本文所述，直接比较基于Fc受体、基于toll样受体(TLR)或基于FMS样酪氨酸激酶3 (Flt3)的IC结构域，并且发现基于Flt3的IC结构域在生成功能性CAR-DC方面是最有效的。

基于FMS样酪氨酸激酶3 (Flt3)的IC结构域可以是任何基于Flt3或Flt3衍生的IC结构域，例如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的人Flt3 IC结构域的活性变体或功能片段。

如本文所述，细胞内结构域可以是FMS样酪氨酸激酶3 (Flt3)细胞内结构域。Flt3信号传导结构域衍生自Flt3基因。Flt3编码充当细胞因子Flt3配体(Flt3L)的受体的III类受体酪氨酸激酶。衍生自Flt3的细胞内结构域显示对于成功地获得CAR树突状细胞是关键的。

在一些实施方案中，CAR-DC可以通过组合CAR中的两个或更多个细胞内结构域，将不同细胞内结构域的性质接合到一个单一树突状细胞中。例如，此类组合可以包括来自Flt3家族的一个细胞内结构域、以及来自含ITAM结构域的蛋白质或含TIR结构域的蛋白质的一个细胞内结构域，导致不同信号传导途径的同时激活。这些被视为上文更详细地描述的共刺激结构域。

每个共刺激结构域可以具有独特的性质。scFv的亲和力、抗原表达的强度、非肿瘤(off-tumor)毒性的可能性或待治疗的疾病中的差异可能影响细胞内结构域的选择。

如本文所述，CAR可以包含抗原结合结构域或肿瘤结合结构域。抗原结合结构域可以包含与由靶向细胞类型表达的抗原(例如，由肿瘤细胞表达的抗原)或其片段结合的任何结构域(参见例如，通过引用以其整体并入本文的Saar Gill等人美国申请号15/747,555)。例如，抗原结合结构域可以是抗体(来自人、小鼠或其它动物)、人源化抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、骆驼科抗体、天然受体或配体或其片段。例如，抗原结合结构域可以是抗体的单链可变片段(scFv)。抗原结合结构域可以针对各种肿瘤相关蛋白，其可以包括EphA2、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、CA-125、MUC-1抗体、CD19、CD20、CD123、CD22、CD30、SlamF7、CD33、EGFRvIII、BCMA、GD2、CD38、PSMA、B7H3、EPCAM、IL-13Ra2、PSCA、间皮素、Her2、LewisY、LewisA、CIAX、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、ras或p53的异常产物、或发现在肿瘤细胞的表面上比临界的正常组织更高度富集的其它蛋白质。任何肿瘤抗原(抗原肽)都可以用于本文所述的肿瘤相关实施方案中。抗原来源包括但不限于癌蛋白。抗原可以表达为肽或者完整的蛋白质或其一部分。完整蛋白质或其一部分可以是天然的或诱变的。肿瘤抗原的非限制性实例包括碳酸酐酶IX (CAIX)、癌胚抗原(CEA)、CD8、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CLL1、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD133、CD138、CD123、CD44V6、巨细胞病毒(CMV)感染细胞的抗原(例如细胞表面抗原)、上皮糖蛋白2 (EGP-2)、上皮糖蛋白40 (EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、受体酪氨酸蛋白激酶erb-B2,3,4 (erb-B2,3,4)、叶酸结合蛋白(FBP)、胎儿乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体-α、神经节苷脂G2 (GD2)、神经节苷脂G3 (GD3)、人表皮生长因子受体2 (HER-2)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、白细胞介素13受体亚基α-2 (IL-13Rα2)、κ-轻链、激酶插入结构域受体(KDR)、Lewis Y (LeY)、L1细胞粘附分子(L1CAM)、黑色素瘤抗原家族A、1 (MAGE-A1)、粘蛋白16 (MUC16)、粘蛋白1 (MUC1)、间皮素(MSLN)、ERBB2、MAGEA3、p53、MART1、GP100、蛋白酶3 (PR1)、酪氨酸酶、存活素、hTERT、EphA2、NKG2D配体、睾丸癌抗原NY-ESO-1、癌胚抗原(h5T4)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、血管内皮生长因子R2 (VEGF-R2)、和肾母细胞瘤蛋白(WT-1)、BCMA、NKCS1、EGF1R、EGFR-VIII、CD99、CD70、ADGRE2、CCR1、LILRB2、PRAME CCR4、CD5、CD3、TRBC1、TRBC2、TIM-3、整联蛋白B7、ICAM-1、CD70、Tim3、CLEC12A和ERBB。

如本文所述，靶向抗体片段或scFv可以针对任何疾病相关抗原或肿瘤相关抗原(TAA)。TAA可以是本领域已知与肿瘤相关的任何抗原。

scFv在本领域中众所周知用作各种构建体中的结合部分(参见例如，Sentman2014 Cancer J. 20 156–159；Guedan 2019 Mol Ther Methods Clin Dev. 12 145–156)。本领域已知的或使用本领域已知的手段针对抗原生成的任何scFv都可以用作结合部分。

CAR的抗原结合能力由细胞外scFv定义。scFv的形式一般是通过柔性肽序列连接的两个可变结构域，其取向为VH-接头-VL或VL-接头-VH。取决于scFv的结构，scFv内的可变结构域的取向可能促成CAR是否在树突状细胞表面上表达或CAR-DC是否靶向抗原和发出信号。另外，可变结构域接头的长度和/或组成可以促成scFv的稳定性或亲和力。

CAR分子的关键组分scFv可以仔细地设计且操纵，以影响肿瘤相对于正常组织的特异性和差异靶向。

通常，细胞外配体结合结构域通过跨膜结构域(Tm)与嵌合抗原受体(CAR)的信号传导转导结构域连接。跨膜结构域穿过细胞膜，将CAR锚定至DC表面，并且将细胞外配体结合结构域连接到信号传导转导结构域，影响CAR在DC表面上的表达。本公开内容中的跨膜结构域的区别特征是在DC的表面处表达，以指导针对预定靶细胞的免疫细胞应答的能力。跨膜结构域可以衍生自天然或合成来源。可替代地，本公开内容的跨膜结构域可以衍生自任何膜结合蛋白质或跨膜蛋白质。

本公开内容的跨膜多肽的非限制性实例包括CD8α或β，T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CDS，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CDS0，CD86，CD134，CD137和CD154。可替代地，跨膜结构域可以是合成的，并且占优势地包含疏水性氨基酸残基(例如，亮氨酸和缬氨酸)。

跨膜结构域可以进一步包含在细胞外配体结合结构域和所述跨膜结构域之间的铰链区。术语“铰链区”一般意指任何寡肽或多肽，其发挥功能以将跨膜结构域与细胞外配体结合结构域相连。特别地，铰链区用于为细胞外配体结合结构域提供更多的灵活性和可及性。铰链区可以包含至多300个氨基酸，优选5至100个氨基酸，且最优选8至50个氨基酸。铰链区可能衍生自天然存在的分子的全部或部分，或者衍生自抗体恒定区的全部或部分，所述分子例如CD28、4-1BB (CD137)、OX-40 (CD134)、CD3ζ、T细胞受体α或β链、CD45、CD4、CD5、CD8b、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、ICOS、CD154。可替代地，铰链区可以是对应于天然存在的铰链序列的合成序列，或者铰链区可以是完全合成的铰链序列。在一个实施方案中，铰链结构域包含人CD8α、FcγRIIIα受体或IgG1的部分，并且与其具有至少80%、90%、95%、97%或99%的序列同一性。

铰链，也称为间隔区，位于将结合单元与跨膜结构域分开的CAR的细胞外结构区域中。铰链可以是能够确保树突状细胞与靶接近的任何部分。铰链可以是能够确保DC与靶接近的任何部分(例如，基于CD8的铰链)。除了基于受体的整个细胞外部分的CAR之外，大多数CAR (如CAR T)细胞被设计为具有免疫球蛋白(Ig)样结构域铰链或CD8铰链，但提供在跨膜结构域和靶结合结构域之间的空间的任何蛋白质序列都可以充当有效铰链。

铰链一般对于有效的CAR表达和活性供应稳定性。铰链(也与跨膜结构域组合)也确保了与靶的适当接近。

铰链还提供了接近靶向抗原的灵活性。给定CAR的最佳间隔区长度可以取决于靶向表位的位置。长间隔区可以为CAR提供额外的灵活性，并且允许更好地接近膜近端表位或复杂的糖基化抗原。带有短铰链的CAR在结合膜远端表位方面可以是更有效的。间隔区的长度对于为免疫突触形成提供足够的细胞间距离可能是重要的。因此，铰链可以相应地对于各个表位进行优化。

此处，铰链可以可操作地连接到跨膜结构域。

任选地，细胞外信号传导结构域可以掺入CAR构建体内，以传播信号传导。细胞外信号传导结构域可以克隆到铰链区内，但可以基于靶进行选择。

信号肽指导分泌或跨膜蛋白质向细胞膜和/或细胞表面的转运，以允许多肽的正确定位。特别地，本公开内容的信号肽将附加多肽，即CAR受体导向细胞膜，其中附加多肽的细胞外配体结合结构域展示在细胞表面上，附加多肽的跨膜结构域跨越细胞膜，并且附加多肽的信号传导转导结构域位于细胞的细胞质部分中。在一个实施方案中，信号肽是来自人CD8α的信号肽。功能片段被定义为CD8α信号肽的至少10个氨基酸的片段，其将附加多肽导向细胞膜和/或细胞表面。

本公开内容的CAR-DC可以包含一种或多种不同的CAR构建体。例如，双重CAR-DC可以通过以下生成：将第一细胞外配体结合结构域的蛋白质编码序列克隆到含有一个或多个共刺激结构域和信号传导转导结构域的病毒载体内，并且将第二细胞外配体结合结构域的第二个蛋白质编码序列克隆到含有另外一个或多个共刺激结构域和信号传导转导结构域的同一病毒载体内，导致其两种CAR构建体由同一载体表达的质粒。串联CAR-DC是具有单个嵌合抗原多肽的DC，所述嵌合抗原多肽包含能够与两种不同的细胞表面分子相互作用的两个不同的细胞外配体结合结构域，其中所述细胞外配体结合结构域通过柔性接头连接在一起，并且共享一个或多个共刺激结构域，其中第一细胞外配体结合结构域或第二细胞外配体结合结构域的结合将通过一个或多个共刺激结构域和信号传导转导结构域发信号。

DC或其祖先的遗传修饰可以通过用重组DNA构建体转导基本上同质的细胞组合物来实现。在某些实施方案中，逆转录病毒载体(γ-逆转录病毒或慢病毒)用于将DNA构建体引入细胞内。例如，可以将编码CAR的多核苷酸克隆到逆转录病毒载体内，并且可以由其内源启动子、逆转录病毒长末端重复、或对于目的靶细胞类型特异性的启动子驱动表达。也可以使用其它病毒载体或非病毒载体。

对于使DC或其祖先包括CAR的初始遗传修饰，逆转录病毒载体一般用于转导，然而可以使用任何其它合适的病毒载体或非病毒递送系统。CAR可以在单个多顺反子表达盒、单个载体的多重表达盒或多重载体中用辅助分子(例如细胞因子)进行构建。产生多顺反子表达盒的元件的实例包括但不限于各种病毒和非病毒内部核糖体进入位点(IRES，例如FGF-1IRES、FGF-2 IRES、VEGF IRES、IGF-II IRES、NF-κB IRES、RUNX1 IRES、p53 IRES、甲型肝炎IRES、丙型肝炎IRES、瘟病毒IRES、口蹄疫病毒IRES、微小核糖核酸病毒IRES、脊髓灰质炎病毒IRES和脑心肌炎病毒IRES)和可切割的接头(例如2A肽，例如P2A、T2A、E2A和F2A肽)。在某些实施方案中，本文公开的任何载体或CAR可以包含P2A肽。逆转录病毒载体和合适包装系的组合也是合适的，其中衣壳蛋白对于感染人细胞将是有功能的。各种产生兼嗜性病毒的细胞系是已知的，包括但不限于PA12 (Miller等人(1985) Mol. Cell. Biol. 5:431-437)；PA317 (Miller等人(1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902)；以及CRIP (Danos等人(1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:6460-6464)。非兼嗜性颗粒也是合适的，例如用VSVG、RD114或GALV包膜和本领域已知的任何其它假型化的颗粒。

可能的转导方法还包括例如通过Bregni等人(1992) Blood 80:1418-1422的方法，细胞与生产细胞的直接共培养，或者例如通过Xu等人(1994) Exp. Hemat. 22:223-230；以及Hughes等人(1992) J Clin. Invest. 89:1817的方法，与单独的病毒上清液或者具有或不具有适当生长因子和聚阳离子的浓缩载体原种一起培养。

