TWI660968B - Antagonat組合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供組合物、化合物及調節基因表現之方法。在某些實施例中，本發明闡述組合物，其中該組合物包含antagoNAT。在一些實施例中，該antagoNAT係包含經修飾及未經修飾糖亞單元之寡核苷酸，其中該antagoNAT與天然反義轉錄物雜交。本發明之某些實施例提供調節細胞中基因表現之方法，其包含使該細胞與antagoNAT接觸。在一些實施例中，該方法包括形成包含該antagoNAT及該基因之天然反義轉錄物的雜合體，其中該雜合體空間上阻斷該天然反義轉錄物之正常功能。

Description

ANTAGONAT組合物及其使用方法
本發明實施例包含組合物、化合物及調節基因表現之方法。
本申請案主張2010年11月18日申請之美國臨時專利申請案第61/415,307號及2010年11月21日申請之美國臨時專利申請案第61/415,858號之優先權，該等案件之全文以引用方式併入本文中。
DNA-RNA及RNA-RNA雜交對於包括DNA複製、轉錄及轉譯在內之許多核酸功能態樣甚為重要。雜交對於檢測特定核酸或改變其表現之各種技術亦至關重要。例如，反義核苷酸藉由與靶RNA雜交來破壞基因表現，由此干擾RNA剪接、轉錄、轉譯及複製。反義DNA具有額外特徵，亦即DNA-RNA雜合體用作核糖核酸酶H消化之受質，該活性存在於大部分細胞類型中。反義分子可遞送至細胞中，如同寡去氧核苷酸之情形，或者其可自內源基因表現為RNA分子。
本發明提供組合物、化合物及調節細胞中多核苷酸功能之方法。在某些實施例中，本發明闡述組合物，其中該組合物包含醫藥上可接受之稀釋劑或載劑及antagoNAT。在一些實施例中，該antagoNAT係與天然反義轉錄物雜交之經修飾寡核苷酸。本發明之某些實施例提供調節細胞中多 核苷酸功能之方法，其包含使細胞與antagoNAT接觸。在一些實施例中，該方法包括形成包含antagoNAT及多核苷酸之雜合體，其中該雜合體空間上阻斷多核苷酸之正常功能。
本發明之一些實施例闡述包含醫藥上可接受之稀釋劑或載劑及antagoNAT之組合物，其中該antagoNAT之長度為10個至30個核苷亞單元。在一些實施例中，該antagoNAT與預選天然反義轉錄物雜交。在其他實施例中，該antagoNAT在3'末端包含至少一個糖經修飾之核苷亞單元且在5'末端包含至少一個糖經修飾之核苷亞單元。在一些實施例中，該antagoNAT在5'核苷亞單元與3'核苷亞單元之間進一步包含內部糖經修飾之核苷亞單元及內部糖未經修飾之核苷亞單元，其中連續的內部核糖核苷不超過三個且至少一個內部核苷係經修飾的。在其他或另外的實施例中，該antagoNAT在5'核苷亞單元與3'核苷亞單元之間包含內部糖經修飾之核苷亞單元及內部糖未經修飾之核苷亞單元，其中連續的內部核糖核苷不超過三個且在內部糖未經修飾之核苷亞單元之間存在至少一個經修飾內部核苷。
在一些實施例中，本文所述組合物之antagoNAT包含糖經修飾及糖未經修飾之核苷亞單元，其中糖經修飾及糖未經修飾之核苷亞單元各自包含嘧啶鹼基或嘌呤鹼基。在其他實施例中，內部糖經修飾之核苷亞單元各自包含嘧啶鹼基或嘌呤鹼基。在其他或另外的實施例中，內部糖經修飾之核苷亞單元各自包含嘧啶鹼基。
在其他實施例中，糖經修飾之核苷亞單元各自在2'位上經烷氧基、烷基、鹵素、胺基、巰基、烷基胺、烷基巰基、烷基酯或結合至C4'碳之O-伸烷基取代。在一些實施例中，糖經修飾之核苷亞單元各自在2'位上經烷氧基、鹵素或結合至C4'碳之O-伸烷基取代。在特定實施例中，糖經修飾之核苷亞單元各自在2'位上經甲氧基取代。在某些特定實施例中，糖經修飾之核苷亞單元各自在2'位上經O-甲氧基乙基取代。在本發明之其他實施例中，糖經修飾之核苷亞單元各自在2'位上經結合至C4'碳之O-亞甲基(2'-OCH2-4')或結合至C4'碳之O-伸乙基(2'-OCH2CH2-4')取代。
在本發明之一些較佳組合物中，各未經修飾核苷亞單元獨立地包含核糖或2'-去氧核糖。
在組合物之一些實施例中，本文所述組合物之antagoNAT包含磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸烷基酯、磷醯胺酸酯、硼烷磷酸酯、碳酸酯、胺基甲酸酯、乙醯胺酸酯、硫醚、硫代甲縮醛(thioformacetal)核苷酸間鍵聯或其組合之主鏈。在其他實施例中，該antagoNAT包含磷酸二酯及硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯之主鏈。在特定實施例中，該antagoNAT包含硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯之主鏈。
在某些實施例中，本文所述組合物之antagoNAT與預選天然反義轉錄物至少50%互補。
在某些實施例中，本文所述組合物之antagoNAT包括不超過五個的包含2'-去氧核糖之連續內部未經修飾核苷，其 中(a)3'末端區段包含雙環2'-經修飾糖核苷且5'末端區段包含非雙環2'-經修飾糖核苷；或(b)3'末端區段包含非雙環2'-經修飾糖核苷且5'末端區段包含雙環2'-經修飾糖核苷。
本發明之一些實施例闡述式(I)之antagoNAT或其鹽：C-Au-[By-A'w]x-By-A"z-C式(I)其中：各A、A'及A"獨立地具有以下結構： 各B獨立地具有以下結構： 各C獨立地為羥基、磷酸酯基、經取代或未經取代之烷氧基、或任一適宜5'或3'末端帽；各u、v、w、x、y及z獨立地為大於或等於1之整數；各D係雜環鹼基；各E獨立地選自由下列組成之群：經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烷氧基、經取代或未經取代之胺、鹵素、經取代或未經取代之胺基烷氧基、經取代或未經取代之烯基、或巰基；各G獨立地為-OP(O)2O-、-OP(O)(OR)O-、-OP(O)(S)O- 、-OP(O)(SR)O-、-OP(S)2O-、-OP(R)(O)O-、-OP(NR2)(O)O-、-OC(O)O-、-OCH2C(O)NHCH2-、-OCH2S-、-CH2SCH2-、-OP(O)(BH3)O-、-NP(O)2O-、-OP(R)(O)O-，或當(Ia)連結至C時不存在；各R獨立地為氫或經取代或未經取代之烷基；各J係氫，或J與E一起形成視情況包括選自N或O之額外雜原子之環結構；且各K獨立地為羥基或氫。
在antagoNAT之某些實施例中，本文所述antagoNAT之各雜環鹼基獨立地選自嘌呤或嘧啶鹼基。在其他實施例中，各雜環鹼基獨立地選自腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、2-胺基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶或次黃嘌呤。在某些特定實施例中，各雜環鹼基獨立地選自腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶或胞嘧啶。在其他特定實施例中，各A'之雜環鹼基獨立地選自尿嘧啶、胸腺嘧啶或胞嘧啶。
在一些實施例中，闡述antagoNAT，其中各A、A'或A"獨立地具有以下結構： 在本發明之一些較佳化合物中，各E獨立地為甲氧基、乙氧基、O-甲基乙基或氟。在特定實施例中，各E係甲氧基。在某些特定實施例中，各E係O-甲基乙基。
在本文所述antagoNAT之一些實施例中，各G獨立地為-OP(O)2O-、-OP(O)(OR)O-或-OP(O)(S)O-。在特定實施例中，各G係-OP(O)(S)O-。
在本文所述antagoNAT之一些實施例中，各C係羥基或任一適宜末端帽結構。
在本發明之某些較佳antagoNAT中，當K係羥基時，v及y獨立地為1、2或3之整數，且x至少為1。在其他實施例中，當K係氫時，v及y獨立地為1、2、3、4或5之整數，且(a)其中至少一個A具有(Id)或(Ie)之結構且至少一個A"具有(Ic)之結構；或(b)其中至少一個A具有(Ic)之結構且至少一個A"具有(Id)或(Ie)之結構。
在某些實施例中，本發明提供調節細胞中基因表現之方法。在一些實施例中，該方法包括使細胞與本文所述antagoNAT接觸，其中該antagoNAT之長度為10個至30個核苷亞單元。在一些實施例中，本文所述組合物之antagoNAT或本文所述方法中所用之antagoNAT與基因之天然反義轉錄物特異性雜交。在其他實施例中，該antagoNAT在3'末端包括至少一個糖經修飾之核苷亞單元且在5'末端包括至少一個糖經修飾之核苷亞單元。在一些實施例中，該antagoNAT在5'核苷亞單元與3'核苷亞單元之間進一步包含內部糖經修飾之核苷亞單元及內部糖未經修飾之核苷亞單元，其中連續的內部核糖核苷不超過三個且至少一個內部核苷係經修飾的。在特定實施例中，該antagoNAT在5'核苷亞單元與3'核苷亞單元之間額外包括內 部糖經修飾之核苷亞單元及內部糖未經修飾之核苷亞單元，其中連續的內部核糖核苷不超過三個且在內部糖未經修飾之核苷亞單元之間存在至少一個經修飾內部核苷。
在一些實施例中，本文所述之任一調節基因表現之方法進一步包含形成包含antagoNAT及天然反義轉錄物之雜合體；由此調節該基因之表現。在一些實施例中，本文所述之任一調節基因表現之方法進一步包含形成包含antagoNAT及天然反義轉錄物之雜合體，其中該雜合體並非核糖核酸酶裂解之受質。在某些實施例中，該方法包含空間上阻斷天然反義轉錄物之正常功能。在一些實施例中，該antagoNAT與天然反義轉錄物之互補體具有至少50%的序列一致性。在其他實施例中，相對於對照，細胞中之基因表現上調。在某些實施例中，相對於對照，細胞中之基因表現下調。
在一些實施例中，根據本文所述方法與antagoNAT接觸之細胞類型係哺乳動物細胞。
此外，根據本發明之某些實施例，提供調節細胞中多核苷酸之功能的方法，其包含使細胞與antagoNAT接觸。在一些實施例中，該antagoNAT之長度為10個至30個核苷亞單元。在其他實施例中，該antagoNAT與多核苷酸雜交。在特定實施例中，該antagoNAT在3'末端包含至少一個糖經修飾之核苷亞單元且在5'末端包含至少一個糖經修飾之核苷亞單元。在一些實施例中，該antagoNAT在5'核苷亞單元與3'核苷亞單元之間進一步包含內部糖經修飾之核苷 亞單元及內部糖未經修飾之核苷亞單元，其中連續的內部核糖核苷不超過三個且至少一個內部核苷係經修飾的。在其他或另外的實施例中，該antagoNAT在5'核苷亞單元與3'核苷亞單元之間包含內部糖經修飾之核苷亞單元及內部糖未經修飾之核苷亞單元，其中連續的內部核糖核苷不超過三個且在內部糖未經修飾之核苷亞單元之間存在至少一個經修飾內部核苷。
在一些實施例中，根據本文所述方法之靶多核苷酸係有義鏈之天然反義鏈。在某些實施例中，該antagoNAT與多核苷酸之互補體具有至少50%的序列一致性。
在一些實施例中，本文所述之任一調節多核苷酸功能之方法進一步包含形成包含antagoNAT及多核苷酸之雜合體；由此調節該多核苷酸之該功能。在某些實施例中，該雜合體並非核糖核酸酶裂解之受質。在一些實施例中，該方法包含空間上阻斷多核苷酸之正常功能。在某些實施例中，相對於對照，細胞中有義鏈之表現提高。在其他實施例中，相對於對照，細胞中有義鏈之表現降低。
在一些實施例中，根據本文所述方法與antagoNAT接觸之細胞類型係哺乳動物細胞。
本說明書中提及之所有出版物及專利申請案均以相同程度以引用方式併入本文中，如同將每一個別出版物或專利申請案特定且個別地指明以引用方式併入一般。
儘管本文已顯示及闡述本發明之較佳實施例，但熟習此 項技術者應明瞭該等實施例僅以實例方式提供。熟習此項技術者在不背離本發明下可構想出多種變化、改變及取代。應瞭解，本文所述之本發明實施例之各種替代可用於實施本發明。意欲由下文申請專利範圍來限定本發明之範疇，且本發明由此涵蓋在該等申請專利範圍及其等效形式之範疇內的方法及結構。
