CN115768462A - 用DuoCAR治疗癌症的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文中提供了：新的治疗性免疫治疗组合物，其包含至少两种载体，每种载体编码功能性CAR，因此载体的组合导致两种或更多种不同结合结构域的表达，其中每种载体所编码的结合结构域与跨膜结构域和一个或更多个不同的胞内信号传导基序共价连接；以及在可用于治疗癌症和其他疾病和病症的患者特异性免疫治疗中使用所述组合物的方法。

Description

用DuoCAR治疗癌症的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本PCT申请要求于2019年11月22日提交的美国发明专利申请16/692,957的优先权，所述美国发明专利申请16/692,957要求于2019年9月18日提交的PCT申请No.PCT/US19/51734的优先权，所述PCT申请No.PCT/US19/51734又要求于2018年9月18日提交的美国发明专利申请No.16/134,735的优先权，所述美国发明专利申请No.16/134,735是2018年8月21日提交的美国发明专利申请No.16/078,269的部分继续申请，所述美国发明专利申请No.16/078,269又要求2017年9月1日提交的PCT申请No.PCT/US17/49923的优先权，所述PCT申请No.PCT/US17/49923又根据35U.S.C.第119(e)节要求于2016年9月2日提交的美国临时专利申请No.62/382,791的优先权权益，其每一个的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本申请涉及癌症领域，特别地涉及包含编码功能性嵌合抗原受体的至少两种载体的组合物以及在患者特异性免疫治疗中使用所述组合物的方法。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且在此通过引用整体并入。所述ASCII拷贝创建于2020年11月19日，命名为Sequence Listing.txt，并且大小为366千字节。
背景技术
癌症是对人健康最致命的威胁之一。仅在美国，癌症每年就影响近130万新患者，并且是继心血管疾病之后的第二大死因，占死亡的约四分之一。实体瘤是造成这些死亡中的大多数的原因。尽管在某些癌症的医学治疗方面有显著的进展，但是在过去20年里，所有癌症的总体5年生存率仅提高了约10％。癌症或恶性肿瘤以不受控制的方式迅速生长和转移，这使治疗极为困难。现代癌症治疗的困难之一是癌症的活检和诊断与患者的有效治疗之间流逝的时间量。在此期间，患者的肿瘤可能会不受阻碍地生长，使得疾病在实施治疗前进一步进展。这不利地影响了癌症的预后和结局。
嵌合抗原受体(DuoCAR)是包含三个基本单元的杂合分子：(1)胞外抗原结合基序，(2)连接/跨膜基序，以及(3)胞内T细胞信号传导基序(Long AH，Haso WM，OrentasRJ.Lessons learned from a highly-active CD22-specific chimeric antigenreceptor.Oncoimmunology.2013；2(4)：e23621)。CAR的抗原结合基序通常在免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)分子的最小结合结构域单链可变片段(single chain Fragmentvariable，scFv)之后形成。还已经工程化改造了替代的抗原结合基序，例如受体配体(即，IL-13已被工程化改造为结合肿瘤表达的IL-13受体)、完整的免疫受体、文库来源的肽和固有免疫系统效应分子(例如NKG2D)。用于CAR表达的替代细胞靶标(例如NK或γ-δT细胞)也在开发中(Brown CE等，Clin Cancer Res.2012；18(8)：2199-209；Lehner M等，PLoSOne.2012；7(2)：e31210)。关于限定最活跃的T细胞群以用CAR载体进行转导，确定最佳培养和扩增技术，以及限定CAR蛋白质结构本身的分子细节，仍然有重要的工作。
CAR的连接基序可以是相对稳定的结构结构域，例如IgG的恒定结构域，或设计成延伸的柔性接头。可使用结构基序(例如来源于IgG恒定结构域的那些)来使scFv结合结构域延伸远离T细胞质膜表面。这对于其中结合结构域特别接近肿瘤细胞表面膜的一些肿瘤靶标(例如对于二唾液酸神经节苷脂GD2；Orentas等，未发表的观察结果)来说可以是重要的。迄今为止，CAR中使用的信号传导基序总是包含CD3-ζ链，因为该核心基序是T细胞活化的关键信号。首次报道的第二代CAR的特征在于CD28信号传导结构域和CD28跨膜序列。该基序也用于包含CD137(4-1BB)信号传导基序的第三代CAR中(Zhao Y等，J Immunol.2009；183(9)：5563-74)。随着利用与抗CD3和抗CD28抗体连接的珠来活化T细胞的新技术的出现，来自CD28的经典“信号2”的存在不再需要由CAR本身编码。使用珠活化，发现第三代载体在体外测定中并不优于第二代载体，并且它们在白血病的小鼠模型中并不提供优于第二代载体的明显益处(Haso W，Lee DW，Shah NN，Stetler-Stevenson M，Yuan CM，Pastan IH，Dimitrov DS，Morgan RA，FitzGerald DJ，Barrett DM，Wayne AS，Mackall CL，OrentasRJ.Anti-CD22-chimeric antigen receptors targeting B cell precursor acutelymphoblastic leukemia.Blood.2013；121(7)：1165-74；Kochenderfer JN等，Blood.2012；119(12)：2709-20)。第二代CD28/CD3-ζ中CD19特异性CAR的临床成功(Lee DW等，American Society of Hematology Annual Meeting.New Orleans，LA；十二月，7-10，2013)和CD137/CD3-ζ信号传导形式(Porter DL等，N Engl J Med.2011；365(8)：725-33)证实了这一点。除CD137之外，其他肿瘤坏死因子受体超家族成员(例如OX40)也能够在CAR转导的T细胞中提供重要的持久信号(Yvon E等，Clin Cancer Res.2009；15(18)：5852-60)。培养CAR T细胞群的培养条件同样重要。
在癌症的CAR治疗的更广泛且有效的适应中，当前的挑战涉及缺乏令人信服的靶标。产生细胞表面抗原的结合物(binder)目前是容易实现的，但是找到对肿瘤具有特异性同时避开(spare)正常组织的细胞表面抗原仍然是一个艰巨的挑战。使表达CAR的T细胞具有更高靶细胞特异性的一种潜在方式是使用组合CAR方法。在一个系统中，CD3-ζ和CD28信号单元被划分在同一细胞中表达的两个不同CAR构建体之间；在另一系统中，两个DuoCAR在同一T细胞中表达，但其中一个具有更低的亲和力并因此需要首先接合供替选的CAR以用于第二个的完整活性(Lanitis E等，Cancer Immunol Res.2013；1(1)：43-53；Kloss CC等，Nat Biotechnol.2013；31(1)：71-5)。对于产生作为免疫治疗剂的单个基于scFv的CAR的第二个挑战是肿瘤细胞异质性。至少一个研究小组已经开发了用于胶质母细胞瘤的CAR策略，其中效应细胞群同时靶向多种抗原(HER2、IL-13Ra、EphA2)，以期避免靶抗原阴性群的生长(Hegde M等，Mol Ther.2013；21(11)：2087-101)。
基于T细胞的免疫治疗已成为合成生物学中的新前沿；考虑了多个启动子和基因产物以将这些高度强效的细胞引导至肿瘤微环境，在那里T细胞既可逃避负调节信号，又可介导有效的肿瘤杀伤。通过药物诱导的诱导型胱天蛋白酶9(caspase 9)构建体与AP1903的二聚化消除不期望的T细胞示出了这样一种方式，其中可药理学地启动可控制T细胞群的强大开关(Di Stasi A等，N Engl J Med.2011；365(18)：1673-83)。通过诱饵受体的表达来产生对转化生长因子-β的负调控作用免疫的效应T细胞群进一步示出效应T细胞可被工程化改造以达到最佳抗肿瘤活性的程度(Foster AE等，J Immunother.2008；31(5)：500-5)。
因此，尽管CAR似乎能够以类似于内源性T细胞受体的方式触发T细胞活化，但迄今为止基于CAR的技术的临床应用的主要障碍一直限于CAR+T细胞的体内扩增、输注之后细胞的迅速消失、令人失望的临床活性、潜在医学疾病或病症的复发、以及使用这样的CAR+T细胞的癌症的诊断与及时治疗之间流逝的过长的时间。
因此，本领域迫切且感到长期需要发现用于使用基于CAR的治疗来治疗癌症的组合物和方法，其可显示癌症特异性的预期治疗特性而没有上述缺点。
本发明通过提供包含编码功能性嵌合抗原受体的至少两种载体的组合物以及在可用于治疗癌症和其他疾病和/或病症的患者特异性免疫治疗中使用所述组合物的方法解决了这些需求。
特别地，如本文中公开和描述的本发明提供了免疫治疗组合物，其包含编码至少两种载体的一种或更多种分离的核酸分子，每种载体编码功能性DuoCAR，因此载体的组合导致两种或更多种不同结合结构域的表达，其中每种载体所编码的结合结构域与跨膜结构域和一个或更多个不同的胞内信号传导基序共价连接，该免疫治疗组合物可用于转导自体淋巴细胞以产生活跃的患者特异性抗肿瘤淋巴细胞群，其可直接输注回到患者中以促进患者特异性抗肿瘤T细胞的体内扩增、持续(persistence)，导致以患者特异性方式发生肿瘤稳定化、减退、消除、癌症缓解、或者癌症复发的预防或改善、或者其组合。
发明概述
本文中提供了包含两种或更多种载体转导的淋巴细胞的新的过继免疫治疗组合物，以及在可用于治疗癌症和其他疾病和病症的患者特异性组合免疫治疗中使用所述组合物的方法。
因此，在一个方面中，本文中提供了表达Duo嵌合抗原受体(Duo chimericantigen receptor，DuoCAR)的慢病毒载体，以及编码表达DuoCAR之慢病毒载体的核酸分子。还提供了使用所公开的表达DuoCAR的慢病毒载体、宿主细胞和核酸分子的方法，例如，以在对象中治疗癌症。
在一个方面中，提供了免疫治疗组合物，其包含编码至少两种载体(DuoCAR)的一种或更多种分离的核酸分子，每种载体编码功能性CAR，其中一种载体中的至少一个结合结构域是不同的，并且因此载体的组合导致两种或更多种不同结合结构域的表达，其中每种载体所编码的结合结构域与跨膜结构域和一个或更多个不同的胞内信号传导基序共价连接。
在一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其包含编码至少三种载体(TrioCAR)的一种或更多种分离的核酸分子，每种载体编码功能性CAR，因此载体的组合导致两种或更多种不同结合结构域的表达，其中每种载体所编码的结合结构域与跨膜结构域和一个或更多个不同的胞内信号传导基序共价连接。
在一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其包含编码至少四种载体(QuatroCAR)的一种或更多种分离的核酸分子，每种载体编码功能性CAR，因此载体的组合导致两种或更多种不同结合结构域的表达，其中每种载体所编码的结合结构域与跨膜结构域和一个或更多个不同的胞内信号传导基序共价连接。
在另一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其包含编码至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种载体(例如，“nCAR”)的一种或更多种分离的核酸分子，每种载体编码功能性CAR，因此载体的组合导致两种或更多种不同结合结构域的表达，其中每种载体所编码的结合结构域与跨膜结构域和一个或更多个不同的胞内信号传导基序共价连接，其中当组装成CAR产物时，nCAR组(set)的每个独特成员构成独特的CAR组合物，其在本文中称为“nCAR”(例如，DuoCAR、TrioCAR、QuatroCAR、PentaCAR、HexaCAR、HeptaCAR、OctaCAR、NonaCAR和DecaCAR等)。
在一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其包含：(a)至少两种载体，每种包含在细胞中有功能的核酸序列；(b)其中每种载体编码功能性CAR；(c)其中每个CAR包含至少一个结合结构域、单跨膜结构域和至少一个胞内信号传导基序；(d)其中一种载体中的至少一个结合结构域是不同的；并且(e)其中在每种所述载体中至少一个结合结构域、单跨膜结构域、至少一个接头结构域和至少一个胞内信号传导基序共价连接，其中载体的组合用于遗传修饰一个或更多个淋巴细胞群。
在另一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其包含：(a)至少两种载体，每种包含在细胞中有功能的核酸序列；(b)其中每种载体编码功能性CAR；(c)其中每个CAR包含至少一个结合结构域、单跨膜结构域和至少一个胞内信号传导基序；(d)其中每种载体中的至少一个结合结构域是不同的；(e)其中至少一个信号传导基序组合在各载体之间是不同的；并且(f)其中在每种所述载体中至少一个结合结构域、单跨膜结构域和至少一个胞内信号传导基序共价连接，其中两种或更多种载体的组合用于遗传修饰一个或更多个淋巴细胞群。
在一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其中每种载体编码多于一种功能性CAR。
在另一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其中在一个或更多个载体上一个或更多个信号传导基序组合是相同的。
在另一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其中在一个或更多个载体上一个或更多个多结合结构域是相同的。
在另一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其中淋巴细胞群包含自体T细胞或包含外周血来源淋巴细胞的混合物。
在另一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其中CAR的至少一个胞外抗原结合结构域包含与所述抗原结合之抗体的至少一个单链可变片段。
在另一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其中CAR的至少一个胞外抗原结合结构域包含与所述抗原结合之抗体的至少一个重链可变区。
在另一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其中CAR的至少一个胞外抗原结合结构域、CAR的至少一个胞内信号传导结构域或这二者通过接头或间隔区结构域与跨膜结构域连接。
在另一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其中CAR的胞外抗原结合结构域的前面是前导肽。
在另一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其中CAR的胞外抗原结合结构域靶向抗原，所述抗原包含与MHC组合的CD19、CD20、CD22、ROR1、TSLPR、间皮素、CD33、CD38、CD123(IL3RA)、CD138、BCMA(CD269)、GPC2、GPC3、FGFR4、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1、MAGE-A3、PRAME肽、或其任意组合。
在另一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其中CAR的胞外抗原结合结构域包含抗CD19 scFV抗原结合结构域、抗CD20 scFV抗原结合结构域、抗CD22 scFV抗原结合结构域、抗ROR1 scFV抗原结合结构域、抗TSLPR scFV抗原结合结构域、抗间皮素scFV抗原结合结构域、抗CD33 scFV抗原结合结构域、抗CD38 scFV抗原结合结构域、抗CD123(IL3RA)scFV抗原结合结构域、抗CD138 scFV抗原结合结构域、抗BCMA(CD269)scFV抗原结合结构域、抗GPC2 scFV抗原结合结构域、抗GPC3 scFV抗原结合结构域、抗FGFR4 scFV抗原结合结构域、抗c-Met scFV抗原结合结构域、抗PMSA scFV抗原结合结构域、抗糖脂F77 scFV抗原结合结构域、抗EGFRvIII scFV抗原结合结构域、抗GD-2 scFV抗原结合结构域、抗NY-ESO-1TCR(包括单链TCR构建体)抗原结合结构域、抗MAGE-A3TCR、或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列、或其任意组合。
在另一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其中CAR的接头或间隔区结构域来源于CD8的胞外结构域，并与跨膜结构域连接。
在另一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其中CAR还包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自以下的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD271、TNFRSF19、FcεR、或其任意组合。
在另一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其中所述至少一个胞内信号传导结构域还包含CD3ζ胞内结构域。
在另一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其中所述至少一个胞内信号传导结构域相对于CD3ζ胞内结构域设置在C端侧。
在另一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其中所述至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域、主要信号传导结构域、或其任意组合。
在另一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其中所述至少一个共刺激结构域包含OX40、CD70、CD27、CD28、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、DAP10、DAP12和4-1BB(CD137)、PD-1、GITR、CTLA-4的功能性信号传导结构域或其任意组合。
在另一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其中用单一载体编码所有嵌合抗原受体(例如，逆转录病毒、腺病毒、SV40、疱疹病毒载体、POX载体、RNA、质粒、黏粒、或任何病毒载体或非-病毒载体)，与CRISPR系统组合用于整合。
在另一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其中每种载体是RNA载体或DNA载体，其单独或与转染试剂或将RNA或DNA递送到细胞中的方法(一个非限制性实例是电穿孔)组合。
在另一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其中至少一种载体表达调节细胞中核酸表达的核酸分子。
在另一个实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其中核酸分子抑制或删除内源基因的表达。
在某些实施方案中，提供了免疫治疗组合物，其中活跃的患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群在淋巴细胞收获或肿瘤活检的一天、两天、三天、四天、五天、七天、十天、十二天、十四天、二十一天、或一个月内产生，并且其中活跃的患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群可输注回到患有癌症的患者中，并且能够促进患者特异性抗肿瘤淋巴细胞的体内扩增、持续，导致以患者特异性方式发生肿瘤稳定化、减退、消除、癌症缓解、或者癌症复发的预防或改善、或者其组合。
在一个方面中，本文中提供了编码上述嵌合抗原受体的分离的核酸分子。
在本发明免疫治疗组合物的用于患者特异性自体淋巴细胞群的DuoCAR的一个方面中，修饰DuoCAR以表达或包含可检测标志物，以用于诊断、监测和/或预测治疗结局(例如癌症患者的无进展存活)或用于监测这样的治疗的进展。在用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的DuoCAR的一个实施方案中，编码所公开DuoCAR的核酸分子可包含在载体(例如病毒或非病毒载体)中。载体是DNA载体、RNA载体、质粒载体、黏粒载体、疱疹病毒载体、麻疹病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、或逆转录病毒载体、或其组合。
在用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的DuoCAR的某些实施方案中，两种或更多种慢病毒载体用不同的病毒糖蛋白(viral glycoprotein，GP)进行假型化(pseudotype)，所述病毒糖蛋白包括例如但不限于：双嗜性鼠白血病病毒[MLV-A]、狒狒内源性病毒(baboon endogenous virus，BaEV)、GP164、长臂猿白血病病毒[GALV]、RD114、猫内源性病毒逆转录病毒来源的GP和水泡性口炎病毒[VSV]、麻疹病毒、禽疫病毒[FPV]、埃博拉病毒[EboV]、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒[LCMV])非逆转录病毒来源的GP、及其嵌合变体，包括例如但不限于：编码与MLV-A GP的胞质尾区(指定为TR)融合的GALV或RD114 GP的胞外结构域和跨膜结构域的嵌合GP。
在用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的DuoCAR的某些实施方案中，载体还包含启动子，其中启动子是诱导型启动子、组织特异性启动子、组成型启动子、自杀启动子、或其任意组合。
在用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的DuoCAR的另一个实施方案中，可进一步修饰表达CAR的载体以包含一个或更多个操作元件以控制CAR T细胞的表达，或者通过自杀开关消除CAR-T细胞。自杀开关可以包括例如，诱导细胞凋亡的信号传导级联或诱导细胞死亡的药物。在一个优选的实施方案中，可进一步修饰表达CAR的载体以表达酶，例如胸苷激酶(thymidine kinase，TK)或胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase，CD)。
在用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的DuoCAR的另一个方面中，还提供了包含编码DuoCAR的核酸分子的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是T细胞，例如从对象获得的原代T细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是CD8+T细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是CD4+T细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是从患者产品中直接纯化的不考虑比例的所选择的CD4+和CD8+淋巴细胞。在另一个实施方案中，产物中CD4+和CD8+T细胞的数量是特定的。在另一个实施方案中，使用如通过表型标志物识别的T细胞的特定亚群，其包括T初始细胞(T
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cell，Tn)、T效应记忆细胞(T effector memory cell，Tem)、T中央记忆细胞(Tcentral memory cell，Tcm)、T调节细胞(T regulatory cell，Treg)、诱导的T调节细胞(induced T regulatory cell，iTreg)、T抑制细胞(T suppressor cell，Ts)、T干细胞记忆细胞(T stem cell memory cell，Tscm)、自然杀伤(Natural Killer，NK)细胞和淋巴因子活化杀伤(lymphokine activated killer，LAK)细胞。
在另一个实施方案中，提供了药物组合物，其包含抗肿瘤有效量的免疫治疗组合物，所述免疫治疗组合物包含患有癌症的人的患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的群，其中所述群的细胞包含含有以下的细胞：编码至少两种载体的核酸分子，每种载体编码功能性CAR，因此载体的组合导致两种或更多种不同结合结构域的表达，其中每种载体所编码的结合结构域与跨膜结构域和一个或更多个不同的胞内信号传导基序共价连接。
在另一个实施方案中，提供了药物组合物，其包含抗肿瘤有效量的免疫治疗组合物，所述免疫治疗组合物包含患有癌症的人的患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的群，其中所述群的细胞包含含有以下的细胞：(a)编码两种或更多种载体的核酸分子；(b)其中每种载体编码功能性CAR；(c)其中每个CAR包含至少一个结合结构域、至少一个跨膜结构域、至少一个接头结构域和至少一个胞内信号传导基序；(d)其中一种载体中的至少一个结合结构域是不同的；并且(e)其中在每种所述载体中至少一个结合结构域、单跨膜结构域、至少一个接头结构域和至少一个胞内信号传导基序共价连接，其中载体的组合用于遗传修饰一个或更多个淋巴细胞群。
在另一个实施方案中，提供了药物组合物，其包含抗肿瘤有效量的免疫治疗组合物，所述免疫治疗组合物包含患有癌症的人的患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的群，其中所述群的细胞包含含有以下的细胞：(a)编码两种或更多种载体的核酸分子；(b)其中每种载体编码功能性CAR；(c)其中每个CAR包含至少一个结合结构域、至少一个跨膜结构域、至少一个接头结构域和至少一个胞内信号传导基序；(d)其中每种载体中的至少一个结合结构域是不同的；(e)其中至少一个信号传导基序组合在各载体之间是不同的；并且(f)其中在每种所述载体中至少一个结合结构域、单跨膜结构域、至少一个接头结构域和至少一个胞内信号传导基序共价连接，其中两种或更多种载体的组合用于遗传修饰一个或更多个淋巴细胞群。
在一个实施方案中，癌症是对一种或更多种化学治疗剂无响应的难治性癌症。癌症包括造血系统癌症(hematopoietic cancer)、骨髓增生异常综合征、胰腺癌、头颈癌、皮肤肿瘤、以下中的微小残留病(minimal residual disease，MRD)：急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、黑素瘤或其他血癌(hematologicalcancer)和实体瘤、或其任意组合。在另一个实施方案中，癌症包括血癌，例如白血病(例如，慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)或慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML))、淋巴瘤(例如，套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤)或多发性骨髓瘤、或其任意组合。
在另一个实施方案中，癌症包括成人上皮癌(adult carcinoma)，其包括口腔和咽癌症(coral and pharynx cancer)(舌、口、咽、头和颈)、消化系统癌症(食管、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝、肝内胆管、胆囊、胰腺)、呼吸系统癌症(喉、肺和支气管)、骨和关节癌症、软组织癌症、皮肤癌症(黑素瘤、基底和鳞状细胞癌)、儿童肿瘤(神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤(Ewing’s sarcoma))、中枢神经系统肿瘤(脑、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、胶质瘤)，以及乳腺、生殖系统(子宫颈、子宫体、卵巢、外阴、阴道、前列腺、睾丸、阴茎、子宫内膜)、泌尿系统(膀胱、肾和肾盂、输尿管)、眼和眶(orbit)、内分泌系统(甲状腺)以及脑和其他神经系统的癌症、或其任意组合。
在另一方面中，提供了药物组合物，其包含用两种或更多种编码单个或多个嵌合抗原受体(DuoCAR)的慢病毒载体转导的自体淋巴细胞群，因此产生患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群，所述患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群能够促进患者特异性抗肿瘤T细胞的体内扩增、持续，导致以患者特异性方式发生肿瘤稳定化、减退、消除、癌症缓解、或者癌症复发的预防或改善、或者其组合。
在另一方面中，提供了药物组合物，其包含用一种或更多种编码单个或多个嵌合抗原受体(DuoCAR)的慢病毒载体转导的自体T细胞群，以产生患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群，所述患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群能够促进患者特异性抗肿瘤T细胞的体内扩增、持续，导致以患者特异性方式发生肿瘤稳定化、减退、消除、癌症缓解、或者癌症复发的预防或改善、或者其组合。
在另一方面中，提供了制备活跃的患者特异性自体抗肿瘤含Duo CAR的淋巴细胞的方法。所述方法包括用编码两种或更多种特异性结合抗原的嵌合抗原受体(DuoCAR)的两种或更多种载体或核酸分子转导淋巴细胞，从而制备活跃的患者特异性自体抗肿瘤含DuoCAR的淋巴细胞。
在另一方面中，提供了产生RNA工程化改造的淋巴细胞群的方法，所述方法包括将编码两种或更多种嵌合抗原受体(DuoCAR)的核酸分子的体外转录RNA或合成RNA引入到对象的细胞群中，从而产生患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群，所述患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群能够促进患者特异性抗肿瘤T细胞的体内扩增、持续，导致以患者特异性方式发生肿瘤稳定化、减退、消除、癌症缓解、或者癌症复发的预防或改善、或者其组合。
在另一方面中，提供了用于治疗患有与肿瘤抗原的表达升高相关的疾病、障碍或病症的哺乳动物的方法，所述方法包括向对象施用包含抗肿瘤有效量的自体淋巴细胞群的药物组合物，所述自体淋巴细胞群用编码单个或多个嵌合抗原受体(DuoCAR)的一种或更多种慢病毒载体转导，从而产生患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群，所述患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群能够促进患者特异性抗肿瘤T细胞的体内扩增、持续，导致以患者特异性方式发生肿瘤稳定化、减退、消除、癌症缓解、或者癌症复发的预防或改善、或者其组合。
在另一方面中，提供了用于治疗患有与肿瘤抗原的表达升高相关的疾病、障碍或病症的哺乳动物的方法，所述方法包括向对象施用包含抗肿瘤有效量的自体淋巴细胞群的药物组合物，所述自体淋巴细胞群用编码单个或多个嵌合抗原受体(DuoCAR)的两种或更多种慢病毒载体转导，以产生患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群，其可直接输注回到患者中，以促进患者特异性抗肿瘤T细胞的体内扩增、持续，导致以患者特异性方式发生肿瘤稳定化、减退、消除、或癌症缓解、或者癌症复发的预防或改善、或者其任意组合。
在一个实施方案中，提供了用于治疗患有与肿瘤抗原的表达升高相关的疾病、障碍或病症的哺乳动物的方法，所述方法包括向对象施用药物组合物，所述药物组合物包含至少两种载体和可药用赋形剂，每种载体编码功能性CAR，因此载体的组合导致两种或更多种不同结合结构域的表达，其中每种载体所编码的结合结构域与跨膜结构域和一个或更多个不同的胞内信号传导基序共价连接，其中载体的组合用于遗传修饰一个或更多个淋巴细胞群。
在另一个实施方案中，提供了用于治疗患有与肿瘤抗原的表达升高相关的疾病、障碍或病症的哺乳动物的方法，所述方法包括向对象施用药物组合物，所述药物组合物包含(a)编码两种或更多种载体的核酸分子；(b)其中每种载体编码功能性CAR；(c)其中每个CAR包含至少一个结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导基序；(d)其中一种载体中的至少一个结合结构域是不同的；并且(e)其中在每种所述载体中至少一个结合结构域、单跨膜结构域和至少一个胞内信号传导基序共价连接，其中载体的组合用于遗传修饰一个或更多个淋巴细胞群。
在另一个实施方案中，提供了用于治疗患有与肿瘤抗原的表达升高相关的疾病、障碍或病症的哺乳动物的方法，所述方法包括向对象施用药物组合物，所述药物组合物包含(a)编码两种或更多种载体的核酸分子；(b)其中每种载体编码功能性CAR；(c)其中每个CAR包含至少一个结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导基序；(d)其中每种载体中的至少一个结合结构域是不同的；(e)其中至少一个信号传导基序组合在各载体之间是不同的；并且(f)其中在每种所述载体中至少一个结合结构域、单跨膜结构域和至少一个胞内信号传导基序共价连接，其中两种或更多种载体的组合用于遗传修饰一个或更多个淋巴细胞群。
在某些实施方案中，进行遗传修饰的淋巴细胞是自体T细胞淋巴细胞，并且其中将自体或同种异体T细胞淋巴细胞直接输注回到患者中以预防或改善恶性疾病的复发。
在某些另外的实施方案中，进行遗传修饰的淋巴细胞是自体T细胞淋巴细胞，并且其中将自体淋巴细胞直接输注回到患者中以促进患者特异性抗肿瘤T细胞淋巴细胞的体内扩增、持续，导致以患者特异性方式发生肿瘤稳定化、减退、消除、或癌症缓解、或者癌症复发的预防或改善、或者其任意组合。
在另一个实施方案中，T细胞已通过表达特异性活化或记忆相关表面标志物进行预选。
在另一个实施方案中，T细胞来源于造血干细胞供体，并且其中该过程在造血干细胞移植的情况下进行。
在某些实施方案中，提供了其中淋巴细胞已通过表达特异性活化或记忆相关表面标志物进行预选的方法。
在某些实施方案中，本文中提供了这样的方法，其中淋巴细胞是T细胞且来源于造血干细胞供体，并且其中该过程在造血干细胞移植的情况下进行。
在另一个方面中，提供了用于在被诊断患有癌症的人中产生遗传工程化的患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的持续群的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向有此需要的人患者施用本文中所述的一种或更多种患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群，其中患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的持续群或淋巴细胞的后代的群在施用之后在人中持续至少一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、两年或三年。
