CN111876384B

CN111876384B - 一种肿瘤组织植入液及其制备方法与用途

Info

Publication number: CN111876384B
Application number: CN202010762567.8A
Authority: CN
Inventors: 刘晗青; 屠志刚
Original assignee: Jiangsu Laisen Biotechnology Research Institute Co ltd
Current assignee: Jiangsu Laisen Biotechnology Research Institute Co ltd
Priority date: 2020-07-31
Filing date: 2020-07-31
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2040-07-31
Also published as: CN111876384A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肿瘤组织植入液及其制备方法与用途。本发明所提供的肿瘤植入液以人尤文肉瘤细胞系RD‑ES成瘤后的组织匀浆作为肿瘤微环境模拟基质，并加入EGF、hFGF、ITS、非必需氨基酸以及L‑谷氨酰胺作其他成分。其可以很好提高肿瘤组织的粘附性能，经多种肿瘤细胞验证其可以大大增加人源肿瘤细胞株异种移植的成瘤成功率，对多种肿瘤模型均有很好的效果。同时，本发明所提供的制备方法简单、成本低，易操作、对操作者要求低。

Description

一种肿瘤组织植入液及其制备方法与用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肿瘤组织植入液及其制备方法与用途。

背景技术

PDX (Patient-Derived tumor Xenograft)人源肿瘤异种移植模型，是指将肿瘤患者的肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠体内，依靠小鼠提供的微环境进行生长而建成的一种肿瘤模型。在PDX模型构建过程中肿瘤微环境（TME）的模拟基质组成是非常重要的因素。小鼠EHS（Engelbreth-Holm Swarm）肉瘤衍生产品是目前实验研究中最常用的肿瘤微环境模拟基质。但是由于 EHS的分子组成不能准确模拟人类TME，使得其在人源肿瘤异种移植模型建立过程中会产生差异，影响实验中对人类癌症的侵袭过程的研究。目前商品化的EHS肿瘤衍生产品如Matrigel®、ECM凝胶（Sigma）、Cultrex®BME（Amsbio）、Geltrex®（Gibco）以及ECMatrix™（Millipore）等均以鼠肿瘤组织匀浆为主要成分，很难完全模拟人类肿瘤生长的自然微环境，因此，常常发生临床前和临床数据的不匹配，影响医药研发的成功率。

发明内容

有鉴于此，本发明针对现有技术中存在的不足，本发明的主要目的是提供一种肿瘤组织植入液及其制备方法与用途。本发明的组织植入液以人尤文肉瘤细胞系RD-ES成瘤后的组织匀浆为肿瘤微环境模拟基质，提高人源肿瘤细胞株异种移植的成瘤成功率，对多种肿瘤模型均有很好的效果。

本发明的上述目的通过如下技术方案得以实现：

一方面，本发明提供了一种肿瘤组织植入液，所述的肿瘤组织植入液以人尤文肉瘤细胞系RD-ES成瘤后的组织匀浆为肿瘤微环境基质；在一个实施方案中，所述肿瘤组织植入液还含有10~40 ng/ml表皮细胞生长因子（EGF），10~40 ng/ml成纤维细胞生长因子（hFGF），2~8 pg/ml ITS（细胞培养添加物），1% 非必需氨基酸和2 mmol/L L-谷氨酰胺中的一种或多种。

在进一步的实施方案中，所述的肿瘤组织植入液还含有20 ng/ml表皮细胞生长因子，20 ng/ml成纤维细胞生长因子，4 pg/ml ITS，1%非必需氨基酸和2 mmol/L L-谷氨酰胺中的一种或多种。

另一方面，本发明还提供一种肿瘤组织植入液的制备方法，其步骤包括：

（1）将人尤文肉瘤RD-ES细胞在85%RPMI-1640+15%FBS的培养基中常规传代后注入小鼠皮下，当小鼠体内肉瘤体积达到250 mm³时取出肉瘤组织，液氮冷冻肉瘤组织后将其磨成组织粉末，多次重悬于NaCl缓冲液后，用细胞培养基稀释成不同批次的组织液，合并组织液得到人尤文肉瘤细胞系RD-ES细胞匀浆；

（2）在步骤（1）中得到的人尤文肉瘤细胞系RD-ES细胞匀浆中加入10~40 ng/ml表皮细胞生长因子、10~40 ng/ml成纤维细胞生长因子、2~8 pg/ml ITS、1% 非必需氨基酸和/或2 mmol/L L-谷氨酰胺中的一种或多种得到肿瘤组织植入液。