其它转导病毒载体可以用于修饰DC或其祖先。在某些实施方案中，所选载体显示出高感染效率以及稳定的整合和表达(参见例如，Cayouette等人，Human Gene Therapy 8:423-430，1997；Kido等人，Current Eye Research 15:833-844，1996；Bloomer等人，Journal of Virology 71:6641-6649，1997；Naldini等人，Science 272:263-267，1996；以及Miyoshi等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:10319，1997)。可以使用的其它病毒载体包括例如腺病毒、慢病毒和腺伴随病毒载体、牛痘病毒、牛乳头状瘤病毒或疱疹病毒，例如EB病毒(也参见例如以下的载体：Miller，Human Gene Therapy 15-14，1990；Friedman，Science 244:1275-1281，1989；Eglitis等人，BioTechniques 6:608-614，1988；Tolstoshev等人，Current Opinion in Biotechnology 1:55-61，1990；Sharp，The Lancet337:1277-1278，1991；Cornetta等人，Nucleic Acid Research and Molecular Biology36:311-322，1987；Anderson，Science 226:401-409，1984；Moen，Blood Cells 17:407-416，1991；Miller等人，Biotechnology 7:980-990，1989；LeGal La Salle等人，Science259:988-990，1993；以及Johnson，Chest 107:77S-83S，1995)。逆转录病毒载体特别充分地开发并且已用于临床环境中(Rosenberg等人，N. Engl. J. Med 323:370，1990；Anderson等人，美国专利号5,399,346)。

非病毒方法也可以用于DC或其祖先的遗传修饰。例如，核酸分子可以引入DC或其祖先内，在脂质转染的存在下施用核酸(Feigner等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.84:7413，1987；Ono等人，Neuroscience Letters 17:259，1990；Brigham等人，Am. J. Med.Sci. 298:278，1989；Staubinger等人，Methods in Enzymology 101:512，1983)，脱唾液酸血清类粘蛋白-聚赖氨酸缀合(asialoorosomucoid-polylysine conjugation)(Wu等人，Journal of Biological Chemistry 263:14621，1988；Wu等人，Journal of BiologicalChemistry 264:16985，1989)，或通过在手术条件下的显微注射(Wolff等人，Science 247:1465，1990)。用于基因转移的其它非病毒手段包括使用磷酸钙、DEAE葡聚糖、电穿孔和原生质体融合的体外转染。脂质体也可以潜在地有益于DNA递送到细胞内。将正常基因移植到受试者的受累组织内也可以通过以下实现：将正常核酸离体转移到可培养的细胞类型(例如，自体或异源原代细胞或其子代)内，这之后将该细胞(或其后代)注射到靶向组织内或进行全身注射。还可以使用转座酶或靶向核酸酶(例如锌指核酸酶、大范围核酸酶或TALE核酸酶、CRISPR)衍生或获得重组受体。瞬时表达可以通过RNA电穿孔来获得。

成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)系统是在原核细胞中发现的基因组编辑工具。当用于基因组编辑时，该系统包括Cas9 (能够利用crRNA作为其引导来修饰DNA的蛋白质)，CRISPR RNA (crRNA，含有由Cas9使用以将其引导至宿主DNA的正确区段的RNA，连同与tracrRNA结合的区域(一般为发夹环形式)，与Cas9形成活性复合物)，反式激活crRNA(tracrRNA，与crRNA结合并与Cas9形成活性复合物)，以及DNA修复模板的任选区段(引导细胞修复过程的DNA，允许插入特异性DNA序列)。CRISPR/Cas9经常采用质粒来转染靶细胞。crRNA需要对于每种应用进行设计，因为这是Cas9用于鉴定且直接结合细胞中的靶DNA的序列。还需要对于每种应用设计携带CAR表达盒的修复模板，因为它必须与切口的任一侧上的序列重叠且编码插入序列。多重crRNA和tracrRNA可以包装在一起，形成单引导RNA(sgRNA)。这种sgRNA可以与Cas9基因连接在一起并且制备成质粒，以便转染到细胞内。

锌指核酸酶(ZFN)是人工限制性酶，其通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域组合而生成。锌指结构域可以进行改造，以靶向特异性DNA序列，其允许锌指核酸酶靶向基因组内的所需序列。各个ZFN的DNA结合结构域通常含有多个个别锌指重复，并且可以各自识别多个碱基对。生成新的锌指结构域的最常见方法是将具有已知特异性的较小的锌指“模块”组合。ZFN中最常见的切割结构域是来自IIs型限制性核酸内切酶FokI的非特异性切割结构域。使用内源同源重组(HR)机制和携带CAR表达盒的同源DNA模板，ZFN可以用于将CAR表达盒插入基因组内。当靶向序列被ZFN切割时，HR机制寻找在受损染色体和同源DNA模板之间的同源性，然后将模板序列复制到染色体的两个断裂端部之间，由此将同源DNA模板整合到基因组内。

转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)是可以进行改造以切割特异性DNA序列的限制性酶。TALEN系统以与ZFN几乎相同的原理操作。它们通过将转录激活因子样效应物DNA结合结构域与DNA切割结构域组合而生成。转录激活因子样效应物(TALE)由33-34个氨基酸重复基序组成，具有对于特定核苷酸具有强识别的两个可变位置。通过组装这些TALE的阵列，TALE DNA结合结构域可以进行改造，以结合所需的DNA序列，并且从而引导核酸酶在基因组中的特定位置处切割。用于多核苷酸治疗方法中的cDNA表达可以由任何合适的启动子(例如，人巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40 (SV40)或金属硫蛋白启动子)指导，并且受任何适当的哺乳动物调控元件或内含子(例如延伸因子1a增强子/启动子/内含子结构)调控。例如，需要时，已知优先指导特定细胞类型中的基因表达的增强子可以用于指导核酸的表达。所使用的增强子可以包括但不限于表征为组织或细胞特异性增强子的那些增强子。可替代地，如果基因组克隆用作治疗构建体，则调控可以由同源调节序列来介导，或需要时，由衍生自异源来源的调控序列包括上述任何启动子或调控元件来介导。

所得到的细胞可以在与未修饰的细胞相似的条件下生长，由此修饰的细胞可以扩增并用于各种目的。

任何靶向基因组编辑方法都可以用于将本文公开的CAR置于本文公开的免疫应答细胞的一个或多个内源基因座处。在某些实施方案中，CRISPR系统用于将本文公开的CAR递送至本文公开的免疫应答细胞的一个或多个内源基因座。在某些实施方案中，锌指核酸酶用于将本文公开的CAR递送至本文公开的免疫应答细胞的一个或多个内源基因座。在某些实施方案中，TALEN系统用于将本文公开的CAR递送至本文公开的免疫应答细胞的一个或多个内源基因座。

用于递送基因组编辑试剂/系统的方法可以根据需要而变。在某些实施方案中，所选基因组编辑方法的组分作为在一种或多种质粒中的DNA构建体进行递送。在某些实施方案中，组分经由病毒载体进行递送。常见的递送方法包括但不限于电穿孔、显微注射、基因枪、穿刺感染(impalefection)、静水压力、连续输注、超声处理、磁转染、腺伴随病毒、病毒载体的包膜蛋白假型化、复制型载体顺式和反式作用元件、单纯疱疹病毒和化学媒介物(例如，寡核苷酸、脂质复合物、聚合物囊泡(polymersome)、聚合复合物(polyplex)、树枝状聚合物、无机纳米颗粒和细胞穿透肽)。

本文公开的CAR的放置可以在任何内源基因座处进行。

本公开内容还提供了药物组合物。药物组合物包含作为活性组分的多种CAR-DC和至少一种药学上可接受的赋形剂。

药学上可接受的赋形剂可以是稀释剂、粘合剂、填料、缓冲剂、pH改性剂、崩解剂、分散剂、防腐剂、润滑剂、掩味剂、调味剂或着色剂。可以根据已知的药学原理选择用于形成药物组合物的赋形剂的量和类型。

包含本文公开的CAR-DC的组合物可以方便地作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳状液、分散体或粘性组合物，其可以缓冲至所选的pH。液体制剂通常比凝胶、其它粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物尤其通过注射略微更便于施用。另一方面，粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制，以提供与特定组织的更长接触时期。液体或粘性组合物可以包含载体，其可以是溶剂或分散介质，含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等等)及其合适的混合物。

可以通过将CAR-DC与各种量的其它成分(根据需要)一起掺入所需量的适当溶剂中，来制备无菌可注射溶液。此类组合物可以与合适的载体、稀释剂或赋形剂例如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等等混合。组合物也可以是冻干的。组合物可以含有辅助物质，例如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝剂或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、色素等等，取决于所需的施用途径和制剂。可以参考标准文本，例如通过引用并入本文的“REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE”，第17版，1985，以制备合适的制剂，而无需过度实验。

可以添加增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等等，来确保微生物作用的预防。可以通过使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，来达到可注射药物形式的延长吸收。然而，根据本文公开的主题，所使用的任何媒介物、稀释剂或添加剂都必须与CAR-DC或其祖先相容。

组合物可以是等渗的，即它们可以具有与血液和泪液相同的渗透压。可以使用氯化钠或其它药学上可接受的试剂例如右旋糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或者其它无机或有机溶质，来实现组合物的所需等渗性。氯化钠可以特别用于含有钠离子的缓冲液。

需要时，可以使用药学上可接受的增稠剂将组合物的粘度维持在所选择的水平下。例如，甲基纤维素可容易且经济地获得，并且易于操作。其它合适的增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等等。增稠剂的浓度可以取决于所选择的试剂。重要的一点是使用将达到所选粘度的量。显然，合适载体和其它添加剂的选择将取决于确切的施用途径和特定剂型例如液体剂型(例如，组合物是否被配制成溶液、悬浮液、凝胶或另一种液体形式，例如定时释放形式或液体填充形式)的性质。

待施用的细胞数量将对于待治疗的受试者而变。在一个实施方案中，将约10³至约10¹⁰、约10⁵至约10⁹、或约10⁶至约10⁸个本文公开的CAR-DC施用于人受试者。更有效的细胞可以以甚至更少的数目进行施用。在某些实施方案中，将至少约1×10⁸、约2×10⁸、约3×10⁸、约4×10⁸、或约5×10⁸个本文公开的CAR-DC施用于人受试者。在某些实施方案中，将约1×10⁷至5×10⁸个本文公开的CAR-DC施用于人受试者。被视为有效剂量的精确确定可以基于对于每个受试者个体的因素，包括其大小、年龄、性别、重量和特定受试者的状况。根据本公开内容和本领域的知识，本领域技术人员可以容易地确定剂量。

本领域技术人员可以容易地确定组合物中并且待在方法中施用的细胞和任选的添加剂、媒介物和/或载体的量。通常，任何添加剂(除活性细胞和/或试剂之外)以0.001至50% (重量)溶液的量存在于磷酸盐缓冲盐水中，并且活性成分以微克到毫克的数量级存在，例如约0.0001至约5重量%、约0.0001至约1重量%、约0.0001至约0.05重量%、或约0.001至约20重量%、约0.01至约10重量%、或约0.05至约5重量%。对于待施用于动物或人的任何组合物，可以确定下述：毒性，例如通过在合适的动物模型例如啮齿类动物如小鼠中确定致死剂量(LD)和LD₅₀；组合物的剂量、其中组分的浓度和组合物的施用时机，其引发合适的应答。根据技术人员的知识、本公开内容和本文引用的文件，此类确定不需要过度实验。并且，用于序贯施用的时间可以无需过度实验进行确定。

包含本文公开的CAR-DC的组合物可以全身性地或直接地提供给受试者，用于诱导和/或增强针对抗原的免疫应答和/或治疗和/或预防瘤、病原体感染或传染病。在某些实施方案中，将本文公开的CAR-DC或包含其的组合物直接注射到目的肿瘤或器官(例如，受瘤形成影响的器官)内。可替代地，例如，通过施用到循环系统(例如，肿瘤脉管系统)内，将本文公开的CAR-DC或包含其的组合物间接地提供给目的器官。可以在细胞或组合物施用之前、期间或之后提供扩增剂和分化剂，以增加在体外或体内的T细胞、NK细胞或CTL细胞产生。

本文公开的CAR-DC可以在任何生理上可接受的媒介物中，通常在血管内进行施用，尽管它们也可以引入骨或其它方便的部位内，在所述部位中，细胞可以找到用于再生和分化的适当部位(例如，淋巴管)。通常，将施用至少约1×10⁵个细胞的群体。本文公开的CAR-DC可以包含纯化的细胞群体。本领域技术人员可以使用各种众所周知的方法，例如荧光激活细胞分选(FACS)，容易地确定本文CAR-DC在群体中的百分比。包含本文公开的CAR-DC的群体中的合适纯度范围为约50%至约55%、约5%至约60%和约65%至约70%。在某些实施方案中，纯度为约70%至约75%、约75%至约80%或约80%至约85%。在某些实施方案中，纯度为约85%至约90%、约90%至约95%和约95%至约100%。剂量可以通过本领域技术人员容易地进行调整(例如，纯度的降低可能需要剂量的增加)。细胞可以通过注射、导管等等进行引入。

本文公开的组合物可以是药物组合物，其包含本文公开的CAR-DC或其祖先和药学上可接受的载体。施用可以是自体的或异源的。例如，CAR-DC或祖先可以从一个受试者获得，并且施用于同一受试者或不同的相容受试者。外周血衍生的CAR-DC或其子代(例如，在体内、离体或体外衍生的)可以经由局部注射包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外施用进行施用。当施用本文公开主题的治疗组合物(例如，包含本文公开的CAR-DC的药物组合物)时，它可以以单位剂量的可注射形式(溶液、悬浮液、乳状液)进行配制。