本文所揭示之所有基因、基因名稱及基因產物意欲對應於可應用本文所揭示組合物及方法之來自任一物種的同源物。因此，該等術語包括但不限於人類及小鼠之基因及基因產物。應瞭解，在揭示來自特定物種之基因或基因產物時，此揭示內容意欲僅具有實例性，且不應解釋為限制意義，除非上下文明確指明。因此，例如，對於在一些實施例中係關於哺乳動物核酸及胺基酸序列之本文所揭示基因而言，其意欲涵蓋來自其他動物之同源及/或直系同源基因及基因產物，該等其他動物包括但不限於其他哺乳動物、魚、兩棲動物、爬行動物及禽類。在較佳實施例中，基因或核酸序列係人類。
某些定義
本文所用之術語僅用於闡述特定實施例之目的而並非意欲限制本發明。除非上下文另外明確指明，否則本文所用之單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」亦意欲包括複數形式。另外，就詳細說明及/或申請專利範圍中使用術語「包括(including)」、「包括(includes)」、「具有(having)」、「具有(has)」、「具有(with)」或其變化形式而言，該等術 語之包括方式意欲與術語「包含(comprising)」之方式類似。
術語「約」或「近似地」意指熟習此項技術者所測定之特定值的可接受誤差範圍，其部分地取決於該值之測量或測定方式，亦即，量測系統之侷限性。例如，根據業內規範，「約」可意指在1個或1個以上之標準偏差內。另一選擇為，「約」可意指與給定值相差至多20%、較佳至多10%、更佳至多5%且更佳至多1%的範圍。另一選擇為，尤其對於生物系統或過程而言，該術語可意指在一數值之一個數量級內、較佳在5倍內且更佳在2倍內。在本申請案及申請專利範圍中闡述特定值時，除非另有闡述，否則應假設術語「約」意指在該特定值之可接受誤差範圍內。
本文所用之術語「核苷」或「核苷亞單元」意指包含核鹼基(nucleobase)及糖之糖苷胺(glycosylamine)。核苷包括(但不限於)天然核苷、無鹼基核苷、經修飾核苷及具有模擬鹼基及/或糖基團之核苷。
本文所用之術語「未經修飾核苷」或「天然核苷」意指包含天然核鹼基及天然糖之核苷。天然核苷包括核糖核酸(RNA)及去氧核糖核酸(DNA)核苷。
本文所用之術語「未經修飾糖」或「糖未經修飾」係指RNA(2'-OH)或DNA(2'-H)中自其天然存在形式未經修飾之核苷糖。
本文所用之術語「經修飾糖」、「2'-經修飾糖」或「糖經修飾」係指在2'位上包含除H或OH以外之取代基之核苷的 呋喃戊糖基糖。2'-經修飾糖包括(但不限於)在2'位上經烷氧基、烷基、鹵素、胺基、巰基、烷基胺、烷基巰基、烷基酯或結合至C4'碳之O-伸烷基取代之呋喃戊糖基糖。
本文所用之術語「核鹼基」係指核苷或核苷酸之鹼基部分。核鹼基可包含能夠以氫鍵鍵結至另一核酸之鹼基的任一原子或原子團。
本文所用之術語「未經修飾核鹼基」係指RNA或DNA中自其天然存在形式未經修飾之核鹼基。
本文所用之術語「雜環鹼基」係指包含雜環之核鹼基。
本文所用之術語「核苷酸」或「核苷酸亞單元」係指具有共價連接至糖之磷酸酯基的核苷。核苷酸可經各種取代基中之任一者修飾。
本文所用之「核苷間鍵聯」係指毗鄰核苷之間的共價鍵聯。
本文所用之「天然核苷酸間鍵聯」係指3'至5'磷酸二酯鍵聯。
本文所用之術語「經修飾核苷間鍵聯」係指在核苷或核苷酸之間之除天然存在核苷間鍵聯以外的任一鍵聯。
術語「寡聚化合物」意欲包括術語寡核苷酸及寡核苷(單獨或組合使用)以及包括所形成之嵌合化合物之其他寡聚化合物。
在本發明之上下文中，術語「寡核苷酸」係指核糖核酸(RNA)或去氧核糖核酸(DNA)之寡聚物或聚合物或其模擬物。術語「寡核苷酸」亦包括天然及/或經修飾單體或鍵 聯之直鏈或環狀寡聚物，包含去氧核糖核苷、核糖核苷、其經取代及α-變旋異構形式、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、硫代磷酸酯、膦酸甲酯及諸如此類。寡核苷酸能夠藉助單體與單體相互作用之規則模式特異性結合至靶多核苷酸，例如Watson-Crick型鹼基配對、Hoögsteen型鹼基配對或反向Hoögsteen型鹼基配對、或諸如此類。
在本發明之上下文中，「嵌合」化合物係寡核苷酸，其含有兩個或更多個化學區域，例如DNA區域、RNA區域、經修飾核苷酸區域等。在寡核苷酸之情形下，每一化學區域係由至少一個亞單元(亦即，核苷酸)構成。該等寡核苷酸通常包含至少一個對寡核苷酸進行修飾以展示一或多種期望性質之區域。寡核苷酸之期望性質包括但不限於(例如)增加對於核酸酶降解之抗性、增加細胞攝取、降低毒性效應及/或增加對於靶核酸之結合親和力。寡核苷酸之不同區域可由此具有不同性質。本發明之嵌合寡核苷酸可形成為兩種或更多種上述寡核苷酸、經修飾寡核苷酸、寡核苷及/或寡核苷酸類似物之混合結構。
本文所用之術語「antagoNAT」係指包含兩種或更多種核苷結構且能夠雜交至核酸分子區域之聚合結構。在一些實施例中，antagoNAT係與特定天然反義分子互補之經化學改造的寡核苷酸，其中該等寡核苷酸包含糖未經修飾之核苷亞單元及糖經修飾之核苷亞單元。在其他實施例中，該antagoNAT在3'末端包括至少一個糖經修飾之核苷亞單元且在5'末端包括至少一個糖經修飾之核苷亞單元。在一 些實施例中，該antagoNAT在5'核苷亞單元與3'核苷亞單元之間進一步包含內部糖經修飾之核苷亞單元及內部糖未經修飾之核苷亞單元，其中連續的內部核糖核苷不超過三個且至少一個內部核苷係經修飾的。在一些實施例中，該antagoNAT在5'核苷亞單元與3'核苷亞單元之間額外包括內部糖經修飾之核苷亞單元及內部糖未經修飾之核苷亞單元，其中連續的內部核糖核苷不超過三個且在內部糖未經修飾之核苷亞單元之間存在至少一個經修飾內部核苷。在一些實施例中，該antagoNAT與有義鏈之天然反義轉錄物雜交。在某些實施例中，antagoNAT係反義寡核苷酸。在一些實施例中，antagoNAT與靶核酸分子之特異性雜交干擾核酸分子之正常功能。在特定實施例中，某一antagoNAT與靶分子之雜交產物並非核糖核酸酶裂解之受質。寡聚雙鏈化合物可為雜交形成雙鏈化合物之兩條鏈或具有充分自身互補性而能夠雜交且形成完整或部分雙鏈化合物之單鏈。
本文所用之術語「混合主鏈antagoNAT」係指antagoNAT之至少一個核苷間鍵聯不同於antagoNAT之至少另一個核苷酸間鍵聯的antagoNAT。
本文所用之術語「末端區段」係指在經化學修飾寡核苷酸之3'末端及/或5'末端之經修飾糖核苷亞單元的連續序列。
本文所用之術語「反義化合物」或「反義分子」或「反義轉錄物」係指與雜交之靶核酸分子至少部分互補之寡聚 化合物。在某些實施例中，反義化合物調節(增加或降低)靶核酸之表現。反義化合物包括(但不限於)為寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸類似物、寡核苷酸模擬物及該等之嵌合組合的化合物。該等分子包括(例如)反義RNA或DNA分子、干擾RNA(RNAi)、微小RNA、誘餌RNA分子、短干擾RNA(siRNA)、酶RNA、治療性編輯RNA及RNA激動劑與拮抗劑、反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部引導序列(EGS)寡核苷酸、交替剪接體、引物、探針、及與靶核酸之至少一部分雜交之其他寡聚化合物。因此，該等化合物可以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環狀寡聚化合物形式引入。儘管所有的反義化合物均係寡聚化合物，但並非所有的寡聚化合物均係反義化合物。
本文所用之術語「反義寡核苷酸」係指為寡核苷酸之反義化合物。
本文所用之術語「天然反義轉錄物」係指與其他RNA轉錄物及/或其他內源有義轉錄物至少部分互補之在細胞內編碼的寡聚化合物。在某些實施例中，天然反義轉錄物不編碼蛋白質。在某些實施例中，天然反義轉錄物含有早期在轉錄物中阻止顯著蛋白質編碼之終止密碼子。
本文所用之術語「反義活性」係指可歸因於反義化合物與其靶核酸之雜交之任一可檢測及/或可量測活性。該檢測及或量測可為直接的或間接的。例如，在某些實施例中，反義活性係藉由檢測及或量測靶蛋白的量來評估。在某些實施例中，反義活性係藉由檢測及/或量測靶核酸的 量來評估。
本文所用之術語「檢測反義活性」或「量測反義活性」意指對試樣實施測試以檢測或量測反義活性並與對照試樣進行比較。該檢測及/或量測可包括零值。
本文所用之術語「對照試樣」係指尚未與測試化合物接觸之試樣。在某些實施例中，對照試樣係在將寡聚化合物投與動物之前獲得。在某些實施例中，對照試樣係自未投與寡聚化合物之動物獲得。在某些實施例中，使用參考標準物作為對照試樣之替代者。
本文所用之術語「經模擬處理之試樣」係指尚未與測試化合物接觸之試樣。在某些實施例中，經模擬處理之試樣係包含液體媒劑之對照試樣。在某些實施例中，經模擬處理之試樣係包含水性媒劑之對照試樣。在特定實施例中，經模擬處理之試樣係包含鹽水、水或緩衝溶液之對照試樣。
本文所用之術語「基序」係指寡聚化合物中之未經修飾及經修飾核苷酸或鍵聯的模式。
本文所用之術語「靶基因」係指編碼靶標之基因。
本文所用之術語「靶向(targeting或targeted to)」係指反義化合物與特定靶核酸分子或靶核酸分子內之特定核苷酸區域之締合。
本文所用之術語「對...具有特異性之寡核苷酸」或「靶向...之寡核苷酸」係指具有如下序列之寡核苷酸：(i)能夠與靶核酸分子之一部分形成穩定複合物，或(ii)能夠與 RNA轉錄物及/或靶基因之天然反義轉錄物的一部分形成穩定雙鏈體。複合物及雙鏈體之穩定性可藉由理論計算及/或活體外分析進行測定。
本文所用之術語「靶核酸」涵蓋DNA、自該DNA轉錄之RNA(包括mRNA前體及mRNA)、以及源自該RNA、編碼序列、非編碼序列、有義或反義多核苷酸之cDNA。寡聚化合物與其靶核酸之特異性雜交會干擾該核酸之正常功能。與靶核酸特異性雜交之化合物對該靶核酸功能的此調節通常稱為「反義的」。擬干擾之DNA功能包括(例如)複製及轉錄。擬干擾之RNA功能包括所有重要功能，例如，RNA至蛋白質轉譯位點之易位、蛋白質自RNA之轉譯、使RNA產生一或多種mRNA形式之剪接、及RNA可參與或促進之催化活性。對靶核酸功能之該干擾的總體效應係調節編碼產物或寡核苷酸之表現。
本文所用之術語「互補百分比」係指寡聚化合物中與另一寡聚化合物或核酸之對應核鹼基具有核鹼基互補性之核鹼基的數目除以寡聚化合物之總長度(核鹼基之數目)。
本文所用之術語「調節」係指與調節之前之功能或活性程度相比對該功能或活性之擾動。例如，調節包括基因表現之變化，即增加(刺激或誘導)或減小(抑制或降低)。調節亦包括基因表現之上調(刺激或誘導)或下調(抑制或降低)。
本文所用之術語「表現」係指基因之編碼資訊藉以轉化成細胞中存在及操作之結構的所有功能及步驟。該等結構 包括(但不限於)轉錄及轉譯產物。
另外，在本發明之上下文中，「雜交」係指互補核鹼基之間的氫鍵，其可為Watson-Crick、Hoögsteen或反向Hoögsteen氫鍵。
本文所用之「互補」係指兩個核鹼基之間準確配對的能力。例如，腺嘌呤及胸腺嘧啶係經由形成氫鍵配對之互補核鹼基。
本文所用之術語「互補」及「可特異性雜交」係指在第一與第二含有核苷亞單元之核酸類寡聚物之間的準確配對或序列互補性。例如，若第一核酸某一位置上之核鹼基能夠與第二核酸相同位置上之核鹼基氫鍵鍵結，則可認為該第一核酸與該第二核酸在該位置上彼此互補。當每一分子中有足夠數目之對應位置被可彼此氫鍵鍵結之核鹼基佔據時，第一與第二核酸彼此互補。因此，「可特異性雜交」及「互補」係用以指代互補性程度足夠而在本發明化合物與靶核酸分子之間發生穩定且特異性結合的術語。應瞭解，本發明之寡聚化合物無需與擬特異性雜交之其靶核酸序列100%互補。在以下情形下寡聚化合物可特異性雜交：該寡聚化合物與靶反義分子之結合會干擾該靶反義分子之正常功能而導致效用損失，且存在足夠程度之互補性以避免寡聚化合物與非靶序列在期望發生特異性結合之條件下(亦即，在活體內分析或治療性治療情形下之生理條件下，或在活體外分析情形下實施分析之條件下)發生非特異性結合。
本文所用之術語「副效應」係指可歸因於治療之除期望效應以外的生理學反應。在某些實施例中，副效應包括(但不限於)肝臟功能測試異常、注射位點反應、腎功能異常、肝臟毒性、腎毒性、中樞神經系統異常及肌病。
本文所用之術語「SIRT1」係指沉默交配型資訊調節因子(Silencing mating type information regulator)2之同源物且係SIRTuin去乙醯酶蛋白家族之成員。SIRT1之胺基酸序列可參見Genbank登記號NP.sub.--08509。SIRT1係酵母Sir2蛋白質之人類同源物且展示NAD依賴性去乙醯酶活性。