在进一步的实施方案中，步骤（1）中所述的人尤文肉瘤细胞系RD-ES细胞匀浆的浓度为20 mg/ml。

另一方面，本发明还提供了上述肿瘤组织植入液在促进人源肿瘤异种移植模型中的用途。

进一步地，所述的用途为在人源肿瘤异种移植中促进细胞的粘附。

进一步地，所述的肿瘤为肺癌、卵巢癌、胃癌、头颈部癌和/或结直肠癌。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的肿瘤植入液以人尤文肉瘤细胞系RD-ES成瘤后的组织匀浆作为肿瘤微环境模拟基质，并加入EGF 、hFGF、ITS 、非必需氨基酸以及L-谷氨酰胺作其他成分。本发明提供的肿瘤植入液可以很好提高肿瘤组织的粘附性能，经多种肿瘤细胞验证其可以大大增加人源肿瘤细胞株异种移植的成瘤成功率，对多种肿瘤模型均有很好的效果。同时，本发明所提供的制备方法简单、成本低，易操作、对操作者要求低。

具体实施方式

本发明公开了一种肿瘤组织植入液及其制备方法与用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料，均可由市场购得。

试剂：人尤文肉瘤RD-ES细胞购于上海舜冉，细胞培养基购自于上海英潍捷基，胰蛋白酶（EDTA）购自于Sigma-Aldrich，RPMI-1640购自于上海英潍捷基，FBS购自于Gibco公司。

实施例1：人尤文肉瘤细胞系RD-ES细胞匀浆的制备

将人尤文肉瘤RD-ES细胞在37℃的5%CO₂湿化环境中培养，胰蛋白酶（EDTA）常规传代，每2-3天更换一次培养基（85%RPMI-1640+15%FBS）。在4-6周裸鼠皮下注射2×10⁶个人尤文肉瘤细胞系RD-ES细胞，当小鼠内肉瘤体积达到250 mm³时，处死小鼠，取出肉瘤组织，用液氮冷冻；冷冻后的肉瘤组织用冷冻研磨机研磨成组织粉末，取10克组织粉末重悬在20 ml预冷的3.4 M NaCl缓冲液（pH 7.4）中，匀浆后离心后再次重悬于20 ml上述NaCl缓冲液中，使用DC蛋白质分析法（Bio-Rad）测定蛋白质浓度，用细胞培养基稀释不同批次的组织液，得到浓度20 mg/ml人尤文肉瘤细胞系RD-ES细胞匀浆；−20℃下储存备用（分份存储，每份体积小于0.5 ml）。

实施例2：肿瘤组织植入液的配置

取实施例1中所制备的人尤文肉瘤细胞系RD-ES细胞匀浆，分别加入不同浓度（5、10、20、40 ng/ml）的EGF因子制备得到含有不同浓度EGF因子的肿瘤植入液。对得到的肿瘤植入液进行细胞粘附试验。在96孔板中，每孔加入100μl PBS、10μg/ml BSA（Sigma-Aldrich）、分别加入上述含有不同浓度EGF因子的肿瘤植入液，每个浓度六个孔，涂布24小时。植入液分别在PBS中稀释至1:10，第二天去除多余液体，培养板用100 μl/孔0.1% BSA孵育2小时，并用PBS洗涤。将6000个100μl无血清培养基中的A549细胞添加到每个孔中，放入在培养箱中培养2 h。PBS冲洗掉未粘附的细胞，用10%三氯乙酸固定剩余细胞，用结晶紫染色并在540 nm下使用读板机定量。表1是含有不同浓度EGF因子的肿瘤植入液细胞粘附影响对照表。

表1.含有不同浓度EGF因子的肿瘤植入液对细胞粘附影响对照表

由表1可见，加入浓度为10~40 ng/ml的EGF因子后配置得到的肿瘤植入液均具有较高的吸光度，当EGF因子浓度为20 ng/ml时测得的吸光度最高。

实施例3：肿瘤组织植入液的配置

取实施例1中所制备的人尤文肉瘤细胞系RD-ES细胞匀浆，分别加入不同浓度（5、10、20、40 ng/ml）的hFGF制备得到含有不同浓度EGF因子的肿瘤植入液。采用与实施例2相同的方法对得到的肿瘤植入液进行细胞粘附试验。表2是含有不同浓度hFGF因子的肿瘤植入液细胞粘附影响对照表。

表2. 含有不同浓度hFGF因子的肿瘤植入液细胞粘附影响对照表

由表2可见，加入浓度为10~40 ng/ml的hFGF因子后配置得到的肿瘤植入液均具有较高的吸光度，且当hFGF因子浓度为20 ng/ml时测得的吸光度最高。

实施例4：肿瘤组织植入液的配置

取实施例1中所制备的人尤文肉瘤细胞系RD-ES细胞匀浆，分别加入不同浓度（1、2、4、8pg/ml）的ITS制备得到含有不同浓度ITS因子的肿瘤植入液。采用与实施例2相同的方法对得到的肿瘤植入液进行细胞粘附试验。表3是含有不同浓度ITS因子的肿瘤植入液细胞粘附影响对照表。

表3.含有不同浓度ITS因子的肿瘤植入液细胞粘附影响对照表

由表3可见，加入浓度为1~8 pg/ml的ITS因子后配置得到的肿瘤植入液的吸光度均有所提高，且当ITS因子浓度为4 pg/ml时测得的吸光度最高。可见，加入浓度为1~8 pg/ml的ITS因子后配置得到的肿瘤植入液使得细胞的粘附性能有所提升。