在一个实施方案中，人中的子代淋巴细胞包含记忆T细胞。在另一个实施方案中，T细胞是自体T细胞。
在本文中所述的方法的所有方面和实施方案中，可使用包含一种或更多种如本文中所公开的Duo Car免疫治疗组合物的患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群治疗或预防或改善任何上述与肿瘤抗原的表达升高相关的癌症、疾病、障碍或病症。
在另一方面中，提供了用于制备包含如上文所述的患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群或用于预防、治疗或改善如上文所述的与对象中肿瘤抗原的表达升高相关的任何癌症、疾病、障碍或病症的DuoCar免疫治疗组合物的药盒(kit)，所述药盒包含含有上文所公开的核酸分子、载体、宿主细胞或组合物的任一种或其任意组合的容器，以及使用所述药盒的说明书。
虽然已经参照DuoCAR的产生和使用举例说明了本发明的组合物和方法，但本文中考虑了所述组合物和方法特别地旨在包括TrioCAR和QuatroCAR的产生和使用。
在另一方面中，免疫治疗组合物包含编码至少一种载体的一种或更多种分离的核酸，其中所述载体包含核酸序列，其产生编码DuoCAR的至少一种信使RNA(即，多顺反子核酸或产生多于一种转录物的核酸)，导致结合两种或更多种不同的抗原靶标的能力，从而产生存在于表达所述载体的单细胞中的多抗原特异性。
在另一方面中，免疫治疗组合物包含如上文所述编码至少两种载体的一种或更多种分离的核酸，其中每种载体还编码在可溶性结合物(例如，标记的scFv，或与抗标签结合物连接的scFv)共孵育或共同施用之后重构功能性嵌合抗原受体的功能性标签或抗标签结合部分(AT-CAR)，因此两种载体的组合导致结合两个或更多个不同的抗原结合结构域的能力，导致存在于表达这两种载体的细胞中的多抗原特异性。
在另一方面中，免疫治疗组合物包含如上文所述编码至少两种载体的一种或更多种分离的核酸，其中每种载体编码在可溶性结合物(例如，标记的scFv，或与抗标签结合物连接的scFv)共孵育或共同施用之后重构功能性嵌合抗原受体的功能性标签或抗标签结合部分(AT-CAR)，其中每种载体表达可结合可溶性蛋白质或蛋白质修饰的结构的独特标签(或抗标签)，导致多抗原特异性，或者其中每种载体表达仅结合一个可溶性结合结构域的独特标签(或抗标签)，导致编码AT-CAR的胞内信号传导基序特异性连接至标记(或抗标记)结合物的抗原结合结构域。
在用于制备DuoCAR载体的一个非限制性实施方案中，在上文提及的实施方案和方面中公开的每种组合物和方法，两种载体可分别制备，并随后依次或同时添加至T细胞。在另一个非限制性实施方案中，两种或更多种载体的质粒DNA可在生产细胞的转染之前或期间组合，或整合到生产细胞基因组中，以产生包含多个DuoCAR载体颗粒的病毒载体的混合物，随后用于患者T细胞的转导和遗传修饰。
对于本文中具体考虑的DuoCAR、TrioCAR和QuatroCAR的多个方面和实施方案中的每一个，编码功能性CAR的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、9、21、25、29、31、35、39、43、47、49、51、53、55、59、61、109、111、113或115的核苷酸序列、或其任意组合。
对于本文中具体考虑的DuoCAR、TrioCAR和QuatroCAR的多个方面和实施方案中的每一个，每个载体编码功能性CAR，所述功能性CAR包含SEQ ID NO：4、10、22、26、30、32、36、40、44、48、50、52、54、56、60、62、110、112、114或116的氨基酸序列、或其任意组合。
应理解，如上文所述的患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群、表达嵌合抗原受体(DuoCAR)的两种或更多种慢病毒载体、宿主细胞以及方法在本文中详细描述的具体方面和实施方案之外是可用的。从下面参照附图进行的详细描述中，本公开内容的前述特征和优点将变得更明显。
附图简述
当结合附图阅读时，将会更好地理解本发明的一些优选实施方案的以下详细描述。出于举例说明本发明的目的，在附图中示出了目前优选的一些实施方案。然而，应理解，本发明不限于附图中所示实施方案的精确安排和手段。
图1描绘了可作为离散的商业实体生产的四(4)种产品(实例1至4)。可产生这些DuoCAR组以靶向表达三种白血病相关抗原(CD19、CD20和CD22)的人B细胞恶性肿瘤。在产品1中，两种基因载体用于共转导活化的T细胞群。第一载体编码通过CD8跨膜区(8)连接的与单个胞内结构域(z，CD3ζ链)连接的两个抗原结合结构域(CD19、CD20)。第二载体编码CD22结合结构域和两个信号传导结构域(BB，来源于CD137/4-1BB；以及z)。第二种产品(实例2)的特征为具有与CD28和z信号传导结构域连接的CD19-和CD20-结合结构域的第一载体。第二载体编码CD22结合结构域以及BB和z信号传导结构域，并且基本上重现了第三代CAR载体的信号传导包(三个不同的信号传导结构域)。在第三种产品(实例3)中，第一载体编码与BB和z信号传导结构域连接的CD20-和CD22-结合结构域，并且第二载体编码与CD28和z信号传导结构域连接的CD19结合结构域。在第四种产品(实例4)中，第一载体编码CD20-和CD22-结合结构域以及BB和z信号传导结构域。第二载体编码CD19结合结构域和z信号传导结构域。
图2描绘了可组合到用于靶向B细胞恶性肿瘤的治疗产品中的DuoCAR的所有潜在单组分。命名法与图1中的相同。
图3描绘了可应用于多种治疗需求(包括炎性疾病或自身免疫病和感染性疾病)的DuoCAR的通用图式。在图中，a-CDX、a-CDY、a-CDZ分别是指对三种不同靶抗原CDX、CDY和CDZ具有特异性的抗原结合结构域。CAR的胞内方面全部包含与CD3-ζ、CD28或4-1BB信号传导结构域连接的CD8接头和跨膜结构域(如图1中)。将这些两种载体的任一种特定组合(例如A加F，其中靶向抗原X、Y和Z，同时提供通过CD3-ζ和4-1BB的胞内信号传导)成单一载体将根据具体的治疗需要来定义。
图4描绘了DuoCAR组的通用图式，其中每种载体靶向两种抗原。与图3中的载体相同的载体保留其特定的字母名称(图3中和图4中的A相同)。新的第四抗原结合结构域由a-CDW表示。靶向4种抗原的一种产品是A+T Duo CAR组。在这种情况下，靶向胞外抗原CDX、CDY、CDZ和CDW，同时提供CD3-ζ和CD28胞内信号二者。
图5A至5G描绘了文献中的当前CAR(图5A、5B、5C和5D)与本发明的DuoCAR(图5E、5F和5G)的比较。可产生诱导与接头和跨膜结构域(单空白框)连接的单个结合结构域(成对的黑色、空白或条纹的球，每个具有独立的特异性)的表达的CAR表达载体。在图中，粗灰线表示浆细胞膜。在该图中，成对的黑色球可表示抗CD19 scFv，成对的空白球表示抗CD20scFv，并且成对的条纹球表示抗CD22 scFv，所有这些都通过连接氨基酸序列(例如GGGGS的多聚体(1、2、3、4、5或6个重复))连接。如所示的，在细胞内，来源于4-1BB(CD137)、CD28和CD3-ζ链的淋巴细胞信号传导结构域可被组合。(图5A)在单一CAR中，单个结合结构域与跨膜结构域和2个信号传导结构域组合，产生第二代CAR。(图5B)在割裂CAR(Split CAR)中，两个不同的结合物与单个信号传导结构域一起表达，其必须组合以在识别两种不同的抗原时产生有效的T细胞信号传导。(图5C)在串联CAR中，两个结合结构域与单个信号传导结构域连接。在这种情况下，任一结构域的结合诱导完整的T细胞活化。(图5D)在来自一个载体的多个CAR中，从单一载体表达两个完全功能性CAR，每个能够结合仅一个抗原。(图5E)相比之下，DuoCAR由两个载体构成，并且表达至少三个结合结构域，可能具有信号传导结构域的多种组合。区分DuoCAR的基本特征是两种或更多种转录物的表达、结合结构域的多重性(至少一个是多靶向的)以及两种表达的细胞表面蛋白中的至少一种的完全功能性信号传导特征。(图5F)在DuoCAR单特异性可溶性结合物形式中，由载体编码的CAR部分表达标签或抗标签基序，其也编码跨膜和胞内信号传导基序(CAR基础载体，与胞内基序是不同的)。基础载体结合可溶性蛋白质，所述可溶性蛋白质包含与抗原相互作用的scFv结构域和标签或抗标签基序二者以介导与CAR基础蛋白质本身的结合。一旦可溶性蛋白质与CAR基础蛋白质结合，就会重构介导由DuoCAR介导的抗肿瘤活性[如(E)中]的相同结构特征。(图5G)在双特异性可溶性结合物形式的DuoCAR中，双特异性“标签”-“抗标签”相互作用是独特的，使得仅一种可溶性结合物可与仅一种基础载体结合。在这种情况下，在基础载体上的黑色菱形和可溶性双scFv蛋白上的角形结合物可表示“生物素”-“抗生物素”相互作用，并且第二CAR基础载体上的黑色月牙形与单特异性scFv结构上的黑色椭圆形相互作用，并且可表示“FITC”-“抗FITC”相互作用。
图6描绘了用CAR表达载体转导的原代人T细胞上CAR构建体的细胞表面表达水平，其在第二代(两个共刺激结构域)和第三代(三个共刺激结构域)形式之间不同。对T细胞进行转导以表达以下CAR：无CAR(模拟)、第二代CAR(CAR-A-28z)、第三代CAR(CAR-A-28BBz)和作为替代的第二代CAR(CAR-A-BBz)。通过流式细胞术检测CAR的表面表达水平并将其报告为平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MF)，y轴。尽管所有构建体都表达了非常相同的CAR结合结构域，但这两种第二代CAR的MFI更亮。
图7描绘了人T细胞中的DuoCAR细胞表面表达。将人T细胞用CD3-CD28纳米基质(TransAct，Miltenyi Biotec)在IL-2的存在下激活，用两种载体(一种编码串联CD20-CD19CAR，并且一种编码单一CD22CAR，因此是2+1 Duo-组形式)转导，并随后使用重组CD19、CD20或CD22进行染色通过流式细胞术分析CD19-scFv、CD20-scFv或CD22-scFv结构域的表达。成对的列示出了对于CD20和CD19 scFv(左列)以及CD22和CD19 scFv(右列)的双重染色。第1行示出了未经转导的T细胞(UTD)，并因此未示出结合。第2行示出了用编码具有CD8跨膜结构域和胞内CD28和CD3-ζ信号传导结构域的CD20_CD19 CAR载体(20-19-28z)的LV转导的T细胞。虽然对于CD20和CD19结合见到了双重染色(左图)，但在右图中仅见到CD19结合。第3行示出了用具有CD8跨膜结构域和胞内4-1BB和CD3-ζ信号传导结构域的CD22 CAR载体(22-BBz)转导的T细胞。用CD19或CD20未见到双重染色(左图)，并且仅见到能够结合CD22的单一细胞群(右图)。在第4行中，T细胞用由第2行和第3行中的这两种载体构成的Duo组进行转导。仅Duo组表达所有三种CAR编码的结合结构域(42％的细胞表达CD20_19(左图)，并且38％表达CD22和CD19结合结构域(右图))。由于CD22和CD19 scFv位于包含Duo组的两个独立的跨膜蛋白中的每一个上，因此在该实例中38％代表真正的Duo组表达群。
图8描绘了表达DuoCAR之T细胞的抗肿瘤细胞裂解活性。将用单一CAR组分(20_19-28z或22-BBz)或DuoCAR(20_19-28z+22-BBz)转导的人T细胞(如图7中所述)在四种不同的效应物与靶标比例(20∶1、10∶1、5∶1、2.5∶1，如所指示的)下用于细胞毒性T细胞测定。用作CAR-T靶标的白血病细胞系是：Raji(表达所有三种靶抗原)、REH(表达所有三种靶抗原)、K562(对照，无靶标表达)、K562-CD19(表达CD19)、K562-CD20(表达CD20)和K562-CD22(表达CD22)。仅DuoCAR转导的细胞(20-19-28z+22-BBz、2+1 Duo组)对这两种白血病细胞系(Raji和REH)和所有三种单表达K562靶细胞系(K562-CD19、K562-CD20、K562-CD22)表现出高的细胞裂解活性。
图9描绘了如通过两种不同的LV制备方法实现的原代人T细胞中的DuoCAR细胞表面表达。使用与图7中相同的方法和数据分析，因此，产生了用对CD19、CD20和CD22具有特异性的DuoCAR(2+1 Duo组，其中一个CAR是串联的CD20和CD19结合物，并且第二个CAR由CD22结合物构成)转导的细胞。第一列数据示出对于CD19和CD20结合物的表达的流式细胞术分析，而第二列示出对于CD22和CD19结合物的流式细胞术分析，表示为四个不同的群的表达DuoCAR的细胞中的CAR，所述四个不同的群对应于分别在左下、左上、右上和右下象限中的未经转导的、单独CD22-CAR转导的、用CD22和CD20_19 CAR双重转导的和用串联CD20_CD19CAR单独转导的。两种LV转导方法(共转导)和单一LV转导方法(共转染)二者给出了类似的DuoCAR染色模式，其中通过表达这两种CAR细胞表面蛋白，超过30％的T细胞群对CD19、CD20和CD22具有特异性。
图10A和10B描绘了DuoCAR双顺反子构建体的示意图。从单个双顺反子开放阅读框表达DuoCAR构建体，其包含通过2A肽分开的两条CAR链的序列。一个CAR由在框内与CD8铰链和跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ激活结构域连接的CD22 scFv构成(图10A)。另一个CAR由基于串联CD20 CD19 scFv的靶向结构域，然后是CD8铰链和跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ激活结构域构成(图10B)。
图11描绘了如通过流式细胞术测量的用DuoCAR表达载体和对照转导的原代人T细胞上组1双顺反子DuoCAR的细胞表面表达。对T细胞进行转导以表达以下CAR：无CAR(UTD)，构建体编号2228(2019串联CAR)，构建体编号2200、2209、2218、2225、2227(CD22 CAR变体)，构建体编号(2515、2520、2521，包含靶向CD22的一条CAR链以及靶向CD20和CD19肿瘤抗原的另一条串联CAR链的双顺反子CAR)。在所示的二分图中，CAR 22表达示出在Y轴上，并且代表串联2019 CAR链的CAR 19表达示出在X轴上。在每个象限中指示了百分比阳性细胞。数据代表了来自独立健康供体的T细胞中的三个转导实验。
图12描述了与Raji肿瘤细胞共孵育的双顺反子DuoCAR组1的细胞因子响应。对T细胞进行转导以表达以下CAR：无CAR(UTD)，构建体编号2228(-2019串联CAR)，构建体编号2200(-CD22 CAR)，构建体编号2515、2520、2521 DuoCAR，将T细胞和对照与三阳性Raji细胞孵育过夜，然后收获上清液并通过ELISA分析IFNg、TNFa和IL-2。N＝3，+/-SD。示出了一个实验，其代表来自独立供体的T细胞中的三个独立实验。
图13描绘了如通过流式细胞术测量的用DuoCAR表达载体和对照转导的原代人T细胞上组2双顺反子DuoCAR的细胞表面表达。对T细胞进行转导以表达以下CAR：无CAR(UTD)，构建体编号1497(-2019串联CAR)，构建体编号2200(-CD22 CAR)，构建体编号D0043、D0044、D0046、D0047-包含靶向CD22的一条CAR链以及靶向CD20和CD19肿瘤抗原的另一条串联CAR链的双顺反子CAR。在所示的二分图中，CAR22表达示出在Y轴上，并且代表串联2019 CAR链的CAR 19表达示出在X轴上。在每个象限中指示了阳性细胞的百分比。数据代表了来自三个独立健康供体的T细胞中的三个转导实验。
图14描绘了表达组2双顺反子DuoCAR之T细胞的抗肿瘤细胞裂解活性。将用单一CAR组分(LTG1497、20_19-28z或LTG2200、22-BBz)或DuoCAR(构建体编号D0043、D0044、D0046、D0047，编码20_19-28z+22-BBz)转导的人T细胞在四种不同的效应物与靶标比例(10∶1、5∶1、2.5∶1，如所指示的，为简洁起见，省略了构建体名称中“D”与数字标记之间的零)下用于细胞毒性T细胞测定。用作CAR-T靶标的白血病细胞系是：Raji(表达所有三种靶标抗原)、Reh(表达所有三种靶标抗原)、392T(缺少所有三种靶标抗原)。DuoCAR以E∶T依赖性方式裂解三阳性细胞系，并且在靶标阴性293T细胞系中未发生裂解。
图15描述了表达双顺反子DuoCAR组2之T细胞的抗肿瘤细胞裂解活性。将用单一CAR组分(LTG1497、20_19-28z或LTG 2200、22-BBz)或DuoCAR(构建体编号D0043、D0044、D0046、D0047，编码20_19-28z+22-BBz)转导的人T细胞在四种不同的效应物与靶标比例(10∶1、5∶1、2.5∶1。如所指示的，为简洁起见，省略了构建体名称中“D”与数字标记之间的零)下用于细胞毒性T细胞测定。用作CAR-T靶标的单阳性肿瘤细胞系是：K19(表达CD19)、K20(表达CD20)和K22(表达CD22)。这三种单阳性肿瘤细胞系是通过期望的单一抗原(CD19、CD20或CD2)和萤火虫萤光素酶基因的稳定转导在天然缺少CD19、CD20或CD22表达的亲本K562红白血病细胞系的背景下开发的。DuoCAR以E∶T依赖性方式裂解单阳性细胞系，但是没有通过具有错配的抗原靶向结构域的CAR对照(CAR 22，LTG 2200 vs K19和K20，串联CAR 2019，LTG1479 vs K22)介导的高于背景水平的裂解。
图16描绘了与Raji肿瘤细胞共孵育或在不存在肿瘤(单独的CAR)的情况下孵育的双顺反子DuoCAR版本2的细胞因子响应。对T细胞进行转导以表达以下CAR：无CAR(UTD)，构建体编号2273(-2019串联单链CAR)，构建体编号2200(CD22单链CAR)，构建体编号D44、D47(分别参考D0044和D0047 CAR构建体，为简洁起见，省略了构建体名称中“D”与数字标记之间的零)。将DuoCAR和T细胞以及对照与三阳性Raji细胞孵育过夜，然后收获上清液并通过ELISA分析IFNg、TNFa和IL-2。N＝3，+/-SD。示出了一个实验，其代表来自独立供体的T细胞中的三个独立实验。
图17描绘了两条CAR链的示意图，其可通过共转染或共转导的方式组合以用于在同一细胞或细胞群中共表达以产生DuoCAR。一条CAR链由在框内与CD8铰链和跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ激活结构域连接的CD22 scFv构成。另一条CAR链由基于串联CD20 CD19 scFv的靶向结构域，然后是CD8铰链和跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ激活结构域构成。
图18描绘了如通过流式细胞术测量的用DuoCAR表达载体制备物(通过两种转移质粒共转染以产生LV来产生)或单独转导的单一载体对照(上方的图)转导的原代人T细胞上DuoCAR和对照的细胞表面表达。对T细胞进行转导以表达以下CAR：构建体编号2273、2228(-2019串联CAR)、D1、D2、D3、CD22 CAR，以及DuoCAR(构建体编号D1+2273、D2+2273、D3+2273)。在所示的散点图中，CAR 22表达示出在Y轴上，并且代表串联2019 CAR链的CAR 19表达示出在X轴上。在每个象限中指示了阳性细胞的百分比。使用来自三个供体的T细胞进行的三个实验的代表性数据。
图19A和19B描绘了DuoCAR细胞或单链CAR对照的抗肿瘤细胞裂解活性。通过两种转移质粒共转染以产生慢病毒载体来产生DuoCAR T细胞。用所得的DuoCAR载体或单链CAR对照对T细胞进行转导以表达以下CAR：构建体编号2273(-2019单链串联CAR)；构建体编号D1、D2、D3(-CD22单链CAR)；以及DuoCAR(构建体编号D1+2273、D2+2273、D3+2273，为简洁起见，省略了名称中的“D”)，其通过在同一CAR T产品中组合两种单一CAR链而产生。在两种不同的效应物与靶标比例(10∶1、5∶1，如所指示的)下，在针对为CD19+CD20+CD22+的天然白血病系(Raji、Reh)或CD19、CD20、CD22三阴性对照系293T的细胞毒性T细胞测定中分析了所得的CAR T细胞(图19A)。天然靶标系Raji和Reh被单链CAR构建体，被所有DuoCAR组构建体编号D1+2273、D2+2273、D3+2273(为简洁起见，省略了名称中的“D”)以及被单链CAR对照裂解。相比之下，DuoCAR和单一CAR对照相对于CD19、CD20、CD22三阴性系293T没有细胞裂解，证明了CAR构建体的靶标特异性。由于DuoCAR同时靶向三种靶抗原，并且为了进一步解决靶标特异性问题，针对在天然缺少CD19、CD20或CD22表达的K562红白血病细胞的背景下产生的转基因单阳性肿瘤系测试了DuoCAR。用作CAR-T靶标的单阳性肿瘤细胞系为：K19(表达CD19)、K20(表达CD20)和K22(表达CD22)，图19B。DuoCAR以E∶T依赖性方式裂解单阳性细胞系，表明DuoCAR的所有靶向结构域都是功能性的，并且对其同源靶分子具有特异性(图19B)。此外，具有错配的抗原靶向结构域的CAR单链对照(CAR 22，LTG 2200 vs K19和K20，串联CAR2019，LTG 1479vs K22)没有特异性裂解活性(图19B)。
图20描述了DuoCAR细胞或单链CAR对照响应于Raji13G11(一种CD19+CD20+CD22+克隆)的细胞因子释放活性。通过两种转移质粒的共转染以产生慢病毒载体来产生DuoCART细胞。用所得的单链CAR对照载体的DuoCAR载体对T细胞进行转导以表达以下CAR：构建体编号2273(-2019串联CAR)；构建体编号D1、D2、D3(-CD22 CAR)；以及三种DuoCAR(D1+2273、D2+2273、D3+2273，图20，为简洁起见，省略了组标签中的“D”)。将所得CAR T细胞与三阳性Raji肿瘤系以E∶T比例为10组合过夜，并分析培养物上清液中的IFNg、TNFa和IL-2。所有DuoCAR构建体都响应于Raji细胞而引起三种细胞因子的高水平。由在不存在Raji靶标的情况下孵育的CAR T细胞构成的DuoCAR单独对照没有响应于Raji13G11细胞而产生可感测的细胞因子，证明了细胞因子响应是靶标特异性的(图20)。
图21A和21B描绘了同时靶向CD19、CD20和CD22的DuoCAR、以及串联CAR和单一CAR对照的构建。每个DuoCAR由与第一代或第二代单靶向CD22 CAR共表达的双重靶向CD20和CD19的串联CAR构成。两种CAR构建体以双顺反子形式共表达，并通过核糖体跳读位点2A序列连接，以确保两条CAR链在化学计量上相等的表达。由于这种双顺反子表达盒的性质，两条CAR链在每种经转导的T细胞中共表达。(图21A)三重靶向的抗CD20和抗CD19抗CD22DuoCAR D93由以下构成：20-19串联ScFv、铰链和跨膜结构域、ICOS共刺激结构域和CD3z激活结构域，然后是2A序列，并随后是由CD22 scFv、铰链和跨膜结构域以及CD3z激活结构域构成的单靶向CD22 CAR。DuoCAR D94如D93一样构建，不同之处在于将ICOS共刺激结构域替换为OX40结构域。DuoCAR构建体D95如D94一样构建，不同之处在于将ICOS共刺激结构域添加至CD22CAR链。DuoCAR构建体D96与构建体D95一样构成，不同之处在于将D95构建体中的OX40共刺激结构域替换为CD27共刺激结构域。所有构建体均包含CD8来源的铰链和跨膜结构域。串联构建体1497和单一CAR构建体D89、D92、1538、1497代表功能性对照。(图21B)示意性地描绘了：DuoCAR T细胞，其中一条串联CAR链和一条单一CAR链在同一T细胞中共表达；串联CAR；第二代单一CAR(具有共刺激结构域)；以及第一代单一CAR(没有共刺激结构域)。
图22A和22B：Duo-CAR T构建体D93、D94、D95、D96和串联CAR1497(比较)在人原代T细胞上的表面表达。CAR T表达通过流式细胞术测定。如材料和方法中所述，将T细胞用Miltenyi Biotec TransActTM CD3 CD28试剂在存在IL-2的情况下活化，并用LV在MOI 80下转导。在培养第8天，使用以下三种染色方法中的一种测定有生存力的经转导T细胞(7-AAD阴性)的CAR表面表达：CD19Fc，接着是抗Fc-AF647；CD20生物素试剂，接着是链霉亲和素PE；或者CD22-his试剂，接着是抗his-PE染色。图22A。示出了四个实验中的一个代表性转导实验。上方的图示出了与靶向CD19的scFv相关的靶向CD20的scFv的表达，并且下方的图示出了与靶向CD19的scFv的表达相关的靶向CD22的scFv的表达。转导中使用的LV在每列的顶部列出。在直方图的每个象限中注明了CAR T阳性群的百分比。图22B。示出了在来自不同供体的T细胞中进行的四次转导实验的DuoCAR表达百分比平均值±SEM。经CAR转导的T细胞被定义为CAR19+CAR22+细胞，代表在每种细胞中共表达的两条DuoCAR链的同时检出。
图23A、23B、23C和23D描绘了体外CAR T细胞毒性。使用用萤光素酶稳定转导的Raji 13G11 CD19+CD20+CD22+、REH CD19+CD20低CD22+或CD19-CD22-细胞系(293T或K562)进行基于萤光素酶的细胞毒性测定。针对图23A)Raji细胞、图23B)Reh细胞、图23C)K562细胞或图23D)293T细胞示出了DuoCAR D1-D4、串联CAR 1497或单一CAR D89和D92对靶细胞的特异性裂解。包括阴性对照UTD-未经转导的T细胞。CAR T细胞与靶肿瘤细胞以列出的效应物与靶标(E∶T)比例(x轴)共孵育过夜。误差条代表三个技术重复的平均值。示出了一个实验，其代表来自三个供体的T细胞中的三个独立实验。条代表用来自三个独立供体的CAR T细胞进行的三个独立实验的平均值+/-SD值。
图24。响应于白血病细胞系的CAR T细胞因子释放。使用ELISA测量在与Raji白血病系以10∶1的E∶T比例共培养过夜之后CAR-T(在x轴上列出)产生的细胞因子IL-2、IFNγ和TNFα。条代表三个重复样品的平均值+SD。数据代表用来自三个独立供体的CAR T细胞进行的三个独立实验。
图25A和25B描绘了DuoCAR的体内抗肿瘤活性。将荷Raji瘤的NSG小鼠用DuoCAR T细胞D93、D94、D95和D96、或串联CAR 1497、或单一CAR D89或D92处理。在肿瘤接种之后7天，以500万个CAR T细胞/小鼠(图25A)或200万个CAR T细胞/小鼠(图25B)的剂量i.v.注射CART细胞。在指定日通过生物发光评价肿瘤负荷。N＝6只小鼠/组，示出了辐射率平均值±SEM。
图26A至26H描绘了针对以下的体外CAR T细胞毒性：A431肿瘤系克隆，其经转导以仅过表达一种靶抗原，以证实靶向CD22 CD19的CAR T细胞的特异性(图26A至26D)；以及亲本A431阴性对照系；或者Raji白血病系克隆，其经工程化改造以缺乏CD19、CD20或CD22的表达，代表抗原逃逸克隆；以及亲本Raji系(用于比较)(图26E至26H)。所有靶标系均稳定表达萤火虫萤光素酶。条表示来自一个实验的一式三份测定的平均值+SEM值，该一个实验代表了用来自三个独立供体的CAR T细胞进行的三个独立实验。
图27描绘了DuoCAR在肿瘤抗原逃逸模型中的体内抗肿瘤活性。NSG小鼠用等比例的Raji CD19neg、Raji CD20neg、Raji CD22neg和亲本Raji克隆的混合物接种。将Raji肿瘤用DuoCAR T细胞：D93、D94、D95或D96(其能够靶向CD19、CD20或CD22抗原)或单一CAR对照：CAR22D92、CAR191538或CAR201495处理。在肿瘤接种之后七天以500万个CAR T细胞/小鼠的剂量i.v.注射T细胞，或者在指定日通过生物发光评价肿瘤负荷。N＝6只小鼠/组，示出了辐射率平均值±SEM。
发明详述
定义
除非上下文另外明确指出，否则本文中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。例如，术语“抗原”包括单个/种或多个/种抗原，并且可认为与短语“至少一个/种抗原”等同。本文中使用的术语“包含”意指“包括”。因此，“包含抗原”意指“包括抗原”而不排除其他要素。短语“和/或”意指“和”或“或/或者”。应进一步理解，除非另外指出，否则对于核酸或多肽给出的任何和所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值都是近似的，并且是出于描述的目的而提供。虽然可使用与本文中描述的那些类似或等同的许多方法和材料，但是下文描述了特定的合适的方法和材料。在有冲突的情况下，以本说明书(包括对术语的解释)为准。此外，材料、方法和实例仅是举例说明性的，而不旨在是限制性的。为了便于查阅多个实施方案，提供了以下对术语的解释：
当提及可测量值(例如量、持续时间(temporal duration)等)时，术语“约”意指涵盖与特定值有+/-20％、+/-10％或更优选+/-5％，或+/-1％，或者还更优选+/-0.1％的变异，因为这样的变异适合于执行所公开的方法。
除非另外指出，否则根据常规用法使用本文中的技术术语。分子生物学中常用术语的定义可见于Benjamin Lewin，Genes VII，Oxford University Press出版，1999；Kendrew等(编辑)，The Encyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science Ltd.出版，1994；以及Robert A.Meyers(编辑)，Molecular Biology and Biotechnology：AComprehensive Desk Reference，VCH Publishers，Inc.出版，1995；以及其他类似的参考文献。
本发明涉及用于治疗疾病和/或病症以及癌症(包括但不限于血液系统恶性肿瘤和实体瘤)的组合物和方法。本发明涉及用两种或更多种载体转导以表达一种或更多种DuoCAR的T细胞的过继性细胞转移的患者特异性肿瘤特异性策略。
本发明更特别地涉及表达嵌合抗原受体(DuoCAR)的慢病毒载体、以及用表达CAR的慢病毒载体转导的宿主细胞(例如，淋巴细胞、T细胞)、编码慢病毒载体和嵌合抗原受体的核酸分子，并且还提供了使用它们例如以在对象中治疗癌症的方法。
令人惊讶和出乎意料地，本发明人现已发现，如果自体淋巴细胞群用编码单个或多个嵌合抗原受体(DuoCAR)的两种或更多种慢病毒载体转导，则包含患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的免疫治疗组合物作为抗肿瘤免疫治疗剂有效得多。表达单个或多个CAR的至少两种或更多种慢病毒载体的使用显示出促进患者特异性抗肿瘤T细胞的体内扩增、持续，导致以患者特异性方式发生肿瘤稳定化、减退、消除、或癌症缓解、或者癌症复发的预防或改善、或者其任意组合。
如本文中所述的这样的活跃的患者特异性抗肿瘤T细胞群可直接输注回到患者中以促进患者特异性抗肿瘤T细胞的体内扩增、持续，导致以患者特异性方式发生肿瘤稳定化、减退、消除、癌症缓解、或者癌症复发的预防或改善、或者其组合。这还包括治疗性细胞群的有效扩增和迅速缩减。
因此，在其最广泛的方面，这种过继免疫治疗的新颖性在于使用CAR表达载体的组合。区别特征是与表达一种或更多种嵌合抗原受体的单一载体的常规用途相反，Duo CAR方法赋予体内抗肿瘤T细胞活性以多重抗原特异性和最佳信号传导二者。创建其中高效靶向三种或更多种抗原的系统远远优于单一或串联的方法，所述单一或串联的方法允许肿瘤癌细胞产生逃逸变体，导致肿瘤转移和/或肿瘤复发。编码单个或多个嵌合抗原受体(DuoCAR)的两种或更多种载体(其中每种载体中的至少一个结合结构域的特定组合是不同的，并且要求每种载体之间，至少一种信号传导基序组合是不同的)的使用用于确保用这样的duo慢病毒载体来源的CAR转导的经遗传修饰的一个或更多个淋巴细胞群产生患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群，所述患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群能够促进患者特异性抗肿瘤淋巴细胞的体内扩增、持续，导致以患者特异性方式发生肿瘤或癌症的稳定化、减退、消除或缓解、和/或肿瘤或癌症复发的预防或改善、或其任意组合。
在一个方面中，提供了免疫治疗组合物，其包含编码至少两种载体(DuoCAR)的一种或更多种分离的核酸分子，每种载体编码功能性CAR，其中一种载体中的至少一个结合结构域是不同的，并且因此载体的组合导致两种或更多种不同结合结构域的表达，其中每种载体所编码的结合结构域与跨膜结构域和一个或更多个不同的胞内信号传导基序共价连接。
在另一方面中，提供了免疫治疗组合物，其包含编码至少两种载体(DuoCAR)的一种或更多种分离的核酸分子，每种载体编码功能性CAR，因此载体的组合导致两种或更多种不同结合结构域的表达，其中每种载体所编码的结合结构域与跨膜结构域和一个或更多个不同的胞内信号传导基序共价连接，前提是所述免疫治疗组合物特别地排除分别在图5(A)、(B)、(C)或(D)中描绘的单一CAR、割裂CAR、串联CAR或多个CAR。
用本发明的DuoCAR慢病毒载体修饰的T细胞实现的免疫治疗效力和对肿瘤或癌症复发的预防或改善比用单一常规CAR设计实现的显著地更大且协同地更多。与常规的基于CAR的T细胞免疫治疗相比，正是生物治疗益处的这种独特组合与患者特异性抗肿瘤淋巴细胞的提高的体内扩增、持续相关，导致肿瘤或癌症的稳定化、减退、消除或缓解。
可产生CAR表达载体，其诱导与接头和跨膜结构域(单空白框)连接的单个结合结构域(黑色、空白或条纹的球，每个具有独立的特异性，图5)的表达。下文图5描绘了常规CAR与本发明的DuoCAR的比较。在图5中，粗灰线表示浆细胞膜。如所示的，在细胞内，来源于4-1BB(CD137)、CD28和CD3-ζ链的淋巴细胞信号传导结构域可被组合。在本文件中的CD3信号传导结构域的所有实例和用途中，包括通过其中酪氨酸残基的选择性诱变或其他这样的突变改变基于免疫受体酪氨酸的活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activationmotif，ITAM)的一种、两种或三种使得ITAM基序不再是磷酸化的靶标来修饰CD3ζ链。在单一CAR中(图5A)，单个结合结构域与跨膜结构域和2个信号传导结构域组合。在割裂CAR中(图5B)，两个不同的结合物与单个信号传导结构域一起表达，其必须组合以产生有效的信号传导。在串联CAR中(图5C)，两个结合结构域与单个信号传导结构域连接。在来自一个载体的多个CAR中(图5D)，从单一载体表达两个完全功能性CAR。本发明的Duo-CAR(例如，图5E)编码至少两种载体，每种载体编码功能性CAR，因此载体的组合导致两种或更多种不同结合结构域的表达，其中每种载体所编码的结合结构域与跨膜结构域和一个或更多个不同的胞内信号传导基序共价连接。区分本发明的DuoCAR的基本特征是两种或更多种载体的使用、结合结构域的多重性以及两种表达的细胞表面蛋白中的至少一种的完全功能性信号传导特征(相对于体内T细胞扩增)。
在另一方面中，使用DuoCAR来增强对由治疗性T细胞群介导的肿瘤的免疫应答。免疫应答以至少三种方式增强。
首先，通过为T细胞提供另外的信号以在体内扩增和存活，本发明的DuoCAR通过在遇到自身抗原(例如CD19)时刺激T细胞群来允许治疗性T细胞群的持续，所述自身抗原的损失是患者可耐受的，并且还用于为不存在于肿瘤组织本身中的治疗性细胞群提供刺激信号。公知/公认的是，与表达两个胞内共刺激结构域的那些DuoCAR相比，第三代DuoCAR(在胞内表达与单个胞外Ig样结合物连接的三个共刺激结构域)在治疗性T细胞上不那么好地表达。例如，在下文图6中，在第二代(两个共刺激结构域)与第三代(三个共刺激结构域)构建体之间，原代人T细胞上CAR构建体的表达水平不同。对T细胞进行转导以表达以下CAR：无CAR(模拟)、第二代CAR(CAR-A-28z)、第三代CAR(CAR-A-28BBz)和作为替代的第二代CAR(CAR-A-BBz)。通过流式细胞术检测CAR的表面表达水平并将其报告为平均荧光强度(MF)，y轴。尽管所有构建体都表达了非常相同的CAR结合结构域，但这两种第二代CAR的MFI更亮。
