JP7269733B2 - 操作されたｔ細胞を用いて癌を処置するための方法 - Google Patents

操作されたｔ細胞を用いて癌を処置するための方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１５年６月１２日出願の米国仮特許出願第６２／１７５，００３号に対する優先権の利益を主張する。
開示の分野
本出願は、癌の分野、特に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が形質導入された自家Ｔ細胞と共培養された、患者特異的変異癌転写物を発現するレンチウイルスベクターが形質導入された自家抗原提示細胞を含む組成物、ならびに患者特異的併用免疫療法における使用の方法に関する。
発明の背景
癌は、ヒトの健康に対する重大な脅威の１つである。米国だけで、癌は毎年ほぼ１３０万人の新たな患者が罹患し、心血管疾患に次いで２番目に多い死因であり、死亡数の約４分の１を占めている。固形腫瘍が、これらの死亡のほとんどの原因である。ある特定の癌の医学的処置においては顕著な進歩があったものの、全ての癌についての５年全生存率は過去２０年間で約１０％しか改善しなかった。癌または悪性腫瘍は、制御されずに迅速に転移および成長し、処置を非常に困難にする。現代の癌処置における困難の１つは、患者の生検および癌の診断ならびに有効な処置の間に経過する時間である。この時間の間に、患者の腫瘍は妨げなしに成長する可能性があり、その結果、疾患は、処置が適用される前にさらに進行してしまう。これは、癌の予後および転帰に負の影響を与える。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、３つの本質的な単位を含むハイブリッド分子である：（１）細胞外抗原結合性モチーフ、（２）連結／膜貫通モチーフ、および（３）細胞内Ｔ細胞シグナル伝達モチーフ（Ｌｏｎｇ ＡＨ，Ｈａｓｏ ＷＭ，Ｏｒｅｎｔａｓ ＲＪ．Ｌｅｓｓｏｎｓ ｌｅａｒｎｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｈｉｇｈｌｙ－ａｃｔｉｖｅ ＣＤ２－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１３年；２巻（４号）：ｅ２３６２１頁（非特許文献１））。ＣＡＲの抗原結合性モチーフは一般に、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の最小の結合性ドメインである単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を基にして作られる。代替の抗原結合性モチーフとして、例えば、受容体リガンド（即ち、ＩＬ－１３は、腫瘍が発現するＩＬ－１３受容体に結合するように操作されている）、インタクトな免疫受容体、ライブラリー由来ペプチド、および自然免疫系エフェクター分子（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）も操作されている。ＣＡＲ発現のための代替の細胞標的（例えば、ＮＫまたはガンマ－デルタＴ細胞）も開発中である（Ｂｒｏｗｎ ＣＥら Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１２年；１８巻（８号）：２１９９～２０９頁（非特許文献２）；Ｌｅｈｎｅｒ Ｍら ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２年；７巻（２号）：ｅ３１２１０頁（非特許文献３））。ＣＡＲベクターを形質導入するための最も活性なＴ細胞集団を定義すること、最適な培養および増殖の技術を決定すること、ならびにＣＡＲタンパク質構造自体の分子的詳細を定義することに関して、いまだにかなりの労力を要している。
ＣＡＲの連結モチーフは、ＩｇＧの定常ドメインなどの比較的安定な構造ドメインとするか、または伸長された可撓性リンカーとなるように設計することができる。ＩｇＧの定常ドメインに由来するものなどの構造モチーフを使用して、ｓｃＦｖ結合性ドメインをＴ細胞原形質膜表面から離れて延在させることができる。これは、結合性ドメインが腫瘍細胞表面膜に特に近い一部の腫瘍標的にとって重要であり得る（例えば、ジシアロガングリオシドＧＤ２にとって；Ｏｒｅｎｔａｓら、未公開の観察）。今日まで、ＣＡＲにおいて使用されるシグナル伝達モチーフは常にＣＤ３－ζ鎖を含んでいるが、それは、このコアモチーフが、Ｔ細胞活性化のための重要なシグナルであるからである。最初に報告された第２世代ＣＡＲは、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８膜貫通配列を特徴としていた。このモチーフは、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）シグナル伝達モチーフを含有する第３世代ＣＡＲでも同様に使用された（Ｚｈａｏ Ｙら Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９年；１８３巻（９号）：５５６３～７４頁（非特許文献４））。新たなテクノロジーの進歩に伴い、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体に連結されたビーズによるＴ細胞の活性化、ならびにＣＤ２８由来のカノニカルな「シグナル２」の存在がＣＡＲ自体によってコードされる必要はもはやなくなった。ビーズ活性化を使用して、第３世代ベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて第２世代ベクターよりも優れているわけではないことが見出され、また、白血病のマウスモデルにおいては第２世代ベクターを超える明らかな利益は得られなかった（Ｈａｓｏ Ｗ，Ｌｅｅ ＤＷ，Ｓｈａｈ ＮＮ，Ｓｔｅｔｌｅｒ－Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ Ｍ，Ｙｕａｎ ＣＭ，Ｐａｓｔａｎ ＩＨ，Ｄｉｍｉｔｒｏｖ ＤＳ，Ｍｏｒｇａｎ ＲＡ，ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ ＤＪ，Ｂａｒｒｅｔｔ ＤＭ，Ｗａｙｎｅ ＡＳ，Ｍａｃｋａｌｌ ＣＬ，Ｏｒｅｎｔａｓ ＲＪ．Ａｎｔｉ－ＣＤ２２－ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｂ ｃｅｌｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ．２０１３年；１２１巻（７号）：１１６５～７４頁（非特許文献５）；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ＪＮら Ｂｌｏｏｄ．２０１２年；１１９巻（１２号）：２７０９～２０頁（非特許文献６））。これは、第２世代ＣＤ２８／ＣＤ３－ζ（Ｌｅｅ ＤＷら Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ．Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ，ＬＡ；１２月７～１０日、２０１３年（非特許文献７））およびＣＤ１３７／ＣＤ３－ζシグナル伝達形式（Ｐｏｒｔｅｒ ＤＬら Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１１年；３６５巻（８号）：７２５～３３頁（非特許文献８））のＣＤ１９特異的ＣＡＲの臨床的成功によって裏付けられている。ＣＤ１３７に加えて、ＯＸ４０などの他の腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーも、ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞において重要な持続シグナルを提供することができる（Ｙｖｏｎ Ｅら Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９年；１５巻（１８号）：５８５２～６０頁（非特許文献９））。ＣＡＲ Ｔ細胞集団が培養された培養条件も等しく重要である。
癌に対するＣＡＲ療法のより広範で有効な適応における現在の課題は、説得力のある標的の不足に関する。細胞表面抗原への結合因子を創出することは、現在容易に達成可能であるが、正常組織を見逃しながら腫瘍に対して特異的な細胞表面抗原を発見することは、依然として厄介な課題である。ＣＡＲ発現Ｔ細胞により高い標的細胞特異性を与えるための１つの潜在的な方法は、コンビナトリアルＣＡＲアプローチを使用することである。１つのシステムでは、ＣＤ３－ζとＣＤ２８シグナル単位が、同じ細胞において発現される２つの異なるＣＡＲ構築物間で分割される；別のシステムでは、２つのＣＡＲが、同じＴ細胞において発現されるが、一方はより低い親和性を有し、したがって第２のＣＡＲの完全な活性のために代替的ＣＡＲが最初に結合されることを必要とする（Ｌａｎｉｔｉｓ Ｅら Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２０１３年；１巻（１号）：４３～５３頁（非特許文献１０）；Ｋｌｏｓｓ ＣＣら Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３年；３１巻（１号）：７１～５頁（非特許文献１１））。免疫療法剤としての単一のｓｃＦｖベースのＣＡＲの生成のための第２の課題は、腫瘍細胞の不均一性である。少なくとも１つのグループは、標的抗原陰性集団の成長を回避することを期待して、エフェクター細胞集団が複数の抗原（ＨＥＲ２、ＩＬ－１３Ｒａ、ＥｐｈＡ２）を同時に標的化する、神経膠芽腫のためのＣＡＲ戦略を開発している（Ｈｅｇｄｅ Ｍら Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１３年；２１巻（１１号）：２０８７～１０１頁（非特許文献１２））。
Ｔ細胞ベースの免疫療法は、合成生物学における新たな領域になっている；複数のプロモーターおよび遺伝子産物は、これらの高度に強力な細胞を腫瘍微小環境に導くことが想定され、ここで、Ｔ細胞は、負の調節シグナルを免れることができ、かつ有効な腫瘍死滅を媒介できる。誘導性カスパーゼ９構築物のＡＰ１９０３との薬物誘導性二量体化を介した望ましくないＴ細胞の排除は、Ｔ細胞集団を制御できる強力なスイッチが薬理学的に開始され得る１つの方法を実証している（Ｄｉ Ｓｔａｓｉ Ａら Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１１年；３６５巻（１８号）：１６７３～８３頁（非特許文献１３））。デコイ受容体の発現によるトランスフォーミング成長因子－βの負の調節効果に対して免疫性であるエフェクターＴ細胞集団の創出は、エフェクターＴ細胞が最適な抗腫瘍活性のために操作され得る程度をさらに実証している（Ｆｏｓｔｅｒ ＡＥら Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８年；３１巻（５号）：５００～５頁（非特許文献１４））。
したがって、ＣＡＲは、内因性Ｔ細胞受容体と類似した様式でＴ細胞活性化を誘発できるようであるが、今日までのこのＣＡＲベースのテクノロジーの臨床適用に対する主要な障害は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の限定的なｉｎ ｖｉｖｏ増殖、注入後の細胞の迅速な消失、期待外れの臨床活性、および診断とかかるＣＡＲ＋Ｔ細胞を使用する癌の時宜を得た処置との間の過度の長さの時間である。
Ｌｏｎｇ ＡＨ，Ｈａｓｏ ＷＭ，Ｏｒｅｎｔａｓ ＲＪ．Ｌｅｓｓｏｎｓ ｌｅａｒｎｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｈｉｇｈｌｙ－ａｃｔｉｖｅ ＣＤ２－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１３年；２巻（４号）：ｅ２３６２１頁 Ｂｒｏｗｎ ＣＥら Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１２年；１８巻（８号）：２１９９～２０９頁 Ｌｅｈｎｅｒ Ｍら ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２年；７巻（２号）：ｅ３１２１０頁 Ｚｈａｏ Ｙら Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９年；１８３巻（９号）：５５６３～７４頁 Ｈａｓｏ Ｗ，Ｌｅｅ ＤＷ、Ｓｈａｈ ＮＮ，Ｓｔｅｔｌｅｒ－Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ Ｍ，Ｙｕａｎ ＣＭ，Ｐａｓｔａｎ ＩＨ，Ｄｉｍｉｔｒｏｖ ＤＳ、Ｍｏｒｇａｎ ＲＡ，ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ ＤＪ，Ｂａｒｒｅｔｔ ＤＭ，Ｗａｙｎｅ ＡＳ，Ｍａｃｋａｌｌ ＣＬ，Ｏｒｅｎｔａｓ ＲＪ．Ａｎｔｉ－ＣＤ２２－ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｂ ｃｅｌｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ．２０１３年；１２１巻（７号）：１１６５～７４頁 Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ＪＮら Ｂｌｏｏｄ．２０１２年；１１９巻（１２号）：２７０９～２０頁 Ｌｅｅ ＤＷら Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ．Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ，ＬＡ；１２月７～１０日、２０１３年 Ｐｏｒｔｅｒ ＤＬら Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１１年；３６５巻（８号）：７２５～３３頁 Ｙｖｏｎ Ｅら Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９年；１５巻（１８号）：５８５２～６０頁 Ｌａｎｉｔｉｓ Ｅら Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２０１３年；１巻（１号）：４３～５３頁 Ｋｌｏｓｓ ＣＣら Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３年；３１巻（１号）：７１～５頁 Ｈｅｇｄｅ Ｍら Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１３年；２１巻（１１号）：２０８７～１０１頁 Ｄｉ Ｓｔａｓｉ Ａら Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１１年；３６５巻（１８号）：１６７３～８３頁 Ｆｏｓｔｅｒ ＡＥら Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８年；３１巻（５号）：５００～５頁
したがって、上述の欠点なしに患者特異的な意図した治療的特質を示し得るＣＡＲベース療法を使用する癌の処置のための組成物および方法を発見する、当該分野における緊急かつ長年にわたる要求が存在する。
本発明は、共培養されたレンチウイルスベクターが形質導入された自家抗原提示細胞／Ｔ細胞を含む組成物、ならびに癌ならびに他の疾患および／または状態を処置するために使用され得る患者特異的併用療法におけるその使用の方法を提供することによって、これらの要求に対処する。
特に、本明細書に開示および記載される本発明は、患者特異的な腫瘍コードされる変異癌抗原を発現するレンチウイルスベクターが形質導入された自家抗原提示細胞を含む組成物であって、この細胞が、治療的Ｔ細胞集団中に形質導入された１または複数のレンチウイルス発現される腫瘍生検および末梢血由来腫瘍抗原Ｔ細胞受容体ありまたはなしのいずれかで、レンチウイルスベクター発現されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が形質導入された自家Ｔ細胞と共培養されて、腫瘍の安定化、低減および／もしくは排除、ならびに／または癌の緩解および／もしくは排除を生じる患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖、持続を患者特異的に促進するために患者に直接戻し注入することができる活性患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞集団を生成する、組成物を提供する。
発明の概要
共培養された、レンチウイルスベクターが形質導入された自家抗原提示細胞およびＴ細胞を含む新規養子免疫療法組成物、ならびに癌ならびに他の疾患および状態を処置するために使用され得る患者特異的併用免疫療法におけるその使用の方法が、本明細書で提供される。
したがって、一態様では、患者特異的変異癌抗原を発現するレンチウイルスベクター、ネイティブＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するレンチウイルスベクター、腫瘍特異的反応性Ｔ細胞ＴＣＲ転写物を発現するレンチウイルスベクターおよびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するレンチウイルスベクター、ならびに変異癌抗原、ネイティブＴ細胞受容体、Ｔ細胞ＴＣＲ転写物および受容体を発現する宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）、ならびに変異癌抗原、ネイティブＴ細胞受容体、Ｔ細胞ＴＣＲ転写物および受容体をコードする核酸分子が、本明細書で提供される。例えば、対象において癌を処置するために、開示された患者特異的変異癌抗原を発現するレンチウイルスベクター、ネイティブＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するレンチウイルスベクター、腫瘍特異的反応性Ｔ細胞ＴＣＲ転写物を発現するレンチウイルスベクターおよびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するレンチウイルスベクター、宿主細胞ならびに核酸分子を使用する方法もまた提供される。
一態様では、単一または複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする１または複数のレンチウイルスベクターが形質導入された自家Ｔ細胞集団を含む養子免疫療法組成物であって、このＴ細胞が、患者由来腫瘍抗原を発現する１または複数のレンチウイルスベクターが形質導入された自家抗原提示細胞と共培養され、それによって、腫瘍の安定化、低減および／もしくは排除、ならびに／または癌の緩解および／もしくは排除を生じる患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖、持続を患者特異的に促進することが可能な活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団を生成する、養子免疫療法組成物が提供される。
一実施形態では、自家抗原提示細胞は、自家樹状細胞もしくはＢ細胞または混合物あるいは末梢血由来リンパ球に由来する。
一実施形態では、ネイティブＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含有する自家患者特異的Ｔ細胞に、患者由来腫瘍抗原を発現する１または複数のレンチウイルスベクターが形質導入された自家抗原提示細胞との共培養の間またはその後のいずれかに、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するようにレンチウイルスベクターが形質導入されて、腫瘍の安定化、低減および／もしくは排除、ならびに／または癌の緩解および／もしくは排除を生じる患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖、持続を患者特異的に促進することが可能な活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団を生成する、養子免疫療法組成物が提供される。
一実施形態では、患者由来腫瘍抗原が、ミュータノーム（ｍｕｔａｎｏｍｅ）内の変異体ＲＮＡ転写物を同定するために、患者生検およびヌクレオチドシーケンシングを介して同定される、養子免疫療法組成物が提供される。
一実施形態では、自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）が、患者特異的樹状細胞もしくはＢ細胞または混合物あるいは末梢血由来リンパ球を含む自家抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む、養子免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）が、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）で不死化された活性患者特異的自家Ｂ細胞を含む自家抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む、養子免疫療法組成物であって、不死化ステップが、自家Ｂ細胞をＥＢＶ含有細胞培養物上清と共に培養することを含む、養子免疫療法組成物が提供される。一実施形態では、ＥＢＶで不死化されたかかる活性患者特異的自家Ｂ細胞の産生のための商業サービスには、例えば、限定としてではなく、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌ，ＡＢＭ，Ｉｎｃ．（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｂｍｇｏｏｄ．ｃｏｍ／ＥＢＶ－Ｃｅｌｌ－Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）が含まれる。一実施形態では、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞株は、限定としてではなく、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞株Ｂ９５－８（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６１２）、またはあるいはＥＢＶ含有上清（ＡＴＣＣ－ＢＲ１４－９２）を含む、当該分野で慣用的に使用される細胞株を含む。
別の態様では、単一または複数のキメラ抗原受容体をコードする１または複数のレンチウイルスベクターが形質導入された自家Ｔ細胞集団を含む養子免疫療法組成物であって、このＴ細胞集団に、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１または複数のレンチウイルスベクターがさらに形質導入されて、腫瘍の安定化、低減および／もしくは排除、ならびに／または癌の緩解および／もしくは排除を生じる患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖、持続を患者特異的に促進することが可能な活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団を生成する、養子免疫療法組成物が提供される。
一実施形態では、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が、患者由来腫瘍抗原を発現する１または複数のレンチウイルスベクターが形質導入された抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、ＨＬＡ適合性または患者特異的なＴ細胞と共培養することによって最初に同定されたものである、養子免疫療法組成物が提供される。
一実施形態では、自家抗原提示細胞は、自家樹状細胞もしくはＢ細胞または混合物あるいは末梢血由来リンパ球に由来する。
一実施形態では、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が、ＨＬＡ適合性または患者特異的である、養子免疫療法組成物が提供される。
一実施形態では、患者特異的腫瘍特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含有する自家患者特異的Ｔ細胞に、患者由来腫瘍抗原を発現する１または複数のレンチウイルスベクターが形質導入された自家抗原提示細胞との共培養の間またはその後のいずれかに、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するようにレンチウイルスベクターが形質導入されて、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を認識することが可能であり、腫瘍の安定化、低減および／もしくは排除、ならびに／または癌の緩解および／もしくは排除を生じる患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖、持続を患者特異的に促進することが可能な活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団を生成する、養子免疫療法組成物が提供される。
一実施形態では、患者由来腫瘍抗原が、ミュータノーム内の変異体ＲＮＡ転写物を同定するために、患者生検およびヌクレオチドシーケンシングを介して同定される、養子免疫療法組成物が提供される。一実施形態では、ヌクレオチドシーケンシングは、次世代シーケンシングを使用して実施される。
一実施形態では、自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）が、患者特異的樹状細胞もしくはＢ細胞または混合物あるいは末梢血由来リンパ球を含む自家抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む、養子免疫療法組成物が提供される。
ある特定の実施形態では、活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団が、腫瘍生検の１日、３日、５日、７日、１０日、１４日、２１日または１カ月以内に生成され、癌に罹患している患者に直接戻し注入することができる活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団が、腫瘍の安定化、低減および／もしくは排除、ならびに／または癌の緩解および／もしくは排除を生じる患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖、持続を患者特異的に促進することが可能である、養子免疫療法組成物が提供される。
上述の両方の態様のある特定の実施形態では、ＣＡＲが、少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、養子免疫療法組成物が提供される。
上述の両方の態様のある特定の実施形態では、ＣＡＲの少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する抗体の少なくとも１つの単鎖可変フラグメントを含む、養子免疫療法組成物が提供される。
上述の両方の態様のある特定の実施形態では、ＣＡＲの少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域を含む、養子免疫療法組成物が提供される。
上述の両方の態様のある特定の実施形態では、ＣＡＲの少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメイン、ＣＡＲの少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその両方が、リンカーまたはスペーサードメインによって膜貫通ドメインに接続される、養子免疫療法組成物が提供される。
上述の両方の態様のある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインにリーダーペプチドが先行する、養子免疫療法組成物が提供される。
上述の両方の態様のある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＴＳＬＰＲ、メソセリン、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＦＧＦＲ４、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ、またはそれらの任意の組合せを含む抗原を標的化する、養子免疫療法組成物が提供される。
上述の両方の態様のある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインが、抗ＣＤ１９ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ２０ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ２２ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＲＯＲ１ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＴＳＬＰＲ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗メソセリンｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３３ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３８ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１３８ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ２ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＦＧＦＲ４ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＰＭＳＡ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗糖脂質Ｆ７７ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＧＤ－２ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＮＹ－ＥＳｏ－１ ＴＣＲ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、または８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するそのアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の組合せを含む、養子免疫療法組成物が提供される。
上述の両方の態様のある特定の実施形態では、ＣＡＲのリンカーまたはスペーサードメインが、ＣＤ８の細胞外ドメインに由来し、膜貫通ドメインに連結される、養子免疫療法組成物が提供される。
上述の両方の態様のある特定の実施形態では、ＣＡＲが、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７１、ＴＮＦＲＳＦ１９、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインをさらに含む、養子免疫療法組成物が提供される。
上述の両方の態様のある特定の実施形態では、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをさらに含む、養子免疫療法組成物が提供される。
上述の両方の態様のある特定の実施形態では、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインに対してＣ末端側に配置される、養子免疫療法組成物が提供される。
上述の両方の態様のある特定の実施形態では、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含む、養子免疫療法組成物が提供される。
上述の両方の態様のある特定の実施形態では、少なくとも１つの共刺激ドメインが、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）の機能的シグナル伝達ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含む、養子免疫療法組成物が提供される。
一態様では、患者特異的変異癌抗原をコードする単離された核酸分子、ネイティブＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする単離された核酸分子、腫瘍特異的反応性Ｔ細胞ＴＣＲ転写物をコードする単離された核酸分子またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離された核酸分子が、本明細書で提供される。
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲの一態様では、ＣＡＲは、診断、癌患者の無増悪生存期間などの処置転帰のモニタリングおよび／もしくは予測における使用のため、またはかかる処置の進行をモニタリングするために、検出可能なマーカーを発現または含有するように改変される。
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲの一実施形態では、開示されたＣＡＲをコードする核酸分子は、ウイルスベクターなどのベクター中に含有され得る。ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドベクター、コスミドベクター、ヘルペスウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、もしくはレトロウイルスベクター、ヒヒ内因性ウイルス（ＢａＥＶ）またはそれらの組合せである。