本文所用之術語「ABCA1」係指ATP結合盒轉運蛋白A1(ABCA1)且係膜主體蛋白，該膜主體蛋白自細胞輸出膽固醇並藉由促進脂蛋白元A-I(apoA-I)脂質化而開始形成成熟的HDL。
本文所用之術語「SCN1」係指電壓閘控之鈉通道I型α亞單元。
本文所用之術語「烷基」係指藉由移除一個氫原子衍生自含有一個至二十個碳原子之烴部分的飽和或不飽和的直鏈或具支鏈烴基團。本文所用之烷基可視情況包括一或多個其他取代基。
本文所用之術語「鹵基」及「鹵素」係指選自氟、氯、溴及碘之原子。
本文所用之術語「環烷基」係指藉由移除一個氫原子衍生自含有三個至二十個碳原子之單環狀或雙環飽和碳環化 合物之單價基團。本文所用之環烷基可視情況包括一或多個其他取代基。
烷基或環烷基可視情況經以下中之一或多者取代：氟、氯、溴、碘、羧基、烷氧基羰基、烷基胺基羰基、二-(烷基)-胺基羰基、羥基、烷氧基、甲醯氧基、烷基羰基氧基、烷基硫基、環烷基或苯基。
本文所用之術語「胺基烷基」係指經胺基取代之烷基。此術語意欲包括在任一位置上具有胺基取代基且其中烷基將胺基烷基附接至母體分子之烷基。胺基烷基之烷基及/或胺基部分可進一步經取代基取代。
本文所用之術語「烷氧基」係指在烷基與氧原子之間形成的基團，其中利用氧原子將烷氧基附接至母體分子。本文所用之烷氧基可視情況包括其他取代基。
本文所用之術語「烯基」係指含有至多二十四個碳原子且具有至少一個碳碳雙鍵之直鏈或具支鏈烴鏈基團。本文所用之烯基可視情況包括一或多個其他取代基。
本文所用之術語「芳基」係指具有一或多個芳香族環之單環狀或多環狀碳環系統基團。芳基之實例包括(但不限於)苯基、萘基、四氫萘基、四氫萘基、二氫茚基、茚基(idenyl)及諸如此類。本文所用之芳基可視情況包括其他取代基。
本文所用之術語「醯基」係指藉由自有機酸移除羥基形成之基團且具有通式-C(O)-X，其中X通常為脂肪族、非環狀或芳香族的。醯基可視情況包括其他取代基。
本文所用之術語「取代基(substituent及substituent group)」係指通常添加至其他基團或母體化合物以增強期望性質或得到期望效應之基團。取代基可經保護或未經保護且可添加至母體化合物中之一個可及位點。取代基亦可進一步經其他取代基取代且可直接或經由諸如烷基等連接基團附接至母體化合物。
使用2'-OH及2'-H作為未經修飾糖之縮寫，即呋喃戊核糖基(pentoribofuranosyl)及呋喃戊去氧核糖基(pentodeoxyribofuranosyl)糖。對於經修飾核苷，所用縮寫係：2'-O-烷基表示在呋喃戊糖基結構之2'位上具有一般烷基。(例如，具有特定烷基標注為2'-OMe，對於甲基)。
本文所用之術語「雙環核苷」係指核苷之呋喃糖部分包括連結呋喃糖環上之兩個原子的橋由此形成雙環環系統的核苷。
本文所用之術語「LNA」或「鎖核酸」係指核糖基糖環之2'羥基連接至糖環之4'碳由此形成雙環核苷的核苷。
本文所用之術語「在2'位上經結合至C4'碳之O-亞甲基取代」係指連結呋喃糖環之兩個原子的橋橋連呋喃糖環之4'碳原子與2'碳原子由此形成雙環環系統的雙環核苷。
術語「醫藥上可接受之鹽」係指在正確醫學判斷範疇內適用於接觸人類及低等動物組織而不會產生過度毒性、刺激、過敏反應及諸如此類且與合理效益/風險比相稱之鹽。例如，S.M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences,66：1-19(1977)中詳細闡述醫藥上可接受之鹽，該文獻出 於此目的以引用方式併入本文中。該等鹽係在本文所述化合物之最終分離及純化期間原位製備，或藉由使游離鹼官能基與適宜有機酸反應來單獨製備。醫藥上可接受之無毒性酸加成鹽的實例係與無機酸(例如，鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸及高氯酸)或與有機酸(例如，乙酸、草酸、馬來酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸或丙二酸)或藉由使用其他文獻記載方法(例如，離子交換)形成之胺基鹽。其他醫藥上可接受之鹽包括己二酸鹽、藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、月桂基硫酸鹽、乙磺酸鹽、甲酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、葡萄糖酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽及諸如此類。代表性鹼金屬或鹼土金屬鹽包括鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽及諸如此類。若合適，其他醫藥上可接受之鹽包括無毒性銨、四級銨及胺陽離子，其係使用諸如鹵離子、氫氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低碳烷基磺酸根及芳基磺酸根等抗衡離子來形成。
本文所用之術語「帽結構」或「末端帽結構」係指在反義化合物之任一末端納入之化學修飾。
本文所用之術語「類似物」涉及核苷酸時包括具有經修飾鹼基部分及/或經修飾糖部分之合成核苷酸(參見(例如)由以下所概述：Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York,1980；Freier & Altmann,(1997)Nucl.Acid.Res.,25(22),4429-4443；Toulmé,J.J.,(2001)Nature Biotechnology 19：17-18；Manoharan M.,(1999)Biochemica et Biophysica Acta 1489：117-139；Freier S.M.,(1997)Nucleic Acid Research,25：4429-4443；Uhlman,E.,(2000)Drug Discovery & Development,3：203-213；Herdewin P.,(2000)Antisense & Nucleic Acid Drug Dev.,10：297-310)；2'-O、3'-C連接之[3.2.0]二環阿糖核苷(參見(例如)N.K Christiensen等人，(1998)J.Am.Chem.Soc.,120：5458-5463；Prakash TP,Bhat B.(2007)Curr Top Med Chem.7(7)：641-9；Eun Jeong Cho,Joo-Woon Lee,Andrew D.Ellington Applications of Aptamers as Sensors Annual Review of Analytical Chemistry，2009年7月，第2卷，第241-264頁)。該等類似物包括經設計以增強結合性質(例如，雙鏈體或三鏈體穩定性、特異性或諸如此類)之合成核苷酸。
本文所用之術語「哺乳動物」涵蓋通常處於醫學護理下之溫血哺乳動物(例如，人類及家養動物)。實例包括貓、犬、馬、牛及人類、以及僅指人類。
概述
在某些實施例中，化學修飾提高反義化合物之效能及/或功效、減少毒理學效應、降低發生副效應之可能性。在某些實施例中，包含某些化學修飾之antagoNAT比包含不同修飾之其他寡聚化合物具有較小毒性。化學修飾可藉由(例如)以下來改變寡核苷酸活性：增加反義寡核苷酸對其靶核酸分子之親和力、增加對核酸酶之抗性、改變寡核苷酸之藥物代謝動力學及/或減少毒理學效應。
識別天然反義轉錄物
本發明之一些實施例闡述靶向天然反義轉錄物之antagoNAT。在一些實施例中，實施已知基因數據庫(例如Genebank)掃描以識別任一可能之天然存在反義轉錄物。某些掃描過程在某一基因之基因間區域內獲得非編碼RNA轉錄物。在一些實施例中，利用序列識別及隨後篩選來識別抑制某一基因之表現的單鏈反義寡核苷酸。
某些AntagoNAT
在某些實施例中，本文所述組合物之antagoNAT係與天然反義轉錄物雜交之寡核苷酸。某些寡核苷酸包含經修飾核苷、未經修飾核苷及經修飾核苷間鍵聯。
根據本發明之一些實施例，本文所述化合物包括一或多個不對稱中心，且此產生對映異構體、非對映異構體及其他立體異構構型。本發明包括所有對映異構體及非對映異構體以及其按任何比例之混合物。本發明亦擴展至分離的對映異構體或對映異構體對。分離對映異構體與非對映異 構體之方法已為熟習此項技術者所熟知。
本發明之一些實施例闡述包含醫藥上可接受之稀釋劑或載劑及antagoNAT之組合物，其中該antagoNAT之長度為10個至50個核苷亞單元。在一些實施例中，該antagoNAT之長度為10個至45個核苷亞單元、或長度為10個至40個核苷亞單元、或長度為10個至35個核苷亞單元、或長度為15個至30個核苷亞單元。在其他實施例中，該antagoNAT之長度為18個至30個核苷亞單元。在其他實施例中，該antagoNAT之長度為20個至30個核苷亞單元。在其他實施例中，該antagoNAT之長度為25個至30個核苷亞單元。在其他實施例中，該antagoNAT之長度為10個至20個核苷亞單元。
在其他實施例中，該antagoNAT在3'末端包含至少一個糖經修飾之核苷亞單元且在5'末端包含至少一個糖經修飾之核苷亞單元。在一些實施例中，該antagoNAT在5'核苷亞單元與3'核苷亞單元之間進一步包含內部糖經修飾之核苷亞單元及內部糖未經修飾之核苷亞單元，其中連續的內部核糖核苷不超過三個且至少一個內部核苷係經修飾的。在其他或另外的實施例中，該antagoNAT在5'核苷亞單元與3'核苷亞單元之間包含內部糖經修飾之核苷亞單元及內部糖未經修飾之核苷亞單元，其中連續的內部核糖核苷不超過三個且在內部糖未經修飾之核苷亞單元之間存在至少一個經修飾內部核苷。在一些實施例中，該antagoNAT在3'末端包含未經修飾糖核苷亞單元或在5'末端包含未經修 飾糖核苷亞單元。在其他實施例中，該antagoNAT在3'末端包含未經修飾糖核苷亞單元且在5'末端包含未經修飾糖核苷亞單元。在其他實施例中，該antagoNAT在3'末端包含經修飾糖核苷亞單元且在5'末端包含未經修飾糖核苷亞單元。在其他實施例中，該antagoNAT在3'末端包含未經修飾糖核苷亞單元且在5'末端包含經修飾糖核苷亞單元。
在組合物之某些實施例中，存在不超過五個包含2'-去氧核糖之連續內部未經修飾核苷，其中(a)3'末端區段包含雙環2'-經修飾糖核苷且5'末端區段包含非雙環2'-經修飾糖核苷；或(b)3'末端區段包含非雙環2'-經修飾糖核苷且5'末端區段包含雙環2'-經修飾糖核苷。
在一些實施例中，該組合物包含糖經修飾及糖未經修飾之核苷亞單元，其中糖經修飾及糖未經修飾之核苷亞單元各自包含嘧啶鹼基或嘌呤鹼基。在其他實施例中，內部糖經修飾之核苷亞單元各自包含嘧啶鹼基或嘌呤鹼基。在其他或另外的實施例中，內部糖經修飾之核苷亞單元各自包含嘧啶鹼基。天然或未經修飾之鹼基或雜環鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)、以及嘧啶核鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。熟習此項技術者習知之許多經修飾核鹼基或核鹼基模擬物適合於本文所述化合物。另外，視情況包括經修飾核鹼基或雜環鹼基，例如7-脫氮嘌呤、5-甲基胞嘧啶、2-胺基腺嘌呤、5-溴尿嘧啶或次黃嘌呤。在特定實施例中，內部糖經修飾之核苷亞單元各自獨立地包含選自尿嘧啶、胸腺嘧啶或胞嘧啶之嘧啶鹼基。