通过在独立的载体CAR构建体上提供第三T细胞活化序列，发明人能够重新获得表达三个共刺激结构域的优点，而不会导致T细胞表面的CAR表达降低的缺点。
在第二方面，本发明的DuoCAR可靶向肿瘤以外的介导免疫抑制作用的细胞类型。例如，如果表达CD19的B细胞存在于肿瘤病灶中并且还抑制抗肿瘤免疫，如通过产生IL-4或其他介质，则使用表达DuoCAR的肿瘤特异性T细胞群的第二个益处在于还除去了免疫抑制性细胞群。
例如，如果免疫抑制性B细胞存在于实体瘤病灶内，则可通过使用B细胞特异性DuoCAR(例如CD19特异性DuoCAR)来消除这些。如果存在免疫抑制性成纤维细胞样细胞，则可通过基质特异性DuoCAR(例如通过靶向成纤维细胞活化蛋白-α(FAP))来除去这些。如果畸形的脉管系统导致缺乏有效的免疫应答，则对这些类型的血管或淋巴管特异性靶标(例如抗VEGFR)具有特异性的DuoCAR也可改善治疗结局。
在第三方面，本发明的DuoCAR靶向肿瘤远端(即，存在于体内的其他区室)的免疫抑制群。例如，使用DuoCAR以靶向可存在于肿瘤病灶本身或区域性淋巴结或骨髓中的骨髓来源的抑制细胞(myeloid derived suppressor cell，MDSC)。公认的是肿瘤引流淋巴结可以是免疫激活或免疫抑制的部位。这取决于淋巴结的总体炎性情况以及迁移至淋巴结之前的远端树突细胞分化。如果肿瘤引流淋巴结填充着骨髓来源的抑制细胞(MDSC)或分化不良的抗原呈递细胞(例如树突细胞)，则靶向尽管在肿瘤本身的远端的这些细胞类型的DuoCAR也可改善治疗结局。除癌症特异性DuoCAR免疫治疗应用之外，DuoCAR的第二个应用是预防或治疗自身免疫和/或炎性疾病。与基于肿瘤学的应用的区别在于，在促进Th-2样免疫应答的条件下培养的T调节细胞(Treg)或诱导的T调节细胞(iTreg)或其他细胞将是细胞底物。对于肿瘤学应用，Th-1样细胞是细胞底物。在多样的治疗应用中，如造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)之后的移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GvHD)、变应性气道、肠或其他黏膜炎症、或皮肤变态反应中，产生免疫抑制性细胞因子(例如转化生长因子-β(transforming growth factor-beta，TFG-β))的CAR修饰的淋巴细胞的存在可用于发挥广泛的致耐受性信号，其改善自身免疫或炎症驱动的疾病。这种方法包括外周或中枢神经系统(central nervous system，CNS)的神经炎性病症，例如阿尔茨海默病、多发性硬化、创伤性脑损伤、帕金森病和CTE(由于反复的震荡或微震荡导致的慢性创伤性脑病)。这种方法还包括进行性瘢痕形成性疾病，例如COPD(慢性阻塞性肺疾病)。
在炎性疾病的治疗中，对组织抗原、发炎细胞表面上的窘迫标志物(distressmarker)或错误折叠的蛋白质(例如tau蛋白或β-淀粉样蛋白)具有特异性的淋巴细胞将通过产生对这些靶具有特异性的DuoCAR表达载体来产生。用于阿尔茨海默病的基于单一抗体的治疗已经在临床开发中(即，Eli Lilly and Company的索拉珠单抗(Solanezumab)和Biogen，Inc.的阿杜卡尼单抗(Aducanumab))。在阿尔茨海默病中，单体或聚集的β-淀粉样蛋白的抗体可以以CAR形式用于代替细胞表面蛋白的结合物。通过MHC分子结合的tau蛋白或tau-肽的结合物也可用作CAR的结合基序。介导将淋巴细胞归巢至特定外周组织的受体也可包含在CAR形式中，以产生对表达CAR之Treg群的区域性特异性。已知驱动淋巴细胞浸润到特定组织中的黏附受体结构域以及细胞因子序列或细胞因子或趋化因子受体或结合物可用作CAR结构域的一部分。已知黏附分子(例如CD44和整联蛋白α-4)将淋巴细胞靶向CNS，因此包括来自已知介导淋巴细胞群的CNS迁移行为的黏附分子的结构域也可用于将表达CAR的淋巴细胞靶向疾病区域。对于肠(即，MAdCAm-1的结合物、CCR9的表达、或抗CCL25等)、肺(即P-选择素或间皮素)、皮肤(即E-选择素的结合物)、或其他黏膜表面也是如此。
为了使用这种方法，患有炎性病症或其疾病可通过缓解炎性病理状况来治疗(例如阿尔茨海默病)的患者将被送入诊所并收获外周血。Treg可通过免疫磁珠(调节性T细胞分离试剂盒，Miltenyi Biotec)直接进行选择，或通过在合适的细胞因子环境中培养来诱导。然后将这些Treg或iTreg用DuoCAR载体转导，并且如果需要，在体外扩增(Treg扩增试剂盒，Miltenyi Biotec)。DuoCAR结合结构域将来源于介导组织特异性归巢的抗体或受体和疾病相关的结合物，例如抗β淀粉样蛋白。因此产生的经工程化改造的免疫效应细胞将靶向合适的位点，并产生与其Th2或Treg分化模式一致的细胞因子。还已知CAR-T细胞可被工程化改造以在CAR受体活化之后分泌特定的遗传有效负载。除了从载体表达的DuoCAR有效负载之外，另外的治疗性蛋白质或肽可由经工程化改造的T细胞群表达或分泌，例如：a)A-βDP(淀粉样蛋白β降解蛋白酶)，b)基质蛋白酶(例如COPD中的MMP-9和MMP9抑制剂)，c)干扰斑块形成的肽或可溶性抗体样结合物，以及d)细胞因子(例如TGF-β、IL-4、IL-10)。
miRNA也可在细胞内表达以调节T细胞功能。miRNA的一些实例是miR-92a、miR-21、miR-155、miR-146a、miR-3162、miR-1202、miR-1246和miR-4281、miR-142、miR-17-92。还可开发miRNA的shRNA。一些实例是靶向miR-28、miR-150和miR-107的shRNA，其通常与PD1结合并提高其表达。
除了基于肿瘤学和基于炎性疾病和自身免疫病的应用之外，Duo CAR技术的第三种应用是产生对病毒、细菌或真菌抗原具有特异性的治疗性淋巴细胞群。因此，对于针对B细胞恶性肿瘤描述的肿瘤学应用，对感染性疾病的靶向将允许DuoCAR产品基于对微生物抗原的识别来介导针对感染物(infective agent)或其所在的患病组织的免疫保护或免疫治疗活性。与其中T细胞受体本身介导病原体编码肽的识别的基于T细胞受体(TCR)的方法不同，Duo CAR方法将利用以CAR载体形式表达的结合蛋白，其将为经转导的T细胞群提供抗体样识别(即，不需要抗原加工)。治疗性T细胞群的活化将导致免疫激活部位能够消除被感染的细胞，并且如果微生物抗原不是细胞缔合的，则能够释放可溶性介质(例如干扰素-γ)，其将使得针对感染物的有效的免疫应答成为可能。
例如，已知HIV是高度可变的，但是可对特定的分支(clade)或家族进行分类，并且产生针对分支特异性病毒包膜蛋白(env，gp120)的抗体。使用DuoCAR方法，三种或更多种分支特异性抗体样结合物包含在CAR构建体中，导致广泛的抗HIV免疫活性。除病毒蛋白之外，还可靶向细菌蛋白。目前的医学挑战是治疗通常在医疗环境中出现的抗生素抗性细菌菌株。这些包括VRE(耐万古霉素肠球菌)、MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)、KPC(产肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的革兰氏阴性菌(Klebsiella pneumoniae carbapenemase producinggram-negative bacteria)，也称为CRKP)等。克雷伯菌细胞表面抗原包括O抗原(9种变体)和K抗原(约80种变体)。O抗原谱可很容易地用小的DuoCAR文库覆盖，许多K抗原也一样。为了使用，将产生CAR构建体，其特征在于与不同K或O血清型结合的抗体，并且这些CAR载体用于转导如用于肿瘤学应用那样分离和活化的Th1样效应细胞群。在真菌疾病中，L.Cooper等(Kumasesan，P.R.，2014，PNAS USA，111：10660)的工作示出通常在人细胞上表达的真菌结合蛋白dectin-1可重构为CAR，并用于控制体外真菌生长。人疾病曲霉病发生在严重免疫抑制的个体中，并且由真菌烟曲霉(A.fumigatus)引起。多个研究小组已经产生了对曲霉(aspergillus)细胞表面的抗原成分具有特异性的单克隆抗体，从而打开了用靶向真菌表面上的三种或更多种曲霉抗原的DuoCAR进行过继免疫治疗的大门。因此，在所有这些感染性疾病应用中，产生针对微生物抗原的免疫球蛋白样结合物的能力允许多种抗原被表达CAR的效应淋巴细胞群靶向。
接下来是对本文中公开的可用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的DuoCAR的详细描述，包括其胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的描述，以及DuoCAR、使用所公开DuoCAR的抗体及其抗原结合片段、缀合物、核苷酸、表达、载体和宿主细胞、治疗方法、组合物和药盒的另外的描述。虽然已参照DuoCAR的产生和使用举例说明了本发明的组合物和方法，但本文中考虑了所述组合物和方法特别地旨在包括TrioCAR和QuatroCAR的产生和使用。
A.嵌合抗原受体(如存在于DuoCAR中)
本文中公开的DuoCAR包含至少两种载体，每种载体编码功能性CAR，因此载体的组合导致两种或更多种不同结合结构域的表达，其中每种载体所编码的结合结构域与跨膜结构域和一个或更多个不同的胞内信号传导基序共价连接，至少一个能够与抗原结合的胞外结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内结构域。
CAR是人工构建的杂交蛋白或多肽，其包含通过跨膜结构域与T细胞信号传导结构域连接的抗体的抗原结合结构域(例如，单链可变片段(scFv))。DuoCAR的特征包括其能够以非MHC限制性方式朝着所选靶标重定向T细胞特异性和反应性，以及利用单克隆抗体的抗原结合性质。非MHC限制性抗原识别赋予表达DuoCAR的T细胞以不依赖于抗原加工而识别抗原的能力，因此绕过了主要的肿瘤逃逸机制。此外，当在T细胞中表达时，DuoCAR有利地不与内源性T细胞受体(TCR)α和β链二聚化。
如本文中公开的，DuoCAR的胞内T细胞信号传导结构域可包括例如T细胞受体信号传导结构域、T细胞共刺激信号传导结构域或这二者。T细胞受体信号传导结构域是指包含T细胞受体的胞内结构域(例如但不限于CD3ζ蛋白的胞内部分)的CAR的一部分。共刺激信号传导结构域是指包含共刺激分子的胞内结构域的CAR的一部分，所述共刺激分子是淋巴细胞对抗原的高效应答所需的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。在一些情况下，激活结构域可通过磷酸化的特定位点(即CD3ζ链中的ITAM基序)的突变来减弱，从而小心地调节由该结构域介导的信号转导的程度。
1.胞外结构域
在一个实施方案中，在如本文中公开的患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群中使用的CAR包含靶特异性结合元件，其也称为抗原结合结构域或部分。结构域的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数目。例如，可选择抗原结合结构域以识别充当与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物的配体。因此，可充当CAR中抗原结合结构域的配体的细胞表面标志物的一些实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫病和癌细胞相关的那些。
在一个实施方案中，可通过工程化改造与肿瘤细胞上的抗原特异性结合的期望的抗原结合结构域来工程化改造CAR以靶向目的肿瘤抗原。肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的引起免疫应答(特别是T细胞介导的免疫应答)的蛋白质。抗原结合结构域的选择将取决于待治疗的癌症的具体类型。肿瘤抗原是本领域中公知的，并且包括例如胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen，PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、存活蛋白(survivin)和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(prostate-carcinoma tumorantigen-1，PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白(ephrinB2)、CD22、胰岛素生长因子(insulin growth factor，IGF)-I受体、IGF-II受体、IGF-I受体和间皮素。本文中公开的肿瘤抗原仅以举例的方式包括在内。该列表并不旨在是排他性的，并且其他实例对于本领域技术人员而言将是明显的。
在一个实施方案中，肿瘤抗原包含与恶性肿瘤相关的一种或更多种抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达许多可充当免疫攻击的靶抗原的蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原，例如黑素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和GP100以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase，PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。另一些靶分子属于转化相关分子的组，例如癌基因HER-2/Neu/ErbB-2。另一组靶抗原是肿瘤-胚胎抗原(onco-fetal antigen)，例如癌胚抗原(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成个体肿瘤独特的真正地肿瘤特异性的免疫球蛋白抗原。B细胞分化抗原(例如CD19、CD20、CD22和CD37)是B细胞淋巴瘤中靶抗原的另一些候选物。这些抗原中的一些(CEA、HER-2、CD19、CD20、CD22，独特型)已被用作单克隆抗体被动免疫治疗的靶标，但成效有限。
肿瘤抗原的类型也可以是肿瘤特异性抗原(tumor-specific antigen，TSA)或肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)。TSA是肿瘤细胞独有的，并且不在体内的其他细胞上出现。TAA不是肿瘤细胞独有的，并且相反在无法诱导对抗原免疫耐受状态的条件下也在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可在使得免疫系统能够对抗原作出应答的条件下发生。TAA可以是当免疫系统不成熟并且不能应答时在胚胎发育期间在正常细胞上表达的抗原，或者其可以是在正常细胞上通常以极低水平存在但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。
TSA或TAA的一些非限制性实例包括以下：分化抗原，例如MART-1/MelanA(MART-1)、gp100(PmeI 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2；以及肿瘤特异性多谱系抗原，例如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过表达的胚胎抗原，例如CEA；过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因，例如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位造成的独特的肿瘤抗原；例如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原例如EB病毒(Epstein Barr virus)抗原EBVA和人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)抗原E6和E7。其他大的基于蛋白质的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C-相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
在一个优选的实施方案中，CAR的抗原结合结构域部分靶向包括但不限于以下的抗原：CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、MY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR等。在另一个实施方案中，本文中提供了DuoCAR，其包含标签或抗标签结合结构域。
根据待靶向的期望的抗原，可工程化改造CAR以包含对所期望的抗原靶标具有特异性的合适的抗原结合结构域。例如，如果CD19是待靶向的期望的抗原，则对CD19具有特异性的抗体或其scFv片段可用作并入到CAR中的抗原结合结构域。
在一个示例性实施方案中，CAR的抗原结合结构域部分靶向CD19。优选地，CAR中的抗原结合结构域是抗CD19 scFV，其中抗CD19 scFV的核酸序列包含SEQ ID NO：27所示序列。在一个实施方案中，抗CD19 scFV包含编码SEQ ID NO：28的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，CAR的抗CD19 scFV部分包含SEQ ID NO：28所示氨基酸序列。在第二个示例性实施方案中，CAR的抗原结合结构域靶向CD20。优选地，CAR中的抗原结合结构域是抗CD20 scFv，其中抗CD20 scFv的核酸序列包含SEQ ID NO：1所示序列。在另一个实施方案中，CAR的抗CD20 scFV部分包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。在第三个示例性实施方案中，CAR的抗原结合结构域靶向CD22。优选地，CAR中的抗原结合结构域是抗CD22 scFv，其中抗CD22 scFv的核酸序列包含SEQ ID NO：7所示序列。在另一个实施方案中，CAR的抗-CD22scFV部分包含SEQ ID NO：8所示氨基酸序列。
在本发明的一个方面中，提供了能够与非TSA或非TAA结合的CAR，所述非TSA或非TAA包括例如但不限于来源于以下的抗原：逆转录病毒科(例如，人类免疫缺陷病毒，例如HIV-1和HIV-LP)、小核糖核酸病毒(例如，脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒和埃可病毒)、风疹病毒、冠状病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病毒、埃博拉病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、细小病毒、腺病毒科、疱疹病毒科[例如1型和2型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)和疱疹病毒]、痘病毒科(例如，天花病毒、痘苗痘病毒和痘病毒)或丙型肝炎病毒、或其任意组合。
在本发明的另一个方面中，提供了能够与来自以下的细菌菌株的抗原结合的CAR：葡萄球菌(Staphylococci)、链球菌(Streptococcus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞菌(Pseudomonas)或沙门菌(Salmonella)。特别地，提供了能够与来自感染性细菌的抗原结合的CAR，所述感染性细菌例如幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、分枝杆菌属的细菌菌株(例如，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)或戈登分枝杆菌(M.gordonea))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitides)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、A组链球菌、B组链球菌(无乳链球菌(Streptococcusagalactiae))、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)或破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、或其组合。
2.跨膜结构域
在如本文中公开的用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群中的DuoCAR中，CAR包含与CAR的胞外结构域融合的一个或更多个跨膜结构域。
在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的接头结构域来源于CD8的胞外结构域，并且与跨膜结构域连接。
在一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中所编码的接头结构域来源于跨膜结构域的胞外结构域，并且与跨膜结构域连接。
在一些情况下，可选择跨膜结构域或通过氨基酸替换来避免这样的结构域与相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域的结合，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
跨膜结构域可来源于天然或合成来源。当来源是天然的时，该结构域可来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。特别用于本发明的跨膜区可来源于(即，至少包含其跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD271、TNFRSF19、FcεR、或其任意组合。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，其将主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。优选地，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将存在于合成跨膜结构域的每个末端。任选地，短的寡肽接头或多肽接头(优选长度为2至10个氨基酸)可在CAR的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体或三丙氨酸基序提供特别合适的接头。
在一个实施方案中，本发明的CAR中的跨膜结构域是CD8跨膜结构域。在一个实施方案中，CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO：11的核酸序列。在一个实施方案中，CD8跨膜结构域包含编码SEQ ID NO：12的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列。
在一些情况下，CAR的跨膜结构域包含CD8.α.铰链结构域。在一个实施方案中，CD8铰链结构域包含SEQ ID NO：13的核酸序列。在一个实施方案中，CD8铰链结构域包含编码SEQ ID NO：14的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，CD8铰链结构域包含SEQ IDNO：14的氨基酸序列。
不旨在限制任何特定的作用机制，认为与如本发明的本文中公开的患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群中使用的示例性DuoCAR相关的增强的治疗功能的可能原因包括例如但不限于：a)质膜内的改进的横向运动，其允许更高效的信号转导，b)质膜微结构域(例如脂筏(lipid raft))内的优越位置以及与T细胞活化相关的跨膜信号传导级联相互作用的更好的能力，c)通过优先移动远离抑制性或下调性相互作用(例如较少地与磷酸酶(例如CD45)接近或相互作用)的质膜内的优越位置，以及d)优越组装成T细胞受体信号传导复合物(即，免疫突触)，或其任意组合。
在如本文中公开的患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的一个实施方案中，用于本文中公开的DuoCAR的非限制性示例性跨膜结构域包括TNFRSF16和TNFRSF19跨膜结构域，其可用于获得如2015年10月9日提交的标题为CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS AND METHODSOF USE并且转让给Lentigen Technology，Inc.(事件编号LEN_015PRO)的申请人的共同未决临时专利申请No.62/239,509中所公开的TNFRSF跨膜结构域和/或接头或间隔区结构域，特别包括其中如表1中列出的肿瘤坏死因子受体超家族内列出的那些其他TNFRSF成员。
3.间隔区结构域
在如本文中公开的用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的DuoCAR中，可在胞外结构域与TNFRSF跨膜结构域之间，或在胞内结构域与TNFRSF跨膜结构域之间布置间隔区结构域。间隔区结构域意指用于将TNFRSF跨膜结构域与胞外结构域和/或TNFRSF跨膜结构域与胞内结构域连接的任何寡肽或多肽。间隔区结构域包含至多300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，且最优选25至50个氨基酸。
在数个实施方案中，接头可包含间隔区元件，其在存在时增大接头的大小，使得效应分子或可检测标志物与抗体或抗原结合片段之间的距离增大。示例性间隔区是本领域普通技术人员已知的，并包括在美国专利No7,964,5667、498,298、6,884,869、6,323,315、6,239,104、6,034,065、5,780,588、5,665,860、5,663，149、5,635,483、5,599,902、5,554,725、5,530,097、5,521,284、5,504,191、5,410,024、5，138,036、5,076,973、4,986,988、4,978,744、4,879,278、4,816,444和4,486,414以及美国专利公开No 20110212088和20110070248中所列出的那些，其各自通过引用整体并入本文。
间隔区结构域优选具有促进CAR与抗原结合并增强信号传导进入细胞的序列。预期促进结合的氨基酸的一些实例包括半胱氨酸、带电荷的氨基酸以及潜在的糖基化位点中的丝氨酸和苏氨酸，并且这些氨基酸可用作构成间隔区结构域的氨基酸。
作为间隔区结构域，可使用以下的全部或一部分：CD8.α.(NCBI RefSeq：NP.sub.--001759.3)的包含铰链区的第137至206位氨基酸(SEQ ID NO：15)，CD8.β.(GenBank：AAA35664.1)的第135至195位氨基酸，CD4(NCBI RefSeq.NP.sub.--000607.1)的第315至396位氨基酸，或CD28(NCBI RefSeq.NP.sub.--006130.1)的第137至152位氨基酸。此外，作为间隔区结构域，可使用抗体H链或L链的恒定区的一部分(CH1区或CL区，例如，具有SEQ ID NO：16中所示氨基酸序列的肽)。此外，间隔区结构域可以是人工合成的序列。
此外，在CAR中，信号肽序列可连接至N端。信号肽序列存在于许多分泌蛋白和膜蛋白的N端，且长度为15至30个氨基酸。由于上述作为胞内结构域的许多蛋白质分子具有信号肽序列，因此信号肽可用作CAR的信号肽。在一个实施方案中，信号肽包含SEQ ID NO：5中所示的前导(信号肽)序列的核苷酸序列。在一个实施方案中，信号肽包含SEQ ID NO：6中所示氨基酸序列。
4.胞内结构域
CAR的胞质结构域或其他胞内信号传导结构域负责活化其中已置入CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的专门功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞裂解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞执行专门功能的蛋白质的部分。尽管通常可使用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，只要其转导效应子功能信号，就可使用这样的截短部分代替完整链。因此，术语胞内信号传导结构域意在包括足以转导效应子功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于CAR中的胞内信号传导结构域的优选实例包括T细胞受体(TCR)和共同受体的胞质序列，其在抗原受体接合后共同发挥作用以引发信号转导；以及这些序列的任何衍生物或变体以及具有相同功能性能力的任何合成序列。
已知仅通过TCR产生的信号不足以完全活化T细胞并且还需要次级信号或共刺激信号。因此，可以说T细胞活化是由两种不同种类的胞质信号传导序列介导的：通过TCR引发抗原依赖性初级活化的那些(初级胞质信号传导序列)和以抗原非依赖性方式发挥作用以提供次级信号或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列)。
初级胞质信号传导序列以刺激性方式或以抑制性方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激性方式发挥作用的初级胞质信号传导序列可包含被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。
特别用于本文中公开的CAR中的包含初级胞质信号传导序列的ITAM的一些实例包括来源于以下的那些：TCRζ(CD3ζ)、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。ITAM的一些具体的非限制性实例包括具有以下序列的肽：CD3.ζ.(NCBI RefSeq：NP.sub.--932170.1)的第51至164位氨基酸，Fc.ε.RI.y.(NCBI RefSeq：NP.sub.--004097.1)的第45至86位氨基酸，Fc.ε.RI.β.(NCBI RefSeq：NP.sub.--000130.1)的第201至244位氨基酸，CD3.γ.(NCBI RefSeq：NP.sub.--000064.1)的第139至182位氨基酸，CD3.δ.(NCBI RefSeq：NP.sub.--000723.1)的第128至171位氨基酸，CD3.ε.(NCBI RefSeq：NP.sub.--000724.1)的第153至207位氨基酸，CD5(NCBI RefSeq：NP.sub.--055022.2)的第402至495位氨基酸，0022(NCBI RefSeq：NP.sub.--001762.2)的第707至847位氨基酸，CD79a(NCBI RefSeq：NP.sub._001774.1)的第166至226位氨基酸，CD79b(NCBI RefSeq：NP.sub._000617.1)的第182至229位氨基酸，以及CD66d(NCBI RefSeq：NP.sub._001806.2)的第177至252位氨基酸，及其与这些肽具有相同功能的变体。基于本文中所述的NCBIRefSeq ID或GenBank的氨基酸序列信息的氨基酸号是基于每种蛋白质的前体(包含信号肽序列等)的全长进行编号的。在一个实施方案中，CAR中的胞质信号传导分子包含来源于CD3ζ的胞质信号传导序列。在另一个实施方案中，CD3ζ中的一个、两个或三个ITAM基序通过由另一个氨基酸突变或替换酪氨酸残基而减弱。
在一个优选的实施方案中，可将CAR的胞内结构域设计成自身包含CD3-ζ信号传导结构域，或者将其与在CAR的情况下可用的任何其他期望的胞质结构域组合。例如，CAR的胞内结构域可包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导区域。共刺激信号传导区域是指包含共刺激分子的胞内结构域的CAR的一部分。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的高效应答所需的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。这样的共刺激分子的一些实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(lymphocytefunction-associated antigen-1，LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等。这样的共刺激分子的一些具体的非限制性实例包括具有以下序列的肽：CD2((NCBI RefSeq：NP.sub.--001758.2)的第236至351位氨基酸，CD4(NCBI RefSeq：NP.sub.--000607.1)的第421至458位氨基酸，CD5(NCBI RefSeq：NP.sub.--055022.2)的第402至495位氨基酸，CD8.α.(NCBI RefSeq：NP.sub.--001759.3)的第207至235位氨基酸，CD83(GenBank：AAA35664.1)的第196至210位氨基酸，CD28(NCBI RefSeq：NP.sub.--006130.1)的第181至220位氨基酸，CD137(4-1BB，NCBI RefSeq：NP.sub.--001552.2)的第214至255位氨基酸，CD134(OX40，NCBI RefSeq：NP.sub.--003318.1)的第241至277位氨基酸和ICOS(NCBI RefSeq：NP.sub.--036224.1)的第166至199位氨基酸，及其与这些肽具有相同功能的变体。因此，尽管本文中的公开内容主要以4-1BB作为共刺激信号传导元件来举例说明，但其他共刺激元件也在本公开内容的范围内。
CAR的胞质信号传导部分内的胞质信号传导序列可以以随机或特定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽接头或多肽接头(优选长度为2至10个氨基酸)可形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。
在一个实施方案中，胞内结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在另一个实施方案中，胞内结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在另一个实施方案中，胞内结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28和4-1BB的信号传导结构域。
在一个实施方案中，CAR中的胞内结构域被设计成包含4-1BB的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中4-1BB的信号传导结构域包含SEQ ID NO：17所示核酸序列并且CD3-ζ的信号传导结构域包含SEQ ID NO：19所示核酸序列。
在一个实施方案中，CAR中的胞内结构域被设计成包含4-1BB的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中4-1BB的信号传导结构域包含编码SEQ ID NO：18的氨基酸序列的核酸序列并且CD3-ζ的信号传导结构域包含编码SEQ ID NO：20的氨基酸序列的核酸序列。