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲのある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、例えば、限定としてではなく、両種指向性マウス白血病ウイルス［ＭＬＶ－Ａ］、ＧＰ１６４、テナガザル白血病ウイルス［ＧＡＬＶ］、ＲＤ１１４、ネコ内因性ウイルスレトロウイルス由来ＧＰ、および水疱性口内炎ウイルス［ＶＳＶ］、麻疹ウイルス、家禽ペストウイルス［ＦＰＶ］、エボラウイルス［ＥｂｏＶ］、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス［ＬＣＭＶ］非レトロウイルス由来ＧＰを含む異なるウイルス糖タンパク質（ＧＰ）、ならびに例えば、限定としてではなく、ＭＬＶ－Ａ ＧＰの細胞質テイル（ＴＲと称する）に融合されたＧＡＬＶまたはＲＤ１１４ ＧＰの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインをコードするキメラＧＰを含むそれらのキメラバリアントでシュードタイプ化される。
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲのある特定の実施形態では、ベクターは、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、自殺プロモーターまたはそれらの任意の組合せであるプロモーターをさらに含む。
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲのさらに別の実施形態では、ＣＡＲを発現するベクターは、自殺スイッチによって、ＣＡＲ Ｔ細胞の発現を制御するため、またはＣＡＲ－Ｔ細胞を排除するために、１または複数の作動可能なエレメントを含むようにさらに改変され得る。自殺スイッチには、例えば、アポトーシス誘導性シグナル伝達カスケード、または細胞死を誘導する薬物が含まれ得る。好ましい実施形態では、ＣＡＲを発現するベクターは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）またはシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）などの酵素を発現するようにさらに改変され得る。
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲの別の態様では、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む宿主細胞もまた提供される。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｔ細胞、例えば、対象から得られた初代Ｔ細胞である。一実施形態では、宿主細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。
さらに別の実施形態では、癌を有するヒトの活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）の集団の抗腫瘍有効量を含む医薬組成物であって、癌が、１または複数の化学療法剤に対して非応答性の難治性癌である、医薬組成物が提供される。癌は、造血癌、骨髄異形成症候群、膵癌、頭頸部癌、皮膚腫瘍、急性リンパ芽球性白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）における微小残存病変（ＭＲＤ）、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、黒色腫もしくは他の血液学的癌および固形腫瘍、またはそれらの任意の組合せを含む。
さらに別の実施形態では、癌を有するヒトの活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）の集団の抗腫瘍有効量を含む医薬組成物であって、癌が、血液学的癌、例えば、白血病（例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）もしくは慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ））、リンパ腫（例えば、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫またはホジキンリンパ腫）または多発性骨髄腫、あるいはそれらの任意の組合せを含む、医薬組成物が提供される。
さらに別の実施形態では、癌を有するヒトの活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）の集団の抗腫瘍有効量を含む医薬組成物であって、癌が、口腔および咽頭癌（舌、口、咽頭、頭頸部）、消化器系癌（食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、肝内胆管、胆嚢、膵臓）、呼吸器系癌（喉頭、肺および気管支）、骨および関節の癌、軟組織癌、皮膚癌（黒色腫、基底細胞癌および扁平上皮癌）、小児腫瘍（神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫）、中枢神経系の腫瘍（脳腫瘍、星状細胞腫、神経膠芽腫、神経膠腫）、ならびに乳房、生殖系（子宮頸部、子宮体、卵巣、外陰部、腟、前立腺、精巣、陰茎、子宮内膜）、泌尿器系（膀胱、腎臓および腎盂、尿管）、眼および眼窩、内分泌系（甲状腺）ならびに脳および他の神経系の癌、またはそれらの任意の組合せを含む成人の癌を含む、医薬組成物が提供される。
別の態様では、活性患者特異的自家抗腫瘍ＣＡＲ含有Ｔ細胞を作製する方法が提供される。この方法は、ｉ）１もしくは複数の患者特異的変異癌抗原；ｉｉ）１もしくは複数の患者特異的かつ腫瘍特異的ＴＣＲ；およびｉｉｉ）抗原に特異的に結合する１もしくは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組合せをコードするベクターまたは核酸分子をＴ細胞に形質導入し、それによって、活性患者特異的自家抗腫瘍ＣＡＲ含有Ｔ細胞を作製することを含む。
さらに別の態様では、ＲＮＡ操作されたＴ細胞の集団を生成する方法であって、ｉ）１もしくは複数の患者特異的変異癌抗原；ｉｉ）１もしくは複数の患者特異的かつ腫瘍特異的ＴＣＲ；およびｉｉｉ）１もしくは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組合せをコードする核酸分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡまたは合成ＲＮＡを対象の細胞中に導入し、それによって、腫瘍の安定化、低減および／もしくは排除、ならびに／または癌の緩解および／もしくは排除を生じる患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖、持続を患者特異的に促進することが可能な活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団を生成することを含む方法が提供される。
別の態様では、単一または複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする１または複数のレンチウイルスベクターが形質導入された自家Ｔ細胞集団を含む医薬組成物であって、Ｔ細胞が、患者由来腫瘍抗原を発現する１または複数のレンチウイルスベクターが形質導入された自家抗原提示細胞と共培養され、それによって、腫瘍の安定化、低減および／もしくは排除、ならびに／または癌の緩解および／もしくは排除を生じる患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖、持続を患者特異的に促進することが可能な活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団を生成する、医薬組成物が提供される。
別の態様では、単一または複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする１または複数のレンチウイルスベクターが形質導入された自家Ｔ細胞集団を含む医薬組成物であって、Ｔ細胞集団に、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１または複数のレンチウイルスベクターがさらに形質導入されて、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を認識することが可能であり、腫瘍の安定化、低減および／もしくは排除、ならびに／または癌の緩解および／もしくは排除を生じる患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖、持続を患者特異的に促進することが可能な活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団を生成する、医薬組成物が提供される。
一実施形態では、Ｔ細胞が、血液学的癌を有するヒトのＴ細胞である、医薬組成物が提供される。
別の実施形態では、血液学的癌が、白血病またはリンパ腫である、医薬組成物が提供される。
別の実施形態では、白血病が、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である、医薬組成物が提供される。
別の実施形態では、リンパ腫が、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫またはホジキンリンパ腫である、医薬組成物が提供される。
別の実施形態では、血液学的癌が多発性骨髄腫である、医薬組成物が提供される。別の実施形態では、ヒトの癌が、口腔および咽頭癌（舌、口、咽頭、頭頸部）、消化器系癌（食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、肝内胆管、胆嚢、膵臓）、呼吸器系癌（喉頭、肺および気管支）、骨および関節の癌、軟組織癌、皮膚癌（黒色腫、基底細胞癌および扁平上皮癌）、小児腫瘍（神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫）、中枢神経系の腫瘍（脳腫瘍、星状細胞腫、神経膠芽腫、神経膠腫）、ならびに乳房、生殖系（子宮頸部、子宮体、卵巣、外陰部、腟、前立腺、精巣、陰茎、子宮内膜）、泌尿器系（膀胱、腎臓および腎盂、尿管）、眼および眼窩、内分泌系（甲状腺）ならびに脳および他の神経系の癌、またはそれらの任意の組合せを含む成人の癌を含む、医薬組成物が提供される。
別の態様では、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害または状態を有する哺乳動物を処置するための方法であって、方法が、単一または複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする１または複数のレンチウイルスベクターが形質導入された自家Ｔ細胞の抗腫瘍有効量を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、Ｔ細胞が、患者由来腫瘍抗原を発現する１または複数のレンチウイルスベクターが形質導入された自家抗原提示細胞と共培養され、それによって、腫瘍の安定化、低減および／もしくは排除、ならびに／または癌の緩解および／もしくは排除を生じる患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖、持続を患者特異的に促進することが可能な活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団を生成する、方法が提供される。
別の態様では、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害または状態を有する哺乳動物を処置するための方法であって、方法が、単一または複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする１または複数のレンチウイルスベクターが形質導入された自家Ｔ細胞の抗腫瘍有効量を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、Ｔ細胞集団に、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１または複数のレンチウイルスベクターがさらに形質導入されて、腫瘍の安定化、低減および／もしくは排除、ならびに／または癌の緩解および／もしくは排除を生じる患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖、持続を患者特異的に促進するために患者に直接戻し注入することができる、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を認識することが可能な活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団を生成する、方法が提供される。
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞が、特異的活性化またはメモリー関連表面マーカーを発現するということによって事前選択されている、方法が本明細書で提供される。
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞および樹状細胞が、造血幹細胞ドナーに由来し、この手順が、造血幹細胞移植の状況で実施される、方法が本明細書で提供される。
さらに別の態様では、癌と診断されたヒトにおいて、遺伝子操作された活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）の持続性の集団を生成するための方法が提供される。一実施形態では、方法は、本明細書に記載される１または複数の活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）を、それを必要とするヒト患者に投与するステップであって、活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）の持続性の集団、またはＴ細胞の子孫の集団は、投与の後少なくとも１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月、２年または３年にわたって、ヒトにおいて持続するステップを含む。
一実施形態では、ヒトにおける子孫のＴ細胞は、メモリーＴ細胞を含む。別の実施形態では、Ｔ細胞は自家Ｔ細胞である。
本明細書に記載される方法の態様および実施形態の全てにおいて、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する上述の癌、疾患、障害または状態のいずれかは、本明細書に開示される活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）を含む組成物のうち１または複数を使用して、処置または予防または寛解され得る。
さらに別の態様では、上記活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）を含む組成物を作製するためのキット、または上記対象において、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する癌、疾患、障害もしくは状態のいずれかを予防、処置もしくは寛解するためのキットであって、上に開示された核酸分子、ベクター、宿主細胞もしくは組成物のいずれか１つまたはそれらの任意の組合せを含むコンテナ、およびキットを使用するための指示書を含むキットが提供される。
上記のような、活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）、患者特異的変異癌抗原を発現するレンチウイルスベクター、ネイティブＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するレンチウイルスベクター、腫瘍特異的反応性Ｔ細胞ＴＣＲ転写物を発現するレンチウイルスベクターおよびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するレンチウイルスベクター、ならびに変異癌抗原、ネイティブＴ細胞受容体、Ｔ細胞ＴＣＲ転写物および受容体を発現する宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）、ならびに変異癌抗原、ネイティブＴ細胞受容体、Ｔ細胞ＴＣＲ転写物および受容体をコードする核酸分子、宿主細胞ならびに方法は、本明細書に詳細に記載される具体的な態様および実施形態を超えて有用であることが理解される。本開示の前述の特色および利点は、添付の図面を参照して進む以下の詳細な説明からより明らかになる。
本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と共に読むとさらによく理解される。本発明を例証する目的のため、本発明において好ましい図面の実施形態を示す。しかしながら本発明が、図面中に示した実施形態の正確な配置と手段に限られないことは理解されるはずである。
癌を処置するための第１の例示的方法を示す図であって、免疫療法（患者への戻し注入）用のＴ細胞にＣＡＲ発現ＬＶを形質導入し、それらのネイティブＴＣＲにより刺激して次世代シーケンシングにより同定した患者特異的変異体タンパク質を認識させる図である。 癌を処置するための第２の例示的方法を示す図であって、免疫療法（患者への戻し注入）用のＴ細胞にＣＡＲ発現ＬＶと腫瘍生検または血液のいずれか由来のＴＣＲ配列を形質導入し、腫瘍の次世代シーケンシングにより同定した転写物を発現するＤＣにより刺激する図である。
詳細な説明
定義
本明細書で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」とは、文脈が明らかに他を示さない限り、単数形および複数形の両方を指す。例えば、用語「１つの抗原」は、単数または複数の抗原を含み、語句「少なくとも１つの抗原」と等価とみなされ得る。本明細書で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」とは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。したがって、「１つの抗原を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、他の要素を排除することなく、「１つの抗原を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味する。語句「および／または」とは、「および」または「または」を意味する。核酸またはポリペプチドについて与えられた任意のおよび全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、ならびに全ての分子量または分子質量値は、特記しない限り、おおよそであり、便宜的に提供されていることをさらに理解すべきである。本明細書に記載されるものと類似または等価な多くの方法および材料が使用され得るが、特に適切な方法および材料が以下に記載される。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法および実施例は、例示にすぎず、限定を意図しない。種々の実施形態の再検討を容易にするために、以下の用語の説明が提供される。
用語「約」とは、測定可能な値、例えば、量、時間的持続期間などに言及する場合、特定された値から±２０％、±１０％、またはより好ましくは±５％、もしくは±１％、またはなおより好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味し、かかる変動は、開示された方法を実施するために適切である。
特記しない限り、本明細書の技術用語は、従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般的用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓによって刊行されたＢｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩ，１９９９年；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．によって刊行されたＫｅｎｄｒｅｗら（編）Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４年；およびＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．によって刊行されたＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，１９９５年；および他の類似の参考文献中に見出すことができる。
本発明は、血液悪性疾患および固形腫瘍を含むがこれらに限定されない癌を処置するための組成物および方法に関する。本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように形質導入されたＴ細胞の養子細胞移入の患者特異的腫瘍特異的戦略に関する。
本発明は、より特には、患者特異的変異癌抗原を発現するレンチウイルスベクター、ネイティブＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するレンチウイルスベクター、腫瘍特異的反応性Ｔ細胞ＴＣＲ転写物を発現するレンチウイルスベクターおよびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するレンチウイルスベクター、ならびに変異癌抗原、ネイティブＴ細胞受容体、Ｔ細胞ＴＣＲ転写物および受容体を発現する宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）、ならびに変異癌抗原、ネイティブＴ細胞受容体、Ｔ細胞ＴＣＲ転写物および受容体をコードする核酸分子に関する。例えば、対象において癌を処置するために、開示された、患者特異的変異癌抗原を発現するレンチウイルスベクター、ネイティブＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するレンチウイルスベクター、腫瘍特異的反応性Ｔ細胞ＴＣＲ転写物を発現するレンチウイルスベクターおよびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するレンチウイルスベクター、宿主細胞ならびに核酸分子を使用する方法もまた提供される。
驚くべきことにかつ予想外に、腫瘍特異的ＴＣＲの発現（ネイティブＴ細胞集団の選択、またはレンチウイルスベクターによる腫瘍特異的ＴＣＲの分子的クローニングおよび移入のいずれかによる）に加えて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発現が伴う場合、Ｔ細胞の活性抗腫瘍集団がより有効であることが、本発明者らによってここで発見された。ＣＡＲは、驚くべきことにかつ予想外に、その喪失が患者によって忍容され得、腫瘍組織自体の中には存在しない治療的細胞集団に刺激シグナルを提供するようになおも機能する自己抗原（例えば、ＣＤ１９）に遭遇したときにこのＴ細胞集団を刺激するということによって、腫瘍特異的ＴＣＲ（複数可）を有するＴ細胞集団の持続を可能にする。本明細書に記載されるかかる活性患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞集団は、腫瘍の安定化、低減および／もしくは排除、ならびに／または癌の緩解および／もしくは排除を生じる患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖、持続を患者特異的に促進するために、患者に直接戻し注入することができる。
したがって、その最も広い態様では、この養子免疫療法の新規性は、ＡＰＣに腫瘍特異的変異遺伝子を形質導入し、次いで、患者Ｔ細胞と共に培養することによる、患者ＴＣＲを同定するためのレンチウイルスベクターの使用にある。これは、その患者における変異抗原のシーケンシングおよび同定、ならびに次いで、ＬＶを介してＡＰＣにおいて変異タンパク質を発現させ、Ｔ細胞を共培養し、患者ＴＣＲを同定することを含む。次いで、ミュータノーム（ｍｕｔａｔｏｍｅ）特異的ＴＣＲおよびＴ細胞は、単離および特徴付けされ得る。さらに、ＣＡＲは次いで、免疫応答（ＩＲ）を増強するために添加される。鑑別特色は、ＣＡＲが一次免疫療法剤ではないが、高度に特異的であるＴＣＲ応答を増大させるように作用することである。これは、２つの別個の方法でＩＲを増大させる：第１には、身体中で増殖および生存するためにＴ細胞にさらなるシグナルを提供することによる；第２には、免疫抑制的細胞抗原を標的化することによる。
別の態様では、この養子免疫療法の新規性は、ＬＶを使用して腫瘍コードされる変異体遺伝子をＡＰＣに形質導入し、次いで、患者細胞と共に培養することによる、患者由来腫瘍特異的ＴＣＲを同定するためのレンチウイルスベクターの使用にある。これは、患者由来の変異抗原のシーケンシングおよび同定、ならびに次いで、ＬＶによってＡＰＣにおいて変異タンパク質を発現させ、患者Ｔ細胞を共培養してミュータノーム特異的ＴＣＲを同定することを含む。別の態様では、ＣＡＲは、治療的Ｔ細胞集団によって媒介される、腫瘍に対する免疫応答を増強するために使用される。免疫応答は、少なくとも３つの方法で増強される。第１に、身体中で増殖および生存するためにＴ細胞にさらなるシグナルを提供することによって、ＣＡＲは、その喪失が患者によって忍容され得、腫瘍組織自体の中には存在しない治療的細胞集団に刺激シグナルを提供するようになおも機能する自己抗原（例えば、ＣＤ１９）に遭遇したときにＴ細胞集団を刺激するということによって、腫瘍特異的ＴＣＲ（複数可）を有する治療的Ｔ細胞集団の持続を可能にする。第２の態様では、ＣＡＲは、免疫抑制的効果を媒介する、腫瘍以外の細胞型を標的化し得る。例えば、ＣＤ１９発現Ｂ細胞が腫瘍病変中に存在し、また抗腫瘍効果を媒介する場合、ＣＡＲ発現腫瘍特異的Ｔ細胞集団の第２の利点は、免疫抑制的細胞集団もまた除去されることである。第３の態様では、ＣＡＲは、腫瘍に対して遠位の、即ち、身体中の別の区画中に存在する免疫抑制的集団を標的化する。例えば、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を標的化し、腫瘍病変自体中または所属リンパ節もしくは骨髄中のいずれかに存在し得るＣＡＲを使用する。
ＣＡＲ、抗体およびその抗原結合性フラグメント、コンジュゲート、ヌクレオチド、発現、ベクターおよび宿主細胞、開示されたＣＡＲを使用する処置の方法、組成物およびキットのさらなる記載と共に、それらの細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの記載を含む、本明細書に開示される活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用され得るＣＡＲの詳細な記載は以下である。
Ａ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本明細書に開示されるＣＡＲは、抗原に結合することが可能な少なくとも１つの細胞外ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内ドメインを含む。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、膜貫通ドメインを介してＴ細胞シグナル伝達ドメインに連結された抗体の抗原結合性ドメイン（例えば、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ））を含有する、人工的に構築されたハイブリッドタンパク質またはポリペプチドである。ＣＡＲの特徴には、非ＭＨＣ拘束様式で、モノクローナル抗体の抗原結合特性を活用して、選択された標的に向かってＴ細胞の特異性および反応性を再指向させるそれらの能力が含まれる。非ＭＨＣ拘束的な抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシングと無関係に抗原を認識する能力を与え、そうして、腫瘍エスケープの主要な機構を迂回する。さらに、Ｔ細胞中で発現される場合、ＣＡＲは、有利なことに、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖およびベータ鎖と二量体化しない。
本明細書に開示するように、ＣＡＲの細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインには、例えば、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達ドメイン、またはその両方が含まれ得る。Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインとは、Ｔ細胞受容体の細胞内ドメイン、例えば、限定としてではなく、ＣＤ３ゼータタンパク質の細胞内部分などを含む、ＣＡＲの一部分を指す。共刺激シグナル伝達ドメインとは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である共刺激分子の細胞内ドメインを含む、ＣＡＲの一部分を指す。
１．細胞外ドメイン
一実施形態では、本明細書に開示される活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲは、さもなければ抗原結合性ドメインまたは部分と呼ばれる標的特異的結合エレメントを含む。ドメインの選択は、標的細胞の表面を規定するリガンドの型および数に依存する。例えば、抗原結合性ドメインは、特定の疾患状態と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。したがって、ＣＡＲ中の抗原結合性ドメインに対するリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌および寄生生物感染、自己免疫疾患ならびに癌細胞と関連するものが含まれる。
一実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する所望の抗原結合性ドメインを操作することによって、目的の腫瘍抗原を標的化するように操作され得る。腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞媒介性免疫応答を惹起する、腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。抗原結合性ドメインの選択は、処置される特定の型の癌に依存する。腫瘍抗原は、当該分野で周知であり、これには、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ベータ－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ｐ５３、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体ならびにメソセリンが含まれる。本明細書に開示される腫瘍抗原は、例として含まれるにすぎない。このリストは、排他的である意図はなく、さらなる例が、当業者に容易に明らかである。
一実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍と関連する１または複数の抗原性癌エピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原として機能し得るいくつかのタンパク質を発現する。これらの分子には、組織特異的抗原、例えば、黒色腫におけるＭＡＲＴ－１、チロシナーゼおよびＧＰ １００、ならびに前立腺癌における前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）が含まれるがこれらに限定されない。他の標的分子は、癌遺伝子ＨＥＲ－２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ－２などの形質転換関連分子の群に属する。標的抗原のさらに別の群は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの癌胎児性抗原である。Ｂ細胞リンパ腫では、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンが、個々の腫瘍に独自の真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。Ｂ細胞分化抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２およびＣＤ３７は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原の他の候補である。これらの抗原の一部（ＣＥＡ、ＨＥＲ－２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、イディオタイプ）は、限定的な成功で、モノクローナル抗体による受動免疫療法の標的として使用されている。
腫瘍抗原の型は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）でもあり得る。ＴＳＡは、腫瘍細胞に独自であり、身体中の他の細胞上には存在しない。ＴＡＡは、腫瘍細胞に独自ではなく、その代り、抗原に対する免疫学的寛容の状態を誘導できない条件下で正常細胞上でも発現される。腫瘍上での抗原の発現は、免疫系が抗原に応答できるようにする条件下で生じ得る。ＴＡＡは、免疫系が未熟であり応答できない胎児発生の間に正常細胞上で発現される抗原であり得、または正常細胞上では非常に低いレベルで通常存在するが、腫瘍細胞上ではかなり高いレベルで発現される抗原であり得る。