任一本文所述組合物包含在2'位上經烷氧基、烷基、鹵素、胺基、巰基、烷基胺、烷基巰基、烷基酯、結合至C4'碳之O-伸烷基或其組合取代之糖經修飾之核苷亞單元。熟習此項技術者習知之許多經修飾糖核苷適合於本文所述化合物。在一些實施例中，糖經修飾之核苷亞單元各自在2'位上經烷氧基、鹵素或結合至C4'碳之O-伸烷基取代。2'位上之適宜取代基包括但不限於甲氧基、氟、O-甲氧基乙基、結合至C4'碳之O-亞甲基(2'-OCH2-4')、或結合至C4'碳之O-伸乙基(2'-OCH2CH2-4')。在其他實施例中，經修飾糖亞單元在2'位上包含以下中之一者：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O烷基-O-烷基，其中烷基、烯基及炔基可為經取代或未經取代之C1至C10烷基或C2至C10烯基及炔基。尤佳者係-O(CH2)nOCH3、-O[(CH2)nO]mCH3、-O(CH2)nNH2、-O(CH2)nCH3、-O(CH2)nONH2及-O([(CH2)nON(CH2)nCH3)2，其中n及m可為1至約10。其他寡核苷酸在2'位上包含以下中之一者：C1至C10低碳烷基、經取代低碳烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、經取代甲矽烷基、報告基團、嵌入劑、改良寡核苷酸之藥物動力學性質之基團、或改良寡核苷酸之藥效學性質之基團、及其他具有類似性質之取代基。亦可在寡核苷酸上之其他位置進行類似修飾，尤其係3'末端核苷酸上或2'-5'連 接寡核苷酸中糖之3'位及5'末端核苷酸之5'位。寡核苷酸亦可具有糖模擬物，例如使用環丁基部分來代替呋喃戊糖基糖。教示該等經修飾糖結構之製備之代表性美國專利包含(但不限於)美國專利第4,981,957號、第5,118,800號、第5,319,080號、第5,359,044號、第5,393,878號、第5,446,137號、第5,466,786號、第5,514,785號、第5,519,134號、第5,567,811號、第5,576,427號、第5,591,722號、第5,597,909號、第5,610,300號、第5,627,053號、第5,639,873號、第5,646,265號、第5,658,873號、第5,670,633號及第5,700,920號，每一者皆以引用方式併入本文中。
任一本文所述組合物包含未經修飾之核苷亞單元，其中核苷之糖係核糖或2'-去氧核糖。在某些實施例中，未經修飾之核苷亞單元包含核糖。在其他實施例中，未經修飾之核苷亞單元包含2'-去氧核糖。在特定實施例中，未經修飾之核苷亞單元包含核糖及2'-去氧核糖。
任一本文所述組合物包含磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸烷基酯、磷醯胺酸酯、硼烷磷酸酯、碳酸酯、胺基甲酸酯、乙醯胺酸酯、硫醚、硫代甲縮醛核苷酸間鍵聯或其組合之主鏈。在其他實施例中，該antagoNAT包含磷酸二酯及硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯之主鏈。在特定實施例中，該antagoNAT包含硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯之主鏈。
本發明之一些實施例闡述式(I)之antagoNAT或其鹽： C-Au-[Bv-A'w]x-By-A"z-C式(I)其中：各A、A'及A"獨立地具有以下結構： 各B獨立地具有以下結構： 各C獨立地為羥基、磷酸酯基、經取代或未經取代之烷氧基、或任一適宜5'或3'末端帽；各u、v、w、x、y及z獨立地為大於或等於1之整數；各D係雜環鹼基；各E獨立地選自由下列組成之群：經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烷氧基、經取代或未經取代之胺、鹵素、經取代或未經取代之胺基烷氧基、經取代或未經取代之烯基、或巰基；各G獨立地為-OP(O)2O-、-OP(O)(OR)O-、-OP(O)(S)O-、-OP(O)(SR)O-、-OP(S)2O-、-OP(R)(O)O-、-OP(NR2)(O)O-、-OC(O)O-、-OCH2C(O)NHCH2-、-OCH2S-、-CH2SCH2-、-OP(O)(BH3)O-、-NP(O)2O-、-OP(R)(O)O-，或當(Ia)連結至C時不存在； 各R獨立地為氫或經取代或未經取代之烷基；各J係氫，或J與E一起形成視情況包括選自N或O之額外雜原子之環結構；且各K獨立地為羥基或氫。
在一些實施例中，任一本文所述antagoNAT包含獨立地選自嘌呤或嘧啶鹼基之雜環鹼基。在其他實施例中，各雜環鹼基獨立地選自腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、7-脫氮嘌呤、2-胺基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶或次黃嘌呤。在某些特定實施例中，各雜環鹼基獨立地選自腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶或胞嘧啶。在其他特定實施例中，各A'之雜環鹼基獨立地選自尿嘧啶、胸腺嘧啶或胞嘧啶。
在一些實施例中，闡述antagoNAT，其中各A、A'或A"獨立地具有以下結構： 在本發明之一些較佳化合物中，各E獨立地為甲氧基、乙氧基、O-甲基乙基或氟。在特定實施例中，各E係甲氧基。在某些特定實施例中，各E係O-甲基乙基。
在本發明之一些較佳antagoNAT中，各G獨立地為-OP(O)2O-、-OP(O)(OR)O-或-OP(O)(S)O-。在特定實施例中，各G係-OP(O)(S)O-。在其他實施例中，G係-OP(O)2O-與-OP(O)(S)O-之組合。
在本發明之一些較佳antagoNAT中，各C係羥基或適宜末端帽結構。
在本發明之某些較佳antagoNAT中，當K係羥基時，v及y獨立地為1、2或3之整數，且x至少為1。在其他實施例中，當K係氫時，v及y獨立地為1、2、3、4或5之整數，且(a)其中至少一個A具有(Id)或(Ie)之結構且至少一個A"具有(Ic)之結構；或(b)其中至少一個A具有(Ic)之結構且至少一個A"具有(Id)或(Ie)之結構。
互補性
業內應瞭解，納入核苷酸親和修飾可容許與未經修飾化合物相比較大數量之失配。同樣，antagoNAT序列與其他寡核苷酸序列相比可對失配更耐受。在一些實施例中，antagoNAT與基因之天然反義轉錄物雜交。
任一本文所述antagoNAT或化合物與預選天然反義轉錄物至少約50%互補。在某些實施例中，本發明之antagoNAT與其所靶向靶核酸序列內之靶區域具有至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的序列互補性。例如，化合物之20個核苷酸中有18個與靶區域互補且由此將特異性雜交之antagoNAT將代表90%的互補性。在本實例中，剩餘非互補核苷酸可與互補核苷酸群集或分散開且無需彼此鄰近或與互補核苷 酸鄰近。因此，長度為18個核苷酸且具有四個非互補核苷酸(側面側接兩個與靶核酸分子完全互補之區域)之antagoNAT與靶核酸分子將具有77.8%之總體互補性且由此屬於本發明範疇內。antagoNAT與靶核酸分子區域之互補性百分比通常可使用業內已知之BLAST程式(鹼基局部對準檢索工具)及PowerBLAST程式來測定(Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.,215,403-410；Zhang及Madden，(1997)Genome Res.,7,649-656)。同源性、序列一致性或互補性百分比可藉由(例如)Gap程式(Wisconsin序列分析程式包，Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,Madison Wis.)，使用默認設置(其使用Smith及Waterman算法)來測定(Ady.Appl.Math.,(1981)2,482-489)。
藉由使用自動對準核酸序列並指示一致性或同源性區域之電腦程式來促進適當靶核酸分子之選擇。使用該等程式藉由(例如)搜索諸如GenBank等數據庫或藉由對PCR產物測序來比較所獲得的核酸序列。對來自各種物種之核酸序列進行比較使得能夠選擇顯示適當之物種間一致性程度的核酸序列。在尚未測序基因之情形下，實施南方墨點法(Southern blot)以測定靶物種與其他物種之基因間的一致性程度。藉由在不同嚴格程度下實施南方墨點法(如業內所熟知)，可大致量測一致性。該等程序使得能夠選擇如下靶核酸分子：對欲控制個體中之靶核酸序列展示高程度互補性且對其他物種中之對應核酸序列展示較低程度互補 性。熟習此項技術者應認識到，可在較大範圍中選擇適用於本發明之基因區域。
方法
在本發明之某些實施例中，本發明提供調節細胞中基因表現之方法。在一些實施例中，該方法包括使細胞與antagoNAT接觸，其中該antagoNAT之長度為10個至30個核苷亞單元。在一些實施例中，該antagoNAT與基因之天然反義轉錄物特異性雜交。在其他實施例中，該antagoNAT在3'末端包括至少一個糖經修飾之核苷亞單元且在5'末端包括至少一個糖經修飾之核苷亞單元。在一些實施例中，該antagoNAT在5'核苷亞單元與3'核苷亞單元之間進一步包含內部糖經修飾之核苷亞單元及內部糖未經修飾之核苷亞單元，其中連續的內部核糖核苷不超過三個且至少一個內部核苷係經修飾的。在一些實施例中，該antagoNAT在5'核苷亞單元與3'核苷亞單元之間額外包括內部糖經修飾之核苷亞單元及內部糖未經修飾之核苷亞單元，其中連續的內部核糖核苷不超過三個且在內部糖未經修飾之核苷亞單元之間存在至少一個經修飾內部核苷。
在一些實施例中，本文所述之任一調節基因表現之方法進一步包含形成包含antagoNAT及天然反義轉錄物之雜合體，其中該雜合體並非核糖核酸酶裂解之受質。在某些實施例中，該方法包含空間上阻斷天然反義轉錄物之正常功能，由此調節基因功能。在某些實施例中，本發明之antagoNAT與天然反義轉錄物具有至少約50%、至少約 55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的序列互補性。在其他實施例中，相對於對照細胞，細胞中之基因表現上調。在某些實施例中，相對於對照細胞，細胞中之基因表現下調。
在一些實施例中，根據本文所述方法與antagoNAT接觸之細胞類型係哺乳動物細胞。
此外，根據本發明之某些實施例，提供調節細胞中多核苷酸之功能的方法，其包含使細胞與antagoNAT接觸。在一些實施例中，該antagoNAT之長度為10個至30個核苷亞單元。在其他實施例中，該antagoNAT與多核苷酸雜交。在特定實施例中，該antagoNAT在3'末端包含至少一個糖經修飾之核苷亞單元且在5'末端包含至少一個糖經修飾之核苷亞單元。在其他或另外的實施例中，該antagoNAT在5'核苷亞單元與3'核苷亞單元之間包含內部糖經修飾之核苷亞單元及內部糖未經修飾之核苷亞單元，其中連續的包含核糖之內部核苷不超過三個且在內部糖未經修飾之核苷亞單元之間存在至少一個經修飾內部核苷。
在一些實施例中，根據本文所述方法靶向之多核苷酸係有義鏈之天然反義鏈。在某些實施例中，本發明之antagoNAT與多核苷酸具有至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約 80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的序列互補性。
在一些實施例中，本文所述之任一調節多核苷酸功能之方法進一步包含形成包含antagoNAT及多核苷酸之雜合體，由此調節該多核苷酸之該功能。在某些實施例中，所得雜合體並非核糖核酸酶裂解之受質。在一些實施例中，該方法包含空間上阻斷多核苷酸之正常功能。在某些實施例中，相對於對照，細胞中有義鏈之表現提高。在其他實施例中，相對於對照，細胞中有義鏈之表現降低。
在一些實施例中，根據本文所述方法與antagoNAT接觸之細胞類型係哺乳動物細胞。