在一个实施方案中，CAR中的胞内结构域被设计成包含4-1BB的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中4-1BB的信号传导结构域包含SEQ ID NO：18所示氨基酸序列并且CD3-ζ的信号传导结构域包含SEQ ID NO：20所示氨基酸序列。
5.DuoCAR的另外的描述
本发明范围内还明确包含用于如本文中公开的患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群中的DuoCAR的功能性部分。当在提及CAR使用时，术语“功能性部分”是指本文中所公开的一个或更多个DuoCAR的任何部分或片段，所述部分或片段保留其作为部分的CAR(亲本CAR)的生物学活性。功能性部分涵盖例如保留与亲本CAR在相似程度上、在相同程度上或在更高程度上识别靶细胞或检测、治疗或预防疾病的能力的那些CAR部分。根据亲本CAR，功能性部分可包含例如亲本CAR的约10％、25％、30％、50％、68％、80％、90％、95％或更多。
功能性部分可在该部分的氨基端或羧基端或在两个端包含另外的氨基酸，所述另外的氨基酸不存在于亲本CAR的氨基酸序列中。期望地，另外的氨基酸不干扰功能性部分的生物学功能，例如识别靶细胞、检测癌症、治疗或预防癌症等。更期望地，与亲本CAR的生物学活性相比，另外的氨基酸增强了生物学活性。
本公开内容的范围内包含本文中公开的DuoCAR的功能性变体。本文中使用的术语“功能性变体”是指与亲本CAR具有实质或显著序列同一性或相似性的CAR、多肽或蛋白质，所述功能性变体保留其作为变体的CAR的生物学活性。功能性变体涵盖例如保留与亲本CAR在相似程度、相同程度或更高程度上识别靶细胞的能力的本文中所述的CAR(亲本CAR)的那些变体。根据亲本CAR，功能性变体可例如与亲本CAR在氨基酸序列方面具有至少约30％、50％、75％、80％、90％、98％或更多的同一性。
功能性变体可例如包含具有至少一个保守氨基酸替换的亲本CAR的氨基酸序列。作为替代或补充，功能性变体可包含具有至少一个非保守氨基酸替换的亲本CAR的氨基酸序列。在这种情况下，优选地非保守氨基酸替换不干扰或抑制功能性变体的生物学活性。非保守氨基酸替换可增强功能性变体的生物学活性，以使得与亲本CAR相比，功能性变体的生物学活性提高。
DuoCAR的氨基酸替换优选为保守氨基酸替换。保守氨基酸替换是本领域中已知的，并且包括其中具有某些物理和/或化学特性的一个氨基酸被交换为具有相同或相似化学或物理特性的另一个氨基酸的氨基酸替换。例如，保守氨基酸替换可以是酸性/带负电荷的极性氨基酸替换另一个酸性/带负电荷的极性氨基酸(例如，Asp或Glu)，具有非极性侧链的氨基酸替换另一个具有非极性侧链的氨基酸(例如，Ala、Gly、Val、He、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Cys、Val等)，碱性/带正电荷的极性氨基酸替换另一个碱性/带正电荷的极性氨基酸(例如，Lys、His、Arg等)，具有极性侧链的不带电荷的氨基酸替换另一个具有极性侧链的不带电荷的氨基酸(例如，Asn、Gin、Ser、Thr、Tyr等)，具有β分支侧链的氨基酸替换另一个具有β分支侧链的氨基酸(例如，He、Thr和Val)，具有芳香族侧链的氨基酸替换另一个具有芳香族侧链的氨基酸(例如，His、Phe、Trp和Tyr)等。
CAR可基本上由本文中所述的特定氨基酸序列组成，使得其他组分(例如其他氨基酸)不大幅改变功能性变体的生物学活性。
DuoCAR(包括功能性部分和功能性变体)可具有任何长度，即，可包含任何数目的氨基酸，前提是DuoCAR(或其功能性部分或功能性变体)保留其生物学活性，例如，与抗原特异性结合、检测哺乳动物中的患病细胞、或者在哺乳动物中治疗或预防疾病等的能力。例如，CAR的长度可以为约50至约5000个氨基酸，例如长度为50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个氨基酸。
DuoCAR(包括本发明的功能性部分和功能性变体)可包含合成氨基酸以代替一种或更多种天然存在的氨基酸。这样的合成氨基酸是本领域中已知的，并且包括例如氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨基甲基-半胱氨酸、反式-3-羟基脯氨酸和反式-4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸、β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苄基-N’-甲基-赖氨酸、N’，N’-二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、γ-二氨基丁酸、β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。
可将DuoCAR(包括功能性部分和功能性变体)糖基化、酰胺化、羧化、磷酸化、酯化、N-酰化、环化(通过例如二硫桥)或转化成酸加成盐和/或任选地二聚化或多聚合或缀合。
可通过本领域中已知的方法获得DuoCAR(包括其功能性部分和功能性变体)。DuoCAR可通过制备多肽或蛋白质的任何合适的方法制备。从头合成多肽和蛋白质的合适方法描述于参考文献中，例如Chan等，Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis，OxfordUniversity Press，Oxford，United Kingdom，2000；Peptide and Protein DrugAnalysis，ed.Reid，R.，Marcel Dekker，Inc.，2000；Epitope Mapping，ed.Westwood等，Oxford University Press，Oxford，United Kingdom，2001；以及美国专利5,449,752。产生嵌合抗原受体的方法、包含这样的受体的T细胞及其用途(例如，用于治疗癌症)是本领域中已知的并且在本文中进一步描述(参见，例如，Brentjens等，2010，Molecular Therapy，18：4，666-668；Morgan等，2010，Molecular Therapy，2010年2月23日在线公开，2010，第1至9页；Till等，2008，Blood，112：2261-2271；Park等，Trends Biotechnol.，29：550-557，2011；Grupp等，N Engl J Med.，368：1509-1518，2013；Han等，J.Hematol Oncol.，6：47，2013；Tumaini等，Cytotherapy，15，1406-1417，2013；Haso等，(2013)Blood，121，1165-1174；PCT公开WO2012/079000、WO2013/126726；以及美国公开2012/0213783，其各自通过引用整体并入本文)。例如，编码所公开的嵌合抗原结合受体的核酸分子可包含在用于转导宿主细胞(例如T细胞)的表达载体(例如慢病毒载体)中以制备所公开的CAR。在一些实施方案中，使用嵌合抗原受体的方法包括从对象中分离T细胞，用编码嵌合抗原受体的表达载体(例如慢病毒载体)转导T细胞，以及向对象施用表达CAR的T细胞进行治疗，例如用于在对象中治疗肿瘤。
B.抗体和抗原结合片段
一个实施方案还提供了本文中公开的用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的CAR、表达CAR的T细胞、与本文中公开的一种或更多种抗原特异性结合的抗体或其抗原结合结构域或部分。本文中使用的“表达CAR的T细胞”或“CAR T细胞”意指表达CAR的T细胞，并且具有通过例如CAR的抗体来源的靶向结构域确定的抗原特异性。
本文中使用的“抗原结合结构域”可包括抗体及其抗原结合片段。术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，并且涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)及其抗原结合片段，只要它们显示出所期望的抗原结合活性即可。抗体的一些非限制性实例包括例如保留对抗原的结合亲和力的本领域中已知的完整的免疫球蛋白及其变体和片段。
“单克隆抗体”是从基本上同质的抗体的群获得的抗体，即，除了可能以少量存在的天然存在的突变以外，包含该群的个体抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，其针对单个抗原表位。修饰语“单克隆”表示如从基本上同质的抗体群获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。在一些实例中，单克隆抗体是由B淋巴细胞的单克隆或已经被编码单个抗体(或其抗原结合片段)的抗体轻链和重链可变区的核酸转染的细胞或其后代产生的抗体。在一些实例中，从对象中分离单克隆抗体。单克隆抗体可具有保守氨基酸替换，其对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本无影响。生产单克隆抗体的示例性方法是已知的，例如，参见Harlow&Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，第2版.Cold Spring Harbor Publications，New York(2013)。
通常来说，免疫球蛋白具有通过二硫键相互连接的重链(H)和轻链(L)。免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及众多的免疫球蛋白可变结构域基因。存在两种类型的轻链，lambda(λ)和kappa(κ)。存在决定抗体分子之功能活性的五种主要的重链种类(或同种型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。
每个重链和轻链包含恒定区(或恒定结构域)和可变区(或可变结构域；参见，例如Kindt等Kuby Immunology,6.sup.th ed.，W.H.Freeman和Co.，第91页(2007))。在数个实施方案中，重链和轻链可变区组合以特异性地结合抗原。在另外的一些实施方案中，仅需要重链可变区。例如，仅由重链组成的天然存在的骆驼科(camelid)抗体在不存在轻链的情况下是有功能且稳定的(参见，例如，Hamers-Casterman等，Nature，363：446-448，1993；Sheriff等，Nat.Struct.Biol.，3：733-736，1996)。提及“VH”或“VH”是指抗体重链的可变区，包括抗原结合片段，例如Fv、scFv、dsFv或Fab的可变区。提及“VL”或“VL”是指抗体轻链的可变结构域，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的可变结构域。
轻链和重链可变区包含被三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)中断的“框架”区(参见，例如，Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Department of Health and Human Services，1991)。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内是相对保守的。抗体的框架区(即成分轻链和重链的组合框架区)用于在三维空间中定位和对齐CDR。
CDR主要负责与抗原的表位结合。给定CDR的氨基酸序列边界可使用许多公知的方案中的任一种来容易地确定，包括由以下描述的那些：Kabat等(“Sequences of Proteinsof Immunological Interest，”第5版.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991；“Kabat”编号方案)、Al-Lazikani等(JMB 273,927-948，1997；“Chothia”编号方案)和Lefranc等(“IMGT unique numbering for immunoglobulin and Tcell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains，”Dev.Comp.Immunol.，27：55-77，2003；“IMGT”编号方案)。每条链的CDR通常被称为CDR1、CDR2和CDR3(从N端至C端)，并且通常也由其中特定CDR所定位的链来鉴定。因此，VH CDR3是来自其中存在它的抗体的重链的可变结构域的CDR3，而VL CDR1是来自其中存在它的抗体的轻链的可变结构域的CDR1。轻链CDR有时被称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。重链CDR有时被称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。
“抗原结合片段”是保留了特异性识别同源抗原之能力的全长抗体的一部分以及这样的部分的多种组合。抗原结合片段的一些非限制性实例包括Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段包括通过修饰完整抗体产生的抗原结合片段或使用重组DNA方法从头合成的那些(参见，例如，Kontermann和Dubel(编辑)，Antibody Engineering，第1至2卷，第2版，Springer Press，2010)。
单链抗体(scFv)是包含作为遗传融合的单链分子的通过合适的多肽接头连接的一个或更多个抗体的VH和VL结构域的经基因工程化改造的分子(参见，例如，Bird等，Science，242：423426，1988；Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.，85：58795883，1988；Ahmad等，Clin.Dev.Immunol.，2012，doi：10.1155/2012/980250；Marbry，IDrugs，13：543-549，2010)。scFv中的VH结构域和VL结构域的分子内取向对于scFv通常不是决定性的。因此，可使用具有这两种可能的排列(VH结构域-接头结构域-VL结构域；VL结构域-接头结构域-VH结构域)的scFv。
在dsFv中，重链和轻链可变链已突变以引入二硫键从而使链的缔合稳定化。还包括双抗体，其是二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但是使用太短而不允许相同链上的两个结构域之间配对的接头，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见，例如，Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.，90：64446448，1993；Poljak等，Structure，2：11211123，1994)。
抗体还包括基因工程化改造形式，例如嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)和异源缀合抗体(例如双特异性抗体)。还参见Pierce Catalog and Handbook，1994-1995(PierceChemical Co.，Rockford，IL)；Kuby，J.，Immunology，第3版.，W.H.Freeman&Co.，New York，1997。
非天然存在的抗体可使用固相肽合成来构建，可重组产生，或者可例如如Huse等，Science 246：1275-1281(1989)(其通过引入并入本文)所述通过筛选由可变重链和可变轻链组成的组合文库而获得。制备例如嵌合的、人源化的、CDR移植的、单链和双功能性抗体的这些和其他方法是本领域技术人员公知的(Winter和Harris，Immunol.Today 14：243-246(1993)；Ward等，Nature 341：544-546(1989)；Harlow和Lane，同上，1988；Hilyard等，Protein Engineering：A practical approach(IRL Press 1992)；Borrabeck，AntibodyEngineering，第2版.(Oxford University Press 1995)；其各自通过引用并入本文)。
作为参照抗体的“与相同表位结合的抗体”是指在竞争测定中阻断参照抗体与其抗原结合的50％或更多的抗体，并且反过来，参照抗体在竞争性测定中阻断该抗体与其抗原结合的50％或更多。抗体竞争测定是已知的，并且本文中提供了示例性的竞争测定。
“人源化”抗体或抗原结合片段包含人框架区和来自非人(例如小鼠、大鼠或合成)抗体或抗原结合片段的一个或更多个CDR。提供CDR的非人抗体或抗原结合片段被称为“供体(donor)”，并且提供框架的人抗体或抗原结合片段被称为“接纳体(acceptor)”。在一个实施方案中，在人源化的免疫球蛋白中，所有CDR都来自供体免疫球蛋白。恒定区不需要存在，但是如果存在的话，其可与人免疫球蛋白恒定区基本上相同，例如至少约85％至90％，例如约95％或更高的同一性。因此，除了可能的CDR之外，人源化抗体或抗原结合片段的所有部分都与天然人抗体序列的相应部分基本上相同。
“嵌合抗体”是包含来源于两种不同抗体(其通常来自不同的物种)的序列的抗体。在一些实例中，嵌合抗体包含来自一种人抗体的一个或更多个CDR和/或框架区和来自其他人抗体的CDR和/或框架区。
“完全人抗体”或“人抗体”是包含来自(或来源于)人基因组的序列，但不包含来自其他物种的序列的抗体。在一些实施方案中，人抗体包含来自(或来源于)人基因组的CDR、框架区和Fc区(如果存在的话)。人抗体可使用用于基于来源于人基因组的序列产生抗体的技术来鉴定和分离，例如通过噬菌体展示或使用转基因动物(参见例如Barbas等Phagedisplay：A Laboratory Manuel.第1版.New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2004.Print.；Lonberg，Nat.Biotech.，23：1117-1125，2005；Lonenberg，Curr.Opin.Immunol.，20：450-459，2008)。
抗体可具有一个或更多个结合位点。如果存在多于一个结合位点，则结合位点可彼此相同或者可以不同。例如，天然存在的免疫球蛋白具有两个相同的结合位点，单链抗体或Fab片段具有一个结合位点，而双特异性或双功能抗体具有两个不同的结合位点。
测试抗体与CAR的任何功能性部分结合的能力的方法是本领域中已知的并且包括任何抗体-抗原结合测定，例如如放射免疫测定(radioimmunoassay，RIA)、ELISA、Western印迹、免疫沉淀和竞争性抑制测定法(参见，例如，Janeway等，见下文，美国专利申请公开No2002/0197266A1和美国专利No 7,338,929)。
此外，CAR、表达CAR的T细胞、抗体或其抗原结合部分可包含可检测标记，例如如放射性同位素、荧光团(例如，异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE))、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)和元素颗粒(例如，金颗粒)。
C.缀合物
本文中公开的用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的DuoCAR、表达CAR的T细胞、或对本文中公开的一种或更多种抗原具有特异性的单克隆抗体或其抗原结合片段可使用任意数目的本领域技术人员已知的方法与试剂例如效应分子或可检测标志物缀合。可使用共价和非共价连接方式二者。缀合物包括但不限于其中存在效应分子或可检测标志物与抗体或抗原结合片段的共价连接的分子，所述抗体或抗原结合片段特异性结合本文中公开的一种或更多种抗原。本领域技术人员将理解，可使用多种效应分子和可检测标志物，包括(但不限于)化学治疗剂、抗血管生成剂、毒素、放射性试剂(例如125I、32P、14C、3H和35S)和其他标记、靶部分和配体等。
特定效应分子或可检测标志物的选择取决于特定的靶分子或细胞以及期望的生物学效应。因此，例如，效应分子可以是用于导致特定靶细胞(例如肿瘤细胞)死亡的细胞毒素。
用于将效应分子或可检测标志物附接至抗体或抗原结合片段的方法根据效应物的化学结构而变化。多肽通常包含多种官能团；例如羧酸(COOH)、游离胺(-NH2)或巯基(-SH)基团，其可用于与抗体上的合适官能团反应以导致效应分子或可检测标志物的结合。或者，将抗体或抗原结合片段衍生化以暴露或附接另外的反应性官能团。衍生化可涉及附接许多已知接头分子(例如，可获自Pierce Chemical Company，Rockford，IL的那些)中的任一种。接头可以是用于将抗体或抗原结合片段连接至效应分子或可检测标志物的任何分子。接头能够与抗体或抗原结合片段和效应分子或可检测标志物形成共价键。合适的接头是本领域技术人员公知的，且包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。当抗体或抗原结合片段和效应分子或可检测标志物是多肽时，接头可通过其侧基连接至组成氨基酸(例如通过二硫键连接至半胱氨酸)或连接至末端氨基酸的α碳氨基和羧基。
在数个实施方案中，接头可包含间隔区元件，其在存在时增大接头的大小，使得效应分子或可检测标志物与抗体或抗原结合片段之间的距离增大。示例性间隔区是本领域普通技术人员已知的，并且包括以下中列出的那些：美国专利No 7,964,5667、498,298、6,884,869、6,323,315、6,239,104、6,034,065、5,780,588、5,665,860、5,663,149、5,635,483、5,599,902、5,554,725、5,530,097、5,521,284、5,504,191、5,410,024、5，138,036、5,076,973、4,986,988、4,978,744、4,879,278、4,816,444和4,486,414，以及美国专利公开No20110212088和20110070248，其各自通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，接头在胞内条件下是可切割的，使得在胞内环境中接头的切割从抗体或抗原结合片段释放效应分子或可检测标志物。在另一些实施方案中，接头不可切割，并且效应分子或可检测标志物例如通过抗体降解而释放。在一些实施方案中，接头可被存在于胞内环境(例如，在溶酶体或内体或陷窝(caveolea)内)中的切割剂切割。接头可以是例如肽接头，其被胞内肽酶或蛋白酶(包括但不限于溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶)切割。在一些实施方案中，肽接头为至少两个氨基酸长或至少三个氨基酸长。然而，接头可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸长，例如1至2、1至3、2至5、3至10、3至15、1至5、1至10、1至15个氨基酸长。蛋白酶可包括组织蛋白酶(cathepsin)B和D以及纤溶酶，已知所有这些均水解二肽药物衍生物，导致靶细胞内活性药物的释放(参见例如Dubowchik和Walker，1999，Pharm.Therapeutics83：67-123)。例如，可使用可被巯基依赖性蛋白酶组织蛋白酶B切割的肽接头(例如，苯丙氨酸-亮氨酸或甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸接头)。这样的接头的另一些实例在例如美国专利No.6,214,345中描述，其通过引用并入本文。在一个具体的实施方案中，可被胞内蛋白酶切割的肽接头是缬氨酸-瓜氨酸接头或苯丙氨酸-赖氨酸接头(参见例如美国专利No.6,214,345，其描述了具有缬氨酸-瓜氨酸接头的多柔比星的合成)。
在另一些实施方案中，可切割接头是pH敏感的，即在某些pH值下对水解敏感。通常来说，pH敏感接头在酸性条件下可水解。例如，可使用在溶酶体中可水解的酸不稳定接头(例如，腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等)(参见例如美国专利No.5,122,368、5,824,805、5,622,929；Dubowchik和Walker，1999，Pharm.Therapeutics83：67-123；Neville等，1989，Biol.Chem.264：14653-14661)。这样的接头在中性pH条件(例如在血液中的条件)下相对稳定，但在低于pH 5.5或5.0(溶酶体的近似pH)下不稳定。在某些实施方案中，可水解接头是硫醚接头(例如，如通过酰腙键与治疗剂连接的硫醚(参见例如美国专利No.5,622,929)。
在另一些实施方案中，接头在还原条件下是可切割的(例如，二硫化物接头)。多种二硫化物接头是本领域中已知的，包括例如使用以下可形成的那些：SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)-、SPDB和SMPT。(参见例如Thorpe等，1987，Cancer Res.47：5924-5931；Wawrzynczak等，In Immunoconjugates：Antibody Conjugates inRadioimagery and Therapy of Cancer(C.W.Vogel ed.，Oxford U.Press，1987)；Phillips等，Cancer Res.68：92809290，2008)。还参见美国专利No.4,880,935)。
在另一些具体的实施方案中，接头是丙二酸酯接头(Johnson等，1995，AnticancerRes.15：1387-93)、马来酰亚胺苯甲酰基接头(Lau等，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10)：1299-1304)或3’-N-酰胺类似物(Lau等，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10)：1305-12)。
在另一些实施方案中，接头不可切割，并且效应分子或可检测标志物通过抗体降解释放(参见美国公开No.2005/0238649，其通过引用整体并入本文)。
在数个实施方案中，接头对胞外环境中的切割具有抗性。例如，当缀合物存在于胞外环境中(例如血浆中)时，缀合物的样品中不多于约20％、不多于约15％、不多于约10％、不多于约5％、不多于约3％、或不多于约1％的接头被切割。可例如通过将包含目标接头的缀合物与血浆一起孵育预定的时间段(例如，2、4、8、16或24小时)并随后对血浆中存在的游离效应分子或可检测标志物的量进行定量来确定接头是否对胞外环境中的切割具有抗性。可用于缀合物中的多种示例性接头在WO2004-010957、美国公开No.2006/0074008、美国公开No.20050238649和美国公开No.2006/0024317中描述，其各自通过引用整体并入本文。
在数个实施方案中，提供了CAR、表达CAR的T细胞、抗体或其抗原结合部分与一种或更多种小分子毒素(例如加利车霉素(calicheamicin)、美登素类化合物(maytansinoid)、多拉司他汀(dolastatin)、奥瑞斯他汀(auristatin)、单端孢菌烯(trichothecene)和CC1065)以及这些毒素的具有毒素活性的衍生物的缀合物。
适合用作美登素类化合物毒素部分的美登素化合物是本领域中公知的，并且可根据已知方法从天然来源分离，使用基因工程技术产生(参见Yu等(2002)PNAS 99：7968-7973)，或根据已知方法合成地制备美登醇和美登醇类似物。美登素类化合物是通过抑制微管蛋白聚合而发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素首次从东非灌木齿叶美登木(Maytenusserrata)中分离(美国专利No.3,896,111)。随后，发现某些微生物也产生美登素类化合物，例如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利No.4,151,042)。合成的美登醇及其衍生物和类似物例如在以下中公开：美国专利No.4,137,230、4,248,870、4,256,746、4,260,608、4,265,814、4,294,757、4,307,016、4,308,268、4,308,269、4,309,428、4,313,946、4,315,929、4,317,821、4,322,348、4,331,598、4,361,650、4,364,866、4,424,219、4,450,254、4,362,663和4,371,533，其各自通过引用并入本文。包含美登素类化合物的缀合物、其制备方法及其治疗用途在例如美国专利No.5,208,020、5,416,064、6,441,163以及欧洲专利EP 0 425235 B1中公开，其公开内容通过引用明确地并入本文。
另外的毒素可与CAR、表达CAR的T细胞、抗体或其抗原结合部分一起使用。示例性毒素包括假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin，PE)、蓖麻毒蛋白(ricin)、相思豆毒蛋白(abrin)、白喉毒素及其亚基、核毒素(ribotoxin)、核糖核酸酶、皂草毒蛋白(sapofin)和加利车霉素以及肉毒杆菌毒素A至F。这些毒素是本领域中公知的，并且许多可从商业来源容易地获得(例如Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)。所考虑的毒素还包括毒素的变体(参见，例如，参见美国专利No.5,079,163和4,689,401)。
皂草毒蛋白是来源于石碱草(Saponaria officinalis)的毒素，其通过使核糖体复合物的60S部分失活来破坏蛋白质合成(Stirpe等，Bio/Technology，10：405-412，1992)。然而，该毒素不具有特异性进入细胞的机制，并因此需要与识别细胞表面蛋白质的抗体或抗原结合片段缀合，所述细胞表面蛋白质被内化以被细胞高效地摄取。
白喉毒素分离自白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)。通常来说，用于免疫毒素的白喉毒素被突变以降低或消除非特异性毒性。具有完全酶活性但显著降低的非特异性毒性的被称为CRM107的突变体自二十世纪七十年代就已知(Laird和Groman，J.Virol.19：220，1976)，并且已被用于人临床试验。参见美国专利No.5,792,458和美国专利No.5,208,021。
蓖麻毒素是来自蓖麻(Ricinus communis)(蓖麻籽)的凝集素RCA60。对于蓖麻毒素的实例，参见美国专利No.5,079,163和美国专利No.4,689,401。根据其分子量，蓖麻凝集素(Ricinus communis agglutinin，RCA)以分别为约65和120kD的被称为RCA60和RCA120的两种形式存在(Nicholson&Blaustein，J.Biochim.Biophys.Acta 266：543，1972)。A链负责使蛋白质合成失活和杀伤细胞。B链使蓖麻毒素与细胞表面半乳糖残基结合，并且有助于A链转运到胞质溶胶中(Olsnes等，Nature 249：627-631，1974和美国专利No.3,060,165)。
核糖核酸酶也与靶向分子缀合以用作免疫毒素(参见Suzuki等，Nat.Biotech.17：265-70，1999)。一些示例性核毒素(ribotoxin)(例如α-帚曲毒蛋白(α-sarcin)和局限曲菌素(restrictocin))在例如Rathore等，Gene190：31-5，1997；和Goyal和Batra，Biochem.345Pt 2：247-54，2000中讨论。加利车霉素首次分离自棘孢小单孢(Micromonosporaechinospora)，并且是烯二炔类抗肿瘤抗生素家族的成员，其造成DNA中的双链断裂，导致凋亡(参见例如Lee等，J.Antibiot.42：1070-87，1989)。该药物是临床试验中免疫毒素的毒性部分(参见例如Gillespie等，Ann.Oncol.11：735-41，2000)。
相思豆毒蛋白包含来自相思豆(Abrus precatorius)的毒性凝集素。毒素原理，相思豆毒蛋白a、b、c和d的分子量为约63至67kD，并且由两个二硫键连接的多肽链A和B构成。A链抑制蛋白质合成；B链(相思豆毒蛋白-b)与D-半乳糖残基结合(参见Funatsu等，Agr.Biol.Chem.52：1095，1988；以及Olsnes，Methods Enzymol.50：330-335，1978)。
用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的CAR、表达CAR的T细胞、对本文中公开的一种或更多种抗原具有特异性的单克隆抗体、其抗原结合片段也可与可检测标志物缀合；例如能够通过以下检测的可检测标志物：ELISA、分光光度法、流式细胞术、显微术或诊断成像技术(例如计算机断层扫描(computed tomography，CT)、计算机轴向断层扫描(computedaxial tomography，CAT)、磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、核磁共振成像(nuclear magnetic resonance imaging，NMRI)、磁共振断层扫描(magnetic resonancetomography，MTR)、超声、纤维镜检查和腹腔镜检查)。可检测标志物的一些具体的非限制性实例包括荧光团、化学发光剂、酶连接、放射性同位素和重金属或化合物(例如用于通过MRI检测的超顺磁性铁氧化物纳米晶体)。例如，可用的可检测标志物包括荧光化合物，包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲基胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、镧系元素磷光体等。生物发光标志物也是有用的，例如萤光素酶、绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)、黄色荧光蛋白(Yellow fluorescent protein，YFP)。CAR、表达CAR的T细胞、抗体或其抗原结合部分也可与可用于检测的酶(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等)缀合。当CAR、表达CAR的T细胞、抗体或其抗原结合部分与可检测酶缀合时，其可通过添加另外的试剂来检测，酶使用该试剂产生可辨别的反应产物。例如，当存在试剂辣根过氧化物酶时，添加过氧化氢和二氨基联苯胺产生视觉上可检测的有色反应产物。CAR、表达CAR的T细胞、抗体或其抗原结合部分也可与生物素缀合，并且通过间接测量亲和素或链霉亲和素结合来检测。应指出，亲和素本身可与酶或荧光标记缀合。
CAR、表达CAR的T细胞、抗体或其抗原结合部分可与顺磁性试剂(例如钆)缀合。顺磁性试剂(例如超顺磁性铁氧化物)也可用作标记。抗体也可与镧系元素(例如铕和镝)和锰缀合。抗体或抗原结合片段还可用被第二报道物识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)标记。
CAR、表达CAR的T细胞、抗体或其抗原结合部分也可与放射性标记的氨基酸缀合。放射性标记可用于诊断目的和治疗目的二者。例如，放射性标记可用于通过x射线、发射光谱或其他诊断技术来检测本文中公开的一种或更多种抗原和表达抗原的细胞。此外，放射性标记可治疗性地用作毒素以用于在对象中治疗肿瘤，例如用于治疗神经母细胞瘤。多肽标记的一些实例包括但不限于以下放射性同位素或放射性核苷酸：3H、14C、15N、35S、90y、99Tc、111In、125I、131I。