ＴＳＡまたはＴＡＡの非限定的な例には、以下が含まれる：分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２および腫瘍特異的多系列抗原、例えば、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐ１５；過剰発現された胚抗原、例えば、ＣＥＡ；過剰発現された癌遺伝子および変異した腫瘍サプレッサー遺伝子、例えば、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ；染色体転座から生じる独自の腫瘍抗原；例えば、ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ；ならびにウイルス抗原、例えば、エプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７。他の大きいタンパク質ベースの抗原には、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２、ＣＡ １９－９、ＣＡ ７２－４、ＣＡＭ １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、ベータ－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ １５、ｐ １６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ－フェトプロテイン、ベータ－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ １２５、ＣＡ １５－３／ＣＡ ２７．２９／ＢＣＡＡ、ＣＡ １９５、ＣＡ ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８／Ｐ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３／ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０／Ｍａｃ－２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰおよびＴＰＳが含まれる。
好ましい実施形態では、ＣＡＲの抗原結合性ドメイン部分は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソセリン、ＣＤ３３、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＭＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲなどを含むがこれらに限定されない抗原を標的化する。
標的化される所望の抗原に依存して、ＣＡＲは、所望の抗原標的に対して特異的な適切な抗原結合ドメインを含むように操作され得る。例えば、ＣＤ１９が標的化される所望の抗原である場合、ＣＤ１９に対する抗体が、ＣＡＲ中への抗原結合ドメイン取込みとして使用され得る。
例示的な一実施形態では、ＣＡＲの抗原結合性ドメイン部分は、ＣＤ１９を標的化する。好ましくは、ＣＡＲ中の抗原結合性ドメインは、抗ＣＤ１９ ｓｃＦＶであり、ここで、抗ＣＤ１９ ｓｃＦＶの核酸配列は、配列番号２７に示される配列を含む。一実施形態では、抗ＣＤ１９ ｓｃＦＶは、配列番号２８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＡＲの抗ＣＤ１９ ｓｃＦＶ部分は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明の一態様では、例えば、限定としてではなく、レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－ＬＰ）、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルスおよびエコーウイルス）、風疹ウイルス、コロナウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科［例えば、１型および２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ならびにヘルペスウイルス］、ポックスウイルス科（例えば、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルスおよびポックスウイルス）もしくはＣ型肝炎ウイルスに由来する抗原、またはそれらの任意の組合せを含む非ＴＳＡまたは非ＴＡＡに結合することが可能なＣＡＲが提供される。
本発明の別の態様では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａの細菌株に由来する抗原に結合することが可能なＣＡＲが提供される。特に、感染性細菌、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐｓ．の細菌株（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉまたはＭ．ｇｏｒｄｏｎｅａ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅもしくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉに由来する抗原、またはそれらの組合せに結合することが可能なＣＡＲが提供される。
２．膜貫通ドメイン
本明細書に開示される活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲでは、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合された１または複数の膜貫通ドメインを含む。
一実施形態では、コードされるリンカードメインが、ＣＤ８の細胞外ドメインに由来し、膜貫通ドメインに連結される、単離された核酸分子が提供される。
一実施形態では、コードされるリンカードメインが、膜貫通ドメインの細胞外ドメインに由来し、膜貫通ドメインに連結される、単離された核酸分子が提供される。
一部の場合には、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するために、かかるドメインの、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を回避するために、選択され得るまたはアミノ酸置換により得る。
膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合型または膜貫通タンパク質に由来し得る。本発明において特に使用される膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７１、ＴＮＦＲＳＦ１９に由来し得る（即ち、それらの膜貫通領域（複数可）を少なくとも含み得る）。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であり得、その場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を優勢に含む。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンの三つ組が、合成膜貫通ドメインの各末端において見出される。任意選択で、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、好ましくは２アミノ酸長と１０アミノ酸長との間が、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間での連結を形成し得る。グリシン－セリン二つ組は、特に適切なリンカーを提供する。
一実施形態では、本発明のＣＡＲ中の膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである。一実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号１１の核酸配列を含む。一実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
一部の場合には、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８アルファヒンジドメインを含む。一実施形態では、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号１３の核酸配列を含む。一実施形態では、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
任意の特定の作用機構に限定する意図はないが、本発明の本明細書に開示される活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用される例示的なＣＡＲと関連する増強された治療機能の可能な理由には、例えば、限定としてではなく、ａ）より効率的なシグナル伝達を可能にする、原形質膜内での改善された側方の動き、ｂ）脂質ラフトなどの原形質膜マイクロドメイン内の優れた位置、およびＴ細胞活性化と関連する膜貫通シグナル伝達カスケードと相互作用するより高い能力、ｃ）抑制的もしくは下方調節性の相互作用から離れる優先的な動きによる、原形質膜内の優れた位置、例えば、ＣＤ４５などのホスファターゼとあまり近接していないこと、もしくはそれとのより少ない相互作用、ならびにｄ）Ｔ細胞受容体シグナル伝達複合体（即ち、免疫シナプス）への優れたアセンブリ、またはそれらの任意の組合せが含まれると考えられる。
本明細書に開示される活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）の一実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲにおいて使用される非限定的な例示的な膜貫通ドメインには、ＴＮＦＲＳＦ１６が含まれ、ＴＮＦＲＳＦ１９膜貫通ドメインは、出願人の同時係属中の仮特許出願第６２／２３９，５０９号、表題ＣＨＩＭＥＲＩＣ ＡＮＴＩＧＥＮ ＲＥＣＥＰＴＯＲＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＥ、２０１５年１０月９日出願、および譲渡されたＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．の案件番号ＬＥＮ＿０１５ＰＲＯに開示されたような、特に、その中の表Ｉに列挙された腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー内に列挙された他のＴＮＦＲＳＦメンバーを含む、ＴＮＦＲＳＦ膜貫通ドメインおよび／またはリンカーもしくはスペーサードメインを誘導するために使用され得る。
３．スペーサードメイン
本明細書に開示される活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲでは、スペーサードメインは、細胞外ドメインとＴＮＦＲＳＦ膜貫通ドメインとの間、または細胞内ドメインとＴＮＦＲＳＦ膜貫通ドメインとの間に配置され得る。スペーサードメインは、ＴＮＦＲＳＦ膜貫通ドメインを細胞外ドメインと連結させるように、および／またはＴＮＦＲＳＦ膜貫通ドメインを細胞内ドメインと連結させるように機能する、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、最大で３００アミノ酸、好ましくは１０～１００アミノ酸、最も好ましくは２５～５０アミノ酸を含む。
幾つかの実施形態では、リンカーは、存在する場合には、リンカーのサイズを増加させ、その結果、エフェクター分子または検出可能なマーカーと抗体または抗原結合性フラグメントとの間の距離が増加される、スペーサーエレメントを含み得る。例示的なスペーサーは、当業者に公知であり、これには、米国特許第７，９６４，５６６号、米国特許第７，４９８，２９８号、米国特許第６，８８４，８６９号、米国特許第６，３２３，３１５号、米国特許第６，２３９，１０４号、米国特許第６，０３４，０６５号、米国特許第５，７８０，５８８号、米国特許第５，６６５，８６０号、米国特許第５，６６３，１４９号、米国特許第５，６３５，４８３号、米国特許第５，５９９，９０２号、米国特許第５，５５４，７２５号、米国特許第５，５３０，０９７号、米国特許第５，５２１，２８４号、米国特許第５，５０４，１９１号、米国特許第５，４１０，０２４号、米国特許第５，１３８，０３６号、米国特許第５，０７６，９７３号、米国特許第４，９８６，９８８号、米国特許第４，９７８，７４４号、米国特許第４，８７９，２７８号、米国特許第４，８１６，４４４号および米国特許第４，４８６，４１４号、ならびに米国特許出願公開第２０１１０２１２０８８号および米国特許出願公開第２０１１００７０２４８号中に列挙されるものが含まれ、その各々は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
スペーサードメインは、好ましくは、抗原とのＣＡＲの結合を促進し、細胞中へのシグナル伝達を増強する配列を有する。結合を促進すると予測されるアミノ酸の例には、システイン、荷電アミノ酸、ならびに潜在的グリコシル化部位中のセリンおよびスレオニンが含まれ、これらのアミノ酸は、スペーサードメインを構成するアミノ酸として使用され得る。
スペーサードメインとして、ＣＤ８アルファ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７５９．３）のヒンジ領域であるアミノ酸番号１１８～１７８（配列番号１５）、ＣＤ８ベータ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３５６６４．１）のアミノ酸番号１３５～１９５、ＣＤ４（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６０７．１）のアミノ酸番号３１５～３９６、またはＣＤ２８（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００６１３０．１）のアミノ酸番号１３７～１５２の全体または一部が使用され得る。また、スペーサードメインとして、抗体Ｈ鎖またはＬ鎖の定常領域の一部（ＣＨ１領域またはＣＬ領域、例えば、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するペプチド）が使用され得る。さらに、スペーサードメインは、人工的に合成された配列であり得る。
さらに、ＣＡＲでは、シグナルペプチド配列が、Ｎ末端に連結され得る。シグナルペプチド配列は、多くの分泌タンパク質および膜タンパク質のＮ末端に存在し、１５～３０アミノ酸の長さを有する。細胞内ドメインとして上で言及されるタンパク質分子の多くは、シグナルペプチド配列を有するので、これらのシグナルペプチドがＣＡＲのためのシグナルペプチドとして使用され得る。一実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む。
４．細胞内ドメイン
ＣＡＲの細胞質ドメインまたはさもなければ細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが中に置かれた免疫細胞の正常なエフェクター機能のうち少なくとも１つの活性化を担う。用語「エフェクター機能」とは、細胞の特殊化した機能を指す。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊化した機能を実行するように細胞を指示する、タンパク質の部分を指す。通常は細胞内シグナル伝達ドメイン全体が使用され得るが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分が使用される限りにおいて、かかる短縮された部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用され得る。したがって、用語、細胞内シグナル伝達ドメインとは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮された部分を含むことを意味する。
ＣＡＲでの使用のための細胞内シグナル伝達ドメインの好ましい例には、抗原受容体係合後にシグナル伝達を開始させるように協力して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体もしくはバリアント、および同じ機能的能力を有する任意の合成配列が含まれる。
ＴＣＲ単独を通じて生成されるシグナルが、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であること、および二次または共刺激シグナルもまた必要とされることは公知である。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つの別個のクラスの細胞質シグナル伝達配列によって媒介されると言われ得る：ＴＣＲを介した抗原依存的な一次活性化を開始させるもの（一次細胞質シグナル伝達配列）および二次または共刺激シグナルを提供するように抗原依存的に作用するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）。
一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激性の方法または阻害性の方法のいずれかで、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激性の様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含有し得る。
本明細書に開示されるＣＡＲにおいて特に使用される一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例には、ＴＣＲゼータ（ＣＤ３ゼータ）、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものが含まれる。ＩＴＡＭの具体的な非限定的な例には、ＣＤ３ゼータ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿９３２１７０．１）のアミノ酸番号５１～１６４、ＦｃイプシロンＲＩガンマ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００４０９７．１）のアミノ酸番号４５～８６、ＦｃイプシロンＲＩベータ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００１３０．１）のアミノ酸番号２０１～２４４、ＣＤ３ガンマ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００００６４．１）のアミノ酸番号１３９～１８２、ＣＤ３デルタ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００７２３．１）のアミノ酸番号１２８～１７１、ＣＤ３イプシロン（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００７２４．１）のアミノ酸番号１５３～２０７、ＣＤ５（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０５５０２２．２）のアミノ酸番号４０２～４９５、００２２（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７６２．２）のアミノ酸番号７０７～８４７、ＣＤ７９ａ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７７４．１）のアミノ酸番号１６６～２２６、ＣＤ７９ｂ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６１７．１）のアミノ酸番号１８２～２２９、およびＣＤ６６ｄ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１８０６．２）のアミノ酸番号１７７～２５２の配列を有するペプチド、ならびにこれらのペプチドが有するのと同じ機能を有するそれらのバリアントが含まれる。本明細書に記載されるＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＩＤまたはＧｅｎＢａｎｋのアミノ酸配列情報に基づくアミノ酸番号は、各タンパク質の前駆体（シグナルペプチド配列などを含む）の全長に基づいて番号付けされる。一実施形態では、ＣＡＲ中の細胞質シグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータに由来する細胞質シグナル伝達配列を含む。
好ましい実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、それ自体で、またはＣＡＲの状況で有用な任意の他の所望の細胞質ドメイン（複数可）と組み合わせて、ＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含むように設計され得る。例えば、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含み得る。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答のために必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。かかる共刺激分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが含まれる。かかる共刺激分子の具体的な非限定的な例には、ＣＤ２（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７５８．２）のアミノ酸番号２３６～３５１、ＣＤ４（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６０７．１）のアミノ酸番号４２１～４５８、ＣＤ５（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０５５０２２．２）のアミノ酸番号４０２～４９５、ＣＤ８アルファ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７５９．３）のアミノ酸番号２０７～２３５、ＣＤ８３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３５６６４．１）のアミノ酸番号１９６～２１０、ＣＤ２８（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００６１３０．１）のアミノ酸番号１８１～２２０、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１５５２．２）のアミノ酸番号２１４～２５５、ＣＤ１３４（ＯＸ４０、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００３３１８．１）のアミノ酸番号２４１～２７７およびＩＣＯＳ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０３６２２４．１）のアミノ酸番号１６６～１９９の配列を有するペプチド、ならびにこれらのペプチドが有するのと同じ機能を有するそれらのバリアントが含まれる。したがって、本明細書の開示は、４－１ＢＢを共刺激シグナル伝達エレメントとして主に例示するが、他の共刺激エレメントが本開示の範囲内である。
ＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムにまたは特定された順序で、互いに連結され得る。任意選択で、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、好ましくは２アミノ酸長と１０アミノ酸長との間が、連結を形成し得る。グリシン－セリン二つ組は、特に適切なリンカーを提供する。
一実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。別の実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。さらに別の実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインならびにＣＤ２８および４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。
一実施形態では、ＣＡＲ中の細胞内ドメインは、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号１７に示される核酸配列を含み、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号１９に示される核酸配列を含む。
一実施形態では、ＣＡＲ中の細胞内ドメインは、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
一実施形態では、ＣＡＲ中の細胞内ドメインは、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む。
５．ＣＡＲのさらなる記載
本明細書で開示される活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲの機能的部分もまた、本発明の範囲内に明示的に含まれる。用語「機能的部分」とは、ＣＡＲに関して使用する場合、本明細書に開示されるＣＡＲの１または複数の任意の一部またはフラグメントを指し、この一部またはフラグメントは、それがその一部であるＣＡＲ（親ＣＡＲ）の生物学的活性を保持する。機能的部分は、例えば、親ＣＡＲと類似の程度、同じ程度、またはより高い程度まで、標的細胞を認識する能力、または疾患を検出、処置もしくは予防する能力を保持する、ＣＲＡの一部を包含する。親ＣＡＲに関して、機能的部分は、例えば、親ＣＡＲの約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％以上を構成し得る。
機能的部分は、その部分のアミノ末端もしくはカルボキシ末端において、または両方の末端において、さらなるアミノ酸を含み得、このさらなるアミノ酸は、親ＣＡＲのアミノ酸配列中には見出されない。望ましくは、さらなるアミノ酸は、例えば、標的細胞を認識し、癌を検出し、癌を処置または予防するなどの、機能的部分の生物学的機能を妨害しない。より望ましくは、さらなるアミノ酸は、親ＣＡＲの生物学的活性と比較して、その生物学的活性を増強する。
本明細書に開示されるＣＡＲの機能的バリアントが、本開示の範囲内に含まれる。用語「機能的バリアント」とは、本明細書で使用する場合、親ＣＡＲに対する実質的なまたは著しい配列同一性または類似性を有するＣＡＲ、ポリペプチドまたはタンパク質を指し、この機能的バリアントは、それがそのバリアントであるＣＡＲの生物学的活性を保持する。機能的バリアントは、例えば、親ＣＡＲと類似の程度、同じ程度、またはより高い程度まで、標的細胞を認識する能力を保持する、本明細書に記載されるＣＡＲ（親ＣＡＲ）のバリアントを包含する。親ＣＡＲに関して、機能的バリアントは、例えば、親ＣＡＲに対して、少なくとも約３０％、５０％、７５％、８０％、９０％、９８％以上、アミノ酸配列が同一であり得る。
機能的バリアントは、例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する親ＣＡＲのアミノ酸配列を含み得る。あるいは、またはさらに、機能的バリアントは、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を有する親ＣＡＲのアミノ酸配列を含み得る。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性を妨害も阻害もしないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性を増強し得、その結果、機能的バリアントの生物学的活性は、親ＣＡＲと比較して増加される。
ＣＡＲのアミノ酸置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換は、当該分野で公知であり、これには、ある特定の物理的および／または化学的特性を有する１つのアミノ酸が、同じまたは類似の化学的または物理的特性を有する別のアミノ酸に交換されるアミノ酸置換が含まれる。例えば、保存的アミノ酸置換は、酸性／負に荷電した別の極性アミノ酸（例えば、ＡｓｐまたはＧｌｕ）を置換する酸性／負に荷電した極性アミノ酸、非極性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｖａｌなど）を置換する非極性側鎖を有するアミノ酸、塩基性／正に荷電した別の極性アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇなど）を置換する塩基性／正に荷電した極性アミノ酸、極性側鎖を有する別の非荷電アミノ酸（例えば、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒなど）を置換する極性側鎖を有する非荷電アミノ酸、ベータ分岐側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、Ｈｅ、ＴｈｒおよびＶａｌ）を置換するベータ分岐側鎖を有するアミノ酸、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒ）を置換する芳香族側鎖を有するアミノ酸などであり得る。
ＣＡＲは、本明細書に記載される特定されたアミノ酸配列（単数または複数）から本質的になり得、その結果、他の構成要素、例えば、他のアミノ酸は、機能的バリアントの生物学的活性を著しくは変化させない。
ＣＡＲ（機能的部分および機能的バリアントを含む）は、任意の長さであり得る、即ち、任意の数のアミノ酸を含み、但し、ＣＡＲ（またはその機能的部分もしくは機能的バリアント）は、それらの生物学的活性、例えば、抗原に特異的に結合する能力、哺乳動物において罹患細胞を検出する能力、または哺乳動物において疾患を処置もしくは予防する能力などを保持する。例えば、ＣＡＲは、約５０～約５０００アミノ酸長、例えば、５０、７０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００以上のアミノ酸長であり得る。
ＣＡＲ（本発明の機能的部分および機能的バリアントを含む）は、１または複数の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含み得る。かかる合成アミノ酸は、当該分野で公知であり、これには、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、－アミノ ｎ－デカン酸、ホモセリン、Ｓ－アセチルアミノメチル－システイン、トランス－３－ヒドロキシプロリンおよびトランス－４－ヒドロキシプロリン、４－アミノフェニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、４－カルボキシフェニルアラニン、β－フェニルセリン、β－ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、ａ－ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン－２－カルボン酸、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’－ベンジル－Ｎ’－メチル－リシン、Ν’，Ν’－ジベンジル－リシン、６－ヒドロキシリシン、オルニチン、－アミノシクロペンタンカルボン酸、ａ－アミノシクロヘキサンカルボン酸、ａ－アミノシクロヘプタンカルボン酸、ａ－（２－アミノ－２－ノルボルナン）－カルボン酸、γ－ジアミノ酪酸、β－ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニンおよびａ－ｔｅｒｔ－ブチルグリシンが含まれる。
ＣＡＲ（機能的部分および機能的バリアントを含む）は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ－アシル化、例えばジスルフィド架橋を介した環化、もしくは酸付加塩へ変換および／または任意選択で二量体化もしくは重合、あるいはコンジュゲートされ得る。
ＣＡＲ（その機能的部分および機能的バリアントを含む）は、当該分野で公知の方法によって得られ得る。ＣＡＲは、ポリペプチドまたはタンパク質を作製する任意の適切な方法によって作製され得る。ポリペプチドおよびタンパク質をデノボ合成する適切な方法は、Ｃｈａｎら，Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ，２０００年；Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｉｄ，Ｒ．編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，２０００年；Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ，Ｗｅｓｔｗｏｏｄら編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ，２００１年；および米国特許第５，４４９，７５２号などの参考文献に記載されている。キメラ抗原受容体を生成する方法、かかる受容体を含むＴ細胞、およびそれらの使用（例えば、癌の処置のため）は、当該分野で公知であり、本明細書にさらに記載されている（例えば、その各々が、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓら，２０１０年，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８巻：４号、６６６～６６８頁；Ｍｏｒｇａｎら，２０１０年，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，オンライン公開２月２３日，２０１０年，１～９頁；Ｔｉｌｌら，２００８年，Ｂｌｏｏｄ，１１２巻：２２６１～２２７１頁；Ｐａｒｋら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２９巻：５５０～５５７頁，２０１１年；Ｇｒｕｐｐら，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．，３６８巻：１５０９～１５１８頁，２０１３年；Ｈａｎら，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．，６巻：４７頁，２０１３年；Ｔｕｍａｉｎｉら，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，１５巻，１４０６～１４１７頁，２０１３年；Ｈａｓｏら，（２０１３年）Ｂｌｏｏｄ，１２１巻，１１６５～１１７４頁；ＷＯ２０１２／０７９０００、ＷＯ２０１３／１２６７２６；および米国特許出願公開第２０１２／０２１３７８３号を参照のこと）。例えば、開示されたキメラ抗原結合性受容体をコードする核酸分子は、開示されたＣＡＲを作製するために、Ｔ細胞などの宿主細胞に形質導入するために使用される発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター）中に含まれ得る。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体を使用する方法は、対象からＴ細胞を単離するステップ、キメラ抗原受容体をコードする発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター）をＴ細胞に形質導入するステップ、および対象における処置、例えば腫瘍の処置のために、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を対象に投与するステップを含む。