II. 方法

本文公开的和/或使用本文公开的方法生成的细胞可以用于免疫疗法和过继性细胞转移中，用于治疗癌症、自身免疫性疾病、传染病及其它病况，或者制造用于治疗癌症、自身免疫性疾病、传染病及其它病况的药物。本公开内容的一个方面提供了刺激适应性抗肿瘤T细胞应答的修饰的树突状细胞。

如本文所述，适应性抗肿瘤T细胞应答可以通过来自CAR-DC的抗原交叉呈递或交叉引发得到启动或增强。交叉呈递描述了其中修饰的树突状细胞吸收、加工且呈递在细胞表面上与MHC I分子的复合物上的抗原(例如，肿瘤细胞抗原)的过程。抗原然后被T细胞识别。交叉引发描述了其中抗原被T细胞识别导致T细胞变得激活的过程。激活的T细胞然后能够具有增强的增殖、持久性和/或针对表达该抗原的肿瘤细胞的靶向、增强的细胞毒性。

如本文所述，在一个非限制性实例中，适应性抗肿瘤T细胞应答可以包含T细胞功能的增加。例如，T细胞功能可以通过细胞毒性T细胞淋巴细胞测定(CTL)进行评价，其中使逐步升高比率的效应T细胞与靶肿瘤细胞混合限定的时间量(一般为4小时)，并且通过肿瘤荧光素酶活性定量肿瘤细胞杀死。

如本文所述，适应性抗肿瘤T细胞应答还可以包含T细胞活化或增殖的增加。例如，可以通过针对增殖或活化标记物如细胞因子释放的FACS分析，通过评价CD4和CD8 T细胞分裂，来测量T细胞活化或增殖。

如本文所述，成功的适应性抗肿瘤T细胞应答可以导致肿瘤细胞的细胞毒性、进一步的肿瘤细胞吞噬作用和肿瘤体积的减小。抗肿瘤T细胞应答可以直接消除CAR靶向的抗原阳性(Ag⁺)肿瘤，并且通过交叉呈递和表位扩散间接消除CAR-Ag^-肿瘤细胞(不被CAR直接识别)。表位扩散指免疫应答的扩展，以包括最初触发免疫应答的抗原之外的T细胞和抗体特异性。例如，表位扩散可以导致并不表达被CAR靶向的抗原的肿瘤细胞被T细胞靶向。

因此，本公开内容提供了在受试者中刺激适应性抗肿瘤T细胞应答的方法，其中所述方法一般包括向受试者施用有效量的CAR-DC。CAR-DC靶向肿瘤细胞或癌细胞，吞噬肿瘤细胞或癌细胞，并且将肿瘤抗原交叉呈递给受试者的T细胞。相应地，CAR-DC直接靶向抗原阳性(Ag⁺)肿瘤细胞或癌细胞用于消除，和/或通过交叉呈递和表位扩散间接靶向CAR抗原阴性(Ag^-)肿瘤细胞或癌细胞用于消除。

在另一个实施方案中，本公开内容提供了用于减少或预防受试者中的癌症复发的方法，其中所述方法一般包括向受试者施用有效量的CAR-DC，其靶向由癌细胞或肿瘤细胞表达的抗原。当癌症在初始治疗后恢复时，发生复发。这可以在原发性或原始癌症治疗后几周、几个月或甚至几年发生。如本文所述，本公开内容显示了产生持久的适应性抗肿瘤T细胞应答，参见例如实施例1 (vi)。

在一些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗受试者中的癌症或肿瘤的方法，其中所述方法一般包括向受试者施用有效量的CAR-DC，其靶向由癌细胞或肿瘤细胞表达的抗原。这种治疗方法对于实体瘤可以是特别有效的，但可以针对任何形式的癌症。迄今为止，在临床试验中，传统的嵌合抗原受体(CAR) T细胞在实体瘤中仅显示出1%的完全应答。如果不是所有细胞都表达靶抗原，则实体瘤逃避CAR T识别。在患者中成功地产生适应性免疫应答将克服两类免疫疗法的失败。树突状细胞(DC)在启动适应性免疫应答中是关键的。CAR-DC使得新的治疗策略能够直接消除CAR靶向的抗原阳性(Ag+)肿瘤，并且通过表位扩散间接消除Ag-实体瘤细胞(不被CAR识别)。

肿瘤或癌症可以是在以下中发生的任何肿瘤或癌症(或者是源自以下的转移性癌症)：膀胱、乳腺、骨、宫颈、肌肉、脑和神经系统、内分泌系统、子宫内膜、眼、唇、口、肝、肺、胃肠系统(如结肠、直肠)、泌尿生殖系统和妇科系统(如宫颈、卵巢)、头和颈、造血系统、肾、皮肤、胰腺、前列腺、甲状腺、骨、胸部和呼吸系统、或已经历恶性转化的任何其它人组织。实体瘤是衍生自除血细胞外的任何人细胞的肿瘤。

癌症可以是血液系统恶性肿瘤或实体瘤。血液系统恶性肿瘤包括白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤及其亚型。淋巴瘤可以通过多种方式经常基于恶性细胞的潜在类型进行分类，包括何杰金氏淋巴瘤(经常是里斯氏细胞(Reed-Sternberg cell)的癌症，但有时也起源于B细胞；所有其它淋巴瘤都是非何杰金氏淋巴瘤)、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、以及如本文定义和本领域已知的其它淋巴瘤。

B细胞淋巴瘤包括但不限于弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、以及如本文定义和本领域已知的其它B细胞淋巴瘤。

T细胞淋巴瘤包括T细胞急性成淋巴细胞性白血病/淋巴瘤(T-ALL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、T细胞慢性淋巴细胞性白血病(T-CLL)、西泽里综合征、以及如本文定义和本领域已知的其它T细胞淋巴瘤。

白血病包括急性髓样(或粒细胞性)白血病(AML)、慢性髓样(或粒细胞性)白血病(CML)、急性淋巴细胞性(或成淋巴细胞性)白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病(有时分类为淋巴瘤)、以及如本文定义和本领域已知的其它白血病。

浆细胞恶性肿瘤包括淋巴浆细胞性淋巴瘤、浆细胞瘤和多发性骨髓瘤。

在一些实施方案中，药物可以用于治疗患者中的癌症，特别是用于治疗实体瘤例如黑色素瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤或癌例如脑肿瘤、头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤(例如非小细胞肺癌、NSCLC)、生殖道(例如卵巢)肿瘤、上消化道肿瘤、胰腺肿瘤、肝肿瘤、肾系统(例如肾)肿瘤、膀胱肿瘤、前列腺肿瘤和结肠直肠肿瘤。

在另一个实施方案中，药物可以用于治疗患者中的癌症，特别是用于治疗选自多发性骨髓瘤和急性髓样白血病(AML)的血液系统恶性肿瘤，以及选自T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)、非何杰金氏淋巴瘤和T细胞慢性淋巴细胞性白血病(T-CLL)的T细胞恶性肿瘤。

可以用本公开内容的方法治疗的瘤或癌症的非限制性实例可以包括急性成淋巴细胞性白血病、急性髓样白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤(儿童期小脑或大脑)、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤(小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视路和下丘脑神经胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤、类癌瘤(儿童期、胃肠道)、原发灶不明癌、中枢神经系统淋巴瘤(原发性)、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、宫颈癌、儿童期癌症、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性骨髓增生性病症、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文肿瘤家族中的尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤(儿童期)、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌(眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤)、胆囊癌、胃部(胃)癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道基质肿瘤、生殖细胞肿瘤(儿童期颅外、性腺外、卵巢)、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤(成人、儿童期脑干、儿童期大脑星形细胞瘤、儿童期视路和下丘脑)、胃类癌、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞(肝)癌、何杰金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑和视路神经胶质瘤(儿童期)、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病(急性成淋巴细胞性、急性髓样、慢性淋巴细胞性、慢性粒细胞性、毛细胞)、唇癌和口腔癌、肝癌(原发性)、肺癌(非小细胞、小细胞)、淋巴瘤(AIDS相关、伯基特、皮肤T细胞、何杰金、非何杰金、原发性中枢神经系统)、巨球蛋白血症(华氏)、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、髓母细胞瘤(儿童期)、黑色素瘤、眼内黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤(成人恶性、儿童期)、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌、口癌、多发性内分泌肿瘤综合征(儿童期)、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、粒细胞性白血病(慢性)、髓样白血病(成人急性、儿童期急性)、多发性骨髓瘤、骨髓增生性病症(慢性)、鼻腔癌和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非何杰金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮-基质肿瘤)、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度潜在恶性肿瘤、胰腺癌、胰腺癌(胰岛细胞)、鼻旁窦癌和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤(儿童期)、垂体腺瘤、浆细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤(儿童期)、唾液腺癌、肉瘤(尤文肿瘤家族、卡波西、软组织、子宫)、西泽里综合征、皮肤癌(非黑色素瘤、黑色素瘤)、皮肤癌(默克尔细胞)、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、隐匿性原发性(转移性)鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤(儿童期)、T细胞淋巴瘤(皮肤)、T细胞白血病和淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤(儿童期)、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、甲状腺癌(儿童期)、肾盂和输尿管移行细胞癌、滋养细胞肿瘤(妊娠)、原发灶不明(成人、儿童期)、输尿管和肾盂移行细胞癌、尿道癌、子宫癌(子宫内膜)、子宫肉瘤、阴道癌、视路和下丘脑神经胶质瘤(儿童期)、外阴癌、华氏巨球蛋白血症或肾母细胞瘤(儿童期)。

因此，本公开内容的各方面是用于治疗有需要的受试者的方法。如本文使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”指通过受过训练且持证的专业人员向有需要的受试者提供医疗护理。医疗护理可以是诊断测试、治疗性治疗和/或预防性或预防措施。治疗性和预防性治疗的目的是预防或减缓(减轻)不希望的生理变化或疾病/病症。治疗性或预防性治疗的有益或所需的临床结果包括但不限于无论是可检测还是不可检测的症状的减轻、疾病程度的缩减、疾病的稳定(即，不恶化)状态、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分还是全部的)。“治疗”还可以意指与如果未接受治疗的预计存活相比的延长存活。需要治疗的人包括已经患有疾病、病况或病症的人，以及倾向于患有疾病、病况或病症的人，或者其中待预防疾病、病况或病症的人。

还提供的是治疗或预防受试者中的增生性疾病、病症或病况(例如，肿瘤或癌症或其转移)的方法，所述受试者需要施用治疗有效量的如本文所述的基于树突状细胞的疗法，以便减少或消除肿瘤或癌症。

本文所述的方法一般对有需要的受试者执行。需要本文所述的治疗方法的受试者可以是患有、诊断有、怀疑患有癌症或者增生性疾病、病症或病况的受试者；或处于发展癌症或者增生性疾病、病症或病况的风险中的受试者。通常通过病史、体格检查或者与所讨论的疾病或状况一致的诊断测试来评价治疗需要的确定。可通过本文所述方法治疗的各种病况的诊断在本领域的技术内。受试者可以是动物受试者，包括哺乳动物，例如马、牛、犬、猫、羊、猪、小鼠、大鼠、猴、仓鼠、豚鼠和人或鸡。例如，受试者可以是人受试者。

一般地，CAR-DC疗法的安全和有效量是例如将在受试者中引起所需的疗效，同时使不需要的副作用降到最低的量。在各个实施方案中，本文所述的基于树突状细胞的疗法的有效量可以显著抑制肿瘤生长或癌症进展，减缓肿瘤或癌症的进展，或者限制肿瘤或癌症的发展。

当用于本文所述的治疗中时，治疗有效量的CAR-DC疗法可以以纯形式采用，或者当存在此类形式时，以药学上可接受的盐形式并且连同或不连同药学上可接受的赋形剂一起采用。例如，本公开内容的化合物可以以适用于任何医学治疗的合理利益/风险比，以足以减少或治愈增生性疾病、病症或病况的量施用。

可以与药学上可接受的载体组合以产生单一剂型的本文所述组合物的量将根据所治疗的宿主和特定的施用模式而变。本领域技术人员将了解，包含在每种剂型的个别剂量中的药剂的单位含量本身无需构成治疗有效量，因为必需的治疗有效量可以通过施用多个个别剂量来达到。

本文描述的组合物的毒性和治疗功效可以通过用于确定LD₅₀ (对50%的群体致死的剂量)和ED₅₀ (在50%的群体中的治疗有效的剂量)的标准药学程序在细胞培养物或实验动物中进行确定。毒性效应和疗效之间的剂量比是治疗指数，其可以表示为比率LD₅₀/ED₅₀，其中较大的治疗指数在本领域中一般被理解为最佳的。