检测这样的可检测标志物的手段是本领域技术人员公知的。因此，例如，可使用照相胶片或闪烁计数器检测放射性标记，可使用光电检测器检测荧光标记以检测发射的照射。通常通过向酶提供底物并检测酶对底物之作用产生的反应产物来检测酶标记，并通过简单地使有色标记可视化来检测比色标记。
D.核苷酸、表达、载体和宿主细胞
本发明的一个实施方案还提供了包含编码本文中所述的任何DuoCAR、抗体或其抗原结合部分(包括其功能性部分和功能性变体)的核苷酸序列的核酸。本发明的核酸可包含编码本文中所述的任何前导序列、抗原结合结构域、跨膜结构域和/或胞内T细胞信号传导结构域的核苷酸序列。
在一个实施方案中，提供了编码嵌合抗原受体(DuoCAR)的分离的核酸分子，其从N端至C端包含至少一个胞外抗原结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域。
在用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的CAR的一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中编码的胞外抗原结合结构域包含与所述抗原结合之抗体的至少一个单链可变片段。
在用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的CAR的另一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中编码的胞外抗原结合结构域包含与所述抗原结合之抗体的至少一个重链可变区。
在用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的CAR的另一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中编码的CAR胞外抗原结合结构域包含与抗原结合的至少一个基于脂质运载蛋白的抗原结合抗原(anticalins)。
在用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的CAR的一个实施方案中，提供了分离的核酸分子，其中编码的胞外抗原结合结构域通过接头结构域与跨膜结构域连接。
在用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的DuoCAR的另一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中编码的胞外抗原结合结构域的前面是编码前导或信号肽的序列。
在用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的DuoCAR的另一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中编码的胞外抗原结合结构域靶向抗原，所述抗原包括但不限于：CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、CD38、CD123(IL3RA)、CD138、BCMA(CD269)、GPC2、GPC3、FGFR4、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGEA3TCR、或其任意组合。
在用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的DuoCAR的某些实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中编码的胞外抗原结合结构域包含抗CD19 scFV抗原结合结构域、抗CD20 scFV抗原结合结构域、抗CD22 scFV抗原结合结构域、抗ROR1 scFV抗原结合结构域、抗TSLPR scFV抗原结合结构域、抗间皮素scFV抗原结合结构域、抗CD33/IL3Ra scFV抗原结合结构域、抗CD38 scFV抗原结合结构域、抗CD123(IL3RA)scFV抗原结合结构域、抗CD138 scFV抗原结合结构域、抗BCMA(CD269)scFV抗原结合结构域、抗GPC2 scFV抗原结合结构域、抗GPC3 scFV抗原结合结构域、抗FGFR4 scFV抗原结合结构域、抗c-Met scFV抗原结合结构域、抗PMSA scFV抗原结合结构域、抗糖脂F77 scFV抗原结合结构域、抗EGFRvIIIscFV抗原结合结构域、抗GD-2 scFV抗原结合结构域、抗NY-ESo-1TCR scFV抗原结合结构域、抗MAGE A3TCR scFV抗原结合结构域，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其任意组合。
在用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的DuoCAR的一个方面中，本文中提供的CAR还包含接头结构域。
在用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的DuoCAR的一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中胞外抗原结合结构域、胞内信号传导结构域或这二者通过接头结构域与跨膜结构域连接。
在用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的DuoCAR的一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中编码的接头结构域来源于CD8的胞外结构域，并且与跨膜结构域连接。
在用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的DuoCAR的另一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中编码跨膜结构域的核酸序列包含其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
在用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的DuoCAR的一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中编码的跨膜结构域包含含有至少一个但不多于10个修饰的氨基酸序列，或其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的DuoCAR的另一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中所编码的CAR还包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自以下的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154、或其组合。
在用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的DuoCAR的另一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中编码的胞内信号传导结构域还包含CD3ζ胞内结构域。
在本文中公开的CAR的一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中编码的胞内信号传导结构域相对于CD3ζ胞内结构域设置在C端侧。
在用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的DuoCAR的另一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中编码的至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域、主要信号传导结构域或其组合。
在用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的DuoCAR的另一些实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其中编码的至少一个共刺激结构域包含OX40、CD70、CD27、CD28、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、DAP10、DAP12和4-1BB(CD137)的功能性信号传导结构域或其组合。
在用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的DuoCAR的一个实施方案中，提供了编码CAR的分离的核酸分子，其还包含前导序列或信号肽序列。
在一些实施方案中，核苷酸序列可以是密码子修饰的。不受特定理论的约束，认为核苷酸序列的密码子优化提高了mRNA转录物的翻译效率。核苷酸序列的密码子优化可涉及将天然密码子替换成编码相同氨基酸但可被细胞内更容易获得的tRNA翻译的另一密码子，从而提高翻译效率。核苷酸序列的优化还可减低干扰翻译的二级mRNA结构，从而提高翻译效率。
在本发明的一个实施方案中，核酸可包含编码本发明CAR的抗原结合结构域的经密码子修饰的核苷酸序列。在本发明的另一个实施方案中，核酸可包含编码本文中所述的任何DuoCAR(包括其功能性部分和功能性变体)的经密码子修饰的核苷酸序列。
本文中使用的“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常意指DNA或RNA的聚合物，其可以是单链或双链的，合成的或从天然来源获得(例如，分离和/或纯化)的，其可包含天然、非天然或改变的核苷酸，并且其可包含天然、非天然或改变的核苷酸间连接，例如氨基磷酸酯连接或硫代磷酸酯连接，而不是存在于未经修饰的寡核苷酸的核苷酸之间的磷酸二酯。在一些实施方案中，核酸不包含任何插入、缺失、倒位和/或替换。然而，如本文中所讨论的，在一些情况下，核酸包含一个或更多个插入、缺失、倒位和/或替换可以是合适的。
重组核酸可以是具有非天然存在的序列或具有通过序列的两个在其他情况下分开的区段的人工组合制备的序列的核酸。这种人工组合通常通过化学合成，或者更常见地通过分离的核酸区段的人工操作，例如通过基因工程技术(例如Sambrook等(同上)中描述的那些)来完成。可使用本领域中已知的方法基于化学合成和/或酶促连接反应来构建核酸。参见例如Sambrook等(同上)和Ausubel等(同上)。例如，可使用天然存在的核苷酸或多种经修饰核苷酸来化学合成核酸，所述经修饰核苷酸被设计成提高分子的生物学稳定性或提高杂交后形成的双链体的物理稳定性(例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)。可用于产生核酸的经修饰核苷酸的一些实例包括但不限于：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-取代腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。或者，本发明的一种或更多种核酸可从公司(例如Integrated DNA Technologies(Coralville，IA，USA))购买。
核酸可包含编码任何DuoCAR或其功能性部分或功能性变体的任何分离的或纯化的核苷酸序列。或者，核苷酸序列可包含简并至任何序列或简并序列之组合的核苷酸序列。
一个实施方案还提供了分离的或纯化的核酸，所述核酸包含与本文中所述的任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列或在严格条件下与本文中所述的任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
在严格条件下杂交的核苷酸序列可在高严格条件下杂交。“高严格条件”意指核苷酸序列以比非特异性杂交可检测地更强的量与靶序列(本文中所述的任何核酸的核苷酸序列)特异性杂交。高严格条件包括将具有精确互补序列的多核苷酸或仅包含少数分散的错配的多核苷酸与碰巧具有少数与核苷酸序列匹配的小区域(例如，3至10个碱基)的随机序列区分开的条件。这样的互补小区域比14至17个或更多个碱基的全长互补序列更容易解链，并且高度严格杂交使得它们可易于区分。相对高的严格条件包括例如低盐和/或高温条件，例如通过在约50℃至70℃的温度下由约0.02M至0.1M NaCl或等同物来提供。这样的高严格条件容许核苷酸序列与模板或靶链之间小的(如果有的话)错配，并且特别适合于检测任何本发明DuoCAR的表达。通常认识到，通过添加提高量的甲酰胺可使条件变得更加严格。
还提供了包含与本文中所述的任何核酸具有至少约70％或更多，例如约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的核苷酸序列的核酸。
在一个实施方案中，可将核酸并入到重组表达载体中。在这一点上，一个实施方案提供了包含任何核酸的重组表达载体。为了本文中的目的，术语“重组表达载体”意指经遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，当构建体包含编码mRNA、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列并且在足以使mRNA、蛋白质、多肽或肽在细胞内表达的条件下使载体与细胞接触时，其允许宿主细胞表达mRNA、蛋白质、多肽或肽。载体作为整体不是天然存在的。
但是，载体的部分可以是天然存在的。重组表达载体可包含任何类型的核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，其可以是单链或双链的，合成的或部分地从天然来源获得的，并且其可包含天然、非天然的或改变的核苷酸。重组表达载体可包含天然存在或非天然存在的核苷酸间连接或这两种类型的连接。优选地，非天然存在或改变的核苷酸或核苷酸间连接不阻碍载体的转录或复制。
在一个实施方案中，重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可用于转化或转染任何合适的宿主细胞。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或用于这二者的载体，例如质粒和病毒。载体可选自pUC系列(Fermentas Life Sciences，GlenBurnie，MD)、pBluescript系列(Stratagene，LaJolla，CA)、pET系列(Novagen，Madison，WI)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)和pEX系列(Clontech，Palo Alto，CA)。
也可使用噬菌体载体，例如
Figure BPA0000324003010000571
λZapII(Stratagene)、EMBL4和λNMI149。植物表达载体的一些实例包括pBIOl、pBI101.2、pBHOl.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的一些实例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。重组表达载体可以是病毒载体，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体。慢病毒载体是来源于慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括自我失活性慢病毒载体，如Milone等，Mol.Ther.17(8)：1453-1464(2009)中提供的。可用于临床的慢病毒载体的另一些实例包括例如但不限于来自Oxford BioMedica plc的LENTIVECTOR.RTM.基因递送技术，来自Lentigen的LENTIMAX.TM.载体系统等。慢病毒载体的非临床类型也是可用的并且是本领域技术人员已知的。
许多转染技术通常是本领域中已知的(参见例如Graham等，Virology，52：456-467(1973)；Sambrook等，同上；Davis等，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier(1986)；以及Chu等，Gene，13：97(1981)。
转染方法包括磷酸钙共沉淀(参见例如Graham等，同上)、直接微量注射到培养的细胞中(参见例如Capecchi，Cell，22：479-488(1980))、电穿孔(参见例如Shigekawa等，BioTechniques，6：742-751(1988))、脂质体介导的基因转移(参见例如Mannino等，BioTechniques，6：682-690(1988))、脂质介导的转导(参见例如Feigner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：7413-7417(1987))和使用高速微弹(microprojectile)的核酸递送(参见例如Klein等，Nature，327：70-73(1987))。
在一个实施方案中，可使用以下中描述的标准重组DNA技术来制备重组表达载体：例如，Sambrook等，同上，以及Ausubel等，同上。可制备环状或线性的表达载体构建体，以包含在原核或真核宿主细胞中有功能的复制系统。复制系统可来自例如ColEl、2μ质粒、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等。
重组表达载体可包含调节序列，例如转录和翻译起始和终止密码子，其对于将酌情引入载体的宿主细胞(例如，细菌、真菌、植物或动物)的类型是特异性的，并考虑载体是基于DNA还是RNA。重组表达载体可包含限制性位点以促进克隆。
重组表达载体可包括一个或更多个标记基因，其允许选择经转化或转染的宿主细胞。标记基因包含杀生物剂抗性，例如对抗生素、重金属等的抗性，在营养缺陷型宿主中互补以提供原养型等。用于本发明表达载体的合适标记基因包括例如新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。
重组表达载体可包含天然或非天然启动子，所述启动子与编码CAR的核苷酸序列(包括其功能性部分和功能性变体)或与和编码CAR的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列可操作地连接。启动子(例如，强、弱、诱导型、组织特异性和发育特异性)的选择在技术人员的普通技术范围内。类似地，核苷酸序列与启动子的组合也在技术人员的技术范围内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子或在鼠干细胞病毒的长末端重复中发现的启动子。
重组表达载体可设计成用于瞬时表达、用于稳定表达或用于这二者。此外，可使重组表达载体用于组成型表达或用于诱导型表达。
此外，可使重组表达载体包含自杀基因。本文中使用的术语“自杀基因”是指导致表达自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以是赋予表达基因的细胞对试剂(例如，药物)的敏感性，并且当细胞接触或暴露于试剂时造成细胞死亡的基因。自杀基因是本领域中已知的(参见例如，Suicide Gene Therapy：Methods and Reviews，Springer，Caroline J.(Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics，Institute of CancerResearch，Sutton，Surrey，UK)，HumanaPress，2004)，并且包括例如单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基还原酶。
一个实施方案还提供了包含本文中所述的任何重组表达载体的宿主细胞。本文中使用的术语“宿主细胞”是指可包含本发明重组表达载体的任何类型的细胞。宿主细胞可以是真核细胞，例如植物、动物、真菌或藻类，或者可以是原核细胞，例如细菌或原生动物。宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞(即从生物体(例如人)直接分离的)。宿主细胞可以是贴壁细胞或悬浮细胞(即悬浮生长的细胞)。合适的宿主细胞是本领域中已知的，并且包括例如DH5α大肠杆菌(E.coli)细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞等。出于扩增或复制重组表达载体的目的，宿主细胞可以是原核细胞，例如DH5α细胞。出于产生重组CAR的目的，宿主细胞可以是哺乳动物细胞。宿主细胞可以是人细胞。尽管宿主细胞可以是任何细胞类型，可来源于任何类型的组织，并且可处于任何发育阶段，但宿主细胞可以是外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte，PBL)或外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。宿主细胞可以是T细胞。
出于本文中的目的，T细胞可以是任何T细胞，例如培养的T细胞，例如原代T细胞，或来自培养的T细胞系(例如Jurkat、SupTl等)的T细胞，或获自哺乳动物的T细胞。如果获自哺乳动物，则T细胞可获自多种来源，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其他组织或流体。T细胞也可以是富集或纯化的。T细胞可以是人T细胞。T细胞可以是从人分离的T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞，并且可处于任何发育阶段，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助性T细胞(例如Thi和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如，细胞毒T细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、初始T细胞等。T细胞可以是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
在一个实施方案中，本文中所述的DuoCAR可用于合适的非T细胞。这样的细胞是具有免疫效应功能的那些，例如如NK细胞和由多能干细胞产生的T样细胞。
一个实施方案还提供了包含本文中所述的至少一种宿主细胞的细胞群。细胞群可以是异质群，其包含含有所述的任何重组表达载体的宿主细胞，此外还包含至少一种不含任何重组表达载体的其他细胞(例如宿主细胞(例如T细胞))，或者T细胞以外的细胞，例如B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌细胞、脑细胞等。或者，细胞群可以是基本上同质群，其中群主要包含(例如，基本上由其组成))含有重组表达载体的宿主细胞。群也可以是细胞的克隆群，其中群的所有细胞都是包含重组表达载体的单宿主细胞的克隆，使得群的所有细胞都包含重组表达载体。在本发明的一个实施方案中，细胞群是包含含有本文中所述的重组表达载体的宿主细胞的克隆群。
可分离和/或纯化DuoCAR(包括其功能性部分和变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞(包括其群)和抗体(包括其抗原结合部分)。例如，纯化的(或分离的)宿主细胞制备物是其中宿主细胞比体内天然环境中细胞的纯度更高的制备物。这样的宿主细胞可例如通过标准纯化技术来生产。在一些实施方案中，纯化宿主细胞的制备物，使得宿主细胞占制备物的总细胞含量的至少约50％，例如至少约70％。例如，纯度可以是至少约50％，可以是大于约60％、约70％或约80％，或者可以是约100％。
E.治疗方法
预期用于患者特异性自体抗肿瘤淋巴细胞群的DuoCAR可用于在哺乳动物中治疗或预防疾病的方法。在这点上，一个实施方案提供了在哺乳动物中治疗或预防癌症的方法，其包括向哺乳动物施用在哺乳动物中有效治疗或预防癌症之量的DuoCAR、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群、抗体和/或其抗原结合部分和/或药物组合物。上文已经公开了使用上述DuoCAR的另一些方法。
一个实施方案还包括在施用本文中公开的DuoCAR之前对哺乳动物进行淋巴细胞清除(lymphodepleting)。淋巴细胞清除的一些实例包括但不限于非清髓性淋巴细胞清除化学治疗、清髓性淋巴细胞清除化学治疗、全身辐照等。
对于其中施用宿主细胞或细胞群的方法，细胞可以是哺乳动物同种异体或自体的细胞。优选地，细胞是哺乳动物自体的。本文中使用的同种异体意指来源于与引入材料的个体相同物种的不同动物的任何材料。当一个或更多个基因座的基因不同时，两个或更多个个体被认为彼此是同种异体的。在一些方面中，来自相同物种的个体的同种异体材料可以是基因上足够不同以抗原性地相互作用。本文中使用的“自体”意指来自随后重新引入材料的个体的同一个体的任何材料。
本文中提及的哺乳动物可以是任何哺乳动物。本文中使用的术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目的哺乳动物，例如小鼠和仓鼠，以及兔形目(Logomorpha)的哺乳动物，例如兔。哺乳动物可来自食肉目(Carnivora)，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。哺乳动物可来自偶蹄目(order Artiodactyla)，包括牛科(牛)和猪科(猪)，或者奇蹄目(order Perssodactyla)，包括马科(马)。哺乳动物可以是灵长目、Ceboid或Simoid(猴)，或者类人猿目(orderAnthropoids)(人和猿)。优选地，哺乳动物是人。
对于所述方法，癌症可以是任何癌症，包括以下中的任一种：急性淋巴细胞癌、急性髓性白血病、肺泡横纹肌肉瘤、膀胱癌症(例如膀胱癌)、骨癌、脑癌(例如髓母细胞瘤)、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓样癌、结肠癌、食管癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠的类癌肿瘤、头颈癌(例如，头颈鳞状细胞癌)、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病、液体肿瘤、肝癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌和肺腺癌)、淋巴瘤、间皮瘤、肥大细胞瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、B慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)和伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、滑膜肉瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌和输尿管癌。
本文中使用的术语“治疗”和“预防”以及从其来源的词语不必需意味着100％或完全治疗或预防。相反，存在不同程度的治疗或预防，本领域普通技术人员认为其具有潜在的益处或治疗效果即可。在这一点上，该方法可提供对哺乳动物中癌症的任何量或任何水平的治疗或预防。
此外，由该方法提供的治疗或预防可包括治疗或预防所治疗或预防的疾病(例如，癌症)的一种或更多种病症或症状。而且，为了本文中的目的，“预防”可涵盖延迟疾病或其症状或病症的发作。
另一个实施方案提供了在哺乳动物中检测癌症之存在的方法，其包括：(a)使来自哺乳动物的包含一个或更多个细胞的样品与DuoCAR、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群、抗体和/或其抗原结合部分或药物组合物接触，从而形成复合物，(b)以及检测该复合物，其中复合物的检出指示哺乳动物中癌症的存在。
样品可通过任何合适的方法(例如活检或尸检)获得。活检是从个体中取出组织和/或细胞。这样的取出可以是从个体收集组织和/或细胞，以便在取出的组织和/或细胞上进行实验。该实验可包括确定个体是否具有和/或患有某病症或疾病状态的实验。病症或疾病可以是例如癌症。
关于在乳动物中检测哺增殖性病症(例如癌症)之存在的方法的一个实施方案，包含哺乳动物细胞的样品可以是包含全细胞、其裂解物或全细胞裂解物级分(例如，核或胞质级分、全蛋白质级分或核酸级分)的样品。如果样品包含全细胞，则细胞可以是哺乳动物的任何细胞，例如任何器官或组织的细胞，包括血细胞或内皮细胞。
接触可相对于哺乳动物在体外或体内发生。优选地，接触是体外的。
此外，复合物的检测可通过本领域中已知的许多方式进行。例如，可用可检测标记(例如如上文公开的放射性同位素、荧光团(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)))、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)和元素颗粒(例如，金颗粒))来标记本文中公开的DuoCAR、本文中所述的多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群或抗体或其抗原结合部分。
测试CAR识别靶细胞的能力和抗原特异性的方法是本领域中已知的。例如，Clay等，J.Immunol，163：507-513(1999)教导了测量细胞因子(例如，干扰素-γ、粒细胞/单核细胞集落刺激因子(granulocyte/monocyte colony stimulating factor，GM-CSF)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)或白介素2(interleukin 2，IL-2))释放的方法。此外，可通过测量细胞的细胞毒性来评价CAR功能，如Zhao等，J.Immunol.174：4415-4423(2005)中所述。
另一个实施方案提供了本发明的DuoCAR、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群、抗体或其抗原结合部分和/或药物组合物用于在哺乳动物中治疗或预防增殖性病症(例如癌症)的用途。癌症可以是本文中所述的任何癌症。
任何施用方法都可用于所公开的治疗剂，包括局部施用和全身施用。例如，可使用表面、经口、血管内(例如静脉内)、肌内、腹膜内、鼻内、皮内、鞘内和皮下施用。具体施用方式和剂量方案将由主治临床医师考虑病例的详情(例如，对象、疾病、涉及的疾病状态以及治疗是否是预防性的)来选择。在施用多于一种试剂或组合物的情况下，可使用一种或更多种施用途径；例如，化学治疗剂可经口施用，并且抗体或抗原结合片段或缀合物或组合物可静脉内施用。施用方法包括注射，其中CAR、CAR T细胞、缀合物、抗体、抗原结合片段或组合物提供在无毒可药用载体(例如水、盐水、林格液、葡萄糖溶液、5％人血清白蛋白、固定油、油酸乙酯或脂质体)中。在一些实施方案中，可使用所公开化合物的局部施用，例如通过将抗体或抗原结合片段施用于除去肿瘤的组织区域或怀疑易于发生肿瘤的区域。在一些实施方案中，包含治疗有效量的抗体或抗原结合片段的药物制剂的持续肿瘤内(或肿瘤旁)释放可以是有益的。在另一些实例中，将缀合物作为滴眼剂表面施用于角膜，或玻璃体内施用到眼中。
所公开的治疗剂可配制成适合精确剂量的单独施用的单位剂型。另外，所公开的治疗剂可以以单剂量或多剂量方案施用。多剂量方案是其中主要治疗过程可具有多于一个分开的剂量(例如1至10个剂量)，然后根据需要以随后的时间间隔给予其他剂量以维持或加强组合物的作用的方案。治疗可涉及在几天到几个月甚至几年的时期中化合物的每日剂量或多个每日剂量。因此，剂量方案还将至少部分地基于待治疗的对象的特定需求来确定，并将取决于施用操作者的判断。
抗体或缀合物的典型剂量可以是约0.01至约30mg/kg，例如约0.1至约10mg/kg。
在一些具体的实例中，以多个每日给药方案(例如至少两个连续日，10个连续日等，例如持续数周、数月或数年的时间)，向对象施用包含缀合物、抗体、组合物、DuoCAR、CART细胞或另外的试剂中的一种或更多种的治疗组合物。在一个实例中，向对象施用缀合物、抗体、组合物或另外的试剂至少30天，例如至少2个月、至少4个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月或至少36个月的时间。
在一些实施方案中，所公开的方法包括与所公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、CAR或表达CAR的T细胞组合，向对象提供手术、放射治疗和/或化学治疗剂(例如，先后地、基本上同时或同时)。这样的试剂和治疗的方法和治疗剂量是本领域技术人员已知的，并且可由熟练的临床医生确定。另外的试剂的制备和给药方案可根据制造商的说明书使用或由熟练的从业人员根据经验确定。这样的化学治疗的制备和给药方案也描述在ChemotherapyService，(1992)Ed.，M.C.Perry，Williams&Wilkins，Baltimore，Md中。
在一些实施方案中，组合治疗可包括向对象施用治疗有效量的另外的癌症抑制剂。可与组合治疗一起使用的另一些治疗剂的一些非限制性实例包括微管结合剂、DNA嵌入剂或交联剂、DNA合成抑制剂、DNA和RNA转录抑制剂、抗体、酶、酶抑制剂、基因调节剂和血管生成抑制剂。这些试剂(以治疗有效量施用)和治疗可单独或组合使用。例如，可将任何合适的抗癌剂或抗血管生成剂与本文中公开的CAR、CAR-T细胞、抗体、抗原结合片段或缀合物组合施用。这样的试剂的方法和治疗剂量是本领域技术人员已知的，并且可由熟练的临床医生确定。
用于组合免疫治疗的另外的化学治疗剂包括但不限于烷化剂，例如氮芥类(例如，苯丁酸氮芥、二氯乙基甲胺(chlormethine)、环磷酰胺、异环磷酰胺和美法仑)、亚硝基脲类(例如，卡莫司汀、福莫司汀、洛莫司汀和链脲霉素)、铂化合物(例如，卡铂、顺铂、奥沙利铂和BBR3464)、白消安、达卡巴嗪、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、丙卡巴肼、替莫唑胺、噻替派和乌拉莫司汀(uramustine)；抗代谢物类，例如叶酸类(例如，甲氨喋呤、培美曲塞和雷替曲塞)、嘌呤类(例如，克拉屈滨、氯法拉滨、氟达拉滨、巯嘌呤和硫鸟嘌呤)、嘧啶类(例如，卡培他滨)、阿糖胞苷、氟尿嘧啶和吉西他滨；植物生物碱，例如鬼臼类(例如，依托泊苷和替尼泊苷)、紫杉烷类(例如，多西他赛和紫杉醇)、长春花类(例如，长春花碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨)；细胞毒性/抗肿瘤抗生素，例如蒽环类家族成员(例如，柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌和戊柔比星)、博来霉素、利福平、羟基脲和丝裂霉素；拓扑异构酶抑制剂，例如拓扑替康和伊立替康；单克隆抗体，例如阿仑单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗和曲妥珠单抗；光敏剂，例如氨基乙酰丙酸、氨基乙酰丙酸甲酯、卟吩姆钠(porffumer sodium)和维替泊芬；以及另一些试剂，例如阿利维A酸、六甲蜜胺、安丫啶、阿那格雷、三氧化二砷、天冬酰胺酶、阿西替尼、贝沙罗汀、贝伐单抗、硼替佐米、塞来昔布、地尼白介素(denileukin difiitox)、厄罗替尼、雌莫司汀、吉非替尼、羟基脲、伊马替尼、拉帕替尼、帕唑帕尼、喷司他丁、马索罗酚(masoprocol)、米托坦、培门冬酶(pegaspargase)、他莫昔芬、索拉非尼、舒尼替尼、威罗菲尼(vemurafinib)、凡德他尼和维甲酸。这样的药剂的选择和治疗剂量是本领域技术人员已知的，并且可由熟练的临床医师确定。