Ｂ．抗体および抗原結合性フラグメント
一実施形態は、本明細書に開示される活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、本明細書で開示された抗原のうち１または複数に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性ドメインもしくは部分をさらに提供する。本明細書で使用する場合、「ＣＡＲを発現するＴ細胞」または「ＣＡＲ Ｔ細胞」とは、ＣＡＲを発現するＴ細胞を意味し、例えば、ＣＡＲの抗体由来の標的化ドメインによって決定される抗原特異性を有する。
本明細書で使用する場合、「抗原結合性ドメイン」は、抗体およびその抗原結合性フラグメントを含み得る。用語「抗体」は、最も広い意味で本明細書において使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、およびそれらの抗原結合性フラグメントを含むがこれらに限定されない種々の抗体構造を包含する。抗体の非限定的な例には、例えば、当該分野で公知のインタクトな免疫グロブリン、ならびに抗原に対する結合親和性を保持するそのバリアントおよびフラグメントが含まれる。
「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体である、即ち、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る可能な天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性エピトープに対するものである。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるという抗体の特徴を示すのであって、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈すべきではない。一部の例では、モノクローナル抗体は、単一クローンのＢリンパ球によって産生された抗体、または単一の抗体（またはその抗原結合性フラグメント）の抗体の軽鎖および重鎖可変領域をコードする核酸がトランスフェクトされた細胞、もしくはその子孫によって産生された抗体である。一部の例では、モノクローナル抗体は、対象から単離される。モノクローナル抗体は、抗原結合または他の免疫グロブリン機能に対する影響を実質的に有さない保存的アミノ酸置換を有し得る。モノクローナル抗体の産生の例示的な方法は公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１３年）を参照のこと。
典型的には、免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続された重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子を含む。２つの型の軽鎖、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）が存在する。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥが存在する。
各重鎖および軽鎖は、定常領域（または定常ドメイン）および可変領域（または可変ドメインを含有する；例えば、Ｋｉｎｄｔら Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第６版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，９１頁（２００７年）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖の可変領域は、組み合わさって、抗原に特異的に結合する。さらなる実施形態では、重鎖可変領域のみが必要とされる。例えば、重鎖のみからなる天然に存在するラクダ科動物（camelid）抗体は、軽鎖の非存在下で機能的かつ安定である（例えば、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３６３巻：４４６～４４８頁，１９９３年；Ｓｈｅｒｉｆｆら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，３巻：７３３～７３６頁，１９９６年を参照のこと）。「ＶＨ」または「ＶＨ」への言及は、抗原結合性フラグメント、例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂのものを含む、抗体重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」または「ＶＬ」への言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂのものを含む、抗体軽鎖の可変ドメインを指す。
軽鎖および重鎖の可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域を含有する（例えば、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１年を参照のこと）。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。構成成分である軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、３次元空間にＣＤＲを位置付けアラインさせるように機能する。
ＣＤＲは主に、抗原のエピトープへの結合を担う。所与のＣＤＲのアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔら（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，第５版 Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１年；「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら，（ＪＭＢ ２７３巻，９２７～９４８頁，１９９７年；「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）、およびＬｅｆｒａｎｃら（「ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ」，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７巻：５５～７７頁，２００３年；「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）に記載されるものを含む、いくつかの周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定され得る。各鎖のＣＤＲは、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（Ｎ末端からＣ末端へ）と呼ばれ、典型的には、特定のＣＤＲが位置する鎖によっても同定される。したがって、ＶＨ ＣＤＲ３は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ３であるが、ＶＬ ＣＤＲ１は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ１である。軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と呼ばれる場合もある。重鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と呼ばれる場合もある。
「抗原結合性フラグメント」は、同族抗原を特異的に認識する能力を保持する全長抗体の部分、ならびにかかる部分の種々の組合せである。抗原結合性フラグメントの非限定的な例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；二特異性抗体；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体フラグメントから形成された多特異的抗体が含まれる。抗体フラグメントには、抗体全体の改変によって産生された抗原結合性フラグメント、または組換えＤＮＡ方法論を使用してｄｅ ｎｏｖｏで合成された抗原結合性フラグメントが含まれる（例えば、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（編），Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１～２巻，第２版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ，２０１０年を参照のこと）。
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、適切なポリペプチドリンカーによって連結された１または複数の抗体（複数可）のＶＨおよびＶＬドメインを遺伝学的に融合された単鎖分子として含有する遺伝子操作された分子である（例えば、Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２巻：４２３～４２６頁，１９８８年；Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５巻：５８７９～５８８３頁，１９８８年；Ａｈｍａｄら，Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１２年，ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１２／９８０２５０；Ｍａｒｂｒｙ，ＩＤｒｕｇｓ，１３巻：５４３～５４９頁，２０１０年を参照のこと）。ｓｃＦｖ中のＶＨドメインおよびＶＬドメインの分子内配向は、典型的には、ｓｃＦｖにとって決定的ではない。したがって、両方の可能な配置（ＶＨドメイン－リンカードメイン－ＶＬドメイン；ＶＬドメイン－リンカードメイン－ＶＨドメイン）を有するｓｃＦｖが使用され得る。
ｄｓＦｖでは、重鎖および軽鎖の可変鎖は、鎖の会合を安定化させるために、ジスルフィド結合を導入するように変異されている。ＶＨおよびＶＬドメインが、単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによって、そのドメインを別の鎖の相補的ドメインとペアリングさせ、２つの抗原結合部位を創出する、二価の二重特異的抗体である二特異性抗体もまた含まれる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０巻：６４４４～６４４８頁，１９９３年；Ｐｏｌｊａｋら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２巻：１１２１～１１２３頁，１９９４年を参照のこと）。
抗体は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）およびヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異的抗体）などの、遺伝子操作された形態もまた含む。Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４～１９９５年（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）；Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７年もまた参照のこと。
天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築され得、組換え産生され得、または、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＨｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６巻：１２７５～１２８１頁（１９８９年）に記載されるように、可変重鎖および可変軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。例えば、キメラ、ヒト化、ＣＤＲ移植、単鎖および二機能性抗体を作製するこれらおよび他の方法は、当業者に周知である（ＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １４巻：２４３～２４６頁（１９９３年）；Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ ３４１巻：５４４～５４６頁（１９８９年）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，上記，１９８８年；Ｈｉｌｙａｒｄら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９９２年）；Ｂｏｒｒａｂｅｃｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２版（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５年）；その各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいてその抗原への参照抗体の結合を５０％以上遮断する抗体を指し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいてその抗原への抗体の結合を５０％以上遮断する。抗体競合アッセイは公知であり、例示的な競合アッセイが本明細書で提供される。
「ヒト化」抗体または抗原結合性フラグメントは、ヒトフレームワーク領域および非ヒト（例えば、マウス、ラットまたは合成）抗体または抗原結合性フラグメント由来の１または複数のＣＤＲを含む。ＣＤＲを提供する非ヒト抗体または抗原結合性フラグメントは、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト抗体または抗原結合性フラグメントは、「アクセプター」と呼ばれる。一実施形態では、全てのＣＤＲが、ヒト化免疫グロブリン中のドナー免疫グロブリン由来である。定常領域は、存在する必要はないが、存在する場合には、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、例えば、少なくとも約８５～９０％、例えば、約９５％以上同一であり得る。したがって、ヒト化抗体または抗原結合性フラグメントの全ての部分は、おそらくはＣＤＲを除いて、天然ヒト抗体配列の対応する部分と実質的に同一である。
「キメラ抗体」は、典型的には異なる種のものである２つの異なる抗体に由来する配列を含む抗体である。一部の例では、キメラ抗体は、１つのヒト抗体由来の１または複数のＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域ならびに別のヒト抗体由来のＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域を含む。
「完全ヒト抗体」または「ヒト抗体」は、ヒトゲノム由来の（またはヒトゲノムに由来する）配列を含むが、別の種由来の配列を含まない抗体である。一部の実施形態では、ヒト抗体は、ヒトゲノム由来の（またはヒトゲノムに由来する）ＣＤＲ、フレームワーク領域および（存在する場合には）Ｆｃ領域を含む。ヒト抗体は、例えば、ファージディスプレイによって、ヒトゲノムに由来する配列に基づいて配列を創出するためのテクノロジーを使用して、またはトランスジェニック動物を使用して、同定および単離され得る（例えば、Ｂａｒｂａｓら Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕｅｌ．第１版 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００４年 Ｐｒｉｎｔ．；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２３巻：１１１７～１１２５頁，２００５年；Ｌｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０巻：４５０～４５９頁，２００８年を参照のこと）。
抗体は、１または複数の結合部位を有し得る。１よりも多い結合部位が存在する場合、これらの結合部位は、互いに同一であってもよく、異なってもよい。例えば、天然に存在する免疫グロブリンは、２つの同一の結合部位を有し、単鎖抗体またはＦａｂフラグメントは、１つの結合部位を有するが、二重特異的または二機能性抗体は、２つの異なる結合部位を有する。
ＣＡＲの任意の機能的部分に結合する能力について抗体を試験する方法は、当該分野で公知であり、これには、任意の抗体－抗原結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降および競合阻害アッセイなどが含まれる（例えば、Ｊａｎｅｗａｙら、以下、米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６号Ａｌ、および米国特許第７，３３８，９２９号を参照のこと）。
また、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分は、検出可能な標識、例えば、放射性同位体、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）および元素粒子（例えば、金粒子）などを含み得る。
Ｃ．コンジュゲート
本明細書に開示される活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、または本明細書に開示された抗原のうち１もしくは複数に対して特異的なモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性フラグメントは、当業者に公知のいくつもの手段を使用して、エフェクター分子または検出可能なマーカーなどの薬剤にコンジュゲートされ得る。共有結合および非共有結合の両方の手段が使用され得る。コンジュゲートには、本明細書に開示された抗原のうち１または複数に特異的に結合する抗体または抗原結合性フラグメントへのエフェクター分子または検出可能なマーカーの共有結合的連結が存在する分子を含むがこれらに限定されない。当業者は、化学療法剤、抗血管新生剤、毒素、放射活性剤、例えば、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３Ｈおよび３５Ｓ、ならびに他の標識、標的部分およびリガンドなどを含む（がこれらに限定されない）種々のエフェクター分子および検出可能なマーカーが使用され得ることを理解する。
特定のエフェクター分子または検出可能なマーカーの選択は、特定の標的分子または細胞、および所望の生物学的効果に依存する。したがって、例えば、エフェクター分子は、特定の標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の死をもたらすために使用される細胞毒であり得る。
エフェクター分子または検出可能なマーカーを抗体または抗原結合性フラグメントに結合させるための手順は、エフェクターの化学構造に従って変動する。ポリペプチドは、典型的には、種々の官能基；例えば、カルボン酸（ＣＯＯＨ）、遊離アミン（－ＮＨ２）またはスルフヒドリル（－ＳＨ）基を含有し、これらは、エフェクター分子または検出可能なマーカーの結合を生じるための、抗体上の適切な官能基との反応のために利用可能である。あるいは、抗体または抗原結合性フラグメントは、さらなる反応性官能基を曝露または結合するために誘導体化される。誘導体化は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬから入手可能なものなどの、いくつかの公知のリンカー分子のいずれかの結合を含み得る。リンカーは、抗体または抗原結合性フラグメントをエフェクター分子または検出可能なマーカーに結合させるために使用される任意の分子であり得る。リンカーは、抗体または抗原結合性フラグメントおよびエフェクター分子または検出可能なマーカーの両方への共有結合を形成することが可能である。適切なリンカーは、当業者に周知であり、これには、直鎖もしくは分岐鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカーまたはペプチドリンカーが含まれるがこれらに限定されない。抗体または抗原結合性フラグメントおよびエフェクター分子または検出可能なマーカーがポリペプチドである場合、リンカーは、それらの側基を介して（例えば、システインへのジスルフィド連結を介して）構成成分アミノ酸に、または末端アミノ酸のアルファ炭素のアミノおよびカルボキシル基に結合され得る。
幾つかの実施形態では、リンカーは、存在する場合には、リンカーのサイズを増加させ、その結果、エフェクター分子または検出可能なマーカーと抗体または抗原結合性フラグメントとの間の距離が増加される、スペーサーエレメントを含み得る。例示的なスペーサーは、当業者に公知であり、これには、米国特許第７，９６４，５６６号、米国特許第７，４９８，２９８号、米国特許第６，８８４，８６９号、米国特許第６，３２３，３１５号、米国特許第６，２３９，１０４号、米国特許第６，０３４，０６５号、米国特許第５，７８０，５８８号、米国特許第５，６６５，８６０号、米国特許第５，６６３，１４９号、米国特許第５，６３５，４８３号、米国特許第５，５９９，９０２号、米国特許第５，５５４，７２５号、米国特許第５，５３０，０９７号、米国特許第５，５２１，２８４号、米国特許第５，５０４，１９１号、米国特許第５，４１０，０２４号、米国特許第５，１３８，０３６号、米国特許第５，０７６，９７３号、米国特許第４，９８６，９８８号、米国特許第４，９７８，７４４号、米国特許第４，８７９，２７８号、米国特許第４，８１６，４４４号および米国特許第４，４８６，４１４号、ならびに米国特許出願公開第２０１１０２１２０８８号および米国特許出願公開第２０１１００７０２４８号中に列挙されるものが含まれ、その各々は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、リンカーは、細胞内条件下で切断可能であり、その結果、リンカーの切断は、細胞内環境中で、抗体または抗原結合性フラグメントからエフェクター分子または検出可能なマーカーを放出させる。さらに他の実施形態では、リンカーは切断不能であり、エフェクター分子または検出可能なマーカーは、例えば、抗体分解によって放出される。一部の実施形態では、リンカーは、細胞内環境中（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内）に存在する切断剤によって切断可能である。リンカーは、例えば、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含むがこれらに限定されない細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチドリンカーであり得る。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。しかし、リンカーは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸長、例えば、１～２、１～３、２～５、３～１０、３～１５、１～５、１～１０、１～１５アミノ酸長であり得る。プロテアーゼには、カテプシンＢおよびＤならびにプラスミンが含まれ得、その全ては、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して、標的細胞の内側での活性薬物の放出を生じることが公知である（例えば、ＤｕｂｏｗｃｈｉｋおよびＷａｌｋｅｒ，１９９９年，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３巻：６７～１２３頁を参照のこと）。例えば、チオール依存的プロテアーゼであるカテプシンＢによって切断可能なペプチドリンカーが使用され得る（例えば、フェニルアラニン－ロイシンまたはグリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシンリンカー）。かかるリンカーの他の例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２１４，３４５号に記載されている。具体的な実施形態では、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーは、バリン－シトルリン（Ｃｉｔｒｕｌｉｎｅ）リンカーまたはフェニルアラニン－リシンリンカーである（例えば、バリン－シトルリンリンカーを用いたドキソルビシンの合成を記載する米国特許第６，２１４，３４５号を参照のこと）。
他の実施形態では、切断可能なリンカーは、ｐＨ感受性、即ち、ある特定のｐＨ値において加水分解に対して感受性である。典型的には、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解可能である。例えば、リソソームにおいて加水分解可能な酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス－アコニットアミド（cis-aconitic amide）、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）が使用され得る（例えば、米国特許第５，１２２，３６８号；米国特許第５，８２４，８０５号；米国特許第５，６２２，９２９号；ＤｕｂｏｗｃｈｉｋおよびＷａｌｋｅｒ，１９９９年，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３巻：６７～１２３頁；Ｎｅｖｉｌｌｅら，１９８９年，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４巻：１４６５３～１４６６１頁を参照のこと）。かかるリンカーは、血液中などの中性のｐＨ条件下で比較的安定であるが、リソソームのおよそのｐＨであるｐＨ５．５または５．０を下回るｐＨでは不安定である。ある特定の実施形態では、加水分解可能なリンカーは、チオエーテルリンカー（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療剤に結合されたチオエーテルなど）である（例えば、米国特許第５，６２２，９２９号を参照のこと）。
他の実施形態では、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。種々のジスルフィドリンカーが当該分野で公知であり、これには、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）ブチレート）およびＳＭＰＴ（Ｎ－スクシンイミジル－オキシカルボニル－アルファ－メチル－アルファ－（２－ピリジル－ジチオ）トルエン）－、ＳＰＤＢおよびＳＭＰＴを使用して形成され得るものが含まれる（例えば、Ｔｈｏｒｐｅら，１９８７年，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７巻：５９２４～５９３１頁；Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋら，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ Ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（Ｃ．Ｗ．Ｖｏｇｅｌ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕ．Ｐｒｅｓｓ、１９８７年）；Ｐｈｉｌｌｉｐｓら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８巻：９２８０～９２９０頁，２００８年を参照のこと）。米国特許第４，８８０，９３５号もまた参照のこと。
さらに他の具体的な実施形態では、リンカーは、マロネートリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９９５年，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５巻：１３８７～９３頁）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕら，１９９５年，Ｂｉｏｏｒｇ－Ｍｅｄ－Ｃｈｅｍ．３巻（１０号）：１２９９～１３０４頁）または３’－Ｎ－アミドアナログ（Ｌａｕら，１９９５年，Ｂｉｏｏｒｇ－Ｍｅｄ－Ｃｈｅｍ．３巻（１０号）：１３０５～１２頁）である。
さらに他の実施形態では、リンカーは切断不能であり、エフェクター分子または検出可能なマーカーは、抗体分解によって放出される（その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号を参照のこと）。
幾つかの実施形態では、リンカーは、細胞外環境中での切断に対して抵抗性である。例えば、コンジュゲートが細胞外環境中（例えば、血漿中）に存在する場合、コンジュゲートのサンプル中のリンカーの約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約３％以下、または約１％以下が切断される。リンカーが細胞外環境中での切断に対して抵抗性であるか否かは、例えば、目的のリンカーを含有するコンジュゲートを、所定の期間（例えば、２、４、８、１６または２４時間）にわたって血漿と共にインキュベートし、次いで、血漿中に存在する遊離のエフェクター分子または検出可能なマーカーの量を定量することによって決定され得る。コンジュゲート中で使用され得る種々の例示的なリンカーは、ＷＯ２００４／０１０９５７、米国特許出願公開第２００６／００７４００８号、米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号および米国特許出願公開第２００６／００２４３１７号に記載されており、その各々は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
幾つかの実施形態では、ＣＡＲのコンジュゲート、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分、および１または複数の小分子毒素、例えば、カリチアマイシン、マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、ドラスタチン、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、トリコテシンおよびＣＣ１０６５ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体が提供される。
マイタンシノイド毒素部分としての使用に適切なマイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）化合物は、当該分野で周知であり、公知の方法に従って天然供給源から単離され得、遺伝子操作技術（Ｙｕら（２００２年）ＰＮＡＳ ９９巻：７９６８～７９７３頁を参照のこと）、または公知の方法に従って合成により調製されたマイタンシノール（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｌ）およびマイタンシノールアナログを使用して産生され得る。マイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂阻害剤である。マイタンシンは、東アフリカの低木Ｍａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａから最初に単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。引き続いて、ある特定の微生物もまた、マイタンシノールおよびＣ－３マイタンシノールエステルなどのマイタンシノイドを産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成マイタンシノールならびにその誘導体およびアナログは、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号；米国特許第４，２４８，８７０号；米国特許第４，２５６，７４６号；米国特許第４，２６０，６０８号；米国特許第４，２６５，８１４号；米国特許第４，２９４，７５７号；米国特許第４，３０７，０１６号；米国特許第４，３０８，２６８号；米国特許第４，３０８，２６９号；米国特許第４，３０９，４２８号；米国特許第４，３１３，９４６号；米国特許第４，３１５，９２９号；米国特許第４，３１７，８２１号；米国特許第４，３２２，３４８号；米国特許第４，３３１，５９８号；米国特許第４，３６１，６５０号；米国特許第４，３６４，８６６号；米国特許第４，４２４，２１９号；米国特許第４，４５０，２５４号；米国特許第４，３６２，６６３号；および米国特許第４，３７１，５３３号に開示されており，その各々は、参照により本明細書に組み込まれる。マイタンシノイドを含有するコンジュゲート、それを作製する方法、およびそれらの治療的使用は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号；米国特許第５，４１６，０６４号；米国特許第６，４４１，１６３号および欧州特許ＥＰ０ ４２５ ２３５ Ｂ１に開示されており、それらの開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