对于任何特定受试者的具体治疗有效剂量水平将取决于各种因素，包括待治疗的病症和病症的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；受试者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；施用时间；施用途径；所采用的组合物的排泄率；治疗的持续时间；与所采用的具体化合物组合或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的类似因素(参见例如，Koda-Kimble等人(2004) Applied Therapeutics: The Clinical Use ofDrugs，Lippincott Williams & Wilkins，ISBN 0781748453；Winter (2003) BasicClinical Pharmacokinetics，第4版，Lippincott Williams & Wilkins，ISBN0781741475；Sharqel (2004) Applied Biopharmaceutics & Pharmacokinetics，McGraw-Hill/Appleton & Lange，ISBN 0071375503)。例如，以低于实现所需疗效需要的水平起始组合物的剂量并逐渐增加剂量直至达到所需效应，这完全在本领域的技术内。需要时，可以将有效日剂量分成多重剂量用于施用的目的。因而，单一剂量组合物可以含有此类量或其约数，以构成日剂量。然而，应理解，本公开内容的化合物和组合物的总每日使用量将由主治医生在合理医学判断的范围内决定。

再次，本文所述的每种状态、疾病、病症和病况以及其它，都可以受益于本文所述的组合物和方法。一般地，治疗状态、疾病、病症或病况包括预防或延迟哺乳动物中的临床症状的出现，所述哺乳动物可能患有或易患所述状态、疾病、病症或病况，但尚未经历或展示其临床症状或亚临床症状。治疗还可以包括抑制状态、疾病、病症或病况，例如，阻止或减少疾病或者其至少一种临床症状或亚临床症状的发展。此外，治疗可以包括缓解疾病，例如引起状态、疾病、病症或病况或者其临床症状或亚临床症状中的至少一种的消退。对于待治疗的受试者的益处可以是统计上显著的或者至少对于受试者或医生可感知的。

CAR-DC疗法的施用可以作为单一事件或在治疗的时间过程中发生。例如，可以每天、每周、每两周或每月施用一次基于树突状细胞的疗法。对于更慢性的病况，治疗可以从几周延长到几个月或几年。

按照本文所述方法的治疗可以在用于癌症或者增生性疾病、病症或病况的常规治疗模式之前、同时或之后执行。

CAR-DC疗法可以与另一种药剂例如抗癌疗法，或另一种药剂同时或序贯施用。例如，基于树突状细胞的疗法可以在另一种药剂例如化学治疗剂、另一种形式的免疫疗法或放射疗法之前、之后或同时施用。同时施用可以通过施用分开的组合物而发生，每种组合物含有基于树突状细胞的疗法和另一种药剂例如化学治疗剂、另外的免疫疗法或放射疗法中的一种或多种。同时施用可以通过施用一种组合物而发生，所述组合物含有基于树突状细胞的疗法、抗生素、抗炎剂或另一种药剂例如化学治疗剂、免疫疗法或放射疗法中的两种或更多种。

本公开内容的CAR-DC或CAR-DC群体的施用通过气溶胶吸入、注射、摄入、输血、植入或移植来进行。本文所述的CAR-DC组合物，即单CAR、双CAR、串联CAR，可以皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌内、通过静脉内注射或淋巴管内注射、或腹膜内施用于患者。在一个实施方案中，本公开内容的细胞组合物优选通过静脉内注射进行施用。

如上文指出的，CAR-DC细胞或CAR-DC群体的施用可以由以下组成：施用10³-10⁹个细胞/kg体重，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重，包括在这些范围内的细胞数目的所有整数值。CAR-DC或CAR-DC群体可以以一个或多个剂量进行施用。在另一个实施方案中，有效量的CAR-DC或CAR-DC群体作为单一剂量进行施用。在另一个实施方案中，有效量的细胞作为多于一个剂量在一段时间内进行施用。施用时机在医疗保健提供者的判断内，并且取决于患者的临床状况。CAR-DC或CAR-DC群体可以得自任何来源，例如血库或供体。虽然患者的需求不同，但给定CAR-DC群体对于特定疾病或病况的有效量的最佳范围的确定在本领域的技术内。有效量意指提供治疗或预防益处的量。所施用的剂量将取决于患者受体的年龄、健康和重量，同时治疗的类型(如果有的话)，治疗频率以及所需效应的性质。

在另一个实施方案中，有效量的CAR-DC或CAR-DC群体或包含那些CAR-DC的组合物是肠胃外施用的。施用可以是静脉内施用。CAR-DC或CAR-DC群体或包含那些CAR-DC的组合物的施用可以通过在肿瘤内注射直接完成。

在本公开内容的一个实施方案中，CAR-DC或CAR-DC群体与任何数目的相关治疗模式结合，例如在其之前、同时或之后施用于患者，所述治疗模式包括但不包括限于用细胞因子治疗，或来自CAR-DC内的细胞因子表达，所述细胞因子增强树突状细胞或T细胞增殖和持久性，并且包括但不限于Flt3L、IL-2、IL-7和IL-15或其类似物。

在一些实施方案中，本公开内容的CAR-DC或CAR-DC群体可以与抑制免疫抑制途径的药剂组合使用，所述药剂包括但不限于TGFβ抑制剂、白细胞介素10 (IL-10)、腺苷、VEGF、吲哚胺2,3双加氧酶1 (IDO1)、吲哚胺2,3-双加氧酶2 (IDO2)、色氨酸2-3-双加氧酶(TDO)、乳酸、缺氧、精氨酸酶和前列腺素E2的抑制剂。

在另一个实施方案中，本公开内容的CAR-DC或CAR-DC群体可以与T细胞检查点抑制剂组合使用，所述T细胞检查点抑制剂包括但不限于抗CTLA4 (例如伊匹木单抗)、抗PD1(例如帕博利珠单抗、纳武单抗、西米普利单抗)、抗PDL1 (例如阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗)、抗PDL2、抗BTLA、抗LAG3、抗TIM3、抗VISTA、抗TIGIT和抗KIR。

在另一个实施方案中，本公开内容的CAR-DC或CAR-DC群体可以与T细胞激动剂组合使用，所述T细胞激动剂包括但不限于刺激CD28、ICOS、OX-40、CD27、4-1BB、CD137、GITR和HVEM的抗体。

在另一个实施方案中，本公开内容的CAR-DC或CAR-DC群体可以与治疗性溶瘤病毒组合使用，所述溶瘤病毒包括但不限于逆转录病毒、微小核糖核酸病毒、弹状病毒、副粘病毒、呼肠孤病毒、细小病毒、腺病毒、疱疹病毒和痘病毒。

在另一个实施方案中，本公开内容的CAR-DC或CAR-DC群体可以与免疫刺激疗法组合使用，所述免疫刺激疗法例如toll样受体激动剂，包括但不限于TLR3、TLR4、TLR7和TLR9激动剂。

在另一个实施方案中，本公开内容的CAR-DC或CAR-DC群体可以与干扰素基因刺激剂(STING)激动剂例如环状GMP-AMP合酶(cGAS)组合使用。

III.试剂盒

还提供的是试剂盒。此类试剂盒可以包括本文所述的药剂或组合物，并且在某些实施方案中，包括施用说明书。此类试剂盒可以促进本文所述方法的执行。当作为试剂盒供应时，组合物的不同组分可以包装在分开的容器中并恰在使用前混合。组分包括但不限于DC细胞、DC祖先、DC前体或其修饰的细胞、CAR构建体、或CAR-DC细胞或编码CAR构建体的核酸序列、以及递送系统。需要时，组分的此类分开包装可以存在于包装或分配装置中，所述包装或分配装置可以包含含有该组合物的一种或多种单位剂型。例如，该包装可以包含金属或塑料箔，例如泡罩包装。在某些情况下，组分的此类分开包装还可以允许长期贮存而不丧失组分的活性。

试剂盒还可以包括在分开容器中的试剂，例如无菌水或盐水，以添加到分开包装的冻干活性组分中。例如，密封的玻璃安瓿可以含有冻干组分，并且在分开的安瓿中，含有无菌水、无菌盐水或无菌，其各自已在中性非反应气体例如氮下进行包装。安瓿可以由任何合适的材料组成，所述材料例如玻璃、有机聚合物例如聚碳酸酯、聚苯乙烯、陶瓷、金属或通常用于容纳试剂的任何其它材料。合适容器的其它实例包括可以由与安瓿类似的物质制成的瓶，以及可以由箔衬里内部如铝或合金组成的封套。其它容器包括试管、小瓶、烧瓶、瓶、注射器等等。容器可以具有无菌接入端口，例如具有可以被皮下注射针刺穿的塞子的瓶。其它容器可能具有通过可容易去除的膜分开的两个区室，所述膜在去除后允许组分混合。可去除的膜可以是玻璃、塑料、橡胶等等。

在某些实施方案中，试剂盒可以与说明材料一起供应。说明书可以印刷在纸或其它基材上，和/或可以作为电子可读介质或视频供应。详细说明书可能与试剂盒没有物理关联；相反，用户可能被导向由试剂盒的制造商或分销商指定的互联网网站。

如本文所述的对照样品或参考样品可以是来自健康受试者或来自随机受试者组的样品。可以使用参考值代替先前从健康受试者或一组健康受试者获得的对照样品或参考样品。对照样品或参考样品也可以是具有已知量的可检测化合物的样品或掺料样品。

本发明的方法和算法可以包含在控制器或处理器中。此外，本发明的方法和算法可以体现为计算机实现的方法或用于执行此类计算机实现的一种或多种方法的方法，并且还可以以有形或非瞬态计算机可读存储介质的形式体现，所述存储介质含有计算机程序或其它机器可读指令(在本文中“计算机程序”)，其中当计算机程序加载到计算机或其它处理器(在本文中“计算机”)内和/或由计算机执行时，计算机成为用于实践一种或多种方法的仪器。用于包含此类计算机程序的存储介质包括例如软盘和磁盘、光盘(CD)-ROM (无论是否可写入)、DVD数字光盘、RAM和ROM存储器、计算机硬盘驱动器和备份驱动器、外部硬盘驱动器、“拇指”驱动器以及由计算机可读的任何其它存储介质。一种或多种方法也可以以计算机程序的形式体现，例如，无论是存储在存储介质中还是通过传输介质如电导体、光导纤维或其它光导体，或者通过电磁辐射进行传输，其中当计算机程序加载到计算机内和/或由计算机执行时，计算机成为用于实践一种或多种方法的仪器。一种或多种方法可以在通用微处理器上或在专门配置为实践一个或多个过程的数字处理器上实现。当采用通用微处理器时，计算机程序代码配置微处理器的电路，以创建特定的逻辑电路布置。由计算机可读的存储介质包括由计算机本身或另一种机器可读的介质，所述机器读取计算机指令用于将这些指令提供给计算机用于控制其操作。此类机器可以包括例如用于读取上文提到的存储介质的机器。

一般技术

除非另有说明，否则本公开内容的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述技术在本领域的技术内。此类技术在文献中得到充分说明，所述文献例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989) Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait，编辑1984)；Methods in Molecular Biology，Humana Press；Cell Biology: ALaboratory Notebook (J. E. Cellis，编辑，1989) Academic Press；Animal CellCulture (R. I. Freshney，编辑1987)；Introuction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather和P. E. Roberts，1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures (A. Doyle，J. B. Griffiths和D. G. Newell，编辑1993-8) J.Wiley和Sons；Methods in Enzymology (Academic Press，Inc.)；Handbook ofExperimental Immunology (D. M. Weir和C. C. Blackwell，编辑): Gene TransferVectors for Mammalian Cells (J. M. Miller和M. P. Calos，编辑，1987)；CurrentProtocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel等人编辑1987)；PCR: ThePolymerase Chain Reaction，(Mullis等人，编辑1994)；Current Protocols inImmunology (J. E. Coligan等人，编辑，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley和Sons，1999)；Immunobiology (C. A. Janeway和P. Travers，1997)；Antibodies(P. Finch，1997)；Antibodies: a practice approach (D. Catty.，编辑，IRL Press，1988-1989)；Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd和C. Dean，编辑，Oxford University Press，2000)；Using antibodies: a laboratory manual (E.Harlow和D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；The Antibodies (M.Zanetti和J. D. Capra，编辑Harwood Academic Publishers，1995)；DNA Cloning: Apractical Approach，第I和II卷(D.N. Glover 编辑1985)；Nucleic Acid Hybridization(B.D. Hames & S.J. Higgins 编辑(1985»；Transcription and Translation (B.D.Hames & S.J. Higgins，编辑(1984»；Animal Cell Culture (R.I. Freshney，编辑(1986»；Immobilized Cells and Enzymes (lRL Press，(1986»；以及B. Perbal，Apractical Guide To Molecular Cloning (1984)；F.M. Ausubel等人(编辑)。

为了使本发明可以更容易理解，首先定义某些术语。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明的实施方案所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。与本文所述的方法和材料相似、修改或等价的许多方法和材料可以用于本发明的实施方案的实践中，而无需过度实验，优选的材料和方法在本文中进行描述。在描述且请求保护本发明的实施方案时，下述术语将按照下文阐述的定义使用。

如本文使用的，术语“约”指可以就任何可定量的变量而言，例如通过典型的测量技术和设备而发生的数值数量的变化，所述变量包括但不限于质量、体积、时间、距离和量。进一步地，鉴于现实世界中使用的固体和液体处理程序，存在某些无意的误差和变化，其很可能是由于用于制备组合物或执行方法等等的成分的制造、来源或纯度的差异。术语“约”也包含可以是至多±5%，但也可以是±4%、3%、2%、1%等的这些变化。无论是否被术语“约”修饰，权利要求包括数量的等价物。