在本发明的某些实施方案中，将使用本文中所述的方法或本领域中已知的其他方法来活化和扩增(其中T细胞扩增至治疗水平)的细胞连同任何数量的相关治疗方式一起(例如，在其之前、同时或之后)施用于患者，所述相关治疗方式包括但不限于利用药剂的治疗，例如抗病毒治疗，西多福韦和白介素-2、用于MS患者的阿糖胞苷(也称为ARA-C)或那他珠单抗治疗，或用于银屑病患者的依法珠单抗治疗，或用于PML患者的其他治疗。在另一些实施方案中，本发明的T细胞可与以下组合使用：化学治疗、放射、免疫抑制剂(例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、抗体或其他免疫清除剂(例如CAM PATH、抗CD3抗体或其他抗体治疗)、细胞毒素、氟达拉宾、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐照。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等，Cell 66：807-815，1991；Henderson等，Immun 73：316-321，1991；Bierer等，Curr.Opin.Immun 5：763-773，1993)。在另一个实施方案中，将本发明的细胞组合物连同以下一起(例如，在其之前、同时或之后)施用于患者：骨髓移植、使用化学治疗剂(例如氟达拉滨)的T细胞清除治疗、外束放射治疗(external-beam radiation therapy，XRT)、环磷酰胺、或抗体(例如OKT3或CAMPATH)。在另一个实施方案中，在B细胞清除治疗(例如与CD20反应的药剂(例如美罗华(Rituxan)))之后施用本发明的细胞组合物。例如，在一个实施方案中，对象可进行用高剂量化学治疗的标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些实施方案中，在移植之后，对象接受本发明的扩增的免疫细胞的输注。在一个另外的实施方案中，在手术之前或之后施用扩增的细胞。
待施用至患者的上述治疗的剂量将根据所治疗的病症和治疗的接受者的确切性质而变化。可根据本领域接受的实践进行用于人施用的计量的缩放。例如，对于成年患者，CAMPATH的剂量将通常为1至约100mg，通常每天施用，持续1至30天的时间。优选的每日剂量为每天1至10mg，但是在一些情况下可使用每天多至40mg的较大剂量。
组合治疗可提供协同作用并证明是协同的，即当活性成分一起使用时实现的效果大于单独使用化合物所产生的效果的总和。当活性成分如下时可获得协同作用：(1)在组合的单位剂型中共配制并同时施用或递送；(2)作为独立制剂交替或平行递送；或(3)通过一些其他方案。当交替递送时，例如当通过在分开的注射器中的不同注射先后施用或递送化合物时可获得协同作用。一般来说，在交替期间，先后(即，依次)施用每种活性成分的有效剂量，而在组合治疗中，两种或更多种活性成分的有效剂量一起施用。
在一个实施方案中，在抗癌治疗之后将有效量的与本文中公开的一种或更多种抗原特异性结合的抗体或抗原结合片段或其缀合物施用于患有肿瘤的对象。在已经流逝了足够量的时间以允许所施用的抗体或抗原结合片段或缀合物与各癌细胞上表达的抗原形成免疫复合物之后，检测免疫复合物。免疫复合物的存在(或不存在)指示治疗的有效性。例如，与在治疗之前取得的对照相比免疫复合物的提高指示治疗是无效的，而与在治疗之前取得的对照相比免疫复合物的降低指示治疗是有效的。
F.生物药物组合物
本文中提供了用于基因治疗、免疫治疗、过继免疫治疗和/或细胞治疗的生物药物或生物制品组合物(在下文中称为“组合物”)，所述组合物包含在载体(例如可药用载体)中的所公开的DuoCAR、或表达CAR的T细胞、抗体、抗原结合片段、缀合物、DuoCAR或表达与本文中公开的一种或更多种抗原特异性结合的CAR的T细胞中的一种或更多种。该组合物可制备成单位剂型用于向对象施用。施用的量和时间由治疗临床医师决定，以达到期望的结局。组合物可配制用于全身(例如静脉内)或局部(例如肿瘤内)施用。在一个实例中，公开的DuoCAR、或表达CAR的T细胞、抗体、抗原结合片段、缀合物配制成用于肠胃外施用，例如静脉内施用。包含如本文中公开的CAR、或表达CAR的T细胞、缀合物、抗体或抗原结合片段的组合物用于例如治疗和检测肿瘤，例如但不限于神经母细胞瘤。在一些实例中，组合物可用于治疗或检测癌。包含如本文中公开的CAR、或表达CAR的T细胞、缀合物、抗体或抗原结合片段的组合物还用于例如检测病理性血管生成。
用于施用的组合物可包含溶解在可药用载体(例如水性载体)中的CAR、或表达CAR的T细胞、缀合物、抗体或抗原结合片段的溶液。可使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的，并且通常不含不期望的物质。这些组合物可通过常规、公知的灭菌技术灭菌。所述组合物可根据需要包含可药用辅助物质以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂、辅助剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。在这些制剂中，CAR、或表达CAR的T细胞、抗体或抗原结合片段或缀合物的浓度可广泛地变化，并将主要根据所选择的具体施用方式和对象的需要基于流体体积、黏度、体重等来进行选择。制备用于基因治疗、免疫治疗和/或细胞治疗的这样的剂型的实际方法对于本领域技术人员来说是已知的或将是明显的。
用于静脉内施用的典型组合物包含每个对象每天约0.01至约30mg/kg抗体或抗原结合片段或缀合物(或相应剂量的CAR、或表达CAR的T细胞、包含抗体或抗原结合片段的缀合物)。制备可施用的组合物的实际方法对于本领域技术人员来说将是已知的或明显的，并且在如Remington’s Pharmaceutical Science，第19版，Mack Publishing Company，Easton，PA(1995)的出版物中更详细地描述。
CAR、或表达CAR的T细胞、抗体、抗原结合片段或缀合物可以以经冻干的形式提供，并且在施用之前用无菌水再水化，但是其也可以以已知浓度的无菌溶液提供。然后将DuoCAR、或表达CAR的T细胞、抗体或抗原结合片段或缀合物的溶液添加至输注袋，所述输注袋包含0.9％氯化钠(USP)，并且在一些情况下以0.5至15mg/kg体重的剂量施用。本领域中在施用抗体或抗原结合片段或缀合物药物中有相当多的经验可获得；例如，自1997年批准
Figure BPA0000324003010000671
以来，抗体药物已经在美国上市。CAR、或表达CAR的T细胞、抗体、其抗原结合片段或缀合物可通过缓慢输注而不是通过静脉内推送(push)或推注(bolus)来施用。在一个实例中，施用较高负荷剂量，随后将施用剂量维持在较低水平。例如，4mg/kg抗体或抗原结合片段(或相应剂量的包含抗体或抗原结合片段的缀合物)的初始负载剂量可在约90分钟的时间内输注，然后如果先前的剂量良好耐受，则每周2mg/kg的维持剂量在约30分钟的时间内输注，持续4至8周。
控释胃肠外制剂可制备为植入物、油性注射剂或微粒体系。对于蛋白质递送系统的广泛概述，参见，Banga，A.J.，Therapeutic Peptides and Proteins：Formulation，Processing，and Delivery Systems，Technomic Publishing Company，Inc.，Lancaster，PA，(1995)。微粒体系包括微球、微粒、微囊、纳米囊、纳米球和纳米粒。微囊包含治疗性蛋白质(例如细胞毒素或药物)作为核心。在微球中，治疗剂分散在整个颗粒中。小于约1μm的颗粒、微球和微囊通常分别被称为纳米粒、纳米球和纳米囊。毛细血管具有约5μm的直径，所以仅纳米粒是静脉内施用的。微粒的直径通常为约100μm，并且皮下或肌内施用。参见例如Kreuter，J.，Colloidal Drug Delivery Systems，J.Kreuter，编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，NY，第219至342页(1994)；和Tice&Tabibi，Treatise on Controlled DrugDelivery，A.Kydonieus，编辑，Marcel Dekker，Inc.New York，NY，第315至339页，(1992)。
聚合物可用于本文中公开的DuoCAR、或表达CAR的T细胞、抗体或抗原结合片段或缀合物组合物的离子受控的释放。用于受控的药物递送的多种可降解和不可降解的聚合物基质是本领域中已知的(Langer，Accounts Chem.Res.26：537-542，1993)。例如，嵌段共聚物泊洛沙姆407在低温下作为黏性流动液体存在，但在体温下形成半固体凝胶。已经显示其是配制和持续递送重组白介素-2和脲酶的有效载剂(Johnston等，Pharm.Res.9：425-434，1992；和Pec等，J.Parent.Sci.Tech.44(2)：58-65，1990)。或者，羟基磷灰石已被用作蛋白质受控释放的微载体(Ijntema等，Int.J.Pharm.112：215-224，1994)。在另一方面中，脂质体用于脂质封装之药物的受控释放以及药物靶向(Betageri等，Liposome Drug DeliverySystems，Technomic Publishing Co.，Inc.，Lancaster，PA(1993))。用于治疗性蛋白质的受控递送的许多另外的系统是已知的(参见美国专利No.5,055,303、美国专利No.5,188,837、美国专利No.4,235,871、美国专利No.4,501,728、美国专利No.4,837,028、美国专利No.4,957,735、美国专利No.5,019,369、美国专利No.5,055,303、美国专利No.5,514,670、美国专利No.5,413,797、美国专利No.5,268,164、美国专利No.5,004,697、美国专利No.4,902,505、美国专利No.5,506,206、美国专利No.5,271,961、美国专利No.5,254,342和美国专利No.5,534,496)。
G药盒
在一个方面中，还提供了使用本文中公开的DuoCAR的药盒。例如，用于在对象中治疗肿瘤或制备表达本文中公开的一种或更多种DuoCAR的CAR T细胞的药盒。药盒通常将包含如本文中公开的公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、核酸分子、CAR或表达CAR的T细胞。可在药盒中包含所公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、核酸分子、DuoCAR或表达CAR的T细胞中的多于一种。
药盒可包含容器和在容器上或与容器缔合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由多种材料(例如玻璃或塑料)形成。容器通常容纳包含所公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、核酸分子、DuoCAR或表达CAR的T细胞中的一种或更多种的组合物。在数个实施方案中，容器可具有无菌入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或小瓶，其具有可被皮下注射针头刺穿的塞)。标签或包装插页指示组合物用于治疗特定病症。
标签或包装插页通常将还包含例如在治疗或预防肿瘤或制备CAR T细胞的方法中使用所公开的抗体、抗原结合片段、缀合物、核酸分子、DuoCAR或表达CAR的T细胞的说明书。包装插页通常包含习惯上包含在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于使用这样的治疗产品的适应证、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。指导材料可以是以电子形式(例如计算机软盘或光盘)书写的，或者可以是可视的(例如视频文件)。药盒还可包含附加组分以有利于为其设计药盒的特定应用。因此，例如，药盒可另外地包含检测标记的手段(例如酶标记的酶底物、检测荧光标记的滤波装置、合适的次级标记(例如二抗)等)。药盒可另外包含常规用于实践特定方法的缓冲剂和其他试剂。这样的药盒和合适的内容物是本领域技术人员公知的。
实施例
通过下文附图和第17至27页(包括上文)的公开内容中描述的DuoCAR的实例进一步举例说明了本发明，这些实例不应以任何方式解释为对其范围加以限制。相反，应清楚地理解，在不脱离本发明的精神和/或所附权利要求书的范围的情况下，可采取多种其他实施方案、修改及其等同物，在阅读了本文中的描述之后，所述其他实施方案、修改及其等同物本身已经向本领域技术人员提示。
虽然已经结合上文概述的示例性实施方式描述了多种细节，但是在查看了前述公开内容之后，多种替代、修改、变化、改进和/或实质性等同物可变得明显，无论其是已知的或者还是或可能是目前不可预见的。
本文中引用的每个申请和专利，以及每个申请和专利中引用的每个文件或参考文献(包括在每个已授权的专利的审查期间；“申请引用文件”)，以及对应于这些申请和专利中任一个和/或要求这些申请和专利中任一个的优先权的每个PCT和外国申请或专利，以及在每个申请引用文件中引用或参考的每个文件，都在此通过引用明确地并入本文，并且可用于本发明的实践中。更一般地，本文中引用了文件或参考文献，不管是在权利要求书之前的参考列表中还是在正文本身；并且，这些文件或参考文献(“本文引用参考文献”)中的每一个，以及每个本文引用参考文献中引用的每个文件或参考文献(包括任何制造商的说明书、说明等)，都在此通过引用明确地并入本文。
一些具体实施方案的前述说明提供了足够的信息，使得其他人通过应用当前知识可容易地修改或改编多种应用(例如具体实施方案)而不脱离一般概念，并且因此，这样的改编和修改应当并且旨在在所公开的实施方案的等同物的含义和范围内理解。应理解，本文中使用的措辞或术语是出于描述而非限制的目的。在附图和说明书中，已经公开了示例性实施方案，并且尽管可能已经采用了特定术语，但是除非另有说明，否则它们仅以一般性和描述性含义使用并且不用于限制目的，因此权利要求书的范围不限于此。此外，本领域技术人员将理解，本文中讨论的方法的某些步骤可以以替代顺序排序，或者可以将步骤进行组合。因此，所附权利要求书旨在不受限于本文中公开的具体实施方案。本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规的实验确定本文中描述的本发明实施方案的许多等同物。这样的等同物涵盖在以下权利要求书中。
实施例描述
提供了五个实施例，其中在LV转导的人T细胞群的表面上三个功能性结合结构域的表达以及不同共刺激胞内结构域的组合证明了Duo组技术的可行性(实施例1)，并且该群针对三种不同的白血病抗原的功能性活性证明了其有效性(实施例2)。实施例3中描述了共转染(即用编码两种DuoCAR链的单一LV产物(通过用两种CAR编码质粒共转染包装系产生)转导)产生的DuoCAR的表达和功能的比较。在实施例4中，比较了用通过共转染方法产生的LV转导的DuoCAR以及通过单一构建体编码的双顺反子DuoCAR(其中两条DuoCAR链被核糖体跳读位点分开)的转导效率和功能。
该技术所基于的且可作为Duo组组分包含在DuoCAR中的单特异性CAR的一些实例包括单CD20靶向载体LTG1495，其为核苷酸序列SEQ ID NO：3和氨基酸序列SEQ ID NO：4。第二个实例是对CD22具有特异性的单特异性CAR LTG2200，其为核苷酸序列SEQ ID NO：9和氨基酸序列SEQ ID NO：10。在产生DuoCAR中的一个重要分子方面是包含非冗余的相容序列，并且在经转导的T细胞中评价那些序列，使得没有不利的重组或胞内缔合发生。这在载体的生产细胞系中或在靶细胞群中均可发生。出于这个原因，包含已知在DuoCAR环境中相容的变体CAR结构。这些包括分别在核苷酸序列SEQ ID：29和氨基酸序列SEQ ID：30中描述的CD19特异性CAR LTG1494。该序列包含连接scFv的重链和轻链的良好描述的接头，称为Whitlow接头(氨基酸序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO：107)，参见Whitlow M.，等，1993，Protein Eng.6：989-995)。在一些情况下，Whitlow接头被替换为(GGGGS)n接头，例如以CD19 CAR形式，如在LTG1538(其分别为核苷酸序列SEQ ID NO：31和氨基酸序列SEQ IDNO：32)中。在另一个实例中，产生具有替代的跨膜结构域的CAR。抗CD19CAR LTG1562(其分别为核苷酸序列SEQ ID NO：21和氨基酸序列SEQ ID NO：22)利用CD4(与CD8相反)跨膜结构域。类似地，抗CD19 CAR LTG1563(其分别为核苷酸序列SEQ ID NO：49和氨基酸序列SEQ IDNO：50)具有来源于TNFRSF19的替代的跨膜结构域。DuoCAR还可靶向实体瘤，例如表达间皮素肿瘤抗原的那些。例如，如在2017年1月9日提交的并且转让给Lentigen Technology，Inc.(事件编号LEN_017)的标题为“Compositions and Methods for Treating Cancerwith Anti-Mesothelin Immunotherapy”的申请人的共同未决临时专利申请No.62/444,201中所公开的，已经产生了间皮素的scFV结合物，其分别为核苷酸序列SEQ ID NO：37和氨基酸序列SEQ ID NO：38，其可并入功能性CAR(其分别为核苷酸序列SEQ ID NO：39和氨基酸序列SEQ ID NO：40)中，并因此可并入DuoCAR治疗中。除scFv序列之外，单链抗原结合物(与scFv相反)可并入DuoCAR应用中。例如，如在2017年3月24日提交的并且转让给LentigenTechnology，Inc.(事件编号LEN_018)的标题为“Compositions and Methods ForTreating Cancer With Anti-CD33Immunotherapy”的申请人的共同未决临时专利申请No.62/476,438中所公开的CD33特异性仅重链结合物(其分别为核苷酸序列SEQ ID NO：41和氨基酸序列SEQ ID NO：42)可并入靶向表达CD33的恶性肿瘤的功能性CAR LTG1906(其分别为核苷酸序列SEQ ID NO：43和氨基酸序列SEQ ID NO：44)中。DuoCAR治疗应用的一个实例是治疗表达CD19、CD20和TSLPR抗原的白血病。在这种情况下，LTG1496或LTG1497(分别为SEQ ID NO：35、26)可与TSLPR特异性CAR(LTG1789)(其分别为SEQ ID NO：47和氨基酸序列SEQ ID NO：48)组合，后者已经从TSLPR特异性scFV结构域(其为核苷酸序列SEQ ID NO：45和氨基酸序列SEQ ID NO：46)产生。
DuoCAR治疗应用的另一个实例是治疗表达CD38抗原的癌症。例如，如在2018年11月30日提交的并且转让给Lentigen Technology，Inc.(事件编号LEN_026)的标题为“Compositions and Methods For Treating Cancer With Anti-CD38Immunotherapy”的申请人的共同未决临时专利申请No.62/773,940中所公开的CD38特异性结合物可并入靶向表达CD38的恶性肿瘤的一种或更多种功能性CAR中，如申请人的共同未决临时专利申请No.62/773,940(其通过引用整体并入本文)中所公开的。
DuoCAR治疗应用的另一个实例是治疗表达CD123抗原的癌症。例如，如在2019年9月20日提交的并且转让给Lentigen Technology，Inc.(事件编号LEN_024)并要求2018年9月20日提交的临时专利申请No.62/734,106的优先权的标题为“Compositions andMethods For Treating Cancer With Anti-CD123Immunotherapy”的申请人的共同未决美国专利申请No.16/578,063中所公开的CD123特异性结合物可并入靶向表达CD123的恶性肿瘤的一种或更多种功能性CAR中，如申请人的共同未决美国专利申请No.16/578,063(其通过引用整体并入本文)中所公开的。
DuoCAR治疗应用的另一个实例是治疗表达BCMA抗原的癌症。例如，如在2019年5月30日提交的并且转让给Lentigen Technology，Inc.(事件编号MBG_13)的标题为“FullyHuman BCMA CAR T Cells for the Treatment of Multiple Myeloma and Other BCMA-Positive Malignancies”的申请人的共同未决临时专利申请No.62/854,574中所公开的BCMA特异性结合物可并入靶向表达BCMA的恶性肿瘤的一种或更多种功能性CAR中，如申请人的共同未决临时专利申请No.62/854,574(其通过引用整体并入本文)中所公开的。
该技术所基于的串联CAR(包含2个scFv结构域，如核苷酸序列SEQ ID：23和氨基酸序列SEQ ID：24中所描述的)的实例包括CD20_CD19 CAR LTG1497，其为核苷酸序列SEQ IDNO：25和氨基酸序列SEQ ID NO：26。在一些情况下，逆转两个结合物的顺序可提供在靶细胞中更好的DuoCAR表达。因此，如在核苷酸序列SEQ ID NO：25和氨基酸序列SEQ ID NO：26中所示的LTG1497(其中CD19 scFV更接近膜)和如在核苷酸序列SEQ ID NO：33和氨基酸序列SEQ ID NO：34中所示的LTG1496(其中CD19 scFV更远离膜)二者都可用作包含DuoCAR的Duo组的成员之一。
实施例1和2中使用的方法：
细胞系(PBMC和靶标)
除非另有说明，否则所有细胞系和试剂均购自美国组织培养物保藏中心(American Tissue Culture Collection，ATCC，Manassas，VA)。伯基特淋巴瘤细胞系Raji、急性淋巴细胞白血病细胞系REH、以及慢性髓细胞性白血病细胞系K562在补充有10％热灭活的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，Hyclone，Logan，UT)和2mM L-Glutamax(ThermoFisher Scientific，Grand Island，NY)的RPMI-1640培养基中培养。人胚肾细胞系293T在补充有10％热灭活的FBS的杜氏改良Eagle培养基中增殖。
通过用编码萤火虫萤光素酶的慢病毒载体(Lentigen Technology，Inc.，Gaithersburg，MD)稳定转导野生型肿瘤系，然后克隆和选择萤光素酶阳性克隆来产生表达萤光素酶的细胞系的单细胞克隆。适合小鼠的Raji-luc系通过以下产生：将稳定表达萤火虫萤光素酶的Raji克隆移植到NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdscid Il2rgtm1Wj1/SzJ)，The JacksonLaboratory Sacramento，CA)中，通过阳性选择(CD19微珠，人，Miltenyi Biotec，BergischGladbach，Germany)或阴性选择(小鼠细胞消耗试剂盒，Miltenyi Biotec)从小鼠脾中分离移植的Raji-luc肿瘤细胞，在培养中扩增，并重新克隆以有利于选择具有高的萤火虫萤光素酶表达的克隆。在捐赠者的书面同意下，从俄克拉荷马血液研究所(Oklahoma BloodInstitute，OBI，Oklahoma City，OK)的健康志愿者中收集全血。经加工的血沉棕黄层(buffy coat)购自OBI。使用CD4-和CD8-微珠(Miltenyi Biotec)的1∶1混合物，根据制造商的方案，通过阳性选择从血沉棕黄层中纯化CD4阳性和CD8阳性人T细胞。包含DuoCAR的嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)表达载体的产生
CAR抗原结合结构域scFv序列来源于小鼠杂交瘤FMC-63(对于CD19)(FMC-63：AA1-267，GenBank ID：HM852952.1)和Leu-16(对于CD20)[1](VL和VH的整个序列)。CD22 scFv结合由公开可获得的序列产生。通过将每个抗体的scFv在框内连接至CD8铰链和跨膜结构域(AA123-191，参考序列D NP_001759.3)、4-1BB(CD137，AA 214-255，UniProt序列IDQ07011)反式激活结构域和CD3ζ信号传导结构域(CD247，AA52-163，参考序列ID：NP_000725.1.)来产生串联的CAR19_20或CAR20_19。19A和20A的scFv区依次通过柔性链间接头(GGGGS)5(SEQ ID NO：108)连接，然后是CD8、4-1BB和CD3ζ结构域。来自人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体α亚基的前导序列包含在所有构建体中，如[2]中所述。对CAR构建体序列进行密码子优化(DNA2.0，Newark，CA)，并在人EF-1α启动子的调节下将其克隆到第三代慢病毒质粒骨架(Lentigen Technology Inc.，Gaithersburg，MD)中。如先前所述[3]，通过对HEK 293T细胞进行瞬时转染产生包含慢病毒载体(Lentiviral vector，LV)的上清液。将收获的沉淀的慢病毒上清液储存在-80℃下。
原代T细胞转导：
将来自正常供体的经选择的CD4+和CD8+人原代T细胞以0.3至2×106个细胞/ml的密度在补充有40IU/ml IL-2的TexMACS培养基(无血清)中培养，用CD3/CD28
Figure BPA0000324003010000731
TransAct试剂(Miltenyi Biotec)活化并在第3天在10ug/ml鱼精蛋白硫酸盐(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的存在下用编码CAR构建体的慢病毒载体转导过夜，并在第4天更换培养基。在第5天，将培养物转移至补充有200IU/ml IL-2的TexMACS培养基，并增殖直至在第10至13天收获。
免疫效应物测定：为了确定细胞介导的细胞毒性(CTL测定)，将用萤火虫萤光素酶稳定转导的5,000个靶细胞与CAR T细胞以不同的效应物与靶标比例组合并孵育过夜。将SteadyGlo试剂(Promega，Madison WI)添加至每个孔，并在EnSpire板读取仪(PerkinElmer，Shelton，Connecticut)上分析所得的发光，并将其记录为每秒的计数(样品CPS)。使用仅靶标的孔(最大CPS)和仅靶标的孔加1％吐温-20(最小CPS)确定测定范围。特异性裂解百分比计算如下：(1-(样品CPS-最小CPS)/(最大CPS-最小CPS))。
流式细胞术分析：除非另有说明，否则用于流式细胞术的所有细胞染色试剂均来自Miltenyi Biotec。从培养物中收获100万个CAR T转导细胞，在冷染色缓冲液(含有0.5％牛血清白蛋白的AutoMACS溶液)中洗涤两次，并在4℃下以350×g沉淀5分钟。通过用蛋白质L-生物素缀合物(储液1mg/ml，1∶1000稀释，GenScript，Piscataway，NJ)在4℃下染色30分钟，然后进行两次洗涤并用链霉亲和素-PE缀合物在4℃下染色30分钟(储液：1.0ml，1∶200稀释，Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)来初始检测经转导T细胞上的CAR表面表达。未经转导的细胞和仅用链霉亲和素-PE染色的转导细胞用作阴性对照。抗CD4抗体用于确定CAR T阳性群的CD4与CD8比例，并在第二个孵育步骤期间添加。通过7AAD染色(BD Biosciences，San Jose，CA)排除死细胞。将细胞洗涤两次并重悬于200ul染色缓冲液中，然后通过流式细胞术进行定量分析。在IL-2存在下，对用CD3-CD28纳米基质(TransAct，Miltenyi Biotec)活化用Duo组载体转导的人T细胞进行特异性Duo组CAR T染色，并如抗体一样，使用重组CD19、CD20或CD22进行染色来通过流式细胞术分析CD19-scFv、CD20-scFv或CD22-scFv结构域的表达。
抗CD19 scFv活性用以1ug/样品使用的CD19-Fc(R&D Biosystems)进行检测，并用0.75ug/样品的山羊抗人Fc-γ-R-PE(Jackson ImmuoResearch Laboratories，Inc.)进行染色。抗CD20 scFv活性用0.1ug/样品的CD20-生物素(Miltenyi Biotech)进行检测，用0.2ug/样品的链霉亲和素APC(Miltenyi Biotec)进行检测。抗CD22 scFc活性用0.1ug/样品的CD22-His(Thermo Fisher)进行检测，并用抗His FITC(Miltenyi Biotec)进行检测。在
Figure BPA0000324003010000741
分析仪(Miltenyi Biotec)上进行流式细胞术分析。使用CD19-FITC、CD20 VioBlue和CD22-APC抗体进行靶肿瘤系和萤光素酶阳性亚克隆的表征。通过7AAD染色(BD Biosciences，San Jose，CA)将死细胞排除在分析之外。
实施例1
原代人T细胞上DuoCAR(2+1 Duo组)的表达
作为原理证明，产生由两种CAR-T载体构成的Duo组。该组中的一个成员表达与CD8跨膜结构域和CD28和CD3-ζ信号传导结构域连接的串联CD20_CD19结合结构域(LTG2228)，其为SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52。Duo组的第二个成员是具有与CD8跨膜结构域和4-1BB和CD3-ζ信号传导结构域连接的单一CD22结合物的CAR构建体(LTG2200)，其为SEQ ID NO：9和SED ID NO：10。在图7中，成对的列示出了对于CD20和CD19 scFv(左列)以及CD22和CD19scFv(右列)的双重染色。第1行示出了未经转导的T细胞(UTID)，并因此未示出结合。第2行示出了用编码具有CD8跨膜结构域和胞内CD28和CD3-ζ信号传导结构域的CD20_CD19 CAR载体(20-19-28z)的LV转导的T细胞。虽然对于CD20和CD19结合见到了双重染色(左图)，但在右图中仅见到CD19结合。第3行示出了用具有CD8跨膜结构域和胞内4-1BB和CD3-ζ信号传导结构域的CD22 CAR载体(22-BBz)转导的T细胞。用CD19或CD20未见到双重染色(左图)，并且仅见到能够结合CD22的单一细胞群(右图)。在第4行中，T细胞用由第2行和第3行中的这两种载体构成的Duo组进行转导。仅Duo组表达所有三种CAR编码的结合结构域(42％的细胞表达CD20_19(左图)，并且38％表达CD22和CD19结合结构域(右图))。由于CD22和CD19 scFv位于包含Duo组的两个独立的跨膜蛋白中的每一个上，因此在该实施例中38％代表真正的Duo组表达群。
实施例2
通过共转导方法产生的表达DuoCAR的人T细胞制备物的抗白血病活性
表达同时靶向三种白血病抗原的DuoCAR的人T细胞制备物的抗白血病活性(参见图7的DuoCAR表达特征)。在使用白血病细胞系和模型细胞系作为靶标的细胞毒性T细胞测定中，对于效应T细胞群使用由CD20_19串联CAR和CD22特异性单一CAR构成的Duo组(如在实施例1中制备的)。将用单一CAR组分(20_19-28z或22-BBz)或DuoCAR(20_19-28z+22-BBz)转导的人T细胞在四种不同的效应物与靶标比例(20∶1、10∶1、5∶1、2.5∶1，如所指示的)下用于细胞毒性T细胞测定(参见图8)。用作CAR-T靶标的白血病细胞系是：Raji(表达所有三种靶抗原)、REH(表达所有三种靶抗原)、K562(对照，无靶标表达)、K562-CD19(表达CD19)、K562-CD20(表达CD20)和K562-CD22(表达CD22)。仅DuoCAR转导的细胞(20-19-28z+22-BBz)对这两种白血病细胞系(Raji和REH)和所有三种单表达K562靶细胞系(K562-CD19、K562-CD20、K562-CD22)表现出高的细胞裂解活性。这表明在同一效应T细胞群中，DuoCAR技术可独特地同时靶向三种白血病抗原，并因此通过能够一次靶向多于一种或两种靶抗原、因此降低恶性肿瘤产生逃逸突变体(已经丢失或下调一种或两种抗原的细胞克隆，并且这逃逸了免疫消除)的可能性来示出优异的抗肿瘤活性。由于丢失抗原的变体(其最终复发)的逃逸和生长，最终的结果将是对于患者更高的治愈率。
实施例3
通过共转染方法产生的表达DuoCAR的人T细胞制备物的抗白血病活性
本申请中描述的DuoCAR技术产生了治疗性淋巴细胞(在该实施例中为人T细胞)的群，其表达来自由基因载体编码的多于一种跨膜蛋白的多于两种抗原特异性。在该实施例中，这通过两种不同的方式实现。图9包含三行数据，标记为“未经转导”、“共转导”和“共转染”。图9包含如图7中生成的两列数据，其中第一列是通过流式细胞术分析对CD20-和CD19-特异的特异性结合的表达，并且第二列是通过流式细胞术分析CD22-和CD19-结合活性的表达。在第一行数据中，示出了未经转导的人T细胞。对于CAR来源结合活性的CD19、CD20或CD22重组蛋白指示物，没有看到结合活性，表明没有DuoCAR表达。在第二行中，使用“共转导”产生DuoCAR。在该数据集中，使用两种LV同时转导活化的T细胞。如在图7中的，包含DuoCAR的Duo组中的一种CAR是与CD28信号传导和CD3-ζ信号传导基序连接的串联的CD20和CD19结合物；且另一种CAR是与4-1BB和CD3-ζ信号传导基序连接的CD22结合物。第一列中的右上象限示出了对于CD20和CD19-scFv活性的一致染色的非常特殊的模式。这是由于这两种结合物位于相同的表面糖蛋白上，并且因此它们以相同的强度共表达，产生所见的非常特殊的线性模式。在共转导数据的第二列中，当两种糖蛋白在每个细胞上不以一致模式表达时，见到了更传统的模式。因此，见到了4种不同种群的模式。在左下象限中，见到了不表达任一结合物的细胞。在左上象限中，见到了仅表达CD22 CAR的细胞。在右下象限中见到了仅表达CD20_CD19串联CAR的细胞。最后，在右上象限中，见到了表达包含DuoCAR的CAR Duo组的这两种成员的细胞。
在最后一行中，以不同的方式产生表达DuoCAR的细胞群。与其中在T细胞转导时使用独立产生的2种LV制备物的共转导方法不同，“共转染”是指将两种骨架质粒(编码包含DuoCAR的两种CAR)同时转染到293T包装细胞系中用于LV生产的方法。包含该第三代LV系统的辅助质粒在这两种方法中是相同的。共转染方法的优点是产生了包含编码两种CAR的载体的单一LV制备物。从数据中可见，与第二行中的共转导方法相比，使用共转染方法看到了CD20-CD19 CAR和CD22 CAR表达的几乎相同的模式。在第二列的数据的右上象限中，通过共转染(CD22用于CD22-CAR和CD19共染色用于CD20_19 CAR)产生的LV诱导的这两种糖蛋白的染色模式表明这两种方法均高效地产生DuoCAR。
参考文献
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2)Haso，W.，et al.，Anti-CD22-chimeric antigen receptors targeting B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.Blood，2013.121(7)：p.1165-1174.
3)Kuroda.H.，et al.，Simplified lentivirus vector production inprotein-free media using polyethylenimine-mediated transfection.Journal ofvirological methods，2009.157(2)：p.113-121.
