JP2023502503A - DuoCARによりがんを処置するための組成物および方法 - Google Patents

DuoCARによりがんを処置するための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

少なくとも2つのベクターを含む新規治療用免疫療法組成物であって、各ベクターが機能的CARをコードし、それによって、ベクターの組合せが、2つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各ベクターがコードする結合性ドメイン(複数可)が、膜貫通ドメインおよび1つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されている、治療用免疫療法組成物、ならびにがんおよび他の疾患および状態を処置するために使用することができる患者特異的な免疫療法におけるその使用方法が本明細書で提供される。

Description

発明の詳細な説明
関連出願の相互参照
本PCT出願は、2019年11月22日出願の米国特許出願第16/692,957号に対する優先権を主張し、これは、2019年9月18日出願のPCT出願第PCT/US19/51734号に対する優先権を主張し、これは次に、2018年8月21日出願の米国特許出願第16/078,269号の一部継続出願である2018年9月18日出願の米国特許出願第16/134,735に対する優先権を主張し、これは次に、2017年9月1日出願のPCT出願第PCT/US17/49923号に対する優先権の利益を主張し、これは次に、米国特許法第119条(e)の下で、2016年9月2日出願の米国仮特許出願第62/382,791号に対する優先権の利益を主張し、それらのそれぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の分野
本出願は、がんの分野、特に、機能的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも2つのベクターを含む組成物、および患者特異的な免疫療法におけるその使用方法に関する。
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された、その全体にわたって参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。2020年11月19日に作成された前記ASCIIコピーはSequenceListing.txtと名付けられ、366キロバイトのサイズである。
発明の背景
がんは、ヒトの健康に対する最も致命的な脅威の1つである。米国だけで、がんは毎年ほぼ130万人の新たな患者が罹患し、心血管疾患に次いで2番目に多い死因であり、死亡数の約4分の1を占めている。固形腫瘍が、これらの死亡のほとんどの原因である。ある特定のがんの医学的処置においては顕著な進歩があったものの、全てのがんについての5年全生存率は過去20年間で約10%しか改善しなかった。がんまたは悪性腫瘍は、制御されずに迅速に転移および成長し、処置を非常に困難にする。現代のがん処置における難しさの1つは、がんの生検および診断の間に経過する時間、ならびに患者の有効な処置である。この時間の間に、患者の腫瘍は、妨げられずに成長し得、その結果、疾患は、処置が適用される前に、さらに進行している。このことは、がんの進行および転帰に負の影響を及ぼす。
キメラ抗原受容体(DuoCAR)は、3つの本質的な単位を含むハイブリッド分子である:(1)細胞外抗原結合性モチーフ、(2)連結/膜貫通モチーフ、および(3)細胞内T細胞シグナル伝達モチーフ(Long AH、Haso WM、Orentas RJ.Lessons learned from a highly-active CD2-specific chimeric antigen receptor.Oncoimmunology.2013年;2巻(4号):e23621頁)。CARの抗原結合性モチーフは一般に、免疫グロブリン(Ig)分子の最小の結合性ドメインである単鎖断片可変(scFv)を基にして作られる。代替の抗原結合性モチーフとして、例えば、受容体リガンド(即ち、IL-13は、腫瘍が発現するIL-13受容体に結合するように操作されている)、インタクトな免疫受容体、ライブラリー由来ペプチド、および自然免疫系エフェクター分子(例えば、NKG2D)も操作されている。CAR発現のための代替の細胞標的(例えば、NKまたはガンマ-デルタT細胞)も開発中である(Brown CEら Clin Cancer Res.2012年;18巻(8号):2199~209頁;Lehner Mら PLoS One.2012年;7巻(2号):e31210頁)。CARベクターを形質導入するための最も活性なT細胞集団を定義すること、最適な培養および増殖の技術を決定すること、ならびにCARタンパク質構造自体の分子的詳細を定義することに関して、いまだにかなりのなすことが残っている。
CARの連結モチーフは、IgGの定常ドメインなどの比較的安定な構造ドメインとするか、または伸長された可撓性リンカーとなるように設計することができる。IgGの定常ドメインに由来するものなどの構造モチーフを使用して、scFv結合性ドメインをT細胞原形質膜表面から離れて延在させることができる。これは、結合性ドメインが腫瘍細胞表面膜に特に近い一部の腫瘍標的にとって重要であり得る(例えば、ジシアロガングリオシドGD2にとって;Orentasら、未公開の観察)。今日まで、CARにおいて使用されるシグナル伝達モチーフは常にCD3-ζ鎖を含んでいるが、それは、このコアモチーフが、T細胞活性化のための重要なシグナルであるからである。最初に報告された第2世代CARは、CD28シグナル伝達ドメインおよびCD28膜貫通配列を特徴としていた。このモチーフは、CD137(4-1BB)シグナル伝達モチーフを含有する第3世代CARでも同様に使用された(Zhao Yら J Immunol.2009年;183巻(9号):5563~74頁)。新たなテクノロジーの進歩に伴い、抗CD3および抗CD28抗体に連結されたビーズによるT細胞の活性化、CD28由来のカノニカルな「シグナル2」の存在がCAR自体によってコードされる必要はもはやなくなった。ビーズ活性化を使用して、第3世代ベクターは、in vitroアッセイにおいて第2世代ベクターよりも優れているわけではないことが見出され、また、白血病のマウスモデルにおいては第2世代ベクターを超える明らかな利益は得られなかった(Haso W、Lee DW、Shah NN、Stetler-Stevenson M、Yuan CM、Pastan IH、Dimitrov DS、Morgan RA、FitzGerald DJ、Barrett DM、Wayne AS、Mackall CL、Orentas RJ.Anti-CD22-chimeric antigen receptors targeting B cell precursor acute lymphoblastic leukemia,Blood.2013年;121巻(7号):1165~74頁;Kochenderfer JNら Blood.2012年;119巻(12号):2709~20頁)。これは、第2世代CD28/CD3-ζ(Lee DWら American Society of Hematology Annual Meeting.New Orleans、LA;12月7~10日、2013年)およびCD137/CD3-ζシグナル伝達形式(Porter DLら N Engl J Med.2011年;365巻(8号):725~33頁)のCD19特異的CARの臨床的成功によって裏付けられている。CD137に加えて、OX40などの他の腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーも、CARが形質導入されたT細胞において重要な持続シグナルを提供することができる(Yvon Eら Clin Cancer Res.2009年;15巻(18号):5852~60頁)。CAR T細胞集団が培養された培養条件も、等しく重要である。
がんに対するCAR療法のより広範で有効な適応における現在の課題は、説得力のある標的の不足に関する。細胞表面抗原への結合因子を創出することは、現在容易に達成可能であるが、正常組織を見逃しながら腫瘍に対して特異的な細胞表面抗原を発見することは、依然として厄介な課題である。CAR発現T細胞により高い標的細胞特異性を与えるための1つの潜在的な方法は、コンビナトリアルCARアプローチを使用することである。1つのシステムでは、CD3-ζとCD28シグナル単位が、同じ細胞において発現される2つの異なるCARコンストラクト間で分割される;別のシステムでは、2つのDuoCARが、同じT細胞において発現されるが、一方はより低い親和性を有し、したがって第2のCARの完全な活性のために代替的CARが最初に結合されることを必要とする(Lanitis Eら Cancer Immunol Res.2013年;1巻(1号):43~53頁;Kloss CCら Nat Biotechnol.2013年;31巻(1号):71~5頁)。免疫療法剤としての単一のscFvベースのCARの生成のための第2の課題は、腫瘍細胞の不均一性である。少なくとも1つのグループは、標的抗原陰性集団の成長を回避することを期待して、エフェクター細胞集団が複数の抗原(HER2、IL-13Ra、EphA2)を同時に標的化する、神経膠芽腫のためのCAR戦略を開発している(Hegde Mら Mol Ther.2013年;21巻(11号):2087~101頁)。
T細胞ベースの免疫療法は、合成生物学における新たな領域になっている;複数のプロモーターおよび遺伝子産物は、これらの高度に強力な細胞を腫瘍微小環境に導くことが想定され、ここで、T細胞は、負の調節シグナルを免れることができ、かつ有効な腫瘍死滅を媒介できる。AP1903による誘導性カスパーゼ9コンストラクトの薬物誘導性二量体化を介した望ましくないT細胞の排除は、T細胞集団を制御できる強力なスイッチが薬理学的に始動され得る1つの手段を実証している(Di Stasi Aら、N Engl J Med.2011年;365巻(18):1673~83頁)。デコイ受容体の発現によるトランスフォーミング成長因子-βの負の調節効果に対して免疫性であるエフェクターT細胞集団の創出は、エフェクターT細胞が最適な抗腫瘍活性のために操作され得る程度をさらに実証している(Foster AEら J Immunother.2008年;31巻(5号):500~5頁)。
したがって、CARは、内因性T細胞受容体と類似した様式でT細胞活性化を誘発できるようであるが、今日までのCARベースのテクノロジーの臨床適用に対する主要な障害は、CAR+T細胞の限定的なin vivo増殖、注入後の細胞の迅速な消失、期待外れの臨床活性、根本的な医学的疾患または状態の再発、およびかかるCAR+T細胞を使用するがんの診断およびタイムリーな処置の間に経過する必要以上の時間である。
したがって、上述の欠点なしにがん特異的な意図する治療的特質を示し得るCARベースの治療を使用するがんの処置のための組成物および方法を発見する、当該分野における緊急かつ長年にわたる要求が存在する。
本発明は、機能的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも2つのベクターを含む組成物、ならびにがん、および他の疾患および/または状態を処置するために使用され得る患者特異的な免疫療法におけるその使用方法を提供することによって、これらの要求に対処する。
特に、本明細書に開示および記載される本発明は、少なくとも2つのベクターをコードする1つまたは複数の単離された核酸分子を含む免疫療法組成物を提供し、各ベクターは、機能的DuoCARをコードし、それによって、ベクターの組合せは、2つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各ベクターがコードする結合性ドメイン(複数可)は、膜貫通ドメインおよび1つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されており、この免疫療法組成物は、自家リンパ球を形質導入するために使用されて、in vivo増殖を促進するために、患者に直接注入して戻され得る活性な患者特異的な抗腫瘍リンパ球細胞集団が生成し、患者特異的な抗腫瘍T細胞の持続は、患者特異的な様式で、腫瘍の安定化、低減、排除、がんの寛解、またはがんの再発の予防もしくは改善、あるいはそれらの組合せをもたらす。
発明の概要
2つ以上のベクターが形質導入されたリンパ球を含む新規養子免疫療法組成物、ならびにがん、および他の疾患および状態を処置するために使用することができる患者特異的な併用免疫療法におけるその使用方法が本明細書で提供される。
したがって、一態様では、Duoキメラ抗原受容体(DuoCAR)を発現するレンチウイルスベクター、ならびにDuoCARを発現するレンチウイルスベクターをコードする核酸分子が本明細書で提供される。例えば対象におけるがんを処置するための、開示されるDuoCARを発現するレンチウイルスベクター、宿主細胞、および核酸分子を使用する方法も提供される。
一態様では、少なくとも2つのベクター(DuoCAR)をコードする1つまたは複数の単離された核酸分子を含む免疫療法組成物が提供され、各ベクターは、機能的CARをコードし、ベクターのうち1つにおける少なくとも1つの結合性ドメイン(複数可)は、同一ではなく、それによって、ベクターの組合せは、2つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各ベクターがコードする結合性ドメイン(複数可)は、膜貫通ドメインおよび1つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されている。
一実施形態では、少なくとも3つのベクター(TRioCAR)をコードする1つまたは複数の単離された核酸分子を含む免疫療法組成物が提供され、各ベクターは、機能的CARをコードし、それによって、ベクターの組合せは、2つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各ベクターがコードする結合性ドメイン(複数可)は、膜貫通ドメインおよび1つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されている。
一実施形態では、少なくとも4つのベクター(QuatroCAR)をコードする1つまたは複数の単離された核酸分子を含む免疫療法組成物が提供され、各ベクターは、機能的CARをコードし、それによって、ベクターの組合せは、2つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各ベクターがコードする結合性ドメイン(複数可)は、膜貫通ドメインおよび1つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されている。
さらに別の実施形態では、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9または10のベクター(例えば、「nCAR」)をコードする1つまたは複数の単離された核酸分子を含む免疫療法組成物が提供され、各ベクターは、機能的CARをコードし、それによって、ベクターの組合せは、2つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各ベクターがコードする結合性ドメイン(複数可)は、膜貫通ドメインおよび1つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されており、各独自の数のnCARは、本明細書で「nCAR」(例えば、DuoCAR、TrioCAR、QuatroCAR、PentaCAR、HexaCAR、HeptaCAR、OctaCAR、NonaCAR、およびDecaCARなど)と呼ばれる独自のCAR組成物を構成するCAR産物にアセンブルされる時に定められる。
一実施形態では、(a)細胞において機能的である核酸配列をそれぞれ含む少なくとも2つのベクターを含み;(b)各ベクターが、機能的CAR分子をコードし;(c)各CARが、少なくとも1つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達モチーフで構成され;(d)ベクターのうち1つにおける少なくとも1つの結合性ドメインが、同一ではなく;(e)少なくとも1つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、少なくとも1つのリンカードメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達モチーフが、各前記ベクターにおいて共有結合的に連結されており、ベクターの組合せが、1つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、(a)細胞において機能的である核酸配列をそれぞれ含む少なくとも2つのベクターを含み;(b)各ベクターが、機能的CAR分子をコードし;(c)各CARが、少なくとも1つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み;(d)各ベクターにおける少なくとも1つの結合性ドメイン(複数可)が、同一ではなく;(e)少なくとも1つのシグナル伝達モチーフの組合せが、ベクターそれぞれの間で同一ではなく;(f)少なくとも1つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達モチーフが、各前記ベクターにおいて共有結合的に連結されており、2つ以上のベクターの組合せが、1つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、免疫療法組成物が提供される。
一実施形態では、各ベクターが1つよりも多い機能的CARをコードする、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、1つまたは複数のシグナル伝達モチーフの組合せが、1つまたは複数のベクターにおいて同一である、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、1つまたは複数の多重結合性ドメインが、1つまたは複数のベクターにおいて同一である、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、リンパ球集団(複数可)が、自家T細胞、または末梢血由来リンパ球の混合物を含む、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、CARの少なくとも1つの細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する抗体の少なくとも1つの単鎖可変断片を含む、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、CARの少なくとも1つの細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する抗体の少なくとも1つの重鎖可変領域を含む、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、CARの少なくとも1つの細胞外抗原結合性ドメイン、CARの少なくとも1つの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその両方が、リンカーまたはスペーサードメインによって膜貫通ドメインに接続されている、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、CARの細胞外抗原結合性ドメインに、リーダーペプチドが先行する、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、CARの細胞外抗原結合性ドメインが、CD19、CD20、CD22、ROR1、TSLPR、メソセリン、CD33、CD38、CD123(IL3RA)、CD138、BCMA(CD269)、GPC2、GPC3、FGFR4、c-Met、PSMA、糖脂質F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1、MAGE-A3、MHCと組み合わされたPRAMEペプチド、またはそれらの任意の組合せを含む抗原を標的化する、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、CARの細胞外抗原結合性ドメインが、抗CD19 scFV抗原結合性ドメイン、抗CD20 scFV抗原結合性ドメイン、抗CD22 scFV抗原結合性ドメイン、抗ROR1 scFV抗原結合性ドメイン、抗TSLPR scFV抗原結合性ドメイン、抗メソセリンscFV抗原結合性ドメイン、抗CD33 scFV抗原結合性ドメイン、抗CD38 scFV抗原結合性ドメイン、抗CD123(IL3RA) scFV抗原結合性ドメイン、抗CD138 scFV抗原結合性ドメイン、抗BCMA(CD269) scFV抗原結合性ドメイン、抗GPC2 scFV抗原結合性ドメイン、抗GPC3 scFV抗原結合性ドメイン、抗FGFR4 scFV抗原結合性ドメイン、抗c-Met scFV抗原結合性ドメイン、抗PMSA scFV抗原結合性ドメイン、抗糖脂質F77 scFV抗原結合性ドメイン、抗EGFRvIII scFV抗原結合性ドメイン、抗GD-2 scFV抗原結合性ドメイン、抗NY-ESO-1 TCR(単鎖TCRコンストラクトを含む)抗原結合性ドメイン、抗MAGE-A3 TCR、または85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するそのアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを含む、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、CARのリンカーまたはスペーサードメインが、CD8の細胞外ドメインに由来し、膜貫通ドメインに連結される、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、CARが、T細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD271、TNFRSF19、FcイプシロンR、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインをさらに含む、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、少なくとも1つの細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3ゼータ細胞内ドメインをさらに含む、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、少なくとも1つの細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3ゼータ細胞内ドメインに対してC末端側に配置される、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、少なくとも1つの細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含む、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、少なくとも1つの共刺激ドメインが、OX40、CD70、CD27、CD28、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、DAP10、DAP12、および4-1BB(CD137)、PD-1、GITR、CTLA-4、またはそれらの任意の組合せの機能的シグナル伝達ドメインを含む、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、単一のベクターが、組み込みのためのCRISPRシステムと組み合わせて、全てのキメラ抗原受容体をコードするために使用される(例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、SV40、ヘルペスベクター、POXベクター、RNA、プラスミド、コスミド、または任意のウイルスベクターもしくは非ウイルスベクター)、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、各ベクターが、単独、あるいはトランスフェクション試薬、または非限定的な例が電気穿孔であるRNAもしくはDNAを細胞に送達する方法と組み合わされる、RNAベクターまたはDNAベクターである、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、少なくとも1つのベクターが、細胞において核酸の発現を調節する核酸分子を発現する、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、核酸分子が、内因性遺伝子の発現を阻害するまたは欠失させる、免疫療法組成物が提供される。
ある特定の実施形態では、活性な患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団が、リンパ球の採取または腫瘍生検の1日、2日、3日、4日、5日、7日、10日、12日、14日、21日、または1か月以内に生成し、活性な患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を、がんに罹患している患者に注入して戻すことができ、かつin vivo増殖を促進することができ、患者特異的な抗腫瘍リンパ球細胞集団の持続が、患者特異的な様式で、腫瘍の安定化、低減、排除、がんの寛解、またはがんの再発の予防もしくは改善、あるいはそれらの組合せをもたらす、免疫療法組成物が提供される。
一態様では、上述のキメラ抗原受容体をコードする単離された核酸分子が本明細書で提供される。
本発明の免疫療法組成物の患者特異的な自家リンパ球集団(複数可)において使用されるDuoCARの一態様では、DuoCARは、診断、がん患者の無増悪生存期間などの処置転帰のモニタリングおよび/もしくは予測における使用のため、またはかかる処置の進行をモニタリングするために、検出可能なマーカーを発現または含有するように改変される。患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるDuoCARの一実施形態では、開示されるDuoCARをコードする核酸分子は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターなどのベクター中に含まれ得る。ベクターは、DNAベクター、RNAベクター、プラスミドベクター、コスミドベクター、ヘルペスウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、もしくはレトロウイルスベクター、またはそれらの組合せである。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるDuoCARのある特定の実施形態では、2つ以上のレンチウイルスベクターは、例えば、限定としてではなく、両種指向性マウス白血病ウイルス[MLV-A]、ヒヒ内在性ウイルス(BaEV)、GP164、テナガザル白血病ウイルス[GALV]、RD114、ネコ内在性ウイルスレトロウイルス由来GP、および水疱性口内炎ウイルス[VSV]、麻疹ウイルス、家禽ペストウイルス[FPV]、エボラウイルス[EboV]、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス[LCMV])非レトロウイルス由来GPを含む、異なるウイルス糖タンパク質(GP)、ならびに例えば、限定としてではなく、MLV-A GPの細胞質尾部(TRと称される)に融合されたGALVまたはRD114 GPの細胞外および膜貫通ドメインをコードするキメラGPを含む、それらのキメラバリアントでシュードタイプ化される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるDuoCARのある特定の実施形態では、ベクターは、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、自殺プロモーターまたはそれらの任意の組合せであるプロモーターをさらに含む。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるDuoCARのさらに別の実施形態では、CARを発現するベクターは、自殺スイッチによって、CAR T細胞の発現を制御するため、またはCAR-T細胞を排除するために、1または複数の作動可能なエレメントを含むようにさらに改変され得る。自殺スイッチには、例えば、アポトーシス誘導性シグナル伝達カスケード、または細胞死を誘導する薬物が含まれ得る。好ましい実施形態では、CARを発現するベクターは、チミジンキナーゼ(TK)またはシトシンデアミナーゼ(CD)などの酵素を発現するようにさらに改変され得る。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるDuoCARの別の態様では、DuoCARをコードする核酸分子(複数可)を含む宿主細胞もまた提供される。一部の実施形態では、宿主細胞は、T細胞、例えば、対象から得られた初代T細胞である。一実施形態では、宿主細胞はCD8T細胞である。一実施形態では、宿主細胞はCD4+T細胞である。一実施形態では、宿主細胞は、釣り合いを気にせずに患者の産物から直接精製された選択されたCD4+およびCD8+リンパ球である。別の実施形態では、産物中のCD4+およびCD8+T細胞の数は特異的である。別の実施形態では、ナイーブT細胞(Tn)、エフェクターメモリーT細胞(Tem)、セントラルメモリーT細胞(Tcm)、調節性T細胞(TReg)、誘導調節性T細胞(iTreg)、サプレッサーT細胞(Ts)、幹細胞メモリーT細胞(Tscm)、ナチュラルキラー(NK)細胞、およびリンホカイン活性化キラー(LAK)細胞を含む表現型マーカーによって同定されるT細胞の特異的サブセットが利用される。
さらに別の実施形態では、がんを有するヒトの患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)の集団を含む抗腫瘍有効量の免疫療法組成物を含む医薬組成物であって、集団の細胞が、少なくとも2つのベクターをコードする核酸分子を含む細胞を含み、各ベクターが、機能的CARをコードし、それによって、ベクターの組合せが、2つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各ベクターがコードする結合性ドメイン(複数可)が、膜貫通ドメインおよび1つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されている、医薬組成物が提供される。
さらに別の実施形態では、がんを有するヒトの患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)の集団を含む抗腫瘍有効量の免疫療法組成物を含む医薬組成物であって、集団の細胞が、(a)2つ以上のベクターをコードする核酸分子を含む細胞を含み;(b)各ベクターが、機能的CARをコードし;(c)各CARが、少なくとも1つの結合性ドメイン、少なくとも1つの膜貫通ドメイン、少なくとも1つのリンカードメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達モチーフで構成され;(d)ベクターのうち1つにおける少なくとも1つの結合性ドメインが、同一ではなく;(e)少なくとも1つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、少なくとも1つのリンカードメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達モチーフが、各前記ベクターにおいて共有結合的に連結されており、ベクターの組合せが、1つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、医薬組成物が提供される。
さらに別の実施形態では、がんを有するヒトの患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)の集団を含む抗腫瘍有効量の免疫療法組成物を含む医薬組成物であって、集団の細胞が、(a)2つ以上のベクターをコードする核酸分子を含む細胞を含み;(b)各ベクターが、機能的CARをコードし;(c)各CARが、少なくとも1つの結合性ドメイン、少なくとも1つの膜貫通ドメイン、少なくとも1つのリンカードメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み;(d)各ベクターにおける少なくとも1つの結合性ドメイン(複数可)が、同一ではなく;(e)少なくとも1つのシグナル伝達モチーフの組合せが、ベクターそれぞれの間で同一ではなく;(f)少なくとも1つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、少なくとも1つのリンカードメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達モチーフが、各前記ベクターにおいて共有結合的に連結されており、2つ以上のベクターの組合せが、1つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、医薬組成物が提供される。
一実施形態では、がんは、1または複数の化学療法剤に対して非応答性の難治性がんである。がんは、造血がん、骨髄異形成症候群、膵がん、頭頸部がん、皮膚腫瘍、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)における微小残存病変(MRD)、肺がん、乳房がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、黒色腫もしくは他の血液学的がんおよび固形腫瘍、またはそれらの任意の組合せを含む。別の実施形態では、がんは、血液学的がん、例えば、白血病(例えば、慢性リンパ性白血病(CLL)、急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、もしくは慢性骨髄性白血病(CML))、リンパ腫(例えば、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫またはホジキンリンパ腫)または多発性骨髄腫、あるいはそれらの任意の組合せを含む。
さらに別の実施形態では、がんは、口腔および咽頭がん(舌、口、咽頭、頭頸部)、消化器系がん(食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、肝内胆管、胆嚢、膵臓)、呼吸器系がん(喉頭、肺および気管支)、骨および関節のがん、軟組織がん、皮膚がん(黒色腫、基底細胞癌および扁平上皮癌)、小児腫瘍(神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫)、中枢神経系の腫瘍(脳腫瘍、星状細胞腫、神経膠芽腫、神経膠腫)、ならびに乳房、生殖系(子宮頸部、子宮体、卵巣、外陰部、腟、前立腺、精巣、陰茎、子宮内膜)、泌尿器系(膀胱、腎臓および腎盂、尿管)、眼および眼窩、内分泌系(甲状腺)ならびに脳および他の神経系のがん、またはそれらの任意の組合せを含む成人癌を含む。
別の態様では、単一または複数のキメラ抗原受容体(DuoCAR)をコードする2つ以上のレンチウイルスベクターで形質導入され、それによって、in vivo増殖を促進することができる患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団が生成し、患者特異的な抗腫瘍T細胞の持続が、患者特異的な様式で、腫瘍の安定化、低減、排除、がんの寛解、またはがんの再発の予防もしくは改善、あるいはそれらの組合せをもたらす、自家リンパ球細胞集団を含む医薬組成物が提供される。
別の態様では、単一または複数のキメラ抗原受容体(DuoCAR)をコードする1つまたは複数のレンチウイルスベクターで形質導入されて、in vivo増殖を促進することができる患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団が生成し、患者特異的な抗腫瘍T細胞の持続が、患者特異的な様式で、腫瘍の安定化、低減、排除、がんの寛解、またはがんの再発の予防もしくは改善、あるいはそれらの組合せをもたらす、自家T細胞集団を含む医薬組成物が提供される。
別の態様では、活性な患者特異的な自家抗腫瘍DuoCARを含むリンパ球細胞を作製する方法が提供される。この方法は、抗原に特異的に結合する2つ以上のキメラ抗原受容体(DuoCAR)をコードする2つ以上のベクターまたは核酸分子をリンパ球細胞に形質導入し、それによって、活性な患者特異的な自家抗腫瘍DuoCARを含むリンパ球細胞を作製するステップを含む。
さらに別の態様では、RNA操作されたリンパ球細胞の集団を生成する方法であって、2つ以上のキメラ抗原受容体(DuoCAR)をコードする核酸分子のin vitro転写RNAまたは合成RNAを対象の細胞集団中に導入し、それによって、in vivo増殖を促進することができる患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を生成するステップを含み、患者特異的な抗腫瘍T細胞の持続が、患者特異的な様式で、腫瘍の安定化、低減、排除、がんの寛解、またはがんの再発の予防もしくは改善、あるいはそれらの組合せをもたらす、方法が提供される。
別の態様では、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害、または状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、単一または複数のキメラ抗原受容体(DuoCAR)をコードする1つまたは複数のレンチウイルスベクターで形質導入され、それによって、in vivo増殖を促進することができる患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を生成する抗腫瘍有効量の自家リンパ球細胞を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、患者特異的な抗腫瘍T細胞の持続が、患者特異的な様式で、腫瘍の安定化、低減、排除、がんの寛解、またはがんの再発の予防もしくは改善、あるいはそれらの組合せをもたらす、方法が提供される。
別の態様では、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害、または状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、単一または複数のキメラ抗原受容体(DuoCAR)をコードする2つ以上のレンチウイルスベクターで形質導入されて、in vivo増殖を促進するために患者に直接注入して戻すことができる患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を生成する抗腫瘍有効量の自家リンパ球細胞集団を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、患者特異的な抗腫瘍T細胞の持続が、患者特異的な様式で、腫瘍の安定化、低減、排除、またはがんの寛解、またはがんの再発の予防もしくは改善、あるいはそれらの任意の組合せをもたらす、方法が提供される。
一実施形態では、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害、または状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、少なくとも2つのベクターであって、各ベクターが、機能的CARをコードし、それによって、ベクターの組合せが、2つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各ベクターがコードする結合性ドメイン(複数可)が、膜貫通ドメインおよび1つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されている、ベクター、ならびに薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、ベクターの組合せが、1つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、方法が提供される。
別の実施形態では、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害、または状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、(a)2つ以上のベクターをコードする核酸分子を含み;(b)各ベクターが、機能的CARをコードし;(c)各CARが、少なくとも1つの結合性ドメイン、少なくとも1つの膜貫通ドメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達モチーフで構成され;(d)ベクターのうち1つにおける少なくとも1つの結合性ドメインが、同一ではなく;(e)少なくとも1つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達モチーフが、各前記ベクターにおいて共有結合的に連結されており、ベクターの組合せが、1つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法が提供される。
さらに別の実施形態では、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害、または状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、(a)2つ以上のベクターをコードする核酸分子を含み;(b)各ベクターが、機能的CARをコードし;(c)各CARが、少なくとも1つの結合性ドメイン、少なくとも1つの膜貫通ドメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み;(d)各ベクターにおける少なくとも1つの結合性ドメイン(複数可)が、同一ではなく;(e)少なくとも1つのシグナル伝達モチーフの組合せが、ベクターそれぞれの間で同一ではなく;(f)少なくとも1つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達モチーフが、各前記ベクターにおいて共有結合的に連結されており、2つ以上のベクターの組合せが、1つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法が提供される。
ある特定の実施形態では、遺伝子改変されたリンパ球は、自家T細胞リンパ球であり、自家または同種T細胞リンパ球は、悪性腫瘍疾患の再発を予防または改善するために、患者に直接注入して戻される。
ある特定の他の実施形態では、遺伝子改変されたリンパ球は、自家T細胞リンパ球であり、自家リンパ球は、in vivo増殖を促進するために、患者に直接注入して戻され、患者特異的な抗腫瘍T細胞リンパ球の持続は、患者特異的な様式で、腫瘍の安定化、低減、排除、またはがんの寛解、またはがんの再発の予防もしくは改善、あるいはそれらの任意の組合せをもたらす。
さらに別の実施形態では、T細胞は、特異的活性化または記憶に関連する表面マーカーの発現によって事前選択されている。
さらに別の実施形態では、T細胞は造血幹細胞ドナーに由来し、手順は造血幹細胞移植の状況で行われる。
ある特定の実施形態では、リンパ球細胞が、特異的活性化または記憶に関連する表面マーカーの発現によって事前選択されている、方法が提供される。
ある特定の実施形態では、リンパ球細胞が、T細胞であり、造血幹細胞ドナーに由来し、手順が造血幹細胞移植の状況で行われる、方法が本明細書で提供される。
さらに別の態様では、がんと診断されたヒトにおいて、遺伝子操作された患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)の持続性の集団を生成する方法が提供される。一実施形態では、この方法は、本明細書に記載される1つまたは複数の患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)をそれを必要とするヒト患者に投与するステップを含み、患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)の持続性の集団、またはリンパ球細胞の子孫の集団は、ヒト中で、投与後、少なくとも1か月間、2か月間、3か月間、4か月間、5か月間、6か月間、7か月間、8か月間、9か月間、10か月間、11か月間、12か月間、2年間、または3年間、持続する。
一実施形態では、ヒト中の子孫リンパ球細胞は、メモリーT細胞を含む。別の実施形態では、T細胞は自家T細胞である。
本明細書に記載される方法の態様および実施形態の全てにおいて、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する上述のがん、疾患、障害または状態のいずれかは、本明細書に開示されるDuoCAR免疫療法組成物のうち1または複数を含む患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)を使用して、処置または予防または改善され得る。
さらに別の態様では、上記患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)を含むDuoCAR免疫療法組成物を作製するためのキット、または上記対象において、腫瘍抗原の上昇した発現と関連するがん、疾患、障害もしくは状態のいずれかを予防、処置もしくは改善するためのキットであって、上に開示された核酸分子、ベクター、宿主細胞もしくは組成物のいずれか1つまたはそれらの任意の組合せを含むコンテナ、およびキットを使用するための指示書を含むキットが提供される。
本発明の組成物および方法は、DuoCARの生成および利用を参照して例示しているが、組成物および方法が、TrioCARおよびQuatroCARの作成および利用を含むことを具体的に意図することが本明細書で企図される。
さらに別の態様では、免疫療法組成物は、少なくとも1つのベクターをコードする1つまたは複数の単離された核酸を含み、前記ベクターが、DuoCARをコードする少なくとも1つのメッセンジャーRNA(即ち、マルチシストロン性核酸、または1つよりも多い転写物をもたらす核酸)をもたらす核酸配列を含み、2つ以上の同一ではない抗原標的に結合する能力をもたらし、それによって、前記ベクターを発現する単一細胞に存在する複数の抗原特異性を生じる。
さらに別の態様では、免疫療法組成物は、上記少なくとも2つのベクターをコードする1つまたは複数の単離された核酸を含み、各ベクターが、可溶性バインダー(タグ化scFv、または抗タグバインダーに連結されたscFvなど)の共インキュベーションまたは共投与の際に機能的キメラ抗原受容体を再構成するする機能的タグまたは抗タグ結合性部分(AT-CAR)をさらにコードし、それによって、2つのベクターの組合せが、2つ以上の同一ではない抗原結合性ドメインに結合する能力をもたらし、これらの2つのベクターを発現する細胞に存在する複数の抗原特異性を生じる。
さらに別の態様では、免疫療法組成物は、上記少なくとも2つのベクターをコードする1つまたは複数の単離された核酸を含み、各ベクターが、可溶性バインダー(タグ化scFv、または抗タグバインダーに連結されたscFvなど)の共インキュベーションまたは共投与の際に機能的キメラ抗原受容体を再構成するする機能的タグまたは抗タグ結合性部分(AT-CAR)をコードし、各ベクターが、複数の抗原特異性をもたらす可溶性タンパク質または構造が改変されたタンパク質と結合することができる独自のタグ(または、抗タグ)を発現するか、あるいは各ベクターが、タグ化(または、抗タグ化)バインダーの抗原結合性ドメインへの細胞内シグナル伝達モチーフがコードされるAT-CARの特異的連結をもたらす唯一の可溶性結合性ドメインと結合する独自のタグ(または抗タグ)を発現する。
DuoCARベクターの製造のための非限定的な実施形態では、上記で言及される実施形態および態様に開示される組成物および方法のそれぞれは、2つのベクターを、別々に作製し、次いで、続けてまたは同時に、T細胞に添加することができる。別の非限定的な実施形態では、2つ以上のベクターのプラスミドDNAを、産生細胞のトランスフェクションの前もしくはその間に混合して、または細胞ゲノムの産生中に組み込んで、複数のDuoCARベクター粒子を含むウイルスベクターの混合物を産生することができ、その後、患者のT細胞の形質導入および遺伝子改変のために使用することができる。
本明細書で具体的に企図されるDuoCAR、TrioCAR、およびQuatroCARの種々の態様および実施形態それぞれのために、機能的CARをコードするヌクレオチド配列は、配列番号3、9、21、25、29、31、35、39、43、47、49、51、53、55、59、61、109、111、113、もしくは115、またはそれらの任意の組合せのヌクレオチド配列を含む。
本明細書で具体的に企図されるDuoCAR、TrioCAR、およびQuatroCARの種々の態様および実施形態それぞれのために、各ベクターは、配列番号4、10、22、26、30、32、36、40、44、48、50、52、54、56、60、62、110、112、114、もしくは116、またはそれらの任意の組合せのアミノ酸配列を含む機能的CARをコードする。
上記の患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)、キメラ抗原受容体(DuoCAR)を発現する2つ以上のレンチウイルスベクター、宿主細胞、および方法は、本明細書に詳細に記載される具体的な態様および実施形態を超えて有用であることが理解される。本開示の前述の特色および利点は、添付の図面を参照して進む以下の詳細な説明からより明らかになる。
本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読んだ場合に、より良好に理解されるであろう。本発明を例証する目的のために、現在好ましい実施形態を図面に示す。しかし、本発明が、図面に示される実施形態の正確な配置および手段に限定されないことが理解されるべきである。