当介绍本公开内容的要素或其优选方面时，冠词“一个”、“一种”、“该”和“所述”预期意指存在一个或多个/一种或多种要素。术语“包含”、“包括”和“具有”预期是包括在内的，并且意指可能存在除所列要素外的另外要素。

术语“患者”、“受试者”、“个体”等等在本文中可互换使用，并且指适应本文所述方法的任何动物或其细胞，无论是在体外还是原位。在某些非限制性实施方案中，患者、受试者或个体是人。

如本文使用的，术语“受试者”指哺乳动物，优选人。哺乳动物包括但不限于人、灵长类动物、家畜、啮齿类动物和宠物。受试者可能正在等待医疗护理或治疗，可能处于医疗护理或治疗下，或者可能已接受医疗护理或治疗。

本文描述的是生成嵌合抗原受体树突状细胞(CAR-DC)的方法。

将前体细胞，例如干细胞、单核细胞或在这种情况下的骨髓细胞分离，在Flt3L中生长约1天，然后用目的CAR进行病毒转导，然后用Flt3L进一步分化约2-15天，以生成用于在体内或体外使用的DC样细胞。可以通过FACS分析，使用识别细胞表面上的CAR的抗体，来评价CAR表达。此处使用逆转录病毒或慢病毒来完成病毒转导，但可以用任何基因递送方法来实现。

提供下述定义和方法，以更好地定义本发明并且在本发明的实践中指导本领域的普通技术人员。除非另有说明，否则术语由相关领域的普通技术人员根据常规用法来理解。

如本文使用的，术语“异源DNA序列”、“外源DNA区段”或“异源核酸”各自指这样的序列，其源于对于特定宿主细胞外来的来源，或者，如果源于相同来源，则从其原始形式进行修饰。因此，宿主细胞中的异源基因包括这样的基因，其对于特定宿主细胞是内源性的，但已通过例如DNA改组或克隆的使用进行修饰。该术语还包括天然存在的DNA序列的非天然存在的多重拷贝。因此，该术语指这样的DNA区段，其对于细胞是外来的或异源的，或与细胞同源但在宿主细胞核酸内通常未发现该元件的位置中。表达外源DNA区段以得到外源多肽。“同源”DNA序列是与它引入其内的宿主细胞天然相关的DNA序列。

表达载体、表达构建体、质粒或重组DNA构建体一般被理解为指这样的核酸，其已经由人为干预包括通过重组手段或直接化学合成，用一系列指定的核酸元件生成，所述核酸元件允许特定核酸在例如宿主细胞中的转录或翻译。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的部分。通常，表达载体可以包括与启动子可操作地连接的待转录的核酸。

“启动子”一般被理解为指导核酸转录的核酸控制序列。诱导型启动子一般被理解为响应特定刺激，介导可操作连接的基因转录的启动子。启动子可以包括在转录起始位点附近的必需核酸序列，例如在聚合酶II型启动子的情况下，TATA元件。启动子可以任选地包括远端增强子或阻遏子元件，其定位可以距离转录起始位点多达几千个碱基对。

如本文使用的，“可转录的核酸分子”指能够转录成RNA分子的任何核酸分子。用于将构建体引入细胞内的方法是已知的，其方式是这样的，使得可转录的核酸分子转录成功能性mRNA分子，所述功能性mRNA分子被翻译并因此作为蛋白质产物表达。构建体也可以被构建为能够表达反义RNA分子，以便抑制特定的目的RNA分子的翻译。对于本公开内容的实践，用于制备且使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法是本领域技术人员众所周知的(参见例如，Sambrook和Russel (2006) Condensed Protocols from Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN-10: 0879697717；Ausubel等人(2002) Short Protocols in Molecular Biology，第5版，CurrentProtocols，ISBN-10: 0471250929；Sambrook和Russel (2001) Molecular Cloning: ALaboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN-10:0879695773；Elhai，J.和Wolk，C. P. 1988. Methods in Enzymology 167，747-754)。

“转录起始位点”或“起始位点”是围绕作为转录序列的部分的第一个核苷酸的位置，其也定义为位置+1。相对于该位点，可以对基因的所有其它序列及其控制区进行编号。下游序列(即，在3'方向上的进一步蛋白质编码序列)可以命名为正的，而上游序列(主要是在5'方向上的控制区)命名为负的。

“可操作地连接的”或“功能上连接的”优选地指核酸序列在单个核酸片段上的结合，使得一个的功能受另一个影响。例如，如果两个序列的位置使得调控DNA序列影响编码DNA序列的表达(即，编码序列或功能性RNA处于启动子的转录控制下)，则调控DNA序列被说成与编码RNA或多肽的DNA序列“可操作地连接”或“相关”。编码序列可以在有义或反义取向上与调控序列可操作地连接。所述两个核酸分子可以是单个邻接核酸分子的部分，并且可以是相邻的。例如，如果启动子调控或介导目的基因在细胞中的转录，则启动子与目的基因可操作地连接。

“构建体”一般被理解为任何重组核酸分子，例如质粒、粘粒、病毒、自主复制的核酸分子、噬菌体、或者线性或环状单链或双链DNA或RNA核酸分子，其衍生自任何来源，能够基因组整合或自主复制，包含其中一种或多种核酸分子已可操作地连接的核酸分子。

本公开内容的构建体可以含有与可转录的核酸分子可操作连接的启动子，所述可转录的核酸分子与3'转录终止核酸分子可操作连接。另外，构建体可以包括但不限于来自例如3'非翻译区(3' UTR)的另外的调控核酸分子。构建体可以包括但不限于mRNA核酸分子的5'非翻译区(5' UTR)，其可以在翻译起始中起重要作用，并且也可以是表达构建体中的遗传组分。这些另外的上游和下游调控核酸分子可以衍生自这样的来源，其相对于启动子构建体上存在的其它元件是天然的或异源的。

术语“转化”指将核酸片段转移到宿主细胞的基因组内，导致遗传上稳定的继承。含有转化的核酸片段的宿主细胞被称为“转基因”细胞，并且包含转基因细胞的生物体被称为“转基因生物体”。

“转化的”、“转基因的”和“重组的”指异源核酸分子已引入其内的宿主细胞或生物体，例如细菌、蓝细菌、动物或植物。核酸分子可以稳定地整合到基因组内，如本领域一般已知且公开的(Sambrook 1989；Innis 1995；Gelfand 1995；Innis & Gelfand 1999)。已知的PCR方法包括但不限于使用配对引物、嵌套引物、单一特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等等的方法。术语“未转化的”指未经过转化过程的正常细胞。

“野生型”指在自然界中发现的不含任何已知突变的病毒或生物体。

具有上述所需百分比同一性，并且保留所表达蛋白质的所需活性的变体核苷酸及其编码多肽的设计、生成和测试在本领域的技术内。例如，突变体的定向进化和快速分离可以根据参考文献中描述的方法，所述参考文献包括但不限于Link等人(2007) NatureReviews 5(9)，680-688；Sanger等人(1991) Gene 97(1)，119-123；Ghadessy等人(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98(8) 4552-4557。因此，本领域技术人员可以生成大量核苷酸和/或多肽变体，其与本文所述的参考序列具有例如至少50-99%同一性，并且根据本领域的常规方法在其中筛选所需的表型。

核苷酸和/或氨基酸序列同一性百分比(%)被理解为当比对两个序列时，候选序列中的核苷酸或氨基酸残基与参考序列相比等同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。为了确定同一性百分比，将序列比对，并且在需要时，引入缺口以达到最大序列同一性百分比。确定同一性百分比的序列比对程序是本领域技术人员众所周知的。可公开获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign (DNASTAR)软件经常用于比对序列。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在待比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。当比对序列时，给定序列A与、和或针对给定序列B的序列同一性百分比 (其可以可替代地表述为具有或包含与、和或针对给定序列B的一定序列同一性百分比的给定序列A)可以计算为：序列同一性百分比= X/Y100，其中X是通过序列比对程序或算法对A和B的比对评分为等同匹配的残基数目，而Y是B中的残基总数目。如果序列A的长度不等于序列B的长度，则A与B的序列同一性百分比并不等于B与A的序列同一性百分比。

一般地，可以在任何位置处进行保守取代，只要所需的活性得到保留。可以进行所谓的保守交换，其中被替换的氨基酸具有与原始氨基酸相似的性质，例如Glu与Asp的交换，Gln与Asn的交换，Val与Ile的交换，Leu与Ile的交换，以及Ser与Thr的交换。例如，具有相似性质的氨基酸可以是脂肪族氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)；含羟基或硫/硒的氨基酸(例如丝氨酸、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸)；环状氨基酸(例如脯氨酸)；芳香族氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)；碱性氨基酸(例如组氨酸、赖氨酸、精氨酸)；或酸性氨基酸及其酰胺(例如天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺)。缺失是通过直接键替换氨基酸。用于缺失的位置包括多肽的末端和各个蛋白质结构域之间的键合。插入是将氨基酸引入多肽链内，直接键在形式上被一个或多个氨基酸替换。可以在本领域已知的计算机模拟程序的帮助下调节氨基酸序列，所述程序可以产生具有例如改善的活性或改变的调控的多肽。在这种人工生成的多肽序列的基础上，可以使用所需宿主细胞的特定密码子用法，在体外合成编码这种调节多肽的相应核酸分子。

“高度严格的杂交条件”定义为在65℃下在6 X SSC缓冲液(即，0.9 M氯化钠和0.09 M柠檬酸钠)中的杂交。鉴于这些条件，可以通过计算两个序列之间的DNA双链体的解链温度(Tm)，来作出关于一组给定序列是否杂交的确定。如果特定双链体在6 X SSC的盐条件下具有低于65℃的解链温度，则两个序列不杂交。另一方面，如果解链温度在相同的盐条件下高于65℃，则序列杂交。一般而言，关于任何杂交的DNA:DNA序列的解链温度可以使用下式进行确定：Tm = 81.5℃ + 16.6(log10[Na+]) + 0.41 (G/C含量分数) – 0.63 (%甲酰胺) - (600/l)。此外，对于核苷酸同一性中的每1%减少，DNA:DNA杂交体的Tm减少1-1.5℃(参见例如Sambrook和Russel，2006)。

宿主细胞可以使用本领域已知的各种标准技术进行转化(参见例如，Sambrook和Russel (2006) Condensed Protocols from Molecular Cloning: A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN-10: 0879697717；Ausubel等人(2002) Short Protocols in Molecular Biology，第5版，Current Protocols，ISBN-10:0471250929；Sambrook和Russel (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN-10: 0879695773；Elhai，J.和Wolk，C.P. 1988. Methods in Enzymology 167，747-754)。此类技术包括但不限于病毒感染、磷酸钙转染、脂质体介导的转染、微弹介导的递送、受体介导的摄取、细胞融合、电穿孔等等。转染的细胞可以进行选择且增殖，以提供包含在宿主细胞基因组中稳定整合的表达载体的重组宿主细胞。

保守取代I

侧链特性 氨基酸

脂肪族的非极性的 G A P I L V

极性的-非荷电的 C S T M N Q

极性的-荷电的 D E K R

芳香族的 H F W Y

其它 N Q D E

保守取代II

侧链特性 氨基酸

非极性的(疏水性的)

A. 脂肪族的： A L I V P

B. 芳香族的： F W

C. 含硫的： M

D. 边界的： G

非荷电的-极性的

A. 羟基： S T Y

B. 酰胺： N Q

C. 巯基： C

D. 边界： G

带正电荷的(碱性的)： K R H

带负电荷的(酸性的)： D E

保守取代III

原始残基　 示例性取代

Ala (A)　　Val、Leu、Ile

Arg (R)　　Lys、Gln、Asn

Asn (N)　　Gln、His、Lys、Arg

Asp (D)　　Glu

Cys (C)　　Ser

Gln (Q)　　Asn

Glu (E)　　Asp

His (H)　　Asn、Gln、Lys、Arg

Ile (I)　　Leu、Val、Met、Ala、Phe,

Leu (L)　　Ile、Val、Met、Ala、Phe

Lys (K)　　Arg、Gln、Asn

Met(M)　 　Leu、Phe、Ile

Phe (F)　　Leu、Val、Ile、Ala

Pro (P)　　Gly

Ser (S)　　Thr

Thr (T)　　Ser

Trp(W)　 　Tyr、Phe

Tyr (Y)　　Trp、Phe、Tur、Ser

Val (V)　　Ile、Leu、Met、Phe、Ala

可以引入宿主细胞的示例性核酸包括例如来自另一物种的DNA序列或基因，或者甚至源于或存在于同一物种中，但通过基因工程方法掺入受体细胞内的基因或序列。术语“外源的”也预期指通常不存在于被转化的细胞中的基因，或者可能仅仅不以如转化DNA区段或基因中发现的形式、结构等存在的基因，或通常存在并且希望以不同于天然表达模式的方式表达，例如过表达的基因。因此，术语“外源”基因或DNA预期指被引入受体细胞内的任何基因或DNA区段，而不管相似基因是否可能已经存在于此类细胞中。包括在外源DNA中的DNA类型可以包括已经存在于细胞中的DNA、来自同一类型生物体的另一个个体的DNA、来自不同生物体的DNA、或外部生成的DNA例如含有基因的反义信使的DNA序列、或者编码基因的合成或修饰版本的DNA序列。