已在(例如)美國專利申請公開案第2009/0258925號，「Natural Antisense and Non-coding RNA Transcripts as Drug Targets」中闡述藉由靶向天然反義轉錄物來調節基因表現，該案件之全文以引用方式併入本文中。此公開案報導靶向天然反義轉錄物來上調及下調有義轉錄物，其可為編碼或非編碼。天然反義靶向亦闡述於(例如)：美國專利申請公開案第2010/0105760號，「Treatment of Apolipoprotein-A1 Related Diseases by Inhibition of Natural Antisense Transcript to Apolipoprotein-A1」；WO 2010/065671，「Treatment of Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)Related Diseases by Inhibition of Natural Antisense Transcript to VEGF」；WO 2010/065662，「Treatment of Sirtuin 1(SIRT1)Related Disease by Inhibition of Natural Antisense Transcript to Sirtuin 1」；WO 2010/102058，「Treatment of Sirtuin 1(SIRT1)Related Disease by Inhibition of Natural Antisense Transcript to Sirtuin 1」；WO 2010/065792，「Treatment of Erythropoietin(EPO)Related Diseases by Inhibition of Natural Antisense Transcript to EPO」；WO 2010/065787，「Treatment of Tumor Suppressor Gene Related Diseases by Inhibition of Natural Antisense Transcript to the Gene」；WO 2010/093904，「Treatment of Brain Derived Neurotrophic Factor(BDNF)Related Diseases by Inhibition of Natural Antisense Transcript to BDNF」；及WO 2010/093906 GDNF，「Treatment of Glial Cell Derived Neurotrophic Factor(GDNF)Related Diseases by Inhibition of Natural Antisense Transcript to GDNF」，所有該等案件均以引用方式併入本文中。
儘管上文已闡述本發明之多個實施例，然而，應瞭解，該等實施例僅係以實例方式提供而不具有限制意義。可根據本文之揭示內容對所揭示實施例作出諸多改變，此並不背離本發明之精神或範疇。因此，本發明之廣度及範疇不應受上述實施例中之任一者限制。
本文所提及之所有文件皆以引用方式併入本文中。出於所有目的，本申請案中引用之所有出版物及專利文件皆係 以相同程度以引用方式併入本文中，如同將每一個別出版物或專利文件個別地指明以引用方式併入一般。對於本文件中引用之各個參考文獻，申請者不承認任一特定參考文獻係其發明之「先前技術」。本發明組合物及方法之實施例闡釋於下列實例中。
實例
以下非限制性實例用於闡釋本發明之所選實施例。應瞭解，所示組份之要素之比例變化及替代物已為熟習此項技術者所明瞭且在本發明實施例之範疇內。
概要
實例中所列示之序列已加注釋以指出核苷及核苷間鍵聯修飾之位置及類型。實例中未加注釋之所有核苷皆為β-D-去氧核糖核苷。各經修飾核苷之前有字母或符號。特定言之，「m」表示2'-O-甲基且「+」表示LNA或雙環核苷。符號「＊」表示硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
材料
RAW264.7巨噬細胞係自ATCC購得，並在補加有10% FBS及5%青黴素/鏈黴素之鷹氏最低必需培養基(Eagle Minimum Essential Medium)中培養。原代星狀細胞係自Sciencell研究實驗室購得，並在補加有5% FBS及2%星狀細胞生長培養基之Sciencell星狀細胞培養基中培養。使HepG2細胞在EMEM(ATCC登記號為2003)+10% FBS中生長。使來自ATCC之NIH 3T3細胞在DMEM(Mediatech登記號為10-013-CV)+10% FCS(Mediatech登記號為35-022-CV) 中生長。使518A2細胞在DMEM+5% FBS中生長。
由IDT公司(Coralville,IA)以小規模製造用於篩選之antagoNAT批料。除非另外說明，否則將寡核苷酸以20 nM之最終濃度逐滴施加至接種於6孔板中OptiMEM+Lipofectamine混合物中之細胞。培育約18 h後，更換培養基並再持續培育18-24 h，然後收穫細胞用於RNA分離。
實例1：用於寡核苷酸/寡核苷合成之醯亞胺(Amidite)
2'-O-甲基核苷醯亞胺及2'-OH核苷醯亞胺係自Glen Research,Sterling,VA購得。其他2'-O-烷基經取代核苷醯亞胺係如美國專利第5,506,351號、第5,466,786號或第5,514,786號中所述來製備，該等專利以引用方式併入本文中。
實例2：2'-O-甲基核苷醯亞胺之合成 i. 2'-O-甲基-5-甲基尿苷
將2,2'-脫水-5-甲基尿苷(10.0 g,0.0416 mol)溶解於存於不銹鋼高壓罐(容積為100 mL)中之甲醇(80 mL)中。藉由向甲醇中添加硼烷溶液(1 M，存於THF中)並使所產生的氫氣逸出來產生硼酸三甲酯。添加硼酸三甲酯(5.6 mL,0.049 mol)。將高壓罐密封並置於150℃下之油浴中，此會產生壓力。40 h後，將高壓罐在冰中冷卻，打開並在減壓下濃縮內容物。
ii. 5'-O-二甲氧基三苯基甲基-2'-O-甲基-5-甲基尿苷
將2'-O-甲基-5-甲基尿苷(12 g)在吡啶(2×50 mL)中共蒸發，並溶解於無水吡啶(50 mL)中。添加二甲氧基三苯基 甲基氯(18.1 g,0.054 mol)。蓋上燒瓶蓋並使其在室溫下靜置45 min。用甲醇(10 mL)處理反應混合物，並在減壓下濃縮所得溶液。將殘留物分配於乙酸乙酯(2×400 mL)與飽和碳酸氫鈉溶液(500 mL)之間。將有機層合併，乾燥(硫酸鈉)，過濾並濃縮。
實例3：寡核苷酸之合成
未經取代及經取代之磷酸二酯寡核糖核苷酸係在自動化DNA合成儀中利用標準磷醯亞胺化學利用碘氧化來合成。
按照磷酸二酯寡核苷酸來合成硫代磷酸酯寡核苷酸，只是標準氧化試劑由0.2 M之3H-1,2-苯并二硫雜環戊烯-3-酮-1,1，-二氧化物存於乙腈中之溶液替換以用於亞磷酸酯鍵聯之逐步硫雜化。硫雜化等待步驟延長至68秒，且隨後為加帽步驟。自管柱裂解並在55℃下於濃氫氧化銨中解阻斷(18 h)後，藉由用2.5體積之乙醇自0.5 M NaCl溶液沉澱兩次來純化寡核苷酸。在20%丙烯醯胺、8 M尿素、454 mM Tris-硼酸鹽緩衝液(pH 7)中實施分析型凝膠電泳。
實例4：嵌合硫代磷酸酯寡核苷酸
使用自動化DNA合成儀來合成具有2'-O-烷基硫代磷酸酯及2'-H硫代磷酸酯寡核苷酸區段之嵌合寡核糖核苷酸。使用自動化合成儀及5'-二甲氧基三苯甲基-3'-O-磷醯亞胺(對於未經修飾亞單元)及5'-二甲氧基三苯甲基-2'-O-甲基-3'-O-磷醯亞胺(對於3'末端及5'末端以及內部經修飾亞單元)來合成寡核苷酸。藉由在遞送四唑及鹼基後延長等待步驟來改進標準合成循環。環外胺之保護基團對於腺嘌呤及鳥 嘌呤係苯氧基乙醯基，對於胞嘧啶、2'-O-甲基腺嘌呤及2'-O-甲基胞嘧啶係苯甲醯基，且對於2'-O-甲基鳥嘌呤係異丁醯基。自載體裂解經完全保護之寡核苷酸，並在3：1氨/乙醇中在室溫下過夜脫去磷酸酯基之保護基團，隨後凍乾至乾燥。在室溫下添加甲醇氨，獲得去保護之鹼基。將所得物凍乾至乾燥並在尺寸排除管柱中脫鹽。
使用自動化DNA合成儀來合成具有2'-O-烷基硫代磷酸酯及2'-OH硫代磷酸酯寡核苷酸區段之嵌合寡核糖核苷酸。使用自動化合成儀及5'-二甲氧基三苯甲基-2'-第三丁基二甲基甲矽烷基-3'-O-磷醯亞胺(對於未經修飾亞單元)及5'-二甲氧基三苯甲基-2'-O-甲基-3'-O-磷醯亞胺(對於3'末端及5'末端以及內部經修飾亞單元)來合成寡核苷酸。對標準合成循環進行改進。環外胺之保護基團對於腺嘌呤及鳥嘌呤係苯氧基乙醯基，對於胞嘧啶、2'-O-甲基腺嘌呤及2'-O-甲基胞嘧啶係苯甲醯基，且對於2'-O-甲基鳥嘌呤係異丁醯基。自載體裂解經完全保護之寡核苷酸，並在3：1氨/乙醇中在室溫下過夜脫去磷酸酯基之保護基團，隨後凍乾至乾燥。在室溫下添加甲醇氨，獲得去保護之鹼基。在室溫下用1 M存於THF中之TBAF處理24小時以脫去2'-OH基團之保護基團。將所得物凍乾至乾燥並在尺寸排除管柱中脫鹽。
實例5：識別ABCA1之天然反義轉錄物
為識別任一可能之天然存在ABCA1反義轉錄物，對已知基因數據庫(例如UCSC基因組瀏覽器及Genebank)實施掃描。此在ABCA1基因之基因間區域內獲得長度為約1 Kb之 非編碼RNA轉錄物，顯示其係以相反的5'至3'方向轉錄得到(BF133827)。基於此及隨後的序列，顯示三種單鏈反義寡核苷酸在抑制此轉錄物表現方面尤其有效。含有該等反義寡核苷酸所靶向之特定區域之BF133827序列呈現於圖1中。
實例6：靶向ABCA1反義轉錄物之反義寡核苷酸之活體外篩選
使用RAW264.7小鼠白血病巨噬細胞系來檢測反義寡核苷酸對ABCA1表現之影響。圖2繪示在用每一反義寡核苷酸(50 nM)轉染後48小時所觀察到的ABCA1 mRNA相對表現程度。對於所測試之三種活性反義寡核苷酸序列，定量RT-PCR分析揭示，與用對照寡核苷酸(CUR586)處理相比，在用CUR1090及CUR1091轉染之細胞中ABCA1 mRNA表現有相當大增加，其中用CUR1090時觀察到最顯著效應(p=0.0004；單因子ANOVA；n=4)。隨後實施西方墨點法(western blot)分析以檢測mRNA表現之此上調是否轉化成該等細胞內ABCA1蛋白質含量之對應增加。在用每一反義寡核苷酸轉染後48小時後，利用SDS-PAGE分離總細胞蛋白質並用市售ABCA1多株抗體進行探測。此分析顯示預期分子量為220 kDa之帶(圖3a)。光密度測定分析證實，與用CUR586處理相比，在用CUR1090處理之細胞中ABCA1之表現增加三倍(p=0.0024；單因子ANOVA；n=3)(圖3b)。
ABCA1 mRNA表現之實時PCR分析
使用Qiagen RNeasy管柱自細胞及組織試樣提取總 RNA。cDNA係使用Taqman逆轉錄套組(Applied Biosystems)自800 ng經脫氧核糖核酸酶處理之RNA來製備。利用針對小鼠ABCA1之Taqman基因表現分析(Applied Biosystems,CA,USA)來擴增來自各試樣之cDNA。ABCA1與參考基因(18s RNA)之Ct值間之相對差值計算為△△Ct。所有實時PCR均係使用7900HT快速實時PCR系統(Applied Biosystems,CA,USA)來實施。
十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳及免疫墨點法
全細胞及組織蛋白質係使用M-PER蛋白質提取試劑(Thermo Scientific)來提取，且使用BCA蛋白質分析套組(Pierce)來測定各試樣之總蛋白質濃度。在聚丙烯醯胺標準凝膠(polyacrylamide Criterion gel)上分離相同濃度之蛋白質試樣，並藉由電泳轉移至PVDF膜上。將PVDF膜使用稀釋於1x Tris緩衝鹽水(含有2 mM Tris、500 nM氯化鈉，pH 7.5)中之5%奶在室溫下阻斷1 h，並在4℃下與以1：1000稀釋於阻斷緩衝液中之多株兔抗ABCA1一級抗體(Novus)一起培育過夜。次日，將PVDF膜與以1：2000稀釋於阻斷緩衝液中之連接辣根過氧化物酶之抗兔二級抗體(Cell Signalling)一起在室溫下培育1 h，用TBS-T緩衝液洗滌。使用化學發光過氧化物酶受質來顯現蛋白譜帶並暴露於X射線膠片。掃描X射線膠片並實施電泳譜帶之定量光密度測定。亦用一級小鼠抗肌動蛋白抗體來探測PVDF膜。藉由將ABCA1光密度測定值除以肌動蛋白負載對照所獲得之值來確定ABCA1蛋白質表現。
實例7：巨噬細胞ABCA1蛋白質之免疫組織化學分析
為進一步描述ABCA1表現之增加，利用免疫組織化學來分析ABCA1之細胞分佈。在轉染後48小時固定經寡核苷酸處理之RAW264.7細胞，並與一級ABCA1多株抗體、隨後結合Alexa Fluor 488之二級抗體一起培育過夜。圖4顯示在經各序列處理之細胞中ABCA1之相對表現程度。可以看出，與對照相比，在用CUR1090轉染之細胞中檢測到螢光活性顯著增強。此外，與其重要的細胞功能一致，大部分此ABCA1表現在巨噬細胞膜附近或沿著巨噬細胞膜顯現。
