ES2524643T3 - Genes control para la normalización de datos de análisis de expresión génica - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la normalización de una expresión de ARNm en varias muestras de sangre que comprende: a) una comparación de los valores de expresión de uno o varios ácidos nucleicos seleccionados de SEC ID 22 a SEC ID 97 a través de distintas muestras de sangre; b) derivación de una medida de estabilidad génica para la normalización de valores de expresión de uno o varios ácidos nucleicos, seleccionados de SEC ID 22 a SEC ID 97 a través de varias muestras de sangre; y c) una normalización de la expresión de otros ácidos nucleicos, que se aislaron de varias muestras de sangre, basándose en la etapa b).

Description

Genes control para la normalización de datos de análisis de expresión génica

La presente invención se refiere a un procedimiento para la normalización de una cantidad de ARNm en varias muestras de acuerdo con la reivindicación 1, a un kit con una selección de secuencias de acuerdo con la reivindicación 9, a un uso de ácidos nucleicos como genes contra! para la normalización da dalas de análisis de expresión génica de acuerdo con la reivindicación 10 asl como a conjuntos de genes control para la normalización de análisís de expresión génica de acuerdo con la reivindicación 11 y 12.

Igual Que antes existe una necesidad de identificar genes, en particular de células sangufneas, que muestran variación sólo mínima en su expresíón en condiciones distintas. Estos denominados genes ·constitutivos· se usan como referencias, controles internos y valores de referencia en la cuantificación de la expresión génica y de ARN y ARNm con procedimientos tales como inmuno\ransferencia tipo Northem, ensayo de protección de ribonucleasa. electroforesis capilar, micromatrices y PCR en tiempo real cuantitativa asi como por medio de otros procedimientos para la medición directa de la transcripción y medición tras amplificación anterior.

A continuación se resumen los términos genes constitutivos y genes control de expresión en el término genes control. Esta simplificación se realiza por motivos de legibilidad y no representa ninguna limitación de la invención.

Una normalización de datos cuantitativos por medio de genes control tiene numerosas posibilidades de uso. Los genes control permiten una identificación de genes cuya actividad se regula de manera diferencial en distintos estados patOlógicos así como el desarrollo de diagnósticos que se basan en esto.

Un gen control es un gen que muestra modificación mínima de la expresión y transcripción a través de distintas muestras de ARN y con ello sirve como control para la medición de actividades génicas variables a través de distintas muestras. Ningun gen muestra actividad no modificada por todos los tejidos. Por tanto existe una alta necesidad de nuevos genes control. en particular para sangre, dado que los valores de expresión de sangre se usan de manera diagnóstica.

Aunque distintos genes control se conocen en la bibliografía [1]. no se conocen genes control y sus transcritos asi como su uso combinado para la normalización de la expresión génica y la transcripción de muestras de sangre completa y células sanguíneas. Los transcritos (también ARNm y microARN así como otros ARN) con concentración conslante en células sanguineas y en células de órganos y tejidos periféricos que están localizados en la sangre completa, representan una condición previa para la normalización de actividades génicas y para la determinación de las modificaciones de otras actividades génicas y por consiguiente una condición previa para el diagnóstico basado en sangre. Del mismo modo están publicados ya distintos estudios para la medición de la actividad génica para el diagnósticolpronóstico de SIRS y septicemia, por ejemplo [2 , 3], sin embargo no se ha descrito aun un uso y una cuantificación de estas señales de actividad génica por medio de genes control de sangre.

Por consiguiente existe una necesidad de genes control de sangre y células sanguíneas robustos y Que dispongan de una estabilidad, que permita una normalización y cuantificación de la expresión géniC<:1 de genes o agrupaciones de genes especificos de enfermedad.

El punto de partida para la invención dada a conocer en la presente solicitud es el conocimiento de que se detectan actividades génicas de distintos genes, que se producen en células sanguíneas, en muestras de un individuo durante las apariciones de enfermedad tlpicas de septicemia (que corresponden a la definición en (4)), no se diferencian de las actividades génicas de los mismos genes de individuos, en los que no se diagnosticó septicemia y pueden usarse conjuntamente o de manera individual como genes control para la normalización de actividades génicas de células sanguíneas y para la determinación de la concentración de transcritos de sangre. Esto permite la normalización y la cuantificación relativa de las actividades de otros genes, lo que puede usarse para el diagnóstico, pronóslico, terapia y control de desarrollo.