根据本文所述的方法开发的宿主菌株可以通过本领域已知的多种手段进行评估(参见例如，Studier (2005) Protein Expr Purif. 41 (1)，207–234；Gellissen，编辑(2005) Production of Recombinant Proteins: Novel Microbial and EukaryoticExpression Systems，Wiley-VCH，ISBN-10: 3527310363；Baneyx (2004) ProteinExpression Technologies，Taylor & Francis，ISBN-10: 0954523253)。

下调或沉默基因的方法是本领域已知的。例如，所表达的蛋白质活性可以使用以下得到下调或消除：反义寡核苷酸(ASO)、蛋白质适体、核苷酸适体和RNA干扰(RNAi) (例如小干扰RNA (siRNA)、短发夹RNA (shRNA)和微小RNA (miRNA) (参见例如，Rinaldi和Wood(2017) Nature Reviews Neurology 14，描述了ASO疗法；Fanning和Symonds (2006)Handb Exp Pharmacol. 173，289-303G，描述了锤头状核酶和小发夹RNA；Helene等人(1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660，27-36；Maher (1992) Bioassays 14 (12): 807-15，描述了靶向脱氧核糖核苷酸序列；Lee等人(2006) Curr Opin Chem Biol. 10，1-8，描述了适体；Reynolds等人(2004) Nature Biotechnology 22 (3)，326 – 330，描述了RNAi；Pushparaj和Melendez (2006) Clinical and Experimental Pharmacology andPhysiology 33 (5-6)，504-510，描述了RNAi；Dillon等人(2005) Annual Review ofPhysiology 67，147-173，描述了RNAi；Dykxhoorn和Lieberman (2005) Annual Review ofMedicine 56，401-423，描述了RNAi)。RNAi分子从各种来源(例如Ambion，TX；SigmaAldrich，MO；Invitrogen)商购可得。使用各种算法的几种siRNA分子设计程序是本领域已知的(参见例如，Cenix 算法，Ambion；BLOCK-iT™ RNAi Designer，Invitrogen；siRNAWhitehead Institute Design Tools，Bioinformatics & Research Computing)。在确定最佳siRNA序列中有影响的性质包括在siRNA的末端处的G/C含量、siRNA的具体内部结构域的Tm、siRNA长度、靶序列在CDS (编码区)内的位置、以及3'突出端的核苷酸含量。

与细胞有关的术语“活化”(及其其它动词变化)一般被理解为与“刺激”同义，并且如本文使用的，指增强的功能结果和/或细胞群体的扩增。

如本文在CAR靶的上下文中使用的术语“抗原”是被嵌合抗原受体识别(即，为其靶)的细胞表面蛋白。在经典意义上，抗原是被抗体或T细胞受体识别的物质，通常是蛋白质，但定义在CAR包含识别一种或多种抗原的抗体衍生的结构域例如轻链(VL)和重链(VH)的范围内重叠。抗原还可以包含能够被免疫系统(最频繁的是T细胞或抗体)识别的任何细胞内或表面分子，一般是蛋白质或肽。

术语“癌症”指体内细胞的恶性肿瘤或异常生长。许多不同的癌症可以通过特定的细胞表面蛋白或分子进行表征或鉴定。因此，一般而言，按照本公开内容的癌症可以指可以用免疫效应细胞例如如本文所述的CAR-DC进行治疗的任何恶性肿瘤，其中所述修饰的树突状细胞识别并结合癌细胞上的细胞表面蛋白。如本文使用的，癌症可以指血液系统恶性肿瘤，例如多发性骨髓瘤、T细胞恶性肿瘤或B细胞恶性肿瘤。T细胞恶性肿瘤可能包括但不限于T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)或非何杰金氏淋巴瘤。癌症还可以指实体瘤，例如包括但不限于宫颈癌、胰腺癌、卵巢癌、间皮瘤和肺癌。

如本文使用的，“细胞表面蛋白”是由细胞至少部分地在细胞的表面上表达的蛋白质(或蛋白质复合物)。细胞表面蛋白的实例包括TCR (及其亚基)和CD7。

如本文使用和本领域一般使用的，“嵌合抗原受体”或“CAR”指具有细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号传导转导结构域的重组融合蛋白，其在细胞外配体结合结构域与靶细胞上存在的组分结合后指导细胞执行专门功能。例如，CAR可以对于所需抗原(例如，肿瘤抗原)具有基于抗体的特异性，具有激活T细胞受体的细胞内结构域，以生成显示出特异性抗靶细胞免疫活性的嵌合蛋白。第一代CAR包括细胞外配体结合结构域和信号传导转导结构域，通常是CD3ζ或FcεRIγ。第二代CAR通过包括细胞内共刺激结构域，通常为4-1BB或CD28，在第一代CAR构建体上进行构建。与第一代CAR相比，这些共刺激结构域帮助增强CAR-T细胞的细胞毒性和增殖。第三代CAR包括多重共刺激结构域，主要是为了增加CAR-T细胞的增殖和持久性。嵌合体抗原受体与其它抗原结合剂的区别在于其既结合MHC不依赖性抗原，又经由其细胞内结构域转导激活信号的能力。

如本文使用的，术语“组合物”指具有一种或多种治疗上可接受的载体的免疫治疗细胞群体组合。

如本文使用的，术语“疾病”预期一般与术语“病症”、“综合征”和“病况”(如在医学病况中)同义，并且可与之互换使用，因为它们都反映人体或动物身体或其部分之一的异常状况，其损害正常功能，通常表现为有区别的体征和症状，并且导致人或动物具有减少的寿命或生活质量。

无需进一步说明，认为本领域技术人员可以基于上文说明书最充分地利用本发明。因此，下述具体实施方案应被解释为仅仅是说明性的，而不以任何方式限制本公开内容的剩余部分。本文引用的所有出版物都通过引用并入用于本文提及的目的或主题。

由于可以对上述材料和方法进行各种改变而不脱离本发明的范围，因此预期在上文说明书和下文给出的实施例中含有的所有内容都应该解释为说明性的而不是以限制性含义加以解释。

实施例

包括下述实施例，以证实本公开内容的各个实施方案。本领域技术人员应该了解，下述实施例中公开的技术代表了由发明人发现在本发明的实践中良好发挥功能的技术，并且因此可以被视为构成用于其实践的优选模式。然而，依据本公开内容，本领域技术人员应该了解，可以对所公开的具体实施方案作出许多改变，并且仍获得类似或相似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。

实施例1：功能性CAR树突状细胞的生成和表征

树突状细胞(DC)在启动适应性免疫应答中是关键的。众多研究证实了，DC在肿瘤微环境中且甚至是一般而言的癌症患者中是有限的(Hegde S等人Cancer Cell 2020；37:289-307 e9)。进一步地，即使存在DC，它们也可以诱导抗原的耐受或排斥，并且它们一般没有告诉它们肿瘤细胞是“坏的”并且应该被消除的强信号。

目前，我们正处于细胞疗法的时代，由此可以收集患者的自身细胞，进行修饰以发挥特定功能、扩增并注射回患者内，以治疗他或她的疾病。这提供了用于DC激活的新机会，并且可靠地引发了适应性免疫应答。目前的标准治疗已集中于全身注射分子，以激活遍及全身的DC。与全身性地激活DC不同，本实施例检查了是否可以收集DC，用CAR进行遗传修饰以识别癌细胞，并且这种识别可以诱导信号传导途径，其指导细胞吞食靶，呈递其抗原并分泌另外的目的免疫激活分子，取决于CAR如何进行构建。

已完成以前的工作，以产生CAR-巨噬细胞或CAR-吞噬细胞。如同树突状细胞，巨噬细胞可以吞噬物质，并且可以呈递抗原。然而，在体内，巨噬细胞不能有效地交叉呈递肿瘤细胞相关抗原，并且不能产生消除肿瘤的免疫应答。在体内，DC且特别是称为1型常规树突状细胞(cDC1)的DC亚群，是能够进行有效肿瘤抗原交叉呈递的唯一细胞，如通过以下事实证明的：在cDC1的不存在下，无法实现适应性抗肿瘤应答，不能产生抗肿瘤免疫应答，并且不能通过体内免疫系统消除肿瘤(Theisen DJ等人Science 2018；362:694-9；和Hildner K等人Science 2008；322:1097-100)。因此，在概念上，CAR-巨噬细胞可以潜在地实现直接肿瘤吞噬作用、或者针对具有同质抗原表达的肿瘤的可能直接细胞毒性的目标。然而，与公开的数据(Morrissey MA等人Elife 2018；7)一致，它们预计并不实现抗原交叉呈递或适应性抗肿瘤T细胞应答的目标。

已通过将诱导吞噬作用的各种巨噬细胞受体(例如Fc受体、toll样受体或者其它基于巨噬细胞或T细胞的受体)的细胞内结构域与识别肿瘤的scFv细胞外结构域融合，来产生CAR-巨噬细胞。迄今为止，还没有成功地产生赋予细胞cDC1能力(即，交叉引发内源性T细胞群体的抗肿瘤T细胞应答的能力)的CAR。

本实施例提供了生成功能性CAR-DC的细胞内信号传导结构域，与先前描述的CAR不同，其赋予转导的髓样细胞交叉呈递吞噬的肿瘤抗原的能力，其方式交叉引发内源性T细胞，以在体内和体外产生强烈而成功的适应性抗肿瘤应答。

这些研究的直接意义提供了新的治疗策略，以直接消除CAR靶向的抗原阳性(Ag⁺)肿瘤，并且通过交叉呈递和表位扩散间接消除CAR-Ag^-肿瘤细胞(不被CAR识别)。

本实施例描述了制备嵌合抗原受体树突状细胞(CAR-DC)的方法及其所得到的功能性。CAR构建体因其区分DC的能力及其抗原交叉呈递功能性进行克隆。获得了以下的证据：一种特定的CAR构建体能够成功地驱动肿瘤吞食和内源性肿瘤抗原的交叉呈递，以刺激抗肿瘤CD8 T细胞。下文描述了这种基于FMS样酪氨酸激酶3 (Flt3)的CAR。

方法

各种CAR构建体用各种细胞内信号传导结构域产生，引入DC前体内，并且筛选其在转导后维持交叉呈递DC的表型且在功能上交叉呈递肿瘤抗原的能力。这些数据包括基于Fc受体、基于toll样受体(TLR)或基于Flt3的CAR的直接比较。已出现了一种特定构建体，其最成功地赋予细胞cDC1表型，其维持肿瘤特异性摄取能力并具有交叉呈递肿瘤抗原的能力：基于Flt3的CAR。

这种CAR的设计如下：驱动表面表达的信号肽，随后为肿瘤结合结构域(一般是来自抗体的scFv)，随后为细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域(参见例如图2)。对于实现成功CAR-DC关键的结构域是衍生自Flt3的细胞内结构域。

肿瘤模型：除非另有说明，否则所有实验都在MCA诱导的软组织胁腹肉瘤模型中执行，所述模型证实为含有被T细胞识别的肿瘤抗原(Gubin MM等人Nature 2014；515:577-81；以及Alspach E等人Nature 2019；574:696-701)，其由DC引发且交叉引发(Ferris ST等人Nature 2020；584:624-9)。作为第二种模型，使用了C57BL/6 KPC (Kras(G12D/+)；p53(R172H/+)；Pdx-1-Cre)胰腺癌模型，因为如同人癌症，它具有低突变负担且是弱免疫原性的，它产生了复杂的免疫压制性肿瘤微环境(Tseng WW等人Clin Cancer Res 2010；16:3684-95)，并且可以进行原位或皮下注射。胰腺肿瘤抗原EphA2在90%的胰腺癌上表达，且在正常组织上更罕见地表达。小鼠KPC肿瘤细胞以及MCA诱导的肉瘤细胞天然地表达EphA2。将zsGreen和卵清蛋白(ova)引入这些细胞内，以便使用衍生自OT1小鼠的T细胞定量T细胞应答，所述OT1小鼠是生成细胞毒性CD8 T细胞的转基因小鼠，所述细胞毒性CD8 T细胞特异性识别MHC-I上呈递的ova肽。对于体内模型，将肿瘤细胞注射到双侧胁腹内，其是MCA诱导的肉瘤的天然病变部位。在肿瘤建立三天后，小鼠用CAR转导细胞的局部注射进行治疗。当肿瘤达到2 cm直径时，将小鼠处死。

DC和CAR-DC生成。骨髓细胞通过冲洗同源小鼠的骨髓进行分离，并且在Flt3L中生长1天，然后用目的CAR或空病毒载体进行转导，然后用Flt3L (80 ng/ml)进一步分化6-10天，以生成分化的DC。通过FACS使用标准门控策略来定量cDC1和cDC2群体，其中cDC是谱系阴性的，B220^-、CD11c⁺、MHC-II⁺，并且cDC1和cDC2分别通过CD24和Sirpa阳性进行进一步区分。通过FACS分析，使用识别细胞表面上的CAR的抗人Fab2抗体，来评价CAR表达。