RAW264.7細胞中ABCA1之免疫染色
在轉染後48小時，將細胞在含有聚甲醛(4%)之培養物中固定20分鐘，隨後在PBS中洗滌2-3次。隨後將細胞在-20℃下用乙醇(95)：乙酸(5)實施20分鐘的可滲透化處理，隨後在PBS(5% FBS)中洗滌2-3次。添加以1：1000稀釋於PBS(5% FBS)中之多株兔抗ABCA1一級抗體(Novus)，並將試樣在4℃下保持過夜。次日，將細胞試樣用PBS(5% FBS)阻斷20分鐘，隨後在室溫下與結合Alexa Fluor 488之二級抗體一起培育40分鐘。用PBS洗滌2-3次後，使用含有抗衰減劑之水性封固介質來封固蓋玻片。使用稀釋於PBS(5% FBS)中之Hoechst藍來實施核染色。藉由共焦顯微鏡檢查來分析螢光。
實例8：靶向ABCA1反義轉錄物之反義寡核苷酸之活體外篩選
使用原代星狀細胞來評估反義寡核苷酸對ABCA1表現之 影響。在圖5中可以看出，定量實時PCR分析顯示，與經對照寡核苷酸處理之原代星狀細胞相比，在用CUR 1090及CUR1091轉染之原代星狀細胞中，ABCA1 mRNA之表現統計學顯著上調(p=0.0003；單因子ANOVA；n=3)。觀察到經CUR1090處理之細胞之ABCA1轉錄增加三倍。另外，西方墨點法分析證實，該等細胞內之蛋白質含量對應地增加四倍(p=0.0007；單因子ANOVA；n=3)(圖6a及6b)。
實例9：靶向ABCA1反義轉錄物之AntagoNAT
選擇CUR1090實施進一步化學修飾。基於CURNA之antagoNAT構築體合成CUR1090之兩種不同的2'-O-甲基經修飾形式，並在巨噬細胞RAW264.7細胞中進行測試。該等經修飾寡核苷酸之序列呈現於表1中。作為對照試樣，亦用最初及經修飾活性寡核苷酸二者(CUR 1461及CUR1575)之混雜(serambled)形式來轉染RAW264.7細胞。
實例10：巨噬細胞中靶向ABCA1反義轉錄物之AntagoNAT之活體外篩選
相對於兩種混雜序列對照試樣，用CUR1575及CUR1463 二者處理巨噬細胞導致ABCA1蛋白質之含量增加(圖7)。重要的是，與用未經修飾之活性CUR1090處理之細胞相比，在用CUR1463轉染之細胞中，ABCA1蛋白質之表現進一步增加，此表明該寡核苷酸之2'-O-甲基antagoNAT修飾在蛋白質層面上增強其上調ABCA1之功效。圖7顯示在用經化學修飾之ABCA1-AS反義寡核苷酸處理後48小時巨噬細胞中之ABCA1蛋白質表現。
實例11：小鼠NIH 3T3細胞中靶向ABCA1反義轉錄物之AntagoNAT之活體外篩選
與混雜序列對照試樣相比，用CUR1090、CUR1575及CUR1463處理小鼠NIH 3T3細胞導致小鼠NIH 3T3細胞中之ABCA1 mRNA含量增加，如藉由RT-PCR分析所評估(圖8)。帶有額外2'-O-甲基修飾之antagoNAT CUR1463顯示與帶有硫代磷酸酯主鏈修飾之相同寡核苷酸序列(CUR-1090)相比遠遠較低之毒性。
相對於兩種混雜序列對照試樣，用CUR1090、CUR1457及CUR1463處理小鼠NIH 3T3細胞導致ABCA1蛋白質含量增加，如藉由西方免疫墨點法分析所評估(圖9)。帶有內部糖2'-O-甲基修飾之antagoNAT CUR1463顯示與僅在每一端具有2'-O-甲基修飾之CUR1457相比ABCA1蛋白質之較大程度增加。
實例12：針對ABCA1表現對活性反義寡核苷酸CUR1463進行活體內測試 ABCA1-AS反義寡核苷酸之活體內投與
使用成年四月齡雄性C57BL6小鼠來實施活體內研究。將CUR1463及CUR1575稀釋於無菌PBS中，並以5 mg/kg或50 mg/kg之濃度以100 cc之最終體積經腹膜內注射。將單獨小鼠群組用CUR1463(5 mg/kg或50 mg/kg)、CUR1575(5 mg/kg或50 mg/kg)或鹽水媒劑對照一週處理兩次，持續四週。隨後在最後一次注射後24小時屠宰該等小鼠，並收集各個外圍器官、分離的腦區域及血清試樣。
mRNA表現之分析
已發現，ABCA1在肝臟膽固醇內穩態中發揮重要作用，且使用轉基因小鼠之研究已表明肝ABCA1表現係血漿中HDL膽固醇之主要來源。出於此原因，分析自每一治療群組採集之肝臟試樣的ABCA1 mRNA表現。與先前活體外結果一致，用5 mg/kg CUR1463處理小鼠導致與用鹽水或相等劑量之CUR1575對照處理相比肝臟ABCA1 mRNA之表現統計學顯著增加(p=0.0075；單因子ANOVA；4n9)(圖10)。重複此實驗，其中單獨一群動物接受5 mg/kg CUR1463，一週兩次，持續四週。在兩種情形下，用CUR1463處理均導致相對於對照肝臟ABCA1含量統計學顯著增加。除誘導mRNA表現增加以外，此5 mg/kg劑量之CUR1463亦顯示與媒劑或混雜寡核苷酸對照相比肝臟內ABCA1蛋白質表現之增加(p=0.0459；單因子ANOVA；5n6)(圖11)。
HDL及LDL膽固醇之定量
為檢測此肝ABCA1表現增加之功能意義，量測所有三個 治療群組之總血清膽固醇、LDL膽固醇及HDL膽固醇含量。藉由高速離心5分鐘自血液試樣分離血清。使用HDL/LDL膽固醇定量套組(Biovision)來測定血清HDL及LDL膽固醇含量。藉由在離心後添加2X沉澱緩衝液來分離HDL及LDL部分。隨後將50 μl反應混合物(含有44 μl膽固醇分析緩衝液、2 μl膽固醇探針、2 μl酶混合物及2 μl膽固醇酯酶)添加至每一未知試樣中，並將所有反應在黑暗中於37℃下培育1小時。在微量滴定板讀數器中在570 nm下量測光密度。使用自已知膽固醇濃度之試樣產生之標準曲線來確定血清HDL及LDL膽固醇含量。
在圖12a及12b中可以看出，注射5 mg/kg CUR1463之小鼠不僅顯示與鹽水或CUR1575對照相比總血清膽固醇統計學顯著減少(p=0.0281；單因子ANOVA；n=5)，而且血清LDL膽固醇減少50%(p=0.0175；單因子ANOVA；5n10)。此外，該等小鼠亦顯示HDL膽固醇與LDL膽固醇之比率增大(p=0.0093；單因子ANOVA；5n10)(圖13)。
血清三酸甘油酯含量之定量
使用三酸甘油酯分析套組(Cayman)來監測血清三酸甘油酯含量。此分析係基於脂肪酶使三酸甘油酯酶促水解成甘油，甘油之釋放可以吸光度之形式藉由偶聯酶促反應系統來量測。首先，自提供之三酸甘油酯原料製備已知三酸甘油酯濃度之標準物。將150 μl經稀釋酶緩衝溶液添加至10 μl每一標準或未知試樣中，隨後在室溫下培育15分鐘。在 540 nm下讀取吸光度。按照製造商建議計算三酸甘油酯濃度(mg/dl)。
重要的是，用CUR1463處理儘管減少血清LDL膽固醇，但並不降低防止動脈硬化之HDL的含量，亦不導致血清三酸甘油酯含量之任何變化(圖14a及14b)。
量測血清丙胺酸轉胺酶(ALT)活性
ALT活性係使用丙胺酸轉胺酶活性分析套組(Cayman)來測定。此分析係藉由監測使用乳酸脫氫酶(LDH)之偶聯反應系統中之NADH氧化速率來實施，NADH氧化會伴隨340 nm下吸光度之降低。此降低與ALT活性成正比。將190 μl反應混合物(含有150 μl ALT受質、20 μl ALT輔因子及20 μl測試或陽性對照試樣)在37℃下培育15分鐘，隨後添加20 μl ALT指示劑。每分鐘在340 nm下讀取一次各反應，持續5分鐘。按照製造商建議計算ALT活性(U/ml)。
為檢測該等反義寡核苷酸之任何可能毒性，亦量測所有治療群組之血清丙胺酸轉胺酶(ALT)活性。用作肝臟損傷篩選之方式的血清ALT活性呈現於圖15中。如圖中所顯示，用有效劑量(5 mg/kg)之CUR1463處理導致與肝毒性明顯更大之較高劑量(50 mg/kg)相比顯著較低之ALT活性。更重要的是，未發現5 mg/kg有效劑量與鹽水對照之間有毒性差異，此表明有效治療劑量無不利的肝臟效應。
實例13：靶向人類ABCA1反義轉錄物之反義寡核苷酸之活體外篩選
使用UCSC基因組瀏覽器來識別人類ABCA1反義轉錄物 (AK311445)。首先，針對此轉錄物設計兩種siRNA以確定此轉錄物是否調節ABCA1表現。將siRNA以20 nM轉染至人類黑色素瘤(518A2)細胞中。圖16顯示該等siRNA中之一者(CUR0521)與媒劑對照相比使ABCA1 mRNA表現增加三倍(P=0.05)。SiRNA CUR0519亦使ABCA1 mRNA表現增加，但不具有統計學顯著性(P=0.06)。
單鏈2'-O-甲基經修飾antagoNAT經設計以靶向人類ABCA1反義轉錄物。AntagoNAT及對照寡核苷酸之序列呈現於表2中。
圖17顯示與媒劑處理細胞相比經antagoNAT CUR1719處理之人類肝細胞癌(HepG2)細胞中ABCA1 mRNA之表現增加，如藉由ABCA1 mRNA含量之RT-PCR分析所評估。2'-雙環經修飾間隙體(gapmer)組態寡核苷酸(CUR1745及CUR1747)及2'-O-甲基間隙體組態寡核苷酸(CUR1716)不顯著提高ABCA1 mRNA表現。
將人類肝細胞癌(HepG2)細胞用20 nM濃度之antagoNAT處理並培育48小時。圖18顯示與媒劑對照相比antagoNATCUR1719使ABCA1 mRNA表現增加1.6倍(P=0.05)。第二經化學修飾之寡核苷酸(CUR-1716)亦使ABCA1表現增加，但 不具有統計學顯著性(P=0.1)。
將人類上皮結腸直腸腺癌(CaCo2)細胞用antagoNAT處理並培育48小時。圖19a及19b顯示該等細胞之相對ABCA1蛋白質表現，如藉由西方免疫墨點法分析所評估。與媒劑處理細胞及用對照寡核苷酸處理相比，用50 nM CUR1719處理之細胞顯示該等人類細胞中之ABCA1蛋白質表現增加2.5倍(p=0.0053；單因子ANOVA；n=3)。在用CUR1716處理後亦觀察到蛋白質含量之類似增加，但此結果不能達成顯著性。
實例14：靶向人類SCN1A反義轉錄物之反義寡核苷酸之活體外篩選
將針對設計及分析ABCA1 antagoNAT闡述之方法應用於設計及分析靶向人類SCN1A反義轉錄物之antagoNAT。使用UCSC基因組瀏覽器來識別人類SCN1A反義轉錄物。單鏈2'-O-甲基經修飾antagoNAT經設計以靶向人類SCN1A反義轉錄物。AntagoNAT及對照寡核苷酸之序列呈現於表3中。
將人類肝細胞癌(HepG2)細胞用靶向人類SCN1A反義轉錄物之antagoNAT處理並培育48小時。圖20顯示該等經處理細胞之相對SCN1A蛋白質表現，如藉由SCN1A mRNA含量之RT-PCR分析所評估。與媒劑處理細胞相比，經 antagoNAT CUR-1764處理之HepG2細胞中之SCN1A mRNA表現增加。
實例15：靶向人類SIRT1反義轉錄物之反義寡核苷酸之活體外篩選
將針對設計及分析ABCA1 antagoNAT闡述之方法應用於設計及分析靶向SIRT1反義轉錄物之antagoNAT。使用UCSC基因組瀏覽器來識別SIRT1反義轉錄物。單鏈2'-O-甲基經修飾antagoNAT經設計以靶向SIRT1反義轉錄物。AntagoNAT及對照寡核苷酸之序列呈現於表4中。
將小鼠NIH 3T3細胞用靶向SIRT1反義轉錄物之antagoNAT處理並培育48小時。圖21顯示該等經處理細胞之相對SIRT1蛋白質表現，如藉由SIRT1 mRNA含量之RT-PCR分析所評估。
實例16：藉由用靶向小鼠Sirt1特異性天然反義轉錄物之反義寡核苷酸處理來上調NIH3T3細胞系中之小鼠Sirt1 mRNA
在本實例中，在NIH3T3細胞系中以20 nM之最終濃度篩選靶向小鼠Sirt1特異性天然反義轉錄物之不同化學性質之反義寡核苷酸。此為小鼠細胞系。下文數據證實，藉助調 節小鼠Sirt1特異性天然反義轉錄物之功能而上調Sirt1 mRNA。
材料及方法