別々の商業実体として産生され得る4つの産物(実施例1から4)を示す図である。これらのDuoCARのセットは、3つの白血病関連抗原CD19、CD20、およびCD22を発現するヒトB細胞悪性腫瘍を標的化するために創出することができる。産物1では、2つの遺伝子ベクターを、活性化T細胞集団を共形質導入するために使用する。第1のベクターは、CD8膜貫通領域によって接続された単一の細胞内ドメイン(z、CD3ゼータ鎖)に連結された2つの抗原結合性ドメイン(CD19、CD20)をコードする(8)。第2のベクターは、CD22結合性ドメインおよび2つのシグナル伝達ドメイン(BB、CD137/4-1BB由来;およびz)をコードする。実施例2の第2の産物は、CD28およびzシグナル伝達ドメインに連結されたCD19およびCD20結合性ドメインを有する第1のベクターを特徴とする。第2のベクターは、CD22結合性ドメイン、ならびにBBおよびzシグナル伝達ドメインをコードし、第3世代CARベクターのシグナル伝達パッケージ(3つの異なるシグナル伝達ドメイン)を本質的に反復した。実施例3の第3の産物では、第1のベクターは、BBおよびzシグナル伝達ドメインに連結されたCD20およびCD22結合性ドメインをコードし、第2のベクターは、CD28およびzシグナル伝達ドメインに連結されたCD19結合性ドメインをコードする。実施例4の第4の産物では、第1のベクターは、CD20およびCD22結合性ドメイン、ならびにBBおよびzシグナル伝達ドメインをコードする。第2のベクターは、CD19結合性ドメインおよびzシグナル伝達ドメインをコードする。 B細胞悪性腫瘍を標的化する治療用産物のためにDuoCARに組み合わされ得る全ての潜在的な単一の構成要素を示す図である。命名法は図1におけるものと同一である。 炎症性疾患または自己免疫疾患、および感染性疾患を含む複数の治療上の要求に適用することができるDuoCARについての一般化された模式図を示す図である。図では、a-CDX、a-CDY、a-CDZは、それぞれ、3つの異なる標的抗原CDX、CDY、およびCDZに特異的な抗原結合性ドメインを指す。CARの細胞内の態様は全て、CD8リンカー、およびCD3-ゼータ、CD28、または4-1BBシグナル伝達ドメインのいずれかに連結された膜貫通ドメインを含む(図1における通り)。単一ベクターに対するこれらの2つのベクター(例えば、例AプラスF、ここで、抗原X、Y、およびZは、CD3-ゼータおよび4-1BBを介して細胞内シグナル伝達を提供しながら、標的化される)のうちいずれかの具体的な組合せは、具体的な治療上の要求に従って規定される。 2つの抗原が各ベクターによって標的化されるDuoCARのセットについての一般化された模式図を示す図である。図3におけるものと同一のベクターは、それらの具体的な文字の呼称を保持する(図3および図4のAは同じである)。新たな4番目の抗原結合性ドメインは、a-CDWによって示される。4つの抗原を標的にする1つの産物は、A+T DuoCARのセットである。この例では、細胞外抗原のCDX、CDY、CDZ、およびCDWは、CD3-ゼータおよびCD28細胞内シグナルの両方を提供しながら、標的化される。 本発明のDuoCAR(図5E、5F、および5G)と比較した文献における現在のCAR(図5A、5B、5C、および5D)を示す図である。リンカーおよび膜貫通ドメイン(単一の塗りつぶしなしのボックス)に接続された単一の結合性ドメイン(別個の特異性をそれぞれ有する、対の黒色、塗りつぶしなし、または縞模様の球)の発現を誘導するCAR発現ベクターを創出することができる。図では、太い灰色線は、血漿細胞膜を示す。この図では、対の黒色の球は抗CD19-scFvを示し、対の塗りつぶしなしの球は抗CD20-csFvを示し、対の縞模様の球は抗CD22-scFvを示し、全て、アミノ酸配列、例えば、GGGGSの多量体(1、2、3、4、5、または6反復)を接合させることによって連結される。4-1BB(CD137)、CD28、およびCD3-ゼータ鎖由来の細胞内のリンパ球シグナル伝達ドメインは、示されるように、組み合わせることができる。(図5A)単一CARでは、単一の結合性ドメインは、膜貫通および2つのシグナル伝達ドメインと組み合わされて、第2世代CARが創出される。(図5B)分割CARでは、2つの異なるバインダーが、単一のシグナル伝達ドメインと共に発現され、これは、2つの異なる抗原の認識の際に、有効なT細胞シグナル伝達にするように組み合わされなければならない。(図5C)タンデムCARでは、2つの結合性ドメインは、単一のシグナル伝達ドメインに連結される。この場合では、いずれかのドメインの結合が、完全なT細胞の活性化を誘導する。(図5D)1つのベクター由来の複数CARでは、2つの完全な機能的CARが、単一ベクターから発現され、唯一の抗原とそれぞれ結合することができる。(図5E)対照的に、DuoCARは、2つのベクターで構成され、可能性があるシグナル伝達ドメインの複数の組合せと共に少なくとも3つの結合性ドメインを発現する。DuoCARを識別する本質的な特色は、2つ以上の転写物の発現、結合性ドメインの多重度(少なくとも1つが多重標的化する)、および2つの発現された細胞表面タンパク質のうち少なくとも1つの完全に機能的なシグナル伝達特徴である。(図5F)DuoCARの単一特異性可溶性バインダーフォーマットでは、ベクターによってコードされるCAR部分は、膜貫通および細胞内シグナル伝達モチーフもコードするタグまたは抗タグモチーフを発現する(CARベースのベクター、細胞内モチーフに関して同一ではない)。ベースのベクターは、抗原と相互作用するscFvドメイン、およびCARベースのタンパク質それ自身への結合を媒介するタグまたは抗タグモチーフの両方を含む可溶性タンパク質と結合する。可溶性タンパク質がCARベースのタンパク質に結合したら、DuoCAR[(E)における通り]によって媒介される抗腫瘍活性を媒介する同じ構造上の特徴が再構成される。(図5G)DuoCARの二重特異性可溶性バインダーフォーマットでは、唯一の可溶性バインダーが唯一のベースのベクターに結合することができるように、二重特異性の「タグ」-「抗タグ」相互作用は独特である。この例では、ベースのベクターにおける黒色のひし形、および可溶性二重scFvタンパク質における角形バインダーは、「ビオチン」-「抗ビオチン」相互作用を示し得、第2のCARベースのベクターにおける黒色の三日月形は、単一特異性のscFv構造における黒色の楕円形と相互作用し、「FITC」-「抗FITC」相互作用を示し得る。 第2世代(2つの共刺激ドメイン)および第3世代(3つの共刺激ドメイン)のフォーマットの間で異なるCAR発現ベクターで形質導入された初代ヒトT細胞におけるCARコンストラクトの細胞表面発現レベルを示すグラフである。T細胞を、以下のCAR:CARなし(偽)、第2世代CAR(CAR-A-28z)、第3世代CAR(CAR-A-28BBz)、および代替の第2世代CAR(CAR-A-BBz)を発現するように形質導入した。CARの表面発現のレベルは、フローサイトメトリーによって検出され、y軸の平均蛍光強度(MF)として報告される。全てのコンストラクトが全く同じCAR結合性ドメインを発現したにもかかわらず、両方の第2世代CARのMFIは、非常に明るかった。 ヒトT細胞におけるDuoCAR細胞表面発現を示す図である。ヒトT細胞を、IL-2存在下においてCD3-CD28ナノマトリックス(TRansAct、Miltenyi Biotec)で活性化し、2つのベクター(一方はタンデムCD20-CD19 CARをコードし、もう一方は単一CD22 CARをコードする、したがって、2+1 Duo-Setフォーマット)で形質導入し、次いで、染色のために組換えCD19、CD20、またはCD22を使用して、フローサイトメトリーによって、CD19-、CD20-、またはCD22-scFvドメインの発現について分析した。対の縦列は、CD20およびCD19 scFvについて左の縦列に、CD22およびCD19 scFvについて右の縦列に、二重染色を示す。1行目は、形質導入されていない(UTD)T細胞を示し、したがって結合を示さない。2行目は、CD8膜貫通ドメイン、ならびに細胞内CD28およびCD3-ゼータシグナル伝達ドメインを有するCD20_CD29 CARベクターをコードするLVで形質導入されたT細胞を示す(20-19-28z)。二重染色は、CD20およびCD19の結合について見られるが(左のパネル)、CD19の結合のみ右パネルに見られる。3行目は、CD8膜貫通ドメイン、ならびに細胞内4-1BBおよびCD3-ゼータシグナル伝達ドメインを有するCD22 CARベクターで形質導入されたT細胞を示す(22-BBz)。二重染色は、CD19またはCD20で見られず(左のパネル)、CD22に結合することができる細胞の単一の集団のみ見られる(右のパネル)。4行目では、T細胞は、2行目および3行目の両方のベクターで構成されるDuoSetで形質導入される。DuoSetのみが、3つのCARコード結合性ドメイン全てを発現する(細胞の42%がCD20_19を発現し(左のパネル)、38%がCD22およびCD19結合性ドメインを発現する(右のパネル))。CD22およびCD19 scFvは、DuoSetを含む2つの別個の膜貫通タンパク質それぞれ上にあるので、38%は、この例では、真のDuoSetを発現する集団を示す。 DuoCAR発現T細胞の抗腫瘍細胞溶解活性を示すグラフである。図7に記載されるように、単一のCAR構成要素(20_19-28zまたは22-BBz)またはDuoCAR(20_19-28z+22-BBz)で形質導入されたヒトT細胞を、4つの異なるエフェクター対標的比(20:1、10:1、5:1、2.5:1、示される通り)で、細胞傷害性T細胞アッセイにおいて使用した。CAR-T標的として使用される白血病細胞株は、Raji(3つ全ての標的抗原を発現する)、REH(3つ全ての標的抗原を発現する)、K562(対照、標的発現なし)、K562-CD19(CD19を発現する)、K562-CD20(CD20を発現する)、およびK562-CD22(CD22を発現する)であった。DuoCAR形質導入細胞(20-19-28z+22-BBz、2+1 DuoSet)のみが、白血病細胞株(RajiおよびREH)および3つ全ての単一発現K562標的細胞株(K562-CD19、K562-CD20、K562-CD22)の両方に対する高い細胞溶解活性を示した。 LV調製の2つの異なる方法によって達成される初代ヒトT細胞におけるDuoCAR細胞表面発現を示す図である。図7におけるものと同じ方法およびデータ分析を使用し、次いで、CD19、CD20、およびCD22に特異的なDuoCAR(1つのCARがタンデムCD20およびCD19バインダーであり、第2のCARがCD22バインダーで構成される、2+1 DuoSet)で形質導入された細胞を創出した。1列目のデータは、CD19およびCD20バインダーの発現についてのフローサイトメトリー分析を示すが、2列目は、それぞれ、左下、左上、右上、および右下の象限に、非形質導入、単独CD22-CAR形質導入、CD22およびCD20_19 CARによる二重形質導入、ならびにタンデムCD20_19 CARによる単独形質導入に対応する4つの異なる集団に対する、DuoCAR発現細胞においてCARとして存在するCD22およびCD19バインダーについてのフローサイトメトリー分析を示す。2つのLV形質導入法(共形質導入)および単一LV形質導入法(共トランスフェクション)の両方とも、類似のDuoCAR染色パターンを与え、30%を超えるT細胞集団が、両方のCAR細胞表面タンパク質を発現することによって、CD19、CD20、およびCD22に特異的であった。 DuoCAR2シストロン性コンストラクトの略図を示す図である。DuoCARコンストラクトは、2Aペプチドによって分離された2つのCAR鎖の配列を含む単一の2シストロン性オープンリーディングフレームから発現される。1つのCARは、インフレームでCD8ヒンジおよび膜貫通ドメインに連結されたCD22 scFv、4-1BB共刺激ドメイン、ならびにCD3ゼータ活性化ドメインで構成される(図10A)。別のCARは、タンデムCD20 CD19 scFvベースの標的化ドメイン、続いてCD8ヒンジおよび膜貫通ドメイン、CD28共刺激ドメイン、ならびにCD3ゼータ活性化ドメインで構成される(図10B)。 フローサイトメトリーによって測定される、DuoCAR発現ベクターで形質導入された初代ヒトT細胞におけるSet 1の2シストロン性DuoCARおよび対照の細胞表面発現を示す図である。T細胞を、以下のCAR:CARなし(UTD)、コンストラクト番号2228(2019タンデムCAR)、コンストラクト番号2200、2209、2218、2225、2227(CD22 CARバリアント)、コンストラクト番号(CD22に標的化される1つのCAR鎖、ならびにCD20およびCD19腫瘍抗原に標的化される別のタンデムCAR鎖を含む2515、2520、25212シストロン性CAR)を発現するように形質導入した。示される二連のプロットにおいて、CAR22発現をY軸に示し、タンデム2019CAR鎖を表すCAR19発現をX軸に示す。陽性細胞パーセンテージを各象限に示す。データは、別個の健康なドナーからのT細胞における3つの形質導入実験を代表するものである。 Raji腫瘍細胞と共インキュベートされた2シストロン性DuoCARのセット1のサイトカイン応答を示すグラフである。T細胞を、以下のCAR:CARなし(UTD)、コンストラクト番号2228(-2019タンデムCAR)、コンストラクト番号2200(-CD22 CAR)、コンストラクト番号2515、2520、2521を発現するように形質導入した。DuoCAR T細胞および対照を、三重陽性Raji細胞と共に一晩インキュベートし、次いで上清を採取し、IFNg、TNFa、およびIL-2についてELISAによって分析した。N=3、+/-SD。別個のドナーからのT細胞における3つの単独実験を代表する1つの実験を示す。 フローサイトメトリーによって測定される、DuoCAR発現ベクターで形質導入された初代ヒトT細胞におけるSet 2の2シストロン性DuoCARおよび対照の細胞表面発現を示す図である。T細胞を、以下のCAR:CARなし(UTD)、コンストラクト番号1497(-2019タンデムCAR)、コンストラクト番号2200(-CD22 CAR)、CD22に標的化される1つのCAR鎖、ならびにCD22およびCD19腫瘍抗原に標的化される別のタンデムCAR鎖を含む2シストロン性CARのコンストラクト番号D0043、D0044、D0046、D0047を発現するように形質導入した。示される二連のプロットにおいて、CAR22発現をY軸に示し、タンデム2019CAR鎖を表すCAR19発現をX軸に示す。陽性細胞に対するパーセンテージを各象限に示す。データは、3人の別個の健康なドナーからのT細胞における3つの形質導入実験を代表するものである。 Set 2の2シストロン性DuoCAR発現T細胞の抗腫瘍細胞溶解活性を示すグラフである。単一CAR構成要素(LTG1497、20_19-28z、またはLTG2200、22-BBz)またはDuoCAR(コンストラクト番号D0043、D0044、D0046、D0047、20_19-28z+22-BBzをコードする)で形質導入されたヒトT細胞を、4つの異なるエフェクター対標的比(10:1、5:1、2.5:1、示される通り、コンストラクト名称の「D」および数字表示の間のゼロは簡素化のために省略した)で、細胞傷害性T細胞アッセイにおいて使用した。CAR-T標的として使用される白血病細胞株は、Raji(3つ全ての標的抗原を発現する)、Reh(3つ全ての標的抗原を発現する)、392T(3つ全ての標的抗原を欠く)であった。DuoCARは、E:T依存性の様式で、三重陽性細胞株を溶解し、標的陰性293T細胞株では溶解は起こらなかった。 2シストロン性DuoCARセット2発現T細胞の抗腫瘍細胞溶解活性を示すグラフである。単一CAR構成要素(LTG1497、20_19-28z、またはLTG2200、22-BBz)またはDuoCAR(コンストラクト番号D0043、D0044、D0046、D0047、20_19-28z+22-BBzをコードする)で形質導入されたヒトT細胞を、4つの異なるエフェクター対標的比(10:1、5:1、2.5:1、示される通り、コンストラクト名称の「D」および数字表示の間のゼロは簡素化のために省略した)で、細胞傷害性T細胞アッセイにおいて使用した。CAR-T標的として使用される単一陽性腫瘍細胞株は、K19(CD19を発現する)、K20(CD20を発現する)、およびK22(CD22を発現する)であった。3つの単一陽性腫瘍細胞株を、所望の単一抗原(CD19、CD20、またはCD22)およびホタルルシフェラーゼ遺伝子の安定な形質導入によって、CD19、CD20、またはCD22発現を天然で欠いている親K562赤白血病株のバックグラウンドで開発した。DuoCARは、E:T依存性の様式で、単一陽性細胞株を溶解し、バックグラウンドレベルを上回る溶解は、不一致の抗原標的化ドメイン(CAR 22、LTG 2200対K19およびK20、タンデムCAR 2019、LTG 1479対K22)を有するCAR対照によって媒介されなかった。 Raji腫瘍細胞と共に共インキュベートされたか、または腫瘍の非存在下でインキュベートされた(CAR単独)、2シストロン性DuoCARバージョン2のサイトカイン応答を示すグラフである。T細胞を、以下のCAR:CARなし(UTD)、コンストラクト番号2273(-2019タンデム単鎖CAR)、コンストラクト番号2200(CD22単鎖CAR)、コンストラクト番号D44、D47(それぞれ、D0044およびD0047 CARコンストラクトを参照、コンストラクト名称の「D」および数字表示の間のゼロは簡素化のために省略した)を発現するように形質導入した。DuoCARおよびT細胞および対照を、三重陽性Raji細胞と共に一晩インキュベートし、次いで上清を採取し、IFNg、TNFa、およびIL-2についてELISAによって分析した。N=3、+/-SD。別個のドナーからのT細胞における3つの単独実験を代表する1つの実験を示す。 共トランスフェクションまたは共形質導入によってDuoCARを生成するための同じ細胞または細胞の集団における共発現のために組み合わされ得る2つのCAR鎖の略図を示す図である。1つのCAR鎖は、インフレームでCD8ヒンジおよび膜貫通ドメインに連結されたCD22 scFv、4-1BB共刺激ドメイン、ならびにCD3ゼータ活性化ドメインで構成される。別のCAR鎖は、タンデムCD20 CD19 scFvベースの標的化ドメイン、続いてCD8ヒンジおよび膜貫通ドメイン、CD28共刺激ドメイン、ならびにCD3ゼータ活性化ドメインで構成される。 フローサイトメトリーによって測定される、LVを産生する2つの移入プラスミドの共トランスフェクションによって生成したDuoCAR発現ベクター調製物、または個々に形質導入された単一ベクター対照(上のパネル)で形質導入された初代ヒトT細胞におけるDuoCARおよび対照の細胞表面発現を示す図である。T細胞を、以下のCAR:コンストラクト番号2273、2228(-2019タンデムCAR)、D1、D2、D3、CD22 CAR、およびDuoCAR(コンストラクト番号D1+2273、D2+2273、D3+2273)を発現するように形質導入した。示される散布図において、CAR22発現をY軸に示し、タンデム2019CAR鎖を表すCAR19発現をX軸に示す。陽性細胞に対するパーセンテージを各象限に示す。3人のドナーからのT細胞を使用する3つの実験についての代表的なデータ。 DuoCAR細胞または単鎖CAR対照の抗腫瘍細胞溶解活性を示すグラフである。DuoCAR T細胞を、レンチウイルスベクターを産生する2つの移入プラスミドの共トランスフェクションによって生成した。T細胞を、以下のCAR:コンストラクト番号2273(-2019単鎖タンデムCAR);コンストラクト番号D1、D2、D3(-CD22単鎖CAR);および同じCAR T産物において2つの単一CAR鎖の組合せによって生成したDuoCAR(コンストラクト番号D1+2273、D2+2273、D3+2273、数字表示における「D」は簡素化のために省略)を発現するように、得られるDuoCARベクターまたは単鎖CAR対照で形質導入した。得られるCAR T細胞を、CD19+CD20+CD22+(Raji、Reh)またはCD19、CD20、CD22三重陰性対照株293Tであるネイティブ白血病株に対して、2つの異なるエフェクター対標的比(10:1、5:1、示される通り)で、細胞傷害性T細胞アッセイにおいて分析した(図19A)。ネイティブ標的株RajiおよびRehを、全てのDuoCAR群のコンストラクト番号D1+2273、D2+2273、D3+2273(数字表示における「D」は簡素化のために省略)による単鎖CARコンストラクトによって、および単鎖CAR対照によって、溶解した。対照的に、DuoCARおよび単一CAR対照は、CD19、CD20、CD22三重陰性株293Tに対して細胞溶解性ではなく、CARコンストラクトの標的特異性を実証した。DuoCARは、3つの標的抗原を同時に標的化するので、標的特異性の問題にさらに対処するために、DuoCARを、CD19、CD20、またはCD22発現を天然で欠いているK562赤白血病細胞のバックグラウンドにおいて作製されたトランスジェニック単一陽性腫瘍株に対して試験した。CAR-T標的として使用される単一陽性腫瘍細胞株は、K19(CD19を発現する)、K20(CD20を発現する)、およびK22(CD22を発現する)であった、図19B。DuoCARは、E:T依存性の様式で、単一陽性細胞株を溶解し、DuoCARの全ての標的化ドメインが機能し、それらの同族標的分子に特異的であることを示した(図19B)。さらに、不一致の抗原標的化ドメイン(CAR 22、LTG 2200対K19およびK20、タンデムCAR 2019、LTG 1479対K22)を有するCAR単鎖対照は、特異的な溶解活性を有していなかった(図19B)。 DuoCAR細胞または単鎖CAR対照の抗腫瘍細胞溶解活性を示すグラフである。DuoCAR T細胞を、レンチウイルスベクターを産生する2つの移入プラスミドの共トランスフェクションによって生成した。T細胞を、以下のCAR:コンストラクト番号2273(-2019単鎖タンデムCAR);コンストラクト番号D1、D2、D3(-CD22単鎖CAR);および同じCAR T産物において2つの単一CAR鎖の組合せによって生成したDuoCAR(コンストラクト番号D1+2273、D2+2273、D3+2273、数字表示における「D」は簡素化のために省略)を発現するように、得られるDuoCARベクターまたは単鎖CAR対照で形質導入した。得られるCAR T細胞を、CD19+CD20+CD22+(Raji、Reh)またはCD19、CD20、CD22三重陰性対照株293Tであるネイティブ白血病株に対して、2つの異なるエフェクター対標的比(10:1、5:1、示される通り)で、細胞傷害性T細胞アッセイにおいて分析した(図19A)。ネイティブ標的株RajiおよびRehを、全てのDuoCAR群のコンストラクト番号D1+2273、D2+2273、D3+2273(数字表示における「D」は簡素化のために省略)による単鎖CARコンストラクトによって、および単鎖CAR対照によって、溶解した。対照的に、DuoCARおよび単一CAR対照は、CD19、CD20、CD22三重陰性株293Tに対して細胞溶解性ではなく、CARコンストラクトの標的特異性を実証した。DuoCARは、3つの標的抗原を同時に標的化するので、標的特異性の問題にさらに対処するために、DuoCARを、CD19、CD20、またはCD22発現を天然で欠いているK562赤白血病細胞のバックグラウンドにおいて作製されたトランスジェニック単一陽性腫瘍株に対して試験した。CAR-T標的として使用される単一陽性腫瘍細胞株は、K19(CD19を発現する)、K20(CD20を発現する)、およびK22(CD22を発現する)であった、図19B。DuoCARは、E:T依存性の様式で、単一陽性細胞株を溶解し、DuoCARの全ての標的化ドメインが機能し、それらの同族標的分子に特異的であることを示した(図19B)。さらに、不一致の抗原標的化ドメイン(CAR 22、LTG 2200対K19およびK20、タンデムCAR 2019、LTG 1479対K22)を有するCAR単鎖対照は、特異的な溶解活性を有していなかった(図19B)。 Raji13G11、CD19+CD20+CD22+クローンに反応したDuoCAR細胞または単鎖CAR対照のサイトカイン放出活性を示すグラフである。DuoCAR T細胞を、レンチウイルスベクターを産生する2つの移入プラスミドの共トランスフェクションによって生成した。T細胞を、以下のCAR:コンストラクト番号2273(-2019タンデムCAR);コンストラクト番号D1、D2、D3(-CD22 CAR);および3つのDuoCAR(D1+2273、D2+2273、D3+2273、図20、群のラベルにおける「D」は簡素化のために省略)を発現するように、単鎖CAR対照ベクターの得られるDuoCARベクターで形質導入した。得られるCAR T細胞を、10のE:T比で三重陽性Raji腫瘍株と終夜混合し、培養上清を、IFNg、TNFa、およびIL-2について分析した。全てのDuoCARコンストラクトは、Raji細胞に反応して、高いレベルの3つのサイトカインを生産した。Raji標的の非存在下でインキュベートされたCAR T細胞で構成されるDuoCAR単独対照は、Raji13G11細胞に反応して感知できるサイトカインを産生せず、サイトカイン応答が標的特異的であることが実証された(図20)。 CD19、CD20、およびCD22を同時に標的化するDuoCAR、ならびにタンデムおよび単一CAR対照の構築を示す図である。各DuoCARは、第1世代、または第2世代の単一標的化CD22 CARと共に共発現されるタンデムCD20およびCD19二重標的化CARで構成される。2つのCARコンストラクトは、2シストロン性フォーマットで共発現され、リボソームスキップ部位2A配列によって連結されて、化学量論的に等しい2つのCAR鎖の発現を確実にする。この2シストロン性発現カセットの性質のために、両方のCAR鎖は、各形質導入T細胞において共発現される。(図21A)三重標的化抗CD20および抗CD19抗CD22 DuoCARのD93は、20-19タンデムScFv、ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ICOS共刺激ドメイン、ならびにCD3z活性化ドメイン、続いて2A配列で構成され、次に、単一標的化CD22 CARは、CD22 scFv、ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびにCD3z活性化ドメインから構成される。DuoCARのD94は、ICOS共刺激ドメインのOX40ドメインでの置換を除いて、D93として構築される。DuoCARコンストラクトのD95は、ICOS共刺激ドメインのCD22 CAR鎖への付加を除いて、D94として構築される。DuoCARコンストラクトのD96は、D95コンストラクトにおけるOX40共刺激ドメインのCD27共刺激ドメインでの置換を除いて、コンストラクトD95として構成される。全てのコンストラクトは、CD8由来ヒンジおよび膜貫通ドメインを含む。タンデムコンストラクトの1497および単一CARコンストラクトのD89、D92、1538、1497は、機能的対照を示す。(図21B)1つのタンデムCAR鎖および1つの単一CAR鎖が同じT細胞において共発現されるDuoCAR T細胞、タンデムCAR、第2世代の単一CAR(共刺激ドメインなし)、および第1世代の単一CAR(共刺激ドメインなし)を模式的に示す。 ヒト初代T細胞におけるDuo-CAR TコンストラクトのD93、D94、D95、D96、およびタンデムCARの1497(比較)の表面発現。CAR T発現は、フローサイトメトリーにより決定した。材料および方法において記載されるように、T細胞を、IL-2存在下においてMiltenyi Biotec TransAct(商標)CD3 CD28試薬で活性化し、MOI80でLVを形質導入した。培養8日目に、3つの染色方法、即ち、CD19 Fcに続いて抗Fc-AF647、CD20ビオチン試薬に続いてストレプトアビジンPE、またはCD22-his試薬に続いて抗his-PE染色の1つを使用して、CAR表面発現について生存形質導入T細胞(7-AAD陰性)を検定した。図22A。4つの実験からの1つの代表的な形質導入実験を示す。CD19標的化scFvに対するCD20標的化scFvの発現を上のパネルに示し、CD19標的化scFvの発現に対するCD22標的化scFvの発現を下のパネルに示す。形質導入において使用したLVを、各縦列の上部に示す。CAR T陽性集団のパーセンテージを、ヒストグラムの各象限に示す。図22B。異なるドナーからのT細胞において行った4つの形質導入実験についての平均DuoCAR発現パーセンテージ±SEMを示す。CAR形質導入T細胞を、CAR19+CAR22+細胞と規定し、各細胞において共発現される2つのDuoCAR鎖の同時検出を示す。 in vitroのCAR T細胞傷害性を示すグラフである。ルシフェラーゼが安定に形質導入されたRaji 13G11 CD19+CD20+CD22+、REH CD19+CD20lowCD22+、またはCD19-CD22-細胞株(293TまたはK562)を使用して、ルシフェラーゼ系細胞傷害性アッセイを行った。DuoCARのD1~D4、タンデムCARの1497、または単一CARのD89およびD92による標的細胞の特異的溶解を、図23A)Raji細胞、図23B)Reh細胞、図23C)K562細胞、または図23D)293T細胞について示す。陰性対照であるUTD非形質導入T細胞を含めた。CAR T細胞と標的腫瘍細胞を、記載するエフェクター対標的(E:T)比(x軸)で一晩共インキュベートした。エラーバーは、3回の技術反復実験からの平均値を表す。3人のドナーからのT細胞における3つの単独実験を代表する1つの実験を示す。バーは、3人の別個のドナーからのCAR T細胞を用いて行った3つの独立した実験からの平均+/-SD値を示す。 白血病細胞株に反応したCAR Tサイトカイン放出。x軸に記載するCAR-Tによる、Raji白血病株と10:1のE:T比で一晩共培養後のサイトカインのIL-2、IFNγ、およびTNFαの産生を、ELISAを使用して測定した。バーは、3つの反復実験試料の平均+SDを表す。データは、3人の別個のドナーからのCAR T細胞を用いて行った3つの独立した実験を代表するものである。 DuoCARのin vivo抗腫瘍活性を示すグラフである。Raji腫瘍を保持するNSGマウスを、DuoCAR T細胞のD93、D94、D95、およびD96、またはタンデムCARの1497、または単一CARのD89もしくはD92で処置した。CAR T細胞を、腫瘍接種の7日後に、マウス当たりCAR T細胞500万個(図25A)またはマウス当たりCAR T細胞200万個(図25B)の用量のいずれかで、i.v.注射した。腫瘍量を、示された日に、生物発光によって評価した。群当たりN=6マウス、平均放射輝度±SEMを示す。 CD22 CD19標的化CAR T細胞(図26A~26D)、および親A431陰性対照株、または抗原逃避クローンを示すCD19、CD20、もしくはCD22のいずれかの発現を欠くように操作されたRaji白血病株クローン、および比較のための親Raji株(図26E~H)の特異性を確認するために、1つの標的抗原だけを過剰発現するように形質導入されたA431腫瘍株クローンに対するin vitroでのCAR T細胞傷害性を示すグラフである。全ての標的株は、ホタルルシフェラーゼを安定に発現した。バーは、3人の別個のドナーからのCAR T細胞を用いて行った3つの独立した実験を代表する1つの実験からの3通りの定量の平均±SEM値を表す。 腫瘍抗原逃避のモデルにおけるDuoCARのin vivo抗腫瘍活性を示すグラフである。NSGマウスに、等割合のRaji CD19neg、Raji CD20neg、Raji CD22neg、および親Rajiクローンの混合物を接種した。Raji腫瘍を、CD19、CD20、もしくはCD22抗原を標的化することができるDuoCAR T細胞のD93、D94、D95、もしくはD96、または単一CAR対照:CAR22 D92、CAR19 1538、もしくはCAR20 1495で処理した。T細胞を、腫瘍接種の7日後に、マウス当たりCAR T細胞500万個の用量で、i.v.注射し、腫瘍量を、示された日に、生物発光によって評価した。群当たりN=6マウス、平均放射輝度±SEMを示す。
詳細な説明
定義
本明細書で使用する場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「この(the)」とは、文脈が明らかに他を示さない限り、単数形および複数形の両方を指す。例えば、用語「1つの抗原」は、単数または複数の抗原を含み、語句「少なくとも1つの抗原」と等価とみなされ得る。本明細書で使用する場合、用語「含む(comprises)」とは、「含む(includes)」を意味する。したがって、「1つの抗原を含む(comprising)」とは、他の要素を排除することなく、「1つの抗原を含む(including)」を意味する。語句「および/または」とは、「および」または「または」を意味する。核酸またはポリペプチドについて与えられた任意のおよび全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、ならびに全ての分子量または分子質量値は、特記しない限り、おおよそであり、便宜的に提供されていることをさらに理解すべきである。本明細書に記載されるものと類似または等価な多くの方法および材料が使用され得るが、特に適切な方法および材料が以下に記載される。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法および実施例は、例示にすぎず、限定を意図しない。種々の実施形態の再検討を容易にするために、以下の用語の説明が提供される。
用語「約」とは、測定可能な値、例えば、量、時間的持続期間などに言及する場合、特定された値から+/-20%、+/-10%、またはより好ましくは+/-5%、または+/-1%、またはさらにより好ましくは+/-0.1%の変動を包含することを意味し、かかる変動は、開示される方法を実施するために適切である。
特記しない限り、本明細書の技術用語は、従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般的用語の定義は、Oxford University Pressによって刊行されたBenjamin Lewin、Genes VII、1999年;Blackwell Science Ltd.によって刊行されたKendrewら(編)、The Encyclopedia of Molecular Biology、1994年;およびVCH Publishers,Inc.によって刊行されたRobert A.Meyers(編)、Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference、1995年;および他の類似の参考文献中に見出すことができる。
本発明は、疾患および/または状態、ならびに血液学的悪性腫瘍および固形腫瘍を含むがこれらに限定されないがんを処置するための組成物および方法に関する。本発明は、1つまたは複数のDuoCARを発現するように2つ以上のベクターで形質導入されたT細胞の養子細胞移入の患者特異的な腫瘍特異的戦略に関する。
本発明は、より詳細には、キメラ抗原受容体(DuoCAR)を発現するレンチウイルスベクターに関するだけでなく、CARを発現するレンチウイルスベクターで形質導入された宿主細胞(例えば、リンパ球、T細胞)、レンチウイルスベクターおよびキメラ抗原受容体をコードする核酸分子、および例えば対象におけるがんを処置するためにも提供されるそれを使用する方法にも関する。
驚くべきことに、かつ予想外にも、ここで、自家リンパ球細胞集団が単一または複数のキメラ抗原受容体(DuoCAR)をコードする2つ以上のレンチウイルスベクターで形質導入される場合に、患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を含む免疫療法組成物が、抗腫瘍免疫療法薬として非常に有効であることが発明者によって発見された。単一または複数のCARを発現する少なくとも2つ以上のレンチウイルスベクターの使用は、in vivo増殖を促進するようであり、患者特異的な抗腫瘍T細胞の持続は、患者特異的な様式で、腫瘍の安定化、低減、排除、またはがんの寛解、またはがんの再発の予防もしくは改善、あるいはそれらの任意の組合せをもたらす。
本明細書に記載されるかかる活性な患者特異的な抗腫瘍T細胞集団は、in vivo増殖を促進するために、患者に直接注入して戻すことができ、患者特異的な抗腫瘍T細胞の持続は、患者特異的な様式で、腫瘍の安定化、低減、排除、がんの寛解、またはがんの再発の予防もしくは改善、あるいはそれらの組合せをもたらす。これは、治療用細胞集団の効率的な増殖および迅速な縮小も含む。
したがって、その最も広い態様では、この養子免疫療法の新規性は、CAR発現ベクターの組合せの使用にある。識別する特色は、1つまたは複数のキメラ抗原受容体を発現する単一ベクター従来の使用に反して、DuoCAR手法が、複数の抗原特異性およびin vivoの抗腫瘍T細胞活性のための最適なシグナル伝達の両方を付与することである。3つ以上の抗原が効率的に標的化されるシステムを創出することは、腫瘍がん細胞が腫瘍転移および/または腫瘍再発をもたらす逃避バリアントを生じることを可能にする単一またはタンデム手法よりもはるかに優れている。各ベクターにおける少なくとも1つの結合性ドメイン(複数可)の特異的な組合せが同一ではない単一または複数のキメラ抗原受容体(DuoCAR)をコードする2つ以上のベクターの使用は、少なくとも1つのシグナル伝達モチーフの組合せ(複数可)が、ベクターそれぞれの間で同一ではない要件と相まって、かかるduoレンチウイルスベクター由来CARで形質導入された遺伝子改変された1つまたは複数のリンパ球集団が、in vivo増殖を促進することができる患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を生じ、患者特異的な抗腫瘍リンパ球細胞の持続が、患者特異的な様式で、腫瘍もしくはがんの安定化、低減、排除、もしくは寛解、および/または腫瘍もしくはがんの再発の予防もしくは改善、あるいはそれらの任意の組合せをもたらすことを確実にする働きをする。
一態様では、少なくとも2つのベクター(DuoCAR)をコードする1つまたは複数の単離された核酸分子を含む免疫療法組成物が提供され、各ベクターは、機能的CARをコードし、ベクターのうち1つにおける少なくとも1つの結合性ドメイン(複数可)は、同一ではなく、それによりベクターの組合せは、2つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各ベクターがコードする結合性ドメイン(複数可)は、膜貫通ドメインおよび1つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されている。
別の態様では、少なくとも2つのベクター(DuoCAR)をコードする1つまたは複数の単離された核酸分子を含む免疫療法組成物が提供され、各ベクターは、機能的CARをコードし、それによって、ベクターの組合せは、2つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各ベクターがコードする結合性ドメイン(複数可)は、膜貫通ドメインおよび1つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されており、但し前記免疫療法組成物は、図5(A)、(B)、(C)、または(D)にそれぞれ示される、単一CAR、分割CAR、タンデムCAR、または複数CARを特異的に除外する。
本発明のDuoCARレンチウイルスベクター改変T細胞で達成される、免疫療法有効性、および腫瘍もしくはがんの再発の予防または改善は、単独の従来のCAR設計で達成されるものよりも有意に大きく、かつ相乗的である。それは、in vivo増殖の増加と相関する生物学的治療利益のこの独自の組合せであり、患者特異的な抗腫瘍リンパ球細胞の持続は、従来のCARベースのT細胞免疫療法と比較して、腫瘍もしくはがんの安定化、低減、排除、もしくは寛解をもたらす。
リンカーおよび膜貫通ドメイン(単一の塗りつぶしなしのボックス)に接続された単一の結合性ドメイン(別個の特異性をそれぞれ有する、黒色、塗りつぶしなし、または縞模様の球、図5)の発現を誘導するCAR発現ベクターを創出することができる。以下の図5は、本発明のDuoCARに対する従来のCARの比較を示す。図5では、太い灰色線は、血漿細胞膜を示す。4-1BB(CD137)、CD28、およびCD3-ゼータ鎖由来の細胞内のリンパ球シグナル伝達ドメインは、示されるように、組み合わせることができる。本文書におけるCD3シグナル伝達ドメインの全ての例および使用において、1、2、もしくは3つの免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)のいずれかの、その中のチロシン残基の選択的突然変異誘発、またはそのITAMモチーフをもはやリン酸化のための標的ではなくする他のかかる突然変異による変更によるCD3ゼータ鎖の改変が含まれる。単一CAR(図5A)では、単一の結合性ドメインは、膜貫通および2つのシグナル伝達ドメインと組み合わされる。分割CAR(図5B)では、2つの異なるバインダーは、有効にシグナル伝達するように組み合わされなければならない単一のシグナル伝達ドメインと共に発現される。タンデムCAR(図5C)では、2つの結合性ドメインは、単一のシグナル伝達ドメインに連結されている。1つのベクター由来の複数CAR(図5D)では、2つの完全な機能的CARは、単一ベクターから発現される。本発明のDuo-CAR(例えば、図5E)は、少なくとも2つのベクターをコードし、各ベクターは、機能的CARをコードし、それによって、ベクターの組合せは、2つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各ベクターがコードする結合性ドメイン(複数可)は、膜貫通ドメインおよび1つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されている。本発明のDuoCARを識別する本質的な特色は、2つ以上のベクターの使用、結合性ドメインの多重度、および2つの発現された細胞表面タンパク質のうち少なくとも1つの完全に機能的なシグナル伝達特徴(in vivoのT細胞増殖に関連する)である。
別の態様では、DuoCARは、治療用T細胞集団によって媒介される腫瘍に対する免疫応答を増強するために使用される。免疫応答は少なくとも3つの方法で増強される。
第1に、T細胞に身体における増殖および生存のための追加シグナルを提供することによって、本発明のDuoCARは、自己抗原(例えば、CD19)に遭遇する際に、T細胞集団を刺激することにより治療用T細胞集団の持続を可能にし、その喪失に、患者は耐えることができるが、依然として、これは、腫瘍組織それ自体には存在しない治療用細胞集団のために刺激シグナルを提供する働きをする。第3世代のDuoCAR(単一の細胞外Ig様バインダーに連結された3つの共刺激ドメインを細胞内で発現する)が、2つの細胞内共刺激ドメインを発現するDuoCARのものと比較して、治療用T細胞において良好に発現されないことは周知である/確立されている。例えば、以下の図6では、初代ヒトT細胞におけるCARコンストラクトの発現レベルは、第2世代(2つの共刺激ドメイン)および第3世代(3つの共刺激ドメイン)のコンストラクトの間で異なる。T細胞を、以下のCAR:CARなし(偽)、第2世代CAR(CAR-A-28z)、第3世代CAR(CAR-A-28BBz)、および代替の第2世代CAR(CAR-A-BBz)を発現するように形質導入した。CARの表面発現のレベルは、フローサイトメトリーによって検出され、y軸の平均蛍光強度(MF)として報告される。全てのコンストラクトが全く同じCAR結合性ドメインを発現したにもかかわらず、両方の第2世代CARのMFIは、非常に明るかった。
別個のベクターCARコンストラクト上に第3のT細胞を活性化する配列を提供することによって、発明者は、T細胞表面におけるCARの発現の減少の不利益を被ることなく、3つの共刺激ドメインを発現する利点を取り戻すことが可能である。
第2の態様では、本発明のDuoCARは、免疫抑制効果を媒介する腫瘍以外の細胞型を標的化してもよい。例えば、CD19発現B細胞が腫瘍病変に存在し、抗腫瘍免疫も阻害する場合、IL-4または他のメディエーターの産生によるように、免疫抑制性細胞集団であるDuoCAR発現腫瘍特異的T細胞集団の使用に対する第2の利益も除去される。
例えば、免疫抑制性B細胞が固形腫瘍病変内に存在する場合、これらは、B細胞特異的DuoCAR(CD19特異的DuoCARなど)の使用によって排除され得る。免疫抑制性線維芽細胞様細胞が存在する場合、これらは、間質特異的DuoCARによって(例えば、線維芽細胞活性化タンパク質-アルファ(FAP)を標的化することによって)除去され得る。奇形の脈管構造が、有効な免疫応答の欠如の原因となる場合、これらの種類の血管またはリンパ管の特異的標的(抗VEGFRなど)に特異的なDuoCARは、治療結果も改善し得る。
第3の態様では、本発明のDuoCARは、腫瘍の遠位にある、即ち、身体における別の区画に存在する、免疫抑制性集団を標的化する。例えば、腫瘍病変それ自体、または局所リンパ節もしくは骨髄のいずれかに存在し得る、骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)を標的化するためにDuoCARを使用することである。腫瘍流入領域リンパ節は、免疫活性化または免疫抑制の遺伝子座のいずれかであり得ることが十分に確立されている。これは、リンパ節の全体的な炎症トーン、およびリンパ節への移動前の遠位の樹状細胞分化に依存する。腫瘍流入領域リンパ節が、骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)、または樹状細胞などの誤分化した抗原提示細胞と集合する場合、これらの細胞型を標的化するDuoCARは、腫瘍それ自体の遠位であるが、治療結果も改善し得る。がん特異的なDuoCARの免疫療法適用を越えて、DuoCARの第2の適用は、自己免疫疾患および/または炎症性疾患の予防または処置であろう。腫瘍学ベースの適用からの相違は、調節性T細胞(TReg)、または誘導調節性T細胞(iTreg)、またはTh-2様免疫応答を促進する条件で培養される他の細胞が、細胞性基質であることである。腫瘍学的適用では、Th-1様細胞は細胞性基質である。造血幹細胞移植(HSCT)後の移植片対宿主病(GvHD)、アレルギー性の気道、腸、または他の粘膜炎症、または皮膚のアレルギーと同じぐらい多様な治療適用において、トランスフォーミング成長因子-ベータ(TFG-ベータ)などの免疫阻害性サイトカインを産生するCAR改変リンパ球の存在は、自己免疫または炎症を駆動する疾患を改善する幅広い寛容原性シグナルを発揮する働きをする。この手法は、アルツハイマー病、多発性硬化症、外傷性脳損傷、パーキンソン病、およびCTE(繰り返す脳振盪または微小の脳震盪による慢性外傷性脳症)などの末梢または中枢神経系(CNS)の神経学的炎症状態を含む。この手法は、COPD(慢性閉塞性肺疾患)などの進行性の瘢痕性疾患も含む。
炎症性疾患の処置では、組織抗原に特異的なリンパ球、炎症を起こした細胞の表面上のマーカーの窮迫、またはミスホールディングされたタンパク質(タウタンパク質、またはベータ-アミロイドなど)は、これらの標的に特異的なDuoCAR発現ベクターを生成することによって創出される。アルツハイマーのための単一抗体ベースの療法は、既に臨床開発中である(即ち、Eli Lilly and Companyによるソラネズマブ、およびBiogen,Inc.によるアデュカヌマブ)。アルツハイマー病において、単量体のまたは凝集したベータ-アミロイドに対する抗体は、細胞表面タンパク質に対するバインダーの代わりに、CARフォーマットで使用され得る。MHC分子に結合したタウタンパク質またはタウ-ペプチドに対するバインダーは、CARのための結合性モチーフとして使用することもできる。リンパ球の特異的な末梢組織へのホーミングを媒介する受容体も、CAR発現Treg集団に対して局所特異的にするために、CARフォーマットに含まれ得る。特異的組織、およびサイトカイン配列、またはサイトカインもしくはケモカイン受容体、またはバインダーへのリンパ球炎症を駆動することが公知の接着受容体ドメインは、CARドメインの一部として使用され得る。CD44およびインテグリンアルファ-4などの接着分子は、リンパ球をCNSに標的化することが公知であり、したがって、リンパ球集団のCNS移動挙動を媒介することが公知の接着分子由来のドメインを含めることは、CAR発現リンパ球を疾患の領域に標的化するためにも使用され得る。同じことは、腸(即ち、MAdCAm-1に対するバインダー、CCR9の発現、または抗CCL25など)、肺(即ち、P-セレクチン、またはメソセリン)、皮膚(即ち、E-セレクチンに対するバインダー)、または他の粘膜表面についても合致する。
この手法を使用するために、炎症状態を有するか、またはアルツハイマー病などの疾患が炎症病理学の緩和によって処置され得る患者は、クリニックに入院し、末梢血が採取される。Tregは、免疫磁気ビーズ(調節性T細胞単離キット、Miltenyi Biotec)によって直接選択され得るか、または適切なサイトカイン環境における培養によって誘導され得る。次いで、これらのTregまたはiTregは、DuoCARベクターで形質導入され、必要により、in vitroで増殖される(TReg増殖キット、Miltenyi Biotec)。DuoCAR結合性ドメインは、組織特異的ホーミング、および抗ベータアミロイドなどの疾患関連バインダーを媒介する抗体または受容体に由来する。そのようにして生成された操作された免疫エフェクター細胞は、適切な部位を標的化し、それらのTh2またはTreg分化パターンと一致するサイトカインを産生する。CAR-T細胞が、CAR受容体の活性化の際に特異的遺伝子ペイロードを分泌するように操作することができることも公知である。ベクターから発現されるDuoCARペイロードに加えて、a)A-ベータDP(アミロイドベータ分解プロテアーゼ)、b)マトリックスプロテアーゼ(MMP-9、およびCOPDにおけるMMP9阻害剤など)、c)プラーク形成を妨げるペプチドまたは可溶性抗体様バインダー、およびd)サイトカイン(TGF-ベータ、IL-4、IL-10など)などの追加の治療用タンパク質またはペプチドが、操作されたT細胞によって発現または分泌され得る。
miRNAも、T細胞機能を調節する細胞内で発現され得る。miRNAの例は、miR-92a、miR-21、miR-155、miR-146a、miR-3162、miR-1202、miR-1246およびmiR-4281、miR-142、miR-17-92である。また、miRNAへのshRNAも開発され得る。例は、miR-28、miR-150、およびmiR-107に標的化されるshRNAであり、これは、通常、PD1に結合し、その発現を増加させる。
腫瘍学ベースの適用、ならびに炎症性疾患および自己免疫疾患ベースの適用を超えて、DuoCARテクノロジーの第3の適用は、ウイルス、細菌、または真菌抗原に特異的な治療用リンパ球集団の生成である。したがって、B細胞悪性腫瘍のために記載される腫瘍学的適用に関して、感染性疾患の標的化は、微生物抗原の認識に基づいて、感染体またはそれらが存在する疾患組織に対する免疫保護活性または免疫治療活性をDuoCAR産物が媒介することを可能にする。T細胞受容体(TCR)ベースの手法とは異なって、T細胞受容体それ自体が、ペプチドがコードされる病原体の認識を媒介する場合、DuoCAR手法は、形質導入T細胞集団に対する抗体様認識(即ち、抗原プロセシングを必要としない)を与えるCARベクターフォーマットにおいて発現される結合タンパク質を利用する。治療用T細胞集団の活性化は、感染細胞の排除、および微生物抗原が細胞関連ではない場合には、感染体に対して開始される有効な免疫応答を可能にする可溶性メディエーター様インターフェロン-ガンマの放出を可能にする、免疫活性化遺伝子座をもたらす。
例えば、HIVは、非常に変わりやすいことが公知であり、さらに具体的なクレードまたは科に分類することができ、クレード特異的ウイルスエンベロープタンパク質(env、gp120)に対する抗体を創出することができる。DuoCAR手法を使用して、3つ以上のクレード特異的抗体様バインダーは、広い抗HIV免疫活性をもたらすCARコンストラクトに含まれる。ウイルスタンパク質に加えて、細菌タンパク質を標的化することができる。現在の医学の課題は、医療の場において多くの場合に生じる抗生物質耐性細菌の処置である。これらは、VRE(バンコマイシン耐性腸球菌)、MRSA(メチシリン耐性黄色ブドウ球菌)、KPC(肺炎桿菌カルバペネマーゼ産生グラム陰性菌、またCRKP)などを含む。クレブシエラ属の細胞表面抗原は、O抗原(9バリアント)およびK抗原(およそ80バリアント)を含む。O抗原のスペクトラムは、多くのK抗原のように、小さいDuoCARライブラリーで容易にカバーされ得る。使用のために、異なるKまたはO血清型に結合する抗体を特徴とするCARコンストラクトが創出され、これらのCARベクターは、腫瘍学的適用に関して、単離および活性化されたTh1様エフェクター細胞集団を形質導入するために使用される。真菌疾患において、L.Cooperら(Kumasesan,P.R.、2014年、PNAS USA、111巻:10660頁)の研究は、ヒト細胞において通常発現される真菌結合タンパク質であるデクチン-1が、CARとして再構成され、in vitroで真菌成長を制御するために使用することができることを実証した。ヒト疾患のアスペルギルス症は、重度の免疫抑制個体において起こり、真菌のA.フミガーツスによって引き起こされる。複数の群が、アスペルギルス属の細胞表面の抗原成分に特異的なモノクローナル抗体を産生し、このようにして、真菌表面上の3つ以上のアスペルギルス属抗原を標的化するDuoCARによる養子免疫療法への扉が開かれる。したがって、これらの感染性疾患の適用の全てにおいて、微生物抗原に対する免疫グロブリン様バインダーを創出する能力は、複数の抗原が、CAR発現エフェクターリンパ球集団によって標的化されることを可能にする。
DuoCAR、抗体およびその抗原結合性断片、コンジュゲート、ヌクレオチド、発現、ベクターおよび宿主細胞、開示されたDuoCARを使用する処置の方法、組成物およびキットのさらなる記載と共に、それらの細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの記載を含む本明細書に開示される患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用され得るDuoCARの詳細な記載は以下である。本発明の組成物および方法は、DuoCARの生成および利用を参照して例示しているが、組成物および方法が、TrioCARおよびQuatroCARの作成および利用を含むことを具体的に意図することが本明細書で企図される。
A.キメラ抗原受容体(DuoCAR中の存在として)
本明細書に開示されるDuoCARは、少なくとも2つのベクターを含み、各ベクターは、機能的CARをコードし、それによって、ベクターの組合せは、2つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各ベクターがコードする結合性ドメイン(複数可)は、膜貫通ドメインおよび1つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフ、抗原に結合することができる少なくとも1つの細胞外ドメイン、少なくとも1つの膜貫通ドメイン、ならびに少なくとも1つの細胞内ドメインに共有結合的に連結されている。
CARは、膜貫通ドメインを介してT細胞シグナル伝達ドメインに連結された、抗体の抗原結合性ドメイン(例えば、単鎖可変断片(scFv))を含有する、人工的に構築されたハイブリッドタンパク質またはポリペプチドである。DuoCARの特徴には、非MHC拘束様式で、モノクローナル抗体の抗原結合特性を活用して、選択された標的に向かってT細胞の特異性および反応性を再指向させるそれらの能力が含まれる。非MHC拘束的な抗原認識は、DuoCARを発現するT細胞に、抗原プロセシングと無関係に抗原を認識する能力を与え、そうして、腫瘍エスケープの主要な機構を迂回する。さらに、T細胞中で発現される場合、DuoCARは、有利なことに、内因性T細胞受容体(TCR)のアルファ鎖およびベータ鎖と二量体化しない。
本明細書に開示するように、DuoCARの細胞内T細胞シグナル伝達ドメインには、例えば、T細胞受容体シグナル伝達ドメイン、T細胞共刺激シグナル伝達ドメイン、またはその両方が含まれ得る。T細胞受容体シグナル伝達ドメインとは、T細胞受容体の細胞内ドメイン、例えば、限定としてではなく、CD3ゼータタンパク質の細胞内部分などを含む、CARの一部分を指す。共刺激シグナル伝達ドメインとは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である共刺激分子の細胞内ドメインを含む、CARの一部分を指す。一部の例では、活性化ドメインは、リン酸化の特異的部位の突然変異によって弱毒化され得、即ち、CD3ゼータ鎖中のITAMモチーフは、このようにして、そのドメインによって媒介されるシグナル伝達の程度を注意深く調節する。
1.細胞外ドメイン
一実施形態では、本明細書に開示される患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるCARは、さもなければ抗原結合性ドメインまたは部分と呼ばれる標的特異的結合エレメントを含む。ドメインの選択は、標的細胞の表面を規定するリガンドの型および数に依存する。例えば、抗原結合性ドメインは、特定の疾患状態と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。したがって、CAR中の抗原結合性ドメインに対するリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌および寄生生物感染、自己免疫疾患ならびにがん細胞と関連するものが含まれる。
一実施形態では、CARは、腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する所望の抗原結合性ドメインを操作することによって、目的の腫瘍抗原を標的化するように操作され得る。腫瘍抗原は、免疫応答、特にT細胞媒介性免疫応答を惹起する、腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。抗原結合性ドメインの選択は、処置される特定の型のがんに依存する。腫瘍抗原は、当該分野で周知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原(CEA)、ベータ-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、プロスターゼ(prostase)、前立腺特異的抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、プロステイン(prostein)、PSMA、Her2/neu、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、CD22、インスリン成長因子(IGF)-I受容体、IGF-II受容体、IGF-I受容体ならびにメソセリンが含まれる。本明細書に開示される腫瘍抗原は、例として含まれるにすぎない。このリストは、排他的である意図はなく、さらなる例が、当業者に容易に明らかである。
一実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍と関連する1または複数の抗原性がんエピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原として機能し得るいくつかのタンパク質を発現する。これらの分子には、組織特異的抗原、例えば、黒色腫におけるMART-1、チロシナーゼおよびGP 100、ならびに前立腺がんにおける前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)および前立腺特異的抗原(PSA)が含まれるがこれらに限定されない。他の標的分子は、癌遺伝子HER-2/Neu/ErbB-2などの形質転換関連分子の群に属する。標的抗原のさらに別の群は、癌胎児性抗原(CEA)などのがん胎児性抗原である。B細胞リンパ腫では、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンが、個々の腫瘍に独自の真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。B細胞分化抗原、例えば、CD19、CD20、CD22、およびCD37は、B細胞リンパ腫における標的抗原の他の候補である。これらの抗原の一部(CEA、HER-2、CD19、CD20、CD22、イディオタイプ)は、限定的な成功で、モノクローナル抗体による受動免疫療法の標的として使用されている。
腫瘍抗原の型は、腫瘍特異的抗原(TSA)または腫瘍関連抗原(TAA)でもあり得る。TSAは、腫瘍細胞に独自であり、身体中の他の細胞上には存在しない。TAAは、腫瘍細胞に独自ではなく、その代わり、抗原に対する免疫学的寛容の状態を誘導できない条件下で正常細胞上でも発現される。腫瘍上での抗原の発現は、免疫系が抗原に応答できるようにする条件下で生じ得る。TAAは、免疫系が未熟であり応答できない胎児発生の間に正常細胞上で発現される抗原であり得、または正常細胞上では非常に低いレベルで通常存在するが、腫瘍細胞上ではかなり高いレベルで発現される抗原であり得る。
TSAまたはTAAの非限定的な例には、以下が含まれる:分化抗原、例えば、MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2および腫瘍特異的多系列抗原、例えば、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15;過剰発現された胚抗原、例えば、CEA;過剰発現された癌遺伝子および変異した腫瘍サプレッサー遺伝子、例えば、p53、Ras、HER-2/neu;染色体転座から生じる独自の腫瘍抗原;例えば、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR;ならびにウイルス抗原、例えば、エプスタイン・バーウイルス抗原EBVAおよびヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6およびE7。他の大きいタンパク質ベースの抗原には、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、ベータ-カテニン、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、アルファ-フェトプロテイン、ベータ-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3/CA 27.29/BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68/P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733/EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90/Mac-2結合タンパク質/シクロフィリンC関連タンパク質、TAAL6、TAG72、TLPおよびTPSが含まれる。
好ましい実施形態では、CARの抗原結合性ドメイン部分は、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソセリン、CD33、c-Met、PSMA、糖脂質F77、EGFRvIII、GD-2、MY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCRなどを含むがこれらに限定されない抗原を標的化する。さらに別の実施形態では、タグまたは抗タグ結合性ドメインを含むDuoCARが本明細書に提供される。
標的化される所望の抗原に依存して、CARは、所望の抗原標的に対して特異的な適切な抗原結合性ドメインを含むように操作され得る。例えば、CD19が標的化される所望の抗原である場合、CD19に特異的な抗体またはそのscFv小断片が、CAR中に組み込まれた抗原結合性ドメインとして使用され得る。