Por consiguiente, la presente invención se basa en el objetivo de facilitar medios y procedimientos que posibiliten un punto de referencia para la diferenciación de modificaciones de expresión génica condicionada por la enfermedad y con ello un diagnóstico o control de desarrollo de la terapia.

De manera técnica de procedimiento se soluciona este objetivo mediante las características de la reivindicación 1.

El objetivo se soluciona además mediante un kit de acuerdo con la reivindicación 9 así como un uso de acuerdo con la reivindicación 10 Y mediante conjuntos de genes control de acuerdo con las reivindicaciones 11 y 12.

La invención describe la identificación de nuevos genes control de sangre, sondas de micromatriz adecuadas y cebadores para PCR y su uso, también en combinación, para la normalización de datos de expresión cuantitativos de sangre y células sanguíneas en micromatrlces, ensayos de PCR en tiempo real y otros sistemas con o sin amplificación y con distintas posibilidades de visualización para la determinación así como su uso para el diagnóstico

de modificaciones condicionadas patológicamente en inflamaciones locales de distinta localización yen la reacción sistémica a continuación tal como SIRS, septicemia, septicemia grave con fallo orgánico.

En estos estudios es importante de manera decisiva la normalización de análisis de expresión génica. Para los fines 5 de la presente invención debe entenderse por normalización lo siguiente:

' Por una normalización se entiende hacer comparables las mediciones de distintas matrices o experimentos de PCR

o en particular de RT·PCR, reduciéndose o eliminándose la variabilidad técnica. Dentro de estos experimentos existe una multiplicidad de fuentes Que pueden falsificar las mediciones. Las posibles fuentes perturbadoras técnicas

10 son una eficiencia distinta en la transcripción inversa, el marcado o las reacciones de hibridación as; como problemas con las matrices, efectos de carga en los reactivos o condiciones espeCificas de laboratorio".

El procedimiento de acuerdo con la invención está caracterizado por Que puede diferenciarse en una muestra de sangre de individuo la actividad de uno o varios genes Que van a someterse a estudio mediante detección de la 15 presencia y de la cantidad del producto génico con respecto a las cantidades de los productos génicos delos genes control enlre SIRS y septicemia.

Para ello se dan a conocer genes control y secuencias génicas de sangre y células sanguineas asl como cebadores y sondas derivados de los mismos, que pueden usarse para la determinación, visualización y normalización y 20 cuantificación de actividades génicas y transcritos. Las secuencias de las sondas de oligonucleótidos en una realización preferente están expuestas en la tabla 1 y corresponden al protocolo de secuencias adjunto de Sec ID 1 a Sec ID 7, las secuencias de cebadores usadas en la tabla 2 corresponden al protocolo de secuencias adjunto de Sec ID 8 a Sec ID 21. A este respecto, las secuencias de las sondas de oligonucleótidos pueden adoptar también otras secuencias, en una realización preferente de una longitud de 50-100 nucleótidos, que se unen específicamente

25 a transcritos de los genes expuestos en la tabla 3 con secuencias de Sec ID 22 a Sec ID 97. La longitud de las secuencias usadas en procedimientos de amplificación tal como PCR puede ser cualquiera en lanlo que favorezcan la manipulación y amplificación enzimática deseada.

Tabla 1: sond as de oliaonucleótidos de AoN

Simbolo de en

SECIO

ITGAL

1

SNAPC1

2

CASP8

3

C7

4

PPARD

5

IL 18

6

F3

7

Tabla 2: Cebad ores de ADN d'Irec

os e IOversos.

Simbolo de aen

SEC ID de cebador directo SEC ID de cebador inverso

ITGAl SNAPC1 CASP8

8 9 10 15 16 17

C7 PPARD

11 12 18 19

1L18

13 20

F3

14 21

Los cebadores en la tabla 2 pueden usarse para preparar productos de amplificación Que contenían la región deseada (secuencia) de los genes mencionados. En una realizaciÓn habitual, el producto es de 150·200 nucleótidos de largo.