实施例4
通过共转染方法产生的DuoCAR与双顺反子DuoCAR构建体的比较实施例4中使用的方法：
细胞系(PBMC和靶标)：除非另有说明，否则所有细胞系和试剂均购自美国组织培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)。伯基特淋巴瘤细胞系Raji、急性淋巴细胞白血病细胞系REH、以及慢性髓细胞性白血病细胞系K562在补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS，Hyclone，Logan，UT)和2mM L-Glutamax(Thermo Fisher Scientific，Grand Island，NY)的RPMI-1640培养基中培养。人胚肾细胞系293T在补充有10％热灭活的FBS的杜氏改良Eagle培养基中增殖。
通过用编码萤火虫萤光素酶的慢病毒载体(Lentigen Technology，Inc.，Gaithersburg，MD)稳定转导野生型肿瘤系，然后克隆和选择萤光素酶阳性克隆来产生表达萤光素酶的细胞系的单细胞克隆。适合小鼠的Raji-luc系通过以下产生：将稳定表达萤火虫萤光素酶的Raji克隆移植到NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wj1/SzJ)，The JacksonLaboratory Sacramento，CA)中，通过阳性选择(CD19微珠，人，Miltenyi Biotec，BergischGladbach，Germany)或阴性选择(小鼠细胞消耗试剂盒，Miltenyi Biotec)从小鼠脾中分离移植的Raji-luc肿瘤细胞，在培养中扩增，并重新克隆以有利于选择具有高的萤火虫萤光素酶表达的克隆。在捐赠者的书面同意下，从俄克拉荷马血液研究所(OBI，Oklahoma City，OK)的健康志愿者中收集全血。经加工的血沉棕黄层购自OBI。使用CD4-和CD8-微珠(Miltenyi Biotec)的1∶1混合物，根据制造商的方案，通过阳性选择从血沉棕黄层中纯化CD4阳性和CD8阳性人T细胞。
包含DuoCAR的嵌合抗原受体(CAR)表达载体的产生
CAR抗原结合结构域scFv序列来源于小鼠杂交瘤FMC-63(对于CD19)(FMC-63：AA1-267，GenBank ID：HM852952.1)和Leu-16(对于CD20)[1](VL和VH的整个序列)。使用了数种抗CD22 scFv结合序列。通过将每个抗体的scFv在框内连接至CD8铰链和跨膜结构域(AA123-191，参考序列ID NP_001759.3)、4-1BB(CD137，AA 214-255，UniProt序列IDQ07011)反式激活结构域和CD3ζ信号传导结构域(CD247，AA52-163，参考序列ID：NP_000725.1.)来产生串联的CAR19_20或CAR20_19。19A和20A的scFv区依次通过柔性链间接头(GGGGS)5(SEQ ID NO：108)连接，然后是CD8、4-1BB和CD3ζ结构域。来自人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体α亚基的前导序列包含在所有构建体中，如[2]中所述。在双顺反子CAR设计中，在同一表达盒中编码通过核糖体跳读元件2A分开的两条CAR链。对CAR构建体序列进行密码子优化(DNA2.0，Newark，CA)，并在人MSCV启动子的EF-1α的调节下将其克隆到第三代慢病毒质粒骨架(Lentigen Technology Inc.，Gaithersburg，MD)中。如先前所述[3]，通过对HEK 293T细胞进行瞬时转染产生包含慢病毒载体(LV)的上清液。对于共转染实验，在转染步骤期间，将等量的编码每种DuoCAR链的两种转移质粒组合并与辅助质粒一起应用至HEK 293T包装细胞系，并将所得的病毒载体制剂用于转导原代人T细胞。将收获的沉淀的慢病毒上清液储存在-80℃下。
原代T细胞转导：将来自正常供体的经选择的CD4+和CD8+人原代T细胞以0.3至2×106个细胞/ml的密度在补充有40IU/ml IL-2的TexMACS培养基(无血清)中培养，用CD3/CD28
Figure BPA0000324003010000781
TransAct试剂(Miltenyi Biotec)活化并在第3天在10ug/ml鱼精蛋白硫酸盐(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的存在下用编码CAR构建体的慢病毒载体转导过夜，并在第4天更换培养基。在第5天，将培养物转移至补充有200IU/ml IL-2的TexMACS培养基，并增殖直至在第10至13天收获。
免疫效应物测定：为了确定细胞介导的细胞毒性(CTL测定)，将用萤火虫萤光素酶稳定转导的5,000个靶细胞与CAR T细胞以不同的效应物与靶标比例组合并孵育过夜。将SteadyGlo试剂(Promega，Madison WI)添加至每个孔，并在EnSpire板读取仪(PerkinElmer，Shelton，Connecticut)上分析所得的发光，并将其记录为每秒的计数(样品CPS)。使用仅靶标的孔(最大CPS)和仅靶标的孔加1％吐温-20(最小CPS)确定测定范围。特异性裂解百分比计算如下：(1-(样品CPS-最小CPS)/(最大CPS-最小CPS))。
流式细胞术分析：除非另有说明，否则用于流式细胞术的所有细胞染色试剂均来自Miltenyi Biotec。从培养物中收获100万个CAR T转导细胞，在冷染色缓冲液(含有0.5％牛血清白蛋白的AutoMACS溶液)中洗涤两次，并在4℃下以350×g沉淀5分钟。通过用蛋白质L-生物素缀合物(储液1mg/ml，1∶1000稀释，GenScript，Piscataway，NJ)在4℃下染色30分钟，然后进行两次洗涤并用链霉亲和素-PE缀合物在4℃下染色30分钟(储液：1.0ml，1∶200稀释，Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)来初始检测经转导T细胞上的CAR表面表达。未经转导的细胞和仅用链霉亲和素-PE染色的转导细胞用作阴性对照。抗CD4抗体用于确定CAR T阳性群的CD4与CD8比例，并在第二个孵育步骤期间添加。通过7AAD染色(BD Biosciences，San Jose，CA)排除死细胞。将细胞洗涤两次并重悬于200ul染色缓冲液中，然后通过流式细胞术进行定量分析。在IL-2存在下，对用CD3-CD28纳米基质(TransAct，Miltenyi Biotec)活化用Duo组载体转导的人T细胞进行特异性Duo组CAR T染色，并如抗体一样，使用重组CD19、CD20或CD22进行染色来通过流式细胞术分析CD19-scFv、CD20-scFv或CD22-scFv结构域的表达。
抗CD19 scFv活性用以1ug/样品使用的CD19-Fc(R&D Biosystems)进行检测，并用0.75ug/样品的山羊抗人Fc-γ-R-PE(Jackson ImmuoResearch Laboratories，Inc.)进行染色。抗CD20 scFv活性用0.1ug/样品的CD20-生物素(Miltenyi Biotech)进行检测，用0.2ug/样品的链霉亲和素APC(Miltenyi Biotec)进行检测。抗CD22 scFv活性用0.1ug/样品的CD22-His(Thermo Fisher)进行检测，并用抗His FITC(Miltenyi Biotec)进行检测。在
Figure BPA0000324003010000791
分析仪(Miltenyi Biotec)上进行流式细胞术分析。使用CD19-FITC、CD20 VioBlue和CD22-APC抗体进行靶肿瘤系和萤光素酶阳性亚克隆的表征。通过7AAD染色(BD Biosciences，San Jose，CA)将死细胞排除在分析之外。
使用2A核糖体跳读序列产生双顺反子DuoCAR
除以上实施例2和实施例3中描述的共转导和共转染方法之外，对于同时靶向三种血液肿瘤抗原CD19、CD20、CD22并以不同的共刺激结构域为特征的DuoCAR，可通过使用自切割元件2A来促进来自单一mRNA转录物的两种CAR链的同时表达。2A元件在mRNA转录物翻译成蛋白质期间介导核糖体跳读，因此使得能够以等摩比产生两个独立的CAR蛋白链。在该实施例中，一种CAR链由在框内与CD8铰链和跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ激活结构域连接的CD22 scFv构成。第二种CAR链由基于串联CD20 CD19 scFv的靶向结构域，然后是CD8铰链和跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ激活结构域构成。两种设计在CAR链的顺序上不同，例如在一种设计中，首先是CD22 CAR，然后是2A元件和串联2019 CAR，反之亦然(图10)。
首先，如上所述构建了在EF1a启动子的控制下的同时靶向CD19、CD20和CD22抗原的四种双顺反子DuoCAR设计的组(组1，下表1)。
表1-双顺反子DuoCAR构建体和单一CAR对照的列表
双顺反子DuoCAR构建体编号 描述 组#
LTG2515 EF1A-2019-28z-2A-m971-BBz 组1
LTG2228 EF1A-20-19-28z 组1
LTG2520 EF1A-2019-28z-2A-16P17-BBz 组1
LTG2521 EF1A-2019-28z-2A-16P8-BBz 组1
LTG2200 EF1A-m971 CD22 CAR对照 组1
LTG2209 EF1A-16p17-BBz 组1
LTG2218 EF1A-16p8-BBz 组1
D0043 MSCV_20-19-28z-2A-m971-BBz 组2
D0044 MSCV_20-19-28z-2A-16p8-BBz 组2
D0046 MSCV_m971-BBz-2A-20-19-28z 组2
D0047 MSCV_16p8-BBz-2A-20-19-28z 组2
为了促进DuoCAR形式的靶向CD22之CAR部分的最佳表达，将靶向CD22之CAR链并入到CD22反应性scFv序列16P8或16P17之一中。将CD22 scFv m971用作比较物，并且未经转导的细胞(UTD)用作CAR阴性对照)。如上所述通过2A核糖体跳读序列促进靶向CD20-CD19之CAR链和靶向CD22之CAR链的共表达。包含单独编码的CAR链作为表达对照。用编码每种DuoCAR或单一CAR对照的慢病毒载体转导来自健康供体的人原代T细胞。在T细胞培养扩增完成之后，通过流式细胞术评估CAR表达。表示同一细胞中串联CD20-CD19 CAR链和CD22-CAR链的共表达的DuoCAR组(LTG2515、LTG2520、LTG2521)中CAR20+CAR22+双阳性细胞的百分比相对较低，并且范围为28％(LTG2515、LTG2520)至9％(LTG2521)(图11)。相比之下，单独CAR对照的表达相当高，对于CD22靶向构建体(LTG2200)为约72％，并且对于串联CD20-CD19靶向CAR(LTG 2228)为约38％(图11)。然后在细胞因子释放测定中测试DuoCAR的功能。将对照的DuoCAR效应细胞与Raji靶细胞以效应物与靶标比例(E∶T)为10组合过夜。在孵育期结束时，收获细胞培养物上清液并分析分泌的T细胞细胞因子IFNγ、TNFα和IL-2(图12)。在不存在肿瘤靶细胞的情况下在相似条件下孵育的效应物用作自发细胞因子释放的另外对照。Raji肿瘤细胞与CAR效应物的共孵育导致所有构建体的IFNγ、IL-2和TNFa的强烈上调。值得注意的是，没有CAR自发产生细胞因子。然而，与阳性对照CAR22 LTG2200和串联2019 CARLTG2228相比，所有DuoCAR构建体的细胞因子分泌的量倾向于降低，这可能是由于DuoCAR的相对中等的表达，如图11中所见的。
与单一CAR对照相比，中等程度的DuoCAR表达和细胞因子响应(图11、图12)表明，在本配置中，大的有效负载尺寸可能会不利地影响DuoCAR表达效率。为了改善DuoCAR转导效率，根据需要对所选的DuoCAR序列进行密码子再优化，并在MSCV内部启动子的控制下将表达盒再克隆到新的表达骨架中，以改善双顺反子表达(组2，表1)。
为每种新DuoCAR构建体产生慢病毒载体，并且如材料和方法中所述转导并扩增CAR T细胞。通过流式细胞术确定DuoCAR表达。CD19+CD22+T细胞的百分比表示共表达DuoCAR的两条链的细胞(图13)。在此，均包含抗CD22 scFv 16P8的DuoCAR构建体D0044(MSCV_20-19-28z-2A-16p8-BBz)和D0047(MSCV_16p8-BBz-2A-20-19-28z)实现了高转导效率(图13，分别为51％和45％)。出乎意料的是，包含比较物m971 CD22 scFv的DuoCAR D0043在远端取向情况下表达良好(MSCV_20-19-28z-2A-m971-BBz，46％阳性)，但在相反取向情况下没有表现出表达(D0046，MSCV_m971-BBz-2A-20-19-28z)。因此，包含在DuoCAR设计中的scFv序列的选择以及序列密码子优化和表达骨架的选择对于最佳的DuoCAR表达都是至关重要的。
在针对具有肿瘤抗原CD19、CD20和CD22的不同表达的一组肿瘤系的过夜杀伤测定中，测定DuoCAR组2转导的T细胞的细胞毒性功能。稳定转导所有系以表达萤火虫萤光素酶，并如材料和方法中所述进行杀伤测定。首先，将DuoCAR与CD19+CD20+CD22+的非霍奇金淋巴瘤Raji、或急性淋巴细胞白血病Reh细胞、或CD19-CD20-CD22-人胚肾293T细胞系组合(图15)。包括双顺反子地编码CAR 20-19-28z和CD22 CAR16p8-BBz CAR的DuoCAR D0044和D0047，单一CAR 22对照LTG2200，和串联CAR对照20-19 LTG1497，以及未经转导的T细胞对照(UTD)(图14)。为简洁起见，将构建体D0043、D0044、D0046和D0047在图例中分别标记为D43、D44、D46和D47(图14)。将效应细胞和靶细胞以2.5、5或10的比例一式三份地孵育过夜，然后收获板并用SteadyGlo试剂显现，并通过发光分析(luminometry)测定存活的肿瘤细胞的萤光素酶活性。总体而言，CAR细胞裂解功能与DuoCAR表达相关(图13)。DuoCAR D0047和D0044强力裂解CD19、CD20和CD22三阳性肿瘤系Raji和Reh，阳性对照DuoCAR D0043也是如此，而次佳表达的构建体D0046具有相对较低的裂解功能(图14)。没有CAR构建体导致CD19-CD20-CD22-三阴性系的裂解，强调了CAR介导的裂解对同源抗原的特异性。
为了进一步描述DuoCAR构建体的特异性，产生了表达CD19、CD20或CD22抗原的转基因K562系，分别称为K19、K20、K22(图15)。在与单阳性肿瘤系的共孵育测定中，以靶向CD19、CD20和CD22的CAR链为特征的DuoCAR D44和D47以效应物与靶标比例依赖性方式强力裂解每个靶标系，并且其功能类似于比较物DuoCAR D0043(图例中的构建体名称从D0043、D0044、D0046、D0047分别简写为D43、D44、D46和D47-图15)。表达串联2019 CAR的对照T细胞(1497)裂解肿瘤系K19和K20，但在K22中仅具有可忽略不计的背景裂解效果(在最高E∶T比例10时小于10％的裂解)。单CD22对照CAR强力裂解K22肿瘤细胞，但是在K20细胞中没有功能，并且在K19细胞中仅表现出背景裂解(在最高E∶T比例10时10％的裂解)。因此，该实验系统能够以高精度测试CAR对每种肿瘤抗原的反应性。总之，DuoCAR D0044和D0047两者均证明，其肿瘤靶向结构域中的每一个在该单抗原表达测试系统中都是有功能性的(图15)。
为了表征DuoCAR构建体的细胞因子释放应答，将CD19+CD20+CD22+的DuoCAR T细胞制备物D0044、D0047(图例分别为D44、D47)中的每一种与Raji肿瘤细胞以E∶T比例为10组合过夜，并且通过ELISA分析培养物上清液中的T细胞细胞因子IFNg、TNFa和IL-2(图16)。包括单一CAR22构建体LTG2200和串联2019 CAR构建体LTG2273用于比较，并且未经转导的T细胞(UTD)用作阴性对照。平行地，将来自每组的CAR T细胞在相似的条件下但在不存在肿瘤细胞的情况下进行孵育，以测试自发细胞因子释放(图16)。发现尽管没有构建体产生自发细胞因子释放，但是在与Raji靶标共孵育之后，DuoCAR D44和D47两者均显示出对IL-2、IFNg和TNFa的强烈诱导，强调了这些DuoCAR构建体的效力。值得注意的是，尽管在同一细胞中同时共表达两种链，但是没有检测到进补信号(tonic signaling)的证据，如通过完全没有自发细胞因子释放所证明的(图16)。
已经实现了靶向三种不同肿瘤抗原CD19、CD20、CD22并且由具有不同和互补功能的具有共刺激结构域的两种CAR链构成的双顺反子DuoCAR的成功开发，问题是是否可以通过其他方法来产生类似的构建体。同一ORF内分离的CAR链的成功双顺反子表达需要多个优化和完善步骤，并且对于每个新序列集而言都是独特的。相比之下，在慢病毒载体制造期间或在CAR T转导期间组合两种CAR序列可提供更通用的方法和快速方法，以产生待在同一细胞或同一T细胞群中表达的CAR组合，同时使用单一慢病毒制备物进行T细胞转导。在该实施例中，如在DuoCAR方法中一样，一种CAR链由在框内与CD8铰链和跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ激活结构域连接的CD22 scFv构成。第二种CAR链由基于串联CD20 CD19 scFv的靶向结构域，然后是CD8铰链和跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ激活结构域构成(图17)。在共转染方法中，按照标准方案(参见材料和方法)，在载体生产步骤期间将各自编码一种CAR链的两种转移质粒混合在一起并与辅助质粒组合。因此，所得的慢病毒制备物将编码两种CAR链的混合物。使用这种方法，我们产生了一组同时编码两种CAR链的慢病毒制备物(下表2)。
表2：用于共转染共转导实验的构建体
CAR构建体编号 描述
D1 MSCV-AscI-16P17-CD84-1BBz
D2 MSCV-AscI-16P8-CD84-1BBz
D3 MSCV-AscI-16P13-CD84-1BBz
2273 MSCV-20-19-28z
D1+2273 组合
D2+2273 组合
D3+2273 组合
构建了利用在MSCV启动子的控制下的scFv 16P17、16P8、16P13CAR22-4-1BB-CD3ζ的CAR 22的转移质粒(分别为D1、D2、D3)，以及利用在MSCV的控制下的串联CAR 2019-28-CD3ζ的CAR 22的转移质粒(LTG 2273)。平行产生编码单独的每种CAR链的慢病毒载体。对于所有DuoCAR共转染制备物，常规地实现了高滴度(1010TU/ml，未示出)，强调了这种方法的效率。
为了优化DuoCAR功能，设计了由在MSCV启动子的控制下的scFv16P17、16P8和16P13构成的一系列CAR22构建体(分别为构建体D1、D2和D3)，以及使用也由MSCV启动子驱动的串联CAR 2019的CAR22构建体(LTG2273)，以用于DuoCAR共转染组合(表2和图18)。通过LTG2273与CD22 CAR质粒之一的共转染制备慢病毒载体，并且产生了高感染滴度(未示出)。每种LV以感染复数(multiplicity of infection，MOI)20用于健康供体T细胞的转导，并通过流式细胞术确定CAR表达(图18)。用编码单一CAR对照的LV转导的所有对照组均产生了高CAR表达(对于D1为45％，对于D2为82％，对于D3为82％，对于2273为87％(未示出))。令人惊讶和出乎意料地，在组合共转染中，组D2+73和D3+73产生了两种CAR链的有效且几乎相同的共表达(51％)，而组合D1+73未能共表达(2.8％CAR+)，图18。为了确定这些DuoCAR是否具有裂解功能，我们在一组肿瘤系中测试了来自每组的CAR T细胞(图19，在组D1+2273、D2+2273、D3+2273的标签中，为简洁起见，省略了“D”)。所有DuoCAR制备物均有效地裂解三阳性肿瘤系Raji和Reh，但是没有裂解三阴性系293T，证明了DuoCAR的特异性(图19A)。此外，所有DuoCAR均对单抗原肿瘤系K19、K20和K22表现出高于背景的裂解功能，而具有错配的靶向结构域的单对照CAR没有表现出特异性裂解：参见K19中的D1至D3；K20中的D1至D3，K22中的2273(图19B)。然后测定了与特定肿瘤靶标共孵育之后DuoCAR诱导细胞因子的能力(图20；在组D1+2273、D2+2273、D3+2273的标签中，为简洁起见，省略了“D”)。将DuoCAR T细胞、单一CAR对照和未经转导的T细胞(UTD)与三CD19+CD20+CD22+Raji肿瘤细胞组合并孵育过夜。平行地，在不存在肿瘤的情况下的CAR T细胞在相似条件下孵育以排除自发细胞因子释放。在孵育期结束时，通过ELISA测定培养物上清液的细胞因子IFNg、TNFa和IL-2(图20)。与Raji共孵育之后，所有CAR组均产生了高IFNg水平。尽管一些单一CD22 CAR对照具有中等程度的自发IFNg释放(D2、D3)，但是没有DuoCAR自发产生IFNg，这表明了DuoCAR有可能更高的安全系数。除CAR 2272之外，所有CAR组中Raji共孵育还高度诱导了IL-2和TNFa表达(图20)。
总之，在此描述了通过在LV制备期间将单独的CAR链共转染并将所得LV制备物施加于T细胞转导来产生功能性和高度特异性的DuoCAR。此外，使用仅表达单一靶抗原(K19、K20、K22)的转基因细胞系，证明了每种CAR靶向结构域是功能性的，并且可以引发针对表达靶标的肿瘤细胞的DuoCAR功能。令人惊讶和出乎意料地，仅少数组合能够表现出稳健的CAR表达和强效的细胞毒性功能二者，因此DuoCAR的设计并非无关紧要的。
实施例5
双顺反子DuoCAR强效地根除淋巴瘤肿瘤。
实施例5中使用的材料和方法：
(a)细胞系
伯基特淋巴瘤细胞系Raji和慢性髓细胞性白血病系K562购自美国组织培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)。REH白血病系购自DSMZ(Leibniz Institute DSMZ，Braunschwieg，Germany)。细胞在补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS，Hyclone，Logan，UT)和2mM L-Glutamax(Thermo Fisher Scientific，Grand Island，NY)的RPMI-1640培养基中培养。人胚肾系293T购自ATCC(Gibco/Thermo Fisher Scientific，Grand Island，NY)。通过用编码萤火虫萤光素酶的慢病毒载体(Lentigen Technology，Inc.，Gaithersburg，MD)稳定转导野生型肿瘤系，然后克隆和选择萤光素酶阳性克隆来产生表达萤光素酶的细胞系的单细胞克隆。Raji13G11克隆通过在小鼠中传代萤光素酶转导的Raji细胞来产生，并针对其增殖能力进行选择。在捐赠者的书面同意下，从俄克拉荷马血液研究所(OBI)的健康志愿者中收集全血。经加工的血沉棕黄层购自OBI(Oklahoma City，OK)。使用CD4-和CD8-微珠(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)的1∶1混合物，根据制造商的方案，通过阳性选择从血沉棕黄层中纯化CD4阳性和CD8阳性人T细胞。
(b)嵌合抗原受体(CAR)表达载体的产生
DuoCAR构建体被设计为并入一个靶向CD19和CD20的串联CAR，以及一个靶向CD22的单一CAR的双顺反子序列。来自同一mRNA模板的两种CAR构建体的双顺反子表达通过核糖体跳读元件2A来促进。结合CAR抗原的单一结构域和串联结构域来源于人抗CD22单链可变片段(ScFv)，或前述靶向20-19的串联scFv(Schneider，D.等，(2017).Joumal forimmunotherapy of cancer，5(1)，42.)。通过将结合物序列在框内连接至CD8a连接和跨膜结构域(aa 123-191，参考序列ID NP_001759.3)来产生CAR T编码序列。CAR构建体的C端区段包含CD3ζ信号传导结构域(CD247，aa 52-163，参考序列ID：NP_000725.1)。一些设计还包括来源于人4-1BB、ICOS、OX40或CD27蛋白的共刺激结构域。将CAR构建体序列克隆到第三代慢病毒质粒骨架(Lentigen Technology Inc.，Gaithersburg，MD)中。通过对HEK 293T细胞进行瞬时转染产生包含慢病毒载体(LV)的上清液并通过对包含慢病毒载体的上清液进行离心使载体沉淀，并将其储存在-80℃下。
(c)原代T细胞纯化和转导
使用CD4+和CD8+细胞的免疫磁珠选择，根据制造商的方案(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)，从全血或血沉棕黄层(在捐赠者的书面同意下从商业供应商购买)纯化来自健康志愿者的人原代T细胞。将T细胞以0.3至2×106个细胞/ml的密度在补充有200IU/ml IL-2的TexMACS培养基中培养，用CD3/CD28
Figure BPA0000324003010000861
GMP T细胞TransAct试剂(Miltenyi Biotec)活化并在第2天在10ug/ml鱼精蛋白硫酸盐(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的存在下用编码CAR构建体的慢病毒载体转导过夜，并在第3天更换培养基。培养物在补充有200IU/ml IL-2的TexMACS培养基中增殖直至在第8至10天收获。
(d)免疫效应物测定(CTL和细胞因子)
为了确定细胞介导的细胞毒性(CTL测定)，将用萤火虫萤光素酶稳定转导的5,000个靶细胞与CAR T细胞以不同的效应物与靶标比例组合并孵育过夜。将SteadyGlo试剂(Promega，Madison WI)添加至每个孔，并将所得的发光量化为每秒的计数(样品CPS)。使用仅靶标的孔(最大CPS)和仅靶标的孔加1％吐温-20(最小CPS)确定测定范围。特异性裂解百分比计算如下：(1-(样品CPS-最小CPS)/(最大CPS-最小CPS))。移出来自E∶T比例为10∶1的共培养物的上清液，并通过ELISA(eBioscience，San Diego，CA)分析IFNγ、TNFα和IL-2浓度。
(e)流式细胞术分析
对于细胞染色，从培养物中收获50万个CAR T转导细胞，在补充有0.5％牛血清白蛋白(Miltenyi Biotec)的冷AutoMACS缓冲液中洗涤两次，并通过用CD19-Fc和CD20-生物素或CD19-Fc和CD22-His肽，然后是第二肽特异性荧光缀合物(ackson ImmunoResearch，West Grove，PA)进行染色来检测CAR表面表达。根据供应商的方案，在指定的情况下使用与VioBlue荧光团(Miltenyi Biotec)缀合的抗CD4抗体。未经转导的细胞用作阴性对照。通过7AAD染色(BD Biosciences，San Jose，CA)排除所有研究中的死细胞。将细胞洗涤两次并重悬于200ul染色缓冲液中，然后通过流式细胞术进行定量分析。在
Figure BPA0000324003010000871
分析仪(Miltenyi Biotec)上进行流式细胞术分析，并使用FlowJo软件(Ashland，OR)生成数据图。
靶向CD19、CD20、CD22的三价DuoCAR的产生
通过P2A核糖体跳读元件将靶向2019的串联CAR链与靶向22的CAR链连接来构建三价DuoCAR。基于先前在优化共转导实验中确定的最佳组合设计了四种不同的DuoCAR构建体。优化研究涉及单独或组合地测试包含41BB、CD28、OX40、ICOS或CD27共刺激结构域或者无共刺激结构域的每个CAR部分(即CD20/19串联CAR和CD22单一CAR)。测试的具体参数是CAR表达水平和体外抗肿瘤活性。DuoCAR构建体结构在图21A中示出，称为D93、D94、D95和D96。DuoCAR构建体D93由以下构成：靶向B细胞抗原CD19和CD20的串联scFv结合物结构域，来源于CD8的铰链和跨膜结构域，然后是ICOS共刺激结构域和CD3ζ激活结构域。该CAR构建体序列通过P2A核糖体跳读元件与靶向CD22的第一代CAR连接，从而产生双顺反子、三重靶向的DuoCAR(图21)。使用2A核糖体跳读元件确保了以下CAR属性：(i)产生一种匀质细胞产品，以及(ii)单个细胞内两个CAR部分在化学计量上相等地表达；其组合实现最佳抗肿瘤功能。除了将ICOS共刺激结构域替换为OX40结构域之外，DuoCAR构建体D94与D93相同。构建体D95由以下构成：靶向CD20和CD19的串联OX40z CAR链(这与D94的相同)，然后是第二代CD22CAR链和ICOS共刺激结构域以及CD3ζ激活结构域。最后，DuoCAR构建体D96包含靶向CD20和CD19的串联CAR链以及CD27共刺激结构域，然后是靶向CD22的单一CAR链以及ICOS共刺激结构域(各自具有CD3ζ激活结构域)(图21A)。DuoCAR构建体被编码到慢病毒载体中并转导至人原代T细胞中。DuoCAR在T细胞中稳健表达，CAR T+细胞在三种不同的构建体和供体之间为30％至70％(图22A、22B)。
另外，构建了数个对照CAR构建体，包括单靶向CAR和串联靶向CAR(图21A)。单靶向CAR包含抗CD22 scFv、抗CD19 scFv或抗CD20scFv之一，然后是CD8铰链和跨膜结构域(直接与CD3z激活结构域连接(D92、CAR22，第一代)或者还并入有共刺激结构域(D89、1538、1495，第二代))，图21A。靶向CD20和CD19的串联对照CAR(称为1497 CAR)，由在框内与CD8铰链和跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3z激活结构域连接的串联CD20-CD19 scFv构成。串联对照构建体D88、D90、D91被设计为串联CAR 1497，不同之处在于分别用ICOS、OX40或CD27结构域替换4-1BB共刺激结构域(未示出)。这些构建体对表达所有三种靶抗原CD19、CD20和CD22的未经修饰的肿瘤表现出抗肿瘤活性，但与DuoCAR D93、D94、D95和D96相比，串联构建体不能阻止对CD19和CD20呈双阴性的肿瘤细胞的抗原逃逸。图21B示意性地示出了DuoCAR、串联CAR和第一代或第二代的单一CAR T细胞的在T胞内的CAR链的定位和组成。通过慢病毒转导，所有单一和串联CAR构建体均在人原代T细胞中实现了稳健的表达。
DuoCAR在体外强效且特异性地裂解肿瘤靶标
为了评价所构建的DuoCAR的功能，将所构建的DuoCAR与表达萤光素酶的靶标肿瘤系组合以进行过夜杀伤测定。抗原阳性系：NHL系Raji(CD19+CD20+CD22+)和BALL系Reh(CD19+CD20低CD22+)用于测试DuoCAR以抗原特异性方式裂解肿瘤细胞的能力。还包括阴性对照系：髓细胞性白血病K562和人胚肾系293T，它们都是CD19-CD20-CD22-的(图23)。
包括串联CAR 1497以及单一CAR对照D89和D92(分别是第二代和第一代的靶向CD22的CAR)以用于比较。
如材料和方法中所述，以效应物与靶标(E∶T)比例为10∶1、5∶1或2.5∶1组合CAR T细胞与靶细胞，并在孵育期结束时计算每种条件的特异性裂解。
所有单一和串联CAR均以E∶T依赖性方式裂解靶标阳性肿瘤系Raji和Reh(图23A、23B)。DuoCAR构建体在所有E∶T比例下强效裂解表达靶抗原CD19、CD20和CD22的靶细胞系(图23A、23B)。在Raji细胞中，与DuoCAR D93、D94、D95和D96相比，靶向CD19和CD20抗原的串联对照CAR 1497在测试的E∶T比例下导致相对不多的肿瘤裂解(图23A)。相比之下，在Reh细胞中，1497的裂解效力与DuoCAR D93、D94、D95和D96的裂解效力相似(图23B)。单靶向CAR22构建体D89和D92倾向于是CD22抗原阳性靶标系Raji和Reh的最强效肿瘤细胞杀伤物。相比之下，除K562细胞中的单靶向CAR22构建体D92(其在最高E∶T比例为10时产生27％的非特异性裂解(图23C))之外，DuoCAR构建体或对照均未裂解靶标阴性肿瘤系K562和293T(图23C、23D)。因此，在抗原阳性靶标系的裂解中，DuoCAR的表现与1497串联构建体同样良好，或优于1497串联构建体，并且在抗原阴性系中不产生背景裂解，证明了抗原依赖性。值得注意的是，尽管单一CAR 22 D92在K562细胞中具有非特异性裂解活性，但将D92序列并入DuoCAR构建体D1和D2中不导致DuoCAR对靶标的非特异性裂解。因此，DuoCAR设计显示出削弱了在第一代CAR D92中所见的不期望的自发裂解活性(图23C)。
DuoCAR的细胞因子响应
为了表征DuoCAR响应于靶细胞的细胞因子产生，在过夜孵育之后，从DuoCAR与CD19+CD20+CD22+Raji靶细胞的共培养物中收集上清液。通过ELISA确定培养物上清液中T细胞促炎和稳态细胞因子IL-2、IFNγ和TNFα的浓度(图24，蓝色条)。包括来自同一供体和批次的未经转导T细胞(UTD)作为CAR阴性对照。此外，为了控制在不存在触发靶细胞的情况下CAR T细胞之可能的自发细胞因子释放，每个CAR T细胞组还在没有Raji靶标的情况下孵育(图24，浅灰色条)。与UTD相比，DuoCAR以及单一和串联对照CAR响应于靶标Raji细胞，强烈诱导IL-2、IFNγ和TNFα的产生，然而DuoCAR系或CAR对照在不存在靶细胞的情况下均不倾向于自发释放这些可溶性因子(图24)。
DuoCAR在体内有效裂解CD19+CD20+CD22+Raji肿瘤
已在体外确定了DuoCAR针对抗原阳性靶细胞的细胞毒性和细胞因子释放功能，然后在体内证明了DuoCAR功能。使用用萤火虫萤光素酶稳定转导的Raji细胞的NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wj1/SzJ)小鼠异种移植。包括DuoCAR D93、D94、D95和D96，以及串联对照CAR 1497和单一对照D89和D92(图25A)。在研究第7天，向荷瘤小鼠各自施用500万个CAR T细胞或200万个CAR T细胞，或者剂量匹配的UTD对照，并通过生物发光成像定期测量肿瘤排斥，直至研究第28天(图25A和25B)。在500万个细胞/小鼠的高CAR T剂量方案中，DuoCAR从第14天开始及往后，强效抑制了Raji肿瘤进展，而仅肿瘤组(TA)和未经转导T细胞组(UTD)中的肿瘤进展没有减弱。与TA和UTD阴性对照相比，由DuoCAR以及单一和串联CAR对照介导的肿瘤抑制具有统计学显著性。在研究期间，DuoCAR D93和单一CAR D89和D92倾向于产生最大的肿瘤消退，而DuoCAR D95和串联CAR 1497倾向于是CAR构建体中效力最低的。然而，该剂量水平下的独立CAR构建体之间的差异不具有统计学显著性(图25A)。为了更好地查明DuoCAR构建体之间的细微差异并测试它们在低剂量方案下是否仍具有功能，向携带Raji的小鼠各自给药200万个CAR T细胞(图25B)。尽管CAR T剂量低，但在该水平下与TA和UTD对照相比，所有CAR构建体均显著控制了Raji肿瘤负荷。尽管DuoCAR构建体或对照CAR均未显著优于其他CAR，但DuoCAR D93和D94倾向于维持最佳的肿瘤控制，而DuoCAR D96倾向于比其他CAR效力更低(图25B)。值得注意的是，与DuoCAR D93至D96相比，1497(串联CAR组)中的肿瘤消退显示出延迟，表明DuoCAR构建体在该情况下可能是优越的(图25B)。另外，单一CARD92倾向于比其他CAR构建体更快地降低肿瘤负荷(这与高效力一致)，但也在针对抗原阳性和抗原阴性靶标系的体外细胞毒性实验中观察到了该构建体的较低特异性(图23)。
三特异性DuoCAR仅需要单一抗原用于抗肿瘤功能，并且在丧失CD19、CD20或CD22的肿瘤抗原模型中强效杀伤抗原清除靶细胞。
已证明即使在200万个CAR T+个细胞/小鼠的低剂量方案下，DuoCAR在体内介导对CD19+CD20+CD22+野生型Raji异种移植的强效排斥，体外验证了每种单一抗原触发DuoCAR激活的充分性。在图21A中示意性地示出了本实验中包括的CAR构建体。实验组包括DuoCARD93、D94、D95和D96，串联CAR对照1497以及分别靶向CD22、CD19和CD20抗原的单一CAR对照D92、1538和1495(图26)。
DuoCAR被假定为作为逻辑[OR]门构建体发挥功能，例如三种靶抗原中的一种或更多种的存在足以触发CAR激活和抗肿瘤功能。然后确认在DuoCAR D93、D93、D95和D96中，三种反应性中的每一种是完整的。为此，对天然缺乏B细胞表面分子的A431鳞状细胞癌系进行工程化改造，以稳定表达CD19或CD20或CD22。为了促进对肿瘤裂解的定量，每种靶标A431系还稳定表达萤火虫萤光素酶。在体外细胞毒性测定中针对仅表达一种抗原的每种A431克隆测试DuoCAR T细胞和对照CAR，并且包括亲本A431亲本系作为阴性对照靶标(图26A至26D)。
DuoCAR D93、D93、D95和D96有效裂解各自仅表达单一抗原：CD19(图26A)、CD20(图26B)或CD22(图26C)的肿瘤，但不有效裂解缺乏这些靶分子的表达的亲本系A431(图26D)。DuoCAR对具有同源抗原表达的靶细胞的肿瘤裂解取决于效应物与靶标的比例，证明了DuoCAR构建体的精确特异性。正如预期的那样，如果靶克隆缺乏靶抗原的表达，则单一CAR不能裂解这些克隆。系A19被单一CAR191538裂解，但不被靶向CD22的单一CAR D92或靶向CD20的单一CAR 1495裂解(图26A)。类似地，靶标系A20被CAR201495裂解，但不被单一CARCD22-D92或CD19 CAR-1538裂解(图26B)。此外，只有靶向CD22的单一CAR D92和D89裂解A22靶标系，而分别靶向CD19和CD20的CAR1538和1495不裂解A22靶标系(图26C)。没有构建体裂解亲本系A431，这与该肿瘤系上CD19、CD20或CD22的表达缺乏一致(图26D)。因此，DuoCAR与靶抗原CD19、CD20、CD22中的每一种以单独的方式(独立于其他两种抗原)反应。此外，每种单一抗原CD19、CD20或CD22的单独存在足以触发DuoCAR功能。
然后表明，在肿瘤抗原逃逸模型中，Raji克隆具有清除的CD19、CD20或CD22表达，DuoCAR能够裂解靶细胞(尽管其缺乏三种靶分子中的任一种)(图26E至26G)，并且裂解幅度与亲本Raji系(其中所有三种抗原的表达是完整的)的DuoCAR裂解相当(图26H)。相比之下，单靶向CAR仅针对其中存在其同源靶标的克隆进行裂解。具体地，单一CAR 20和22(D92和1495)，而不是单一CAR 19(1538)，裂解Raji19KO(图26E)，单一CAR19和CAR22，而不是CAR20裂解Raji 20KO(图26F)以及单一CAR19和20，而不是CAR22裂解Raji 22KO系(图26G)。相比之下，单一CAR对照D92、1538或1495均未显示出对表达所有三种靶抗原的亲本Raji克隆的裂解的任何损害(图26H)。这些结果证明了DuoCAR在靶向缺乏一种靶抗原之表达的肿瘤细胞方面的优势。
肿瘤抗原逃逸(当一种或更多种靶抗原的表达减少或完全消失时)和肿瘤异质性(鉴于单一药剂/CAR由于靶抗原的异质性表达而不能靶向全部肿瘤细胞群)仍是CAR T免疫治疗的主要障碍。为了证明DuoCAR对抗已经失去其一些靶抗原之表达的肿瘤的能力，产生了异质性异种移植肿瘤模型(图27)。向NSG小鼠植入等比例的萤光素酶阳性、抗原缺失的Raji克隆：Raji19KO、Raji 20KO、Raji 22KO以及亲本Raji克隆的混合物。在肿瘤植入之后7天，用500万个CAR T+DuoCAR细胞或者靶向CD19、CD20或CD22的单一CAR对照处理小鼠。通过生物发光测量肿瘤负荷。引人注目的是，从研究第14天开始及往后，DuoCAR D93、D94、D95或D96已完全排斥异质性Raji肿瘤。相比之下，接受单靶向CAR CAR19-1538、CAR20-1495或CAR22-D92的小鼠中肿瘤继续生长(图27)。
总之，在此描述了能够产生高功能性、三重靶向的CAR T细胞的四种新的DuoCAR设计D93、D94、D95和D96。DuoCAR T细胞在体外和体内以高特异性与CD19、CD20和CD22抗原反应，并在具有CD19、CD20和CD22的不同表达的散布性体内异种移植Raji肿瘤模型中表现出极强的功能和完全肿瘤排斥，而在该肿瘤抗原逃逸模型中，单靶向CAR不能阻止肿瘤进展。因此，DuoCAR T细胞代表了解决抗原异质性肿瘤群和减轻肿瘤抗原逃逸的新的解决方案，并且因此为改善经CAR T治疗的患者群的临床结局提供了机会。
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本公开内容的序列
下面列出的核酸和氨基酸序列使用如37 C.F.R 1.822中定义的核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母密码示出。仅示出了每个核酸序列的一条链，但应理解，互补链通过参考所示出的链也包含在内。在所附的序列表中：
SEQ ID NO：1 CD20-反应性scFv结合结构域(LTG1495)的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010000921
SEQ ID NO：2 CD20-反应性scFv结合结构域(LTG1495)的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010000931
SEQ ID NO：3 CAR LTG1495(LP-1495-CD8 TM-41BB-CD3ζ)的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010000932