さらなる毒素が、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分と共に使用され得る。例示的な毒素には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）、ヒマ毒、アブリン、ジフテリア毒素およびそのサブユニット、リボトキシン（ｒｉｂｏｔｏｘｉｎ）、リボヌクレアーゼ、サポリンおよびカリチアマイシン、ならびにボツリヌス毒素Ａ～Ｆが含まれる。これらの毒素は、当該分野で周知であり、多くは、商業的供給源（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から容易に入手可能である。企図される毒素には、これらの毒素のバリアントも含まれる（例えば、米国特許第５，０７９，１６３号および米国特許第４，６８９，４０１号を参照のこと）。
サポリンは、リボソーム複合体の６０Ｓ部分を不活性化することによってタンパク質合成を破壊する、Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓに由来する毒素である（Ｓｔｉｒｐｅら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０巻：４０５～４１２頁，１９９２年）。しかし、この毒素は、細胞中への特異的進入のための機構を有さず、したがって、細胞によって効率的に取り込まれるために、内在化される細胞表面タンパク質を認識する抗体または抗原結合性フラグメントへのコンジュゲートを必要とする。
ジフテリア毒素は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅから単離される。典型的には、免疫毒素における使用のためのジフテリア毒素は、非特異的毒性を低減または排除するために変異される。完全な酵素活性を有するが非特異的毒性が顕著に低減された、ＣＲＭ１０７として公知の変異体は、１９７０年代以降公知であり（ＬａｉｒｄおよびＧｒｏｍａｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９巻：２２０頁，１９７６年）、ヒト臨床試験において使用されてきた。米国特許第５，７９２，４５８号および米国特許第５，２０８，０２１号を参照のこと。
ヒマ毒は、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（トウゴマ）由来のレクチンＲＣＡ６０である。ヒマ毒の例については、米国特許第５，０７９，１６３号および米国特許第４，６８９，４０１号を参照のこと。Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓアグルチニン（ＲＣＡ）は、それぞれ、およそ６５ｋＤおよび１２０ｋＤの分子量に従って、ＲＣＡ６０およびＲＣＡ１２０と称される２つの形態で存在する（ＮｉｃｈｏｌｓｏｎおよびＢｌａｕｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２６６巻：５４３頁，１９７２年）。Ａ鎖は、タンパク質合成の不活性化および細胞の死滅を担う。Ｂ鎖は、ヒマ毒を細胞表面ガラクトース残基に結合させ、細胞質ゾル中へのＡ鎖の輸送を促進する（Ｏｌｓｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ２４９巻：６２７～６３１頁，１９７４年および米国特許第３，０６０，１６５号）。
リボヌクレアーゼもまた、免疫毒素としての使用のために標的化分子にコンジュゲートされてきた（Ｓｕｚｕｋｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７巻：２６５～７０頁，１９９９年を参照のこと）。例示的なリボトキシン、例えば、α－サルシン（α－ｓａｒｃｉｎ）およびレストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）は、例えば、Ｒａｔｈｏｒｅら，Ｇｅｎｅ １９０巻：３１～５頁，１９９７年；ならびにＧｏｙａｌおよびＢａｔｒａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４５巻２部：２４７～５４頁，２０００年で議論されている。カリチアマイシンは、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａから最初に単離されたものであり、ＤＮＡ中にアポトーシスをもたらす二本鎖切断を生じさせて、エンジイン抗腫瘍抗生物質ファミリーのメンバーである（例えば、Ｌｅｅら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４２巻：１０７０～８７頁，１９８９年を参照のこと）。この薬物は、臨床試験中の免疫毒素の毒性部分である（例えば、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．１１巻：７３５～４１頁，２０００年を参照のこと）。
アブリンは、Ａｂｒｕｓ ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓ由来の毒性レクチンを含む。毒性素であるアブリンａ、ｂ、ｃおよびｄは、約６３ｋＤおよび６７ｋＤの分子量を有し、２つのジスルフィド連結されたポリペプチド鎖ＡおよびＢから構成される。Ａ鎖はタンパク質合成を阻害する；Ｂ鎖（アブリン－ｂ）は、Ｄ－ガラクトース残基に結合する（Ｆｕｎａｔｓｕら，Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５２巻：１０９５頁，１９８８年；およびＯｌｓｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０巻：３３０～３３５頁，１９７８年を参照のこと）。
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、本明細書に開示された抗原のうち１または複数に対して特異的なモノクローナル抗体、その抗原結合性フラグメントはまた、検出可能なマーカー；例えば、ＥＬＩＳＡ、分光光度法、フローサイトメトリー、顕微鏡法または画像診断技術（例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、コンピュータ体軸断層撮影（ｃｏｍｐｕｔｅｄ ａｘｉａｌ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）（ＣＡＴ）スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、核磁気共鳴画像法（ＮＭＲＩ）、磁気共鳴断層撮影（ＭＴＲ）、超音波、光ファイバー試験および腹腔鏡下試験）による検出が可能な検出可能なマーカーとコンジュゲートされ得る。検出可能なマーカーの具体的な非限定的な例には、フルオロフォア、化学発光剤、酵素的連結、放射活性同位体および重金属または化合物（例えば、ＭＲＩによる検出のための超常磁性酸化鉄ナノ結晶）が含まれる。例えば、有用な検出可能なマーカーには、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５－ジメチルアミン－１－ナフタレンスルホニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）塩化物、フィコエリトリン、ランタニドリン光体などを含む蛍光化合物が含まれる。ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などの生物発光マーカーもまた使用される。ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分は、検出のために有用な酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどにもコンジュゲートされ得る。ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分が、検出可能な酵素とコンジュゲートされる場合、それは、識別できる反応産物を産生するために酵素が使用するさらなる試薬を添加することによって検出され得る。例えば、薬剤西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加が、視覚的に検出可能な着色反応産物をもたらす。ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分はまた、ビオチンとコンジュゲートされ得、アビジンまたはストレプトアビジンの結合の間接的な測定を介して検出され得る。アビジン自体が酵素または蛍光標識とコンジュゲートされ得ることに留意すべきである。
ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分は、ガドリニウムなどの常磁性薬剤とコンジュゲートされ得る。超常磁性酸化鉄などの常磁性薬剤もまた、標識として使用される。抗体は、ランタニド（例えば、ユーロピウムおよびジスプロシウム）およびマンガンともコンジュゲートされ得る。抗体または抗原結合性フラグメントはまた、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体への結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）で標識され得る。
ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分はまた、放射標識されたアミノ酸とコンジュゲートされ得る。放射標識は、診断目的および治療目的の両方のために使用され得る。例えば、放射標識は、ｘ線、発光スペクトルまたは他の診断技術によって本明細書に開示された抗原および抗原発現細胞のうち１または複数を検出するために使用され得る。さらに、放射標識は、対象における腫瘍の処置のため、例えば、神経芽細胞腫の処置のために、毒素として治療的に使用され得る。ポリペプチドのための標識の例には、以下の放射性同位体または放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）が含まれるがこれらに限定されない：３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ。
かかる検出可能なマーカーを検出する手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、放射標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出され得、蛍光マーカーは、発せられた照明を検出するために光検出器を使用して検出され得る。酵素標識は、典型的には、酵素に基質を提供し、基質に対する酵素の作用によって産生された反応産物を検出することによって検出され、発色標識は、着色標識を単純に可視化することによって検出される。
Ｄ．ヌクレオチド、発現、ベクターおよび宿主細胞
本明細書に記載されるＣＡＲ、抗体またはその抗原結合性部分（その機能的部分および機能的バリアントを含む）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が、本発明の一実施形態によってさらに提供される。本発明の核酸は、本明細書に記載されるリーダー配列、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび／または細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
一実施形態では、Ｎ末端からＣ末端へ、少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離された核酸分子が提供される。
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲの一実施形態では、コードされる細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する抗体の少なくとも１つの単鎖可変フラグメントを含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲの別の実施形態では、コードされる細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域を含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲのさらに別の実施形態では、コードされるＣＡＲ細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する少なくとも１つのリポカリンベースの抗原結合性抗原（アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ））を含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲの一実施形態では、コードされる細胞外抗原結合性ドメインが、リンカードメインによって膜貫通ドメインに接続される、単離された核酸分子が提供される。
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲの別の実施形態では、コードされる細胞外抗原結合性ドメインに、リーダーまたはシグナルペプチドをコードする配列が先行する、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲのさらに別の実施形態では、コードされる細胞外抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソセリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ＣＤ３８、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＦＧＦＲ４、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ、またはそれらの任意の組合せを含むがこれらに限定されない抗原を標的化する、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲのある特定の実施形態では、コードされる細胞外抗原結合性ドメインが、抗ＣＤ１９ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ２０ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ２２ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＲＯＲ１ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＴＳＬＰＲ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗メソセリンｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３８ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１３８ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ２ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＦＧＦＲ４ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＰＭＳＡ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗糖脂質Ｆ７７ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＧＤ－２ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＮＹ－ＥＳｏ－１ ＴＣＲ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、または８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するそのアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の組合せを含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲの一態様では、本明細書で提供されるＣＡＲは、リンカードメインをさらに含む。
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲの一実施形態では、細胞外抗原結合性ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその両方が、リンカードメインによって膜貫通ドメインに接続される、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲの一実施形態では、コードされるリンカードメインが、ＣＤ８の細胞外ドメインに由来し、膜貫通ドメインに連結される、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲのさらに別の実施形態では、膜貫通ドメインをコードする核酸配列が、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するそのヌクレオチド配列を含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲの一実施形態では、コードされる膜貫通ドメインが、少なくとも１つであるが１０以下の改変を含むアミノ酸配列、または８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するその配列を含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲの別の実施形態では、コードされるＣＡＲが、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４、またはそれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインをさらに含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲのさらに別の実施形態では、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをさらに含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
本明細書に開示されるＣＡＲの一実施形態では、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインに対してＣ末端側に配置される、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲの別の実施形態では、コードされる少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、またはそれらの組合せを含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲのさらなる実施形態では、コードされる少なくとも１つの共刺激ドメインが、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）の機能的シグナル伝達ドメイン、またはそれらの組合せを含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲの一実施形態では、リーダー配列またはシグナルペプチド配列をさらに含有する、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン改変され得る。特定の理論に束縛されないが、ヌクレオチド配列のコドン最適化は、ｍＲＮＡ転写物の翻訳効率を増加させると考えられる。ヌクレオチド配列のコドン最適化は、ネイティブコドンを、同じアミノ酸をコードするが、細胞内でより容易に利用可能なｔＲＮＡによって翻訳され得る別のコドンに置換し、そうして翻訳効率を増加させることを含み得る。ヌクレオチド配列の最適化はまた、翻訳を妨害する二次ｍＲＮＡ構造を低減させ得、そうして翻訳効率を増加させる。
本発明の実施形態では、核酸は、本発明のＣＡＲの抗原結合性ドメインをコードするコドン改変されたヌクレオチド配列を含み得る。本発明の別の実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるＣＡＲ（その機能的部分および機能的バリアントを含む）のいずれかをコードするコドン改変されたヌクレオチド配列を含み得る。
「核酸」は、本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸分子」を含み、一般に、一本鎖または二本鎖の、合成のまたは天然供給源から得られた（例えば、単離および／または精製された）ものであり得、天然、非天然または変更されたヌクレオチドを含有し得、未改変のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見出されるホスホジエステルの代わりに、天然、非天然または変更されたヌクレオチド間連結、例えば、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）連結またはホスホロチオエート連結を含有し得る、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを意味する。一部の実施形態では、核酸は、いずれの挿入、欠失、逆位および／または置換も含まない。しかし、一部の場合には、本明細書で議論されるように、核酸は、１または複数の挿入、欠失、逆位および／または置換を含むことが適切であり得る。
組換え核酸は、天然に存在しない配列を有するもの、または配列の２つのさもなければ分離されたセグメントの人工的な組合せによって作製される配列を有するものであり得る。この人工的な組合せは、化学的合成によって、またはより一般的には、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、上記に記載されるものなどの遺伝子操作技術による、核酸の単離されたセグメントの人工的操作によって達成される場合が多い。核酸は、当該分野で公知の手順を使用する化学的合成および／または酵素的ライゲーション反応に基づいて構築され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記およびＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照のこと。例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加させるように、もしくはハイブリダイゼーションの際に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された種々に改変されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチド）を使用して化学合成され得る。核酸を生成するために使用され得る改変型ヌクレオチドの例には、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキューオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－置換されたアデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキューオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ウブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシルおよび２，６－ジアミノプリンが含まれるがこれらに限定されない。あるいは、本発明の核酸のうち１または複数は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ、ＵＳＡ）などの会社から購入できる。
核酸は、ＣＡＲまたはその機能的部分もしくは機能的バリアントのいずれかをコードする任意の単離または精製されたヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、ヌクレオチド配列は、配列のいずれかと縮重するヌクレオチド配列、または縮重配列の組合せを含み得る。
一実施形態は、本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列、または本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離または精製された核酸もまた提供する。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズし得る。「高いストリンジェンシーの条件」とは、ヌクレオチド配列が、非特異的ハイブリダイゼーションよりも検出可能に強い量で、標的配列（本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高いストリンジェンシーの条件には、ヌクレオチド配列と一致したいくつかの小領域（例えば、３～１０塩基）を偶然に有するランダム配列から、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、またはいくつかの散在するミスマッチしか含有しないポリヌクレオチドを識別する条件が含まれる。相補性のかかる小領域は、１４～１７またはそれ超塩基の全長相補体よりも容易に融解され、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、それらを容易に識別可能にする。比較的高いストリンジェンシーの条件には、例えば、約０．０２～０．１ＭのＮａＣｌまたは等価物によって、約５０～７０℃の温度で提供されるような、低塩および／または高温条件が含まれる。かかる高いストリンジェンシーの条件は、存在するとしても、ヌクレオチド配列と鋳型または標的鎖との間のミスマッチをほとんど忍容せず、本発明のＣＡＲのいずれかの発現を検出するのに特に適切である。一般に、条件は、漸増量のホルムアミドの添加によって、よりストリンジェントにされ得ることが理解される。
本明細書に記載される核酸のいずれかに対して、少なくとも約７０％以上、例えば、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸もまた提供される。
一実施形態では、核酸は、組換え発現ベクター中に取り込まれ得る。これに関して、一実施形態は、核酸のいずれかを含む組換え発現ベクターを提供する。本明細書の目的のために、用語「組換え発現ベクター」とは、構築物が、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む場合、およびベクターが、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが細胞内で発現されるのに十分な条件下で細胞と接触させられる場合に、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの発現を可能にする、遺伝子改変されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド構築物を意味する。ベクターは、全体としては天然に存在しない。
しかし、ベクターの一部は、天然に存在し得る。組換え発現ベクターは、一本鎖または二本鎖の、合成または一部天然供給源から得られたものであり得、天然、非天然または変更されたヌクレオチドを含有し得る、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むがこれらに限定されない任意の型のヌクレオチドを含み得る。組換え発現ベクターは、天然に存在するもしくは天然に存在しないヌクレオチド間連結、またはその両方の型の連結を含み得る。好ましくは、天然に存在しないまたは変更されたヌクレオチドまたはヌクレオチド間連結は、ベクターの転写も複製も邪魔しない。
一実施形態では、組換え発現ベクターは、任意の適切な組換え発現ベクターであり得、任意の適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするために使用され得る。適切なベクターには、プラスミドおよびウイルスなどの、繁殖および増殖のためもしくは発現のため、またはその両方のために設計されたものが含まれる。ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ、ＭＤ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）からなる群から選択され得る。
バクテリオファージベクター、例えば、λυΤΙ Ο、λυΤΙ １、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＭＢＬ４およびλΝΜΙ １４９もまた使用され得る。植物発現ベクターの例には、ｐＢＩＯｌ、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＨＯｌ．３、ｐＢＩ１２１およびｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が含まれる。動物発現ベクターの例には、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭおよびｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が含まれる。組換え発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。レンチウイルスベクターは、特に、Ｍｉｌｏｎｅら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７巻（８号）：１４５３～１４６４頁（２００９年）に提供されるような自己不活性化レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部分に由来するベクターである。クリニックにおいて使用され得るレンチウイルスベクターの他の例には、例えば、限定としてではなく、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ ｐｌｃのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子送達テクノロジー、ＬｅｎｔｉｇｅｎのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクター系などが含まれる。非臨床型のレンチウイルスベクターもまた利用可能であり、当業者に公知である。
幾つかのトランスフェクション技術が、当該分野で一般に公知である（例えば、Ｇｒａｈａｍら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻：４５６～４６７頁（１９７３年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上記；Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８６年）；およびＣｈｕら，Ｇｅｎｅ，１３巻：９７頁（１９８１年）を参照のこと）。
トランスフェクション方法には、リン酸カルシウム共沈（例えば、Ｇｒａｈａｍら、上記を参照のこと）、培養細胞中への直接的マイクロインジェクション（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，２２巻：４７９～４８８頁（１９８０年）を参照のこと）、エレクトロポレーション（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６巻：７４２～７５１頁（１９８８年）を参照のこと），リポソーム媒介性遺伝子移入（例えば、Ｍａｎｎｉｎｏら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６巻：６８２～６９０頁（１９８８年）を参照のこと）、脂質媒介性形質導入（例えば、Ｆｅｉｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４巻：７４１３～７４１７頁（１９８７年）を参照のこと）および高速微小推進剤（ｈｉｇｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）を使用する核酸送達（例えば、Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７巻：７０～７３頁（１９８７年）を参照のこと）が含まれる。
一実施形態では、組換え発現ベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記およびＡｕｓｕｂｅｌら、上記に記載される、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る。環状または直鎖状である発現ベクターの構築物は、原核生物または真核生物宿主細胞において機能的な複製系を含有するように調製され得る。複製系は、例えば、ＣｏｌＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルスなどに由来し得る。
組換え発現ベクターは、ベクターがＤＮＡベースであるかＲＮＡベースであるかを考慮に入れて、必要に応じて、ベクターが導入される宿主細胞の型（例えば、細菌、真菌、植物または動物）に特異的な調節配列、例えば、転写および翻訳開始および終結コドンを含み得る。組換え発現ベクターは、クローニングを容易にするための制限部位を含み得る。
組換え発現ベクターは、形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする、１または複数のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子には、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性、原栄養性を提供するための栄養要求性宿主における補完などが含まれる。本発明の発現ベクターに適切なマーカー遺伝子には、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。