例示的な一実施形態では、CARの抗原結合性ドメイン部分は、CD19を標的化する。好ましくは、CAR中の抗原結合性ドメインは、抗CD19 scFVであり、ここで、抗CD19 scFVの核酸配列は、配列番号27に示される配列を含む。一実施形態では、抗CD19 scFVは、配列番号28のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、CARの抗CD19 scFV部分は、配列番号28に示されるアミノ酸配列を含む。第2の例示的な一実施形態では、CARの抗原結合性ドメインは、CD20を標的化する。好ましくは、CARにおける抗原結合性ドメインは、抗CD20ScFvであり、抗CD20ScFvの核酸配列は、配列番号1に明記する配列を含む。別の実施形態では、CARの抗CD20ScFv部分は、配列番号2に示されるアミノ酸配列を含む。第3の例示的な一実施形態では、CARの抗原結合性ドメインは、CD22を標的化する。好ましくは、CAR中の抗原結合性ドメインは、抗CD22 scFVであり、ここで、抗CD22 scFVの核酸配列は、配列番号7に示される配列を含む。別の実施形態では、CARの抗CD22 scFV部分は、配列番号8に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明の一態様では、例えば、限定としてではなく、レトロウイルス科(例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、HIV-1およびHIV-LP)、ピコルナウイルス科(例えば、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルスおよびエコーウイルス)、風疹ウイルス、コロナウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルス、インフルエンザウイルス、B型肝炎ウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科[例えば、1型および2型単純ヘルペスウイルス(HSV)、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)ならびにヘルペスウイルス]、ポックスウイルス科(例えば、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルスおよびポックスウイルス)もしくはC型肝炎ウイルスに由来する抗原、またはそれらの任意の組合せを含む非TSAまたは非TAAに結合することが可能なCARが提供される。
本発明の別の態様では、Staphylococci、Streptococcus、Escherichia coli、PseudomonasまたはSalmonellaの細菌株に由来する抗原に結合することが可能なCARが提供される。特に、感染性細菌、例えば、Helicobacter pyloris、Legionella pneumophilia、Mycobacteria sps.の細菌株(例えば、M.tuberculosis、M.avium、M.intracellulare、M.kansaiiまたはM.gordonea)、Staphylococcus aureus、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitides、Listeria monocytogenes、Streptococcus pyogenes、A群Streptococcus、B群Streptococcus(Streptococcus agalactiae)、Streptococcus pneumoniaeもしくはClostridium tetaniに由来する抗原、またはそれらの組合せに結合することが可能なCARが提供される。
2.膜貫通ドメイン
本明細書に開示される患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるDuoCARでは、CARは、CARの細胞外ドメインに融合された1つまたは複数の膜貫通ドメインを含む。
一実施形態では、コードされるリンカードメインが、CD8の細胞外ドメインに由来し、膜貫通ドメインに連結されている、単離された核酸分子が提供される。
一実施形態では、コードされるリンカードメインが、膜貫通ドメインの細胞外ドメインに由来し、膜貫通ドメインに連結されている、単離された核酸分子が提供される。
一部の場合には、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するために、かかるドメインの、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を回避するために、選択され得るまたはアミノ酸置換により得る。
膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合型または膜貫通タンパク質に由来し得る。本発明において特に使用される膜貫通領域は、T細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD271、TNFRSF19、FcイプシロンR、またはそれらの任意の組合せに由来し得る(即ち、それらの膜貫通領域(複数可)を少なくとも含み得る)。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であり得、その場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を優勢に含む。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端において見出される。任意選択で、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、好ましくは2アミノ酸長と10アミノ酸長との間が、CARの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間での連結を形成し得る。グリシン-セリンダブレットまたはトリプルアラニンモチーフは、特に適切なリンカーを提供する。
一実施形態では、本発明のCAR中の膜貫通ドメインは、CD8膜貫通ドメインである。一実施形態では、CD8膜貫通ドメインは、配列番号11の核酸配列を含む。一実施形態では、CD8膜貫通ドメインは、配列番号12のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、CD8膜貫通ドメインは、配列番号12のアミノ酸配列を含む。
一部の場合には、CARの膜貫通ドメインは、CD8アルファヒンジドメインを含む。一実施形態では、CD8ヒンジドメインは、配列番号13の核酸配列を含む。一実施形態では、CD8ヒンジドメインは、配列番号14アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態において、CD8ヒンジドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含む。
任意の特定の作用機構に限定する意図はないが、本発明の本明細書に開示される患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用される例示的なDuoCARと関連する増強された治療機能の可能な理由には、例えば、限定としてではなく、a)より効率的なシグナル伝達を可能にする、原形質膜内での改善された側方の動き、b)脂質ラフトなどの原形質膜マイクロドメイン内の優れた位置、およびT細胞活性化と関連する膜貫通シグナル伝達カスケードと相互作用するより高い能力、c)抑制性もしくは下方調節性の相互作用から離れる優先的な動きによる、原形質膜内の優れた位置、例えば、CD45などのホスファターゼとあまり近接していないこと、もしくはそれとのより少ない相互作用、およびd)T細胞受容体シグナル伝達複合体(即ち、免疫シナプス)への優れたアセンブリー、またはそれらの任意の組合せが含まれると考えられる。
本明細書に開示される患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)の一実施形態では、本明細書に開示されるDuoCARにおいて使用するための非限定的な例示的な膜貫通ドメインは、TNFRSF膜貫通ドメインを駆動するために使用され得るTNFRSF16およびTNFRSF19膜貫通ドメイン、ならびに/またはキメラ抗原受容体および使用の方法というタイトルの2015年10月9日出願の出願人の同時係属している仮特許出願第62/239,509号に開示されるリンカーもしくはスペーサードメイン、ならびに特に、表Iに列挙される腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー内に列挙される他のTNFRSFメンバーを含んで、割り当てられたLentigen Technology,Inc.の物質番号LEN_015PROを含む。
3.スペーサードメイン
本明細書に開示される患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるDuoCARでは、スペーサードメインは、細胞外ドメインとTNFRSF膜貫通ドメインとの間、または細胞内ドメインとTNFRSF膜貫通ドメインとの間に配置され得る。スペーサードメインは、TNFRSF膜貫通ドメインを細胞外ドメインと連結させるように、および/またはTNFRSF膜貫通ドメインを細胞内ドメインと連結させるように機能する、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、最大で300アミノ酸、好ましくは10~100アミノ酸、最も好ましくは25~50アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、リンカーは、存在する場合には、リンカーのサイズを増加させ、その結果、エフェクター分子または検出可能なマーカーと抗体または抗原結合性断片との間の距離が増加される、スペーサーエレメントを含み得る。例示的なスペーサーは、当業者に公知であり、これには、米国特許第7,964,5667号、米国特許第498,298号、米国特許第6,884,869号、米国特許第6,323,315号、米国特許第6,239,104号、米国特許第6,034,065号、米国特許第5,780,588号、米国特許第5,665,860号、米国特許第5,663,149号、米国特許第5,635,483号、米国特許第5,599,902号、米国特許第5,554,725号、米国特許第5,530,097号、米国特許第5,521,284号、米国特許第5,504,191号、米国特許第5,410,024号、米国特許第5,138,036号、米国特許第5,076,973号、米国特許第4,986,988号、米国特許第4,978,744号、米国特許第4,879,278号、米国特許第4,816,444号および米国特許第4,486,414号、ならびに米国特許出願公開第20110212088号および米国特許出願公開第20110070248号中に列挙されるものが含まれ、その各々は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
スペーサードメインは、好ましくは、抗原とのCARの結合を促進し、細胞中へのシグナル伝達を増強する配列を有する。結合を促進すると予測されるアミノ酸の例には、システイン、荷電アミノ酸、ならびに潜在的グリコシル化部位中のセリンおよびスレオニンが含まれ、これらのアミノ酸は、スペーサードメインを構成するアミノ酸として使用され得る。
スペーサードメインとして、CD8アルファ(NCBI RefSeq:NP_001759.3)のヒンジ領域を含むアミノ酸番号137~206(配列番号15)、CD8ベータ(GenBank:AAA35664.1)のアミノ酸番号135~195、CD4(NCBI RefSeq:NP_000607.1)のアミノ酸番号315~396、またはCD28(NCBI RefSeq:NP_006130.1)のアミノ酸番号137~152の全体または一部が使用され得る。また、スペーサードメインとして、抗体H鎖またはL鎖(CH1領域またはCL領域、例えば、配列番号16に示されるアミノ酸配列を有するペプチド)の定常領域の一部が使用され得る。さらに、スペーサードメインは、人工的に合成された配列であり得る。
さらに、CARでは、シグナルペプチド配列が、N末端に連結され得る。シグナルペプチド配列は、多くの分泌タンパク質および膜タンパク質のN末端に存在し、15~30アミノ酸の長さを有する。細胞内ドメインとして上で言及されるタンパク質分子の多くは、シグナルペプチド配列を有するので、これらのシグナルペプチドがCARのためのシグナルペプチドとして使用され得る。一実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号5に示されるリーダー(シグナルペプチド)配列のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む。
4.細胞内ドメイン
CARの細胞質ドメインまたはさもなければ細胞内シグナル伝達ドメインは、CARが中に置かれた免疫細胞の正常なエフェクター機能のうち少なくとも1つの活性化を担う。用語「エフェクター機能」とは、細胞の特殊化した機能を指す。例えば、T細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊化した機能を実行するように細胞を指示する、タンパク質の部分を指す。通常は細胞内シグナル伝達ドメイン全体が使用され得るが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分が使用される限りにおいて、かかる短縮された部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用され得る。したがって、用語、細胞内シグナル伝達ドメインとは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮された部分を含むことを意味する。
CARでの使用のための細胞内シグナル伝達ドメインの好ましい例には、抗原受容体係合後にシグナル伝達を開始させるように協力して作用するT細胞受容体(TCR)および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体もしくはバリアント、および同じ機能的能力を有する任意の合成配列が含まれる。
TCR単独を通じて生成されるシグナルが、T細胞の完全な活性化には不十分であること、および二次または共刺激シグナルもまた必要とされることは公知である。したがって、T細胞活性化は、2つの別個のクラスの細胞質シグナル伝達配列によって媒介されると言われ得る:TCRを介した抗原依存的な一次活性化を開始させるもの(一次細胞質シグナル伝達配列)および二次または共刺激シグナルを提供するように抗原依存的に作用するもの(二次細胞質シグナル伝達配列)。
一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激性の方法または阻害性の方法のいずれかで、TCR複合体の一次活性化を調節する。刺激性の様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはITAMとして公知のシグナル伝達モチーフを含有し得る。
本明細書に開示されるCARにおいて特に使用される一次細胞質シグナル伝達配列を含有するITAMの例には、TCRゼータ(CD3ゼータ)、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79bおよびCD66dに由来するものが含まれる。ITAMの具体的な非限定的な例には、CD3ゼータ(NCBI RefSeq:NP_932170.1)のアミノ酸番号51~164、FcイプシロンRIガンマ(NCBI RefSeq:NP_004097.1)のアミノ酸番号45~86、FcイプシロンRIベータ(NCBI RefSeq:NP_000130.1)のアミノ酸番号201~244、CD3ガンマ(NCBI RefSeq:NP_000064.1)のアミノ酸番号139~182、CD3デルタ(NCBI RefSeq:NP_000723.1)のアミノ酸番号128~171、CD3イプシロン(NCBI RefSeq:NP_000724.1)のアミノ酸番号153~207、CD5(NCBI RefSeq:NP_055022.2)のアミノ酸番号402~495、0022(NCBI RefSeq:NP_001762.2)のアミノ酸番号707~847、CD79a(NCBI RefSeq:NP_001774.1)のアミノ酸番号166~226、CD79b(NCBI RefSeq:NP_000617.1)のアミノ酸番号182~229、およびCD66d(NCBI RefSeq:NP_001806.2)のアミノ酸番号177~252の配列を有するペプチド、ならびにこれらのペプチドが有するのと同じ機能を有するそれらのバリアントが含まれる。本明細書に記載されるNCBI RefSeq IDまたはGenBankのアミノ酸配列情報に基づくアミノ酸番号は、各タンパク質の前駆体(シグナルペプチド配列などを含む)の全長に基づいて番号付けされる。一実施形態では、CAR中の細胞質シグナル伝達分子は、CD3ゼータに由来する細胞質シグナル伝達配列を含む。別の実施形態では、CD3ゼータ中のITAMモチーフのうち1、2、または3つは、突然変異、または別のアミノ酸によるチロシン残基の置換によって弱毒化される。
好ましい実施形態では、CARの細胞内ドメインは、それ自体で、またはCARの状況で有用な任意の他の所望の細胞質ドメイン(複数可)と組み合わせて、CD3-ゼータシグナル伝達ドメインを含むように設計され得る。例えば、CARの細胞内ドメインは、CD3ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含み得る。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むCARの一部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答のために必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。かかる共刺激分子の例には、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、およびCD83と特異的に結合するリガンドなどが含まれる。かかる共刺激分子の具体的な非限定的な例には、CD2(NCBI RefSeq:NP_001758.2)のアミノ酸番号236~351、CD4(NCBI RefSeq:NP_000607.1)のアミノ酸番号421~458、CD5(NCBI RefSeq:NP_055022.2)のアミノ酸番号402~495、CD8アルファ(NCBI RefSeq:NP_001759.3)のアミノ酸番号207~235、CD83(GenBank:AAA35664.1)のアミノ酸番号196~210、CD28(NCBI RefSeq:NP_006130.1)のアミノ酸番号181~220、CD137(4-1BB、NCBI RefSeq:NP_001552.2)のアミノ酸番号214~255、CD134(OX40、NCBI RefSeq:NP_003318.1)のアミノ酸番号241~277およびICOS(NCBI RefSeq:NP_036224.1)のアミノ酸番号166~199の配列を有するペプチド、ならびにこれらのペプチドが有するのと同じ機能を有するそれらのバリアントが含まれる。したがって、本明細書の開示は、4-1BBを共刺激シグナル伝達エレメントとして主に例示するが、他の共刺激エレメントが本開示の範囲内である。
CARの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムにまたは特定された順序で、互いに連結され得る。任意選択で、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、好ましくは2アミノ酸長と10アミノ酸長との間が、連結を形成し得る。グリシン-セリンダブレットは、特に適切なリンカーを提供する。
一実施形態では、細胞内ドメインは、CD3-ゼータのシグナル伝達ドメインおよびCD28のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。別の実施形態では、細胞内ドメインは、CD3-ゼータのシグナル伝達ドメインおよび4-1BBのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。さらに別の実施形態では、細胞内ドメインは、CD3-ゼータのシグナル伝達ドメイン、ならびにCD28および4-1BBのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。
一実施形態では、CAR中の細胞内ドメインは、4-1BBのシグナル伝達ドメインおよびCD3-ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで、4-1BBのシグナル伝達ドメインは、配列番号17に示される核酸配列を含み、CD3-ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号19に示される核酸配列を含む。
一実施形態では、CAR中の細胞内ドメインは、4-1BBのシグナル伝達ドメインおよびCD3-ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで、4-1BBのシグナル伝達ドメインは、配列番号18のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、CD3-ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号20のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
一実施形態では、CAR中の細胞内ドメインは、4-1BBのシグナル伝達ドメインおよびCD3-ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで、4-1BBのシグナル伝達ドメインは、配列番号18に示されるアミノ酸配列を含み、CD3-ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号20に示されるアミノ酸配列を含む。
5.DuoCARのさらなる記載
本明細書に開示される患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるDuoCARの機能的部分もまた、本発明の範囲内に明示的に含まれる。用語「機能的部分」とは、CARに関して使用する場合、本明細書に開示されるDuoCARの1または複数の任意の一部または断片を指し、この一部または断片は、それがその一部であるCAR(親CAR)の生物学的活性を保持する。機能的部分は、例えば、親CARと類似の程度、同じ程度、またはより高い程度まで、標的細胞を認識する能力、または疾患を検出、処置もしくは予防する能力を保持する、CRAの一部を包含する。親CARに関して、機能的部分は、例えば、親CARの約10%、25%、30%、50%、68%、80%、90%、95%またはそれ超を構成し得る。
機能的部分は、その部分のアミノ末端もしくはカルボキシ末端において、または両方の末端において、さらなるアミノ酸を含み得、このさらなるアミノ酸は、親CARのアミノ酸配列中には見出されない。望ましくは、さらなるアミノ酸は、例えば、標的細胞を認識し、がんを検出し、がんを処置または予防するなどの、機能的部分の生物学的機能を妨害しない。より望ましくは、さらなるアミノ酸は、親CARの生物学的活性と比較して、その生物学的活性を増強する。
本明細書に開示されるDuoCARの機能的バリアントが、本開示の範囲内に含まれる。用語「機能的バリアント」とは、本明細書で使用する場合、親CARに対する実質的なまたは著しい配列同一性または類似性を有するCAR、ポリペプチドまたはタンパク質を指し、この機能的バリアントは、それがそのバリアントであるCARの生物学的活性を保持する。機能的バリアントは、例えば、親CARと類似の程度、同じ程度、またはより高い程度まで、標的細胞を認識する能力を保持する、本明細書に記載されるCAR(親CAR)のバリアントを包含する。親CARに関して、機能的バリアントは、例えば、親CARに対して、少なくとも約30%、50%、75%、80%、90%、98%またはそれ超、アミノ酸配列が同一であり得る。
機能的バリアントは、例えば、少なくとも1つの保存的アミノ酸置換を有する親CARのアミノ酸配列を含み得る。あるいは、またはさらに、機能的バリアントは、少なくとも1つの非保存的アミノ酸置換を有する親CARのアミノ酸配列を含み得る。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性を妨害も阻害もしないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性を増強し得、その結果、機能的バリアントの生物学的活性は、親CARと比較して増加される。
DuoCARのアミノ酸置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換は、当該分野で公知であり、これには、ある特定の物理的および/または化学的特性を有する1つのアミノ酸が、同じまたは類似の化学的または物理的特性を有する別のアミノ酸に交換されるアミノ酸置換が含まれる。例えば、保存的アミノ酸置換は、酸性/負に荷電した別の極性アミノ酸(例えば、AspまたはGlu)を置換する酸性/負に荷電した極性アミノ酸、非極性側鎖を有する別のアミノ酸(例えば、Ala、Gly、Val、He、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Cys、Valなど)を置換する非極性側鎖を有するアミノ酸、塩基性/正に荷電した別の極性アミノ酸(例えば、Lys、His、Argなど)を置換する塩基性/正に荷電した極性アミノ酸、極性側鎖を有する別の非荷電アミノ酸(例えば、Asn、Gin、Ser、Thr、Tyrなど)を置換する極性側鎖を有する非荷電アミノ酸、ベータ分岐側鎖を有する別のアミノ酸(例えば、He、ThrおよびVal)を置換するベータ分岐側鎖を有するアミノ酸、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸(例えば、His、Phe、TrpおよびTyr)を置換する芳香族側鎖を有するアミノ酸などであり得る。
CARは、本明細書に記載される特定されたアミノ酸配列(単数または複数)から本質的になり得、その結果、他の構成要素、例えば、他のアミノ酸は、機能的バリアントの生物学的活性を著しくは変化させない。
DuoCAR(機能的部分および機能的バリアントを含む)は、任意の長さであり得る、即ち、任意の数のアミノ酸を含み、但し、DuoCAR(またはその機能的部分もしくは機能的バリアント)は、それらの生物学的活性、例えば、抗原に特異的に結合する能力、哺乳動物において罹患細胞を検出する能力、または哺乳動物において疾患を処置もしくは予防する能力などを保持する。例えば、CARは、約50~約5000アミノ酸長、例えば、50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000またはそれ超アミノ酸長であり得る。
DuoCAR(本発明の機能的部分および機能的バリアントを含む)は、1または複数の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含み得る。かかる合成アミノ酸は、当該分野で公知であり、これには、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、-アミノ n-デカン酸、ホモセリン、S-アセチルアミノメチル-システイン、トランス-3-ヒドロキシプロリンおよびトランス-4-ヒドロキシプロリン、4-アミノフェニルアラニン、4-ニトロフェニルアラニン、4-クロロフェニルアラニン、4-カルボキシフェニルアラニン、β-フェニルセリン、β-ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、a-ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン-2-カルボン酸、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、N’-ベンジル-N’-メチル-リシン、Ν’,Ν’-ジベンジル-リシン、6-ヒドロキシリシン、オルニチン、-アミノシクロペンタンカルボン酸、a-アミノシクロヘキサンカルボン酸、a-アミノシクロヘプタンカルボン酸、a-(2-アミノ-2-ノルボルナン)-カルボン酸、γ-ジアミノ酪酸、β-ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニンおよびa-tert-ブチルグリシンが含まれる。
DuoCAR(機能的部分および機能的バリアントを含む)は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、N-アシル化、例えばジスルフィド架橋を介した環化、もしくは酸付加塩へ変換および/または任意選択で二量体化もしくは重合、あるいはコンジュゲートされ得る。
DuoCAR(その機能的部分および機能的バリアントを含む)は、当該分野で公知の方法によって得られ得る。DuoCARは、ポリペプチドまたはタンパク質を作製する任意の適切な方法によって作製され得る。ポリペプチドおよびタンパク質をデノボ合成する適切な方法は、Chanら、Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis、Oxford University Press、Oxford、United Kingdom、2000年;Peptide and Protein Drug Analysis、Reid,R.編、Marcel Dekker,Inc.、2000年;Epitope Mapping、Westwoodら編、Oxford University Press、Oxford、United Kingdom、2001年;および米国特許第5,449,752号などの参考文献に記載されている。キメラ抗原受容体を作製する方法、そのような受容体を含むT細胞、およびかかる使用(例えば、がんの処置のため)は、当該分野で公知であり、本明細書にさらに記載される(例えば、その各々が、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、Brentjensら、2010年、Molecular Therapy、18巻:4号、666~668頁;Morganら、2010年、Molecular Therapy、2010年2月23日にオンラインで公開、1~9頁;Tillら、2008年、Blood、1巻12号:2261~2271頁;Parkら、Trends Biotechnol.、29巻:550~557頁、2011年;Gruppら、N Engl J Med.、368巻:1509~1518頁、2013年;Hanら、J.Hematol Oncol.、6巻:47頁、2013年;Tumainiら、Cytotherapy、15巻、1406~1417頁、2013年;Hasoら、(2013年) Blood、121巻、1165~1174号;PCT公開の国際公開第2012/079000号、国際公開第2013/12672号;および米国特許出願公開第2012/0213783号を参照されたい)。例えば、開示されるキメラ抗原結合受容体をコードする核酸分子は、開示されるCARを作るために、T細胞などの宿主細胞を形質導入するために使用される発現ベクター(レンチウイルスベクターなど)に含まれ得る。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体を使用する方法は、対象からT細胞を単離するステップ、キメラ抗原受容体をコードする発現ベクター(レンチウイルスベクターなど)によりT細胞を形質導入するステップ、および処置のために、例えば、対象中の腫瘍の処置のために、CAR発現T細胞を対象に投与するステップを含む。
B.抗体および抗原結合性断片
一実施形態は、本明細書に開示される患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるCAR、CARを発現するT細胞、本明細書で開示された抗原のうち1または複数に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性ドメインもしくは部分をさらに提供する。本明細書で使用する場合、「CARを発現するT細胞」または「CAR T細胞」とは、CARを発現するT細胞を意味し、例えば、CARの抗体由来の標的化ドメインによって決定される抗原特異性を有する。
本明細書で使用する場合、「抗原結合性ドメイン」は、抗体およびその抗原結合性断片を含み得る。用語「抗体」は、最も広い意味で本明細書において使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体(例えば、二重特異的抗体)、およびそれらの抗原結合性断片を含むがこれらに限定されない種々の抗体構造を包含する。抗体の非限定的な例には、例えば、当該分野で公知のインタクトな免疫グロブリン、ならびに抗原に対する結合親和性を保持するそのバリアントおよび断片が含まれる。
「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体である、即ち、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る可能な天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性エピトープに対するものである。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるという抗体の特徴を示すのであって、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈すべきではない。一部の例では、モノクローナル抗体は、単一クローンのBリンパ球によって産生された抗体、または単一の抗体(またはその抗原結合性断片)の抗体の軽鎖および重鎖可変領域をコードする核酸がトランスフェクトされた細胞、もしくはその子孫によって産生された抗体である。一部の例では、モノクローナル抗体は、対象から単離される。モノクローナル抗体は、抗原結合または他の免疫グロブリン機能に対する影響を実質的に有さない保存的アミノ酸置換を有し得る。モノクローナル抗体の産生の例示的な方法は公知であり、例えば、Harlow & Lane、Antibodies,A Laboratory Manual、第2版 Cold Spring Harbor Publications、New York(2013年)を参照のこと。
典型的には、免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続された重(H)鎖および軽(L)鎖を有する。免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子を含む。2つの型の軽鎖、ラムダ(λ)およびカッパ(κ)が存在する。抗体分子の機能的活性を決定する5つの主要な重鎖クラス(またはアイソタイプ):IgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEが存在する。
各重鎖および軽鎖は、定常領域(または定常ドメイン)および可変領域(または可変ドメインを含有する;例えば、Kindtら、Kuby Immunology、第6版、W.H.Freeman and Co.、91頁(2007年)を参照のこと)。いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖の可変領域は、組み合わさって、抗原に特異的に結合する。さらなる実施形態では、重鎖可変領域のみが必要とされる。例えば、重鎖のみからなる天然に存在するラクダ科動物(camelid)抗体は、軽鎖の非存在下で機能的かつ安定である(例えば、Hamers-Castermanら、Nature、363巻:446~448頁、1993年;Sheriffら、Nat.Struct.Biol.、3巻:733~736頁、1996年を参照のこと)。「VH」または「VH」への言及は、抗原結合性断片、例えば、Fv、scFv、dsFvまたはFabのものを含む、抗体重鎖の可変領域を指す。「VL」または「VL」への言及は、Fv、scFv、dsFvまたはFabのものを含む、抗体軽鎖の可変ドメインを指す。
軽鎖および重鎖の可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」とも呼ばれる3つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域を含有する(例えば、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、U.S.Department of Health and Human Services、1991年を参照のこと)。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。構成成分である軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、3次元空間にCDRを位置付けアラインさせるように機能する。
CDRは主に、抗原のエピトープへの結合を担う。所与のCDRのアミノ酸配列境界は、Kabatら(「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、第5版 Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD、1991年;「Kabat」番号付けスキーム)、Al-Lazikaniら、(JMB 273巻、927~948頁、1997年;「Chothia」番号付けスキーム)、およびLefrancら(「IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains」、Dev.Comp.Immunol.、27巻:55~77頁、2003年;「IMGT」番号付けスキーム)に記載されるものを含む、いくつかの周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定され得る。各鎖のCDRは、典型的には、CDR1、CDR2およびCDR3(N末端からC末端へ)と呼ばれ、典型的には、特定のCDRが位置する鎖によっても同定される。したがって、VH CDR3は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメイン由来のCDR3であるが、VL CDR1は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメイン由来のCDR1である。軽鎖CDRは、LCDR1、LCDR2およびLCDR3と呼ばれる場合もある。重鎖CDRは、LCDR1、LCDR2およびLCDR3と呼ばれる場合もある。
「抗原結合性断片」は、同族抗原を特異的に認識する能力を保持する全長抗体の部分、ならびにかかる部分の種々の組合せである。抗原結合性断片の非限定的な例には、Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2;ダイアボディ(diabody);直鎖状抗体;単鎖抗体分子(例えば、scFv);および抗体断片から形成された多特異的抗体が含まれる。抗体断片には、抗体全体の改変によって産生された抗原結合性断片、または組換えDNA方法論を使用してde novoで合成された抗原結合性断片が含まれる(例えば、KontermannおよびDubel(編)、Antibody Engineering、1~2巻、第2版、Springer Press、2010年を参照のこと)。
単鎖抗体(scFv)は、適切なポリペプチドリンカーによって連結された1または複数の抗体(複数可)のVHおよびVLドメインを遺伝学的に融合された単鎖分子として含有する遺伝子操作された分子である(例えば、Birdら、Science、242巻:423~426頁、1988年;Hustonら、Proc.Natl.Acad.Sci.、85巻:5879~5883頁、1988年;Ahmadら、Clin.Dev.Immunol.、2012年、doi:10.1155/2012/980250;Marbry、IDrugs、13巻:543~549頁、2010年を参照のこと)。scFv中のVHドメインおよびVLドメインの分子内配向は、典型的には、scFvにとって決定的ではない。したがって、両方の可能な配置(VHドメイン-リンカードメイン-VLドメイン;VLドメイン-リンカードメイン-VHドメイン)を有するscFvが使用され得る。
dsFvでは、重鎖および軽鎖の可変鎖は、鎖の会合を安定化させるために、ジスルフィド結合を導入するように変異されている。VHおよびVLドメインが、単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の2つのドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによって、そのドメインを別の鎖の相補的ドメインとペアリングさせ、2つの抗原結合部位を創出する、二価の二重特異的抗体であるダイアボディもまた含まれる(例えば、Holligerら、Proc.Natl.Acad.Sci.、90巻:6444~6448頁、1993年;Poljakら、Structure、2巻:1121~1123頁、1994年を参照のこと)。
抗体は、キメラ抗体(例えば、ヒト化マウス抗体)およびヘテロコンジュゲート抗体(例えば、二重特異的抗体)などの、遺伝子操作された形態もまた含む。Pierce Catalog and Handbook、1994~1995年(Pierce Chemical Co.、Rockford、IL);Kuby,J.、Immunology、第3版、W.H.Freeman & Co.、New York、1997年もまた参照のこと。
天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築され得、組換え産生され得、または、例えば、参照により本明細書に組み込まれるHuseら、Science 246巻:1275~1281頁(1989年)に記載されるように、可変重鎖および可変軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。例えば、キメラ、ヒト化、CDR移植、単鎖および二機能性抗体を作製するこれらおよび他の方法は、当業者に周知である(WinterおよびHarris、Immunol.Today 14巻:243~246頁(1993年);Wardら、Nature 341巻:544~546頁(1989年);HarlowおよびLane、上記、1988年;Hilyardら、Protein Engineering:A practical approach(IRL Press 1992年);Borrabeck、Antibody Engineering、第2版(Oxford University Press 1995年);その各々は、参照により本明細書に組み込まれる)。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいてその抗原への参照抗体の結合を50%またはそれ超遮断する抗体を指し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいてその抗原への抗体の結合を50%またはそれ超遮断する。抗体競合アッセイは公知であり、例示的な競合アッセイが本明細書で提供される。
「ヒト化」抗体または抗原結合性断片は、ヒトフレームワーク領域および非ヒト(例えば、マウス、ラットまたは合成)抗体または抗原結合性断片由来の1または複数のCDRを含む。CDRを提供する非ヒト抗体または抗原結合性断片は、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト抗体または抗原結合性断片は、「アクセプター」と呼ばれる。一実施形態では、全てのCDRが、ヒト化免疫グロブリン中のドナー免疫グロブリン由来である。定常領域は、存在する必要はないが、存在する場合には、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、例えば、少なくとも約85~90%、例えば、約95%またはそれ超同一であり得る。したがって、ヒト化抗体または抗原結合性断片の全ての部分は、おそらくはCDRを除いて、天然ヒト抗体配列の対応する部分と実質的に同一である。
「キメラ抗体」は、典型的には異なる種のものである2つの異なる抗体に由来する配列を含む抗体である。一部の例では、キメラ抗体は、1つのヒト抗体由来の1または複数のCDRおよび/またはフレームワーク領域ならびに別のヒト抗体由来のCDRおよび/またはフレームワーク領域を含む。
「完全ヒト抗体」または「ヒト抗体」は、ヒトゲノム由来の(またはヒトゲノムに由来する)配列を含むが、別の種由来の配列を含まない抗体である。一部の実施形態では、ヒト抗体は、ヒトゲノム由来の(またはヒトゲノムに由来する)CDR、フレームワーク領域および(存在する場合には)Fc領域を含む。ヒト抗体は、例えば、ファージディスプレイによって、ヒトゲノムに由来する配列に基づいて配列を創出するためのテクノロジーを使用して、またはトランスジェニック動物を使用して、同定および単離され得る(例えば、Barbasら Phage display:A Laboratory Manuel.第1版 New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press、2004年 Print.;Lonberg、Nat.Biotech.、23巻:1117~1125頁、2005年;Lonenberg、Curr.Opin.Immunol.、20巻:450~459頁、2008年を参照のこと)。
抗体は、1または複数の結合部位を有し得る。1よりも多い結合部位が存在する場合、これらの結合部位は、互いに同一であってもよく、異なってもよい。例えば、天然に存在する免疫グロブリンは、2つの同一の結合部位を有し、単鎖抗体またはFab断片は、1つの結合部位を有するが、二重特異的または二機能性抗体は、2つの異なる結合部位を有する。
CARの任意の機能的部分に結合する能力について抗体を試験する方法は、当該分野で公知であり、これには、任意の抗体-抗原結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)、ELISA、ウェスタンブロット、免疫沈降および競合阻害アッセイなどが含まれる(例えば、Janewayら、以下、米国特許出願公開第2002/0197266号Al、および米国特許第7,338,929号を参照のこと)。
また、CAR、CARを発現するT細胞、抗体またはその抗原結合性部分は、検出可能な標識、例えば、放射性同位体、フルオロフォア(例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、フィコエリトリン(PE))、酵素(例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ)および元素粒子(例えば、金粒子)などを含み得る。
C.コンジュゲート
本明細書に開示される患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるDuoCAR、CARを発現するT細胞、または本明細書に開示された抗原のうち1もしくは複数に対して特異的なモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片は、当業者に公知のいくつもの手段を使用して、エフェクター分子または検出可能なマーカーなどの薬剤にコンジュゲートされ得る。共有結合および非共有結合の両方の手段が使用され得る。コンジュゲートには、本明細書に開示された抗原のうち1または複数に特異的に結合する抗体または抗原結合性断片へのエフェクター分子または検出可能なマーカーの共有結合的連結が存在する分子を含むがこれらに限定されない。当業者は、化学療法剤、抗血管新生剤、毒素、放射活性剤、例えば、125I、32P、14C、Hおよび35S、ならびに他の標識、標的部分およびリガンドなどを含む(がこれらに限定されない)種々のエフェクター分子および検出可能なマーカーが使用され得ることを理解する。
特定のエフェクター分子または検出可能なマーカーの選択は、特定の標的分子または細胞、および所望の生物学的効果に依存する。したがって、例えば、エフェクター分子は、特定の標的細胞(例えば、腫瘍細胞)の死をもたらすために使用される細胞毒であり得る。
エフェクター分子または検出可能なマーカーを抗体または抗原結合性断片に結合させるための手順は、エフェクターの化学構造に従って変動する。ポリペプチドは、典型的には、種々の官能基;例えば、カルボン酸(COOH)、遊離アミン(-NH)またはスルフヒドリル(-SH)基を含有し、これらは、エフェクター分子または検出可能なマーカーの結合を生じるための、抗体上の適切な官能基との反応のために利用可能である。あるいは、抗体または抗原結合性断片は、さらなる反応性官能基を曝露または結合するために誘導体化される。誘導体化は、Pierce Chemical Company、Rockford、ILから入手可能なものなどの、いくつかの公知のリンカー分子のいずれかの結合を含み得る。リンカーは、抗体または抗原結合性断片をエフェクター分子または検出可能なマーカーに結合させるために使用される任意の分子であり得る。リンカーは、抗体または抗原結合性断片およびエフェクター分子または検出可能なマーカーの両方への共有結合を形成することが可能である。適切なリンカーは、当業者に周知であり、これには、直鎖もしくは分岐鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカーまたはペプチドリンカーが含まれるがこれらに限定されない。抗体または抗原結合性断片およびエフェクター分子または検出可能なマーカーがポリペプチドである場合、リンカーは、それらの側基を介して(例えば、システインへのジスルフィド連結を介して)構成成分アミノ酸に、または末端アミノ酸のアルファ炭素のアミノおよびカルボキシル基に結合され得る。
いくつかの実施形態では、リンカーは、存在する場合には、リンカーのサイズを増加させ、その結果、エフェクター分子または検出可能なマーカーと抗体または抗原結合性断片との間の距離が増加される、スペーサーエレメントを含み得る。例示的なスペーサーは、当業者に公知であり、これには、米国特許第7,964,566,7号、米国特許第498,298号、米国特許第6,884,869号、米国特許第6,323,315号、米国特許第6,239,104号、米国特許第6,034,065号、米国特許第5,780,588号、米国特許第5,665,860号、米国特許第5,663,149号、米国特許第5,635,483号、米国特許第5,599,902号、米国特許第5,554,725号、米国特許第5,530,097号、米国特許第5,521,284号、米国特許第5,504,191号、米国特許第5,410,024号、米国特許第5,138,036号、米国特許第5,076,973号、米国特許第4,986,988号、米国特許第4,978,744号、米国特許第4,879,278号、米国特許第4,816,444号および米国特許第4,486,414号、ならびに米国特許出願公開第20110212088号および米国特許出願公開第20110070248号中に列挙されるものが含まれ、その各々は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、リンカーは、細胞内条件下で切断可能であり、その結果、リンカーの切断は、細胞内環境中で、抗体または抗原結合性断片からエフェクター分子または検出可能なマーカーを放出させる。さらに他の実施形態では、リンカーは切断不能であり、エフェクター分子または検出可能なマーカーは、例えば、抗体分解によって放出される。一部の実施形態では、リンカーは、細胞内環境中(例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ(caveolea)内)に存在する切断剤によって切断可能である。リンカーは、例えば、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含むがこれらに限定されない細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチドリンカーであり得る。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも2アミノ酸長または少なくとも3アミノ酸長である。しかし、リンカーは、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15アミノ酸長、例えば、1~2、1~3、2~5、3~10、3~15、1~5、1~10、1~15アミノ酸長であり得る。プロテアーゼには、カテプシンBおよびDならびにプラスミンが含まれ得、その全ては、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して、標的細胞の内側での活性薬物の放出を生じることが公知である(例えば、DubowchikおよびWalker、1999年、Pharm.Therapeutics 83巻:67~123頁を参照のこと)。例えば、チオール依存的プロテアーゼであるカテプシンBによって切断可能なペプチドリンカーが使用され得る(例えば、フェニルアラニン-ロイシンまたはグリシン-フェニルアラニン-ロイシン-グリシンリンカー)。かかるリンカーの他の例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,214,345号に記載されている。具体的な実施形態では、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーは、バリン-シトルリン(Citruline)リンカーまたはフェニルアラニン-リシンリンカーである(例えば、バリン-シトルリンリンカーを用いたドキソルビシンの合成を記載する米国特許第6,214,345号を参照のこと)。
他の実施形態では、切断可能なリンカーは、pH感受性、即ち、ある特定のpH値において加水分解に対して感受性である。典型的には、pH感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解可能である。例えば、リソソームにおいて加水分解可能な酸不安定性リンカー(例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス-アコニットアミド(cis-aconitic amide)、オルトエステル、アセタール、ケタールなど)が使用され得る(例えば、米国特許第5,122,368号;米国特許第5,824,805号;米国特許第5,622,929号;DubowchikおよびWalker、1999年、Pharm.Therapeutics 83巻:67~123頁;Nevilleら、1989年、Biol.Chem.264巻:14653~14661頁を参照のこと)。かかるリンカーは、血液中などの中性のpH条件下で比較的安定であるが、リソソームのおよそのpHであるpH5.5または5.0を下回るpHでは不安定である。ある特定の実施形態では、加水分解可能なリンカーは、チオエーテルリンカー(例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療剤に結合されたチオエーテルなど)である(例えば、米国特許第5,622,929号を参照のこと)。
他の実施形態では、リンカーは、還元条件下で切断可能である(例えば、ジスルフィドリンカー)。種々のジスルフィドリンカーが当該分野で公知であり、これには、例えば、SATA(N-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテート)、SPDP(N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート)、SPDB(N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)ブチレート)およびSMPT(N-スクシンイミジル-オキシカルボニル-アルファ-メチル-アルファ-(2-ピリジル-ジチオ)トルエン)-、SPDBおよびSMPTを使用して形成され得るものが含まれる(例えば、Thorpeら、1987年、Cancer Res.47巻:5924~5931頁;Wawrzynczakら、Immunoconjugates:Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer(C.W.Vogel編、Oxford U.Press、1987年);Phillipsら、Cancer Res.68巻:9280~9290頁、2008年を参照のこと)。米国特許第4,880,935号もまた参照のこと。
さらに他の具体的な実施形態では、リンカーは、マロネートリンカー(Johnsonら、1995年、Anticancer Res.15巻:1387~93頁)、マレイミドベンゾイルリンカー(Lauら、1995年、Bioorg-Med-Chem.3巻(10号):1299~1304頁)または3’-N-アミドアナログ(Lauら、1995年、Bioorg-Med-Chem.3巻(10号):1305~12頁)である。
さらに他の実施形態では、リンカーは切断不能であり、エフェクター分子または検出可能なマーカーは、抗体分解によって放出される(その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2005/0238649号を参照のこと)。
いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞外環境中での切断に対して抵抗性である。例えば、コンジュゲートが細胞外環境中(例えば、血漿中)に存在する場合、コンジュゲートのサンプル中のリンカーの約20%以下、約15%以下、約10%以下、約5%以下、約3%以下、または約1%以下が切断される。リンカーが細胞外環境中での切断に対して抵抗性であるか否かは、例えば、目的のリンカーを含有するコンジュゲートを、所定の期間(例えば、2、4、8、16または24時間)にわたって血漿と共にインキュベートし、次いで、血漿中に存在する遊離のエフェクター分子または検出可能なマーカーの量を定量することによって決定され得る。コンジュゲート中で使用され得る種々の例示的なリンカーは、WO2004/010957、米国特許出願公開第2006/0074008号、米国特許出願公開第2005/0238649号および米国特許出願公開第2006/0024317号に記載されており、その各々は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、CARのコンジュゲート、CARを発現するT細胞、抗体、またはその抗原結合性部分、および1または複数の小分子毒素、例えば、カリチアマイシン、マイタンシノイド(maytansinoid)、ドラスタチン、アウリスタチン(auristatin)、トリコテシンおよびCC1065ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体が提供される。
マイタンシノイド毒素部分としての使用に適切なマイタンシン(maytansine)化合物は、当該分野で周知であり、公知の方法に従って天然供給源から単離され得、遺伝子操作技術(Yuら(2002年)PNAS 99巻:7968~7973頁を参照のこと)、または公知の方法に従って合成により調製されたマイタンシノール(maytansinol)およびマイタンシノールアナログを使用して産生され得る。マイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂(mitototic)阻害剤である。マイタンシンは、東アフリカの低木Maytenus serrataから最初に単離された(米国特許第3,896,111号)。引き続いて、ある特定の微生物もまた、マイタンシノールおよびC-3マイタンシノールエステルなどのマイタンシノイドを産生することが発見された(米国特許第4,151,042号)。合成マイタンシノールならびにその誘導体およびアナログは、例えば、米国特許第4,137,230号;米国特許第4,248,870号;米国特許第4,256,746号;米国特許第4,260,608号;米国特許第4,265,814号;米国特許第4,294,757号;米国特許第4,307,016号;米国特許第4,308,268号;米国特許第4,308,269号;米国特許第4,309,428号;米国特許第4,313,946号;米国特許第4,315,929号;米国特許第4,317,821号;米国特許第4,322,348号;米国特許第4,331,598号;米国特許第4,361,650号;米国特許第4,364,866号;米国特許第4,424,219号;米国特許第4,450,254号;米国特許第4,362,663号;および米国特許第4,371,533号に開示されており,その各々は、参照により本明細書に組み込まれる。マイタンシノイドを含有するコンジュゲート、それを作製する方法、およびそれらの治療的使用は、例えば、米国特許第5,208,020号;米国特許第5,416,064号;米国特許第6,441,163号および欧州特許EP0 425 235 B1に開示されており、それらの開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
さらなる毒素が、CAR、CARを発現するT細胞、抗体、またはその抗原結合性部分と共に使用され得る。例示的な毒素には、Pseudomonas外毒素(PE)、ヒマ毒、アブリン、ジフテリア毒素およびそのサブユニット、リボトキシン(ribotoxin)、リボヌクレアーゼ、サポリンおよびカリチアマイシン、ならびにボツリヌス毒素A~Fが含まれる。これらの毒素は、当該分野で周知であり、多くは、商業的供給源(例えば、Sigma Chemical Company、St.Louis、MO)から容易に入手可能である。企図される毒素には、これらの毒素のバリアントも含まれる(例えば、米国特許第5,079,163号および米国特許第4,689,401号を参照のこと)。
サポリンは、リボソーム複合体の60S部分を不活性化することによってタンパク質合成を破壊する、Saponaria officinalisに由来する毒素である(Stirpeら、Bio/Technology、10巻:405~412頁、1992年)。しかし、この毒素は、細胞中への特異的進入のための機構を有さず、したがって、細胞によって効率的に取り込まれるために、内在化される細胞表面タンパク質を認識する抗体または抗原結合性断片へのコンジュゲートを必要とする。
ジフテリア毒素は、Corynebacterium diphtheriaeから単離される。典型的には、免疫毒素における使用のためのジフテリア毒素は、非特異的毒性を低減または排除するために変異される。完全な酵素活性を有するが非特異的毒性が顕著に低減された、CRM107として公知の変異体は、1970年代以降公知であり(LairdおよびGroman、J.Virol.19巻:220頁、1976年)、ヒト臨床試験において使用されてきた。米国特許第5,792,458号および米国特許第5,208,021号を参照のこと。
ヒマ毒は、Ricinus communis(トウゴマ)由来のレクチンRCA60である。ヒマ毒の例については、米国特許第5,079,163号および米国特許第4,689,401号を参照のこと。Ricinus communisアグルチニン(RCA)は、それぞれ、およそ65kDおよび120kDの分子量に従って、RCA60およびRCA120と称される2つの形態で存在する(NicholsonおよびBlaustein、J.Biochim.Biophys.Acta 266巻:543頁、1972年)。A鎖は、タンパク質合成の不活性化および細胞の死滅を担う。B鎖は、ヒマ毒を細胞表面ガラクトース残基に結合させ、細胞質ゾル中へのA鎖の輸送を促進する(Olsnesら、Nature 249巻:627~631頁、1974年および米国特許第3,060,165号)。
リボヌクレアーゼもまた、免疫毒素としての使用のために標的化分子にコンジュゲートされてきた(Suzukiら、Nat.Biotech.17巻:265~70頁、1999年を参照のこと)。例示的なリボトキシン、例えば、α-サルシン(α-sarcin)およびレストリクトシン(restrictocin)は、例えば、Rathoreら、Gene 190巻:31~5頁、1997年;ならびにGoyalおよびBatra、Biochem.345巻2部:247~54頁、2000年で議論されている。カリチアマイシンは、Micromonospora echinosporaから最初に単離されたものであり、DNA中にアポトーシスをもたらす二本鎖切断を生じさせて、エンジイン抗腫瘍抗生物質ファミリーのメンバーである(例えば、Leeら、J.Antibiot.42巻:1070~87頁、1989年を参照のこと)。この薬物は、臨床試験中の免疫毒素の毒性部分である(例えば、Gillespieら、Ann.Oncol.11巻:735~41頁、2000年を参照のこと)。
アブリンは、Abrus precatorius由来の毒性レクチンを含む。毒性素であるアブリンa、b、cおよびdは、約63kDおよび67kDの分子量を有し、2つのジスルフィド連結されたポリペプチド鎖AおよびBから構成される。A鎖はタンパク質合成を阻害する;B鎖(アブリン-b)は、D-ガラクトース残基に結合する(Funatsuら、Agr.Biol.Chem.52巻:1095頁、1988年;およびOlsnes、Methods Enzymol.50巻:330~335頁、1978年を参照のこと)。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるCAR、CARを発現するT細胞、本明細書に開示された抗原のうち1または複数に対して特異的なモノクローナル抗体、その抗原結合性断片はまた、検出可能なマーカー;例えば、ELISA、分光光度法、フローサイトメトリー、顕微鏡法または画像診断技術(例えば、コンピューター断層撮影(CT)、コンピューター体軸断層撮影(computed axial tomography)(CAT)スキャン、磁気共鳴画像法(MRI)、核磁気共鳴画像法(NMRI)、磁気共鳴断層撮影(MTR)、超音波、光ファイバー試験および腹腔鏡下試験)による検出が可能な検出可能なマーカーとコンジュゲートされ得る。検出可能なマーカーの具体的な非限定的な例には、フルオロフォア、化学発光剤、酵素的連結、放射活性同位体および重金属または化合物(例えば、MRIによる検出のための超常磁性酸化鉄ナノ結晶)が含まれる。例えば、有用な検出可能なマーカーには、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、5-ジメチルアミン-1-ナフタレンスルホニル(napthalenesulfonyl)塩化物、フィコエリトリン、ランタニドリン光体などを含む蛍光化合物が含まれる。ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)などの生物発光マーカーもまた使用される。CAR、CARを発現するT細胞、抗体またはその抗原結合性部分は、検出のために有用な酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどにもコンジュゲートされ得る。CAR、CARを発現するT細胞、抗体またはその抗原結合性部分が、検出可能な酵素とコンジュゲートされる場合、それは、識別できる反応産物を産生するために酵素が使用するさらなる試薬を添加することによって検出され得る。例えば、薬剤西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加が、視覚的に検出可能な着色反応産物をもたらす。CAR、CARを発現するT細胞、抗体またはその抗原結合性部分はまた、ビオチンとコンジュゲートされ得、アビジンまたはストレプトアビジンの結合の間接的な測定を介して検出され得る。アビジン自体が酵素または蛍光標識とコンジュゲートされ得ることに留意すべきである。
CAR、CARを発現するT細胞、抗体またはその抗原結合性部分は、ガドリニウムなどの常磁性薬剤とコンジュゲートされ得る。超常磁性酸化鉄などの常磁性薬剤もまた、標識として使用される。抗体は、ランタニド(例えば、ユーロピウムおよびジスプロシウム)およびマンガンともコンジュゲートされ得る。抗体または抗原結合性断片はまた、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ(例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体への結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)で標識され得る。
CAR、CARを発現するT細胞、抗体またはその抗原結合性部分はまた、放射標識されたアミノ酸とコンジュゲートされ得る。放射標識は、診断目的および治療目的の両方のために使用され得る。例えば、放射標識は、x線、発光スペクトルまたは他の診断技術によって本明細書に開示された抗原および抗原発現細胞のうち1または複数を検出するために使用され得る。さらに、放射標識は、対象における腫瘍の処置のため、例えば、神経芽細胞腫の処置のために、毒素として治療的に使用され得る。ポリペプチドのための標識の例には、以下の放射性同位体または放射性ヌクレオチド(radionucleotide)が含まれるがこれらに限定されない:H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I。
かかる検出可能なマーカーを検出する手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、放射標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出され得、蛍光マーカーは、発せられた照明を検出するために光検出器を使用して検出され得る。酵素標識は、典型的には、酵素に基質を提供し、基質に対する酵素の作用によって産生された反応産物を検出することによって検出され、発色標識は、着色標識を単純に可視化することによって検出される。
D.ヌクレオチド、発現、ベクターおよび宿主細胞
本明細書に記載されるDuoCAR、抗体またはその抗原結合性部分(その機能的部分および機能的バリアントを含む)のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が、本発明の一実施形態によってさらに提供される。本発明の核酸は、本明細書に記載されるリーダー配列、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび/または細胞内T細胞シグナル伝達ドメインのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
一実施形態では、N末端からC末端へ、少なくとも1つの細胞外抗原結合性ドメイン、少なくとも1つの膜貫通ドメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体(CuoCAR)をコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるCARの一実施形態では、コードされる細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する抗体の少なくとも1つの単鎖可変断片を含む、CARをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるCARの別の実施形態では、コードされる細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する抗体の少なくとも1つの重鎖可変領域を含む、CARをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるCARのさらに別の実施形態では、コードされるCAR細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する少なくとも1つのリポカリン系の抗原結合性抗原(antigen binding antigen)(アンチカリン)を含む、CARをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるCARの一実施形態では、コードされる細胞外抗原結合性ドメインが、リンカードメインによって膜貫通ドメインに接続されている、単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるDuoCARの別の実施形態では、コードされる細胞外抗原結合性ドメインに、リーダーまたはシグナルペプチドをコードする配列が先行する、CARをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるDuoCARのさらに別の実施形態では、コードされる細胞外抗原結合性ドメインが、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソセリン、CD33/IL3Ra、CD38、CD123(IL3RA)、CD138、BCMA(CD269)、GPC2、GPC3、FGFR4、c-Met、PSMA、糖脂質F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR、またはそれらの任意の組合せを含むがこれに限定されない抗原を標的化する、CARをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるDuoCARのある特定の実施形態では、コードされる細胞外抗原結合性ドメインが、抗CD19 scFV抗原結合性ドメイン、抗CD20 scFV抗原結合性ドメイン、抗CD22 scFV抗原結合性ドメイン、抗ROR1 scFV抗原結合性ドメイン、抗TSLPR scFV抗原結合性ドメイン、抗メソセリンscFV抗原結合性ドメイン、抗CD33/IL3Ra scFV抗原結合性ドメイン、抗CD38 scFV抗原結合性ドメイン、抗CD123(IL3RA) scFV抗原結合性ドメイン、抗CD138 scFV抗原結合性ドメイン、抗BCMA(CD269) scFV抗原結合性ドメイン、抗GPC2 scFV抗原結合性ドメイン、抗GPC3 scFV抗原結合性ドメイン、抗FGFR4 scFV抗原結合性ドメイン、抗c-Met scFV抗原結合性ドメイン、抗PMSA scFV抗原結合性ドメイン、抗糖脂質F77 scFV抗原結合性ドメイン、抗EGFRvIII scFV抗原結合性ドメイン、抗GD-2 scFV抗原結合性ドメイン、抗NY-ESo-1 TCR scFV抗原結合性ドメイン、抗MAGE A3 TCR scFV抗原結合性ドメイン、または85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するそのアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の組合せを含む、CARをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるDuoCARの一態様では、本明細書に提供されるDuoCARは、リンカードメインをさらに含む。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるDuoCARの一実施形態では、細胞外抗原結合性ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその両方が、リンカードメインによって膜貫通ドメインに接続されている、CARをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるDuoCARの一実施形態では、コードされるリンカードメインが、CD8の細胞外ドメインに由来し、膜貫通ドメインに連結されている、CARをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるDuoCARのさらに別の実施形態では、膜貫通ドメインをコードする核酸配列が、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するそのヌクレオチド配列を含む、CARをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるDuoCARの一実施形態では、コードされる膜貫通ドメインが、10以下であるが少なくとも1つの改変、または85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するその配列を含むアミノ酸配列を含む、CARをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるDuoCARの別の実施形態では、コードされるCARが、T細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、およびCD154、またはそれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインをさらに含む、CARをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるDuoCARのさらに別の実施形態では、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3ゼータ細胞内ドメインをさらに含む、CARをコードする単離された核酸分子が提供される。
本明細書に開示されるCARの一実施形態では、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3ゼータ細胞内ドメインに対してC末端側に配置される、CARをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるDuoCARの別の実施形態では、コードされる少なくとも1つの細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、またはそれらの組合せを含む、CARをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるDuoCARのさらなる実施形態では、コードされる少なくとも1つの共刺激ドメインが、OX40、CD70、CD27、CD28、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、DAP10、DAP12および4-1BB(CD137)の機能的シグナル伝達ドメイン、またはそれらの組合せを含む、CARをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるDuoCARの一実施形態では、リーダー配列またはシグナルペプチド配列をさらに含む、CARをコードする単離された核酸分子が提供される。
一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン改変され得る。特定の理論に束縛されないが、ヌクレオチド配列のコドン最適化は、mRNA転写物の翻訳効率を増加させると考えられる。ヌクレオチド配列のコドン最適化は、ネイティブコドンを、同じアミノ酸をコードするが、細胞内でより容易に利用可能なtRNAによって翻訳され得る別のコドンに置換し、そうして翻訳効率を増加させることを含み得る。ヌクレオチド配列の最適化はまた、翻訳を妨害する二次mRNA構造を低減させ得、そうして翻訳効率を増加させる。
本発明の実施形態では、核酸は、本発明のCARの抗原結合性ドメインをコードするコドン改変されたヌクレオチド配列を含み得る。本発明の別の実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるDuoCAR(その機能的部分および機能的バリアントを含む)のいずれかをコードするコドン改変されたヌクレオチド配列を含み得る。
「核酸」は、本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸分子」を含み、一般に、一本鎖または二本鎖の、合成のまたは天然供給源から得られた(例えば、単離および/または精製された)ものであり得、天然、非天然または変更されたヌクレオチドを含有し得、未改変のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見出されるホスホジエステルの代わりに、天然、非天然または変更されたヌクレオチド間連結、例えば、ホスホロアミデート(phosphoroamidate)連結またはホスホロチオエート連結を含有し得る、DNAまたはRNAのポリマーを意味する。一部の実施形態では、核酸は、いずれの挿入、欠失、逆位および/または置換も含まない。しかし、一部の場合には、本明細書で議論されるように、核酸は、1または複数の挿入、欠失、逆位および/または置換を含むことが適切であり得る。
組換え核酸は、天然に存在しない配列を有するもの、または配列の2つのさもなければ分離されたセグメントの人工的な組合せによって作製される配列を有するものであり得る。この人工的な組合せは、化学的合成によって、またはより一般的には、例えばSambrookら、上記に記載されるものなどの遺伝子操作技術による、核酸の単離されたセグメントの人工的操作によって達成される場合が多い。核酸は、当該分野で公知の手順を使用する化学的合成および/または酵素的ライゲーション反応に基づいて構築され得る。例えば、Sambrookら、上記およびAusubelら、上記を参照のこと。例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加させるように、もしくはハイブリダイゼーションの際に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された種々に改変されたヌクレオチド(例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチド)を使用して化学合成され得る。核酸を生成するために使用され得る改変型ヌクレオチドの例には、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-D-ガラクトシルキューオシン(galactosylqueosine)、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-置換されたアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルキューオシン(mannosylqueosine)、5’-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ウブトキソシン(wybutoxosine)、シュードウラシル、キューオシン(queosine)、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシルおよび2,6-ジアミノプリンが含まれるがこれらに限定されない。あるいは、本発明の核酸のうち1または複数は、Integrated DNA Technologies(Coralville、IA、USA)などの会社から購入できる。
核酸は、DuoCARまたはその機能的部分もしくは機能的バリアントのいずれかをコードする任意の単離または精製されたヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、ヌクレオチド配列は、配列のいずれかと縮重するヌクレオチド配列、または縮重配列の組合せを含み得る。
一実施形態は、本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列、または本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離または精製された核酸もまた提供する。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズし得る。「高いストリンジェンシーの条件」とは、ヌクレオチド配列が、非特異的ハイブリダイゼーションよりも検出可能に強い量で、標的配列(本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列)に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高いストリンジェンシーの条件には、ヌクレオチド配列と一致したいくつかの小領域(例えば、3~10塩基)を偶然に有するランダム配列から、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、またはいくつかの散在するミスマッチしか含有しないポリヌクレオチドを識別する条件が含まれる。相補性のかかる小領域は、14~17またはそれ超塩基の全長相補体よりも容易に融解され、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、それらを容易に識別可能にする。比較的高いストリンジェンシーの条件には、例えば、約0.02~0.1MのNaClまたは等価物によって、約50~70℃の温度で提供されるような、低塩および/または高温条件が含まれる。かかる高いストリンジェンシーの条件は、存在するとしても、ヌクレオチド配列と鋳型または標的鎖との間のミスマッチをほとんど忍容せず、本発明のDuoCARのいずれかの発現を検出するのに特に適切である。一般に、条件は、漸増量のホルムアミドの添加によって、よりストリンジェントにされ得ることが理解される。
本明細書に記載される核酸のいずれかに対して、少なくとも約70%またはそれ超、例えば、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%同一であるヌクレオチド配列を含む核酸もまた提供される。
一実施形態では、核酸は、組換え発現ベクター中に取り込まれ得る。これに関して、一実施形態は、核酸のいずれかを含む組換え発現ベクターを提供する。本明細書の目的のために、用語「組換え発現ベクター」とは、コンストラクトが、mRNA、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む場合、およびベクターが、mRNA、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが細胞内で発現されるのに十分な条件下で細胞と接触させられる場合に、宿主細胞によるmRNA、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの発現を可能にする、遺伝子改変されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドコンストラクトを意味する。ベクターは、全体としては天然に存在しない。
しかし、ベクターの一部は、天然に存在し得る。組換え発現ベクターは、一本鎖または二本鎖の、合成または一部天然供給源から得られたものであり得、天然、非天然または変更されたヌクレオチドを含有し得る、DNAおよびRNAを含むがこれらに限定されない任意の型のヌクレオチドを含み得る。組換え発現ベクターは、天然に存在するもしくは天然に存在しないヌクレオチド間連結、またはその両方の型の連結を含み得る。好ましくは、天然に存在しないまたは変更されたヌクレオチドまたはヌクレオチド間連結は、ベクターの転写も複製も邪魔しない。
一実施形態では、組換え発現ベクターは、任意の適切な組換え発現ベクターであり得、任意の適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするために使用され得る。適切なベクターには、プラスミドおよびウイルスなどの、繁殖および増殖のためもしくは発現のため、またはその両方のために設計されたものが含まれる。ベクターは、pUCシリーズ(Fermentas Life Sciences、Glen Burnie、MD)、pBluescriptシリーズ(Stratagene、LaJolla、CA)、pETシリーズ(Novagen、Madison、WI)、pGEXシリーズ(Pharmacia Biotech、Uppsala、Sweden)およびpEXシリーズ(Clontech、Palo Alto、CA)からなる群から選択され得る。
バクテリオファージベクター、例えば、λυΤΙ Ο、λυΤΙ 1、λZapII(Stratagene)、EMBL4およびλΝΜΙ 149もまた使用され得る。植物発現ベクターの例には、pBIOl、pBI101.2、pBHOl.3、pBI121およびpBIN19(Clontech)が含まれる。動物発現ベクターの例には、pEUK-Cl、pMAMおよびpMAMneo(Clontech)が含まれる。組換え発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。レンチウイルスベクターは、特に、Miloneら、Mol.Ther.17巻(8号):1453~1464頁(2009年)に提供されるような自己不活性化レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部分に由来するベクターである。クリニックにおいて使用され得るレンチウイルスベクターの他の例には、例えば、限定としてではなく、Oxford BioMedica plcのLENTIVECTOR(登録商標)遺伝子送達テクノロジー、LentigenのLENTIMAX(商標)ベクター系などが含まれる。非臨床型のレンチウイルスベクターもまた利用可能であり、当業者に公知である。
いくつかのトランスフェクション技術が、当該分野で一般に公知である(例えば、Grahamら、Virology、52巻:456~467頁(1973年);Sambrookら、上記;Davisら、Basic Methods in Molecular Biology、Elsevier(1986年);およびChuら、Gene、13巻:97頁(1981年)を参照のこと)。
トランスフェクション方法には、リン酸カルシウム共沈(例えば、Grahamら、上記を参照のこと)、培養細胞中への直接的マイクロインジェクション(例えば、Capecchi、Cell、22巻:479~488頁(1980年)を参照のこと)、エレクトロポレーション(例えば、Shigekawaら、BioTechniques、6巻:742~751頁(1988年)を参照のこと)、リポソーム媒介性遺伝子移入(例えば、Manninoら、BioTechniques、6巻:682~690頁(1988年)を参照のこと)、脂質媒介性形質導入(例えば、Feignerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84巻:7413~7417頁(1987年)を参照のこと)および高速微小推進剤(high velocity microprojectile)を使用する核酸送達(例えば、Kleinら、Nature、327巻:70~73頁(1987年)を参照のこと)が含まれる。
一実施形態では、組換え発現ベクターは、例えば、Sambrookら、上記およびAusubelら、上記に記載される、標準的な組換えDNA技術を使用して調製され得る。環状または直鎖状である発現ベクターのコンストラクトは、原核生物または真核生物宿主細胞において機能的な複製系を含有するように調製され得る。複製系は、例えば、ColEl、2μプラスミド、λ、SV40、ウシパピローマウイルスなどに由来し得る。
組換え発現ベクターは、ベクターがDNAベースであるかRNAベースであるかを考慮に入れて、必要に応じて、ベクターが導入される宿主細胞の型(例えば、細菌、真菌、植物または動物)に特異的な調節配列、例えば、転写および翻訳開始および終結コドンを含み得る。組換え発現ベクターは、クローニングを容易にするための制限部位を含み得る。
組換え発現ベクターは、形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする、1または複数のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子には、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性、原栄養性を提供するための栄養要求性宿主における補完などが含まれる。本発明の発現ベクターに適切なマーカー遺伝子には、例えば、ネオマイシン/G418耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。
組換え発現ベクターは、CAR(その機能的部分および機能的バリアントを含む)をコードするヌクレオチド配列に、またはCARをコードするヌクレオチド配列に対して相補的なもしくはかかるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に連結したネイティブまたは非ネイティブのプロモーターを含み得る。プロモーターの選択、例えば、強い、弱い、誘導性、組織特異的および発生特異的は、当業者の技術範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列をプロモーターと組み合わせることもまた、当業者の技術範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、SV40プロモーター、RSVプロモーター、またはマウス幹細胞ウイルスの末端反復配列において見出されるプロモーターであり得る。
組換え発現ベクターは、一過性の発現のため、安定な発現のため、またはその両方のために設計され得る。また、組換え発現ベクターは、構成的発現または誘導性発現のために作製され得る。
さらに、組換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製され得る。本明細書で使用する場合、用語「自殺遺伝子」とは、自殺遺伝子を発現する細胞を死なせる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、この遺伝子が発現される細胞に薬物などの薬剤に対する感受性を付与する遺伝子、または細胞が薬剤と接触した場合もしくは薬剤に曝露された場合にその細胞を死なせる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該分野で公知であり(例えば、Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews、Springer、Caroline J.(Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research、Sutton、Surrey、UK)、Humana Press、2004年を参照のこと)、これには、例えば、単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼ(TK)遺伝子、シトシンデアミナーゼ(daminase)、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびニトロレダクターゼが含まれる。
一実施形態は、本明細書に記載される組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞をさらに提供する。本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」とは、本発明の組換え発現ベクターを含有し得る任意の型の細胞を指す。宿主細胞は、真核生物細胞、例えば、植物、動物、真菌もしくは藻類であり得る、または原核生物細胞、例えば、細菌もしくは原生生物であり得る。宿主細胞は、培養細胞または初代細胞であり得る、即ち、ヒトなどの生物から直接単離され得る。宿主細胞は、接着細胞または懸濁細胞、即ち、懸濁物中で成長する細胞であり得る。適切な宿主細胞は、当該分野で公知であり、これには、例えば、DH5a E.coli細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルVERO細胞、COS細胞、HEK293細胞などが含まれる。組換え発現ベクターを増幅または複製することを目的とすると、宿主細胞は、原核生物細胞、例えば、DH5a細胞であり得る。組換えCARを産生することを目的とすると、宿主細胞は、哺乳動物細胞であり得る。宿主細胞は、ヒト細胞であり得る。宿主細胞は任意の細胞型のものであり得、任意の型の組織に起源し得、任意の発生段階のものであり得るが、宿主細胞は、末梢血リンパ球(PBL)または末梢血単核球(PBMC)であり得る。宿主細胞は、T細胞であり得る。
本明細書の目的のために、T細胞は、任意のT細胞、例えば、培養T細胞、例えば、初代T細胞、または培養T細胞株、例えば、Jurkat、SupTlなど由来のT細胞、または哺乳動物から得られたT細胞であり得る。哺乳動物から得られる場合、T細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺または他の組織もしくは体液を含むがこれらに限定されない多数の供給源から得られ得る。T細胞はまた、富化または精製され得る。T細胞は、ヒトT細胞であり得る。T細胞は、ヒトから単離されたT細胞であり得る。T細胞は、CD4+/CD8+二重陽性T細胞、CD4+ヘルパーT細胞、例えば、Th1およびTh2細胞、CD8+T細胞(例えば、細胞傷害性T細胞)、腫瘍浸潤性細胞、メモリーT細胞、ナイーブT細胞などを含むがこれらに限定されない、任意の型のT細胞であり得、任意の発達段階のものでもあり得る。T細胞は、CD8+T細胞またはCD4+T細胞であり得る。
一実施形態では、本明細書に記載されるDuoCARは、適切な非T細胞において使用され得る。かかる細胞は、免疫エフェクター機能を有する細胞、例えば、多能性幹細胞から生成されたNK細胞およびT様細胞などである。
本明細書に記載される少なくとも1つの宿主細胞を含む細胞の集団もまた、一実施形態によって提供される。細胞の集団は、いずれの組換え発現ベクターも含まない少なくとも1つの他の細胞、例えば宿主細胞(例えば、T細胞)、またはT細胞以外の細胞、例えば、B細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞などに加えて、記載される組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む不均一な集団であり得る。あるいは、細胞の集団は、実質的に均質な集団であり得、ここで、集団は主に、組換え発現ベクターを含む(例えば、それらから本質的になる)宿主細胞を含む。集団はまた、細胞のクローン性集団であり得、ここで、集団の全ての細胞は、組換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンであり、その結果、集団の全ての細胞は、その組換え発現ベクターを含む。本発明の一実施形態では、細胞の集団は、本明細書に記載される組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン性集団である。
DuoCAR(その機能的部分およびバリアントを含む)、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞(その集団を含む)および抗体(その抗原結合性部分を含む)は、単離および/または精製され得る。例えば、精製(または単離)された宿主細胞の調製物は、宿主細胞が身体内のその天然環境中の細胞よりも純粋である調製物である。かかる宿主細胞は、例えば、標準的な精製技術によって産生され得る。一部の実施形態では、宿主細胞の調製物は精製され、その結果、宿主細胞は、調製物の総細胞含量の少なくとも約50%、例えば、少なくとも約70%を示す。例えば、純度は、少なくとも約50%であり得、約60%、約70%もしくは約80%よりも上であり得、または約100%であり得る。
E.処置の方法
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団(複数可)において使用されるDuoCARは、哺乳動物において疾患を処置または予防する方法において使用され得ることが企図される。これに関して、一実施形態は、DuoCAR、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体および/もしくはその抗原結合性部分、ならびに/または医薬組成物を、哺乳動物においてがんを処置または予防するのに有効な量で哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物においてがんを処置または予防する方法を提供する。上述のDuoCARの追加の使用方法は、上記に開示されている。
一実施形態は、本明細書に開示されるDuoCARを投与するステップの前に、哺乳動物をリンパ枯渇させる(lymphodepleting)ステップをさらに含む。リンパ枯渇の例には、非骨髄破壊的リンパ枯渇性化学療法、骨髄破壊的リンパ枯渇性化学療法、全身照射などが含まれ得るがこれらに限定されない。
宿主細胞、または細胞の集団が投与される方法を目的として、細胞は、哺乳動物にとって同種または自家である細胞であり得る。好ましくは、細胞は、哺乳動物にとって自家である。本明細書で使用する場合、同種とは、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の材料を意味する。1または複数の遺伝子座において遺伝子が同一でない場合、2以上の個体は、互いに同種であると言われる。一部の態様では、同じ種の個体由来の同種材料は、抗原性に相互作用するのに十分に遺伝的に異なり得る。本明細書で使用する場合、「自家」とは、個体に後に再導入される、同じ個体に由来する任意の材料を意味する。
本明細書で言及される哺乳動物は、任意の哺乳動物であり得る。本明細書で使用する場合、用語「哺乳動物」とは、齧歯目の哺乳動物、例えば、マウスおよびハムスター、ならびにウサギ(Logomorpha)目の哺乳動物、例えば、ウサギを含むがこれらに限定されない任意の哺乳動物を指す。哺乳動物は、ネコ(Feline)(ネコ(cat))およびイヌ(Canine)(イヌ(dog))を含む食肉目由来であり得る。哺乳動物は、ウシ(Bovine)(ウシ(cow))およびブタ(Swine)(ブタ(pig))を含む偶蹄目由来、またはウマ(Equine)(ウマ(horse))を含む奇蹄目(Perssodactyla)のものであり得る。哺乳動物は、霊長目、新世界ザル(Ceboid)目もしくはサル(Simoid)目(サル(monkey))または類人猿(Anthropoid)目(ヒトおよび類人猿(ape))のものであり得る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
これらの方法に関して、がんは、急性リンパ性がん、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、膀胱がん(例えば、膀胱癌)、骨がん、脳がん(例えば、髄芽腫)、乳房がん、肛門、肛門管もしくは肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢もしくは胸膜のがん、鼻、鼻腔もしくは中耳のがん、口腔のがん、外陰部のがん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性がん(chronic myeloid cancer)、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、頭頸部がん(例えば、頭頸部扁平上皮癌)、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、白血病、液性腫瘍、肝臓がん、肺がん(例えば、非小細胞肺癌および肺腺癌)、リンパ腫、中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、上咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、B-慢性リンパ性白血病(CLL)、ヘアリー細胞白血病、急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、およびバーキットリンパ腫、卵巣がん、膵がん、腹膜、網および腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん、皮膚がん、小腸がん、軟組織がん、固形腫瘍、滑膜肉腫、胃がん、精巣がん、甲状腺がんならびに尿管がんのいずれかを含む任意のがんであり得る。
用語「処置する」および「予防する」ならびにそれらから派生した単語は、本明細書で使用する場合、100%または完全な処置または予防を必ずしも意味しない。むしろ、当業者が潜在的な有益な効果または治療効果を有すると認識する、種々の程度の処置または予防が存在する。これに関して、この方法は、任意の量または任意のレベルの、哺乳動物におけるがんの処置または予防を提供し得る。
さらに、この方法によって提供される処置または予防には、処置または予防されているがんなどの疾患の1または複数の状態または症状の処置または予防が含まれ得る。また、本明細書の目的のために、「予防」は、疾患、またはその症状もしくは状態の発病を遅延させることを包含し得る。
別の実施形態は、哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法であって、(a)哺乳動物由来の1または複数の細胞を含む試料を、DuoCAR、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体および/もしくはその抗原結合性部分、または医薬組成物と接触させ、それによって、複合体を形成するステップ、ならびに(b)複合体を検出するステップであって、複合体の検出が、哺乳動物におけるがんの存在を示す、ステップを含む方法を提供する。
試料は、任意の適切な方法、例えば、生検または剖検によって得られ得る。生検は、個体からの組織および/または細胞の取り出しである。かかる取り出しは、取り出された組織および/または細胞に対する実験を実施するために、個体から組織および/または細胞を収集することであり得る。この実験には、個体がある特定の状態もしくは疾患状態を有するかどうか、および/またはある特定の状態もしくは疾患状態に罹患しているかどうかを決定するための実験が含まれ得る。状態または疾患は、例えば、がんであり得る。
哺乳動物における増殖障害、例えばがんの存在を検出する方法の実施形態に関して、哺乳動物の細胞を含む試料は、細胞全体、その溶解物、または細胞全体溶解物の画分、例えば、核もしくは細胞質画分、タンパク質全体画分、または核酸画分を含む試料であり得る。試料が細胞全体を含む場合、これらの細胞は、哺乳動物の任意の細胞、例えば、血液細胞または内皮細胞を含む任意の臓器または組織の細胞であり得る。
接触させるステップは、哺乳動物に関してin vitroまたはin vivoで起こり得る。好ましくは、接触させるステップは、in vitroである。
また、複合体の検出は、当該分野で公知の多くの方法によって行われ得る。例えば、本明細書に記載される、本明細書に開示されるDuoCAR、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、または抗体もしくはその抗原結合性部分は、検出可能な標識、例えば、上に開示される放射性同位体、フルオロフォア(例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、フィコエリトリン(PE))、酵素(例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ)および元素粒子(例えば、金粒子)などで標識され得る。
標的細胞を認識する能力および抗原特異性についてCARを試験する方法は、当該分野で公知である。例えば、Clayら、J.Immunol、163巻:507~513頁(1999年)は、サイトカイン(例えば、インターフェロン-γ、顆粒球/単球コロニー刺激因子(granulocyte/monocyte colony stimulating factor)(GM-CSF)、腫瘍壊死因子a(TNF-a)またはインターロイキン2(IL-2))の放出を測定する方法を教示している。さらに、CAR機能は、Zhaoら、J.Immunol.174巻:4415~4423頁(2005年)に記載されるように、細胞傷害性の測定によって評価され得る。
別の実施形態は、本発明のDuoCAR、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体もしくはその抗原結合性部分、および/または医薬組成物の使用、哺乳動物におけるがんなどの増殖障害の処置または予防を提供する。がんは、本明細書に記載されるがんのいずれかであり得る。
局所および全身投与を含む任意の投与方法が、開示された治療剤のために使用され得る。例えば、外用、経口、静脈内などの血管内、筋内、腹腔内、鼻腔内、皮内、くも膜下腔内および皮下投与が使用され得る。特定の投与様式および投薬レジメンは、症例の特徴(例えば、対象、疾患、関与する疾患状態、および処置が予防的かどうか)を考慮して、担当の臨床医によって選択される。1よりも多い薬剤または組成物が投与されている場合、1または複数の投与経路が使用され得る;例えば、化学療法剤は、経口投与され得、抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲートまたは組成物は、静脈内投与され得る。投与方法には、CAR、CAR T細胞、コンジュゲート、抗体、抗原結合性断片または組成物が、非毒性の薬学的に許容される担体、例えば、水、食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、5%ヒト血清アルブミン、固形油、オレイン酸エチルまたはリポソーム中に提供される注射が含まれる。一部の実施形態では、開示された化合物の局所投与は、例えば、腫瘍が除去された組織の領域、または腫瘍発達の傾向があると疑われる領域に、抗体または抗原結合性断片を適用することによって使用され得る。一部の実施形態では、治療有効量の抗体または抗原結合性断片を含む医薬調製物の持続性の腫瘍内(または腫瘍近傍)放出が有益であり得る。他の例では、コンジュゲートが、角膜に点眼薬として外用で、または目に硝子体内で適用される。
開示された治療剤は、正確な投薬量の個々の投与に適切な単位剤形で製剤化され得る。さらに、開示された治療剤は、単一の用量でまたは複数用量のスケジュールで投与され得る。複数用量のスケジュールは、処置の主要な過程が、1よりも多い別々の用量、例えば1~10用量と、その後の、組成物の作用を維持または強化するために必要に応じて引き続く時間間隔で与えられる他の用量とによるものであり得るスケジュールである。処置は、数日~数か月またはさらには数年の期間にわたる、1日用量または複数の1日用量の化合物(複数可)を含み得る。したがって、投薬レジームはまた、処置される対象の特定の要求に基づいて少なくとも一部決定され、投与する実務者の判断に依存する。
抗体またはコンジュゲートの典型的な投薬量は、約0.01~約30mg/kg、例えば、約0.1~約10mg/kgの範囲であり得る。
特定の例では、対象には、複数の1日投薬スケジュールで、例えば、少なくとも2連続日、10連続日など、例えば、数週間、数か月または数年の期間にわたって、コンジュゲート、抗体、組成物、DuoCAR、CAR T細胞またはさらなる薬剤のうち1または複数を含む治療組成物が投与される。一例では、対象には、少なくとも30日、例えば、少なくとも2か月、少なくとも4か月、少なくとも6か月、少なくとも12か月、少なくとも24か月または少なくとも36か月の期間にわたって、コンジュゲート、抗体、組成物またはさらなる薬剤が投与される。
一部の実施形態では、開示された方法は、開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、CARまたはCARを発現するT細胞と組み合わせて、手術、放射線療法および/または化学療法薬を(例えば、連続的に、実質的に同時にまたは同時に)対象に提供することを含む。かかる薬剤および処置の方法および治療的投薬量は、当業者に公知であり、熟練の臨床医によって決定され得る。さらなる薬剤についての調製および投薬スケジュールは、製造業者の指示に従って使用され得る、または当業者によって実験的に決定される通りであり得る。かかる化学療法についての調製および投薬スケジュールは、Chemotherapy Service、(1992年)M.C.Perry編、Williams & Wilkins、Baltimore、Mdにも記載されている。
一部の実施形態では、併用治療は、治療有効量のさらなるがん阻害剤の、対象への投与を含み得る。併用治療で使用され得るさらなる治療剤の非限定的な例には、微小管結合剤、DNAインターカレーターまたはクロスリンカー、DNA合成阻害剤、DNAおよびRNA転写阻害剤、抗体、酵素、酵素阻害剤、遺伝子調節因子ならびに血管新生阻害剤が含まれる。これらの薬剤(治療有効量で投与される)および処置は、単独でまたは組み合わせて使用され得る。例えば、任意の適切な抗がん剤または抗血管新生剤は、本明細書に開示されるCAR、CAR-T細胞、抗体、抗原結合性断片またはコンジュゲートと組み合わせて投与され得る。方法およびかかる薬剤の治療的投薬量は、当業者に公知であり、熟練の臨床医によって決定され得る。
併用免疫療法のためのさらなる化学療法剤には、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード(例えば、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミドおよびメルファラン)、ニトロソウレア(例えば、カルムスチン、ホテムスチン、ロムスチンおよびストレプトゾシン)、白金化合物(例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチンおよびBBR3464)、ブスルファン、ダカルバジン、メクロレタミン、プロカルバジン、テモゾロミド、チオテパおよびウラムスチン(uramustine);代謝拮抗薬、例えば、葉酸(例えば、メトトレキサート、ペメトレキセドおよびラルチトレキセド)、プリン(例えば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリンおよびチオグアニン)、ピリミジン(例えば、カペシタビン)、シタラビン、フルオロウラシルおよびゲムシタビン;植物アルカロイド、例えば、ポドフィルム(例えば、エトポシドおよびテニポシド)、タキサン(例えば、ドセタキセルおよびパクリタキセル)、ビンカ(例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビン);細胞傷害性/抗腫瘍抗生物質、例えば、アントラサイクリンファミリーのメンバー(例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロンおよびバルルビシン)、ブレオマイシン、リファンピシン、ヒドロキシウレアおよびマイトマイシン;トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、トポテカンおよびイリノテカン;モノクローナル抗体、例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、ペルツズマブおよびトラスツズマブ;腫瘍親和性感光色素、例えば、アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、ポルフィマーナトリウムおよびベルテポルフィン;ならびに他の薬剤、例えば、アリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アキシチニブ、ベキサロテン、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、セレコキシブ、デニロイキンジフチトクス、エルロチニブ、エストラムスチン、ゲフィチニブ、ヒドロキシカルバミド、イマチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、ペントスタチン、マソプロコール、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、タモキシフェン、ソラフェニブ、スニチニブ、ベムラフェニブ(vemurafinib)、バンデタニブおよびトレチノインが含まれるがこれらに限定されない。かかる薬剤の選択および治療的投薬量は、当業者に公知であり、熟練の臨床医によって決定され得る。