使來自ATCC之3T3小鼠胚胎纖維母細胞(登記號為CRL-1658)在生長培養基(杜貝克氏改良鷹氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)(Cellgrow 10-013-CV)+10%胎牛血清(Cellgrow 35-22-CV)+青黴素/鏈黴素(Mediatech登記號為MT30-002-CI))中在37℃及5% CO2下生長。利用以下方法用反義寡核苷酸來處理該等細胞。將該等細胞以約105個/孔之密度再鋪板至6孔板中之生長培養基中，投用20 nM反義寡核苷酸，並在37℃及5% CO2下培育過夜。次日，將6孔板中之培養基更換成新鮮生長培養基(1.5 ml/孔)。所有反義寡核苷酸均係由IDT公司(Coralville,IA)或Exiqon(Vedbaek,Denmark)製得。所有寡核苷酸之序列列示於表5中。將寡核苷酸之原液在不含脫氧核糖核酸酶/核糖核酸酶之無菌水中稀釋至20 μM濃度。投用於一個孔時，將2 μl此溶液與400 μl Opti-MEM培養基(Gibco登記號為31985-070)及4 μl Lipofectamine 2000(Invitrogen登記號為11668019)在室溫下一起培育20 min，並逐滴施加至含有細胞之6孔板之一個孔中。使用包括2 μl水代替寡核苷酸溶液之類似混合物作為模擬轉染對照。另外，使用相同濃度之無活性寡核苷酸CUR-1462作為對照。在37℃及5% CO2下培育約18 h之後，將培養基更換為新鮮生長培養基。添加反義寡核苷酸後48 h，移除培養基，並使用來自 Promega之SV總RNA分離系統(登記號為Z3105)根據製造商說明書自細胞提取RNA。將600毫微克經純化之總RNA添加至使用來自Invitrogen之Superscript VILO cDNA合成套組(登記號為11754-250)如製造商方案中所述實施之逆轉錄反應中。使用來自此逆轉錄反應之cDNA藉由實時PCR使用ABI Taqman基因表現混合物(登記號為4369510)及由ABI設計之引物/探針(用於小鼠Sirt1之Mm01168521_m1分析)來監測基因表現。使用StepOne Plus實時PCR系統(Applied Biosystems)來實施下列PCR循環：在50℃下保持2 min，在95℃下保持10 min，40個循環之(在95℃下保持15秒，在60℃下保持1 min)。用於18S之分析係由ABI製得(登記號為4319413E)。基於經處理及模擬轉染試樣間18S正規化dCt值之差值來計算用反義寡核苷酸處理後基因表現之變化倍數。
結果：與模擬轉染對照相比，在用20 nM反義寡核苷酸處理後NIH3T3細胞中之小鼠Sirt1 mRNA含量顯示於圖22中。自數據可以看出，當以20 nM施加時，一些寡核苷酸(CUR-1099、CUR-1578、CUR-1748)在上調小鼠Sirt1 mRNA含量方面有效。針對小鼠Sirt1天然反義序列設計之 一些寡核苷酸(CUR-1658、CUR-1749)未改變NIH3T3細胞中之Sirt1 mRNA含量。用與小鼠Sirt-1天然反義序列不具有同源性但具有類似LNA化學性質之寡核苷酸(CUR-1750)處理之NIH3T3細胞中之小鼠Sirt1含量未顯示任何顯著調節。
結論：該等差異與文獻數據相符，此表明寡核苷酸之結合可依賴於寡核苷酸靶序列之二級及三級結構。CUR-1750之結果證實，CUR-1099、CUR-1578、CUR-1748之效應係特異性的且不依賴於該等分子之非特異性毒性。
序列表說明-SEQ ID NO：1：智人ATP結合盒亞族A(ABC1)，成員1(ABCA1)，mRNA(NCBI登記號為NM_005502)；SEQ ID NO：2：智人電壓閘控之鈉通道I型α亞單元(SCN1A)，轉錄物變體1，mRNA(NCBI登記號為NM_001165963)；SEQ ID NO：3：智人電壓閘控之鈉通道I型α亞單元(SCN1A)，轉錄物變體2，mRNA(NCBI登記號為NM_006920)；SEQ ID NO：4：智人電壓閘控之鈉通道I型α亞單元(SCN1A)，轉錄物變體3，mRNA(NCBI登記號為NM_001165964)；SEQ ID NO：5：智人電壓閘控之鈉通道I型α亞單元(SCN1A)，轉錄物變體4，mRNA(NCBI登記號為NM_001202435)；SEQ ID NO：6：小家鼠sirtuin 1(沉默交配型資訊調節因子2同源物)1(釀酒酵母(S.cerevisiae))(Sirt1)，轉錄物變體2，mRNA(NCBI登記號為NM_001159589)；SEQ ID NO：7：小家鼠sirtuin 1(沉默交配型資訊調節因子2同源物)1(釀酒酵母)(Sirt1)，轉錄物變 體1，mRNA(NCBI登記號為NM_019812)；SEQ ID NO：8：小家鼠sirtuin 1(沉默交配型資訊調節因子2同源物)1(釀酒酵母)(Sirt1)，轉錄物變體3，mRNA(NCBI登記號為NM_001159590)；SEQ ID NO：9：小鼠天然ABCA1反義序列(AK311445)；SEQ ID NO：10及11：天然SCN1A反義序列，分別為最初及伸展形式(BG724147)；SEQ ID NO：12：小鼠天然SIRT1反義序列(ak044604)；SEQ ID NO：13至21：2'-未經修飾及2'-經修飾ABCA1-AS反義寡核苷酸序列；SEQ ID NO：22至26：靶向ABCA1-AS反義寡核苷酸之AntagoNAT及對照寡核苷酸之序列；SEQ ID NO：27至29：靶向SCN1A-AS反義寡核苷酸之經化學修飾寡核苷酸之序列；SEQ ID NO：30至39：靶向SIRT1反義寡核苷酸之經化學修飾寡核苷酸之序列。＊表示硫代磷酸酯鍵，+表示2'-雙環糖經修飾之核苷或LNA，且m表示2'-O-甲基糖經修飾之核苷。
本發明之新穎特徵詳盡地闡述於隨附申請專利範圍中。參照闡述利用本發明原理之例示性實施例之下文詳細說明及附圖將會更好地瞭解本發明之特徵及優點，在附圖中：
圖1-BF133827之cDNA序列，BF133827係小鼠ABCA1之可能的非編碼反義轉錄物。特異性靶位點突出顯示。
圖2-在用ABCA1-AS反義寡核苷酸(50 nM，n=3)處理後48小時巨噬細胞ABCA1 mRNA表現之RT-PCR分析。值代表平均值±SEM。＊表示與CUR586對照相比之統計學顯著 性(p<0.05；單因子ANOVA；n=3)。
圖3a-在用ABCA1-AS反義寡核苷酸(50 nM，n=3)處理後48小時使用ABCA1一級多株抗體(Novus)對巨噬細胞ABCA1蛋白質表現之西方免疫墨點法分析。
圖3b-巨噬細胞西方免疫墨點法之光密度測定分析。值代表平均值±SEM。＊表示與CUR586對照相比之統計學顯著性(p<0.05；單因子ANOVA；n=3)。
圖4-在用ABCA1-AS反義寡核苷酸(50 nM)處理後48小時巨噬細胞ABCA1蛋白質之免疫染色。使用Hoechst 33258進行核染色，而使用結合Alexa Fluor 488之二級抗體來顯現ABCA1。
圖5-在用ABCA1-AS反義寡核苷酸(50 nM，n=3)處理後星狀細胞ABCA1 mRNA表現之RT-PCR分析。
圖6a-在用ABCA1-AS反義寡核苷酸(50 nM，n=3)處理後使用ABCA1一級多株抗體對星狀細胞ABCA1蛋白質表現之西方免疫墨點法分析。
圖6b-在用ABCA1-AS反義寡核苷酸(50 nM，n=3)處理後星狀細胞西方免疫墨點法之光密度測定分析。值代表平均值±SEM。＊表示與CUR586對照相比之統計學顯著性(p<0.05；單因子ANOVA；n=3)。
圖7-在用經化學修飾之ABCA1-AS反義寡核苷酸(包括antagoNAT CUR1463)處理後48小時巨噬細胞中之ABCA1蛋白質表現。
圖8-在用AntagoNAT CUR1463處理後小鼠NIH 3T3細胞 中ABCA1 mRNA含量之RT-PCR分析。
圖9-在用AntagoNAT CUR 1463處理後小鼠NIH 3T3細胞中ABCA1蛋白質含量之西方免疫墨點法分析。
圖10-用ABCA-AS反義寡核苷酸及antagoNAT(5 mg/kg)處理(一週兩次，持續四週)之野生型小鼠之肝臟中之ABCA1 mRNA表現。值代表經兩次重複研究所獲得之匯總數據，且以平均值±SEM表示。＊表示CUR1463與CUR1575及鹽水對照之間之統計學顯著性差異(p<0.05；單因子ANOVA；4n9)。
圖11-用ABCA1-AS反義寡核苷酸(5 mg/kg)處理(一週兩次，持續四週)之野生型小鼠之肝臟中之ABCA1蛋白質表現，如藉由西方免疫墨點法分析之光密度測定分析所評估。值代表經兩次重複研究所獲得之匯總數據，且以平均值±SEM表示。
圖12a-用ABCA1-AS反義寡核苷酸處理之小鼠中之總血清膽固醇。值代表經兩次重複研究所獲得之匯總數據，且以平均值±SEM表示。＊表示CUR1463與CUR1575及鹽水對照之間之統計學顯著性差異(p<0.05；單因子ANOVA；5n10)。
圖12b-用ABCA1-AS antagoNAT處理之小鼠中之LDL-膽固醇。值代表經兩次重複研究所獲得之匯總數據，且以平均值±SEM表示。＊表示CUR1463與CUR1575及鹽水對照之間之統計學顯著性差異(p<0.05；單因子ANOVA；5n10)。
圖13-用ABCA1-AS antagoNAT(5 mg/kg)處理(一週兩次，持續四週)之小鼠中之HDL：LDL比率。值代表經兩次重複研究所獲得之匯總數據，且以平均值±SEM表示。＊表示CUR1463與CUR1575及鹽水對照之間之統計學顯著性差異(p<0.05；單因子ANOVA；5n10)。
圖14a-用ABCA1-AS antagoNAT(5 mg/kg)處理(一週兩次，持續四週)之小鼠中之血清HDL膽固醇。值代表經兩次重複研究所獲得之匯總數據，且以平均值±SEM表示。
圖14b-用ABCA1-AS antagoNAT(5 mg/kg)處理(一週兩次，持續四週)之小鼠中之三酸甘油酯含量。值代表經兩次重複研究所獲得之匯總數據，且以平均值±SEM表示。
圖15-用ABCA1-AS antagoNAT(5 mg/kg)處理(一週兩次，持續四週)之小鼠中之血清丙胺酸轉胺酶(ALT)活性。值代表經兩次重複研究所獲得之匯總數據，且以平均值±SEM表示。
圖16-在用20 nM siRNA(n=5)處理後48小時人類518A2黑色素瘤細胞中之ABCA1 mRNA表現。值表示平均值+標準偏差。＊表示統計學顯著性。
圖17-HepG2細胞中ABCA1 mRNA含量之RT-PCR分析。AntagoNAT CUR-1719使ABCA1 mRNA表現增加。
圖18-在用2' O-甲基經修飾antagoNAT處理後48小時人類HepG2肝細胞癌細胞中之ABCA1 mRNA表現。值表示平均值+標準偏差。＊表示統計學顯著性。
圖19a-在用ABCA1-AS反義寡核苷酸(50 nM，n=3)處理 人類上皮結腸直腸腺癌(CaCo2)細胞後48小時細胞中ABCA1蛋白質表現之西方免疫墨點法分析。在分析中使用ABCA1一級多株抗體(Novus)。
圖19b-CaCo2西方免疫墨點法分析之光密度測定分析。值代表平均值±SEM。數據表示用antagoNAT處理與用媒劑及對照寡核苷酸處理細胞相比之統計學顯著性(p<0.05；單因子ANOVA；n=3)。
圖20-在用antagoNAT處理後HepG2細胞中SCN1A mRNA含量之RT-PCR分析。
圖21-在用antagoNAT處理後小鼠NIH 3T3細胞中SIRT1 mRNA含量之RT-PCR分析。
圖22-圖22顯示硫代磷酸酯寡核苷酸(CUR-1099)、2'O甲基間隙體/嘧啶經修飾寡核苷酸(CUR-1578)及LNA經修飾間隙體寡核苷酸(CUR-1748)使NIH3T3細胞中之小鼠Sirt1 mRNA表現上調。對照LNA經修飾間隙體組態寡核苷酸(CUR-1750)以及LNA經修飾間隙體寡核苷酸(CUR-1658及CUR-1749)未顯著上調小鼠Sirt1 mRNA表現。
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Claims (38)