巨噬细胞和CAR-巨噬细胞生成。骨髓细胞如上进行分离，在M-CSF或GM-CSF中生长1天，然后用目的CAR进行转导，然后用M-CSF或GM-CSF进一步分化5-10天，以生成病毒转导的巨噬细胞，如先前所述。通过FACS分析，使用识别细胞表面上的CAR的抗体，来评价CAR表达。

T细胞活化和增殖。如先前所述(Theisen DJ等人Science 2018；362:694-9)，使用CFSE通过FACS分析就增殖评价CD3、CD4和CD8 T细胞标记物。

T细胞功能。T细胞功能通过细胞毒性T细胞淋巴细胞测定(CTL)进行评价，其中使限定比率的效应T细胞与靶肿瘤细胞混合，并且在一些情况下，与抗原呈递细胞混合，持续指示的时间量。在多天实验中，每2天更换50%的培养基。使用BioTek Cytation 5活细胞成像和图像分析软件，来定量剩余的肿瘤细胞数目。

CAR-诱导的肿瘤吞噬作用。吞噬作用通过以下进行评价：用酸抗性荧光团(zsGreen)在遗传上标记靶细胞，用RFP (其由递送CAR的同一载体进行递送)标记CAR转导细胞，然后共培养细胞，并且通过FACS或通过使用BioTek’s Cytation 5成像和软件的直接实时视频显微镜检查(这两者均以不同的方式定量吞噬或吸收绿细胞的红细胞数目)，来定量吞噬作用。

交叉呈递测定。标准交叉呈递测定通过以下执行：使CAR转导的DC或对照DC与表达ova的肿瘤或表达ova的热杀死的李斯特属细菌混合，然后添加CFSE标记的OT1 T细胞(其针对MHC-I上呈递的ova SIINFEKL肽反应)，并且在3天后通过流式细胞术测量CD8 T细胞增殖。

结果

(i) CAR巨噬细胞未能诱导全身免疫应答

由于巨噬细胞，包括CAR巨噬细胞，具有在体外刺激T细胞的能力(Klichinsky M等人Nat Biotechnol 2020；38:947-53)，并且由于巨噬细胞是专职的抗原呈递细胞，因此检验了CAR-巨噬细胞可以诱导全身免疫应答的假设。在这种模型中，将肿瘤细胞注射到同源小鼠的双侧胁腹内，并且允许建立三天。在三天后，将CAR巨噬细胞注射到一个肿瘤内(图1A)。如果CAR巨噬细胞局部吞噬和/或杀死肿瘤，则局部注射的肿瘤预计响应。如果它们有效地吸收抗原并交叉引发T细胞，则T细胞将循环，并且如果受到有效刺激，则预计消除对侧肿瘤以及局部肿瘤。如果在任一侧上均未观察到肿瘤应答，则两者均不发生。利用了FcRCAR，先前已发现其通过改造的巨噬细胞有效地诱导吞噬作用(图1B中概念性地描述的)(Morrissey MA等人Elife 2018；7；以及Klichinsky M等人Nat Biotechnol 2020；38:947-53)。如先前研究中使用的，这些实验中的对照治疗是未转导的巨噬细胞。证实了FcR CAR巨噬细胞显著减少注射部位的肿瘤体积(图1C)，但未能诱导任何程度的远端肿瘤消除(图1D)，与局部杀死效应而不诱导适应性免疫应答一致。一只FcR CAR巨噬细胞治疗的小鼠显示出在注射部位处完全的肿瘤消除。在这只小鼠中，如果适应性免疫应答促成排斥，则预计用同一肿瘤再次攻击将导致肿瘤生长的不存在。在该小鼠中重新注射肿瘤后，肿瘤长出，与缺乏由CAR巨噬细胞生成的适应性免疫应答一致(图1E)。

(ii) CAR DC的生成

鉴于这一结果，申请人努力生成可以在局部肿瘤相遇后诱导有效的全身性抗肿瘤免疫应答的CAR修饰的细胞。CAR以标准方式进行设计，其中细胞外结构域识别肿瘤抗原，细胞外铰链和跨膜结构域是恒定的(在这些实验中，CD8)，而内部信号传导结构域不同。假设不同的内部结构域可能帮助促进T细胞对内化肿瘤抗原的交叉引发。由于细菌是由抗原呈递细胞识别的常见病原体，所述抗原呈递细胞具有识别LPS的特异性受体TLR4，因此假设具有TLR4信号传导结构域的CAR可以改善CAR修饰的髓样细胞交叉引发T细胞的能力。鉴于cDC在T细胞交叉引发中的效力，还假设诱导Flt3信号传导(其是启动且维持cDC分化最关键的受体)的CAR可能改善改造的髓样细胞的交叉引发能力。在这些直接比较实验中，内部结构域因此由Fc受体信号传导结构域(此处，共同γ链)、toll样受体(TLR)信号传导结构域(在这种情况下，TLR4)或Flt3信号传导结构域组成(图2)。作为对照，产生了具有等同的细胞外结构域和跨膜结构域但没有内部结构域的CAR，因此它与肿瘤结合但不发信号。每种CAR还表达在P2A序列之后的RFP，以评价转导效率。

在大量病毒生产和转导优化后，实现了成功的CAR转导，并且通过使用直接结合CAR的scFv的抗体的流式细胞术以及来自所引入的RFP的内部荧光确认了表面表达(图3)。

(iii)基于Flt3的CAR在肿瘤-CAR共培养后诱导细胞增殖

在概念上，通过CAR转导的细胞吞噬的肿瘤可以被降解，或被加工成肽并交叉呈递以交叉引发CD8 T细胞。使用其中OT1 T细胞与肿瘤细胞和抗原呈递细胞混合的交叉呈递测定，首次发现与表达ova的热杀死的李斯特属细菌和OT1 T细胞混合、含有对照CAR (含有细胞外结构域和跨膜结构域，但不含细胞内信号传导结构域)的DC产生强T细胞增殖应答，如预计的(阳性对照) (图4A)。然而，当表达ova的细菌替换为表达ova的肿瘤细胞时，对照CAR转导的细胞并不产生可测量的T细胞应答。令人惊讶的是，尽管基于Fc受体和TLR的CAR提供了信号传导结构域(其潜在地重现细菌或调理的病原体诱导的信号传导)的事实，但这些CAR未能诱导比对照CAR更多的肿瘤抗原特异性T细胞增殖。另一方面，基于Flt3的CAR在肿瘤-CAR共培养后成功地诱导肿瘤抗原特异性T细胞增殖，与通过抗原表达细菌诱导的水平相似(图4)。这些数据证实了，Flt3 CAR促进肿瘤抗原特异性T细胞应答，其在量级方面与DC针对细菌生成的稳固应答相似，而常规的吞噬性CAR在遇到肿瘤后并不生成比对照非信号传导CAR更大的肿瘤抗原特异性T细胞应答，尽管实现了显著的肿瘤吞噬作用(图4C)。

(iv)与基于Fc受体或TLR的CAR相比，Flt3 CAR DC实现了显著更多的肿瘤根除

为了测试由CAR抗原呈递细胞实现的抗原交叉呈递是否是功能上有意义的，使表达zsGreen+ Ova抗原的肿瘤细胞以2:1:1的比率与指示的CAR转导的DC分化细胞加上OT1 T细胞一起温育。10天后，通过BioTek活细胞成像和定量GFP肿瘤面积的成像软件，对肿瘤细胞面积进行定量。与通过Flt3 CAR DC增加的T细胞活化一致，与基于Fc受体或TLR的CAR相比，Flt3 CAR DC实现了显著更多的肿瘤根除(图5)。

(v) Flt3 CAR改善DC细胞存活和分化

为了确定为何Flt3 CAR DC在抗原交叉呈递方面更有效，假设这种特定的CAR可以改善细胞存活的能力，或在遇到肿瘤和CAR信号传导后，分化成正确的细胞表型用于有效的T细胞交叉引发。观察到在肿瘤的存在下，表达Flt3 CAR的细胞似乎具有存活优势。为了明确测试CAR诱导的Flt3信号传导是否提供了足够显著的信号传导，以单独维持细胞存活，获得了关键性地依赖Flt3配体而存活的HoxB8 DC细胞系；如果没有Flt3配体，则这些细胞不能在培养中存活，但具有Flt3配体，它们存活并且可以分化成等价于野生型DC的DC。最初在外源性Flt3配体的存在下，这些细胞用不提供信号传导的对照CAR以及Flt3 CAR进行转导，这些细胞然后在不含Flt3配体的正常生长培养基中的肿瘤细胞上铺平板。在两天后，所有对照CAR HoxB8细胞都已死亡并且跨越孔均匀分布；然而，Flt3 CAR HoxB8细胞在肿瘤细胞周围聚集并继续健康地存活(图6)。这证实了Flt3 CAR通过其Flt3 CAR信号传导结构域提供了显著的存活信号传导。在其中存在很少的Flt3配体且DC存活很弱的肿瘤微环境中，这种肿瘤诱导的CAR存活信号传导可能为CAR DC提供进一步的优势。

接下来测试了与用TLR4或FcR CAR转导的等同细胞相比，Flt3 CAR转导的细胞是否不同地分化。在Flt3配体中分化后，通过流式细胞术对细胞进行表型分型。由于cDC1细胞是用于生成适应性免疫应答和肿瘤消除的关键DC，因此具体检查了cDC1表型。令人惊讶的是，即使在Flt3配体的存在下，在CAR中的基于TLR4或FcR的信号传导的存在显著减少DC前体成功地分化成cDC1的能力(图7)。即使在cDC1分化生长因子的存在下，这些炎症信号传导CAR的存在似乎将细胞转向巨噬细胞或cDC2表型。然而，Flt3 CAR的存在维持了cDC1成功地分化的能力(如果没有增强的话) (图7)。

这些数据显示了基于Flt3的CAR能够独特地产生真正的功能性cDC1，其在以前没有得到证实。因此，这些是真正的“CAR-DC”，其与具有明显较差的交叉引发T细胞的能力的CAR-巨噬细胞或CAR-吞噬细胞区别开。

(vi) FLT3 CAR DC生成稳固的适应性免疫应答

为了测试Flt3 CAR DC生成在体内消除远端肿瘤的稳固的适应性免疫应答，采用双侧胁腹原位肉瘤肿瘤模型。将肿瘤注射到双侧胁腹内，并且允许在同源小鼠中建立三天。然后将对照非信号传导CAR DC或Flt3 CAR DC注射到两个肿瘤部位之一内，并且随着时间过去定量在两个部位处的肿瘤生长。发现用对照CAR DC治疗的小鼠在CAR DC注射部位和未治疗部位两者处均进展(图8A)。Flt3 CAR治疗的肿瘤在CAR DC局部注射后继续生长一周多，然后开始消退。具有相似的动力学，与适应性免疫应答一致，远端肿瘤部位也在Flt3CAR DC治疗后生长1-2周，然后类似地开始消退。到第7周，在Flt3 CAR DC治疗的小鼠的所有局部和远端肿瘤部位中无法检测到肿瘤(图8B)，而对照CAR和未治疗的小鼠到同一时间点都已进展到死亡点。为了测试Flt3 CAR DC治疗的小鼠是否已实现了具有免疫记忆的成功的适应性免疫应答，将肿瘤重新注射到这些小鼠的侧腹内。所有Flt3 CAR DC治疗的小鼠都受保护免于肿瘤再次攻击，因为肿瘤不能在这些小鼠的任一中再生长(图8C)。这些数据证实了，Flt3 CAR DC成功地引发了针对靶向肿瘤的适应性全身免疫应答，其足够稳固以消除远端建立的肿瘤。Flt3 CAR DC诱导的抗肿瘤应答持续存在并对肿瘤再次攻击继续提供免疫。

等价方案

虽然本文已描述且说明了若干本发明的实施方案，但本领域普通技术人员将容易地设想用于执行功能和/或获得结果和/或本文所述的一个或多个优点的各种其它手段和/或结构，并且此类变化和/或修改各自被视为在本文描述的本发明实施方案的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易了解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和配置意欲是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于本发明的教导用于其的一种或多种具体应用。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文描述的本发明具体实施方案的许多等价方案。因此，应理解，前述实施方案仅作为示例呈现，并且在所附权利要求及其等价物的范围内，可以以不同于具体描述且请求保护的方式实践本发明实施方案。本公开内容的本发明实施方案针对本文所述的每个个别特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法并不相互矛盾，则两个或更多个此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合包括在本公开内容的发明范围内。

本文公开的所有参考文献、专利和专利申请都关于各自引用的主题通过引用并入，在一些情况下，其可以包含整个文件。

如本文在说明书和权利要求中使用的短语“和/或”应该理解为意指如此结合的要素中的“任一或两者”，即，在一些情况下结合地存在并且在其它情况下分离地存在的要素。用“和/或”列出的多重要素应该以相同的方式加以解释，即，如此结合的“一个或多个”要素。除通过“和/或”子句具体确定的要素外，可以任选地存在其它要素，无论与具体确定的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，当与开放式语言如“包含”结合使用时，对“A和/或B”的提及在一个实施方案中可以仅指A (任选地包括除B外的要素)；在另一个实施方案中，仅指B (任选地包括除A外的要素)；在又一个实施方案中，指A和B两者(任选地包括其它要素)；等。