本発明のある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法、またはT細胞が治療レベルに増殖される当該分野で公知の他の方法を使用して活性化および増殖される細胞は、抗ウイルス療法のシドホビルおよびインターロイキン-2などの薬剤による処置、シタラビン(ARA-Cとしても公知)、またはMS患者のためのナタリズマブ処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ処置、またはPML患者のための他の処置が含まれるがこれらに限定されない任意の数の関連する処置様式と併用して(例えば、その前、それと同時、またはその後)、患者に投与される。さらなる実施形態では、本発明のT細胞は、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸塩、およびFK506、抗体、または他の免疫除去剤、例えば、CAM PATH、抗CD3抗体または他の抗体療法、サイトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、および照射と併用して使用され得る。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼのカルシニューリンを阻害する(シクロスポリンおよびFK506)か、または成長因子誘導シグナル伝達のために重要なp70S6キナーゼを阻害する(ラパマイシン)(Liuら、Cell 66巻:807~815頁、1991年;Hendersonら、Immun 73巻:316~321頁、1991年;Biererら、Curr.Opin.Immun 5巻:763~773頁、1993年)。さらなる実施形態では、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤を使用するT細胞除去療法、外照射療法(XRT)、シクロホスファミド、またはOKT3もしくはCAMPATHTなどの抗体と併用して(例えば、その前、それと同時、またはその後)、患者に投与される。別の実施形態では、本発明の細胞組成物は、CD20と反応する薬剤、例えば、リツキサンなどのB細胞除去療法後に投与される。例えば、一実施形態では、対象は、高用量化学療法、続いて末梢血幹細胞移植による標準処置を受けてもよい。ある特定の実施形態では、移植後、対象は、本発明の増殖された免疫細胞の注入を受ける。追加の実施形態では、増殖された細胞は、外科手術の前または後に投与される。
患者に投与される上記の処置の投薬量は、処置される状態の正確な性質、および処置のレシピエントにより変わる。ヒト投与のための投薬量の調整は、当該分野で許容される実施に従って行うことができる。CAMPATHについての用量は、例えば、一般に、成人患者に対して1~約100mgの範囲であり、通常、1~30日の期間、毎日投与される。好ましい1日用量は、1日当たり1~10mgであるが、一部の例では、最大で1日当たり40mgのより高い用量が使用されてもよい。
併用療法は、相乗作用を提供し得、相乗的であることが証明され得る、即ち、活性成分が一緒に使用される場合に達成される効果は、それらの化合物を別々に使用することから生じ得る効果の合計よりも大きい。相乗効果は、活性成分が、(1)共製剤化され、併用される単位投薬製剤と同時に投与もしくは送達される場合;(2)別々の製剤として交互にもしくは並行して送達される場合;または(3)一部の他のレジメンによる場合に、達成され得る。交互に送達される場合、相乗効果は、それらの化合物が、例えば、別々のシリンジ中の異なる注射によって連続的に投与または送達される場合に達成され得る。一般に、交代の間、有効投薬量の各活性成分が、連続的に、即ち、順次に投与されるが、併用療法では、有効投薬量の2以上の活性成分が一緒に投与される。
一実施形態では、本明細書に開示された抗原のうち1もしくは複数に特異的に結合する抗体もしくは抗原結合性断片またはそのコンジュゲートの有効量が、抗がん処置後に腫瘍を有する対象に投与される。投与された抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲートがそれぞれのがん細胞上で発現された抗原と免疫複合体を形成するのに十分な量の時間が経過した後で、免疫複合体が検出される。免疫複合体の存在(または非存在)は、処置の有効性を示す。例えば、処置の前に採取された対照と比較した免疫複合体の増加は、その処置が有効でないことを示し、処置の前に採取された対照と比較した免疫複合体の減少は、その処置が有効であることを示す。
F.バイオ医薬組成物
担体(例えば、薬学的に許容される担体)中に、開示されたCAR、またはCARを発現するT細胞、抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、CAR、または本明細書に開示された1もしくは複数の抗原に特異的に結合するCARを発現するT細胞のうち1または複数を含む、遺伝子治療、免疫療法、養子免疫療法および/または細胞療法における使用のためのバイオ医薬組成物または生物製剤組成物(本明細書で以下「組成物」)が、本明細書で提供される。これらの組成物は、対象への投与のために単位投薬形態で調製され得る。所望の転帰を達成するための投与の量およびタイミングは、処置を行う臨床医の裁量である。これらの組成物は、全身(例えば、静脈内)または局所(例えば、腫瘍内)投与のために製剤化され得る。一例では、開示されたDuoCAR、またはCARを発現するT細胞、抗体、抗原結合性断片、コンジュゲートは、静脈内投与などの非経口投与のために製剤化される。本明細書に開示されるDuoCAR、またはCARを発現するT細胞、コンジュゲート、抗体もしくは抗原結合性断片を含む組成物は、腫瘍、例えば、限定としてではなく、神経芽細胞腫の、例えば、処置および検出などのために使用される。一部の例では、これらの組成物は、癌の処置または検出に有用である。本明細書に開示されるDuoCAR、またはCARを発現するT細胞、コンジュゲート、抗体もしくは抗原結合性断片を含む組成物は、例えば、病理学的血管新生の検出にも使用される。
投与のための組成物には、水性担体などの薬学的に許容される担体中に溶解されたCAR、またはCARを発現するT細胞、コンジュゲート、抗体もしくは抗原結合性断片の溶液が含まれ得る。例えば緩衝食塩水などの種々の水性担体が使用され得る。これらの溶液は無菌であり、一般に、望ましくない物質を含まない。組成物は、従来の周知の無菌化技術によって無菌化され得る。組成物は、生理学的条件に近付くのに必要な薬学的に許容される補助的物質、例えば、pH調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、アジュバント薬剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有し得る。これらの製剤中のCAR、またはCARを発現するT細胞、抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲートの濃度は、広く変動し得、選択された特定の投与様式および対象の要求に従って、液量、粘度、体重などに主に基づいて選択される。遺伝子治療、免疫療法および/または細胞療法における使用のためのかかる投薬形態を調製する実際の方法は、当業者に公知であり、または明らかとなる。
静脈内投与のための典型的な組成物は、1日当たり対象1人当たり約0.01~約30mg/kgの抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲート(あるいは対応する用量のCAR、またはCARを発現するT細胞、抗体もしくは抗原結合性断片を含むコンジュゲート)を含む。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知または明らかであり、Remington’s Pharmaceutical Science、第19版、Mack Publishing Company、Easton、PA(1995年)などの刊行物中により詳細に記載されている。
CAR、またはCARを発現するT細胞、抗体、抗原結合性断片、またはコンジュゲートは、凍結乾燥形態で提供され得、投与前に無菌水で再水和され得るが、これらは、既知の濃度の無菌溶液中でも提供される。次いで、DuoCAR、またはCARを発現するT細胞、抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲートの溶液が、0.9%塩化ナトリウム、USPを含有する注入バッグに添加され、一部の場合には、0.5~15mg/体重kgの投薬量で投与される。抗体または抗原結合性断片およびコンジュゲート薬物の投与では、当該分野でかなりの経験が利用可能である;例えば、抗体薬物は、1997年のRITUXAN(登録商標)の承認以降、米国で市販されている。CAR、またはCARを発現するT細胞、抗体、抗原結合性断片およびそれらのコンジュゲートは、静注または静脈内ボーラスでではなく、緩徐な注入によって投与され得る。一例では、より高い負荷用量が、より低いレベルで投与される引き続く維持用量と共に投与される。例えば、4mg/kgの初期負荷用量の抗体または抗原結合性断片(または対応する用量の、抗体もしくは抗原結合性断片を含むコンジュゲート)が、およそ90分の期間にわたって注入され得、その後、以前の用量が十分に忍容された場合に30分の期間にわたって注入される4~8週間にわたる2mg/kgの毎週の維持用量が注入され得る。
制御放出非経口製剤は、インプラント、油性注射として、または粒状の系として作製され得る。タンパク質送達系の広い概説については、Banga,A.J.、Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation,Processing,and Delivery Systems、Technomic Publishing Company,Inc.、Lancaster、PA(1995年)を参照のこと。粒状の系には、ミクロスフェア、マイクロ粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェアおよびナノ粒子が含まれる。マイクロカプセルは、中心コアとして、細胞毒または薬物などの治療的タンパク質を含有する。ミクロスフェアでは、治療薬は、粒子の至る所に分散される。約1μmよりも小さい粒子、ミクロスフェアおよびマイクロカプセルは一般に、それぞれ、ナノ粒子、ナノスフェアおよびナノカプセルと呼ばれる。毛細管は、ナノ粒子だけが静脈内投与されるように、およそ5μmの直径を有する。マイクロ粒子は、典型的には、直径がおよそ100μmであり、皮下または筋内投与される。例えば、Kreuter,J.、Colloidal Drug Delivery Systems、J.Kreuter編、Marcel Dekker,Inc.、New York、NY、219~342頁(1994年);ならびにTiceおよびTabibi、Treatise on Controlled Drug Delivery、A.Kydonieus編、Marcel Dekker,Inc.New York、NY、315~339頁(1992年)を参照のこと。
ポリマーは、本明細書に開示されるDuoCAR、またはCARを発現するT細胞、抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲート組成物のイオン制御された放出のために使用され得る。制御された薬物送達に使用される種々の分解性および非分解性ポリマーマトリックスは、当該分野で公知である(Langer、Accounts Chem.Res.26巻:537~542頁、1993年)。例えば、ブロックコポリマーであるpolaxamer 407は、低温で粘性であるがなお可動性の液体として存在するが、体温では半流動性ゲルを形成する。これは、組換えインターロイキン-2およびウレアーゼの製剤化および持続性送達のための有効なビヒクルであることが示されている(Johnstonら、Pharm.Res.9巻:425~434頁、1992年;およびPecら、J.Parent.Sci.Tech.44巻(2号):58~65頁、1990年)。あるいは、ヒドロキシアパタイトが、タンパク質の制御された放出のための微小担体として使用されてきた(Ijntemaら、Int.J.Pharm.112巻:215~224頁、1994年)。さらに別の態様では、リポソームが、脂質カプセル化薬物の制御された放出および薬物標的化に使用される(Betageriら、Liposome Drug Delivery Systems、Technomic Publishing Co.,Inc.、Lancaster、PA(1993年))。治療的タンパク質の制御された送達のための多数のさらなる系が公知である(米国特許第5,055,303号;米国特許第5,188,837号;米国特許第4,235,871号;米国特許第4,501,728号;米国特許第4,837,028号;米国特許第4,957,735号;米国特許第5,019,369号;米国特許第5,055,303号;米国特許第5,514,670号;米国特許第5,413,797号;米国特許第5,268,164号;米国特許第5,004,697号;米国特許第4,902,505号;米国特許第5,506,206号;米国特許第5,271,961号;米国特許第5,254,342号および米国特許第5,534,496号を参照のこと)。
G.キット
一態様では、本明細書に開示されるDuoCARを使用するキットもまた提供される。例えば、対象における腫瘍を処置するためのキットまたは本明細書に開示されるDuoCARのうち1もしくは複数を発現するCAR T細胞を作製するためのキット。キットは、典型的には、本明細書に開示される、開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、核酸分子、CARまたはCARを発現するT細胞を含む。開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、核酸分子、DuoCARまたはCARを発現するT細胞のうち1よりも多くが、キット中に含まれ得る。
キットは、コンテナ、およびコンテナ上のまたはコンテナと関連したラベルまたは添付文書を含み得る。適切なコンテナには、例えば、瓶、バイアル、シリンジなどが含まれる。コンテナは、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。コンテナは、典型的には、開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、核酸分子、DuoCARまたはCARを発現するT細胞のうち1または複数を含む組成物を保持する。いくつかの実施形態では、コンテナは、無菌アクセスポートを有し得る(例えば、コンテナは、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る)。ラベルまたは添付文書は、その組成物が特定の状態を処置するために使用されることを示す。
ラベルまたは添付文書は、典型的には、例えば、腫瘍を処置もしくは予防する方法、またはCAR T細胞を作製する方法における、開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、核酸分子、DuoCARまたはCARを発現するT細胞の使用のための指示書をさらに含む。添付文書は、典型的には、治療的製品の使用に関する、適応症、用法、投薬量、投与、禁忌および/またはかかる警告についての情報を含む、治療的製品の市販の包装中に習慣的に含まれる指示書を含む。教材は、電子的形態(例えば、コンピューターディスケットまたはコンパクトディスク)で書かれ得、または視覚的(例えば、動画ファイル)であり得る。キットは、キットが設計される特定の適用を容易にするためのさらなる構成要素もまた含み得る。したがって、例えば、キットは、標識を検出する手段(例えば、酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、二次抗体などの適切な二次標識など)をさらに含み得る。キットは、特定の方法の実施のために慣用的に使用される緩衝液および他の試薬をさらに含み得る。かかるキットおよび適切な内容物は、当業者に周知である。
実施例
本発明は、以下の添付される図面、および上記を含む17~27頁の開示内に示されるDuoCARの例によってさらに例証され、これらの例は決してその範囲に制約を課すものとして解釈すべきではない。反対に、その様々な他の実施形態、変更形態、および均等物に頼らなければならず、これらは本明細書の記載を読んだ後、本発明の精神および/または添付の特許請求の範囲から逸脱せずに、当業者の念頭に浮かび得ることは容易に理解される。
種々の詳細を、上記で概説した例示的な実行と併せて記載したが、種々の変更、改変、変形、改善および/または実質的な等価物は、公知であるか、またはそれが現在予期されているもしくは予測され得るかに関わらず、上述の開示を検討する際に明らかになり得る。
本文中に引用したそれぞれの出願と特許、および(訴訟中のそれぞれの交付済特許、「出願引用文書」を含めた)それぞれの出願と特許中で引用されたそれぞれの文書または参照文献、およびこれらの出願と特許のいずれかに対応するおよび/またはその優先権を主張するそれぞれのPCTと外国出願または特許、およびそれぞれの出願引用文書中で引用もしくは参照されたそれぞれの文書は、ここで明確に参照により本明細書に組み込まれ、本発明を実施する際に利用することができる。より一般的には、文書または参照文献は本文中、特許請求の範囲の前の参照文献一覧中、または本文自体中のいずれかに引用され、それぞれのこれらの文書または参照文献(「本明細書中引用参照文献」)、および(任意の製造者の仕様書、説明書などを含めた)それぞれの本明細書中引用参照文献中に引用されたそれぞれの文書または参照文献は、ここで明確に参照により本明細書に組み込まれる。
一部の具体的実施形態の前述の記載によって、他者が、本発明の知識を適用することによって、一般的概念から逸脱せずに、具体的実施形態などの様々な適用例に関して容易に変更または適合させることができるのに充分な情報を与え、したがってこのような適合および変更形態は、開示した実施形態の均等物の意味および範囲内と理解すべきであり、理解することが意図されている。本明細書で利用する語句または述語は、限定の目的ではなく記載の目的であることは理解される。図面および記載中、例示的実施形態を開示しており、特異的用語が利用された可能性はあるが、他に言及しない限り、それらは限定の目的ではなく一般的および叙述的な意味でのみ使用され、したがって特許請求の範囲もそのように限定されない。さらに当業者は、本明細書で論じた方法の、ある特定ステップは別の順序で順に並べることができ、またはステップを組み合わせることができることを理解する。したがって、添付の特許請求の範囲は本明細書で開示した詳細な実施形態に限られないことが意図される。当業者は、ごく普通の実験を使用した、本明細書に記載した本発明の実施形態の多くの均等物を理解し、把握することができる。このような均等物は以下の特許請求の範囲によって包含される。
実施例の説明
5つの実施例が提供され、それによって、LV形質導入ヒトT細胞集団の表面における3つの機能的結合性ドメインの発現、および異なる共刺激細胞内ドメインの組合せが、DuoSetテクノロジーの実現可能性を証明し(実施例1)、3つの異なる白血病抗原に対するこの集団の機能活性が、その有効性を証明する(実施例2)。共トランスフェクション、両方のDuoCAR鎖をコードする単一LV産物(2つのCARをコードするプラスミドとのパッケージング系の共トランスフェクションによって生成する)によるaka形質導入で生成したDuoCARの発現および機能の比較を実施例3に記載する。実施例4では、共トランスフェクション法によって生成したLVで形質導入されたDuoCAR、および2つのDuoCAR鎖がリボソームスキップ部位によって分離されている単一コンストラクトによってコードされる2シストロン性DuoCARが、形質導入の効率および機能について比較される。
このテクノロジーが基づき、DuoCARにおいてDuoSet構成要素として含まれ得る単一特異性CARの例は、配列番号3のヌクレオチド配列および配列番号4のアミノ酸配列の単一CD20標的化ベクターLTG1495を含む。第2の例は、配列番号9のヌクレオチド配列および配列番号10のアミノ酸配列の、CD22に特異的な単一特異性CAR LTG2200である。DuoCARの創出において重要な分子の態様は、非冗長性の適合配列の包含、および予期されない組換えまたは細胞内会合が起こらないような形質導入T細胞におけるこれらの配列の評価である。これは、ベクターの産生細胞株、または標的細胞集団の両方で起こり得る。この理由のために、DuoCARの状況に適合することが公知のバリアントCAR構造を含めた。これらは、それぞれ、配列番号29のヌクレオチド配列、および配列番号30のアミノ酸配列に記載されるCD19特異的CAR LTG1494を含む。この配列は、Whitlowリンカー(アミノ酸配列GSTSGSGKPGSGEGSTKG(配列番号107)、Whitlow M.ら、1993年、Protein Eng.6巻:989~995頁を参照されたい)と呼ばれるscFV4の重鎖および軽鎖を接合するよく説明されているリンカーを含む。一部の場合では、Whitlowリンカーは、それぞれ、配列番号31のヌクレオチド配列および配列番号32のアミノ酸配列のLTG1538におけるように、例えば、CD19 CARフォーマットにおいて、(GGGGS)リンカーと置換された。別の例では、代替の膜貫通ドメインを有するCARが創出された。それぞれ、配列番号21のヌクレオチド配列および配列番号22のアミノ酸配列の抗CD19 CAR LTG1562は、CD4(CD8とは対照的に)膜貫通ドメインを利用する。同様に、それぞれ配列番号49のヌクレオチド配列および配列番号50のアミノ酸配列の抗CD19 CAR LTG1563は、TNFRSF19由来の代替の膜貫通を有する。DuoCARはまた、固形腫瘍、例えば、メソセリン腫瘍抗原を発現するものに標的化され得る。例えば、抗メソセリン免疫療法によりがんを処置するための組成物および方法というタイトルの2017年1月9日出願の出願人の同時係属している仮特許出願第62/444,201号、および割り当てられたLentigen Technology,Inc.の物質番号LEN_017に開示される、それぞれ、配列番号37のヌクレオチド配列および配列番号38のアミノ酸配列のscFVバインダーは、メソセリンのために創出され、これは、それぞれ、配列番号39のヌクレオチド配列および配列番号40のアミノ酸配列の機能的CARに組み込まれ得、それによって、DuoCAR療法に組み込まれ得る。scFv配列に加えて、単鎖抗原バインダー(scFvとは対照的に)は、DuoCAR適用に組み込まれ得る。例えば、抗CD33免疫療法によりがんを処置するための組成物および方法というタイトルの2017年3月24日出願の出願人の同時係属している仮特許出願第62/476,438号、および割り当てられたLentigen Technology,Inc.の物質番号LEN_018に開示される、それぞれ、配列番号41のヌクレオチド配列および配列番号42のアミノ酸配列のCD33特異的重鎖のみのバインダーは、CD33発現悪性腫瘍を標的化する、それぞれ、配列番号43のヌクレオチド配列および配列番号44のアミノ酸配列の機能的CARのLTG1906に組み込まれ得る。DuoCAR治療適用の一例は、CD19、CD20、およびTSLPR抗原を発現する白血病の処置である。この場合では、LTG1496またはLTG1497(それぞれ、配列番号35、26)は、それぞれ配列番号47のTSLPR特異的CAR(LTG1789)および配列番号48のアミノ酸配列と組み合わせることができ、これは、配列番号45のヌクレオチド配列および配列番号46のアミノ酸配列のTSLPR特異的scFVドメインから創出された。
DuoCAR治療適用の別の例は、CD38抗原を発現するがんの処置である。例えば、抗CD38免疫療法によりがんを処置するための組成物および方法というタイトルの2018年11月30日出願の出願人の同時係属している仮特許出願第62/773,940号;および割り当てられたLentigen Technology,Inc.の物質番号LEN_026に開示される、CD38特異的バインダーは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、出願人の同時係属している仮特許出願第62/773,940号に開示される、CD38発現悪性腫瘍を標的化する1つまたは複数の機能的CARに組み込まれ得る。
DuoCAR治療適用の別の例は、CD123抗原を発現するがんの処置である。例えば、抗CD123免疫療法によりがんを処置するための組成物および方法というタイトルの2019年9月20日出願の出願人の同時係属している米国特許出願第16/578,063号;および割り当てられたLentigen Technology,Inc.の物質番号LEN_024に開示され;および2018年9月20日出願の仮特許出願第62/734,106号の優先権の利益を主張する、CD123特異的バインダーは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、出願人の同時係属している米国特許出願第16/578,063号に開示される、CD123発現悪性腫瘍を標的化する1つまたは複数の機能的CARに組み込まれ得る。
DuoCAR治療適用の別の例は、BCMA抗原を発現するがんの処置である。例えば、多発性骨髄腫および他のBCMA陽性悪性腫瘍の処置のための完全ヒトBCMA CAR T細胞というタイトルの2019年5月30日出願の出願人の同時係属している仮特許出願第62/854,574号;および割り当てられたLentigen Technology,Inc.の物質番号MBG_13に開示される、BCMA特異的バインダーは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、出願人の同時係属している仮特許出願第62/854,574号に開示される、BCMA発現悪性腫瘍を標的化する1つまたは複数の機能的CARに組み込まれ得る。
このテクノロジーが基づくタンデムCAR(配列番号23のヌクレオチド配列および配列番号24のアミノ酸配列に記載される2つのscFvドメインを含む)の例は、配列番号25のヌクレオチド配列および配列番号26のアミノ酸配列のCD20_CD19 CAR LTG1497を含む。一部の場合では、2つのバインダーの順序を逆転させることで、標的細胞における良好なDuoCAR発現を提供し得る。したがって、配列番号25のヌクレオチド配列および配列番号26のアミノ酸配列に示される、CD19 scFvがより近位であるLTG1497、ならびに配列番号33のヌクレオチド配列および配列番号34のアミノ酸配列に示される、CD19 scFvが膜に対してより遠位であるLTG1496は両方とも、DuoCARを含むDuoSetのメンバーの1つとして使用することができる。
実施例1および2において利用される方法:
細胞株(PBMCおよび標的)
全ての細胞株および試薬は、特記しない限り、American Tissue Culture Collection(ATCC、Manassass、VA)から購入した。バーキットリンパ腫細胞株であるRaji、急性リンパ性白血病細胞株であるREH、および慢性骨髄性白血病細胞株であるK562は、10%の熱不活化ウシ胎児血清(FBS、Hyclone、Logan、UT)および2mMのL-Glutamax(Thermo Fisher Scientific、Grand Island、NY)で補充したRPMI-1640培地において培養した。ヒト胎児由来腎臓細胞株である293Tは、10%の熱不活化FBSで補充したダルベッコ改変イーグル培地において繁殖させた。
野生型腫瘍株に、ホタルルシフェラーゼをコードするレンチウイルスベクター(Lentigen Technology,Inc.、Gaithersburg、MD)を安定に形質導入した後、クローン化し、ルシフェラーゼ陽性クローンを選択することにより、ルシフェラーゼ発現細胞株の単一細胞クローンを生成した。マウス適合Raji-luc株を、NSGマウス(NOD.Cg-PrkdscidIl2rgtm1Wjl/SzJ、The Jackson Laboratory Sacramento、CA)にホタルルシフェラーゼを安定に発現するRajiクローンを移植すること、陽性選択(CD19マイクロビーズ、ヒト、Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、Germany)または陰性選択(マウス細胞枯渇キット、Miltenyi Biotec)のいずれかによって移植されたRaji-Luc腫瘍細胞をマウス脾臓から単離すること、培養において増殖させること、および高発現のホタルルシフェラーゼを有するクローンの選択を容易にするために再クローン化することによって、生成した。Oklahoma Blood Institute(OBI、Oklahoma City、OK)において、書面によるドナーの同意を得て、健康なボランティアから全血が採取された。加工されたバフィーコートをOBIから購入した。CD4およびCD8マイクロビーズ(Miltenyi Biotec)の1:1混合物を製造業者のプロトコールに従って使用する正の選択によって、バフィーコートからCD4陽性およびCD8陽性ヒトT細胞を精製した。
キメラ抗原受容体(CAR)の創出-DuoCARを含む発現ベクター
CAR抗原結合性ドメインのScFvの配列は、CD19に対するマウスハイブリドーマFMC-63(FMC-63:AA1~267、GenBank ID:HM852952.1)およびVLおよびVHの全体配列のCD20に対するLeu-16[1]に由来していた。CD22 scFv結合を、公的に利用可能な配列から創出した。各抗体のscFvを、インフレームでCD8ヒンジおよび膜貫通ドメイン(AA123~191、Ref配列ID NP_001759.3)、4-1BB(CD137、AA214~255、UniProt配列ID Q07011)トランス活性化ドメインおよびCD3ゼータシグナル伝達ドメイン(CD247、AA52~163、Ref配列ID:NP_000725.1)に連結することにより、タンデムCAR19_20またはCAR20_19を生成した。19Aおよび20AのscFv領域を、可動性鎖間リンカー(GGGGS)(配列番号108)、続いてCD8、4-1BB、およびCD3ゼータドメインによって配列中で連結した。ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体アルファサブユニットからのリーダー配列を、[2]に記載されるように、全てのコンストラクトに含めた。CARコンストラクト配列を、コドン最適化し(DNA2.0、Newark、CA)、ヒトEF-1αプロモーターの調節下にある第3世代レンチウイルスプラスミド骨格(Lentigen Technology Inc.、Gaithersburg、MD)にクローン化した。[3]に以前に記載されるように、HEK 293T細胞の一過性トランスフェクションによりレンチウイルスベクター(LV)を含む上清を生成した。採取されたペレット化レンチウイルス上清を、-80℃で保管した。
初代T細胞形質導入:
正常なドナーからの選択されたCD4+およびCD8+ヒト初代T細胞を、40IU/mlのIL-2で補充したTexMACS培地(無血清)において、0.3~2×10細胞/mlの密度で培養し、CD3/CD28 MACS(登録商標)GMP TransAct試薬(Miltenyi Biotec)で活性化し、3日目に、10ug/mlの硫酸プロタミン(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)の存在下で、CARコンストラクトをコードするレンチウイルスベクターを一晩形質導入し、4日目に培地を交換した。5日目に、培養物を、200IU/ml IL-2で補充したTexMACS培地に移し、10~13日目の採取まで繁殖させた。
免疫エフェクターアッセイ:細胞媒介性の細胞傷害性を決定するため(CTLアッセイ)、ホタルルシフェラーゼが安定に形質導入された標的細胞5,000個を種々のエフェクター対標的比でCAR T細胞と混合し、一晩インキュベートした。SteadyGlo試薬(Promega、Madison WI)を各ウェルに添加し、生じた発光を、EnSpireプレートリーダー(Perkin Elmer、Shelton、Connecticut)において分析し、秒あたりのカウントとして記録した(試料CPS)。標的のみのウェル(最大CPS)および1%Tween-20を加えた標的のみのウェル(最小CPS)を使用して、アッセイ範囲を決定した。特異的な溶解パーセントを、(1-(試料CPS-最小CPS)/(最大CPS-最小CPS))として算出した。
フローサイトメトリー分析:フローサイトメトリーのための全ての細胞染色試薬は、特記しない限り、Miltenyi Biotecからであった。100万個のCAR T形質導入細胞を、培養物から採取し、低温の染色緩衝液(0.5%のウシ血清アルブミンを有するAutoMACS溶液)中で2回洗浄し、4℃で5分間、350×gでペレットにした。形質導入T細胞におけるCAR表面発現を、最初に、4℃で30分間、タンパク質L-ビオチンコンジュゲート(ストック 1mg/ml、1:1000希釈、GenScript、Piscataway、NJ)で染色し、続いて2回の洗浄、および4℃で30分間、ストレプトアビジン-PEコンジュゲート(ストック:1.0ml、1:200希釈、Jackson ImmunoResearch Laboratories、West Grove、PA)で染色することによって検出した。陰性対照として、ストレプトアビジン-PEのみで染色された非形質導入細胞および形質導入細胞を使用した。抗CD4抗体を用いて、CAR T陽性集団のCD4とCD8の比を決定し、第2のインキュベーションステップの間に添加した。死滅した細胞は7AAD染色(BD Biosciences、San Jose、CA)により除外した。細胞を2回洗浄し、フローサイトメトリーによる定量分析前に染色緩衝液200μlで再懸濁させた。特異的DuoSet CAR T染色を、IL-2存在下において、DuoSetベクターで形質導入されたCD3-CD28ナノマトリックス(TRansAct、Miltenyi Biotec)で活性化されたヒトT細胞において行い、抗体に対する染色のために組換えCD19、CD20、またはCD22を使用して、フローサイトメトリーによって、CD19-、CD20-、またはCD22-scFvドメインの発現について分析した。
抗CD19 scFv活性を、1ug/試料で使用されるCD19-Fc(R&D Biosystems)で検出し、0.75ug/試料のヤギ抗ヒトFc-ガンマ-R-PE(Jackson ImmuoResearch Laboratories,Inc.)で染色した。抗CD20 scFv活性を、0.11ug/試料のCD20-ビオチン(Miltenyi Biotech)で検出し、0.2ug/試料のstreptavidinpAPC(Miltenyi Biotec)で検出した。抗CD22 scFc活性を、0.1ug/試料のCD22-His(Thermo Fisher)で検出し、抗-His FITC(Miltenyi Biotec)で検出した。フローサイトメトリー分析を、MACSQuant(登録商標)10 Analyzer(Miltenyi Biotec)において行った。標的腫瘍株およびルシフェラーゼ陽性サブクローンの特徴付けを、CD19-FITC、CD20 VioBlue、およびCD22-APC抗体を使用して行った。死滅した細胞は7AAD染色(BD Biosciences、San Jose、CA)により分析から除外した。
実施例1
初代ヒトT細胞におけるDuoCAR(2+1 DuoSet)の発現
原理の証拠として、2つのCAR-Tベクターで構成されるDuoSetを創出した。セットの1メンバーは、CD8膜貫通、ならびにCD28およびCD3-ゼータシグナル伝達ドメインに連結されたタンデムCD20_CD19結合性ドメインを発現した(LTG2228)、配列番号51および配列番号52。DuoSetの第2のメンバーは、CD8膜貫通、ならびに4-1BBおよびCD3-ゼータシグナル伝達ドメインに連結された単一CD22バインダーを有するCARコンストラクトであった(LTG2200)、配列番号9および配列番号10。図7において、対の縦列は、CD20およびCD19 scFvについて左の縦列に、CD22およびCD19 scFvについて右の縦列に、二重染色を示す。1行目は、形質導入されていない(UTD)T細胞を示し、したがって結合を示さない。2行目は、CD8膜貫通ドメイン、ならびに細胞内CD28およびCD3-ゼータシグナル伝達ドメインを有するCD20_CD19 CARベクターをコードするLVで形質導入されたT細胞を示す(20-19-28z)。二重染色は、CD20およびCD19の結合について見られるが(左のパネル)、CD19の結合のみ右パネルに見られる。3行目は、CD8膜貫通ドメイン、ならびに細胞内4-1BBおよびCD3-ゼータシグナル伝達ドメインを有するCD22 CARベクターで形質導入されたT細胞を示す(22-BBz)。二重染色は、CD19またはCD20で見られず(左のパネル)、CD22に結合することができる細胞の単一の集団のみ見られる(右のパネル)。4行目では、T細胞は、2行目および3行目の両方のベクターで構成されるDuoSetで形質導入される。DuoSetのみが、3つのCARコード結合性ドメイン全てを発現する(細胞の42%がCD20_19を発現し(左のパネル)、38%がCD22およびCD19結合性ドメインを発現する(右のパネル))。CD22およびCD19 scFvは、DuoSetを含む2つの別個の膜貫通タンパク質それぞれ上にあるので、38%は、この例では、真のDuoSetを発現する集団を示す。
実施例2
共形質導入法によって生成するDuoCARを発現するヒトT細胞調製物の抗白血病活性
3つの白血病抗原を同時に標的化するDuoCARを発現するヒトT細胞調製物の抗白血病活性(参照、DuoCAR発現の特徴について図7を参照されたい)。CD20_19タンデムCARおよびCD22特異的単一CAR(実施例1におけるようにして調製)で構成されるDuoSetを、標的として白血病細胞株およびモデル細胞株を使用する細胞傷害性T細胞アッセイにおいて、エフェクターT細胞集団として使用した。単一のCAR構成要素(20_19-28zまたは22-BBz)またはDuoCAR(20_19-28z+22-BBz)で形質導入されたヒトT細胞を、4つの異なるエフェクター対標的比(20:1、10:1、5:1、2.5:1、示される通り)で、細胞傷害性T細胞アッセイにおいて使用した(参照、図8を参照されたい)。CAR-T標的として使用される白血病細胞株は、Raji(3つ全ての標的抗原を発現する)、REH(3つ全ての標的抗原を発現する)、K562(対照、標的発現なし)、K562-CD19(CD19を発現する)、K562-CD20(CD20を発現する)、およびK562-CD22(CD22を発現する)であった。DuoCAR形質導入細胞(20-19-28z+22-BBz)のみが、白血病細胞株(RajiおよびREH)および3つ全ての単一発現K562標的細胞株(K562-CD19、K562-CD20、K562-CD22)の両方に対する高い細胞溶解活性を示した。これは、Duoテクノロジーが、同じエフェクターT細胞集団において、3つの白血病抗原を同時に独自に標的化することができることを実証し、したがって、一度に1つよりも多いまたは2つの標的抗原を標的化することを可能にすることによって、優れた抗新生物活性を実証し、このようにして、逃避突然変異体(1つもしくは2つの抗原を欠くか、または下方調節する細胞クローン、これが免疫除去を逃避する)を生じる悪性腫瘍の可能性を減少させる。最後の結果は、抗原喪失バリアントの逃避および副産物により、患者の治癒率が高くなり、これは、最終的には再発する。
実施例3
共トランスフェクション法によって生成するDuoCARを発現するヒトT細胞調製物の抗白血病活性
本出願に記載されるDuoCARテクノロジーは、遺伝子ベクターによってコードされる1つよりも多い膜貫通タンパク質から2つよりも多い抗原特異性を発現する、治療用リンパ球、この実施例ではヒトT細胞の集団を生成する。この実施例では、これは、2つの異なる手段によって達成される。図9は、「非形質導入」、「共形質導入」および「共トランスフェクション」というラベル付きの3行のデータを含む。図9は、図7におけるようにして生成された2つの縦列のデータを含み、ここで、1列目は、CD20およびCD19特異的な特異的結合の発現についてフローサイトメトリーによって分析され、2列目は、CD22およびCD19結合活性の発現についてフローサイトメトリーによって分析される。1行目のデータにおいて、非形質導入ヒトT細胞が示される。結合活性は、CAR由来結合活性のCD19、CD20、またはCD22組換えタンパク質指標について見られず、DuoCAR発現がないことを実証する。2行目において、「共形質導入」を使用して、DuoCARを生成した。このデータセットでは、2つのLVを使用して、活性化T細胞を同時に形質導入した。図7におけるように、DuoCARを含むDuoSet中の1つのCARは、CD28シグナル伝達およびCD3-ゼータシグナル伝達モチーフに連結されたタンデムCD20およびCD19バインダーであり、他のCARは、4-1BBおよびCD3-ゼータシグナル伝達モチーフに連結されたCD22バインダーであった。縦列1における右上象限は、CD20およびCD19 scFv活性についての単一染色の非常に特異的なパターンを示す。これは、同じ表面糖タンパク質における両方のバインダーにより、したがって、それらは、等しい強度で共発現され、見られる非常に特異的な線状パターンを生じる。共形質導入データの2番目の縦列において、2つの糖タンパク質が各細胞において均一なパターンで発現されない場合に、より伝統的なパターンが見られる。したがって、4つの異なる集団のパターンが見られる。左下象限において、どちらのバインダーも発現しない細胞が見られる。左上において、CD22 CARのみを発現する細胞が見られる。右下象限において、CD20_CD19タンデムCARのみを発現する細胞が見られる。最後に、右上象限において、DuoCARを含むCAR DuoSetの両方のメンバーを発現する細胞が見られる。
下の行において、DuoCARを発現する細胞集団は、異なる様式で生成する。独立して創出された2つのLV調製物をT細胞形質導入の時に使用する共形質導入法とは異なって、「共トランスフェクション」は、2つの骨格プラスミド(DuoCARを含む2つのCARをコードする)が、LV産生のために293Tパッケージング細胞株に同時にトランスフェクトされる方法を指す。この第3世代LV系を含むヘルパープラスミドは、両方の方法で同一である。共トランスフェクション法の利点は、両方のCARをコードするベクターを含むLVの単一調製物が創出されることである。データから見られ得るように、共トランスフェクション法を使用することで、2行目の共形質導入法と比較して、CD20-CD19 CARおよびCD22 CARの発現のほぼ同一のパターンが見られる。2列目のデータの右上象限における共トランスフェクションによって作製されたLVによって誘導される両糖タンパク質についての染色パターン(CD22-CARについてCD22、CD20_CD19 CARについてCD19共染色)は、両方の方法が、有効にDuoCARを生成することを実証する。
参照文献:
1)Wu、A.M.ら、Multimerization of a chimeric anti-CD20 single-chain Fv-Fc fusion protein is mediated through variable domain exchange. Protein engineering、2001年 14巻(12号):1025~1033頁。
2)Haso、W.ら、Anti-CD22-chimeric antigen receptors targeting B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood、2013年 121巻(7号):1165~1174頁。
3)Kuroda,H.ら、Simplified lentivirus vector production in protein-free media using polyethylenimine-mediated transfection. Journal of virological methods、2009年 157巻(2号):113~121頁。
実施例4
共トランスフェクション法によって生成したDuoCARと2シストロン性DuoCARコンストラクトとの比較
実施例4において利用される方法:
細胞株(PBMCおよび標的):全ての細胞株および試薬は、特記しない限り、American Tissue Culture Collection(ATCC、Manassass、VA)から購入した。バーキットリンパ腫細胞株であるRaji、急性リンパ性白血病細胞株であるREH、および慢性骨髄性白血病細胞株であるK562は、10%の熱不活化ウシ胎児血清(FBS、Hyclone、Logan、UT)および2mMのL-Glutamax(Thermo Fisher Scientific、Grand Island、NY)で補充したRPMI-1640培地において培養した。ヒト胎児由来腎臓細胞株である293Tは、10%の熱不活化FBSで補充したダルベッコ改変イーグル培地において繁殖させた。
野生型腫瘍株に、ホタルルシフェラーゼをコードするレンチウイルスベクター(Lentigen Technology,Inc.、Gaithersburg、MD)を安定に形質導入した後、クローン化し、ルシフェラーゼ陽性クローンを選択することにより、ルシフェラーゼ発現細胞株の単一細胞クローンを生成した。マウス適合Raji-luc株を、NSGマウス(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ、The Jackson Laboratory Sacramento、CA)にホタルルシフェラーゼを安定に発現するRajiクローンを移植すること、陽性選択(CD19マイクロビーズ、ヒト、Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、Germany)または陰性選択(マウス細胞枯渇キット、Miltenyi Biotec)のいずれかによって移植されたRaji-Luc腫瘍細胞をマウス脾臓から単離すること、培養において増殖させること、および高発現のホタルルシフェラーゼを有するクローンの選択を容易にするために再クローン化することによって、生成した。Oklahoma Blood Institute(OBI、Oklahoma City、OK)において、書面によるドナーの同意を得て、健康なボランティアから全血が採取された。加工されたバフィーコートをOBIから購入した。CD4およびCD8マイクロビーズ(Miltenyi Biotec)の1:1混合物を製造業者のプロトコールに従って使用する正の選択によって、バフィーコートからCD4陽性およびCD8陽性ヒトT細胞を精製した。
キメラ抗原受容体(CAR)の創出-DuoCARを含む発現ベクター:
CAR抗原結合性ドメイン、ScFv、配列は、CD19に対するマウスハイブリドーマFMC-63(FMC-63:AA1~267、GenBank ID:HM852952.1)およびVLおよびVHの全体配列のCD20に対するLeu-16[1]に由来していた。いくつかの抗CD22 scFv結合配列を使用した。各抗体のscFvを、インフレームでCD8ヒンジおよび膜貫通ドメイン(AA123~191、Ref配列ID NP_001759.3)、4-1BB(CD137、AA214~255、UniProt配列ID Q07011)トランス活性化ドメインおよびCD3ゼータシグナル伝達ドメイン(CD247、AA52~163、Ref配列ID:NP_000725.1)に連結することにより、タンデムCAR19_20またはCAR20_19を生成した。19Aおよび20AのscFv領域を、可動性鎖間リンカー(GGGGS)(配列番号108)、続いてCD8、4-1BB、およびCD3ゼータドメインによって配列中で連結した。ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体アルファサブユニットからのリーダー配列を、[2]に記載されるように、全てのコンストラクトに含めた。2シストロン性CAR設計において、2つのCAR鎖は、リボソームスキップ部位2Aによって分離された同じ発現カセット内でコードされた。CARコンストラクト配列を、コドン最適化し(DNA2.0、Newark、CA)、MSCVのヒトEF-1αプロモーターの調節下にある第3世代レンチウイルスプラスミド骨格(Lentigen Technology Inc.、Gaithersburg、MD)にクローン化した。[3]に以前に記載されるように、HEK 293T細胞の一過性トランスフェクションによりレンチウイルスベクター(LV)を含む上清を生成した。共トランスフェクション実験のために、DuoCAR鎖それぞれをコードする当量の2つの移入プラスミドを混合し、ヘルパープラスミドと一緒に、トランスフェクションステップの間にHEK293Tパッケージング細胞株に適用し、生じるウイルスベクター調製物を、初代ヒトT細胞の形質導入のために使用した。採取されたペレット化レンチウイルス上清を、-80℃で保管した。
初代T細胞形質導入:正常なドナーからの選択されたCD4+およびCD8+ヒト初代T細胞を、40IU/mlのIL-2で補充したTexMACS培地(無血清)において、0.3~2×10細胞/mlの密度で培養し、CD3/CD28 MACS(登録商標)GMP TransAct試薬(Miltenyi Biotec)で活性化し、3日目に、10ug/mlの硫酸プロタミン(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)の存在下で、CARコンストラクトをコードするレンチウイルスベクターを一晩形質導入し、4日目に培地を交換した。5日目に、培養物を、200IU/ml IL-2で補充したTexMACS培地に移し、10~13日目の採取まで繁殖させた。
免疫エフェクターアッセイ:細胞媒介性の細胞傷害性を決定するため(CTLアッセイ)、ホタルルシフェラーゼが安定に形質導入された標的細胞5,000個を種々のエフェクター対標的比でCAR T細胞と混合し、一晩インキュベートした。SteadyGlo試薬(Promega、Madison WI)を各ウェルに添加し、生じた発光を、EnSpireプレートリーダー(Perkin Elmer、Shelton、Connecticut)において分析し、秒あたりのカウントとして記録した(試料CPS)。標的のみのウェル(最大CPS)および1% Tween-20を加えた標的のみのウェル(最小CPS)を使用してアッセイ範囲を決定した。特異的な溶解のパーセントを(1-(試料CPS-最小CPS)/(最大CPS-最小CPS))として算出した。
フローサイトメトリー分析:フローサイトメトリーのための全ての細胞染色試薬は、特記しない限り、Miltenyi Biotecからであった。100万個のCAR T形質導入細胞を、培養物から採取し、低温の染色緩衝液(0.5%のウシ血清アルブミンを有するAutoMACS溶液)中で2回洗浄し、4℃で5分間、350×gでペレットにした。形質導入T細胞におけるCAR表面発現を、最初に、4℃で30分間、タンパク質L-ビオチンコンジュゲート(ストック 1mg/ml、1:1000希釈、GenScript、Piscataway、NJ)で染色し、続いて2回の洗浄、および4℃で30分間、ストレプトアビジン-PEコンジュゲート(ストック:1.0ml、1:200希釈、Jackson ImmunoResearch Laboratories、West Grove、PA)で染色することによって検出した。陰性対照として、ストレプトアビジン-PEのみで染色された非形質導入細胞および形質導入細胞を使用した。抗CD4抗体を用いて、CAR T陽性集団のCD4とCD8の比を決定し、第2のインキュベーションステップの間に添加した。死滅した細胞は7AAD染色(BD Biosciences、San Jose、CA)により除外した。細胞を2回洗浄し、フローサイトメトリーによる定量分析前に染色緩衝液200μlで再懸濁させた。特異的DuoSet CAR T染色を、IL-2存在下において、DuoSetベクターで形質導入されたCD3-CD28ナノマトリックス(TRansAct、Miltenyi Biotec)で活性化されたヒトT細胞において行い、抗体に対する染色のために組換えCD19、CD20、またはCD22を使用して、フローサイトメトリーによって、CD19-、CD20-、またはCD22-scFvドメインの発現について分析した。
抗CD19 scFv活性を、1ug/試料で使用されるCD19-Fc(R&D Biosystems)で検出し、0.75ug/試料のヤギ抗ヒトFc-ガンマ-R-PE(Jackson ImmuoResearch Laboratories,Inc.)で染色した。抗CD20 scFv活性を、0.1ug/試料のCD20-ビオチン(Miltenyi Biotech)で検出し、0.2ug/試料のストレプトアビジンAPC(Miltenyi Biotec)で検出した。抗CD22 scFc活性を、0.1ug/試料のCD22-His(Thermo Fisher)で検出し、抗-His FITC(Miltenyi Biotec)で検出した。フローサイトメトリー分析を、MACSQuant(登録商標)10 Analyzer(Miltenyi Biotec)において行った。標的腫瘍株およびルシフェラーゼ陽性サブクローンの特徴付けを、CD19-FITC、CD20 VioBlue、およびCD22-APC抗体を使用して行った。死滅した細胞は7AAD染色(BD Biosciences、San Jose、CA)により分析から除外した。
2Aリボソームスキップ配列を使用する2シストロン性DuoCARの生成
上記の実施例2および実施例3に記載される共形質導入および共トランスフェクションの手法に加えて、DuoCARは、3つの血液学的腫瘍抗原のCD19、CD20、CD22を同時に標的化し、かつ異なる共刺激ドメインを特徴とし、単一のmRNA転写物からの2つのCAR鎖の同時発現は、自己切断エレメント2Aの使用によって容易にすることができる。2Aエレメントは、mRNA転写物のタンパク質への翻訳の間にリボソームスキップを媒介し、このようにして、等モル比の2つの異なるCARタンパク質鎖の産生を可能にする。この実施例では、1つのCAR鎖は、インフレームでCD8ヒンジおよび膜貫通ドメインに連結されたCD22 scFv、4-1BB共刺激ドメイン、ならびにCD3ゼータ活性化ドメインで構成される。第2のCAR鎖は、タンデムCD20 CD19 scFvベースの標的化ドメイン、続いてCD8ヒンジおよび膜貫通ドメイン、CD28共刺激ドメイン、ならびにCD3ゼータ活性化ドメインで構成される。2つの設計は、CAR鎖の順序が異なり、例えば、1つの設計では、CD22 CARが、最初に、2Aエレメント、およびタンデム2019 CARが続き、逆もまた同様である(図10)。
最初に、EF1aプロモーターの制御下でCD19、CD20、およびCD22抗原を同時に標的化する4つの2シストロン性DuoCAR設計のセットを、上記に記載されるように、構築した(セット1、以下の表1)。
Figure 2023502503000002
DuoCARフォーマットにおけるCD22標的化CAR部分の最適な発現を容易にするために、CD22標的化CAR鎖を、CD22反応性scFv配列の16P8または16P17の1つに組み込んだ。CD22 scFv M971は、比較対照として使用され、非形質導入細胞(UTD)はCAR陰性対照としての役割を果たした。CD20-CD19標的化CAR鎖およびCD22標的化CAR鎖の共発現は、上記に記載されるように、2Aリボソームスキップ配列によって容易になった。個々にコードされるCAR鎖を、発現対照として含めた。健康なドナーからのヒト初代T細胞を、各DuoCARまたは単一のCAR対照をコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。T細胞培養増殖の終了の際に、CAR発現をフローサイトメトリーによって評価した。同じ細胞におけるタンデムCD20-CD19 CAR鎖およびCD22-CAR鎖の共発現を表すDuoCAR群(LTG2515、LTG2520、LTG2521)におけるCAR20CAR22二重陽性細胞のパーセンテージは、比較的低く、28%(LTG2515、LTG2520)~9%(LTG2521)の範囲であった(図11)。対照的に、個々のCAR対照の発現は、CD22標的化コンストラクト(LTG2200)について約72%、タンデムCD20-CD19標的化CAR(LTG 2228、図11)について約38%で、かなり高かった。次いで、DuoCARの機能性をサイトカイン放出アッセイにおいて試験した。対照のDuoCARエフェクター細胞を、10のエフェクター対標的比(E:T)で、Raji標的細胞と一晩混合した。インキュベーション期間の最後に、細胞培養上清を採取し、分泌されたT細胞サイトカインのIFNガンマ、TNFアルファ、およびIL-2について検定した(図12)。腫瘍標的細胞の非存在下の類似の条件下でインキュベートされたエフェクターを、自発的サイトカイン放出のための追加の対照として使用した。Raji腫瘍細胞とCARエフェクターとの共インキュベーションは、全てのコンストラクトについて、IFNガンマ、IL-2、およびTNFaの強い上方調節を生じた。特に、CARは、自発的にサイトカインを産生しなかった。しかし、図11において見られるように、サイトカイン分泌の高さは、陽性対照のCAR22 LGT2200と比較して、全てのDuoCARコンストラクトについてより低い傾向であり、タンデム2019 CAR LGT2228は、DuoCARの比較的中程度の発現による可能性がある。