实施例5：肿瘤组织植入液对细胞粘附性的影响

取实施例1中所制备的人尤文肉瘤细胞系RD-ES细胞匀浆，分别加入1% 非必需氨基酸和2 mmol/L 谷氨酰胺制备得到肿瘤植入液。采用与实施例2相同的方法对得到的肿瘤植入液进行细胞粘附试验。表4是含有1% 非必需氨基酸的肿瘤植入液细胞粘附影响对照表；表5是含有谷氨酰胺的肿瘤植入液细胞粘附影响对照表。

表4. 含有1% 非必需氨基酸的肿瘤植入液细胞粘附影响对照表

	PBS	BSA	1% 非必需氨基酸
				吸光度	0.0865	0.0812	0.1338

表5. 含有谷氨酰胺的肿瘤植入液细胞粘附影响对照表

	PBS	BSA	2 mmol/L 谷氨酰胺
				吸光度	0.0781	0.0799	0.1432

由表4、5可见，人尤文肉瘤细胞系RD-ES细胞匀浆中加入1% 非必需氨基酸和2mmol/L 谷氨酰胺后得到的肿瘤植入液的吸光度均有所提高，配置得到的肿瘤植入液使得细胞的粘附性能有所提升。

实施例6：肿瘤组织植入液对成瘤实验的影响

需要说明的是，本发明在实施例1中制备的人尤文肉瘤细胞系RD-ES细胞匀浆中共同加入实施例2~5中的各个因子配制得到肿瘤植入液同样取得了类似提高细胞粘附的技术效果，即在人尤文肉瘤细胞系RD-ES细胞匀浆中加入10~40 ng/ml表皮细胞生长因子、10~40ng/ml成纤维细胞生长因子、2~8 pg/ml ITS、1% 非必需氨基酸、和2 mmol/L L-谷氨酰胺。将上述配置好的肿瘤植入液命名为LS-Opt，与Matrigel进行对照进行肿瘤成瘤实验。

实验动物：6-8周龄的裸鼠，实验开始前动物至少适应性饲养三天。

实验过程：A549细胞（购自于中科院）体外培养，然后将200万个细胞接种于裸鼠皮下。待肿瘤长至100 mm³大小时，从小鼠皮下切除，切成2-3 mm³大小，液氮速冻。取20个组织块，随机均分为实验组和对照组，实验组浸泡在400 μl肿瘤植入液LS-Opt中，对照组在同样环境中浸泡于Matrigel中。半小时后，分别将各组的肿瘤组织植入小鼠皮下，统计各组小鼠的成瘤率。采用相同实验方法分别对HO-8910细胞、MGC-803细胞、SCC47细胞、SW480细胞（均购自于中科院）进行肿瘤成瘤实验。

表6. 肿瘤组织植入液LS-Opt与Matrigel对肿瘤成瘤成功率的影响

成瘤率（%）	实验组（LS-Opt）	对照组（Matrigel）
			A549细胞	90	80
HO-8910细胞	80	70
			MGC-803细胞	80	60
SCC47细胞	90	70
			SW480细胞	80	50

由表6可见，与对照Matrigel组相比，本发明所提供的肿瘤组织植入液（LS-Opt）浸泡肿瘤组织块后植入小鼠皮下的成瘤率明显提高，尤其针对SW480细胞可以较好提高成瘤率。

以上所述仅为本发明的优选实施方式，并非因此限制本发明的专利范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种肿瘤组织植入液，其特征在于，所述肿瘤组织植入液包括人尤文肉瘤细胞系RD-ES成瘤后的组织匀浆，所述组织匀浆的浓度为20 mg/ml；所述组织植入液中还含有10~40ng/m EGF、10~40 ng/ml hFGF、2~8 pg/ml ITS、1%非必需氨基酸和2 mmol/L L-谷氨酰胺。

2.根据权利要求1所述的肿瘤组织植入液，其特征在于，所述的组织植入液中含有20ng/m EGF、20 ng/ml hFGF、4 pg/ml ITS、1%非必需氨基酸和2 mmol/L L-谷氨酰胺。

3.一种肿瘤组织植入液的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（2）在步骤（1）中得到的人尤文肉瘤细胞系RD-ES细胞匀浆中加入10~40 ng/ml表皮细胞生长因子、10~40 ng/ml成纤维细胞生长因子、2~8 pg/ml ITS、1% 非必需氨基酸和2mmol/L L-谷氨酰胺，得到肿瘤组织植入液；所述人尤文肉瘤细胞系RD-ES细胞匀浆的浓度为20 mg/ml。

4.权利要求1所述的肿瘤组织植入液在构建人源肿瘤异种移植模型中的用途，其特征在于，所述的用途为在人源肿瘤异种移植中促进细胞的粘附。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤为肺癌、卵巢癌、胃癌、头颈部癌和/或结直肠癌。