組換え発現ベクターは、ＣＡＲ（その機能的部分および機能的バリアントを含む）をコードするヌクレオチド配列に、またはＣＡＲをコードするヌクレオチド配列に対して相補的なもしくはかかるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に連結したネイティブまたは非ネイティブのプロモーターを含み得る。プロモーターの選択、例えば、強い、弱い、誘導性、組織特異的および発生特異的は、当業者の技術範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列をプロモーターと組み合わせることもまた、当業者の技術範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、またはマウス幹細胞ウイルスの末端反復配列において見出されるプロモーターであり得る。
組換え発現ベクターは、一過性の発現のため、安定な発現のため、またはその両方のために設計され得る。また、組換え発現ベクターは、構成的発現または誘導性発現のために作製され得る。
さらに、組換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製され得る。本明細書で使用する場合、用語「自殺遺伝子」とは、自殺遺伝子を発現する細胞を死なせる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、この遺伝子が発現される細胞に薬物などの薬剤に対する感受性を付与する遺伝子、または細胞が薬剤と接触した場合もしくは薬剤に曝露された場合にその細胞を死なせる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該分野で公知であり（例えば、Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃａｒｏｌｉｎｅ Ｊ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＵＫ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｔ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｕｔｔｏｎ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００４年を参照のこと）、これには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ（ｄａｍｉｎａｓｅ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびニトロレダクターゼが含まれる。
一実施形態は、本明細書に記載される組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞をさらに提供する。本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」とは、本発明の組換え発現ベクターを含有し得る任意の型の細胞を指す。宿主細胞は、真核生物細胞、例えば、植物、動物、真菌もしくは藻類であり得る、または原核生物細胞、例えば、細菌もしくは原生生物であり得る。宿主細胞は、培養細胞または初代細胞であり得る、即ち、ヒトなどの生物から直接単離され得る。宿主細胞は、接着細胞または懸濁細胞、即ち、懸濁物中で成長する細胞であり得る。適切な宿主細胞は、当該分野で公知であり、これには、例えば、ＤＨ５ａ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などが含まれる。組換え発現ベクターを増幅または複製することを目的とすると、宿主細胞は、原核生物細胞、例えば、ＤＨ５ａ細胞であり得る。組換えＣＡＲを産生することを目的とすると、宿主細胞は、哺乳動物細胞であり得る。宿主細胞は、ヒト細胞であり得る。宿主細胞は任意の細胞型のものであり得、任意の型の組織に起源し得、任意の発生段階のものであり得るが、宿主細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であり得る。宿主細胞は、Ｔ細胞であり得る。
本明細書の目的のために、Ｔ細胞は、任意のＴ細胞、例えば、培養Ｔ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、または培養Ｔ細胞株、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴｌなど由来のＴ細胞、または哺乳動物から得られたＴ細胞であり得る。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺または他の組織もしくは体液を含むがこれらに限定されない多数の供給源から得られ得る。Ｔ細胞はまた、富化または精製され得る。Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヒトから単離されたＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例えば、ＴｈｉおよびＴｈ２細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤性細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞などを含むがこれらに限定されない、任意の型のＴ細胞であり得、任意の発生段階のものであり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞であり得る。
一実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、適切な非Ｔ細胞において使用され得る。かかる細胞は、免疫エフェクター機能を有する細胞、例えば、多能性幹細胞から生成されたＮＫ細胞およびＴ様細胞などである。
本明細書に記載される少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞の集団もまた、一実施形態によって提供される。細胞の集団は、いずれの組換え発現ベクターも含まない少なくとも１つの他の細胞、例えば宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）、またはＴ細胞以外の細胞、例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞などに加えて、記載される組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む不均一な集団であり得る。あるいは、細胞の集団は、実質的に均質な集団であり得、ここで、集団は主に、組換え発現ベクターを含む（例えば、それらから本質的になる）宿主細胞を含む。集団はまた、細胞のクローン性集団であり得、ここで、集団の全ての細胞は、組換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンであり、その結果、集団の全ての細胞は、その組換え発現ベクターを含む。本発明の一実施形態では、細胞の集団は、本明細書に記載される組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン性集団である。
ＣＡＲ（その機能的部分およびバリアントを含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）および抗体（その抗原結合性部分を含む）は、単離および／または精製され得る。例えば、精製（または単離）された宿主細胞の調製物は、宿主細胞が身体内のその天然環境中の細胞よりも純粋である調製物である。かかる宿主細胞は、例えば、標準的な精製技術によって産生され得る。一部の実施形態では、宿主細胞の調製物は精製され、その結果、宿主細胞は、調製物の総細胞含量の少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約７０％を示す。例えば、純度は、少なくとも約５０％であり得、約６０％、約７０％もしくは約８０％よりも上であり得、または約１００％であり得る。
Ｅ．処置の方法
活性患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲは、哺乳動物において疾患を処置または予防する方法において使用され得ることが企図される。これに関して、一実施形態は、ＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体および／もしくはその抗原結合性部分、ならびに／または医薬組成物を、哺乳動物において癌を処置または予防するのに有効な量で哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物において癌を処置または予防する方法を提供する。
一実施形態は、本明細書に開示されるＣＡＲを投与するステップの前に、哺乳動物をリンパ枯渇させる（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）ステップをさらに含む。リンパ枯渇の例には、非骨髄破壊的リンパ枯渇性化学療法、骨髄破壊的リンパ枯渇性化学療法、全身照射などが含まれ得るがこれらに限定されない。
宿主細胞、または細胞の集団が投与される方法を目的として、細胞は、哺乳動物にとって同種または自家である細胞であり得る。好ましくは、細胞は、哺乳動物にとって自家である。本明細書で使用する場合、同種とは、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の材料を意味する。１または複数の遺伝子座において遺伝子が同一でない場合、２以上の個体は、互いに同種であると言われる。一部の態様では、同じ種の個体由来の同種材料は、抗原性に相互作用するのに十分に遺伝的に異なり得る。本明細書で使用する場合、「自家」とは、個体に後に再導入される、同じ個体に由来する任意の材料を意味する。
本明細書で言及される哺乳動物は、任意の哺乳動物であり得る。本明細書で使用する場合、用語「哺乳動物」とは、齧歯目の哺乳動物、例えば、マウスおよびハムスター、ならびにウサギ（Ｌｏｇｏｍｏｒｐｈａ）目の哺乳動物、例えば、ウサギを含むがこれらに限定されない任意の哺乳動物を指す。哺乳動物は、ネコ（Ｆｅｌｉｎｅ）（ネコ（ｃａｔ））およびイヌ（Ｃａｎｉｎｅ）（イヌ（ｄｏｇ））を含む食肉目由来であり得る。哺乳動物は、ウシ（Ｂｏｖｉｎｅ）（ウシ（ｃｏｗ））およびブタ（Ｓｗｉｎｅ）（ブタ（ｐｉｇ））を含む偶蹄目由来、またはウマ（Ｅｑｕｉｎｅ）（ウマ（ｈｏｒｓｅ））を含む奇蹄目（Ｐｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）のものであり得る。哺乳動物は、霊長目、新世界ザル（Ｃｅｂｏｉｄ）目もしくはサル（Ｓｉｍｏｉｄ）目（サル（ｍｏｎｋｅｙ））または類人猿（Ａｎｔｈｒｏｐｏｉｄ）目（ヒトおよび類人猿（ａｐｅ））のものであり得る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
これらの方法に関して、癌は、急性リンパ性癌、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、膀胱癌（例えば、膀胱癌）、骨癌、脳癌（例えば、髄芽腫）、乳癌、肛門、肛門管もしくは肛門直腸の癌、眼の癌、肝内胆管の癌、関節の癌、頸部、胆嚢もしくは胸膜の癌、鼻、鼻腔もしくは中耳の癌、口腔の癌、外陰部の癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性癌（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌）、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌、喉頭癌、白血病、液性腫瘍、肝臓癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌および肺腺癌）、リンパ腫、中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、上咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、Ｂ－慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）およびバーキットリンパ腫、卵巣癌、膵癌、腹膜、網および腸間膜の癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、固形腫瘍、滑膜肉腫、胃癌、精巣癌、甲状腺癌ならびに尿管癌のいずれかを含む任意の癌であり得る。
用語「処置する」および「予防する」ならびにそれらから派生した単語は、本明細書で使用する場合、１００％または完全な処置または予防を必ずしも意味しない。むしろ、当業者が潜在的な有益な効果または治療効果を有すると認識する、種々の程度の処置または予防が存在する。これに関して、この方法は、任意の量または任意のレベルの、哺乳動物における癌の処置または予防を提供し得る。
さらに、この方法によって提供される処置または予防には、処置または予防されている癌などの疾患の１または複数の状態または症状の処置または予防が含まれ得る。また、本明細書の目的のために、「予防」は、疾患、またはその症状もしくは状態の発病を遅延させることを包含し得る。
別の実施形態は、哺乳動物における癌の存在を検出する方法であって、（ａ）哺乳動物由来の１または複数の細胞を含む試料を、ＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体および／もしくはその抗原結合性部分、または医薬組成物と接触させ、それによって、複合体を形成するステップ、ならびに（ｂ）複合体を検出するステップであって、複合体の検出が、哺乳動物における癌の存在を示す、ステップを含む方法を提供する。
試料は、任意の適切な方法、例えば、生検または剖検によって得られ得る。生検は、個体からの組織および／または細胞の取り出しである。かかる取り出しは、取り出された組織および／または細胞に対する実験を実施するために、個体から組織および／または細胞を収集することであり得る。この実験には、個体がある特定の状態もしくは疾患状態を有するかどうか、および／またはある特定の状態もしくは疾患状態に罹患しているかどうかを決定するための実験が含まれ得る。状態または疾患は、例えば、癌であり得る。
哺乳動物における増殖障害、例えば癌の存在を検出する方法の実施形態に関して、哺乳動物の細胞を含む試料は、細胞全体、その溶解物、または細胞全体溶解物の画分、例えば、核もしくは細胞質画分、タンパク質全体画分、または核酸画分を含む試料であり得る。試料が細胞全体を含む場合、これらの細胞は、哺乳動物の任意の細胞、例えば、血液細胞または内皮細胞を含む任意の臓器または組織の細胞であり得る。
接触させるステップは、哺乳動物に関してｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで起こり得る。好ましくは、接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏである。
また、複合体の検出は、当該分野で公知の多くの方法によって行われ得る。例えば、本明細書に記載される、本明細書に開示されるＣＡＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、または抗体もしくはその抗原結合性部分は、検出可能な標識、例えば、上に開示される放射性同位体、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）および元素粒子（例えば、金粒子）などで標識され得る。
標的細胞を認識する能力および抗原特異性についてＣＡＲを試験する方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｃｌａｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６３巻：５０７～５１３頁（１９９９年）は、サイトカイン（例えば、インターフェロン－γ、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）（ＧＭ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦ－ａ）またはインターロイキン２（ＩＬ－２））の放出を測定する方法を教示している。さらに、ＣＡＲ機能は、Ｚｈａｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４巻：４４１５～４４２３頁（２００５年）に記載されるように、細胞傷害性の測定によって評価され得る。
別の実施形態は、本発明のＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体もしくはその抗原結合性部分、および／または医薬組成物の使用、哺乳動物における癌などの増殖障害の処置または予防を提供する。癌は、本明細書に記載される癌のいずれかであり得る。
局所および全身投与を含む任意の投与方法が、開示された治療剤のために使用され得る。例えば、外用、経口、静脈内などの血管内、筋内、腹腔内、鼻腔内、皮内、くも膜下腔内および皮下投与が使用され得る。特定の投与様式および投薬レジメンは、症例の特徴（例えば、対象、疾患、関与する疾患状態、および処置が予防的かどうか）を考慮して、担当の臨床医によって選択される。１よりも多い薬剤または組成物が投与されている場合、１または複数の投与経路が使用され得る；例えば、化学療法剤は、経口投与され得、抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたはコンジュゲートまたは組成物は、静脈内投与され得る。投与方法には、ＣＡＲ、ＣＡＲ Ｔ細胞、コンジュゲート、抗体、抗原結合性フラグメントまたは組成物が、非毒性の医薬的に許容される担体、例えば、水、食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、５％ヒト血清アルブミン、固形油、オレイン酸エチルまたはリポソーム中に提供される注射が含まれる。一部の実施形態では、開示された化合物の局所投与は、例えば、腫瘍が除去された組織の領域、または腫瘍発達の傾向があると疑われる領域に、抗体または抗原結合性フラグメントを適用することによって使用され得る。一部の実施形態では、治療有効量の抗体または抗原結合性フラグメントを含む医薬調製物の持続性の腫瘍内（または腫瘍近傍）放出が有益であり得る。他の例では、コンジュゲートが、角膜に点眼薬として外用で、または目に硝子体内で適用される。
開示された治療剤は、正確な投薬量の個々の投与に適切な単位剤形で製剤化され得る。さらに、開示された治療剤は、単一の用量でまたは複数用量のスケジュールで投与され得る。複数用量のスケジュールは、処置の主要な過程が、１よりも多い別々の用量、例えば１～１０用量と、その後の、組成物の作用を維持または強化するために必要に応じて引き続く時間間隔で与えられる他の用量とによるものであり得るスケジュールである。処置は、数日～数カ月またはさらには数年の期間にわたる、１日用量または複数の１日用量の化合物（複数可）を含み得る。したがって、投薬レジームはまた、処置される対象の特定の要求に基づいて少なくとも一部決定され、投与する実務者の判断に依存する。
抗体またはコンジュゲートの典型的な投薬量は、約０．０１～約３０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
特定の例では、対象には、複数の１日投薬スケジュールで、例えば、少なくとも２連続日、１０連続日など、例えば、数週間、数ヶ月または数年の期間にわたって、コンジュゲート、抗体、組成物、ＣＡＲ、ＣＡＲ Ｔ細胞またはさらなる薬剤のうち１または複数を含む治療組成物が投与される。一例では、対象には、少なくとも３０日、例えば、少なくとも２カ月、少なくとも４カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも２４カ月または少なくとも３６カ月の期間にわたって、コンジュゲート、抗体、組成物またはさらなる薬剤が投与される。
一部の実施形態では、開示された方法は、開示された抗体、抗原結合性フラグメント、コンジュゲート、ＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞と組み合わせて、手術、放射線療法および／または化学療法薬を（例えば、連続的に、実質的に同時にまたは同時に）対象に提供することを含む。かかる薬剤および処置の方法および治療的投薬量は、当業者に公知であり、熟練の臨床医によって決定され得る。さらなる薬剤についての調製および投薬スケジュールは、製造業者の指示に従って使用され得る、または当業者によって実験的に決定されるとおりであり得る。かかる化学療法についての調製および投薬スケジュールは、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ，（１９９２年）Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ編，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄにも記載されている。
一部の実施形態では、併用治療は、治療有効量のさらなる癌阻害剤の、対象への投与を含み得る。併用治療で使用され得るさらなる治療剤の非限定的な例には、微小管結合剤、ＤＮＡインターカレーターまたはクロスリンカー、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡおよびＲＮＡ転写阻害剤、抗体、酵素、酵素阻害剤、遺伝子調節因子ならびに血管新生阻害剤が含まれる。これらの薬剤（治療有効量で投与される）および処置は、単独でまたは組み合わせて使用され得る。例えば、任意の適切な抗癌剤または抗血管新生剤は、本明細書に開示されるＣＡＲ、ＣＡＲ－Ｔ細胞、抗体、抗原結合性フラグメントまたはコンジュゲートと組み合わせて投与され得る。方法およびかかる薬剤の治療的投薬量は、当業者に公知であり、熟練の臨床医によって決定され得る。
さらなる化学療法剤には、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミドおよびメルファラン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ホテムスチン、ロムスチンおよびストレプトゾシン）、白金化合物（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチンおよびＢＢＲ３４６４）、ブスルファン、ダカルバジン、メクロレタミン、プロカルバジン、テモゾロミド、チオテパおよびウラムスチン（ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ）；代謝拮抗薬、例えば、葉酸（例えば、メトトレキサート、ペメトレキセドおよびラルチトレキセド）、プリン（例えば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリンおよびチオグアニン）、ピリミジン（例えば、カペシタビン）、シタラビン、フルオロウラシルおよびゲムシタビン；植物アルカロイド、例えば、ポドフィルム（例えば、エトポシドおよびテニポシド）、タキサン（例えば、ドセタキセルおよびパクリタキセル）、ビンカ（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビン）；細胞傷害性／抗腫瘍抗生物質、例えば、アントラサイクリンファミリーのメンバー（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロンおよびバルルビシン）、ブレオマイシン、リファンピシン、ヒドロキシウレアおよびマイトマイシン；トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、トポテカンおよびイリノテカン；モノクローナル抗体、例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、ペルツズマブおよびトラスツズマブ；腫瘍親和性感光色素、例えば、アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、ポルフィマーナトリウムおよびベルテポルフィン；ならびに他の薬剤、例えば、アリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アキシチニブ、ベキサロテン、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、セレコキシブ、デニロイキンジフチトクス、エルロチニブ、エストラムスチン、ゲフィチニブ、ヒドロキシカルバミド、イマチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、ペントスタチン、マソプロコール、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、タモキシフェン、ソラフェニブ、スニチニブ、ベムラフェニブ（ｖｅｍｕｒａｆｉｎｉｂ）、バンデタニブおよびトレチノインが含まれるがこれらに限定されない。かかる薬剤の選択および治療的投薬量は、当業者に公知であり、熟練の臨床医によって決定され得る。
本発明のある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法、またはＴ細胞が治療レベルまで増殖される当該分野で公知の他の方法を使用して活性化および増殖された細胞は、ＭＳ患者のための、薬剤による処置、例えば、抗ウイルス療法、シドホビルおよびインターロイキン－２、シタラビン（ＡＲＡ－Ｃとしても公知）もしくはナタリズマブ処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ処置、またはＰＭＬ患者のための他の処置を含むがこれらに限定されない、いくつもの適切な処置モダリティと併せて（例えば、その前に、それと同時に、またはその後に）患者に投与される。さらなる実施形態では、本発明のＴ細胞は、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、およびＦＫ５０６、抗体、または他の免疫除去（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ）薬剤、例えば、ＣＡＭ ＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体もしくは他の抗体療法、細胞毒（ｃｙｔｏｘｉｎ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒｉｂｉｎｅ）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカインならびに照射と組み合わせて使用され得る。これらの薬物は、カルシウム依存的ホスファターゼであるカルシニューリンを阻害する（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）、または増殖因子誘導性シグナル伝達にとって重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Ｌｉｕら，Ｃｅｌｌ ６６巻：８０７～８１５頁，１９９１年；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら，Ｉｍｍｕｎ ７３巻：３１６～３２１頁，１９９１年；Ｂｉｅｒｅｒら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ ５巻：７６３～７７３頁，１９９３年）。さらなる実施形態では、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、化学療法薬剤、例えばフルダラビン、外部照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミドまたは抗体、例えば、ＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨのいずれかを使用するＴ細胞除去療法と併せて（例えば、その前に、それと同時に、またはその後に）患者に投与される。別の実施形態では、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えばＲｉｔｕｘａｎなどのＢ細胞除去療法の後に投与される。例えば、一実施形態では、対象は、高用量化学療法とその後の末梢血幹細胞移植とによる標準的な処置を受け得る。ある特定の実施形態では、移植後、対象は、本発明の増殖された免疫細胞の注入を受ける。さらなる一実施形態では、増殖された細胞は、手術の前または後に投与される。
患者に投与される上記処置の投薬量は、処置されている状態および処置のレシピエントの正確な性質によって変動する。ヒト投与のための投薬量の調整は、当該分野で受容された実務に従って実施され得る。例えば、ＣＡＭＰＡＴＨの用量は一般に、成人患者について１～約１００ｍｇの範囲内であり、通常は１日と３０日との間の期間にわたって毎日投与される。好ましい１日用量は、１日当たり１～１０ｍｇであるが、一部の場合には、１日当たり最大で４０ｍｇのより大きい用量が使用され得る。
併用療法は、相乗作用を提供し得、相乗的であることが証明され得る、即ち、活性成分が一緒に使用される場合に達成される効果は、それらの化合物を別々に使用することから生じ得る効果の合計よりも大きい。相乗効果は、活性成分が、（１）共製剤化され、併用される単位投薬製剤と同時に投与もしくは送達される場合；（２）別々の製剤として交互にもしくは並行して送達される場合；または（３）一部の他のレジメンによる場合に、達成され得る。交互に送達される場合、相乗効果は、それらの化合物が、例えば、別々のシリンジ中の異なる注射によって連続的に投与または送達される場合に達成され得る。一般に、交代の間、有効投薬量の各活性成分が、連続的に、即ち、順次に投与されるが、併用療法では、有効投薬量の２以上の活性成分が一緒に投与される。
一実施形態では、本明細書に開示された抗原のうち１もしくは複数に特異的に結合する抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたはそのコンジュゲートの有効量が、抗癌処置後に腫瘍を有する対象に投与される。投与された抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたはコンジュゲートがそれぞれの癌細胞上で発現された抗原と免疫複合体を形成するのに十分な量の時間が経過した後で、免疫複合体が検出される。免疫複合体の存在（または非存在）は、処置の有効性を示す。例えば、処置の前に採取された対照と比較した免疫複合体の増加は、その処置が有効でないことを示し、処置の前に採取された対照と比較した免疫複合体の減少は、その処置が有効であることを示す。
Ｆ．バイオ医薬組成物
担体（例えば、医薬的に許容される担体）中に、開示されたＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合性フラグメント、コンジュゲート、ＣＡＲ、または本明細書に開示された１もしくは複数の抗原に特異的に結合するＣＡＲを発現するＴ細胞のうち１または複数を含む、遺伝子治療、免疫療法、養子免疫療法および／または細胞療法における使用のためのバイオ医薬組成物または生物製剤組成物（本明細書で以下「組成物」）が、本明細書で提供される。これらの組成物は、対象への投与のために単位投薬形態で調製され得る。所望の転帰を達成するための投与の量およびタイミングは、処置を行う臨床医の裁量である。これらの組成物は、全身（例えば、静脈内）または局所（例えば、腫瘍内）投与のために製剤化され得る。一例では、開示されたＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合性フラグメント、コンジュゲートは、静脈内投与などの非経口投与のために製剤化される。本明細書に開示されるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、コンジュゲート、抗体もしくは抗原結合性フラグメントを含む組成物は、腫瘍、例えば、限定としてではなく、神経芽細胞腫の、例えば、処置および検出などのために使用される。一部の例では、これらの組成物は、癌の処置または検出に有用である。本明細書に開示されるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、コンジュゲート、抗体もしくは抗原結合性フラグメントを含む組成物は、例えば、病理学的血管新生の検出にも使用される。
投与のための組成物には、水性担体などの医薬的に許容される担体中に溶解されたＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、コンジュゲート、抗体もしくは抗原結合性フラグメントの溶液が含まれ得る。例えば緩衝食塩水などの種々の水性担体が使用され得る。これらの溶液は無菌であり、一般に、望ましくない物質を含まない。組成物は、従来の周知の無菌化技術によって無菌化され得る。組成物は、生理学的条件に近づくのに必要な医薬的に許容される補助的物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、アジュバント薬剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有し得る。これらの製剤中のＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたはコンジュゲートの濃度は、広く変動し得、選択された特定の投与様式および対象の要求に従って、液量、粘度、体重などに主に基づいて選択される。遺伝子治療、免疫療法および／または細胞療法における使用のためのかかる投薬形態を調製する実際の方法は、当業者に公知であり、または明らかとなる。
静脈内投与のための典型的な組成物は、１日当たり対象１人当たり約０．０１～約３０ｍｇ／ｋｇの抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたはコンジュゲート（あるいは対応する用量のＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合性フラグメントを含むコンジュゲート）を含む。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知または明らかであり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１９版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９５年）などの刊行物中により詳細に記載されている。
ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合性フラグメント、またはコンジュゲートは、凍結乾燥形態で提供され得、投与前に無菌水で再水和され得るが、これらは、既知の濃度の無菌溶液中でも提供される。次いで、ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたはコンジュゲートの溶液が、０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰを含有する注入バッグに添加され、一部の場合には、０．５～１５ｍｇ／体重ｋｇの投薬量で投与される。抗体または抗原結合性フラグメントおよびコンジュゲート薬物の投与では、当該分野でかなりの経験が利用可能である；例えば、抗体薬物は、１９９７年のＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）の承認以降、米国で市販されている。ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合性フラグメントおよびそれらのコンジュゲートは、静注または静脈内ボーラスでではなく、緩徐な注入によって投与され得る。一例では、より高い負荷用量が、より低いレベルで投与される引き続く維持用量と共に投与される。例えば、４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量の抗体または抗原結合性フラグメント（または対応する用量の、抗体もしくは抗原結合性フラグメントを含むコンジュゲート）が、およそ９０分の期間にわたって注入され得、その後、以前の用量が十分に忍容された場合に３０分の期間にわたって注入される４～８週間にわたる２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量が注入され得る。
制御放出非経口製剤は、インプラント、油性注射として、または粒状の系として作製され得る。タンパク質送達系の広い概説については、Ｂａｎｇａ，Ａ．Ｊ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ（１９９５年）を参照のこと。粒状の系には、ミクロスフェア、マイクロ粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェアおよびナノ粒子が含まれる。マイクロカプセルは、中心コアとして、細胞毒または薬物などの治療的タンパク質を含有する。ミクロスフェアでは、治療薬は、粒子の至る所に分散される。約１μｍよりも小さい粒子、ミクロスフェアおよびマイクロカプセルは一般に、それぞれ、ナノ粒子、ナノスフェアおよびナノカプセルと呼ばれる。毛細管は、ナノ粒子だけが静脈内投与されるように、およそ５μｍの直径を有する。マイクロ粒子は、典型的には、直径がおよそ１００μｍであり、皮下または筋内投与される。例えば、Ｋｒｅｕｔｅｒ，Ｊ．，Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｋｒｅｕｔｅｒ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２１９～３４２頁（１９９４年）；ならびにＴｉｃｅおよびＴａｂｉｂｉ，Ｔｒｅａｔｉｓｅ ｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ａ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，３１５～３３９頁（１９９２年）を参照のこと。
ポリマーは、本明細書に開示されるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたはコンジュゲート組成物のイオン制御された放出のために使用され得る。制御された薬物送達に使用される種々の分解性および非分解性ポリマーマトリックスは、当該分野で公知である（Ｌａｎｇｅｒ，Ａｃｃｏｕｎｔｓ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６巻：５３７～５４２頁，１９９３年）。例えば、ブロックコポリマーであるｐｏｌａｘａｍｅｒ ４０７は、低温で粘性であるがなお可動性の液体として存在するが、体温では半流動性ゲルを形成する。これは、組換えインターロイキン－２およびウレアーゼの製剤化および持続性送達のための有効なビヒクルであることが示されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．９巻：４２５～４３４頁，１９９２年；およびＰｅｃら，Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．４４巻（２号）：５８～６５頁，１９９０年）。あるいは、ヒドロキシアパタイトが、タンパク質の制御された放出のための微小担体として使用されてきた（Ｉｊｎｔｅｍａら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１１２巻：２１５～２２４頁，１９９４年）。さらに別の態様では、リポソームが、脂質カプセル化薬物の制御された放出および薬物標的化に使用される（Ｂｅｔａｇｅｒｉら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ（１９９３年））。治療的タンパク質の制御された送達のための多数のさらなる系が公知である（米国特許第５，０５５，３０３号；米国特許第５，１８８，８３７号；米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第４，８３７，０２８号；米国特許第４，９５７，７３５号；米国特許第５，０１９，３６９号；米国特許第５，０５５，３０３号；米国特許第５，５１４，６７０号；米国特許第５，４１３，７９７号；米国特許第５，２６８，１６４号；米国特許第５，００４，６９７号；米国特許第４，９０２，５０５号；米国特許第５，５０６，２０６号；米国特許第５，２７１，９６１号；米国特許第５，２５４，３４２号および米国特許第５，５３４，４９６号を参照のこと）。
Ｇ．キット
一態様では、本明細書に開示されるＣＡＲを使用するキットもまた提供される。例えば、対象における腫瘍を処置するためのキットまたは本明細書に開示されるＣＡＲのうち１もしくは複数を発現するＣＡＲ Ｔ細胞を作製するためのキット。キットは、典型的には、本明細書に開示される、開示された抗体、抗原結合性フラグメント、コンジュゲート、核酸分子、ＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞を含む。開示された抗体、抗原結合性フラグメント、コンジュゲート、核酸分子、ＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞のうち１よりも多くが、キット中に含まれ得る。
キットは、コンテナ、およびコンテナ上のまたはコンテナと関連したラベルまたは添付文書を含み得る。適切なコンテナには、例えば、瓶、バイアル、シリンジなどが含まれる。コンテナは、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。コンテナは、典型的には、開示された抗体、抗原結合性フラグメント、コンジュゲート、核酸分子、ＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞のうち１または複数を含む組成物を保持する。いくつかの実施形態では、コンテナは、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、コンテナは、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。ラベルまたは添付文書は、その組成物が特定の状態を処置するために使用されることを示す。
ラベルまたは添付文書は、典型的には、例えば、腫瘍を処置もしくは予防する方法、またはＣＡＲ Ｔ細胞を作製する方法における、開示された抗体、抗原結合性フラグメント、コンジュゲート、核酸分子、ＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞の使用のための指示書をさらに含む。添付文書は、典型的には、治療的製品の使用に関する、適応症、用法、投薬量、投与、禁忌および／またはかかる警告についての情報を含む、治療的製品の市販の包装中に習慣的に含まれる指示書を含む。教材は、電子的形態（例えば、コンピューターディスケットまたはコンパクトディスク）で書かれ得、または視覚的（例えば、動画ファイル）であり得る。キットは、キットが設計される特定の適用を容易にするためのさらなる構成要素もまた含み得る。したがって、例えば、キットは、標識を検出する手段（例えば、酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、二次抗体などの適切な二次標識など）をさらに含み得る。キットは、特定の方法の実施のために慣用的に使用される緩衝液および他の試薬をさらに含み得る。かかるキットおよび適切な内容物は、当業者に周知である。
本発明は以下の実施例によってさらに例証され、これらの実施例は決して本発明の範囲に制約を課すものとして解釈すべきではない。反対に、その様々な他の実施形態、変更形態、および均等物に頼らなければならず、これらは本明細書の記載を読んだ後、本発明の精神および／または添付の特許請求の範囲から逸脱せずに、当業者の念頭に浮かび得ることは容易に理解される。
本発明は以下の実施例によってさらに例証され、これらの実施例は決して本発明の範囲に制約を課すものとして解釈すべきではない。反対に、その様々な他の実施形態、変更形態、および均等物に頼らなければならず、これらは本明細書の記載を読んだ後、本発明の精神および／または添付の特許請求の範囲から逸脱せずに、当業者の念頭に浮かび得ることは容易に理解される。
＜実施例１＞
腫瘍ミュータノームの次世代シーケンシング
この手順は、患者の腫瘍材料の次世代シーケンシング、および腫瘍中に存在した（一群としてミュータノームと呼ぶ）変異タンパク質の同定を指す。これらの配列は、変異体腫瘍タンパク質を発現するベクターを作製するためのベースとして使用する。入手可能な場合、公に入手可能なヒトゲノムのデータベースと同様に、（末梢血などの）非腫瘍関連患者の材料を正常比較用に使用する。次世代シーケンシングの方法は分子生物学において充分定着した技法であり、例えばＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ，Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ Ｎ，Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ＶＥら，２０１３年，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９巻：１５４６～１５５８頁中で見ることができる。
米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）はｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓをオンラインで提供している（ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。その中で、３３タイプの癌の重要なゲノム変化の包括的マップを見ることができる。データは特定ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）ゲノムシークエンシングセンター（ＧＳＣ）を介してＮＩＨに送られる。２形式、全エクソームと全ゲノムのデータがシーケンシングした全ＴＣＧＡ癌症例に関して入手可能である。非腫瘍ＤＮＡは各提出で対照となる。米国国立ヒトゲノム研究所（ＮＨＧＲＩ）によって資金提供された３センター、Ｔｈｅ Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐｌａｔｆｏｒｍ，Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．；Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ，およびｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏは全ゲノム配列を提供する。
Ｔｈｅ Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅと個別に契約した場合、ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ ＷＥＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｄｅｅｐ）サービスが、５０倍以上の有効範囲で標的塩基の８５％をカバーする腫瘍－正常ペアまたは体細胞突然変異分析を提供する（２０１６年６月１０日にアクセスした情報、ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｗｈｉｌｅ－ｅｘｏｍｅ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）。さらに腫瘍試料は、ｔｈｅ ＢｒｏａｄのＣＬＩＡ認可ＣＡＰ公認研究室でもシーケンシングすることができる。市販の全ゲノムと全エクソームシーケンシングサービスは、現在Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ（ｎｇｓ－ｉｍｍｕｎｏ－ｏｎｃｏｌｏｇｙ－ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｓｐｏｔｌｉｇｈｔ－１１７０－２０１６－００５－１．ｐｄｆ）も提供するＩｌｌｕｍｉｎａ（ｗｗｗ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ／ａｒｅａｓ－ｏｆ－ｉｎｔｅｒｅｓｔ／ｃａｎｃｅｒ／ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｈｔｌｍｌ）によって与えられる。他の供給業者も利用可能である。この情報を提供して、全ゲノムと全エクソームシーケンシングサービスは市場で広く入手可能であり、歴史に基づいて、これらの配列提供のコストとスピードが短縮し続けることを実証する。ヒト腫瘍試料のゲノム分析は容易に提供されるサービスであり、または市販の装置とシステムを使用して研究室で実施することができる。
＜実施例２＞
ＴＣＲの次世代シーケンシング
この手順は、生物試料中のＴ細胞受容体の完全補体を定義するためのシーケンシング技法の使用を指す。分析する材料は患者の腫瘍を含み、その場合本発明者らは腫瘍中に存在するＴＣＲを記載する。末梢血では、本発明者らは、その一部が腫瘍特異的である存在する一般的なＴＣＲを記載する。次世代シーケンシングによって特異的ＴＣＲの頻度を定量化することができる。ＴＣＲアルファ鎖とベータ鎖の特異的対を同定するための次世代シーケンシングの適用は、分子生物学において充分定着した技法である（Ｄａｓｈ Ｐ、Ｗａｎｇ Ｇ、Ｔｈｏｍａｓ Ｐ，２０１５年，Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＡＢ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ，ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｅｃｅｎｓｅ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｈａｗ ＡＣ（編），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３４３巻，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．）。
ＴＣＲアルファ鎖（ＴＣＲＡ）とＴＣＲベータ鎖（ＴＣＲＢ）をコードするＤＮＡ配列を決定するための自動ＤＮＡシーケンシングの継続的開発を含め、現在の分子生物学の技法を使用した多数の手法が開発されている。さらに、クローン前駆体から生じた同じＴリンパ球、またはＴ細胞集団において、どのＴＣＲＡがＴＣＲＢと対になるか割り当てるための、いくつかの技法が開発されている。例えば、２０１２年 Ｓｕｎらにおいて、単細胞レベルで表現型によって選別したＣＤ８Ｔ細胞由来のＴＣＲアルファ鎖とベータ鎖をシーケンシングするための能力が実証された。Ｓｕｎ Ｘ、Ｓａｉｔｏ Ｍ、Ｓａｔｏ Ｙら、２０１２年、Ｕｎｂｉａｓｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＴＣＲＡ／Ｂ ｃｈａｉｎｓ ａｔ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋Ｔ－Ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ、ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ４０３８６。
２０１４年 Ｈａｎらにおいて、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃサイトカイン捕捉システム（免疫磁性粒子）によって単離され、特異的サイトカインサブセットを分泌するそれらの能力によっていくつかの場合選別された、Ｔ細胞由来のＴＣＲＡとＴＣＲＢのシーケンシングが実証された。Ｈａｎ Ａ，Ｇｉａｎｖｉｌｌｅ Ｊ，Ｈａｎｓｍａｎｎ Ｌ，Ｄａｖｉｓ ＭＭ，２０１４，Ｌｉｎｋｉｎｇ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｔ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｌｅｖｅｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２巻：６８４～６９２頁。
同様にして、Ｂ細胞によってコードされる抗体レパートリーを含む重鎖と軽鎖をコードする配列が、単細胞シーケンシング法により分析されている。ＤｅＫｏｓｋｙ Ｂ，Ｋｏｊｉｍａ Ｔ，Ｒｏｄｉｎ Ａら，２０１５年，Ｉｎ－ｄｅｐｔｈ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐａｉｒｅｄ ｈｅａｖｙ－ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２１巻：８６～９１頁。
＜実施例３＞
腫瘍ミュータノームを発現するレンチウイルスベクターの作製
抗原提示細胞、患者由来抗原提示細胞、非限定的な例は樹状細胞にミュータノームの発現をもたらすため、レンチウイルスベクター（ＬＶ）を使用して、ミュータノーム中に存在する１０の最も主要な変異体タンパク質をコードした（１０は近似値でありＬＶの数は１から１００まで変わり得る）。ＬＶは関連エピトープを含有するミュータノームをコードすることができ、または多数のＬＶに各変異遺伝子を個別にクローニングすることができる。他の遺伝子または非コードＲＮＡをＤＣに形質導入して、高機能性ＤＣおよび／またはＴ細胞の生成効果を向上することもできる。このような遺伝子または非コードＲＮＡの非限定的な例は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ２２１、およびｍｉＲ１４２－Ｔである。当技術分野で公知のように組織特異的プロモーターおよび／または組織特異的ｍｉＲＮＡを使用することにより、単核細胞のＤＣ分化を容易にして次いで分化が起こった後に停止するように、このようなタンパク質をさらにそれらに形質導入した。
遺伝子ベクターを生成するのに必要な構成遺伝子をコードする一組のプラスミドを産生細胞株に形質導入することにより、ＬＶを迅速に作製した。現在の規制要件に従い、これらのプラスミドを一組として産生細胞株にトランスフェクトする。トランスフェクトしたプラスミドの１つは、標的細胞株に送達するのに望ましい遺伝子であるＬＶの遺伝子ペイロードをコードする。したがって、腫瘍ミュータノームを定義し、抗原提示細胞における発現用の変異遺伝子を選択した後、これらの遺伝子は１つまたは複数の変異タンパク質をコードするプラスミドに移入する。ＬＶは最大１０，０００の塩基対を収容することができる。したがって、最大１０個の遺伝子または個々の遺伝子がＬＶによってコードされ得る。許容可能なパッケージ遺伝子（複数可）サイズを超える場合、したがって２つ以上のＬＶ集団を作製し所望のミュータノームのセット全体をコードする。ミュータノームをコードする変異遺伝子、およびＬＶ骨格プラスミド（目的の遺伝子をコードするプラスミド）に迅速にクローニングすることができる含まれる適切な配列をＰＣＲにより増幅し、または直接合成する。所望のミュータノーム遺伝子をコードするＬＶが生成した後、次いでそれを使用して抗原提示細胞に形質導入する。
＜実施例４＞
ＴＣＲを発現するレンチウイルスベクターの作製
患者材料のシーケンシングによって同定したＴＣＲ配列の発現をもたらすため、ＬＶを使用して完全長ＴＣＲＡおよびＴＣＲＢ鎖をコードする。次いでこれらのベクターを使用して患者のＴ細胞に形質導入し、これによって多数の特異的Ｔ細胞を作製する（ネイティブおよび形質導入ＴＣＲ）。
レトロウイルス遺伝子ベクターを使用して、初代ヒトＴ細胞にヒトＴＣＲを分子クローニング、シーケンシング、および移入する能力は、当技術分野で充分定着している。形質導入Ｔ細胞は、ベクター移入ＴＣＲを使用して細胞を標的化する能力を得る。形質導入Ｔ細胞がクローンである場合、ネイティブＴＣＲと移入ＴＣＲの両方が機能的であることを実証することができる（Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ａｎ Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９８巻：２２０～２２８頁、さらにＪｕｒｇｅｎｓら，２００６年，Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｗｉｔｈ Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）ｌａｔｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｄｕｃｅｓ ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖｉｒｕｓ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ：ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｊ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２６巻：２２～３２頁も参照）。
例えばそれらのＴＣＲＡおよびＴＣＲＢ配列が卵巣癌患者から単離したＴ細胞に由来した、単数または複数のＴＣＲをコードするＬＶを作製し、このＬＶを使用して、単離し、活性化し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した自家患者リンパ球に形質導入する。使用した培養培地の例は、ヒト血清もしくはヒト血清アルブミン、およびＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１などの補助サイトカイン、またはこれらの組合せの補充ありまたはなしの、ＲＰＭＩ－１６４０、またはＴｅｘＭＡＣＳを含む。Ｍｉｔｅｎｙｉ ＴｒａｎｓＡＣＴシステムなどの抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８結合性を有するナノマトリックスの使用によって活性化が容易になる。当技術分野における標準的技法（すなわち組織培養フラスコ中）、またはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）などの自動培養プラットフォームに従い培養を達成する。患者由来の形質導入Ｔ細胞集団の表面上の新たなＴＣＲの存在は、移入した特異的ＴＣＲＢに関する抗体染色によって、またはこれらの配列に関するＰＣＲによって実証することができる。
患者由来のクローンＴＣＲ（複数可）をここで有する活性化Ｔ細胞のこの集団を次いで使用して、その患者によって発現された癌抗原を認識させる。例えば、抗原Ｘを発現する樹状細胞によって活性化した患者由来のＴ細胞からＴＣＲを最初にクローニングした場合、形質導入またはトランスフェクトして抗原Ｘを発現した（樹状細胞またはＢ細胞などの）組織適合ＡＰＣとの共培養によって、形質導入Ｔ細胞集団はここで活性化状態になる。患者へのこのＴ細胞集団の移入によって、抗腫瘍活性が証明される。
別の実施例では、ＬＶは、ベクター中にコードされたＴＣＲではなく内在ＴＣＲを特異的に標的化するアンチセンスまたはｓｈＲＮＡなどのネイティブＴＣＲの阻害因子をコードし、この場合コードされたＴＣＲはアンチセンスまたはｓｈＲＮＡの影響に耐えるよう改変されており、したがって内在ＴＣＲではなく抗原（複数可）を標的化する腫瘍特異的Ｔ細胞を生成する。これらの遺伝子操作Ｔ細胞は、内在ＴＣＲも発現するＴ細胞より改善された安全性と有効性を有し得る。
この実施例では、ＴＣＲとＣＡＲを両方発現するＬＶを作製して抗腫瘍効果を実現する。ＴＣＲとＣＡＲは同じベクター上または異なるベクター上で発現され得る。好ましい実施形態は、医薬品の治療または予防効果を向上し得る所望のＣＡＲ、ＴＣＲ、および任意の他の遺伝子または非コード核酸（一括してペイロードと呼ぶ）を発現させるための、多数のベクターの生成である。
＜実施例５＞
ＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターの作製
患者Ｔ細胞に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の形質導入は重要な一要素である。ＣＡＲは、ＣＡＲ標的細胞との遭遇時に形質導入Ｔ細胞の適切な活性化を保証するのに充分なレベルまで、Ｔ細胞の表面上で発現されなければならない。例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ保有Ｔ細胞は、ＣＤ１９を発現する正常Ｂ細胞によって、またはＣＤ１９を発現する白血病細胞によって刺激される。ＣＡＲは同定された変異腫瘍タンパク質に特異的ではないが、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、腫瘍関連線維芽細胞もしくは線維細胞などの腫瘍微小環境中に存在し得る正常Ｂ細胞もしくは他の増殖可能細胞型、または腫瘍間質中に存在する他の細胞型をその代わりに標的化する。
Ｂ細胞の場合、ＣＤ１９－およびＣＤ２０－特異的ＣＡＲの安全性プロファイルは充分定着している。ＣＤ１９とＣＤ２０の両方を標的化するデュアルＣＡＲも使用することができる。（例えば、抗原が樹状細胞と共有される場合）身体への注入時、およびおそらくｉｎ ｖｉｔｒｏ培養中も腫瘍特異的Ｔ細胞の増殖を駆動するのは、これらの異種、または自己抗原に対する反応性である。抗原の非網羅的な一覧は以下のＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＴＩＥ－２、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２である。非網羅的な例としてＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＴＲＰ２および／またはＩＦＮ－アルファなどの遺伝子を発現させることにより、または前に記載したように、ＤＣを向上のためにさらに遺伝子操作することができる。所望する場合、ＤＣを患者への注入に使用することもできる。このようにＤＣは、身体中で同族ＴＣＲを今や発現する形質導入Ｔ細胞集団の活性を初回抗原刺激または追加抗原刺激するため働き得る。
１つの非限定的な例は、ペイロードの発現を微調整して所望の効果を向上または最適化し得る、ベクター内への他のエレメントの封入である。これらは、遺伝子スイッチ、自殺遺伝子、レオスタットエレメントなどを非限定的に含む。例えば、ＣＡＲの発現は療法後の一定期間のみ望ましい可能性があり、身体中で長期間ＣＡＲ発現は停止させるがＴＣＲ発現は維持し、したがって遺伝子操作Ｔ細胞が身体中で腫瘍細胞を探し続けることができることが好ましい可能性がある。
＜実施例６＞
ＤＣの培養、およびミュータノームライブラリーを発現するレンチウイルスベクターの形質導入（ＤＣｍｕｔｎ）
患者Ｔ細胞に変異体タンパク質を提示するため、樹状細胞（ＤＣ）などの自家抗原提示細胞に形質導入してミュータノームによりコードされる変異体タンパク質を発現させ、発現されたこれらの特異的タンパク質は腫瘍内で最も高発現される変異体タンパク質によって定義される。このｉｎ ｖｉｔｒｏ手順によって、注入前に免疫療法的Ｔ細胞集団の正確な分析と評価が可能である。
１つの非限定的な例は、非ＧＭＰ条件下での患者の末梢血からの単核細胞の単離であり、変異抗原を発現する多数のＬＶをそれらに最初に形質導入し、次いで可溶性ＩＬ－４およびＧＭ－ＣＳＦを使用してそれらを樹状細胞に分化させる。細胞が分化した後、患者Ｔ細胞を樹状細胞と継代培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を増殖させる。次いで腫瘍特異的Ｔ細胞をいくつかの方法によって単離し、特異的ＴＣＲをシーケンシングし判定する。次いでこれらのＴＣＲを、医薬品としてＧＭＰ条件下で製造されるベクターにおいて使用するため合成し、ＬＶにクローニングする。
別の非限定的な例は、同じ単核細胞の単離および抗原特異的樹状細胞のＬＶ媒介生成を利用するが、ただしＧＭＰ条件下である。４日間未満遺伝子改変ＤＣと培養する前、抗原特異的Ｔ細胞、およびおそらく抗原発現ＤＣも治療用医薬品として患者に戻し注入する前に、患者Ｔ細胞にＬＶ抗ＣＤ１９ ＣＡＲを形質導入する。
＜実施例７＞
ＰＢＭＣに対するＣＡＲ（Ｔ－ＣＡＲ）の形質導入
Ｔ細胞増殖を容易にするため、およびさらに身体中の腫瘍抑制シグナルから逃れるため、患者Ｔ細胞にＣＤ１９、ＣＤ２０、または他の増殖可能な自己抗原を標的化するＣＡＲなどのＣＡＲを形質導入する。ＣＡＲＳは、例えばＣＲ３ゼータ鎖によって与えられる「シグナル１」（シグナル１は同族ペプチド－ＭＨＣ複合体との遭遇時にＴＣＲによって通常誘発されるシグナルを指し、ＴＣＲ－ゼータ鎖のリン酸化を含む）と、Ｔ細胞活性化およびＴ細胞増殖および残存の誘導において役割を果たすことが公知であるＣＤ１３７、ＣＤ２８、または他のＴ細胞シグナル形質導入分子によって与えられる「シグナル２」（シグナル２は、シグナル１を得たＴ細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかでさらに刺激され持続するのを生物学的に可能にするのに必要なシグナルを指し、Ｊａｋ－ＳＴＡＴ経路、ＰＩ３キナーゼ、ＰＫＣサブタイプ、ＴＲＡＦ経路、またはＮＦ－ｋａｐｐａＢ経路の活性化を含み得る）の両方を含有する。シグナル１とシグナル２は同じＣＡＲ構築物によってコードされる可能性があり、または異なるＬＶコード遺伝子産物間に分散する可能性があり、特異的ＣＡＲリガンド（複数可）との遭遇時にＴ細胞の活性化を果たし得る。ＴＣＲ形質導入患者Ｔ細胞集団の残存を保証するための手段としてのＣＡＲ構築物の発現は、腫瘍特異的ＴＣＲがそれを行うのに不十分である場合でさえ、Ｔ細胞に関する残存および生存シグナルがＣＡＲによって与えられる点で、本明細書に記載する養子免疫療法の中心的態様である。
＜実施例８＞
患者ＰＢＭＣに対するＴＣＲ（ｒｅｃＴ）の形質導入
腫瘍および末梢血のシーケンシングによって同定したＴＣＲＡ鎖およびＴＣＲＢ鎖を発現するＬＶを作製する。同定したＴＣＲＡとＴＣＲＢ対の数に応じて、ＬＶは多数のＴＣＲをコードすることができ、または単一ＴＣＲで多数のＬＶを作製し、または両方の組合せである。前述のＤＮＡシーケンシングベースのＴＣＲ同定の記載中に詳述したように、ＴＣＲＡ鎖とＴＣＲＢ鎖の対を同定するための具体的技法を、これらのベクターの設計において利用する。これらのＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏでＬＶ形質導入ＤＣもしくはＢ細胞または腫瘍細胞によって提示される腫瘍ミュータノームに対して反応性がある。したがって、卵巣癌患者由来の（例えば一組の活性化マーカーの発現によって、または腫瘍コードタンパク質、すなわちミュータノームの一部を発現するＡＰＣに対する反応性によって腫瘍反応性があると決定した、腫瘍切除からの末梢血またはリンパ球のいずれか由来の）ＴＣＲ配列をＬＶベクターに分子クローニングし、そのベクターを使用して患者Ｔ細胞に形質導入し、したがって形質導入したＴ細胞集団は腫瘍反応性ＴＣＲをここで発現する。ＬＶ形質導入Ｔ細胞集団は腫瘍反応性であり、患者に戻し注入することが可能である。
＜実施例９＞
患者ＰＢＭＣに対するＣＡＲおよびＴＣＲ（ｒｅｃＴ－ＣＡＲ）の形質導入
幾つかの場合、患者Ｔ細胞に少なくとも１つのＣＡＲと多数の組換えＴＣＲ配列（ｒｅｃＴ）の両方を形質導入する。これらの遺伝子操作多重特異性Ｔ細胞はネイティブＴＣＲまたはｒｅｃＴを介して腫瘍細胞と反応することができ、抗腫瘍効果を向上し、ＣＡＲによってＴ細胞は残存することができる。この場合、卵巣癌を有する患者由来のＴ細胞集団に、（本来患者に由来し腫瘍反応性があると決定した）ＴＣＲとＣＡＲの両方をコードするＬＶベクター（複数可）を形質導入する。ＴＣＲは抗腫瘍活性を活性化および指示するために働き、ＣＡＲは身体中の治療的Ｔ細胞集団の残存を可能にするために働く。個々の一例を構築するため、卵巣腫瘍をゲノムまたはエクソームレベルでシーケンシングし、腫瘍抗原Ｘを同定する。次いで抗原Ｘを、ＬＶを介して形質導入し、樹状細胞などの自家ＡＰＣ中で発現させる。次いで患者リンパ球を、Ｘを発現するＤＣと共にインキュベートし、反応性細胞をシーケンシングしてＴＣＲＡおよびＴＣＲＢ配列を同定する。このシーケンシングから誘導したＴＣＲＡとＴＣＲＢの対を次いで使用して、Ｘ特異的ＴＣＲ（複数可）を発現するＬＶを構築する。あるいは、腫瘍抗原反応性Ｔ細胞を血液または腫瘍組織から直接他の活性化マーカーによって同定し、ＴＣＲＡおよびＴＣＲＢ配列を同定しＬＶにクローニングする。次いで患者Ｔ細胞を、培養培地中で（ＣＤ３およびＣＤ２８を介してＴ細胞を刺激する）ＴｒａｓｎＡｃｔ試薬を用いてｅｘ ｖｉｖｏでの培養中に活性化する。次いで活性化Ｔ細胞に、２つの別個のＬＶ、Ｘに反応性がありＴＣＲをコードするＬＶおよびＴＣＲ（複数可）をコードする第２のＬＶ、またはＣＡＲとＴＣＲを共発現する１つのベクターを形質導入する。次いで形質導入Ｔ細胞集団を培養中に増殖させ、導入遺伝子の発現を実証する。ＬＶコード配列の発現を検証した後、この治療的Ｔ細胞集団を抗癌効果のため患者に戻し注入する。Ｘを増大してより多数の腫瘍関連変異体タンパク質（ミュータノーム産物）を含めることによって、この手法を多重化することができる。抗腫瘍細胞と関連する２つ以上のＴＣＲを同定すること、またはミュータノーム由来のいくつかの腫瘍抗原を発現するＡＰＣとの反応性によって、この手法を多重化することもできる。次いでエフェクターＴ細胞集団を治療効果のため患者に注入し、したがってポリクローナルＴ細胞集団はＣＡＲと共にＸに特異的な単数ＴＣＲを発現し、またはポリクローナルＴ細胞集団はいくつかの癌抗原と反応性がある多数のＴＣＲを発現し、ＣＡＲも共発現する。この重要な本発明のステップは、遺伝子操作されてＣＤ１９またはＣＤ２０などの正常組織によってコードされる非必須抗原に対するＣＡＲ、および腫瘍特異的ＴＣＲを発現する、患者由来の新規なエフェクターＴ細胞集団を記載する。