  1. 一種組合物，其包含醫藥上可接受之稀釋劑或載劑及antagoNAT，其中具有10個至30個核苷亞單元之該antagoNAT：與預選天然反義轉錄物雜交；在3'末端包含至少一個糖經修飾之核苷亞單元且在5'末端包含至少一個糖經修飾之核苷亞單元；且在該5'核苷亞單元與該3'核苷亞單元之間進一步包含內部糖經修飾之核苷亞單元及內部糖未經修飾之核苷亞單元，其中連續的內部核糖核苷不超過三個且至少一個內部核苷係經修飾的，其中該內部經修飾之亞單元包含至少一個鎖核酸或2'-OMe；且其中該antagoNAT上調基因表現，其中該antagoNAT為具有式(I)之化合物或其鹽，C-Au-[Bv-A'w]x-By-A"z-C 式(I)其中各A、A'及A"獨立地具有以下結構：各B獨立地具有以下結構：各C獨立地為羥基、磷酸酯基、經取代或未經取代之烷氧基、或任一適宜5'或3'末端帽；各u、v、w、x、y及z獨立地為大於或等於1之整數；各D係雜環鹼基；各E獨立地選自由下列組成之群：經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烷氧基、經取代或未經取代之胺、鹵素、經取代或未經取代之胺基烷氧基、經取代或未經取代之烯基、或巰基；各G獨立地為-OP(O)2O-、-OP(O)(OR)O-、-OP(O)(S)O-、-OP(O)(SR)O-、-OP(S)2O-、-OP(R)(O)O-、-OP(NR2)(O)O-、-OC(O)O-、-OCH2C(O)NHCH2-、-OCH2S-、-CH2SCH2-、-OP(O)(BH3)O-、-NP(O)2O-、-OP(R)(O)O-，或當(Ia)連結至C時不存在；各R獨立地為氫或經取代或未經取代之烷基；各J係氫，或J與E一起形成視情況包括選自N或O之額外雜原子之環結構；且各K獨立地為羥基或氫，且其中該基因選自由SCN1A、SIRT1、ABCA1、VEGF、BDNF及GDNF組成之群。
  2. 如請求項1之組合物，其中該等糖經修飾及糖未經修飾之核苷亞單元各自包含嘧啶鹼基或嘌呤鹼基。
  3. 如請求項1之組合物，其中該等內部糖經修飾之核苷亞單元各自包含嘧啶鹼基或嘌呤鹼基。
  4. 如請求項1之組合物，其中該等內部糖經修飾之核苷亞單元各自包含嘧啶鹼基。
  5. 如請求項1之組合物，其中該等糖經修飾之核苷亞單元各自在2'位上經烷氧基、烷基、鹵素、胺基、巰基、烷基胺、烷基巰基、烷基酯或結合至C4'碳之O-伸烷基取代。
  6. 如請求項1之組合物，其中該等糖經修飾之核苷亞單元各自在2'位上經烷氧基、鹵素或結合至C4'碳之O-伸烷基取代。
  7. 如請求項1之組合物，其中該等糖經修飾之核苷亞單元各自在2'位上經甲氧基取代。
  8. 如請求項1之組合物，其中該等糖經修飾之核苷亞單元各自在2'位上經O-甲氧基乙基取代。
  9. 如請求項1之組合物，其中該等糖經修飾之核苷亞單元各自在2'位上經結合至該C4'碳之O-亞甲基(2'-OCH2-4')或結合至C4'碳之O-伸乙基(2'-OCH2CH2-4')取代。
  10. 如請求項1之組合物，其中該未經修飾之核苷亞單元包含核糖或2'-去氧核糖。
  11. 如請求項1之組合物，其中該antagoNAT包含磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸烷基酯、磷醯胺酸酯、硼烷磷酸酯、碳酸酯、胺基甲酸酯、乙醯胺酸酯、硫醚、硫代甲縮醛核苷酸間鍵聯或其組合之主鏈。
  12. 如請求項1之組合物，其中該antagoNAT包含磷酸二酯及硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯之主鏈。
  13. 如請求項1之組合物，其中該antagoNAT包含硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯之主鏈。
  14. 如請求項1之組合物，其中該antagoNAT與該預選天然反義轉錄物至少50%互補。
  15. 如請求項1之組合物，其中連續的具有2'-去氧核糖部分之內部未經修飾核苷不超過五個，其中(a)該3'末端區段包含雙環2'-經修飾糖核苷且該5'末端區段包含非雙環2'-經修飾糖核苷；或(b)該3'末端區段包含非雙環2'-經修飾糖核苷且該5'末端區段包含雙環2'-經修飾糖核苷。
  16. 一種具有式(I)之antagoNAT或其鹽，C-Au-[Bv-A'w]x-By-A"z-C 式(I)其中各A、A'及A"獨立地具有以下結構：各B獨立地具有以下結構：各C獨立地為羥基、磷酸酯基、經取代或未經取代之烷氧基、或任一適宜5'或3'末端帽；各u、v、w、x、y及z獨立地為大於或等於1之整數；各D係雜環鹼基；各E獨立地選自由下列組成之群：經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烷氧基、經取代或未經取代之胺、鹵素、經取代或未經取代之胺基烷氧基、經取代或未經取代之烯基、或巰基；各G獨立地為-OP(O)2O-、-OP(O)(OR)O-、-OP(O)(S)O-、-OP(O)(SR)O-、-OP(S)2O-、-OP(R)(O)O-、-OP(NR2)(O)O-、-OC(O)O-、-OCH2C(O)NHCH2-、-OCH2S-、-CH2SCH2-、-OP(O)(BH3)O-、-NP(O)2O-、-OP(R)(O)O-，或當(Ia)連結至C時不存在；各R獨立地為氫或經取代或未經取代之烷基；各J係氫，或J與E一起形成視情況包括選自N或O之額外雜原子之環結構；且各K獨立地為羥基或氫，其中至少一個A'為鎖核酸或包含2'-OMe；且其中該antagoNAT上調基因表現，且其中該基因選自由SCN1A、SIRT1、ABCA1、VEGF、BDNF及GDNF組成之群。
  17. 如請求項16之antagoNAT，其中各雜環鹼基獨立地選自嘌呤或嘧啶鹼基。
  18. 如請求項16之antagoNAT，其中各雜環鹼基獨立地選自腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、2-胺基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶或次黃嘌呤。
  19. 如請求項16之antagoNAT，其中各雜環鹼基獨立地選自腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶或胞嘧啶。
  20. 如請求項16之antagoNAT，其中各A'之該雜環鹼基獨立地選自尿嘧啶、胸腺嘧啶或胞嘧啶。
  21. 如請求項16之antagoNAT，其中各A、A'或A"獨立地具有以下結構：
  22. 如請求項21之antagoNAT，其中各E獨立地為甲氧基、乙氧基、O-甲基乙基或氟。
  23. 如請求項21之antagoNAT，其中各E係甲氧基。
  24. 如請求項21之antagoNAT，其中各E係O-甲基乙基。
  25. 如請求項16之antagoNAT，其中各G獨立地為-OP(O)2O-、-OP(O)(OR)O-或-OP(O)(S)O-。
  26. 如請求項16之antagoNAT，其中各G係-OP(O)(S)O-。
  27. 如請求項16之antagoNAT，其中各C係羥基。
  28. 如請求項16之antagoNAT，其中當K係羥基時，v及y獨立地為1、2或3之整數，且x至少為1。
  29. 如請求項21之antagoNAT，其中當K係氫時，v及y獨立地為1、2、3、4或5之整數，且(a)其中至少一個A具有該(Id)或(Ie)之結構且至少一個A"具有該(Ic)之結構；或(b)其中至少一個A具有該(Ic)之結構且至少一個A"具有該(Id)或(Ie)之結構。
  30. 一種antagoNAT用於製備調節細胞中基因表現之藥物的用途，其中具有10個至30個核苷亞單元之該antagoNAT：與該基因之天然反義轉錄物雜交；在3'末端包含至少一個糖經修飾之核苷亞單元且在5'末端包含至少一個糖經修飾之核苷亞單元；在該5'核苷亞單元與該3'核苷亞單元之間進一步包含內部糖經修飾之核苷亞單元及內部糖未經修飾之核苷亞單元，其中連續的內部核糖核苷不超過三個且至少一個內部核苷係經修飾的；且其中該antagoNAT與該天然反義轉錄物雜交，由此上調該基因之表現，其中該內部經修飾之亞單元包含至少一個鎖核酸或2'-OMe，其中該antagoNAT為具有式(I)之化合物或其鹽，C-Au-[Bv-A'w]x-By-A"z-C 式(I)其中各A、A'及A"獨立地具有以下結構：各B獨立地具有以下結構：各C獨立地為羥基、磷酸酯基、經取代或未經取代之烷氧基、或任一適宜5'或3'末端帽；各u、v、w、x、y及z獨立地為大於或等於1之整數；各D係雜環鹼基；各E獨立地選自由下列組成之群：經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烷氧基、經取代或未經取代之胺、鹵素、經取代或未經取代之胺基烷氧基、經取代或未經取代之烯基、或巰基；各G獨立地為-OP(O)2O-、-OP(O)(OR)O-、-OP(O)(S)O-、-OP(O)(SR)O-、-OP(S)2O-、-OP(R)(O)O-、-OP(NR2)(O)O-、-OC(O)O-、-OCH2C(O)NHCH2-、-OCH2S-、-CH2SCH2-、-OP(O)(BH3)O-、-NP(O)2O-、-OP(R)(O)O-，或當(Ia)連結至C時不存在；各R獨立地為氫或經取代或未經取代之烷基；各J係氫，或J與E一起形成視情況包括選自N或O之額外雜原子之環結構；且各K獨立地為羥基或氫，且其中該基因選自由SCN1A、SIRT1、ABCA1、VEGF、BDNF及GDNF組成之群。
  31. 如請求項30之用途，進一步包含：形成包含該antagoNAT及該天然反義轉錄物之雜合體；其中該雜合體並非核糖核酸酶裂解之受質；及空間上阻斷該天然反義轉錄物之正常功能。
  32. 如請求項30之用途，其中該antagoNAT與該天然反義轉錄物之互補體具有至少50%的序列一致性。
  33. 如請求項30之用途，其中該細胞係哺乳動物細胞。
  34. 一種antagoNAT用於製備調節細胞中多核苷酸功能之藥物的用途，其中具有10個至30個核苷亞單元之該antagoNAT：與該多核苷酸雜交；在3'末端包含至少一個糖經修飾之核苷亞單元且在5'末端包含至少一個糖經修飾之核苷亞單元；在該5'核苷亞單元與該3'核苷亞單元之間進一步包含內部糖經修飾之核苷亞單元及內部糖未經修飾之核苷亞單元，其中連續的內部核糖核苷不超過三個且至少一個內部核苷係經修飾的；且其中該antagoNAT與該多核苷酸雜交，由此上調該多核苷酸之該功能，其中該內部經修飾之亞單元包含至少一個鎖核酸或2'-OMe，其中該antagoNAT為具有式(I)之化合物或其鹽，C-Au-[Bv-A'w]x-By-A"z-C 式(I)其中各A、A'及A"獨立地具有以下結構：各B獨立地具有以下結構：各C獨立地為羥基、磷酸酯基、經取代或未經取代之烷氧基、或任一適宜5'或3'末端帽；各u、v、w、x、y及z獨立地為大於或等於1之整數；各D係雜環鹼基；各E獨立地選自由下列組成之群：經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烷氧基、經取代或未經取代之胺、鹵素、經取代或未經取代之胺基烷氧基、經取代或未經取代之烯基、或巰基；各G獨立地為-OP(O)2O-、-OP(O)(OR)O-、-OP(O)(S)O-、-OP(O)(SR)O-、-OP(S)2O-、-OP(R)(O)O-、-OP(NR2)(O)O-、-OC(O)O-、-OCH2C(O)NHCH2-、-OCH2S-、-CH2SCH2-、-OP(O)(BH3)O-、-NP(O)2O-、-OP(R)(O)O-，或當(Ia)連結至C時不存在；各R獨立地為氫或經取代或未經取代之烷基；各J係氫，或J與E一起形成視情況包括選自N或O之額外雜原子之環結構；且各K獨立地為羥基或氫，且其中該功能由選自由SCN1A、SIRT1、ABCA1、VEGF、BDNF及GDNF組成之群之基因產生。
  35. 如請求項34之用途，其中該多核苷酸係有義鏈之天然反義鏈。
  36. 如請求項34之用途，進一步包含：形成包含該antagoNAT及該多核苷酸之雜合體；其中該雜合體並非核糖核酸酶裂解之受質；及空間上阻斷該多核苷酸之正常功能。
  37. 如請求項34之用途，其中該antagoNAT與該多核苷酸之互補體具有至少50%的序列一致性。
  38. 如請求項34之用途，其中該細胞係哺乳動物細胞。
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