如本文在说明书和权利要求中使用的，“或”应该理解为具有与如上文定义的“和/或”相同的含义。例如，当将列表中的项目分开时，“或”或“和/或”应该解释为包括在内的，即包括多个要素或要素列表中的至少一个，但也包括多于一个，以及任选地另外的未列出项目。仅明确另外指出的术语，例如“仅一个”或“恰好一个”，或者当在权利要求中使用时，“由……组成”，指包括多个要素或要素列表中的恰好一个要素。一般而言，如本文使用的，当前面是排他性术语例如“任一”、“之一”、“仅一个”或“恰好一个”时，术语“或”仅应该解释为指示排他性的替代方案(即“一个或另一个但不是两者”)。当在权利要求中使用时，“基本上由……组成”应该具有其如专利法领域中使用的普通含义。

如本文在说明书和权利要求中使用的，在提及一个或多个要素的列表时，短语“至少一个”应该理解为意指选自要素列表中的任何一个或多个要素的至少一个要素，但不一定包括要素列表内具体列出的每个和每一个要素中的至少一个，并且不排除要素列表中的要素的任何组合。该定义还允许可以任选地存在除在短语“至少一个”所指的要素列表内具体确定的要素外的要素，无论与具体确定的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等价地，“A或B中的至少一个”，或等价地“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中，可以指至少一个A，任选地包括多于一个A，而不存在B (并且任选地包括除B外的要素)；在另一个实施方案中，指至少一个B，任选地包括多于一个B，而不存在A (并且任选地包括除A外的要素)；在又一个实施方案中，指至少一个A，任选地包括多于一个A，和至少一个B，任选地包括多于一个B (并且任选地包括其它要素)；等。

序列表

<110> 华盛顿大学

DESELM, Carl

<120> 嵌合抗原受体树突状细胞(CAR-DC)及其制备和使用方法

<130> 047563-675958

<150> 62/948612

<151> 2019-12-16

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 430

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 1

His Lys Tyr Lys Lys Gln Phe Arg Tyr Glu Ser Gln Leu Gln Met Val

1 5 10 15

Gln Val Thr Gly Ser Ser Asp Asn Glu Tyr Phe Tyr Val Asp Phe Arg

20 25 30

Glu Tyr Glu Tyr Asp Leu Lys Trp Glu Phe Pro Arg Glu Asn Leu Glu

35 40 45

Phe Gly Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Lys Val Met Asn Ala

50 55 60

Thr Ala Tyr Gly Ile Ser Lys Thr Gly Val Ser Ile Gln Val Ala Val

65 70 75 80

Lys Met Leu Lys Glu Lys Ala Asp Ser Ser Glu Arg Glu Ala Leu Met

85 90 95

Ser Glu Leu Lys Met Met Thr Gln Leu Gly Ser His Glu Asn Ile Val

100 105 110

Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Leu Ser Gly Pro Ile Tyr Leu Ile Phe

115 120 125

Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu Asn Tyr Leu Arg Ser Lys Arg

130 135 140

Glu Lys Phe His Arg Thr Trp Thr Glu Ile Phe Lys Glu His Asn Phe

145 150 155 160

Ser Phe Tyr Pro Thr Phe Gln Ser His Pro Asn Ser Ser Met Pro Gly

165 170 175

Ser Arg Glu Val Gln Ile His Pro Asp Ser Asp Gln Ile Ser Gly Leu

180 185 190

His Gly Asn Ser Phe His Ser Glu Asp Glu Ile Glu Tyr Glu Asn Gln

195 200 205

Lys Arg Leu Glu Glu Glu Glu Asp Leu Asn Val Leu Thr Phe Glu Asp

210 215 220

Leu Leu Cys Phe Ala Tyr Gln Val Ala Lys Gly Met Glu Phe Leu Glu

225 230 235 240

Phe Lys Ser Cys Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val

245 250 255

Thr His Gly Lys Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp

260 265 270

Ile Met Ser Asp Ser Asn Tyr Val Val Arg Gly Asn Ala Arg Leu Pro

275 280 285

Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Leu Phe Glu Gly Ile Tyr Thr Ile

290 295 300

Lys Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser

305 310 315 320

Leu Gly Val Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Pro Val Asp Ala Asn Phe Tyr

325 330 335

Lys Leu Ile Gln Asn Gly Phe Lys Met Asp Gln Pro Phe Tyr Ala Thr

340 345 350

Glu Glu Ile Tyr Ile Ile Met Gln Ser Cys Trp Ala Phe Asp Ser Arg

355 360 365

Lys Arg Pro Ser Phe Pro Asn Leu Thr Ser Phe Leu Gly Cys Gln Leu

370 375 380

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385 390 395 400

Glu Cys Pro His Thr Tyr Gln Asn Arg Arg Pro Phe Ser Arg Glu Met

405 410 415

Asp Leu Gly Leu Leu Ser Pro Gln Ala Gln Val Glu Asp Ser

420 425 430

<210> 2

<211> 428

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 2

His Lys Tyr Lys Lys Gln Phe Arg Tyr Glu Ser Gln Leu Gln Met Ile

1 5 10 15

Gln Val Thr Gly Pro Leu Asp Asn Glu Tyr Phe Tyr Val Asp Phe Arg

20 25 30

Asp Tyr Glu Tyr Asp Leu Lys Trp Glu Phe Pro Arg Glu Asn Leu Glu

35 40 45

Phe Gly Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Arg Val Met Asn Ala

50 55 60

Thr Ala Tyr Gly Ile Ser Lys Thr Gly Val Ser Ile Gln Val Ala Val

65 70 75 80

Lys Met Leu Lys Glu Lys Ala Asp Ser Cys Glu Lys Glu Ala Leu Met

85 90 95

Ser Glu Leu Lys Met Met Thr His Leu Gly His His Asp Asn Ile Val

100 105 110

Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Leu Ser Gly Pro Val Tyr Leu Ile Phe

115 120 125

Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu Asn Tyr Leu Arg Ser Lys Arg

130 135 140

Glu Lys Phe His Arg Thr Trp Thr Glu Ile Phe Lys Glu His Asn Phe

145 150 155 160

Ser Phe Tyr Pro Thr Phe Gln Ala His Ser Asn Ser Ser Met Pro Gly

165 170 175

Ser Arg Glu Val Gln Leu His Pro Pro Leu Asp Gln Leu Ser Gly Phe

180 185 190

Asn Gly Asn Ser Ile His Ser Glu Asp Glu Ile Glu Tyr Glu Asn Gln

195 200 205

Lys Arg Leu Ala Glu Glu Glu Glu Glu Asp Leu Asn Val Leu Thr Phe

210 215 220

Glu Asp Leu Leu Cys Phe Ala Tyr Gln Val Ala Lys Gly Met Glu Phe

225 230 235 240

Leu Glu Phe Lys Ser Cys Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val

245 250 255

Leu Val Thr His Gly Lys Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala

260 265 270

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275 280 285

Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Leu Phe Glu Gly Ile Tyr

290 295 300

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305 310 315 320

Phe Ser Leu Gly Val Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Pro Val Asp Ala Asn

325 330 335

Phe Tyr Lys Leu Ile Gln Ser Gly Phe Lys Met Glu Gln Pro Phe Tyr

340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

Val Pro Glu His Pro Ser Ile Tyr Gln Asn Arg Arg Pro Leu Ser Arg

405 410 415

Glu Ala Gly Ser Glu Pro Pro Ser Pro Gln Ala Gln

420 425

Claims (29)

1.一种包含嵌合抗原受体(CAR)的修饰的细胞，其中所述CAR包含：

抗原结合结构域；

跨膜结构域；

包含FMS样酪氨酸激酶3 (Flt3)信号传导结构域的细胞内结构域；和

所述修饰的细胞是树突状细胞或其前体或祖细胞。

2.一种嵌合抗原受体(CAR)构建体，其包含：

(i)抗原结合结构域；

(ii)跨膜结构域；和

(iii)包含FMS样酪氨酸激酶3 (Flt3)信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，

其中所述CAR构建体能够在树突状细胞(DC)或其前体或祖细胞中表达或发挥功能。

3.一种包含权利要求2的CAR构建体的修饰的树突状细胞，其中所述树突状细胞选自cDC1细胞或其前体或祖先。

4.一种修饰的细胞，其包含编码权利要求2的CAR的第一核酸序列，或编码抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域的第二核酸序列。

5.权利要求4的修饰的细胞，其中第一细胞内核酸序列编码包含Flt3的蛋白质产物或基于Flt3的蛋白质产物，或后续的细胞内核酸序列编码包含Flt3的蛋白质产物或基于Flt3的蛋白质产物。

6.权利要求1的修饰的细胞，其中所述CAR进一步包含信号肽或另外的细胞外结构域。

7.权利要求1的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞是常规1型树突状细胞(cDC1)。

8.权利要求1或3中任一项的修饰的细胞，其中所述祖细胞选自外周血单核细胞(PBMC)、单核细胞和树突状细胞祖先(MDP)、共同髓系祖先(CMP)、淋巴引发的多潜能祖先(LMPP)或共同树突状细胞祖先(CDP)、或干细胞。

9.权利要求1的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞能够进行抗原交叉呈递、适应性抗肿瘤免疫应答或激活抗肿瘤T细胞。

10.权利要求1的修饰的细胞，其中所述抗原结合结构域包含抗体或其片段。

11.权利要求10的修饰的细胞，其中所述抗体对肿瘤细胞抗原具有结合亲和力。

12.权利要求11的修饰的细胞，其中所述肿瘤细胞抗原是EphA2。

13.权利要求1或3的修饰的细胞，其中所述抗原结合结构域针对选自以下的疾病相关抗原：EphA2、EGFRviii、AFP、CEA、CA-125、MUC-1、CD123、CD30、SlamF7、CD33、EGFRvIII、BCMA、GD2、CD38、PSMA、B7H3、EPCAM、IL-13Ra2、PSCA、间皮素、Her2、CD19、CD20、CD22、sial-LewisA、LewisY、CIAX或另一种肿瘤富集蛋白质。

14.权利要求1或3中任一项的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞能够选择性地吞食肿瘤细胞、交叉呈递肿瘤抗原且激活T细胞，以响应所述肿瘤抗原。

15. 权利要求1或3中任一项的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞能够交叉呈递肿瘤抗原(或具有肿瘤抗原交叉呈递)，其中抗原交叉呈递是细胞在I型主要组织相容性复合物分子(MHC I)上呈递内化抗原的能力，其对于针对肿瘤细胞的有效适应性免疫应答是必需的。

16.权利要求1或3中任一项的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞能够消除CAR靶向的抗原阳性(Ag⁺)肿瘤，并且通过表位扩散间接消除CAR-Ag^-实体瘤细胞(不被CAR识别)。

17.一种药物组合物，其包含权利要求1的修饰的细胞。

18. 一种在受试者中刺激适应性抗肿瘤T细胞应答的方法，其包括：

向所述受试者施用治疗有效量的包含嵌合抗原受体树突状细胞(CAR-DC)的药物组合物；其中

所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域；

所述细胞内结构域包含FMS样酪氨酸激酶3 (Flt3)信号传导结构域；和

所述细胞是树突状细胞或其祖细胞。

19.权利要求18的方法，其中所述受试者患有增生性疾病、病症或病况(例如，癌症)。

20.权利要求18的方法，其中所述方法诱导对受试者中癌细胞的吞噬作用。

21.权利要求18的方法，其中所述CAR-DC交叉引发抗肿瘤T细胞应答。

22.权利要求18的方法，其中所述CAR-DC产生消除肿瘤的免疫应答。

23. 权利要求19的方法，其中所述增生性疾病、病症或病况是恶性肿瘤、实体瘤或液体肿瘤。

24. 权利要求19的方法，其中所述修饰的细胞

直接靶向抗原阳性(Ag⁺)肿瘤细胞用于消除；或

通过交叉呈递和表位扩散间接靶向CAR抗原阴性(Ag^-)肿瘤细胞用于消除。

25.一种制备修饰的免疫细胞(例如DC、cDC1)群体的方法，其包括：

(i)提供或已提供来自受试者的细胞群体(例如，来自循环、脐带或骨髓的单核细胞或干细胞)；

(ii)在包含FMS样酪氨酸激酶3 (Flt3)激动剂的培养基中，将细胞群体培养至少约一天；

(iii)将基于Flt3的嵌合抗原受体(CAR)引入来自(ii)的细胞内；和

(iv)在包含FMS样酪氨酸激酶3 (Flt3)激动剂的培养基中，将来自(iii)的细胞培养足以形成修饰的细胞的时间量，

其中

所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，所述细胞内结构域包含FMS样酪氨酸激酶3 (Flt3)信号传导结构域。

26.权利要求25的方法，其中足以形成所述修饰的细胞的时间量为约5天至约15天。

27.权利要求25的方法，其中将所述CAR引入骨髓细胞内包括将编码包含Flt3或Flt3样细胞内结构域的蛋白质产物的细胞内核酸序列引入所述细胞内。

28.权利要求27的方法，其中所述修饰的细胞能够进行抗原交叉呈递、适应性抗肿瘤免疫应答或激活抗肿瘤T细胞。

29.权利要求25的方法，其中所述修饰的细胞是树突状细胞或常规1型树突状细胞(cDC1)。

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