＜実施例１０＞
Ｔ細胞集団と形質導入ＤＣの共培養
（ＣＡＲ、ｒｅｃＴ、ＣＡＲとｒｅｃＴを用いた形質導入とは無関係に）腫瘍反応性Ｔ細胞を増殖するため、腫瘍ミュータノームのサブセットを発現するＤＣとＴ細胞を共培養する。一実施形態では、ｒｅｃＴ発現細胞はＤＣとの培養を必要とせず、それはｒｅｃＴ＋ＣＡＲの組合せが身体中の腫瘍反応性Ｔ細胞を増殖するのに充分であり得るからである。ＤＣなどの抗原提示細胞との共培養によってＴＣＲＡおよびＴＣＲＢ発現ベクターの腫瘍反応性を検証し、これは試験として普通に実施することが可能である。抗原特異的Ｔ細胞を生成または同定する効果を向上すると考えられる様々なサイトカインまたは他の因子と、これらの細胞を培養する。ＡＰＣまたはＤＣを因子の存在下で培養して、抗原特異的Ｔ細胞の増殖をさらに向上することも可能である。非限定的な例は抗ＰＤ１阻害因子の添加、またはＩＬ－１２の添加であるが、多くの考えられる因子が存在し、共培養中のそれらの向上した効果を試験し評価することが可能である。
＜実施例１１＞
治療的Ｔ細胞集団へのＣＡＲまたはＲｅｃＴ媒介シグナル伝達をもたらすことができる自家細胞産物の共投与または逐次投与によるＲｅｃＴ－ＣＡＲ－Ｔ集団の増殖
この手順の別形では、ＬＶ－ミュータノーム形質導入ＤＣ（または他のＡＰＣ）およびエフェクターＴ細胞集団をいずれも患者に注入または注射することができる。この第２の細胞集団はさらなる一定期間培養することができ、次いで注入、または低温保存することができ、次いで一回または複数回連続で投与することができるとも考えられる。例えば、身体中の皮下、リンパ節、または他の部位に注射されたミュータノーム発現ＤＣは、静脈内注射されたｒｅｃＴまたはネイティブ抗腫瘍ＴＣＲの増殖および機能を向上することができる。このシナリオでは、ＣＡＲの発現が、ＣＡＲが特異的である正常抗原との遭遇時に形質導入Ｔ細胞集団の増殖を駆動する。ミュータノームコードタンパク質を発現する樹状細胞集団の導入は、Ｔ細胞集団によって発現されるｒｅｃＴによる抗腫瘍Ｔ細胞機能を駆動するため働く。ＣＡＲ駆動自己抗原、例えばＣＤ１９は、それが治療的Ｔ細胞集団をもはや増殖させない程度まで消失する可能性もある。この場合、自家ＡＰＣ、例えば樹状細胞または低温保存Ｂ細胞、または不活性化したエプスタインバーウイルス不死化Ｂ細胞を使用してＲｅｃＴ－ＣＡＲ－Ｔ集団を増殖することができる。さらに、不死化Ｂ細胞株を使用してミュータノームタンパク質を発現させることもできる。
ＥＢＶを用いた患者Ｂ細胞の不死化は、大学の研究室（例えば、ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅにおける、ｈｔｔｐｓ：／／ｕｎｃｌｉｎｅｂｅｒｇｅｒ．ｏｒｇ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｃｏｒｅ－ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ／ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ／ｂ－ｃｅｌｌ－ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ－ｓｅｒｖｉｃｅｓを参照）と商業サービス（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌ，ＡＢＭ，Ｉｎｃ．，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｂｍｇｏｏｄ．ｃｏｍ／ＥＢＶ－Ｃｅｌｌ－Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌを参照）の両方で利用可能な標準的サービスである。ここで患者Ｂ細胞を培養上澄みの形でエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）に曝露し、形質転換Ｂ細胞コロニーを増殖させる。これらの患者由来自家細胞は遺伝学的、ウイルス学的および免疫学的手順中で一般に使用される。
したがって、この補助的自家細胞産物は、ＣＡＲ標的およびｒｅｃＴ標的抗原の発現によって治療的Ｔ細胞集団を増殖させるために働く。補助的ＡＰＣ産物がＣＡＲ標的を発現しない場合、それはミュータノームタンパク質単独の発現によって治療的Ｔ細胞集団を刺激する。
＜実施例１２＞
免疫療法用に作製した特異的Ｔ細胞集団
本明細書に記載する組成物と方法は、養子免疫療法に適したいくつかのＴ細胞集団をもたらす。全ての場合、ＣＡＲが含まれるとき、その目的は腫瘍抗原自体に反応することではなく、ｒｅｃＴの共発現ありまたはなしで、患者Ｔ細胞の増殖を駆動することまたは免疫抑制細胞を標的化することである。これらの細胞集団は以下のように要約することができる：
Ａ．ＤＣｍｕｔｎと培養したＴ－ＣＡＲ。この場合Ｔ－ＣＡＲは免疫抑制細胞標的を対象とし、ＤＣｍｕｔｎは抗原特異的Ｔ細胞を増殖させる。
Ｂ．ＤＣｍｕｔｎと培養しなかったｒｅｃＴ－ＣＡＲ。この場合ｒｅｃ－Ｔ－ＣＡＲはＣＡＲも発現する遺伝子改変Ｔ細胞であるが、これらの細胞自体はＤＣと培養しなかった。ｒｅｃ－Ｔ ＴＣＲは別組のＴ細胞とＤＣｍｕｔｎ細胞を培養することによって同定した。
Ｃ．ＤＣｍｕｔｎと培養したｒｅｃＴ－ＣＡＲ。この場合、ＣＡＲを患者Ｔ細胞に形質導入し、これらの細胞をＤＣｍｕｔｎ細胞と培養し、腫瘍抑制細胞集団およびＴ細胞集団の長寿命／増殖を標的化するＣＡＲを追加的に発現する抗原特異的Ｔ細胞を増殖および単離することによってｒｅｃ－Ｔ ＣＡＲ細胞を作製した。
Ｄ．ＤＣｍｕｔｎと培養しなかったｒｅｃＴ。この場合ｒｅｃ－Ｔ細胞はＣＡＲを発現しない遺伝子改変Ｔ細胞であり、これらの細胞自体はＤＣと培養しなかった。ｒｅｃ－Ｔ ＴＣＲは別組のＴ細胞とＤＣｍｕｔｎ細胞を培養することによって同定した。
Ｅ．ＤＣｍｕｔｎと培養したｒｅｃＴ。この場合ｒｅｃ－Ｔ細胞はＤＣｍｕｔｎ細胞と培養しＴＣＲ抗原特異的Ｔ細胞を得る。
Ｆ．ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用されｉｎ ｖｉｖｏアジュバント／ワクチンとしても働き得るＤＣ－ミュータノーム集団。この場合ＤＣ－ミュータノーム集団はワクチンとして使用し、身体中のｒｅｃ－Ｔまたはｒｅｃ－Ｔ ＣＡＲ細胞の増殖を駆動する。
＜実施例１３＞
代替ドナーおよびＴ細胞型
本明細書に記載する養子免疫療法手順の２つの重要な別形を、代替ドナーおよびＴ細胞型に関して考えることができる。
第１の変形は、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の状況での養子免疫療法である。ＨＳＣＴは血液悪性疾患と固形腫瘍の両方において試されている。本明細書に記載する手順の応用例では、ＨＳＣＴ後、ＤＣ（または他のＡＰＣ）およびＴ細胞集団は骨髄（ＨＳＣ）ドナーに由来し、治療的Ｔ細胞を作製し、ＨＳＣＴ後に注入する。
したがって、例えば骨髄腫がある患者はその悪性疾患がシーケンシングされており、ミュータノームが定義されている。ミュータノームタンパク質抗原は、（ＬＶ形質導入によって）ＨＳＣドナー由来のＡＰＣにおいて発現される。ＨＳＣドナー由来Ｔ細胞は、ミュータノームコードタンパク質を発現するＡＰＣとの共培養後に、直接使用するため、またはＴＣＲシーケンシングのために活性化され、選択される。ＣＡＲ構築物は、それが正常自己抗原と反応性であるため、非ＨＳＣＴ技術の応用例と同じ状態である。
第２の変形は、養子免疫療法用の代替Ｔ細胞集団の使用である。ＣＤ１３７、ＣＤ６９、ＰＤ－１、ＣＤ２５、クラスＩＩ ＭＨＣ、およびその他などの細胞表面活性化マーカーを頻繁に使用して、（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＣＤ１３７－ビオチン試薬またはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＣＤ２５試薬を使用して）活性化Ｔ細胞集団を定義および単離することは充分定着している。活性化Ｔ細胞集団は、これらの方法を使用して、末梢血から、腫瘍から、または腫瘍関連抗原を発現する樹状細胞（ＤＣｍｕｔｎ）への曝露によって単離される。同様に、活性化関連サイトカインを産生する活性化Ｔリンパ球を単離する能力を、（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳサイトカイン捕捉システム（ＩＦＮ－ガンマ）を使用して）腫瘍抗原反応性Ｔ細胞を単離するための手段として使用することができる。エフェクターＴ細胞集団は、前記Ｔ細胞型が細胞表面タンパク質（マーカー）の発現によって定義される方式で、磁気ビーズ選別、フローサイトメトリー、プラスチック表面と結合する固相抗体、マトリックスに付着した所望のＴ細胞型によって発現される所望のマーカーに対する固相結合リガンドなどを使用して特異的細胞集団にさらに選別する。例えば、クラスＩＩ ＭＨＣと結合した変異体ペプチドと反応性があるＣＤ４細胞、またはクラスＩ ＭＨＣと結合した変異体ペプチドと反応性があるＣＤ８細胞は、（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＣＤ４試薬またはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＣＤ８試薬を使用して）ＣＤ４またはＣＤ８免疫磁性ビーズを使用して単離することができる。次いでこれらの細胞型を単一集団（例えばＣＤ４単独）として、または特異的組合せもしくは割合で使用する。同様に、Ｔ細胞分化のマーカーを使用して養子免疫療法用の特異的集団を選択した。これらの分化マーカーを使用して、（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＣＤ４５ＲＡ試薬またはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＣＤ６２Ｌ試薬を使用して）メモリーＴ細胞集団または非投薬Ｔ細胞集団を陽性または陰性選択する。さらに、Ｔ細胞集団の特異的生理的態様を使用して、（例えば、酵素アルデヒドデヒドロゲナーゼを発現する細胞集団またはＴ細胞表面上でのナトリウム（Ｎａ＋）とカリウムチャネル（Ｋ＋）の特異的組合せの発現を同定する試薬を使用して）ｉｎ ｖｉｖｏでさらに増殖し得るさらに初期のＴ細胞集団を同定することが可能である。Ｌｉｅｐｉｎｓ Ａら，１９８９年，「Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｄ Ｃａ＋＋ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｋ＋ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｉｎ ａｌｌｏｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ ｌｙｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ １１巻：１６５～１７８頁およびＧａｌｌｉｎ ＥＫ，１９８６年、Ｉｏｎｉｃ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｉｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏ ３９巻：２４１～２５４頁を参照。したがって前述の実施例では、骨髄腫患者由来のＴ細胞とＡＰＣ（ＤＣｍｕｔｎ）の培養前、ＡＰＣへの任意抽出Ｔ細胞集団の曝露後のいずれかであって、ただし患者への注入前に、Ｔ細胞サブセットを治療的細胞集団として単離する。一応用例では、これらのマーカーまたは生理的特徴を使用して腫瘍反応性Ｔ細胞をより正確に同定し、したがってＴＣＲＡとＴＣＲＢ配列のさらに効率よい同定のベースとして働く。別の応用例では、免疫療法に使用するＴ細胞集団を、患者への注入前、ただしＬＶ形質導入を介したｒｅｃＴＣＲおよびＣＡＲの発現誘導後に特定マーカーで予め選択する。別の応用例では、腫瘍反応性マーカーを発現するＴ細胞を患者からの単離後に選択し、この選択したサブセットをＡＰＣ（ＤＣｍｕｔｎ）と共培養して腫瘍特異的ＴＣＲＡおよびＴＣＲＢ配列をさらに効率よく同定する。
様々な詳細を前に略述した例示的施行と共に記載してきたが、様々な代替、変更形態、変形、改良、および／または実質的均等物が、公知であれまたは現在予想外もしくは予想外の可能性があれ、前述の開示を再検討することによって明らかとなり得る。
本文中に引用したそれぞれの出願と特許、および（訴訟中のそれぞれの交付済特許、「出願引用文書」を含めた）それぞれの出願と特許中で引用されたそれぞれの文書または参照文献、およびこれらの出願と特許のいずれかに対応するおよび／またはその優先権を主張するそれぞれのＰＣＴと外国出願または特許、およびそれぞれの出願引用文書中で引用もしくは参照されたそれぞれの文書は、ここで明確に参照により本明細書に組み込まれ、本発明を実施する際に利用することができる。より一般的には、文書または参照文献は本文中、特許請求の範囲の前の参照文献一覧中、または本文自体中のいずれかに引用され、それぞれのこれらの文書または参照文献（「本明細書中引用参照文献」）、および（任意の製造者の仕様書、説明書などを含めた）それぞれの本明細書中引用参照文献中に引用されたそれぞれの文書または参照文献は、ここで明確に参照により本明細書に組み込まれる。
一部の具体的実施形態の前述の記載によって、他者が、本発明の知識を適用することによって、一般的概念から逸脱せずに、具体的実施形態などの様々な適用例に関して容易に変更または適合させることができるのに充分な情報を与え、したがってこのような適合および変更形態は、開示した実施形態の均等物の意味および範囲内と理解すべきであり、理解することが意図されている。本明細書で利用する語句または述語は、限定の目的ではなく記載の目的であることは理解される。図面および記載中、例示的実施形態を開示しており、特異的用語が利用された可能性はあるが、他に言及しない限り、それらは限定の目的ではなく一般的および叙述的な意味でのみ使用され、したがって特許請求の範囲もそのように限定されない。さらに当業者は、本明細書で論じた方法の、ある特定ステップは別の順序で順に並べることができ、またはステップを組合せることができることを理解する。したがって、添付の特許請求の範囲は本明細書で開示した詳細な実施形態に限られないことが意図される。当業者は、ごく普通の実験を使用した、本明細書に記載した本発明の実施形態の多くの均等物を理解し、把握することができる。このような均等物は以下の特許請求の範囲によって包含される。
配列表に関する参照
本出願は、「配列表」という表題のＰＤＦファイルによって米国特許商標庁に電子出願された配列表を含有する。その配列表は参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の配列
以下に列記した核酸およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２において定義されたのと同様に、ヌクレオチド塩基に関する標準的な文字略語およびアミノ酸に関する３文字コードを使用して示す。それぞれの核酸配列の一本鎖のみを示すが、示した鎖に関する何らかの参照によって相補鎖が含まれると理解される。添付の配列表中：
配列番号５はリーダー／シグナルペプチド配列のヌクレオチド配列である：
atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgaactgccgcatccggcgtttctgctgattccg
配列番号６はリーダー／シグナルペプチド配列のアミノ酸配列である：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
配列番号１１はＤＮＡ ＣＤ８膜貫通ドメインのヌクレオチド配列である：
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gc
配列番号１２はＣＤ８膜貫通ドメインのアミノ酸配列である：
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
Val Ile Thr Leu Tyr Cys
配列番号１３はＤＮＡ ＣＤ８ヒンジドメインのヌクレオチド配列である：
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg
gacttcgcct gtgat
配列番号１４はＣＤ８ヒンジドメインのアミノ酸配列である：
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
配列番号１５はＣＤ８．アルファのアミノ酸番号１１８～１７８ヒンジ領域のアミノ酸配列である（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ．ｓｕｂ．－－００１７５９．３）：
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
配列番号１６はヒトＩｇＧ ＣＬ配列のアミノ酸配列である：
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
配列番号１７は４－１ＢＢのＤＮＡシグナル伝達ドメインのヌクレオチド配列である：
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt
gaactg
配列番号１８は４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインのアミノ酸配列である：
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
配列番号１９はＣＤ３－ゼータのＤＮＡシグナル伝達ドメインのヌクレオチド配列である：
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc
配列番号２０はＣＤ３ゼータのアミノ酸配列である：
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
配列番号２１は核酸配列（ＤＮＡ）ＳＰ－ＣＤ１９バインダー－ＣＤ８リンク－ＣＤ４ｔｍ－シグナルＬＴＧ１５６２のヌクレオチド配列である：
atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgaactgccgcatccggcgtttctgctg
attccggatattcagatgacccagaccaccagcagcctgagcgcgagcctgggcgatcgc
gtgaccattagctgccgcgcgagccaggatattagcaaatatctgaactggtatcagcag
aaaccggatggcaccgtgaaactgctgatttatcataccagccgcctgcatagcggcgtg
ccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattatagcctgaccattagcaacctg
gaacaggaagatattgcgacctatttttgccagcagggcaacaccctgccgtataccttt
ggcggcggcaccaaactggaaattaccggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggc
ggcggcggcagcgaagtgaaactgcaggaaagcggcccgggcctggtggcgccgagccag
agcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgccggattatggcgtgagctgg
attcgccagccgccgcgcaaaggcctggaatggctgggcgtgatttggggcagcgaaacc
acctattataacagcgcgctgaaaagccgcctgaccattattaaagataacagcaaaagc
caggtgtttctgaaaatgaacagcctgcagaccgatgataccgcgatttattattgcgcg
aaacattattattatggcggcagctatgcgatggattattggggccagggcaccagcgtg
accgtgagcagcgcggcggcgccggcgccgcgcccgccgaccccggcgccgaccattgcg
agccagccgctgagcctgcgcccggaagcgtgccgcccggcggcgggcggcgcggtgcat
acccgcggcctggattttgtgcagccgatggcgctgattgtgctgggcggcgtggcgggc
ctgctgctgtttattggcctgggcatttttttttgcgtgcgctgccgcccgcgccgcaaa aaactgc
tgtatatttttaaacagccgtttatgcgcccggtgcagaccacccaggaagaa gatggctgcagc
tgccgctttccggaagaagaagaaggcggctgcgaactgcgcgtgaaa tttagccgcagcgc
ggatgcgccggcgtatcagcagggccagaaccagctgtataacgaa ctgaacctgggccgcc
gcgaagaatatgatgtgctggataaacgccgcggccgcgatccg gaaatgggcggcaaacc
gcgccgcaaaaacccgcaggaaggcctgtataacgaactgcag aaagataaaatggcggaa
gcgtatagcgaaattggcatgaaaggcgaacgccgccgcggc aaaggccatgatggcctgtat
cagggcctgagcaccgcgaccaaagatacctatgatgcg
ctgcatatgcaggcgctgccgccgcgc
配列番号２２はＳＰ－ＣＤ１９バインダー－ＣＤ８リンク－ＣＤ４ｔｍ－シグナルＬＴＧ１５６２のアミノ酸配列である：
Figure 0007269733000001
配列番号２７はＳｃｖｆ ｃｄ１９のヌクレオチド配列である：
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcaccatcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc tcctca
配列番号２８はＳｃｖｆ ｃｄ１９のアミノ酸配列である：
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
配列番号２９はＳＰ－ＣＤ１９バインダー－ＣＤ８リンク－ＣＤ８ｔｍ－シグナル伝達ＬＴＧ１４９４のヌクレオチド配列である（本出願人の同時係属仮特許出願第６２／２３９，５０９号の図３Ａを参照）：
atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgaactgccgcatccggcgtttctgctg attccggataccgatattcagatgacccagaccaccagcagcctgagcgcgagcctgggc gatcgcgtgaccattagctgccgcgcgagccaggatattagcaaatatctgaactggtat cagcagaaaccggatggcaccgtgaaactgctgatttatcataccagccgcctgcatagc ggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattatagcctgaccattagc aacctggaacaggaagatattgcgacctatttttgccagcagggcaacaccctgccgtat acctttggcggcggcaccaaactggaaattaccggcagcaccagcggcagcggcaaaccg ggcagcggcgaaggcagcaccaaaggcgaagtgaaactgcaggaaagcggcccgggcctg gtggcgccgagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgccggat tatggcgtgagctggattcgccagccgccgcgcaaaggcctggaatggctgggcgtgatt tggggcagcgaaaccacctattataacagcgcgctgaaaagccgcctgaccattattaaa gataacagcaaaagccaggtgtttctgaaaatgaacagcctgcagaccgatgataccgcg atttattattgcgcgaaacattattattatggcggcagctatgcgatggattattggggc cagggcaccagcgtgaccgtgagcagcgcggcggcgaccaccaccccggcgccgcgcccg ccgaccccggcgccgaccattgcgagccagccgctgagcctgcgcccggaagcgtgccgc ccggcggcgggcggcgcggtgcatacccgcggcctggattttgcgtgcgatatttatatt tgggcgccgctggcgggcacctgcggcgtgctgctgctgagcctggtgattaccctgtat tgcaaacgcggccgcaaaaaactgctgtatatttttaaacagccgtttatgcgcccggtg cagaccacccaggaagaagatggctgcagctgccgctttccggaagaagaagaaggcggc tgcgaactgcgcgtgaaatttagccgcagcgcggatgcgccggcgtatcagcagggccag aaccagctgtataacgaactgaacctgggccgccgcgaagaatatgatgtgctggataaa cgccgcggccgcgatccggaaatgggcggcaaaccgcgccgcaaaaacccgcaggaaggc ctgtataacgaactgcagaaagataaaatggcggaagcgtatagcgaaattggcatgaaa ggcgaacgccgccgcggcaaaggccatgatggcctgtatcagggcctgagcaccgcgacc aaagatacctatgatgcgctgcatatgcaggcgctgccgccgcgc
配列番号３０はＳＰ－ＣＤ１９バインダー－ＣＤ８リンク－ＣＤ８ｔｍ－シグナル伝達ＬＴＧ１４９４のアミノ酸配列である（本出願人の同時係属仮特許出願第６２／２３９，５０９号の図３Ａを参照）：
Figure 0007269733000002
配列番号３１はＳＰ－ＣＤ１９バインダー－ＣＤ８リンク－ＣＤ８ｔｍ－シグナル（再遺伝子操作ＬＴＩ）（ＬＴＧ１５３８）のヌクレオチド配列である（本出願人の同時係属仮特許出願第６２／２３９，５０９号の図３Ｂを参照）：
atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgaactgccgcatccggcgtttctgctg
attccggatattcagatgacccagaccaccagcagcctgagcgcgagcctgggcgatcgc
gtgaccattagctgccgcgcgagccaggatattagcaaatatctgaactggtatcagcag
aaaccggatggcaccgtgaaactgctgatttatcataccagccgcctgcatagcggcgtg
ccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattatagcctgaccattagcaacctg
gaacaggaagatattgcgacctatttttgccagcagggcaacaccctgccgtataccttt
ggcggcggcaccaaactggaaattaccggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggc
ggcggcggcagcgaagtgaaactgcaggaaagcggcccgggcctggtggcgccgagccag
agcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgccggattatggcgtgagctgg
attcgccagccgccgcgcaaaggcctggaatggctgggcgtgatttggggcagcgaaacc
acctattataacagcgcgctgaaaagccgcctgaccattattaaagataacagcaaaagc
caggtgtttctgaaaatgaacagcctgcagaccgatgataccgcgatttattattgcgcg
aaacattattattatggcggcagctatgcgatggattattggggccagggcaccagcgtg
accgtgagcagcgcggcggcgaccaccaccccggcgccgcgcccgccgaccccggcgccg
accattgcgagccagccgctgagcctgcgcccggaagcgtgccgcccggcggcgggcggc
gcggtgcatacccgcggcctggattttgcgtgcgatatttatatttgggcgccgctggcg
ggcacctgcggcgtgctgctgctgagcctggtgattaccctgtattgcaaacgcggccgc
aaaaaactgctgtatatttttaaacagccgtttatgcgcccggtgcagaccacccaggaa
gaagatggctgcagctgccgctttccggaagaagaagaaggcggctgcgaactgcgcgtg
aaatttagccgcagcgcggatgcgccggcgtatcagcagggccagaaccagctgtataac
gaactgaacctgggccgccgcgaagaatatgatgtgctggataaacgccgcggccgcgat
ccggaaatgggcggcaaaccgcgccgcaaaaacccgcaggaaggcctgtataacgaactg
cagaaagataaaatggcggaagcgtatagcgaaattggcatgaaaggcgaacgccgccgc
ggcaaaggccatgatggcctgtatcagggcctgagcaccgcgaccaaagatacctatgat
gcgctgcatatgcaggcgctgccgccgcgc
配列番号３２はＳＰ－ＣＤ１９バインダー－ＣＤ８リンク－ＣＤ８ｔｍ－シグナル（再遺伝子操作ＬＴＩ）（ＬＴＧ１５３８）のアミノ酸配列である（本出願人の同時係属仮特許出願第６２／２３９，５０９号の図３Ｂを参照）：
Figure 0007269733000003

Claims (2)

  1. ＣＤ１９を発現する固形腫瘍を有するヒト患者の治療用薬剤を製造するための単一または複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする１以上のレンチウイルスベクターが形質導入された自家Ｔ細胞集団の使用であって、
    ここにおいて、単一または複数のＣＡＲは、自家患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖および持続を促進するために配列番号２１、配列番号２９および配列番号３１からなる群から選ばれる単離された核酸配列を含み、
    ここにおいて、Ｔ細胞は単球から分化された自家樹状細胞と共培養され、自家樹状細胞は患者由来の腫瘍抗原を発現する１以上のレンチウイルスベクターが形質導入され、
    ここにおいて、Ｔ細胞集団は、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１以上のレンチウイルスベクターがさらに形質導入され、それにより患者に直接戻し注入することができる患者由来腫瘍抗原を認識することが可能である活性な患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団を生成し、患者特異的に腫瘍の安定化、腫瘍の低減、癌の排除、または癌の緩解を生じるものであり、
    ここにおいて、前記Ｔ細胞が、特異的活性化またはメモリー関連表面マーカーを発現するということによって事前選択されている、使用。
  2. 固形腫瘍を有するヒト患者の治療用薬剤を製造するための単一または複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする１以上のレンチウイルスベクターが形質導入された自家Ｔ細胞集団の使用であって、
    ここにおいて、単一または多重のＣＡＲは、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０または抗ＣＤ２２抗体またはその結合フラグメントを含み、ここにおいて抗ＣＤ１９ ＣＡＲは配列番号２１、配列番号２９および配列番号３１からなる群から選ばれる単離された核酸配列を含み、
    ここにおいて、Ｔ細胞集団は、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１以上のレンチウイルスベクターがさらに形質導入され、それにより、患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖および持続を促進するために患者に直接戻し注入することができる患者由来ＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２腫瘍抗原を認識することが可能である活性な患者特異的自家抗腫瘍Ｔ細胞集団を生成し、患者特異的に腫瘍の安定化、腫瘍の低減、癌の排除、または癌の緩解を生じるものであり、
    ここにおいて、前記Ｔ細胞が、特異的活性化またはメモリー関連表面マーカーを発現するということによって事前選択されている、使用。
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