単一CAR対照(図11、図12)と比較して中程度のDuoCAR発現およびサイトカイン応答は、大きなペイロードサイズが、本配置におけるDuoCAR発現の効率に有害な影響を与え得ることを示唆した。DuoCAR形質導入の効率を改善するために、選択DuoCAR配列を必要によりコドン再最適化し、発現カセットを、改善された2シストロン性発現のためのMSCV内部プロモーターの制御下で新しい発現骨格に再クローン化した(セット2、表1)。
レンチウイルスベクターを、各新DuoCARコンストラクトのために作製し、CAR T細胞を材料および方法に記載されるように、形質導入および増殖させた。DuoCAR発現は、フローサイトメトリーにより決定した。CD19+CD22+T細胞のパーセンテージは、DuoCARの2つの鎖を共発現する細胞を示す(図13)。ここで、高い形質導入効率は、DuoCARコンストラクトのD0044(MSCV_20-19-28z-2A-16p8-BBz)およびD0047(MSCV_16p8-BBz-2A-20-19-28z)について達成され、両方とも抗CD22 scFv 16P8を含む(図13、それぞれ、51%および45%)。予想外にも、比較対照のm971 CD22 scFvを含むDuoCARのD0043は、遠位の配向で十分に発現されたが(MSCV_20-19-28z-2A-m971-BBz、46%陽性)、逆の配向では発現を示さなかった(D0046、MSCV_m971-BBz-2A-20-19-28z)。したがって、DuoCAR設計に含まれるscFv配列の選択、ならびに配列のコドン最適化および発現骨格の選択は全て、最適なDuoCAR発現のために重大な意味を持つ。
DuoCARセット2形質導入T細胞の細胞傷害機能を、腫瘍抗原CD19、CD20、およびCD22の変化する発現によるパネル腫瘍株に対する一晩死滅アッセイにおいて検定した。全ての株を、ホタルルシフェラーゼを発現するように安定に形質導入し、死滅アッセイを、材料および方法に記載するように、行った。最初に、DuoCARを、CD19+CD20+CD22+と、非ホジキンリンパ腫のRaji、または急性リンパ芽球性白血病のReh細胞、またはCD19-CD20-CD22-のヒト胎児由来腎臓293T細胞株と混合した(図15)。CAR 20-19-28zおよびCD22 CAR 16p8-BBz CARを2シストロン的にコードするDuoCARのD0044およびD0047、ならびに単一のCAR 22対照のLTG2200、ならびにタンデムCAR対照の20-19 LTG1497だけでなく、非形質転換T細胞対照(UTD)も含めた(図14)。コンストラクトD0043、D0044、D0046、およびD0047は、簡素化のために、それぞれ、D43、D44、D46、およびD47と図の凡例に示す(図14)。エフェクターおよび標的細胞を、2.5、5、または10の比で、三連で一晩インキュベートし、次いで、プレートを、採取し、SteadyGlo試薬で展開し、生存している腫瘍細胞のルシフェラーゼ活性を、ルミノメトリーによって決定した。全体として、CAR細胞溶解機能は、DuoCAR発現と相関した(図13)。 DuoCARのD0047およびD0044は、陽性対照のDuoCARのD0043のように、CD19、CD20およびCD22三重陽性腫瘍株のRajiおよびRehを強力に溶解したが、準最適で発現されるコンストラクトD0046は、比較的低い溶解機能を有していた(図14)。CD19-CD20-CD22-三重陰性株の溶解は、いずれのCARコンストラクトによっても引き起こされず、同族抗原に対するCAR媒介溶解の特異性を強調した。
DuoCARコンストラクトの特異性をさらに描写するために、それぞれ、K19、K20、K22と呼ばれる、CD19、CD20、またはCD22抗原のいずれかを発現するトランスジェニックK562株を生成した(図15)。単一陽性腫瘍株による共インキュベーションアッセイにおいて、CD19、CD20、およびCD22を標的化するCAR鎖を特徴とするDuoCARのD44およびD47は、エフェクター対標的比依存性の様式で、各標的株を強力に溶解し、それらの機能において、比較対照であるDuoCARのD0043と類似していた(図の凡例中のコンストラクトの数字表示は、それぞれ、D0043、D0044、D0046、D0047からD43、D44、D46、およびD47に短縮した-図15)。タンデム2019 CAR(1497)を発現する対照T細胞は、腫瘍株K19およびK20を溶解したが、K22においてわずかなバックグラウンドの溶解効果のみを有していた(最も高い10のE:T比で10%未満の溶解)。単一CD22対照CARは、K22腫瘍細胞を強力に溶解したが、K20細胞において機能を有しておらず、K19細胞においてバックグラウンドの溶解のみを示した(最も高い10:1のE:Tで10%の溶解)。したがって、この実験系は、高精度で、各腫瘍抗原に対するCAR反応性の試験を可能にする。要約すると、DuoCARのD0044およびD0047は両方とも、それらの腫瘍標的化ドメインそれぞれが、この単一抗原発現試験系において機能的であることを実証した(図15)。
DuoCARコンストラクトのサイトカイン放出応答を特徴付けるために、DuoCAR T細胞調製物のD0044、D0047(図の凡例:それぞれ、D44、D47)それぞれとCD19+CD20+CD22+とを、Raji腫瘍細胞と10のE:T比で一晩混合し、培養上清を、T細胞サイトカインのIFNg、TNFa、およびIL-2について、ELISAによって分析した(図16)。単一CAR22コンストラクトのLTG2200、およびタンデム2019 CARコンストラクトのLTG2273を比較のために含め、陰性対照として非形質導入T細胞(UTD)を使用した。並行して、各群からのCAR T細胞を、腫瘍細胞の非存在下であるが類似の条件下でインキュベートして、自発的サイトカイン放出について試験した(図16)。コンストラクトは、サイトカインの自発的な放出を生じなかったが、DuoCARのD44およびD47は両方とも、Raji標的との共インキュベーション後に、これらのDuoCARコンストラクトの効力を強調する、IL-2、IFNg、およびTNFaの強い誘導を呈したことを見出した。特に、同じ細胞における2つの鎖の同時の共発現にもかかわらず、自発的サイトカイン放出の完全な非存在によって裏付けられるように、持続性シグナル伝達の証拠は検出されなかった(図16)。
3つの異なる腫瘍抗原CD19、CD20、CD22を標的化し、異なる優遇機能を有する共刺激ドメインを持つ2つのCAR鎖で構成される2シストロン性DuoCARの開発の成功を達成することで、課題は、類似するコンストラクトが他の手法によって生成され得るかどうかを問うた。同じORF内の別個のCAR鎖の2シストロン性発現の成功は、複数の最適化および改良のステップを必要とし、配列のそれぞれの新たなセットに独特である。対照的に、レンチウイルスベクターの製造の間またはCAR T形質導入の間に2つのCAR配列を組み合わせることは、より普遍的な手法、およびT細胞形質導入のための単一のレンチウイルス調製物を使用しながら、同じ細胞または同じT細胞集団において発現されるCARの組合せを創出するための高速の方法を提示し得る。この実施例では、DuoCAR手法におけるように、1つのCAR鎖は、インフレームでCD8ヒンジおよび膜貫通ドメインに連結されたCD22 scFv、4-1BB共刺激ドメイン、ならびにCD3ゼータ活性化ドメインで構成される。第2のCAR鎖は、タンデムCD20 CD19 scFvベースの標的化ドメイン、続いてCD8ヒンジおよび膜貫通ドメイン、CD28共刺激ドメイン、ならびにCD3ゼータ活性化ドメインで構成される(図17)。共トランスフェクション手法において、1つのCAR鎖をそれぞれコードする2つの移入プラスミドを、標準プロトコールに従って(材料および方法を参照されたい)、一緒に混合し、ベクター産生ステップの間にヘルパープラスミドと組み合わせる。得られるレンチウイルス調製物は、このようにして、2つのCAR鎖の混合物をコードする。この手法を使用して、2つのCAR鎖を同時にコードするレンチウイルス調製物のセットを生成した(以下の表2)。
Figure 2023502503000003
MSCVプロモーターの制御下のscFv 16P17、16P8、16P13 CAR22-4-1BB-CD3ゼータ(それぞれ、D1、D2、D3)、およびMSCVの制御下のタンデムCAR2019-28-CD3ゼータ(LTG 2273)を利用するCAR22のための移入プラスミドを構築した。各CAR鎖を単独でコードするレンチウイルスベクターを、並行して産生した。全てのDuoCAR共トランスフェクション調製物について高力価(1010TU/ml、示さない)が日常的に達成され、この手法の効率性を強調した。
DuoCAR機能を最適化するために、scFv 16P17、16P8、および16P13で構成される一連のCAR22コンストラクトを、MSCVプロモーターの制御下で設計し(それぞれ、コンストラクトD1、D2、D3)、DuoCAR共トランスフェクションの組合せのためにMSCVプロモーターによっても駆動されるタンデムCAR 2019(LTG2273)を使用した(表2および図18)。レンチウイルスベクターを、CD22 CARプラスミドのうち1つとのLTG2273の共トランスフェクションによって調製し、高い感染力価を与えた(示さない)。各LVを、健康なドナーT細胞の形質導入のために、20の感染多重度(MOI)で使用し、CAR発現をフローサイトメトリーによって決定した(図18)。単一CAR対照をコードするLVで形質導入された全ての対照群は、高いCAR発現を与えた(D1について45%、D2について82%、D3について82%、2273について87%(示さない))。驚くべきことに、かつ予想外にも、共トランスフェクションの組合せにおいて、群D2+73およびD3+73は、2つのCAR鎖の効率的でほぼ同一の共発現を与えたが(51%)、D1+73の組合せは、共発現しなかった(2.8% CAR+)、図18。これらのDuoCARが溶解機能を持つかどうかを決定するために、腫瘍株のパネルにおける各群からのCAR T細胞を試験した(図19、群D1+2273、D2+2273、D3+2273のラベルにおいて、「D」は簡素化のために省略した)。全てのDuoCAR調製物は、三重陽性腫瘍株のRajiおよびRehを効率的に溶解したが、三重陰性株の293Tは溶解せず、DuoCARの特異性を裏付けた(図19A)。加えて、全てのDuoCARは、単一抗原の腫瘍株K19、K20、およびK22に対するバックグラウンドを上回る溶解機能を示したが、不一致の標的化ドメインを有する単一対照CARは、特異的溶解を示さなかった:K19においてD1からD3;K20においてD1からD3、K22において2273を参照されたい(図19B)。次いで、特異的腫瘍標的との共インキュベーションの際にサイトカインを誘導するDuoCARの能力を検定した。(図20;群D1+2273、D2+2273、D3+2273のラベルにおいて、「D」は簡素化のために省略した)。DuoCAR T細胞、単一CAR対照、および非形質導入T細胞(UTD)を、三重CD19+CD20+CD22+のRaji腫瘍細胞と混合し、一晩インキュベートした。並行して、腫瘍非存在下のCAR T細胞を、類似の条件下でインキュベートして、自発的サイトカイン放出を除外した。インキュベーション期間の最後に、培養上清を、サイトカインのIFNg、TNFa、およびIL-2について、ELISAによって検定した(図20)。全てのCAR群は、Rajiとの共インキュベーションの際に、高いIFNgレベルを生じた。一部の単一CD22 CAR対照は、中程度の自発的IFNg放出を有していたが(D2、D3)、DuoCARは自発的にIFNgを産生せず、DuoCARについての潜在的に高い安全域を示唆した。IL-2およびTNFa発現も、CAR 2272を除いて、全てのCAR群において、Rajiの共インキュベーションによって高く誘導された(図20)。
要約すると、LV調製、およびT細胞形質導入における生じるLV調製物の適用の間の個々のCAR鎖の共トランスフェクションによる、機能的で高特異的なDuoCARの生成が本明細書に記載される。さらに、単一標的抗原(K19、K20、K22)のみを発現するトランスジェニック細胞株を使用して、CAR標的化ドメインそれぞれが、機能的であり、標的発現腫瘍細胞に対してDuoCAR機能を惹起することができることを実証した。驚くべきことに、かつ予想外にも、わずかな組合せのみが、堅固なCAR発現および強力な細胞傷害機能の両方を実証することが可能であり、したがって、DuoCAR設計は、自明なものではない。
実施例5
2シストロン性DuoCARは、リンパ腫腫瘍を強力に根絶させる。
実施例5において使用される材料および方法:
(a)細胞株
バーキットリンパ腫細胞株であるRaji、および慢性骨髄性白血病株K562は、American Tissue Culture Collection (ATCC、Manassass、VA)から購入した。REH白血病株は、DSMZ(Leibniz Institute DSMZ、Braunschwieg、ドイツ国)から購入した。細胞は、10%の熱不活化ウシ胎児血清(FBS、Hyclone、Logan、UT)および2mMのL-Glutamax(Thermo Fisher Scientific、Grand Island、NY)で補充したRPMI-1640培地において培養した。ヒト胎児由来腎臓株293Tは、ATCCから購入した(Gibco/Thermo Fisher Scientific、Grand Island、NY)。野生型腫瘍株に、ホタルルシフェラーゼをコードするレンチウイルスベクター(Lentigen Technology,Inc.、Gaithersburg、MD)を安定に形質導入した後、クローン化し、ルシフェラーゼ陽性クローンを選択することにより、ルシフェラーゼ発現細胞株の単一細胞クローンを生成した。Raji 13G11クローンは、ルシフェラーゼが形質導入されたRaji細胞をマウスにおいて継代することにより生成し、その増殖能力について選択した。Oklahoma Blood Institute(OBI)において、書面によるドナーの同意を得て、健康なボランティアから全血が採取された。加工されたバフィーコートをOBI(Oklahoma City、OK)から購入した。CD4およびCD8マイクロビーズ(Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、Germany)の1:1混合物を製造業者のプロトコールに従って使用する正の選択によって、バフィーコートからCD4陽性およびCD8陽性ヒトT細胞を精製した。
(b)キメラ抗原受容体(CAR)の創出-発現ベクター
DuoCARコンストラクトを、1つのタンデムCD19およびCD20標的化CAR、ならびに1つの単一CD22標的化CARの2シストロン性配列組み込みとして設計した。同じmRNA鋳型からの2つのCARコンストラクトの2シストロン性発現は、リボソームスキップエレメント2Aによって容易になった。CAR抗原結合シグナルおよびタンデムドメインは、ヒト抗CD22単鎖可変断片(ScFv)、または以前に記載されたタンデム20-19標的化scFv(Schneider、D.ら、(2017年).Journal for immunotherapy of cancer、5巻(1号)、42頁)に由来した。CAR Tコード配列を、バインダー配列を、インフレームでCD8a連結および膜貫通ドメイン(aa123~191、Ref配列ID NP_001759.3)に連結させることによって生成した。CARコンストラクトのC末端セグメントは、CD3ゼータシグナル伝達ドメイン(CD247、aa52~163、Ref配列ID: NP_000725.1)を含んでいた。一部の設計は、ヒト4-1BB、ICOS、OX40、またはCD27タンパク質に由来する共刺激ドメインも含んでいた。CARコンストラクト配列を、第3世代のレンチウイルスプラスミド骨格(Lentigen Technology Inc.、Gaithersburg、MD)にクローニングした。HEK 293T細胞の一過性トランスフェクションによりレンチウイルスベクター(LV)を含む上清を生成し、レンチウイルスベクターを含む上清を遠心処理することによってベクターをペレットにして、-80℃で保管した。
(c)初代T細胞精製および形質導入
製造業者(Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、Germany)のプロトコールに従うCD4およびCD8細胞の免疫磁性ビーズ選択を使用して、全血またはバフィーコート(書面によるドナーの同意を有する民間提供者から購入)から、健康なボランティア由来のヒト初代T細胞を精製した。T細胞を、200IU/mlのIL-2を添加したTexMACS培地で、0.3~2×10細胞/mlの密度で培養し、CD3/CD28 MACS(登録商標)GMP T Cell TransAct試薬(Miltenyi Biotec)で活性化し、2日目に、10ug/mlの硫酸プロタミン(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)の存在下で、CARコンストラクトをコードするレンチウイルスベクターを一晩形質導入し、3日目に培地を交換した。200IU/mlのIL-2を添加したTexMACS培地において、8~10日目の採取まで、培養物を繁殖させた。
(d)免疫エフェクターアッセイ(CTLおよびサイトカイン)
細胞媒介性の細胞傷害性を決定するため(CTLアッセイ)、ホタルルシフェラーゼが安定に形質導入された標的細胞5,000個を種々のエフェクター対標的比でCAR T細胞と合わせ、一晩インキュベートした。SteadyGlo試薬(Promega、Madison WI)を各ウェルに添加し、生じた発光を秒あたりのカウントとして定量化した(試料CPS)。標的のみのウェル(最大CPS)および1%Tween-20を加えた標的のみのウェル(最小CPS)を使用して、アッセイ範囲を決定した。特異的な溶解パーセントを、(1-(試料CPS-最小CPS)/(最大CPS-最小CPS))として算出した。10:1のE:T比の共培養物からの上清を取り出し、ELISA(eBioscience、San Diego、CA)によって、IFNγ、TNFα、およびIL-2濃度について分析した。
(e)フローサイトメトリー分析
細胞染色では、CAR T形質導入細胞50万個を培養物から採取し、0.5%のウシ血清アルブミン(Miltenyi Biotec)で補充した低温のAutoMACS緩衝液中で2回洗浄し、CD19-FcおよびCD20-ビオチンまたはCD19-FcおよびCD22-Hisペプチドに続いて二次ペプチド特異的蛍光コンジュゲート(Jackson ImmunoResearch、West Grove、PA)で染色することにより、CAR表面発現を検出した。供給業者のプロトコールにより、表示があった場合は、VioBlueフルオロフォアにコンジュゲートされた抗CD4抗体(Miltenyi Biotec)を使用した。陰性対照として非形質導入細胞を使用した。全ての研究で、死滅した細胞は7AAD染色(BD Biosciences、San Jose、CA)により除外した。細胞を2回洗浄し、フローサイトメトリーによる定量分析前に染色緩衝液200ulで再懸濁させた。MACSQuant(登録商標)10 Analyzer(Miltenyi Biotec)でフローサイトメトリー分析を実施し、FlowJoソフトウェア(Ashland、OR)を使用してデータプロットを作成した。
CD19、CD20、CD22を標的化する三価DuoCARの生成
三価DuoCARを、タンデム2019標的化CAR鎖を22標的化CAR鎖にP2Aリボソームスキップエレメントにより連結することによって構築した。4つの異なるDuoCARコンストラクトを、最適化共形質導入実験において前に同定された最良の組合せに基づいて設計した。最適化研究は、41BB、CD28、OX40、ICOS、もしくはCD27共刺激ドメインを含むか、または共刺激ドメインを含まない各CAR部分(即ち、CD20/19タンデムCARおよびCD22単一CAR)を、単独または組み合わせて試験することを含んでいた。試験される特異的パラメーターは、CAR発現レベルおよびin vitro抗腫瘍活性であった。D93、D94、D95、およびD96と呼ばれるDuoCARコンストラクトの構造を、図21Aに示す。DuoCARコンストラクトのD93は、B細胞抗原CD19およびCD20を標的化するタンデムscFvバインダードメイン、CD8由来のヒンジおよび膜貫通ドメイン、続いてICOS共刺激ドメイン、ならびにCD3ζ活性化ドメインで構成された。このCARコンストラクト配列は、P2Aリボソームスキップエレメントにより、CD22を標的化する第1世代CARに連結され、このようにして、2シストロン性の三重標的化DuoCARを創出した(図21)。2Aリボソームスキップエレメントの使用は、以下のCARの特質を確実にする:(i)均一な細胞産物の産生、および(ii)個々の細胞内での2つのCAR部分の化学量論的に等しい発現;その組合せが最適な抗腫瘍機能を達成する。DuoCARコンストラクトのD94は、ICOS共刺激ドメインをOX40ドメインで置換したこと除いて、D93と同一であった。コンストラクトD95は、D94のものと同一であるCD20およびCD19タンデム標的化OX40z CAR鎖、続いて第2世代のCD22 CAR鎖とICOS共刺激ドメイン、ならびにCD3ζ活性化ドメインで構成された。最後に、DuoCARコンストラクトのD96は、CD27共刺激ドメインを有するCD20およびCD19タンデム標的化CAR鎖、続いてCD22標的化単一CAR鎖とICOS共刺激ドメインと各CD3ζ活性化ドメインを含んでいた(図21A)。DuoCARコンストラクトは、レンチウイルスベクターにコードされ、ヒト初代T細胞に形質導入された。DuoCARは、3つの異なるコンストラクトおよびドナーの間で30%~70%のCAR T+細胞の範囲で、T細胞において堅固に発現された(図22A、22B)。
加えて、単一標的化CARおよびタンデム標的化CARを含むいくつかの対照CARコンストラクトを構築した(図21A)。単一標的化CARは、抗CD22 scFv、抗CD19 scFv、または抗CD20 scFvのいずれか、続いてCD3z活性化ドメインに直接連結されるか(D92、CAR22、第1世代)、または共刺激ドメインも組み込む(D89、1538、1495、第2世代)かのいずれかのCD8ヒンジおよび膜貫通ドメインを含んでいた、図21A。1497 CARと呼ばれるCD20およびCD19を標的化するタンデム対照CARは、CD8ヒンジおよび膜貫通ドメイン、4-1BB共刺激ドメイン、ならびにCD3z活性化ドメインにインフレームで連結されたタンデムCD20-CD19 scFvで構成された。タンデム対照コンストラクトのD88、D90、D91は、4-1BB共刺激ドメインの、それぞれ、ICOS、OX40、またはCD27ドメインによる置換を除いて、タンデムCAR 1497として設計された(示さない)。これらのコンストラクトは、3つ全ての抗原CD19、CD20、およびCD22を発現する未改変腫瘍に対する抗腫瘍活性を示すが、DuoCARのD93、D94、D95、およびD96とは対照的に、タンデムコンストラクトは、CD19およびCD20に対して二重陰性の腫瘍細胞の抗原逃避を防ぐことができない。T細胞内のCAR鎖のポジショニングおよび組成を、図21Bにおいて、DuoCAR、タンデムCAR、ならびに第1世代および第2世代の単一CAR T細胞について模式的に示す。全ての単一およびタンデムCARコンストラクトは、レンチウイルス形質導入によって、ヒト初代T細胞において堅固な発現を達成した。
DuoCARは、in vitroで、腫瘍標的を強力かつ特異的に溶解する
構築されたDuoCARの機能性を評価するために、構築されたDuoCARを、一晩死滅アッセイのために、ルシフェラーゼ発現標的腫瘍株と混合した。抗原陽性株のNHL株Raji(CD19+CD20+CD22+)、およびB-ALL株Reh(CD19+CD20lowCD22+)を使用して、抗原特異的な様式で、腫瘍細胞を溶解するDuoCARの能力を試験した。両方ともCD19-CD20-CD22-である陰性対照株の骨髄性白血病K562およびヒト胎児由来腎臓細胞株293Tも含めた(図23)。
タンデムCARの1497、ならびに単一CAR対照のD89およびD92、第2および第1世代のCD22標的化CARは、それぞれ、比較のために含めた。
CAR T細胞および標的細胞を、10:1、5:1、または2.5:1のエフェクター対標的(E:T)比で混合し、インキュベーション期間の終了時に、特異的溶解を、材料および方法に記載されるように、各条件について算出した。
全ての単一およびタンデムCARは、E:T依存性の様式で、標的陽性腫瘍株のRajiおよびRehを溶解した(図23A、23B)。DuoCARコンストラクトは、全てのE:T比で、標的化抗原CD19、CD20、およびCD22を発現する標的細胞株を強力に溶解した(図23A、23B)。CD19およびCD20抗原を標的化するタンデム対照CAR 1497は、Raji細胞におけるDuoCARのD93、D94、D95、およびD96と比較して、試験されたE:T比で、比較的中程度の腫瘍溶解をもたらした(図23A)。比較すると、Reh細胞において、1497の溶解効力は、DuoCARのD93、D94、D95、およびD96の溶解効力と同様であった(図23B)。単一標的化CAR22コンストラクトのD89およびD92は、CD22抗原陽性標的株のRajiおよびRehに対して、最も強力な腫瘍細胞キラーである傾向であった。対照的に、最も高い10のE:T比で27%の非特異的溶解を生じるK562細胞における単一標的化CAR22コンストラクトのD92を除いて(図23C)、DuoCARコンストラクトまたは対照は、標的陰性腫瘍株のK562および293Tを溶解しなかった(図23C、23D)。したがって、DuoCARは、抗原陽性標的株の溶解において、1497タンデムコンストラクトと、同様に良好な性能であるか、またはそれよりも優れており、抗原陰性株においてバックグラウンドの溶解を生じず、抗原依存性を実証した。特に、K562細胞における単一CAR 22、D92の非特異的溶解活性にもかかわらず、DuoCARコンストラクトのD1およびD2へのD92配列の組み込みは、DuoCARによる非特異的標的溶解をもたらさない。したがって、DuoCAR設計は、第1世代のCAR D92において見られる望ましくない自発的溶解活性を弱めると思われる(図23C)。
DuoCARのサイトカイン応答
標的細胞に応答するDuoCARのサイトカイン産生を特徴付けるために、上清を、一晩のインキュベーション後、DuoCARのCD19+CD20+CD22+ Raji標的細胞との共培養物から収集した。培養上清中のT細胞の炎症促進性および恒常性サイトカインであるIL-2、IFNγ、およびTNFαの濃度を、ELISAによって決定した(図24、青色のバー)。CAR陰性対照として、同じドナーおよびバッチからの非形質導入T細胞(UTD)を含めた。さらに、作動させる標的細胞の非存在下でCAR T細胞による可能性がある自発的サイトカイン放出のための対照に、各CAR T細胞群を、Raji標的なしでもインキュベートした(図24、薄灰色のバー)。DuoCAR、ならびに単一およびタンデム対照CARは、UTDと比較して、標的Raji細胞に応答して、IL-2、IFNγ、およびTNFαの産生を強く誘導したが、しかし、DuoCAR株またはCAR対照は、標的細胞の非存在下で、これらの可溶性因子の自発的放出の傾向はなかった(図24)。
DuoCARは、in vivoでCD19+CD20+CD22 Raji腫瘍を効率的に溶解する
in vitroで抗原陽性標的細胞に対するDuoCARの細胞傷害性およびサイトカイン放出機能性を確立し、次いで、DuoCAR機能を、in vivoで実証した。ホタルルシフェラーゼで安定に形質導入されたRaji細胞のNSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)マウス異種移植を利用した。DuoCARのD93、D94、D95、およびD96だけでなく、タンデム対照CARの1497、ならびに単一対照のD89およびD92を含めた(図25A)。腫瘍保持マウスに、研究7日目に、CAR T細胞500万個、またはそれぞれCAT T細胞200万個、または用量を一致させたUTD対照のいずれかを投与し、腫瘍拒絶を、研究28日目まで、定期的に生物発光イメージングによって測定した(図25Aおよび25B)。マウス当たり500万個の細胞の高CAR T用量レジメンにおいて、DuoCARは、14日目以降、Raji腫瘍の進行を強力に抑制したが、腫瘍単独群(TA)、および非形質導入T細胞群(UTD)における腫瘍は、衰えることなく進行した。TAおよびUTD陰性対照と比較して、DuoCARならびに単一およびタンデムCAR対照によって媒介される腫瘍抑制は、統計学的に有意であった。DuoCARのD93、ならびに単一CARのD89およびD92は、研究期間にわたって、最も高い腫瘍縮小を生じる傾向であったが、DuoCARのD95、およびタンデムCARの1497は、CARコンストラクトのなかで、最も効力が低い傾向であった。しかし、この投薬量レベルでの個々のCARコンストラクトの間の差は、統計学的に有意ではなかった(図25A)。DuoCARコンストラクト間の小さな相違をより良く指摘するため、およびそれらが低用量レジメンで機能し続けるかどうかを試験するために、Raji保持マウスに、それぞれのCAR T細胞200万個を投与した(図25B)。低CAR T用量にもかかわらず、全てのCARコンストラクトは、このレベルのTAおよびUTD対照と比較して、Raji腫瘍量を有意に制御した。DuoCARコンストラクトまたは対照CARは、他のCARよりも有意に良好ではなかったが、DuoCARのD93およびD94は、良好な腫瘍制御を維持する傾向であり、DuoCARのD96は、他のCARよりも効力が低い傾向であった(図25B)。注目すべきは、タンデムCAR群の1497における腫瘍縮小は、DuoCARのD93~D96と比較して、遅いと思われ、この状況において、DuoCARコンストラクトの可能性がある優位性を示唆した(図25B)。加えて、単一CARのD92は、高い効力と一致して、他のCARコンストラクトよりも速く腫瘍量を低減する傾向であったが、抗原陽性および抗原陰性の腫瘍標的株に対するin vitro細胞傷害実験において、このコンストラクトについてより低い特異性も観察された(図23)。
三重特異性DuoCARは、抗腫瘍機能のために単一抗原のみを必要とし、CD19、CD20、またはCD22のいずれかの腫瘍抗原喪失のモデルにおいて、抗原が消去された標的細胞を強力に死滅させる。
DuoCARがCD19+CD20+CD22+の強力な拒絶を媒介したことを実証したことで、in vivoの野生型Raji異種移植は、200万個のCAR T+細胞/マウスの低用量レジメンでさえ、DuoCARの活性化を引き起こす各単一抗原の十分性が、in vitroで検証された。この実験に含まれるCARコンストラクトを図21Aに模式的に示す。実験群は、DuoCARのD93、D94、D95、およびD96、タンデムCAR対照の1497、ならびにそれぞれ、CD22、CD19およびCD20抗原を標的化する単一CAR対照のD92、1538、および1495を含んでいた(図26)。
DuoCARは、論理的[OR]ゲートコンストラクトとして機能すると推定され、例えば、3つの標的化抗原のうちいずれか1つまたは複数の存在は、CAR活性化および抗腫瘍機能を引き起こすために十分である。次いで、3つの反応性のそれぞれが、DuoCARのD93、D93、D95、およびD96において無傷であることを確認した。この目的で、B細胞表面分子を天然で欠いているA431扁平上皮癌株を、CD19、またはCD20、またはCD22のいずれかを安定に発現するように操作した。腫瘍溶解の定量化を容易にするために、各標的A431株は、ホタルルシフェラーゼも安定に発現した。DuoCAR T細胞および対照CARを、1つの抗原のみを発現するA431クローンのそれぞれに対するin vitro細胞傷害アッセイにおいて試験し、親A431の親株を、標的陰性の対照として含めた(図26A~26D)。
DuoCARのD93、D93、D95、およびD96は、CD19(図26A)、CD20(図26B)、またはCD22(図26C)の単一抗原のみをそれぞれ発現する腫瘍を効率的に溶解したが、これらの標的分子の発現を欠く親株A431は溶解しなかった(図26D)。同族抗原発現を有する標的細胞のDuoCARによる腫瘍溶解は、エフェクター対標的比に依存し、DuoCARコンストラクトの詳細な特異性を実証した。予想通り、単一CARは、そのクローンが標的化抗原の発現を欠く場合に、標的クローンを溶解できなかった。株A19は、単一CARの19、1538によって溶解されたが、単一CAR標的化CD22-D92、または標的化CD20を-1495によって溶解されなかった(図26A)。同様に、標的株A20は、CAR20 1495によって溶解されたが、単一CARのCD22-D92またはCD19 CAR-1538によって溶解されなかった(図26B)。さらに、それぞれ、CD19およびCD20標的化CARの1538および1495ではないが、CD22標的化単一CARのD92およびD89のみ、A22標的株を溶解した(図26C)。この腫瘍株におけるCD19、CD20、またはCD22の発現の欠如と一致して、コンストラクトは親株A431を溶解しなかった(図26D)。したがって、DuoCARは、他の2つの抗原とは無関係に、単離された形態で、標的抗原CD19、CD20、CD22のうちそれぞれ1つと反応性であった。さらに、単離物中の各単一抗原CD19、CD20、またはCD22の存在は、DuoCARの機能を引き起こすのに十分であった。
次いで、腫瘍抗原逃避のモデルであるCD19、CD20、またはCD22のいずれかの消去された発現を有するRajiクローンにおいて、DuoCARは、3つの標的化分子のいずれか1つの欠如にもかかわらず、標的細胞を溶解することができ(図26E~26G)、溶解の大きさは、3つ全ての抗原の発現が無傷であった親Raji株のDuoCAR溶解と同等であった(図26H)。対照的に、単一標的化CARは、それらの毒族標的が存在したクローンに対してのみ溶解性であった。具体的には、単一CARの20および22、D92および1495は、単一CARの19、1538ではそうではないが、Raji 19KOを溶解し(図26E)、単一CARの19およびCAR22は、CAR 20はそうではないが、Raji 20KOを溶解し(図26F)、単一CARの19および20は、CAR22はそうではないが、Raji 22 KO株を溶解した(図26G)。比較すると、単一CAR対照のD92、1538、または1495は、3つ全ての標的抗原を発現する親Rajiクローンの溶解においてどんな影響も示さなかった(図26H)。これらの結果は、標的化抗原の1つの発現を欠く標的化腫瘍細胞におけるDuoCARの優位性を実証する。
標的化抗原のうち1つまたは複数の発現が、減少または完全に消失する場合の腫瘍抗原逃避、および腫瘍の不均一性、一方で、単一薬剤/CARは、標的化抗原の不均一な発現により、腫瘍細胞集団をその全体的に標的化することができず、CAR T免疫療法の大きな障害のままである。それらの標的抗原の一部の発現を失った腫瘍と戦うDuoCARの能力を実証するために、異種の異種移植腫瘍モデルを作製した(図27)。NSGマウスに、ルシフェラーゼ陽性の抗原欠失Rajiクローン:Raji 19KO、Raji 20KO、Raji 22KO、および親Rajiクローンの等しい割合の混合物を移植した。腫瘍移植の7日後、マウスを、500万個のCAR T+DuoCAR細胞、またはCD19、CD20、もしくはCD22を標的化する単一CAR対照で処置した。腫瘍量を、生物発光によって測定した。際立って、研究の14日目以降に始まって、DuoCARのD93、D94、D95、またはD96は、異種Raji腫瘍を完全に拒絶した。対照的に、単一標的化CARのCAR19-1538、CAR20-1495、またはCAR22-D92を受けているマウスにおいて、腫瘍は成長を続けた(図27)。
要約すると、高機能的な三重標的化CAR T細胞の産生が可能な4つの新規なDuoCAR設計のD93、D94、D95、およびD96が本明細書に記載される。DuoCAR T細胞は、高特異性で、in vitroおよびin vivoで、CD19、CD20、およびCD22抗原に対して反応性であり、CD19、CD20、およびCD22の異なる発現を有する散在性in vivo異種移植Raji腫瘍モデルにおける極めて強力な機能および完全な腫瘍拒絶を実証したが、単一標的化CARは、腫瘍抗原逃避のこのモデルにおいて、腫瘍の進行を防ぐことができなかった。したがって、DuoCAR T細胞は、抗原不均一な腫瘍集団に立ち向かい、腫瘍抗原逃避を軽減するための新規な解決手段を提示し、このようにして、CAR T処置患者集団における臨床転帰を改善する機会を提供する。
配列表に対する言及
本出願は、「配列表」というタイトルのPDFファイルにより、米国特許商標庁受理官庁に電子的に提出された配列表を含む。配列表は参照により組み込まれる。
本開示の配列
以下に列挙する核酸およびアミノ酸配列は、37C.F.R.1.822で規定されるように、ヌクレオチド塩基用の標準的な略語、およびアミノ酸用の3文字コードを使用して示される。各核酸配列のうち一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は、示される鎖を参照することによって含まれるものと理解される。添付の配列表では:
配列番号1は、CD20反応性scFv結合性ドメイン(LTG1495)のヌクレオチド配列である。
GAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAA
配列番号2は、CD20反応性scFv結合性ドメイン(LTG1495)のアミノ酸配列である。
EVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIK
配列番号3は、CAR LTG1495(LP-1495-CD8 TM-41BB-CD3ゼータ)のヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号4は、CAR LTG1495(LP-1495-CD8 TM-41BB-CD3ゼータ)のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号5は、リーダー/シグナルペプチド配列のヌクレオチド配列である。
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCG
配列番号6は、リーダー/シグナルペプチド配列のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
配列番号7は、CD22反応性scFv結合性ドメイン(LTG2200)のヌクレオチド配列である。
CAGGTACAGCTCCAGCAGAGTGGCCCAGGGCTCGTGAAGCCAAGCCAGACGCTGTCCCTGACTTGTGCAATTTCAGGGGATTCAGTTTCATCAAATAGCGCGGCGTGGAATTGGATTCGACAATCTCCTTCCCGAGGGTTGGAATGGCTTGGACGAACATATTACAGATCCAAATGGTATAACGACTATGCGGTATCAGTAAAGTCAAGAATAACCATTAACCCCGACACAAGCAAGAACCAATTCTCTTTGCAGCTTAACTCTGTCACGCCAGAAGACACGGCAGTCTATTATTGCGCTCGCGAGGTAACGGGTGACCTGGAAGACGCTTTTGACATTTGGGGGCAGGGTACGATGGTGACAGTCAGTTCAGGGGGCGGTGGGAGTGGGGGAGGGGGTAGCGGGGGGGGAGGGTCAGACATTCAGATGACCCAGTCCCCTTCATCCTTGTCTGCCTCCGTCGGTGACAGGGTGACAATAACATGCAGAGCAAGCCAAACAATCTGGAGCTATCTCAACTGGTACCAGCAGCGACCAGGAAAAGCGCCAAACCTGCTGATTTACGCTGCTTCCTCCCTCCAATCAGGCGTGCCTAGTAGATTTAGCGGTAGGGGCTCCGGCACCGATTTTACGCTCACTATAAGCTCTCTTCAAGCAGAAGATTTTGCGACTTATTACTGCCAGCAGTCCTATAGTATACCTCAGACTTTCGGACAGGGTACCAAGTTGGAGATTAAGGCGGCCGCA
配列番号8は、CD22反応性scFv結合性ドメイン(LTG2200)のアミノ酸配列である。
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKAAA
配列番号9は、CAR LTG2200(LP-2200-CD8 TM-41BB-CD3ゼータ)のヌクレオチド配列である。
ATGCTTCTTTTGGTGACTTCCCTTTTGCTGTGCGAGTTGCCACACCCCGCCTTCCTGCTTATTCCCCAGGTACAGCTCCAGCAGAGTGGCCCAGGGCTCGTGAAGCCAAGCCAGACGCTGTCCCTGACTTGTGCAATTTCAGGGGATTCAGTTTCATCAAATAGCGCGGCGTGGAATTGGATTCGACAATCTCCTTCCCGAGGGTTGGAATGGCTTGGACGAACATATTACAGATCCAAATGGTATAACGACTATGCGGTATCAGTAAAGTCAAGAATAACCATTAACCCCGACACAAGCAAGAACCAATTCTCTTTGCAGCTTAACTCTGTCACGCCAGAAGACACGGCAGTCTATTATTGCGCTCGCGAGGTAACGGGTGACCTGGAAGACGCTTTTGACATTTGGGGGCAGGGTACGATGGTGACAGTCAGTTCAGGGGGCGGTGGGAGTGGGGGAGGGGGTAGCGGGGGGGGAGGGTCAGACATTCAGATGACCCAGTCCCCTTCATCCTTGTCTGCCTCCGTCGGTGACAGGGTGACAATAACATGCAGAGCAAGCCAAACAATCTGGAGCTATCTCAACTGGTACCAGCAGCGACCAGGAAAAGCGCCAAACCTGCTGATTTACGCTGCTTCCTCCCTCCAATCAGGCGTGCCTAGTAGATTTAGCGGTAGGGGCTCCGGCACCGATTTTACGCTCACTATAAGCTCTCTTCAAGCAGAAGATTTTGCGACTTATTACTGCCAGCAGTCCTATAGTATACCTCAGACTTTCGGACAGGGTACCAAGTTGGAGATTAAGGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号10は、CAR LTG2200(LP-2200-CD8 TM-41BB-CD3ゼータ)のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号11は、DNA CD8膜貫通ドメインのヌクレオチド配列である。
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
配列番号12は、CD8膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
IWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
配列番号13は、DNA CD8ヒンジドメインのヌクレオチド配列である。
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTAC
配列番号14は、CD8ヒンジドメインのアミノ酸配列である。
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY
配列番号15は、アミノ酸番号137~206のヒンジおよびCD8アルファの膜貫通領域のアミノ酸配列(NCBI RefSeq:NP-001759.3)である。
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
配列番号16は、ヒトIgG CL配列のアミノ酸配列である。
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
配列番号17は、4-1BBのDNAシグナル伝達ドメインのヌクレオチド配列である。
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
配列番号18は、4-1BBのシグナル伝達ドメインのアミノ酸配列である。
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
配列番号19は、CD3-ゼータのDNAシグナル伝達ドメインのヌクレオチド配列である。
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
配列番号20は、CD3ゼータのアミノ酸配列である。
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号21は、CAR LTG1562(LP-CD19バインダー-CD8リンカー-CD4tm-4-1BB-CD3-ゼータ)のヌクレオチド配列である。
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCGGATATTCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCGAGCCTGGGCGATCGCGTGACCATTAGCTGCCGCGCGAGCCAGGATATTAGCAAATATCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGATGGCACCGTGAAACTGCTGATTTATCATACCAGCCGCCTGCATAGCGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTATAGCCTGACCATTAGCAACCTGGAACAGGAAGATATTGCGACCTATTTTTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCGTATACCTTTGGCGGCGGCACCAAACTGGAAATTACCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAAGTGAAACTGCAGGAAAGCGGCCCGGGCCTGGTGGCGCCGAGCCAGAGCCTGAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCGGATTATGGCGTGAGCTGGATTCGCCAGCCGCCGCGCAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGGGCAGCGAAACCACCTATTATAACAGCGCGCTGAAAAGCCGCCTGACCATTATTAAAGATAACAGCAAAAGCCAGGTGTTTCTGAAAATGAACAGCCTGCAGACCGATGATACCGCGATTTATTATTGCGCGAAACATTATTATTATGGCGGCAGCTATGCGATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGCGCGGCGGCGCCGGCGCCGCGCCCGCCGACCCCGGCGCCGACCATTGCGAGCCAGCCGCTGAGCCTGCGCCCGGAAGCGTGCCGCCCGGCGGCGGGCGGCGCGGTGCATACCCGCGGCCTGGATTTTGTGCAGCCGATGGCGCTGATTGTGCTGGGCGGCGTGGCGGGCCTGCTGCTGTTTATTGGCCTGGGCATTTTTTTTTGCGTGCGCTGCCGCCCGCGCCGCAAAAAACTGCTGTATATTTTTAAACAGCCGTTTATGCGCCCGGTGCAGACCACCCAGGAAGAAGATGGCTGCAGCTGCCGCTTTCCGGAAGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTTAGCCGCAGCGCGGATGCGCCGGCGTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAACTGAACCTGGGCCGCCGCGAAGAATATGATGTGCTGGATAAACGCCGCGGCCGCGATCCGGAAATGGGCGGCAAACCGCGCCGCAAAAACCCGCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGATAAAATGGCGGAAGCGTATAGCGAAATTGGCATGAAAGGCGAACGCCGCCGCGGCAAAGGCCATGATGGCCTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCGACCAAAGATACCTATGATGCGCTGCATATGCAGGCGCTGCCGCCGCGC
配列番号22は、CAR LTG1562(LP-CD19バインダー-CD8リンク-CD4tm-41BB-CD3ゼータ)のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFVQPMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRCRPRRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号23は、CD20_19反応性scFv結合性ドメイン(LTG1497二重特異性バインダー)のヌクレオチド配列である。
GAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCA
配列番号24は、CD20_19反応性scFv結合性ドメイン(LTG1497二重特異性バインダー)のアミノ酸配列である。
EVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAA
配列番号25は、CAR LTG1497(LP-LTG1497-CD8 TM-41BB-CD3ゼータ)または(LP-CD20 VH-(GGGGS)-CD20 VL-(GGGGS)-CD19VL-Whitlowリンカー-CD19 VH-CD8ヒンジ+TM-41BB-CD3ゼータ)のヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号26は、CAR LTG1497(LP-LTG1497-CD8 TM-41BB-CD3ゼータ)または(LP-CD20 VH(GGGGS)-CD20 VL-(GGGGS)-CD19VL-Whitlowリンカー-CD19 VH-CD8ヒンジ+TM-41BB-CD3ゼータ)のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号27は、CD19に対するScFVのヌクレオチド配列である。
GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCACAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
配列番号28は、CD19に対するscFVのアミノ酸配列である。
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
配列番号29は、CAR LTG1494(LP-CD19バインダー-CD8リンク-CD8tm-41BB-CD3ゼータ)のヌクレオチド配列である。
ATGCTTCTCCTGGTCACCTCCCTGCTCCTCTGCGAACTGCCTCACCCTGCCTTCCTTCTGATTCCTGACACTGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCTTCCTTGTCCGCGTCACTGGGAGACAGAGTGACCATCTCGTGTCGCGCAAGCCAGGATATCTCCAAGTACCTGAACTGGTACCAACAGAAGCCCGACGGGACTGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCTCACGCCTGCACAGCGGAGTGCCAAGCAGATTCTCCGGCTCCGGCTCGGGAACCGATTACTCGCTTACCATTAGCAACCTCGAGCAGGAGGACATCGCTACCTACTTCTGCCAGCAAGGAAATACCCTGCCCTACACCTTCGGCGGAGGAACCAAATTGGAAATCACCGGCTCCACGAGCGGCTCCGGGAAGCCTGGTTCCGGGGAAGGCTCCACTAAGGGTGAAGTGAAGCTCCAGGAGTCCGGCCCCGGCCTGGTGGCGCCGTCGCAATCACTCTCTGTGACCTGTACCGTGTCGGGAGTGTCCCTGCCTGATTACGGCGTGAGCTGGATTCGGCAGCCGCCGCGGAAGGGCCTGGAATGGCTGGGTGTCATCTGGGGATCCGAGACTACCTACTACAACTCGGCCCTGAAGTCCCGCCTGACTATCATCAAAGACAACTCGAAGTCCCAGGTCTTTCTGAAGATGAACTCCCTGCAAACTGACGACACCGCCATCTATTACTGTGCTAAGCACTACTACTACGGTGGAAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACATCCGTGACAGTCAGCTCCGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号30は、CAR LTG1494(LP-CD19バインダー-CD8リンク-CD8tm-41BB-CD3ゼータ)のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDTDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号31は、CAR LTG1538(LP-CD19バインダー-CD8リンク-CD8tm-シグナル(LTI再操作CD19 CAR)のヌクレオチド配列である。
ATGCTTCTCCTGGTCACCTCCCTGCTCCTCTGCGAACTGCCTCACCCTGCCTTCCTTCTGATTCCTGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCTTCCTTGTCCGCGTCACTGGGAGACAGAGTGACCATCTCGTGTCGCGCAAGCCAGGATATCTCCAAGTACCTGAACTGGTACCAACAGAAGCCCGACGGGACTGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCTCACGCCTGCACAGCGGAGTGCCAAGCAGATTCTCCGGCTCCGGCTCGGGAACCGATTACTCGCTTACCATTAGCAACCTCGAGCAGGAGGACATCGCTACCTACTTCTGCCAGCAAGGAAATACCCTGCCCTACACCTTCGGCGGAGGAACCAAATTGGAAATCACCGGCGGAGGAGGCTCCGGGGGAGGAGGTTCCGGGGGCGGGGGTTCCGAAGTGAAGCTCCAGGAGTCCGGCCCCGGCCTGGTGGCGCCGTCGCAATCACTCTCTGTGACCTGTACCGTGTCGGGAGTGTCCCTGCCTGATTACGGCGTGAGCTGGATTCGGCAGCCGCCGCGGAAGGGCCTGGAATGGCTGGGTGTCATCTGGGGATCCGAGACTACCTACTACAACTCGGCCCTGAAGTCCCGCCTGACTATCATCAAAGACAACTCGAAGTCCCAGGTCTTTCTGAAGATGAACTCCCTGCAAACTGACGACACCGCCATCTATTACTGTGCTAAGCACTACTACTACGGTGGAAGCTATGCTATGGACTACTGGGGGCAAGGCACTTCGGTGACTGTGTCAAGCGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号32は、CAR LTG1538(LP-CD19バインダー-CD8リンク-CD8tm-シグナル(LTI再操作CD19 CAR)のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号33は、CD19_20反応性scFv結合性ドメイン(LTG1496)のヌクレオチド配列である。
GACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGCGGCCGCA
配列番号34は、CD19_20反応性scFv結合性ドメイン(LTG1496)のアミノ酸配列である。
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKAAA
配列番号35は、CAR LTG1496(LP-LTG1496-CD8 TM-41BB-CD3ゼータ)または(LP-CD19 VL-Whitlowリンカー-CD19 VH(GGGGS) CD20 VH(GGGGS)-CD20 VL CD8ヒンジ+TM-41BB-CD3ゼータ)のヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号36は、CAR LTG1496(LP-LTG1496-CD8 TM-41BB-CD3ゼータ)または(LP-CD19 VL-Whitlowリンカー-CD19 VH-(GGGGS)-CD20 VH(GGGGS)-CD20 VL-CD8ヒンジ+TM-41BB-CD3ゼータ)のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号37は、メソセリン反応性scFv結合性ドメイン(LTG1904)のヌクレオチド配列である。
GAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATTTATCGTCAGTGGCTGGACCCTTTAACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGAGGTGGCGGGTCTGGTGGAGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGATCCTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATCTGGTATTCGGCGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTCGGT
配列番号38は、メソセリン反応性scFv結合性ドメイン(LTG1904)のアミノ酸配列である。
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDLSSVAGPFNYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHLVFGGGTQLTVLG
配列番号39は、CAR LTG1904(LP-1904-CD8 TM-41BB-CD3ゼータ)のヌクレオチド配列である。
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCGGAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATTTATCGTCAGTGGCTGGACCCTTTAACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGAGGTGGCGGGTCTGGTGGAGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGATCCTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATCTGGTATTCGGCGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTCGGTGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号40は、CAR LTG1904(LP-1904-CD8 TM-41BB-CD3ゼータ)のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDLSSVAGPFNYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHLVFGGGTQLTVLGAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号41は、CD33反応性単鎖結合性ドメインVH-4(LTG1906)のヌクレオチド配列である。
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAAGACAAGGGCTTGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGCGGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCACGTATTACTGTGCGAAAGAAAATGTGGACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
配列番号42は、CD33反応性単鎖結合性ドメインVH-4(LTG1906)のアミノ酸配列である。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPRQGLEWVANIKQDGSEKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCAKENVDWGQGTLVTVSS
配列番号43は、CAR LTG1906(LP-VH4-CD8 TM-41BB-CD3ゼータ)のヌクレオチド配列である。
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAAGACAAGGGCTTGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGCGGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCACGTATTACTGTGCGAAAGAAAATGTGGACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号44は、CAR LTG1906(LP-VH4-CD8 TM-41BB-CD3ゼータ)のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPRQGLEWVANIKQDGSEKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCAKENVDWGQGTLVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号45は、TSLPR反応性scFv結合性ドメイン(LTG1789)のヌクレオチド配列である。
ATGGCACTGCCCGTGACCGCCCTGCTTCTGCCGCTTGCACTTCTGCTGCACGCCGCTAGGCCCCAAGTCACCCTCAAAGAGTCAGGGCCAGGAATCCTCAAGCCCTCACAGACTCTGTCTCTTACTTGCTCATTCAGCGGATTCAGCCTTTCCACCTCTGGTATGGGCGTGGGGTGGATTAGGCAACCTAGCGGAAAGGGGCTTGAATGGCTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGACAAGTACTACAACCCCTCACTGAAGTCCCAGCTCACTATTTCCAAAGATACTTCCCGGAATCAGGTGTTCCTCAAGATTACCTCTGTCGACACCGCTGATACCGCCACTTACTATTGTTCACGCAGACCGAGAGGTACCATGGACGCAATGGACTACTGGGGACAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCATCTGGCGGTGGAGGGTCAGGAGGTGGAGGTAGCGGAGGCGGTGGGTCCGACATTGTCATGACCCAGGCCGCCAGCAGCCTGAGCGCTTCACTGGGCGACAGGGTGACCATCAGCTGTCGCGCATCACAAGATATCTCTAAGTATCTTAATTGGTACCAGCAAAAGCCGGATGGAACCGTGAAGCTGCTGATCTACTACACCTCACGGCTGCATTCTGGAGTGCCTAGCCGCTTTAGCGGATCTGGGTCCGGTACTGACTACAGCCTCACCATTAGAAACCTTGAACAGGAGGACATCGCAACTTATTTCTGCCAACAGGTCTATACTCTGCCGTGGACCTTCGGCGGAGGTACCAAACTGGAGATTAAGTCCGG
配列番号46は、TSLPR反応性scFv結合性ドメイン(LTG1789)のアミノ酸配列である。
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSQLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCSRRPRGTMDAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAASSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIRNLEQEDIATYFCQQVYTLPWTFGGGTKLEIKS
配列番号47は、CAR LTG1789(LP-3G11-CD8 TM-41BB-CD3ゼータ)のヌクレオチド配列である。
ATGGCACTGCCCGTGACCGCCCTGCTTCTGCCGCTTGCACTTCTGCTGCACGCCGCTAGGCCCCAAGTCACCCTCAAAGAGTCAGGGCCAGGAATCCTCAAGCCCTCACAGACTCTGTCTCTTACTTGCTCATTCAGCGGATTCAGCCTTTCCACCTCTGGTATGGGCGTGGGGTGGATTAGGCAACCTAGCGGAAAGGGGCTTGAATGGCTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGACAAGTACTACAACCCCTCACTGAAGTCCCAGCTCACTATTTCCAAAGATACTTCCCGGAATCAGGTGTTCCTCAAGATTACCTCTGTCGACACCGCTGATACCGCCACTTACTATTGTTCACGCAGACCGAGAGGTACCATGGACGCAATGGACTACTGGGGACAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCATCTGGCGGTGGAGGGTCAGGAGGTGGAGGTAGCGGAGGCGGTGGGTCCGACATTGTCATGACCCAGGCCGCCAGCAGCCTGAGCGCTTCACTGGGCGACAGGGTGACCATCAGCTGTCGCGCATCACAAGATATCTCTAAGTATCTTAATTGGTACCAGCAAAAGCCGGATGGAACCGTGAAGCTGCTGATCTACTACACCTCACGGCTGCATTCTGGAGTGCCTAGCCGCTTTAGCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号48は、CAR LTG1789(LP-3G11-CD8 TM-41BB-CD3ゼータ)のアミノ酸配列である。
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSQLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCSRRPRGTMDAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAASSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIRNLEQEDIATYFCQQVYTLPWTFGGGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号49は、CAR LTG1563(LP-CD19-TNFRSF19TM-41BB-CD3ゼータ)のヌクレオチド配列である。
ATGCTGCTGCTGGTCACCAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTCCCTCACCCCGCCTTTCTGCTTATCCCGGACATTCAGATGACACAGACCACCTCGAGCTTGTCCGCGTCGCTGGGCGATCGCGTGACCATCTCCTGCCGGGCCTCCCAAGACATTTCAAAGTATCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCGGACGGAACCGTGAAACTGCTGATCTACCATACCAGCCGCCTGCACTCCGGCGTGCCGTCCCGCTTCTCCGGATCGGGTTCCGGAACTGACTACTCACTGACTATCTCCAACTTGGAACAAGAGGACATCGCCACTTACTTCTGTCAACAAGGAAATACCCTTCCCTACACCTTCGGGGGGGGTACCAAGCTGGAGATCACTGGGGGCGGAGGCTCCGGTGGAGGCGGATCCGGCGGTGGAGGGAGCGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCAGGACTCGTGGCGCCATCCCAGTCCCTGTCGGTGACCTGTACTGTCTCCGGAGTCAGCCTCCCCGATTACGGAGTGTCATGGATTAGGCAACCCCCAAGAAAAGGGCTGGAATGGCTCGGAGTGATCTGGGGCTCCGAAACCACCTACTACAACTCGGCGCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTGTTCTTGAAGATGAACAGCTTGCAGACCGACGATACCGCAATCTACTACTGTGCCAAGCACTATTACTACGGGGGGTCTTACGCCATGGACTACTGGGGACAGGGCACCTCCGTGACTGTGTCGTCCGCGGCCGCGCCCGCCCCTCGGCCCCCGACTCCTGCCCCGACGATCGCTTCCCAACCTCTCTCGCTGCGCCCGGAAGCATGCCGGCCCGCCGCCGGTGGCGCTGTCCACACTCGCGGACTGGACTTTGATACCGCACTGGCGGCCGTGATCTGTAGCGCCCTGGCCACCGTGCTGCTGGCGCTGCTCATCCTTTGCGTGATCTACTGCAAGCGGCAGCCTAGGCGAAAGAAGCTCCTCTACATTTTCAAGCAACCCTTCATGCGCCCCGTGCAAACCACCCAGGAGGAGGATGGATGCTCATGCCGGTTCCCTGAGGAAGAAGAGGGCGGTTGCGAGCTCAGAGTGAAATTCAGCCGGTCGGCTGACGCCCCGGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAATGAGCTCAACCTGGGGCGCCGCGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGATCCGGAAATGGGCGGAAAGCCAAGGCGGAAGAACCCGCAGGAAGGTCTTTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATTGGGATGAAGGGAGAAAGACGGAGGGGAAAGGGACATGACGGACTTTACCAGGGCCTGAGCACTGCCACGAAGGACACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCGCTGCCGCCTCGG
配列番号50は、CAR LTG1563(LP-CD19-TNFRSF19TM-41BB-CD3ゼータ)のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFDTALAAVICSALATVLLALLILCVIYCKRQPRRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号51は、CAR LTG2228(LP-CD20_CD19-CD8TM-CD28-CD3ゼータ)のヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCGACTACCACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTGCGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCTCTGGTCATTACCCTGTACTGCCGGTCGAAGAGGTCCAGACTCTTGCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTAGAAGGCCCGGACCCACTAGAAAGCACTACCAGCCGTACGCCCCTCCTCGGGATTTCGCCGCATACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGG
配列番号52は、CAR LTG2228(LP-CD20_CD19-CD8TM-CD28-CD3ゼータ)のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号53は、D0043のヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCGACTACCACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTGCGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCTCTGGTCATTACCCTGTACTGCCGGTCGAAGAGGTCCAGACTCTTGCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTAGAAGGCCCGGACCCACTAGAAAGCACTACCAGCCGTACGCCCCTCCTCGGGATTTCGCCGCATACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGGCGCGCGAAACGCGGCAGCGGCGCGACCAACTTTAGCCTGCTGAAACAGGCGGGCGATGTGGAAGAAAACCCGGGCCCGCGAGCAAAGAGGAATATTATGCTTCTATTAGTGACTTCCCTTTTGCTGTGCGAGTTGCCACACCCCGCCTTCCTGCTTATTCCCCAGGTACAGCTCCAGCAGAGTGGCCCAGGGCTCGTGAAGCCAAGCCAGACGCTGTCCCTGACTTGTGCAATTTCAGGGGATTCAGTTTCATCAAATAGCGCGGCGTGGAATTGGATTCGACAATCTCCTTCCCGAGGGTTGGAATGGCTTGGACGAACATATTACAGATCCAAATGGTATAACGACTATGCGGTATCAGTAAAGTCAAGAATAACCATTAACCCCGACACAAGCAAGAACCAATTCTCTTTGCAGCTTAACTCTGTCACGCCAGAAGACACGGCAGTCTATTATTGCGCTCGCGAGGTAACGGGTGACCTGGAAGACGCTTTTGACATTTGGGGGCAGGGTACGATGGTGACAGTCAGTTCAGGGGGCGGTGGGAGTGGGGGAGGGGGTAGCGGGGGGGGAGGGTCAGACATTCAGATGACCCAGTCCCCTTCATCCTTGTCTGCCTCCGTCGGTGACAGGGTGACAATAACATGCAGAGCAAGCCAAACAATCTGGAGCTATCTCAACTGGTACCAGCAGCGACCAGGAAAAGCGCCAAACCTGCTGATTTACGCTGCTTCCTCCCTCCAATCAGGCGTGCCTAGTAGATTTAGCGGTAGGGGCTCCGGCACCGATTTTACGCTCACTATAAGCTCTCTTCAAGCAGAAGATTTTGCGACTTATTACTGCCAGCAGTCCTATAGTATACCTCAGACTTTCGGACAGGGTACCAAGTTGGAGATTAAGGCTAGCGCAACCACTACGCCTGCTCCGCGGCCTCCAACGCCCGCGCCCACGATAGCTAGTCAGCCGTTGTCTCTCCGACCAGAGGCGTGTAGACCGGCCGCTGGCGGAGCCGTACATACTCGCGGACTCGACTTCGCTTGCGACATCTACATTTGGGCACCCTTGGCTGGGACCTGTGGGGTGCTGTTGCTGTCCTTGGTTATTACGTTGTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGAGAGTCAAATTTTCCAGGTCCGCAGATGCCCCCGCGTACCAGCAAGGCCAGAACCAACTTTACAACGAACTGAACCTGGGTCGCCGGGAGGAATATGATGTGCTGGATAAACGAAGGGGGAGGGACCCTGAGATGGGAGGGAAACCTCGCAGGAAAAACCCGCAGGAAGGTTTGTACAACGAGTTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAGGCTTACTCTGAAATAGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGAGGAAAAGGCCATGATGGCCTTTACCAGGGCTTGAGCACAGCAACAAAGGATACTTACGACGCTCTTCACATGCAAGCTCTGCCACCACGG
配列番号54は、D0043のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRAKRNIMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKASATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号55は、D0044のヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCGACTACCACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTGCGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCTCTGGTCATTACCCTGTACTGCCGGTCGAAGAGGTCCAGACTCTTGCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTAGAAGGCCCGGACCCACTAGAAAGCACTACCAGCCGTACGCCCCTCCTCGGGATTTCGCCGCATACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGGCGCGCGAAACGCGGCAGCGGCGCGACCAACTTTAGCCTGCTGAAACAGGCGGGCGATGTGGAAGAAAACCCGGGCCCGCGAGCAAAGAGGAATATTATGTTGCTGCTCGTGACCTCGCTCCTTCTGTGCGAGCTGCCCCATCCGGCTTTTCTGCTCATCCCTCAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCAATTAGCGGGGACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATACCGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAATCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCCGGTGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTTCGGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTCGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAAGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCCGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGAAGAGGCACTAAGCTGGAAATCAAGGCTAGCGCAACCACTACGCCTGCTCCGCGGCCTCCAACGCCCGCGCCCACGATAGCTAGTCAGCCGTTGTCTCTCCGACCAGAGGCGTGTAGACCGGCCGCTGGCGGAGCCGTACATACTCGCGGACTCGACTTCGCTTGCGACATCTACATTTGGGCACCCTTGGCTGGGACCTGTGGGGTGCTGTTGCTGTCCTTGGTTATTACGTTGTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGAGAGTCAAATTTTCCAGGTCCGCAGATGCCCCCGCGTACCAGCAAGGCCAGAACCAACTTTACAACGAACTGAACCTGGGTCGCCGGGAGGAATATGATGTGCTGGATAAACGAAGGGGGAGGGACCCTGAGATGGGAGGGAAACCTCGCAGGAAAAACCCGCAGGAAGGTTTGTACAACGAGTTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAGGCTTACTCTGAAATAGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGAGGAAAAGGCCATGATGGCCTTTACCAGGGCTTGAGCACAGCAACAAAGGATACTTACGACGCTCTTCACATGCAAGCTCTGCCACCACGG
配列番号56は、D0044のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRAKRNIMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYTDYAVSVKNRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGRGTKLEIKASATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号59は、D0046のヌクレオチド配列である。
ATGCTTCTTTTGGTGACTTCCCTTTTGCTGTGCGAGTTGCCACACCCCGCCTTCCTGCTTATTCCCCAGGTACAGCTCCAGCAGAGTGGCCCAGGGCTCGTGAAGCCAAGCCAGACGCTGTCCCTGACTTGTGCAATTTCAGGGGATTCAGTTTCATCAAATAGCGCGGCGTGGAATTGGATTCGACAATCTCCTTCCCGAGGGTTGGAATGGCTTGGACGAACATATTACAGATCCAAATGGTATAACGACTATGCGGTATCAGTAAAGTCAAGAATAACCATTAACCCCGACACAAGCAAGAACCAATTCTCTTTGCAGCTTAACTCTGTCACGCCAGAAGACACGGCAGTCTATTATTGCGCTCGCGAGGTAACGGGTGACCTGGAAGACGCTTTTGACATTTGGGGGCAGGGTACGATGGTGACAGTCAGTTCAGGGGGCGGTGGGAGTGGGGGAGGGGGTAGCGGGGGGGGAGGGTCAGACATTCAGATGACCCAGTCCCCTTCATCCTTGTCTGCCTCCGTCGGTGACAGGGTGACAATAACATGCAGAGCAAGCCAAACAATCTGGAGCTATCTCAACTGGTACCAGCAGCGACCAGGAAAAGCGCCAAACCTGCTGATTTACGCTGCTTCCTCCCTCCAATCAGGCGTGCCTAGTAGATTTAGCGGTAGGGGCTCCGGCACCGATTTTACGCTCACTATAAGCTCTCTTCAAGCAGAAGATTTTGCGACTTATTACTGCCAGCAGTCCTATAGTATACCTCAGACTTTCGGACAGGGTACCAAGTTGGAGATTAAGGCGGCCGCTACCACAACCCCTGCGCCCCGGCCTCCTACCCCCGCACCCACGATTGCTTCTCAACCTCTTTCACTCCGACCTGAGGCTTGTAGACCTGCAGCCGGGGGTGCCGTCCACACACGGGGACTCGACTTCGCTTGTGATATATATATTTGGGCGCCCCTGGCCGGCACTTGTGGAGTTCTTTTGCTCTCTCTTGTTATCACATTGTACTGCAAGCGAGGTAGGAAGAAATTGCTTTACATTTTTAAGCAGCCGTTCATGCGACCAGTACAGACTACTCAAGAAGAAGATGGGTGCTCTTGTCGGTTCCCGGAAGAAGAAGAGGGTGGTTGCGAGTTGAGGGTGAAGTTCTCCCGCTCTGCCGACGCACCGGCATATCAGCAGGGACAAAACCAGCTCTACAACGAATTGAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTCGATAAGCGGCGGGGTCGCGACCCAGAAATGGGAGGCAAACCGCGCAGGAAAAATCCACAGGAGGGACTTTATAACGAACTTCAAAAGGATAAGATGGCAGAGGCATACAGCGAAATCGGGATGAAAGGCGAGAGAAGAAGGGGGAAAGGGCACGATGGTCTTTACCAGGGGCTTTCTACCGCGACGAAGGATACCTACGATGCTCTCCATATGCAAGCACTTCCTCCTAGACGGGCAAAGCGGGGCTCAGGGGCGACTAACTTTTCACTGTTGAAGCAGGCCGGGGATGTGGAGGAGAATCCTGGTCCTAGAGCTAAGCGAGTAGACATGGCCCTGCCCGTCACTGCGCTGCTTCTTCCACTTGCGCTTCTGCTGCACGCAGCGCGCCCGGAAGTCCAGCTCCAGCAAAGCGGAGCCGAACTCGTGAAGCCGGGGGCCTCCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCATCCGGCTACACCTTCACTAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACTCCGGGTCAAGGGCTGGAGTGGATTGGGGCGATCTACCCGGGCAACGGCGACACCTCCTACAACCAAAAGTTCAAGGGGAAGGCTACTCTTACGGCGGACAAGTCGTCCAGCACCGCATACATGCAACTCTCCTCCCTGACCTCCGAGGACTCGGCGGACTACTACTGCGCCCGGAGCAACTACTACGGTTCCTCCTACTGGTTCTTCGACGTGTGGGGTGCCGGAACTACTGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGCGGATCAGGCGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCCGCAATCCTTTCGGCCTCCCCCGGAGAGAAGGTCACGATGACTTGCAGGGCTTCGTCCTCCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCCGGGTCGTCGCCTAAGCCGTGGATCTACGCTACCTCAAACCTGGCTTCCGGCGTCCCTGCGCGGTTCAGCGGCTCGGGGAGCGGTACCTCATACTCACTCACCATCTCCCGGGTGGAGGCCGAAGATGCGGCCACCTATTATTGCCAACAGTGGTCCTTCAATCCGCCCACCTTCGGGGGGGGAACCAAGCTCGAGATCAAGGGGGGTGGCGGCTCAGGGGGAGGCGGAAGCGGAGGGGGTGGCTCGGGCGGCGGCGGTTCCGGCGGCGGAGGGTCCGATATCCAAATGACCCAGACTACTAGCTCGTTGAGCGCCTCGCTCGGCGACAGAGTGACCATTAGCTGCAGGGCATCCCAGGACATTTCAAAGTACCTGAACTGGTACCAACAGAAGCCCGACGGAACTGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACTCCGGAGTCCCGTCGAGATTTTCCGGCTCCGGAAGCGGAACCGATTATTCGCTCACCATTTCTAACCTGGAACAGGAGGACATTGCCACTTACTTCTGTCAACAAGGAAACACTCTGCCTTACACCTTTGGTGGCGGAACCAAGTTGGAAATTACCGGCTCCACCTCCGGATCCGGAAAGCCTGGATCCGGAGAGGGATCAACCAAGGGAGAAGTGAAGCTGCAGGAGAGCGGGCCCGGCCTTGTCGCCCCGAGCCAGTCCTTGTCCGTGACCTGTACTGTCTCCGGAGTCAGCCTGCCGGACTACGGGGTGTCCTGGATCCGCCAGCCGCCTCGCAAGGGCCTGGAGTGGCTCGGCGTGATCTGGGGATCCGAAACGACTTACTACAACTCGGCCCTCAAGTCGAGGCTCACTATTATCAAGGACAACTCGAAGTCCCAGGTGTTCCTCAAGATGAACTCGCTGCAAACCGACGACACAGCGATCTACTACTGTGCAAAGCATTACTACTACGGAGGCAGCTACGCAATGGACTACTGGGGACAGGGAACCTCCGTGACTGTCTCTAGCGCTAGCGCGACCACTACGCCCGCCCCCCGCCCACCTACCCCCGCCCCGACCATTGCGAGCCAACCGTTGTCACTCCGCCCGGAAGCCTGCCGCCCCGCCGCTGGCGGAGCCGTGCACACCCGGGGACTGGACTTCGCATGCGACATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCTGGAACCTGTGGAGTCCTGCTGCTCTCCCTCGTGATCACTCTGTACTGCCGGTCGAAGCGCTCAAGACTGCTGCACTCAGACTACATGAACATGACTCCTCGGCGGCCGGGGCCGACTCGGAAGCACTACCAGCCTTACGCACCCCCGAGAGATTTCGCGGCCTACCGCTCCCGGGTCAAGTTTTCCCGGTCTGCCGACGCTCCGGCGTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAATGAGCTGAATCTGGGTCGGAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGATAAGCGGAGAGGCAGAGATCCAGAAATGGGAGGAAAGCCTCGGAGAAAGAACCCACAGGAGGGACTGTATAATGAGCTGCAGAAGGACAAAATGGCCGAAGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGCGGCGCAGAGGGAAGGGACATGACGGCCTGTACCAGGGTCTGAGCACCGCGACTAAGGACACCTACGATGCCCTTCATATGCAAGCACTCCCTCCGCGC
配列番号60は、D0046のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRAKRVDMALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSASATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号61は、D0047のヌクレオチド配列である。
ATGTTGCTGCTCGTGACCTCGCTCCTTCTGTGCGAGCTGCCCCATCCGGCTTTTCTGCTCATCCCTCAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCAATTAGCGGGGACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATACCGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAATCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCCGGTGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTTCGGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTCGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAAGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCCGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGAAGAGGCACTAAGCTGGAAATCAAGGCGGCCGCTACCACAACCCCTGCGCCCCGGCCTCCTACCCCCGCACCCACGATTGCTTCTCAACCTCTTTCACTCCGACCTGAGGCTTGTAGACCTGCAGCCGGGGGTGCCGTCCACACACGGGGACTCGACTTCGCTTGTGATATATATATTTGGGCGCCCCTGGCCGGCACTTGTGGAGTTCTTTTGCTCTCTCTTGTTATCACATTGTACTGCAAGCGAGGTAGGAAGAAATTGCTTTACATTTTTAAGCAGCCGTTCATGCGACCAGTACAGACTACTCAAGAAGAAGATGGGTGCTCTTGTCGGTTCCCGGAAGAAGAAGAGGGTGGTTGCGAGTTGAGGGTGAAGTTCTCCCGCTCTGCCGACGCACCGGCATATCAGCAGGGACAAAACCAGCTCTACAACGAATTGAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTCGATAAGCGGCGGGGTCGCGACCCAGAAATGGGAGGCAAACCGCGCAGGAAAAATCCACAGGAGGGACTTTATAACGAACTTCAAAAGGATAAGATGGCAGAGGCATACAGCGAAATCGGGATGAAAGGCGAGAGAAGAAGGGGGAAAGGGCACGATGGTCTTTACCAGGGGCTTTCTACCGCGACGAAGGATACCTACGATGCTCTCCATATGCAAGCACTTCCTCCTAGACGGGCAAAGCGGGGCTCAGGGGCGACTAACTTTTCACTGTTGAAGCAGGCCGGGGATGTGGAGGAGAATCCTGGTCCTAGAGCTAAGCGAGTAGACATGGCCCTGCCCGTCACTGCGCTGCTTCTTCCACTTGCGCTTCTGCTGCACGCAGCGCGCCCGGAAGTCCAGCTCCAGCAAAGCGGAGCCGAACTCGTGAAGCCGGGGGCCTCCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCATCCGGCTACACCTTCACTAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACTCCGGGTCAAGGGCTGGAGTGGATTGGGGCGATCTACCCGGGCAACGGCGACACCTCCTACAACCAAAAGTTCAAGGGGAAGGCTACTCTTACGGCGGACAAGTCGTCCAGCACCGCATACATGCAACTCTCCTCCCTGACCTCCGAGGACTCGGCGGACTACTACTGCGCCCGGAGCAACTACTACGGTTCCTCCTACTGGTTCTTCGACGTGTGGGGTGCCGGAACTACTGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGCGGATCAGGCGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCCGCAATCCTTTCGGCCTCCCCCGGAGAGAAGGTCACGATGACTTGCAGGGCTTCGTCCTCCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCCGGGTCGTCGCCTAAGCCGTGGATCTACGCTACCTCAAACCTGGCTTCCGGCGTCCCTGCGCGGTTCAGCGGCTCGGGGAGCGGTACCTCATACTCACTCACCATCTCCCGGGTGGAGGCCGAAGATGCGGCCACCTATTATTGCCAACAGTGGTCCTTCAATCCGCCCACCTTCGGGGGGGGAACCAAGCTCGAGATCAAGGGGGGTGGCGGCTCAGGGGGAGGCGGAAGCGGAGGGGGTGGCTCGGGCGGCGGCGGTTCCGGCGGCGGAGGGTCCGATATCCAAATGACCCAGACTACTAGCTCGTTGAGCGCCTCGCTCGGCGACAGAGTGACCATTAGCTGCAGGGCATCCCAGGACATTTCAAAGTACCTGAACTGGTACCAACAGAAGCCCGACGGAACTGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACTCCGGAGTCCCGTCGAGATTTTCCGGCTCCGGAAGCGGAACCGATTATTCGCTCACCATTTCTAACCTGGAACAGGAGGACATTGCCACTTACTTCTGTCAACAAGGAAACACTCTGCCTTACACCTTTGGTGGCGGAACCAAGTTGGAAATTACCGGCTCCACCTCCGGATCCGGAAAGCCTGGATCCGGAGAGGGATCAACCAAGGGAGAAGTGAAGCTGCAGGAGAGCGGGCCCGGCCTTGTCGCCCCGAGCCAGTCCTTGTCCGTGACCTGTACTGTCTCCGGAGTCAGCCTGCCGGACTACGGGGTGTCCTGGATCCGCCAGCCGCCTCGCAAGGGCCTGGAGTGGCTCGGCGTGATCTGGGGATCCGAAACGACTTACTACAACTCGGCCCTCAAGTCGAGGCTCACTATTATCAAGGACAACTCGAAGTCCCAGGTGTTCCTCAAGATGAACTCGCTGCAAACCGACGACACAGCGATCTACTACTGTGCAAAGCATTACTACTACGGAGGCAGCTACGCAATGGACTACTGGGGACAGGGAACCTCCGTGACTGTCTCTAGCGCTAGCGCGACCACTACGCCCGCCCCCCGCCCACCTACCCCCGCCCCGACCATTGCGAGCCAACCGTTGTCACTCCGCCCGGAAGCCTGCCGCCCCGCCGCTGGCGGAGCCGTGCACACCCGGGGACTGGACTTCGCATGCGACATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCTGGAACCTGTGGAGTCCTGCTGCTCTCCCTCGTGATCACTCTGTACTGCCGGTCGAAGCGCTCAAGACTGCTGCACTCAGACTACATGAACATGACTCCTCGGCGGCCGGGGCCGACTCGGAAGCACTACCAGCCTTACGCACCCCCGAGAGATTTCGCGGCCTACCGCTCCCGGGTCAAGTTTTCCCGGTCTGCCGACGCTCCGGCGTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAATGAGCTGAATCTGGGTCGGAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGATAAGCGGAGAGGCAGAGATCCAGAAATGGGAGGAAAGCCTCGGAGAAAGAACCCACAGGAGGGACTGTATAATGAGCTGCAGAAGGACAAAATGGCCGAAGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGCGGCGCAGAGGGAAGGGACATGACGGCCTGTACCAGGGTCTGAGCACCGCGACTAAGGACACCTACGATGCCCTTCATATGCAAGCACTCCCTCCGCGC
配列番号62は、D0047のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYTDYAVSVKNRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGRGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRAKRVDMALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSASATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号65は、D0001のヌクレオチド配列である。
ATGCTTCTTTTGGTGACTTCCCTTTTGCTGTGCGAGTTGCCACACCCCGCCTTCCTGCTTATTCCCCAGGTACAGCTTCAACAGAGTGGGCCGGGACTGGTGAAACACTCCCAAACACTTTCTCTGACGTGCGCTATATCAGGTGACTCTGTTTCATCTAATTCTGCTGCGTGGAACTGGATTCGACAATCTCCCAGTCGCGGGTTGGAATGGCTGGGACGAACATATTATCGGTCTAAGTGGTATAACGATTATGCTGTATCTGTTAAATCTCGAATTACGATTAATCCTGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTCCAGTTGAACTCAGTCACACCGGAAGACACTGCGGTCTACTATTGCGCTCAAGAAGTCGAGCCACATGATGCATTCGACATCTGGGGCCAGGGAACGATGGTCACCGTCAGCAGTGGCGGCGGCGGATCTGGGGGTGGCGGTTCTGGCGGTGGAGGATCAGACATACAAATGACGCAGAGTCCCTCAAGTGTGTACGCGAGTGTGGGGGATAAGGTAACTATTACGTGCAGAGCGTCACAGGATGTTAGTGGATGGCTTGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCTTGCTCCACAGCTCCTTATCAGTGGTGCTTCTACACTTCAGGGCGAGGTTCCGAGTAGATTCTCTGGTTCTGGATCTGGTACTGACTTCACTCTTACAATTTCTTCTTTGCAACCAGAAGACTTTGCGACTTATTACTGCCAACAGGCCAAATACTTCCCTTATACATTTGGCCAAGGTACCAAGTTGGAGATAAAGGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号66は、D0001のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKHSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPHDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVYASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLISGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGQGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号67は、D0002のヌクレオチド配列である。
ATGTTGCTGCTCGTGACCTCGCTCCTTCTGTGCGAGCTGCCCCATCCGGCTTTTCTGCTCATCCCTCAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCAATTAGCGGGGACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATACCGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAATCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCCGGTGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTTCGGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTCGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAAGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCCGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGAAGAGGCACTAAGCTGGAAATCAAGGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号68は、D0002のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYTDYAVSVKNRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGRGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号69は、D0003のヌクレオチド配列である。
ATGTTGCTGCTCGTGACCTCGCTCCTTCTGTGCGAGCTGCCCCATCCGGCTTTTCTGCTCATCCCTCAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCCATTAGCGGGAACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATAACGACTACGCCGTGTCCGTGAAGTCCCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCCGGTGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTTCGGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTTGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAGGTGCCATCACGCTTCTCCGGAGGTGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGACAAGGCACTAAGCTGGAAATCAAGGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号70は、D0003のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGNSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGQGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号73は、LTG2273のヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCGACTACCACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTGCGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCTCTGGTCATTACCCTGTACTGCCGGTCGAAGAGGTCCAGACTCTTGCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTAGAAGGCCCGGACCCACTAGAAAGCACTACCAGCCGTACGCCCCTCCTCGGGATTTCGCCGCATACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGG
配列番号74は、LTG2273のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号75は、LTG2200のヌクレオチド配列である。
ATGCTTCTTTTGGTGACTTCCCTTTTGCTGTGCGAGTTGCCACACCCCGCCTTCCTGCTTATTCCCCAGGTACAGCTCCAGCAGAGTGGCCCAGGGCTCGTGAAGCCAAGCCAGACGCTGTCCCTGACTTGTGCAATTTCAGGGGATTCAGTTTCATCAAATAGCGCGGCGTGGAATTGGATTCGACAATCTCCTTCCCGAGGGTTGGAATGGCTTGGACGAACATATTACAGATCCAAATGGTATAACGACTATGCGGTATCAGTAAAGTCAAGAATAACCATTAACCCCGACACAAGCAAGAACCAATTCTCTTTGCAGCTTAACTCTGTCACGCCAGAAGACACGGCAGTCTATTATTGCGCTCGCGAGGTAACGGGTGACCTGGAAGACGCTTTTGACATTTGGGGGCAGGGTACGATGGTGACAGTCAGTTCAGGGGGCGGTGGGAGTGGGGGAGGGGGTAGCGGGGGGGGAGGGTCAGACATTCAGATGACCCAGTCCCCTTCATCCTTGTCTGCCTCCGTCGGTGACAGGGTGACAATAACATGCAGAGCAAGCCAAACAATCTGGAGCTATCTCAACTGGTACCAGCAGCGACCAGGAAAAGCGCCAAACCTGCTGATTTACGCTGCTTCCTCCCTCCAATCAGGCGTGCCTAGTAGATTTAGCGGTAGGGGCTCCGGCACCGATTTTACGCTCACTATAAGCTCTCTTCAAGCAGAAGATTTTGCGACTTATTACTGCCAGCAGTCCTATAGTATACCTCAGACTTTCGGACAGGGTACCAAGTTGGAGATTAAGGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号76は、LTG2200のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号77は、GMCSFリーダーペプチドのヌクレオチド配列である。
ATGCTTCTTTTGGTGACTTCCCTTTTGCTGTGCGAGTTGCCACACCCCGCCTTCCTGCTTATTCCC
配列番号78は、GMCSFリーダーペプチドのアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
配列番号79は、CD8aリーダーペプチドのヌクレオチド配列である。
ATGGCCCTGCCCGTCACTGCGCTGCTTCTTCCACTTGCGCTTCTGCTGCACGCAGCGCGCCCG
配列番号80は、CD8aFリーダーペプチドのアミノ酸配列である。
MALPVTALLLPLALLLHAARP
配列番号81は、CD8ヒンジおよび膜貫通ドメインのヌクレオチド配列である。
GCGGCCGCTACCACAACCCCTGCGCCCCGGCCTCCTACCCCCGCACCCACGATTGCTTCTCAACCTCTTTCACTCCGACCTGAGGCTTGTAGACCTGCAGCCGGGGGTGCCGTCCACACACGGGGACTCGACTTCGCTTGTGATATATATATTTGGGCGCCCCTGGCCGGCACTTGTGGAGTTCTTTTGCTCTCTCTTGTTATCACATTGTACTGC
配列番号82は、CD8ヒンジおよび膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
AAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
配列番号83は、4-1BB/CD137共刺激ドメインのヌクレオチド配列である。
AAGCGAGGTAGGAAGAAATTGCTTTACATTTTTAAGCAGCCGTTCATGCGACCAGTACAGACTACTCAAGAAGAAGATGGGTGCTCTTGTCGGTTCCCGGAAGAAGAAGAGGGTGGTTGCGAGTTG
配列番号84は、4-1BB/CD137共刺激ドメインのアミノ酸配列である。
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