SEQ ID NO：4 CAR LTG1495(LP-1495-CD8 TM-41BB-CD3ζ)的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010000933
SEQ ID NO：5前导/信号肽序列的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010000941
SEQ ID NO：6前导/信号肽序列的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010000942
SEQ ID NO：7 CD22-反应性scFv结合结构域(LTG2200)的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010000943
SEQ ID NO：8 CD22-反应性scFv结合结构域(LTG2200)的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010000944
SEQ ID NO：9 CAR LTG2200(LP-2200-CD8 TM-41BB-CD3ζ)的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010000951
SEQ ID NO：10 CAR LTG2200(LP-2200-CD8 TM-41BB-CD3ζ)的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010000952
SEQ ID NO：11 DNA CD8跨膜结构域的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010000953
SEQ ID NO：12 CD8跨膜结构域的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010000961
SEQ ID NO：13 DNA CD8铰链结构域的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010000962
SEQ ID NO：14 CD8铰链结构域的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010000963
SEQ ID NO：15 CD8.α.(NCBI RefSeq：NP.sub.--001759.3)的铰链和跨膜区的第137至206位氨基酸的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010000964
SEQ ID NO：16人IgG CL序列的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010000965
SEQ ID NO：17 4-1BB的DNA信号传导结构域的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010000966
SEQ ID NO：18 4-1BB的信号传导结构域的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010000967
SEQ ID NO：19 CD3-ζ的DNA信号传导结构域的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010000968
SEQ ID NO：20 CD3ζ的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010000969
SEQ ID NO：21 CAR LTG1562(LP-CD19结合物-CD8接头-CD4tm-4-1BB-CD3-ζ)的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010000971
SEQ ID NO：22 CAR LTG1562(LP-CD19结合物-CD8接头-CD4tm-41BB-CD3ζ)的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010000972
SEQ ID NO：23 CD20_19反应性scFv结合结构域(LTG1497双特异性结合物)的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010000981
SEQ ID NO：24 CD20_19反应性scFv结合结构域(LTG1497双特异性结合物)的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010000982
SEQ ID NO：25 CAR LTG1497(LP-LTG1497-CD8 TM-41BB-CD3ζ)或(LP-CD20 VH-(GGGGS)3-CD20 VL-(GGGGS)5-CD19VL-Whitlow接头-CD19 VH-CD8铰链+TM-41BB-CD3ζ)的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010000991
SEQ ID NO：26 CAR LTG1497(LP-LTG1497-CD8 TM-41BB-CD3ζ)或(LP-CD20 VH(GGGGS)3-CD20 VL-(GGGGS)5-CD19 VL-Whitlow接头-CD19 VH-CD8铰链+TM-41BB-CD3ζ)的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010001001
SEQ ID NO：27 CD19的scFV的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010001002
SEQ ID NO：28 CD19的scFV的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010001003
SEQ ID NO：29 CAR LTG 1494(LP-CD19结合物-CD8接头-CD8tm-41BB-CD3ζ)的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010001011
SEQ ID NO：30 CAR LTG1494(LP-CD19结合物-CD8接头-CD8tm-41BB-CD3ζ)的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010001012
SEQ ID NO：31 CAR LTG1538(LP-CD19结合物-CD8接头-CD8tm-信号(LTI重工程化改造的CD19 CAR)的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010001021
SEQ ID NO：32 CAR LTG1538(LP-CD19结合物-CD8接头-CD8tm-信号(LTI重工程化改造的CD19 CAR)的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010001022
SEQ ID NO：33 CD19_20反应性scFv结合结构域(LTG1496)的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010001031
SEQ ID NO：34 CD19_20反应性scFv结合结构域(LTG1496)的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010001032
SEQ ID NO：35 CAR LTG1496(LP-LTG1496-CD8 TM-41BB-CD3ζ)或(LP-CD19 VL-Whitlow接头-CD19 VH(GGGGS)5 CD20 VH(GGGGS)3-CD20 VL CD8铰链+TM-41BB-CD3ζ)的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010001041
SEQ ID NO：36 CAR LTG1496(LP-LTG1496-CD8 TM-41BB-CD3ζ)或(LP-CD19 VL-Whitlow接头-CD19 VH-(GGGGS)5 CD20 VH(GGGGS)3-CD20 VL-CD8铰链+TM-41BB-CD3ζ的氨基酸序列)：
Figure BPA0000324003010001051
SEQ ID NO：37间皮素-反应性scFv结合结构域(LTG1904)的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010001052
SEQ ID NO：38间皮素-反应性scFv结合结构域(LTG1904)的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010001053
SEQ ID NO：39 CAR LTG1904(LP-LTG1904-CD8 TM-41BB-CD3ζ)的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010001061
SEQ ID NO：40 CAR LTG1904(LP-LTG1904-CD8 TM-41BB-CD3ζ)的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010001062
SEQ ID NO：41 CD33-反应性单链结合结构域VH-4(LTG1906)的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010001071
SEQ ID NO：42 CD33-反应性单链结合结构域VH-4(LTG1906)的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010001072
SEQ ID NO：43 CAR LTG1906(LP-VH4-CD8 TM-41BB-CD3ζ)的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010001073
SEQ ID NO：44 CAR LTG1906(LP-VH4-CD8 TM-41BB-CD3ζ)的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010001074
Figure BPA0000324003010001081
SEQ ID NO：45TSLPR-反应性scFv结合结构域(LTG1789)的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010001082
SEQ ID NO：46TSLPR-反应性scFv结合结构域(LTG1789)的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010001083
SEQ ID NO：47 CAR LTG1789(LP-3G11-CD8 TM-41BB-CD3ζ)的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010001084
Figure BPA0000324003010001091
SEQ ID NO：48 CAR LTG1789(LP-3G11-CD8 TM-41BB-CD3ζ)的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010001092
SEQ ID NO：49 CAR LTG1563(LP-CD19-TNFRSF19TM-41BB-CD3ζ)的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010001093
Figure BPA0000324003010001101
SEQ ID NO：50 CAR LTG1563(LP-CD19-TNFRSF19TM-41BB-CD3ζ)的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010001102
SEQ ID NO：51 CAR LTG2228(LP-CD20_CD19-CD8TM-CD28-CD3ζ)的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010001103
Figure BPA0000324003010001111
SEQ ID NO：52 CAR LTG2228(LP-CD20_CD19-CD8TM-CD28-CD3ζ)的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010001112
SEQ ID NO：53 D0043的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010001113
Figure BPA0000324003010001121
Figure BPA0000324003010001131
SEQ ID NO：54 D0043的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010001132
SEQ ID NO：55 D0044的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010001133
Figure BPA0000324003010001141
Figure BPA0000324003010001151
SEQ ID NO：56 D0044的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010001152
SEQ ID NO：59 D0046的核苷酸序列
Figure BPA0000324003010001153
Figure BPA0000324003010001161
Figure BPA0000324003010001171
SEQ ID NO：60 D0046的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010001172
SEQ ID NO：61 D0047的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010001173
Figure BPA0000324003010001181
Figure BPA0000324003010001191
SEQ ID NO：62 D0047的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010001192
SEQ ID NO：65 D0001的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010001201
SEQ ID NO：66 D0001的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010001202
SEQ ID NO：67 D0002的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010001203
Figure BPA0000324003010001211
SEQ ID NO：68 D0002的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010001212
SEQ ID NO：69 D0003的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010001213
Figure BPA0000324003010001221
SEQ ID NO：70 D0003的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010001222
SEQ ID NO：73 LTG2273的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010001223
Figure BPA0000324003010001231
SEQ ID NO：74 LTG2273的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010001232
SEQ ID NO：75 LTG2200的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010001233
Figure BPA0000324003010001241
SEQ ID NO：76 LTG2200的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010001242
SEQ ID NO：77 GMCSF前导肽的核苷酸序列：
Figure BPA0000324003010001243
SEQ ID NO：78 GMCSF前导肽的氨基酸序列：
Figure BPA0000324003010001244
SEQ ID NO：79 CD8a前导肽的核苷酸序列
Figure BPA0000324003010001251
SEQ ID NO：80 CD8a前导肽的氨基酸序列
Figure BPA0000324003010001252
SEQ ID NO：81 CD8铰链和跨膜结构域的核苷酸序列
Figure BPA0000324003010001253
SEQ ID NO：82 CD8铰链和跨膜结构域的氨基酸序列
Figure BPA0000324003010001254
SEQ ID NO：83 4-1BB/CD137共刺激结构域的核苷酸序列
Figure BPA0000324003010001255
SEQ ID NO：84 4-1BB/CD137共刺激结构域的氨基酸序列
Figure BPA0000324003010001256
SEQ ID NO：85 CD28共刺激结构域核苷酸序列的核苷酸序列
Figure BPA0000324003010001257
SEQ ID NO：86 CD28共刺激结构域的氨基酸序列
Figure BPA0000324003010001258
SEQ ID NO：87 CD3ζ的核苷酸序列
Figure BPA0000324003010001259
SEQ ID NO：88 CD3ζ的氨基酸序列
Figure BPA0000324003010001261
SEQ ID NO：89弗林蛋白酶P2A弗林蛋白酶的核苷酸序列
Figure BPA0000324003010001262
SEQ ID NO：90弗林蛋白酶P2A弗林蛋白酶的氨基酸序列
Figure BPA0000324003010001263
SEQ ID NO：95 16P17 CD22scFvVH的核苷酸序列
Figure BPA0000324003010001264
SEQ ID NO：96 16P17 CD22 scFv VH的氨基酸序列
Figure BPA0000324003010001265
SEQ ID NO：97 16P17 CD22 scFv VL的核苷酸序列
Figure BPA0000324003010001266
SEQ ID NO：98 16P17 CD22 scFv VL的氨基酸序列
Figure BPA0000324003010001267
SEQ ID NO：99 16P8 CD22 scFv VH的核苷酸序列
Figure BPA0000324003010001271
SEQ ID NO：100 16P8 CD22 scFv VH的氨基酸序列
Figure BPA0000324003010001272
SEQ ID NO：101 16P8 CD22 scFv VL的核苷酸序列
Figure BPA0000324003010001273
SEQ ID NO：102 16P8 CD22 scFv VL的氨基酸序列
Figure BPA0000324003010001274
SEQ ID NO：103 16P13 CD22 scFv VH的核苷酸序列
Figure BPA0000324003010001275
SEQ ID NO：104 16P13 CD22 scFv VH的氨基酸序列
Figure BPA0000324003010001276
SEQ ID NO：105 16P13 CD22 scFv VL的核苷酸序列
Figure BPA0000324003010001281
SEQ ID NO：106 16P13 CD22 scFv VL的氨基酸序列
Figure BPA0000324003010001282
SEQ ID NO：107 Whitlow接头的氨基酸序列
Figure BPA0000324003010001283
SEQ ID NO：108柔性链间接头的氨基酸序列
Figure BPA0000324003010001284
SEQ ID NO：109 LTG 2948 DuoCAR D93 CAR2019 ICOZz 2A CAR22z的核苷酸序列
Figure BPA0000324003010001285
Figure BPA0000324003010001291
Figure BPA0000324003010001301
SEQ ID NO：110 LTG 2948 DuoCAR D93 CAR2019 ICOZz 2A CAR22z的氨基酸序列
Figure BPA0000324003010001302
SEQ ID NO：111 LTG 2949 DuoCAR D94 CAR2019 OX40z 2A CAR22z的核苷酸序列
Figure BPA0000324003010001303
Figure BPA0000324003010001311
Figure BPA0000324003010001321
SEQ ID NO：112 LTG 2949 DuoCAR D94 CAR2019 OX40z 2A CAR22z的氨基酸序列
Figure BPA0000324003010001322
SEQ ID NO：113 LTG 2950 DuoCAR D95 CAR2019 OX40z 2A CAR22 ICOSz的核苷酸序列
Figure BPA0000324003010001323
Figure BPA0000324003010001331
Figure BPA0000324003010001341
SEQ ID NO：114 LTG 2950 DuoCAR D95 CAR2019 OX40z 2A CAR22 ICOSz的氨基酸序列
Figure BPA0000324003010001342
SEQ ID NO：115 LTG 2951 DuoCAR D96 CAR2019 27z 2A CAR22 ICOSz的核苷酸序列
Figure BPA0000324003010001351
Figure BPA0000324003010001361
SEQ ID NO：116 LTG2951 DuoCAR D96 CAR2019 27z 2A CAR22 ICOSz的氨基酸序列
Figure BPA0000324003010001362
Figure BPA0000324003010001371
SEQ ID NO：117 D088 CAR2019 ICOSz的核苷酸序列
Figure BPA0000324003010001372
SEQ ID NO：118 D088 CAR2019 ICOSz的氨基酸序列
Figure BPA0000324003010001381
SEQ ID NO：119 D089 CAR22 ICOSz的核苷酸序列
Figure BPA0000324003010001382
SEQ ID NO：120 D089 CAR22 ICOSz的氨基酸序列
Figure BPA0000324003010001391
SEQ ID NO：121 D090 CAR2019 OX40z的核苷酸序列
Figure BPA0000324003010001392
Figure BPA0000324003010001401
SEQ ID NO：122 D090 CAR2019 OX40z的氨基酸序列
Figure BPA0000324003010001402
SEQ ID NO：123 D091 CAR2019 CD27z的核苷酸序列
Figure BPA0000324003010001403
Figure BPA0000324003010001411
SEQ ID NO：124 D091 CAR2019 CD27z的氨基酸序列
Figure BPA0000324003010001412
SEQ ID NO：125 D92 CAR22z的核苷酸序列
Figure BPA0000324003010001413
Figure BPA0000324003010001421
SEQ ID NO：126 D92 CAR22z的氨基酸序列
Figure BPA0000324003010001422
Figure IPA0000323630920000011
Figure IPA0000323630920000021
Figure IPA0000323630920000031
Figure IPA0000323630920000041
Figure IPA0000323630920000051
Figure IPA0000323630920000061
Figure IPA0000323630920000071
Figure IPA0000323630920000081
Figure IPA0000323630920000091
Figure IPA0000323630920000101
Figure IPA0000323630920000111
Figure IPA0000323630920000121
Figure IPA0000323630920000131
Figure IPA0000323630920000141
Figure IPA0000323630920000151
Figure IPA0000323630920000161
Figure IPA0000323630920000171
Figure IPA0000323630920000181
Figure IPA0000323630920000191
Figure IPA0000323630920000201
Figure IPA0000323630920000211
Figure IPA0000323630920000221
Figure IPA0000323630920000231
Figure IPA0000323630920000241
Figure IPA0000323630920000251
Figure IPA0000323630920000261
Figure IPA0000323630920000271
Figure IPA0000323630920000281
Figure IPA0000323630920000291
Figure IPA0000323630920000301
Figure IPA0000323630920000311
Figure IPA0000323630920000321
Figure IPA0000323630920000331
Figure IPA0000323630920000341
Figure IPA0000323630920000351
Figure IPA0000323630920000361
Figure IPA0000323630920000371
Figure IPA0000323630920000381
Figure IPA0000323630920000391
Figure IPA0000323630920000401
Figure IPA0000323630920000411
Figure IPA0000323630920000421
Figure IPA0000323630920000431
Figure IPA0000323630920000441
Figure IPA0000323630920000451
Figure IPA0000323630920000461
Figure IPA0000323630920000471
Figure IPA0000323630920000481
Figure IPA0000323630920000491
Figure IPA0000323630920000501
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Claims (37)

1.免疫治疗组合物，其包含编码至少一种多顺反子载体的一种或更多种分离的核酸分子，每种多顺反子载体编码至少一种功能性CAR，所述功能性CAR包含SEQ ID NO：54、56、60、62、110、112、114或116的氨基酸序列，其中至少一种所述多顺反子载体中的至少一个结合结构域是不同的，并且因此多顺反子载体的组合导致两种或更多种不同功能性CAR分子的表达，并且其中每个功能性CAR分子编码与跨膜结构域和一个或更多个不同的胞内信号传导基序共价连接的至少一个结合结构域。
2.免疫治疗组合物，其包含：
(a)至少一种多顺反子载体，每种多顺反子载体包含在细胞中有功能的核酸序列；
(b)其中每种多顺反子载体编码功能性CAR分子，所述功能性CAR分子包含SEQ ID NO：54、56、60、62、110、112、114或116的氨基酸序列；
(c)其中每个功能性CAR分子包含至少一个结合结构域、单跨膜结构域和至少一个胞内信号传导基序；
(d)其中所述功能性CAR分子之一中的所述至少一个结合结构域是不同的；并且
(e)其中在每个所述功能性car分子中，所述至少一个结合结构域、单跨膜结构域、至少一个接头结构域和至少一个胞内信号传导基序共价连接，其中功能性CAR分子的组合用于遗传修饰一个或更多个淋巴细胞群。
3.免疫治疗组合物，其包含：
(a)至少一种多顺反子载体，每种多顺反子载体包含在细胞中有功能的核酸序列；
(b)其中每种多顺反子载体编码一种或更多种包含SEQ ID NO：54、56、60、62、110、112、114或116的氨基酸序列的功能性CAR；
(c)其中每个功能性CAR分子包含至少一个结合结构域、单跨膜结构域和至少一个胞内信号传导基序；
(d)其中每个CAR中的所述至少一个结合结构域与另一个功能性CAR分子中的至少一个结合结构域是不同的；
(e)其中所述至少一个信号传导基序在以多顺反子方式共表达的各功能性CAR分子之间是不同的；并且
(f)其中在每种所述多顺反子载体中，所述至少一个结合结构域、单跨膜结构域和至少一个胞内信号传导基序共价连接，其中一种或更多种多顺反子载体用于遗传修饰一个或更多个淋巴细胞群。
4.权利要求1至3所述的免疫治疗组合物，其中每种多顺反子载体编码多于一种包含SEQ ID NO：54、56、60、62、110、112、114或116的氨基酸序列的功能性CAR。
5.权利要求2或3所述的免疫治疗组合物，其中所述淋巴细胞群包含自体T细胞或包含外周血来源淋巴细胞的混合物。
6.权利要求2或3所述的免疫治疗组合物，其中所述功能性CAR分子的至少一个胞外抗原结合结构域包含与抗原结合之抗体的至少一个单链可变片段。
7.权利要求2或3所述的免疫治疗组合物，其中所述功能性分子CAR的至少一个胞外抗原结合结构域包含与抗原结合之抗体的至少一个重链可变区。
8.权利要求2或3所述的免疫治疗组合物，其中所述功能性分子CAR的至少一个胞外抗原结合结构域、所述CAR的至少一个胞内信号传导结构域或这二者通过接头或间隔区结构域与所述跨膜结构域连接。
9.权利要求2或3所述的免疫治疗组合物，其中所述功能性CAR分子的胞外抗原结合结构域的前面是前导肽。
10.权利要求2或3所述的免疫治疗组合物，其中所述CAR的胞外抗原结合结构域靶向抗原，所述抗原包含：CD19、CD20、CD22、ROR1、TSLPR、间皮素、CD33、CD38、CD123(IL3RA)、CD138、BCMA(CD269)、GPC2、GPC3、FGFR4、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3 TCR、或其任意组合。
11.权利要求2或3所述的免疫治疗组合物，其中所述CAR的胞外抗原结合结构域包含：抗CD19 scFV抗原结合结构域、抗CD20 scFV抗原结合结构域、抗CD22 scFV抗原结合结构域、抗ROR1 scFV抗原结合结构域、抗TSLPR scFV抗原结合结构域、抗间皮素scFV抗原结合结构域、抗CD33 scFV抗原结合结构域、抗CD38 scFV抗原结合结构域、抗CD123(IL3RA)scFV抗原结合结构域、抗CD138 scFV抗原结合结构域、抗BCMA(CD269)scFV抗原结合结构域、抗GPC2 scFV抗原结合结构域、抗GPC3 scFV抗原结合结构域、抗FGFR4 scFV抗原结合结构域、抗c-Met scFV抗原结合结构域、抗PMSA scFV抗原结合结构域、抗糖脂F77 scFV抗原结合结构域、抗EGFRvIII scFV抗原结合结构域、抗GD-2 scFV抗原结合结构域、抗NY-ESo-1 TCRscFV抗原结合结构域、抗MAGE A3 TCR scFV抗原结合结构域，或与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其任意组合。
12.权利要求2或3所述的免疫治疗组合物，其中所述功能性CAR分子的所述接头或间隔区结构域来源于CD8的胞外结构域，并与所述跨膜结构域连接。
13.权利要求2或3所述的免疫治疗组合物，其中所述功能性CAR分子还包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自以下的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD271、TNFRSF19、或其任意组合。
14.权利要求2或3所述的免疫治疗组合物，其中所述至少一个胞内信号传导结构域还包含CD3ζ胞内结构域。
15.权利要求2或3所述的免疫治疗组合物，其中所述至少一个胞内信号传导结构域相对于所述CD3ζ胞内结构域设置在C端侧。
16.权利要求2或3所述的免疫治疗组合物，其中所述至少一个胞内信号传导结构域包含共刺激结构域、主要信号传导结构域、或其任意组合。
17.权利要求16所述的免疫治疗组合物，其中所述至少一个共刺激结构域包含OX40、CD70、CD27、CD28、CD5、ICAM-I、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、DAP1O、DAP12和4-1BB(CD137)的功能性信号传导结构域、或其任意组合。
18.权利要求1至3所述的免疫治疗组合物，其中用单一病毒载体编码所有嵌合抗原受体(例如，慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、SV40载体、疱疹病毒载体、POX载体或黏粒载体)，与CRISPR系统组合用于整合。
19.权利要求1至3所述的免疫治疗组合物，其中每种多顺反子载体是RNA载体或DNA载体。
20.权利要求1至3所述的免疫治疗组合物，其中至少一种多顺反子载体表达调节细胞中核酸表达的核酸分子。
21.权利要求20所述的治疗组合物，其中所述核酸分子抑制或删除内源基因的表达。
22.药物组合物，其包含抗肿瘤有效量的人淋巴细胞群，其中所述群的细胞包含含有以下的细胞：编码至少一种多顺反子载体的核酸分子，每种多顺反子载体编码功能性CAR，所述功能性CAR包含SEQ ID NO：54、56、60、62、110、112、114或116的氨基酸序列，其中一种所述多顺反子载体中的至少一个结合结构域是不同的，并且因此多顺反子载体的组合导致两种或更多种不同结合结构域的表达，其中每种多顺反子载体所编码的结合结构域与跨膜结构域和一个或更多个不同的胞内信号传导基序共价连接。
23.药物组合物，其包含抗肿瘤有效量的人淋巴细胞群，其中所述群的细胞包含含有以下的细胞：(a)编码一种或更多种多顺反子载体的核酸分子；(b)其中每种多顺反子载体编码功能性CAR，所述功能性CAR包含SEQ ID NO：54、56、60、62、110、112、114或116的氨基酸序列；(c)其中每个功能性CAR分子包含至少一个结合结构域、至少一个跨膜结构域、至少一个接头结构域和至少一个胞内信号传导基序；(d)其中一种所述多顺反子载体中的所述至少一个结合结构域是不同的；并且(e)其中在每种所述多顺反子载体中，所述至少一个结合结构域、单跨膜结构域、至少一个接头结构域和至少一个胞内信号传导基序共价连接，其中多顺反子载体的组合用于遗传修饰一个或更多个淋巴细胞群。
24.药物组合物，其包含抗肿瘤有效量的人淋巴细胞群，其中所述群的细胞包含含有以下的细胞：(a)编码一种或更多种多顺反子载体的核酸分子；(b)其中每种多顺反子载体编码功能性CAR，所述功能性CAR包含SEQ ID NO：54、56、60、62、110、112、114或116的氨基酸序列；(c)其中每个功能性CAR分子包含至少一个结合结构域、至少一个跨膜结构域、至少一个接头结构域和至少一个胞内信号传导基序；(d)其中每种载体中的所述至少一个结合结构域是不同的；(e)其中所述至少一个信号传导基序组合在各多顺反子载体之间是不同的；并且(f)其中在每种所述多顺反子载体中所述至少一个结合结构域、单跨膜结构域、至少一个接头结构域和至少一个胞内信号传导基序共价连接，其中一种或更多种多顺反子载体的组合用于遗传修饰一个或更多个淋巴细胞群。
25.权利要求23或24所述的药物组合物，其中所述淋巴细胞是患有血癌的人的T细胞。
26.权利要求23或24所述的药物组合物，其中所述血癌是白血病或淋巴瘤。
27.权利要求23或24所述的药物组合物，其中所述白血病是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)或慢性髓细胞性白血病(CML)。
28.权利要求23或24所述的药物组合物，其中所述淋巴瘤是套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤。
29.权利要求23或24所述的药物组合物，其中所述血癌是多发性骨髓瘤。
30.权利要求23或24所述的药物组合物，其中人癌症包括成人上皮癌，其包括口腔和咽癌症(舌、口、咽、头和颈)、消化系统癌症(食管、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝、肝内胆管、胆囊、胰腺)、呼吸系统癌症(喉、肺和支气管)、骨和关节癌症、软组织癌症、皮肤癌症(黑素瘤、基底和鳞状细胞癌)、儿童肿瘤(神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤)、中枢神经系统肿瘤(脑、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、胶质瘤)，以及乳腺、生殖系统(子宫颈、子宫体、卵巢、外阴、阴道、前列腺、睾丸、阴茎、子宫内膜)、泌尿系统(膀胱、肾和肾盂、输尿管)、眼和眶、内分泌系统(甲状腺)以及脑和其他神经系统的癌症、或其任意组合。
31.治疗患有与肿瘤抗原的表达升高相关的疾病、障碍或病症的哺乳动物的方法，所述方法包括向对象施用药物组合物，所述药物组合物包含至少一种多顺反子载体和可药用赋形剂，每种载体编码包含SEQ ID NO：54、56、60、62、110、112、114或116的氨基酸序列的功能性CAR，其中一种所述多顺反子载体中的至少一个结合结构域是不同的，并且因此多顺反子载体的组合导致两种或更多种不同结合结构域的表达，其中每种载体所编码的结合结构域与跨膜结构域和一个或更多个不同的胞内信号传导基序共价连接，其中多顺反子载体的组合用于遗传修饰一个或更多个淋巴细胞群。
32.治疗患有与肿瘤抗原的表达升高相关的疾病、障碍或病症的哺乳动物的方法，所述方法包括向对象施用药物组合物，所述药物组合物包含(a)编码两种或更多种载体的核酸分子；(b)其中每种载体编码包含SEQ ID NO：54、56、60、62、110、112、114或116的氨基酸序列的功能性CAR；(c)其中每个功能性CAR分子包含至少一个结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导基序；(d)其中一种所述多顺反子载体中的所述至少一个结合结构域是不同的；并且(e)其中在每种所述多顺反子载体中，所述至少一个结合结构域、单跨膜结构域和至少一个胞内信号传导基序共价连接，其中多顺反子载体的组合用于遗传修饰一个或更多个淋巴细胞群。
33.治疗患有与肿瘤抗原的表达升高相关的疾病、障碍或病症的哺乳动物的方法，所述方法包括向对象施用药物组合物，所述药物组合物包含(a)编码一种或更多种多顺反子载体的核酸分子；(b)其中每种多顺反子载体编码包含SEQ ID NO：54、56、60、62、110、112、114或116的氨基酸序列的功能性CAR；(c)其中每个功能性CAR分子包含至少一个结合结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞内信号传导基序；(d)其中每种多顺反子载体中的所述至少一个结合结构域是不同的；(e)其中所述至少一个信号传导基序组合在各多顺反子载体之间是不同的；并且(f)其中在每种所述多顺反子载体中，所述至少一个结合结构域、单跨膜结构域和至少一个胞内信号传导基序共价连接，其中一种或更多种多顺反子载体的组合用于遗传修饰一个或更多个淋巴细胞群。
34.权利要求31至33所述的方法，其中进行遗传修饰的淋巴细胞是自体淋巴细胞，并且其中将所述自体淋巴细胞或同种异体淋巴细胞直接输注回到患者中以预防恶性疾病复发。
35.权利要求31至33所述的方法，其中进行遗传修饰的淋巴细胞是自体T细胞，并且其中将所述自体T细胞直接输注回到患者中以促进患者特异性抗肿瘤T细胞的体内扩增、持续，导致以患者特异性方式发生肿瘤稳定化、减退、消除、缓解，或者癌症或癌症复发的消除。
36.权利要求31至33所述的方法，其中T细胞已通过表达特异性活化或记忆相关表面标志物进行预选。
37.权利要求31至33所述的方法，其中T细胞和树突细胞来源于造血干细胞供体，并且其中该过程在造血干细胞移植的情况下进行。
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