配列番号85は、CD28共刺激ドメインのヌクレオチド配列である。
CGGTCGAAGCGCTCAAGACTGCTGCACTCAGACTACATGAACATGACTCCTCGGCGGCCGGGGCCGACTCGGAAGCACTACCAGCCTTACGCACCCCCGAGAGATTTCGCGGCCTACCGCTCC
配列番号86は、CD28共刺激ドメインのアミノ酸配列である。
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
配列番号87は、CD3ゼータのヌクレオチド配列である。
AGGGTGAAGTTCTCCCGCTCTGCCGACGCACCGGCATATCAGCAGGGACAAAACCAGCTCTACAACGAATTGAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTCGATAAGCGGCGGGGTCGCGACCCAGAAATGGGAGGCAAACCGCGCAGGAAAAATCCACAGGAGGGACTTTATAACGAACTTCAAAAGGATAAGATGGCAGAGGCATACAGCGAAATCGGGATGAAAGGCGAGAGAAGAAGGGGGAAAGGGCACGATGGTCTTTACCAGGGGCTTTCTACCGCGACGAAGGATACCTACGATGCTCTCCATATGCAAGCACTTCCTCCTAGA
配列番号88は、CD3ゼータのアミノ酸配列である。
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号89は、フューリンP2Aフューリン(Furin P2A furin)のヌクレオチド配列である。
CGGGCAAAGCGGGGCTCAGGGGCGACTAACTTTTCACTGTTGAAGCAGGCCGGGGATGTGGAGGAGAATCCTGGTCCTAGAGCTAAGCGAG
配列番号90は、フューリンP2Aフューリン(Furin P2A furin)のアミノ酸配列である。
RAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRAKR
配列番号95は、16P17 CD22 scFv VHのヌクレオチド配列である。
CAGGTACAGCTTCAACAGAGTGGGCCGGGACTGGTGAAACACTCCCAAACACTTTCTCTGACGTGCGCTATATCAGGTGACTCTGTTTCATCTAATTCTGCTGCGTGGAACTGGATTCGACAATCTCCCAGTCGCGGGTTGGAATGGCTGGGACGAACATATTATCGGTCTAAGTGGTATAACGATTATGCTGTATCTGTTAAATCTCGAATTACGATTAATCCTGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTCCAGTTGAACTCAGTCACACCGGAAGACACTGCGGTCTACTATTGCGCTCAAGAAGTCGAGCCACATGATGCATTCGACATCTGGGGCCAGGGAACGATGGTCACCGTCAGCAGT
配列番号96は、16P17 CD22 scFv VHのアミノ酸配列である。
QVQLQQSGPGLVKHSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPHDAFDIWGQGTMVTVSS
配列番号97は、16P17 CD22 scFv VLのヌクレオチド配列である。
GACATACAAATGACGCAGAGTCCCTCAAGTGTGTACGCGAGTGTGGGGGATAAGGTAACTATTACGTGCAGAGCGTCACAGGATGTTAGTGGATGGCTTGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCTTGCTCCACAGCTCCTTATCAGTGGTGCTTCTACACTTCAGGGCGAGGTTCCGAGTAGATTCTCTGGTTCTGGATCTGGTACTGACTTCACTCTTACAATTTCTTCTTTGCAACCAGAAGACTTTGCGACTTATTACTGCCAACAGGCCAAATACTTCCCTTATACATTTGGCCAAGGTACCAAGTTGGAGATAAAG
配列番号98は、16P17 CD22 scFv VLのアミノ酸配列である。
DIQMTQSPSSVYASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLISGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGQGTKLEIK
配列番号99は、16P8 CD22 scFv VHのヌクレオチド配列である。
CAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCAATTAGCGGGGACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATACCGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAATCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCC
配列番号100は、16P8 CD22 scFv VHのアミノ酸配列である。
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYTDYAVSVKNRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSS
配列番号101は、16P8 CD22 scFv VLのヌクレオチド配列である。
GATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTCGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAAGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCCGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGAAGAGGCACTAAGCTGGAAATCAAG
配列番号102は、16P8 CD22 scFv VLのアミノ酸配列である。
DIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGRGTKLEIK
配列番号103は、16P13 CD22 scFv VHのヌクレオチド配列である。
CAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCCATTAGCGGGAACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATAACGACTACGCCGTGTCCGTGAAGTCCCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCC
配列番号104は、16P13 CD22 scFv VHのアミノ酸配列である。
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGNSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSS
配列番号105は、16P13 CD22 scFv VLのヌクレオチド配列である。
GATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTTGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAGGTGCCATCACGCTTCTCCGGAGGTGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGACAAGGCACTAAGCTGGAAATCAAG
配列番号106は、16P13 CD22 scFv VLのアミノ酸配列である。
DIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGQGTKLEIK
配列番号107は、Whitlowリンカーのアミノ酸配列である。
GSTSGSGKPGSGEGSTKG
配列番号108は、可動性鎖間リンカーのアミノ酸配列である。
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号109は、LTG 2948 DuoCAR D93 CAR2019 ICOZz 2A CAR22zのヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCAACGACCACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTGCGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCTCTGGTCATTACCCTGTACTGCTGGCTGACAAAAAAGAAGTATTCATCTAGTGTACATGATCCGAACGGTGAATACATGTTCATGCGCGCGGTGAACACGGCCAAGAAGAGCAGACTGACCGACGTAACCCTTAGAGTGAAGTTTAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGGCGCGCGAAACGCGGCAGCGGCGCGACCAACTTTAGCCTGCTGAAACAGGCGGGCGATGTGGAAGAAAACCCGGGCCCGCGAGCAAAGAGGAATATTATGGCTCTGCCTGTTACGGCACTGCTCCTTCCGCTTGCATTGTTGTTGCACGCAGCGCGGCCCCAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCAATTAGCGGGGACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATACCGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAATCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCCGGTGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTTCGGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTCGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAAGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCCGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGAAGAGGCACTAAGCTGGAAATCAAGGCTAGCGCAACCACTACGCCTGCTCCGCGGCCTCCAACGCCCGCGCCCACGATAGCTAGTCAGCCGTTGTCTCTCCGACCAGAGGCGTGTAGACCGGCCGCTGGCGGAGCCGTACATACTCGCGGACTCGACTTCGCTTGCGACATCTACATTTGGGCACCCTTGGCTGGGACCTGTGGGGTGCTGTTGCTGTCCTTGGTTATTACGTTGTACTGCAGAGTCAAATTTTCCAGGTCCGCAGATGCCCCCGCGTACCAGCAAGGCCAGAACCAACTTTACAACGAACTGAACCTGGGTCGCCGGGAGGAATATGATGTGCTGGATAAACGAAGGGGGAGGGACCCTGAGATGGGAGGGAAACCTCGCAGGAAAAACCCGCAGGAAGGTTTGTACAACGAGTTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAGGCTTACTCTGAAATAGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGAGGAAAAGGCCATGATGGCCTTTACCAGGGCTTAAGCACAGCAACAAAGGATACTTACGACGCTCTTCACATGCAAGCTCTGCCACCACGG
配列番号110は、LTG 2948 DuoCAR D93 CAR2019 ICOZz 2A CAR22zのアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRAKRNIMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYTDYAVSVKNRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGRGTKLEIKASATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号111は、LTG 2949 DuoCAR D94 CAR2019 OX40z 2A CAR22zのヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCAACGACCACTCCAGCACCGAGACCGCCAACCCCCGCGCCTACCATCGCAAGTCAACCACTTTCTCTCAGGCCTGAAGCGTGCCGACCTGCAGCTGGTGGGGCAGTACATACCAGGGGTTTGGACTTCGCATGTGACGTGGCGGCAATTCTCGGCCTGGGACTTGTCCTTGGTCTGCTTGGTCCGCTCGCAATACTTCTGGCCTTGTACCTGCTCCGCAGAGACCAAAGACTTCCGCCCGACGCCCACAAGCCCCCAGGAGGAGGTTCCTTCAGAACGCCTATACAAGAAGAACAAGCAGATGCCCACTCTACCCTGGCTAAAATCAGGGTGAAGTTTAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGGCGCGCGAAACGCGGCAGCGGCGCGACCAACTTTAGCCTGCTGAAACAGGCGGGCGATGTGGAAGAAAACCCGGGCCCGCGAGCAAAGAGGAATATTATGGCTCTGCCTGTTACGGCACTGCTCCTTCCGCTTGCATTGTTGTTGCACGCAGCGCGGCCCCAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCAATTAGCGGGGACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATACCGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAATCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCCGGTGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTTCGGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTCGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAAGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCCGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGAAGAGGCACTAAGCTGGAAATCAAGGCTAGCGCAACCACTACGCCTGCTCCGCGGCCTCCAACGCCCGCGCCCACGATAGCTAGTCAGCCGTTGTCTCTCCGACCAGAGGCGTGTAGACCGGCCGCTGGCGGAGCCGTACATACTCGCGGACTCGACTTCGCTTGCGACATCTACATTTGGGCACCCTTGGCTGGGACCTGTGGGGTGCTGTTGCTGTCCTTGGTTATTACGTTGTACTGCAGAGTCAAATTTTCCAGGTCCGCAGATGCCCCCGCGTACCAGCAAGGCCAGAACCAACTTTACAACGAACTGAACCTGGGTCGCCGGGAGGAATATGATGTGCTGGATAAACGAAGGGGGAGGGACCCTGAGATGGGAGGGAAACCTCGCAGGAAAAACCCGCAGGAAGGTTTGTACAACGAGTTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAGGCTTACTCTGAAATAGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGAGGAAAAGGCCATGATGGCCTTTACCAGGGCTTAAGCACAGCAACAAAGGATACTTACGACGCTCTTCACATGCAAGCTCTGCCACCACGG
配列番号112は、LTG 2949 DuoCAR D94 CAR2019 OX40z 2A CAR22zのアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRAKRNIMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYTDYAVSVKNRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGRGTKLEIKASATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号113は、LTG 2950 DuoCAR D95 CAR2019 OX40z 2A CAR22 ICOSzのヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCAACGACCACTCCAGCACCGAGACCGCCAACCCCCGCGCCTACCATCGCAAGTCAACCACTTTCTCTCAGGCCTGAAGCGTGCCGACCTGCAGCTGGTGGGGCAGTACATACCAGGGGTTTGGACTTCGCATGTGACGTGGCGGCAATTCTCGGCCTGGGACTTGTCCTTGGTCTGCTTGGTCCGCTCGCAATACTTCTGGCCTTGTACCTGCTCCGCAGAGACCAAAGACTTCCGCCCGACGCCCACAAGCCCCCAGGAGGAGGTTCCTTCAGAACGCCTATACAAGAAGAACAAGCAGATGCCCACTCTACCCTGGCTAAAATCAGGGTGAAGTTTAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGGCGCGCGAAACGCGGCAGCGGCGCGACCAACTTTAGCCTGCTGAAACAGGCGGGCGATGTGGAAGAAAACCCGGGCCCGCGAGCAAAGAGGAATATTATGGCTCTGCCTGTTACGGCACTGCTCCTTCCGCTTGCATTGTTGTTGCACGCAGCGCGGCCCCAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCAATTAGCGGGGACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATACCGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAATCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCCGGTGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTTCGGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTCGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAAGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCCGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGAAGAGGCACTAAGCTGGAAATCAAGGCTAGCGCAACCACTACGCCTGCTCCGCGGCCTCCAACGCCCGCGCCCACGATAGCTAGTCAGCCGTTGTCTCTCCGACCAGAGGCGTGTAGACCGGCCGCTGGCGGAGCCGTACATACTCGCGGACTCGACTTCGCTTGCGACATCTACATTTGGGCACCCTTGGCTGGGACCTGTGGGGTGCTGTTGCTGTCCTTGGTTATTACGTTGTACTGCTGGCTGACAAAAAAGAAGTATTCATCTAGTGTACATGATCCGAACGGTGAATACATGTTCATGCGCGCGGTGAACACGGCCAAGAAGAGCAGACTGACCGACGTAACCCTTAGAGTCAAATTTTCCAGGTCCGCAGATGCCCCCGCGTACCAGCAAGGCCAGAACCAACTTTACAACGAACTGAACCTGGGTCGCCGGGAGGAATATGATGTGCTGGATAAACGAAGGGGGAGGGACCCTGAGATGGGAGGGAAACCTCGCAGGAAAAACCCGCAGGAAGGTTTGTACAACGAGTTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAGGCTTACTCTGAAATAGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGAGGAAAAGGCCATGATGGCCTTTACCAGGGCTTGAGCACAGCAACAAAGGATACTTACGACGCTCTTCACATGCAAGCTCTGCCACCACGG
配列番号114は、LTG 2950 DuoCAR D95 CAR2019 OX40z 2A CAR22 ICOSzのアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRAKRNIMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYTDYAVSVKNRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGRGTKLEIKASATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号115は、LTG 2951 DuoCAR D96 CAR2019 27z 2A CAR22 ICOSzのヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCGACTACCACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTGCGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCTCTGGTCATTACCCTGTACTGCCAACGGCGCAAATACCGCTCCAATAAAGGCGAAAGTCCGGTAGAACCCGCAGAACCTTGCCACTACAGTTGTCCCAGAGAAGAAGAGGGTTCTACAATACCTATTCAAGAGGACTATAGGAAACCAGAGCCCGCATGTAGTCCCAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGGCGCGCGAAACGCGGCAGCGGCGCGACCAACTTTAGCCTGCTGAAACAGGCGGGCGATGTGGAAGAAAACCCGGGCCCGCGAGCAAAGAGGAATATTATGGCTCTGCCTGTTACGGCACTGCTCCTTCCGCTTGCATTGTTGTTGCACGCAGCGCGGCCCCAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCAATTAGCGGGGACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATACCGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAATCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCCGGTGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTTCGGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTCGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAAGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCCGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGAAGAGGCACTAAGCTGGAAATCAAGGCTAGCGCAACCACTACGCCTGCTCCGCGGCCTCCAACGCCCGCGCCCACGATAGCTAGTCAGCCGTTGTCTCTCCGACCAGAGGCGTGTAGACCGGCCGCTGGCGGAGCCGTACATACTCGCGGACTCGACTTCGCTTGCGACATCTACATTTGGGCACCCTTGGCTGGGACCTGTGGGGTGCTGTTGCTGTCCTTGGTTATTACGTTGTACTGCTGGCTGACAAAAAAGAAGTATTCATCTAGTGTACATGATCCGAACGGTGAATACATGTTCATGCGCGCGGTGAACACGGCCAAGAAGAGCAGACTGACCGACGTAACCCTTAGAGTCAAATTTTCCAGGTCCGCAGATGCCCCCGCGTACCAGCAAGGCCAGAACCAACTTTACAACGAACTGAACCTGGGTCGCCGGGAGGAATATGATGTGCTGGATAAACGAAGGGGGAGGGACCCTGAGATGGGAGGGAAACCTCGCAGGAAAAACCCGCAGGAAGGTTTGTACAACGAGTTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAGGCTTACTCTGAAATAGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGAGGAAAAGGCCATGATGGCCTTTACCAGGGCTTGAGCACAGCAACAAAGGATACTTACGACGCTCTTCACATGCAAGCTCTGCCACCACGG
配列番号116は、LTG 2951 DuoCAR D96 CAR2019 27z 2A CAR22 ICOSzのアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSPRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRAKRNIMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYTDYAVSVKNRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGRGTKLEIKASATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号117は、D088 CAR2019 ICOSzのヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCGACTACCACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTGCGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCTCTGGTCATTACCCTGTACTGCTGGCTGACAAAAAAGAAGTATTCATCTAGTGTACATGATCCGAACGGTGAATACATGTTCATGCGCGCGGTGAACACGGCCAAGAAGAGCAGACTGACCGACGTAACCCTTAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGG
配列番号118は、D088 CAR2019 ICOSzのアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号119は、D089 CAR22 ICOSzのヌクレオチド配列である。
ATGTTGCTGCTCGTGACCTCGCTCCTTCTGTGCGAGCTGCCCCATCCGGCTTTTCTGCTCATCCCTCAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCAATTAGCGGGGACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATACCGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAATCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCCGGTGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTTCGGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTCGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAAGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCCGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGAAGAGGCACTAAGCTGGAAATCAAGGCGGCCGCGACTACCACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTGCGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCTCTGGTCATTACCCTGTACTGCTGGCTGACAAAAAAGAAGTATTCATCTAGTGTACATGATCCGAACGGTGAATACATGTTCATGCGCGCGGTGAACACGGCCAAGAAGAGCAGACTGACCGACGTAACCCTTAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGG
配列番号120は、D089 CAR22 ICOSzのアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYTDYAVSVKNRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGRGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号121は、D090 CAR2019 OX40zのヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCAACGACCACTCCAGCACCGAGACCGCCAACCCCCGCGCCTACCATCGCAAGTCAACCACTTTCTCTCAGGCCTGAAGCGTGCCGACCTGCAGCTGGTGGGGCAGTACATACCAGGGGTTTGGACTTCGCATGTGACGTGGCGGCAATTCTCGGCCTGGGACTTGTCCTTGGTCTGCTTGGTCCGCTCGCAATACTTCTGGCCTTGTACCTGCTCCGCAGAGACCAAAGACTTCCGCCCGACGCCCACAAGCCCCCAGGAGGAGGTTCCTTCAGAACGCCTATACAAGAAGAACAAGCAGATGCCCACTCTACCCTGGCTAAAATCAGGGTGAAGTTTAGCCGGTCAGCTGATGCACCTGCATATCAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAATGAGCTGAACCTCGGACGAAGAGAGGAGTACGACGTGTTGGACAAAAGACGAGGTAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCGAGAAGAAAAAACCCACAAGAAGGGCTTTATAATGAGCTTCAGAAAGATAAGATGGCAGAGGCCTACAGTGAGATTGGCATGAAGGGCGAAAGAAGGAGGGGCAAAGGACACGACGGTCTCTACCAAGGCCTCAGCACGGCTACCAAAGATACGTATGACGCATTGCATATGCAGGCATTGCCGCCCCGC
配列番号122は、D090 CAR2019 OX40zのアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号123は、D091 CAR2019 CD27zのヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCGACTACCACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTGCGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCTCTGGTCATTACCCTGTACTGCCAACGGCGCAAATACCGCTCCAATAAAGGCGAAAGTCCGGTAGAACCCGCAGAACCTTGCCACTACAGTTGTCCCAGAGAAGAAGAGGGTTCTACAATACCTATTCAAGAGGACTATAGGAAACCAGAGCCCGCATGTAGTCCCAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGG
配列番号124は、D091 CAR2019 CD27zのアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSPRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号125は、D92 CAR22zのヌクレオチド配列である。
ATGTTGCTGCTCGTGACCTCGCTCCTTCTGTGCGAGCTGCCCCATCCGGCTTTTCTGCTCATCCCTCAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCAATTAGCGGGGACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATACCGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAATCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCCGGTGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTTCGGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTCGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAAGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCCGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGAAGAGGCACTAAGCTGGAAATCAAGGCGGCCGCAACCACTACACCAGCTCCGCGGCCACCCACCCCAGCACCAACAATAGCCAGTCAGCCTTTGTCTCTGAGACCTGAGGCTTGTCGACCCGCTGCAGGTGGGGCAGTTCATACTCGGGGTCTTGATTTCGCCTGCGATATATATATTTGGGCCCCCCTGGCGGGCACGTGTGGGGTGCTCCTTCTTTCACTCGTAATTACTCTTTACTGTAGGGTTAAGTTCTCACGATCCGCCGATGCGCCAGCATACCAACAGGGACAGAACCAACTTTATAATGAGCTGAATCTTGGTCGCAGGGAAGAATATGATGTACTTGATAAACGCAGAGGCCGGGATCCCGAGATGGGAGGGAAACCTCGGAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAATGAATTGCAAAAAGATAAAATGGCTGAAGCTTATTCAGAGATTGGAATGAAAGGCGAGCGGAGAAGAGGAAAAGGGCACGACGGGCTTTACCAAGGACTGTCCACCGCGACAAAGGACACGTACGACGCCCTTCATATGCAGGCGCTTCCTCCACGA
配列番号126は、D92 CAR22zのアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYTDYAVSVKNRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGRGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

Claims (37)

  1. 少なくとも1つのマルチシストロン性ベクターをコードする1つまたは複数の単離された核酸分子を含む免疫療法組成物であって、各マルチシストロン性ベクターが、配列番号54、56、60、62、110、112、114、または116のアミノ酸配列を含む少なくとも1つの機能的CARをコードし、前記マルチシストロン性ベクターのうち少なくとも1つにおける少なくとも1つの結合性ドメインが、同一ではなく、それによって、マルチシストロン性ベクターの組合せが、2つ以上の同一ではない機能的CAR分子の発現をもたらし、各機能的CAR分子が、膜貫通ドメインおよび1つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結された少なくとも1つの結合性ドメインをコードする、免疫療法組成物。
  2. (a)少なくとも1つのマルチシストロン性ベクターであって、各マルチシストロン性ベクターが、細胞において機能的である核酸配列を含む、マルチシストロン性ベクターを含み;
    (b)各マルチシストロン性ベクターが、配列番号54、56、60、62、110、112、114、または116のアミノ酸配列を含む機能的CAR分子をコードし;
    (c)各機能的CAR分子が、少なくとも1つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み;
    (d)前記機能的CAR分子のうち1つにおける前記少なくとも1つの結合性ドメインが、同一ではなく;
    (e)前記少なくとも1つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、少なくとも1つのリンカードメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達モチーフが、各前記機能的CAR分子において共有結合的に連結されており、機能的CAR分子の組合せが、1つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、
    免疫療法組成物。
  3. (a)少なくとも1つのマルチシストロン性ベクターであって、各マルチシストロン性ベクターが、細胞において機能的である核酸配列を含む、マルチシストロン性ベクターを含み;
    (b)各マルチシストロン性ベクターが、配列番号54、56、60、62、110、112、114、または116のアミノ酸配列を含む1つまたは複数の機能的CARをコードし;
    (c)各機能的CAR分子が、少なくとも1つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み;
    (d)各CARにおける前記少なくとも1つの結合性ドメイン(複数可)が、別の機能的CAR分子における少なくとも1つの結合性ドメインと同一ではなく;
    (e)前記少なくとも1つのシグナル伝達モチーフが、マルチシストロン的に共発現された前記機能的CAR分子それぞれの間で同一ではなく;
    (f)前記少なくとも1つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達モチーフが、各前記マルチシストロン性ベクターにおいて共有結合的に連結されており、1つまたは複数のマルチシストロン性ベクターが、1つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、
    免疫療法組成物。
  4. 各マルチシストロン性ベクターが、配列番号54、56、60、62、110、112、114、または116のアミノ酸配列を含む1つよりも多い機能的CARをコードする、請求項1~3に記載の免疫療法組成物。
  5. 前記リンパ球集団(複数可)が、自家T細胞、または末梢血由来リンパ球の混合物を含む、請求項2または3に記載の免疫療法組成物。
  6. 前記機能的CAR分子の少なくとも1つの細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する抗体の少なくとも1つの単鎖可変断片を含む、請求項2または3に記載の免疫療法組成物。
  7. 前記機能的CAR分子の少なくとも1つの細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する抗体の少なくとも1つの重鎖可変領域を含む、請求項2または3に記載の免疫療法組成物。
  8. 前記機能的CAR分子の少なくとも1つの細胞外抗原結合性ドメイン、前記CARの前記少なくとも1つの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその両方が、リンカーまたはスペーサードメインによって前記膜貫通ドメインに接続されている、請求項2または3に記載の免疫療法組成物。
  9. 前記機能的CAR分子の細胞外抗原結合性ドメインに、リーダーペプチドが先行する、請求項2または3に記載の免疫療法組成物。
  10. 前記CARの細胞外抗原結合性ドメインが、CD19、CD20、CD22、ROR1、TSLPR、メソセリン、CD33、CD38、CD123(IL3RA)、CD138、BCMA(CD269)、GPC2、GPC3、FGFR4、c-Met、PSMA、糖脂質F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR、またはそれらの任意の組合せを含む抗原を標的化する、請求項2または3に記載の免疫療法組成物。
  11. 前記CARの細胞外抗原結合性ドメインが、抗CD19 scFV抗原結合性ドメイン、抗CD20 scFV抗原結合性ドメイン、抗CD22 scFV抗原結合性ドメイン、抗ROR1 scFV抗原結合性ドメイン、抗TSLPR scFV抗原結合性ドメイン、抗メソセリンscFV抗原結合性ドメイン、抗CD33 scFV抗原結合性ドメイン、抗CD38 scFV抗原結合性ドメイン、抗CD123(IL3RA) scFV抗原結合性ドメイン、抗CD138 scFV抗原結合性ドメイン、抗BCMA(CD269) scFV抗原結合性ドメイン、抗GPC2 scFV抗原結合性ドメイン、抗GPC3 scFV抗原結合性ドメイン、抗FGFR4 scFV抗原結合性ドメイン、抗c-Met scFV抗原結合性ドメイン、抗PMSA scFV抗原結合性ドメイン、抗糖脂質F77 scFV抗原結合性ドメイン、抗EGFRvIII scFV抗原結合性ドメイン、抗GD-2 scFV抗原結合性ドメイン、抗NY-ESo-1 TCR scFV抗原結合性ドメイン、抗MAGE A3 TCR scFV抗原結合性ドメイン、または85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するそのアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項2または3に記載の免疫療法組成物。
  12. 前記機能的CAR分子の前記リンカーまたはスペーサードメインが、CD8の細胞外ドメインに由来し、前記膜貫通ドメインに連結されている、請求項2または3に記載の免疫療法組成物。
  13. 前記機能的CAR分子が、T細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD271、TNFRSF19、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインをさらに含む、請求項2または3に記載の免疫療法組成物。
  14. 前記少なくとも1つの細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3ゼータ細胞内ドメインをさらに含む、請求項2または3に記載の免疫療法組成物。
  15. 前記少なくとも1つの細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3ゼータ細胞内ドメインに対してC末端側に配置されている、請求項2または3に記載の免疫療法組成物。
  16. 前記少なくとも1つの細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項2または3に記載の免疫療法組成物。
  17. 前記少なくとも1つの共刺激ドメインが、OX40、CD70、CD27、CD28、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、DAP10、DAP12および4-1BB(CD137)の機能的シグナル伝達ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項16に記載の免疫療法組成物。
  18. 単一のウイルスベクターが、組み込みのためのCRISPRシステムと組み合わせて、全てのキメラ抗原受容体をコードするために使用される(例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、SV40ベクター、ヘルペスベクター、POXベクター、またはコスミドベクター)、請求項1~3に記載の免疫療法組成物。
  19. 各マルチシストロン性ベクターが、RNAベクターまたはDNAベクターである、請求項1~3に記載の免疫療法組成物。
  20. 少なくとも1つのマルチシストロン性ベクターが、細胞において核酸の発現を調節する核酸分子を発現する、請求項1~3に記載の免疫療法組成物。
  21. 前記核酸分子が、内因性遺伝子の発現を阻害するまたは欠失させる、請求項20に記載の免疫療法組成物。
  22. 抗腫瘍有効量のヒトリンパ球細胞の集団を含む医薬組成物であって、前記集団の前記細胞が、少なくとも1つのマルチシストロン性ベクターをコードする核酸分子を含む細胞を含み、各マルチシストロン性ベクターが、配列番号54、56、60、62、110、112、114、または116のアミノ酸配列を含む機能的CARをコードし、前記マルチシストロン性ベクターのうち1つにおける少なくとも1つの結合性ドメイン(複数可)が、同一ではなく、それによって、マルチシストロン性ベクターの組合せが、2つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各マルチシストロン性ベクターがコードする結合性ドメイン(複数可)が、膜貫通ドメインおよび1つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されている、医薬組成物。
  23. 抗腫瘍有効量のヒトリンパ球細胞の集団を含む医薬組成物であって、前記集団の前記細胞が、(a)1つまたは複数のマルチシストロン性ベクターをコードする核酸分子を含む細胞を含み;(b)各マルチシストロン性ベクターが、配列番号54、56、60、62、110、112、114、または116のアミノ酸配列を含む機能的CARをコードし;(c)各機能的CAR分子が、少なくとも1つの結合性ドメイン、少なくとも1つの膜貫通ドメイン、少なくとも1つのリンカードメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達モチーフで構成され;(d)前記マルチシストロン性ベクターのうち1つにおける前記少なくとも1つの結合性ドメインが、同一ではなく;(e)前記少なくとも1つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、少なくとも1つのリンカードメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達モチーフが、各前記マルチシストロン性ベクターにおいて共有結合的に連結されており、マルチシストロン性ベクターの組合せが、1つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、医薬組成物。
  24. 抗腫瘍有効量のヒトリンパ球細胞の集団を含む医薬組成物であって、前記集団の前記細胞が、(a)1つまたは複数のマルチシストロン性ベクターをコードする核酸分子を含む細胞を含み;(b)各マルチシストロン性ベクターが、配列番号54、56、60、62、110、112、114、または116のアミノ酸配列を含む機能的CARをコードし;(c)各機能的CAR分子が、少なくとも1つの結合性ドメイン、少なくとも1つの膜貫通ドメイン、少なくとも1つのリンカードメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み;(d)各ベクターにおける前記少なくとも1つの結合性ドメイン(複数可)が、同一ではなく;(e)前記少なくとも1つのシグナル伝達モチーフの組合せが、前記マルチシストロン性ベクターそれぞれの間で同一ではなく;(f)前記少なくとも1つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、少なくとも1つのリンカードメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達モチーフが、各前記マルチシストロン性ベクターにおいて共有結合的に連結されており、1つまたは複数のマルチシストロン性ベクターの組合せが、1つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、医薬組成物。
  25. 前記リンパ球細胞が、血液学的がんを有するヒトのT細胞である、請求項23または24に記載の医薬組成物。
  26. 前記血液学的がんが、白血病またはリンパ腫である、請求項23または24に記載の医薬組成物。
  27. 前記白血病が、慢性リンパ性白血病(CLL)、急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、または慢性骨髄性白血病(CML)である、請求項23または24に記載の医薬組成物。
  28. 前記リンパ腫が、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫またはホジキンリンパ腫である、請求項23または24に記載の医薬組成物。
  29. 前記血液学的がんが多発性骨髄腫である、請求項23または24に記載の医薬組成物。
  30. ヒトがんが、口腔および咽頭がん(舌、口、咽頭、頭頸部)、消化器系がん(食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、肝内胆管、胆嚢、膵臓)、呼吸器系がん(喉頭、肺および気管支)、骨および関節のがん、軟組織がん、皮膚がん(黒色腫、基底細胞癌および扁平上皮癌)、小児腫瘍(神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫)、中枢神経系の腫瘍(脳腫瘍、星状細胞腫、神経膠芽腫、神経膠腫)、ならびに乳房、生殖系(子宮頸部、子宮体、卵巣、外陰部、腟、前立腺、精巣、陰茎、子宮内膜)、泌尿器系(膀胱、腎臓および腎盂、尿管)、眼および眼窩、内分泌系(甲状腺)ならびに脳および他の神経系のがん、またはそれらの任意の組合せを含む成人癌を含む、請求項23または24に記載の医薬組成物。
  31. 腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害、または状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、少なくとも1つのマルチシストロン性ベクターであって、各ベクターが、配列番号54、56、60、62、110、112、114、または116のアミノ酸配列を含む機能的CARをコードし、前記マルチシストロン性ベクターのうち1つにおける少なくとも1つの結合性ドメイン(複数可)が、同一ではなく、それによって、マルチシストロン性ベクターの組合せが、2つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各ベクターがコードする結合性ドメイン(複数可)が、膜貫通ドメインおよび1つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されている、マルチシストロン性ベクター、ならびに薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、マルチシストロン性ベクターの前記組合せが、1つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、方法。
  32. 腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害、または状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、(a)2つ以上のベクターをコードする核酸分子を含み;(b)各ベクターが、配列番号54、56、60、62、110、112、114、または116のアミノ酸配列を含む機能的CARをコードし;(c)各機能的CAR分子が、少なくとも1つの結合性ドメイン、少なくとも1つの膜貫通ドメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達モチーフで構成され;(d)前記マルチシストロン性ベクターのうち1つにおける少なくとも1つの結合性ドメインが、同一ではなく;(e)前記少なくとも1つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達モチーフが、各前記マルチシストロン性ベクターにおいて共有結合的に連結されており、マルチシストロン性ベクターの組合せが、1つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
  33. 腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害、または状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、(a)1つまたは複数のマルチシストロン性ベクターをコードする核酸分子を含み;(b)各マルチシストロン性ベクターが、配列番号54、56、60、62、110、112、114、または116のアミノ酸配列を含む機能的CARをコードし;(c)各機能的CAR分子が、少なくとも1つの結合性ドメイン、少なくとも1つの膜貫通ドメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み;(d)各マルチシストロン性ベクターにおける前記少なくとも1つの結合性ドメイン(複数可)が、同一ではなく;(e)前記少なくとも1つのシグナル伝達モチーフの組合せが、前記マルチシストロン性ベクターそれぞれの間で同一ではなく;(f)前記少なくとも1つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および少なくとも1つの細胞内シグナル伝達モチーフが、各前記マルチシストロン性ベクターにおいて共有結合的に連結されており、1つまたは複数のマルチシストロン性ベクターの組合せが、1つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
  34. 前記遺伝子改変されたリンパ球が、自家リンパ球であり、自家または同種リンパ球が、悪性腫瘍疾患の再発を防ぐために、患者に直接注入して戻される、請求項31~33に記載の方法。
  35. 前記遺伝子改変されたリンパ球が、自家T細胞であり、前記自家T細胞が、in vivo増殖を促進するために、患者に直接注入して戻され、患者特異的な抗腫瘍T細胞の持続が、患者特異的な様式で、腫瘍の安定化、低減、排除、寛解、またはがんもしくはがんの再発の排除をもたらす、請求項31~33に記載の方法。
  36. 前記T細胞が、特異的活性化または記憶に関連する表面マーカーの発現によって事前選択されている、請求項31~33に記載の方法。
  37. 前記T細胞および樹状細胞が造血幹細胞ドナーに由来し、手順が造血幹細胞移植の状況で行われる、請求項31~33に記載の方法。
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