Los genes control pueden usarse individualmente o en combinación de varios. Habitualmente puede determinarse la actividad de genes control tal como se describe en el presente documento con sondas de hibridación para micromatrices o cebadores para PCR y PCR en tiempo real. Los genes control y sus productos de expresión pueden dctenninarse sin embargo también tras la amplificación con otros procedimientos conocidos por el experto tales

10 como por ejemplo NASBA (Nuc/eic Acid Sequence-based Amplifica/ion, amplificación a base de secuencias de acidos nucleicos) y en distinta combinación. Éstos pueden determinarse también con una serie de otros procedimientos o posibilidades de visualización tales como por ejemplo con ayuda de anticuerpos monoclonales. Los cebadores y las sondas pueden usarse para el gen, el producto de expresión (ARNm) o los productos de expresión que no se procesan completamente para dar ARNm .

'5

En otras realizaciones, los cebadores y las sondas se unen a una región especifica de los genes control dados a conocer en el presente documento o sus transcritos. Sin embargo, las sondas y los cebadores pueden interaccionar con cualquier región de las secuencias génicas dadas a conocer en el presente documento o secuencias transcritas a partir de las mismas. los cebadores y las sondas pueden interaccionar a través del apareamiento de bases

20 continuo, sin embargo no han de interaccionar continuamente con la secuencia complementaria completa. Las composiCiones de tampón, concentraciones salinas, etapas de lavado y temperaturas pueden seleccionarse en el presente documento de manera variable.

Igualmente pueden compararse estas modificaciones de los genes control y de los genes de prueba con los valores 25 de expresión (o datos derivados de los mismos, tales como por ejemplo valores promedio) de una o varias muestras de referencia, que no se determinan simultaneamente con la muestra objetivo.

Una forma de realización de la invención esta caracterizada por que se determinan valores de expresión usando genes control de la tabla 3 así como acidos nucleicos y transcritos de estos genes control de sangre y de células 30 sanguíneas como genes control mediante comparación de los valores de expresión con uno o varios acidos nucleicos de prueba y mediante cuantificación con respecto al acido nucleico de prueba.

Otra forma de realización de la invención esta caracterizada por que se usan acidos nucleicos y sondas de ADN con las secuencias segun la tabla 1 y su unión de ARN incluyendo microARN y de transcritos (ARN o ARNm) en sangre 35 o a partir de células sanguíneas de genes según la tabla 3 en disolución o de manera inmovilizada sobre superficies

o partfculas o perlas y el uso de los transcritos unidos de estos genes para la normalización mediante comparación de las cantidades unidas (valores de expresión) de los ácidos nucleicos con uno o varios ácidos nucleicos de prueba unidos a sondas y para la cuantificación con respecto al ácido nucleico de prueba unido.

40 Una forma de realizaciÓn de la invenciÓn está caracterizada por que el procedimiento para la diferenciación ex vivo, in vitro entre SIRS y septicemia (ambas que corresponden a (4]) basándose en la correlación de las cantidades de ARN de gen control y gen de prueba, comprende las siguientes etapas:

a) aislar ARN de gen control asf como ARN de gen de prueba de una muestra de sangre

45 b) marcar el ARN de gen control y de gen de prueba con un marcador detectable y llevar a contacto con el ADN en condiciones de hibridación, siendo el ADN un fragmento génico u oligonucleótido, que se une específicamente a transcritos, productos de amplificación o transcritos in vitro de genes control. c) delectar cuantitativamente las señales de marcación del ARN de gen control y gen de prueba de manera correspondiente a b) y

50 d) comparar los datos cuantitativos de las sei'iales de marcación para realizar una declaración de si un gen específico o fragmento génico se expresa de manera mas fuerte o mas débil en comparación con las sei'iales de los genes control.

Otra forma de realización de la invención esta caracterizada por que se hibrida el ARN de gen control antes de la

55 medición del ARN de gen de prueba con el ADN y se detectan las señales de marcación del complejo ARN conlroUADN, eventualmente se transforman posteriormente y eventualmente se archivan en forma de tabla o curva de calibración.

Otra forma de realización de la invención está caracterizada por que se identifican y se cuantifican ARN de los genes 60 control o partes de los mismos por medio de secuenciación o secuenciación parcial por ejemplo por medio de pirosecuenciación.

Otra forma de realización de la invención esta caracterizada por que como ARN de gen control se usa ARNm o microARN.

Otra forma de realización de la invención está caracterizada por que el ADN se dispone, en particular se inmoviliza, para la unión especifica del ARN del gen control o sus transcritos in vitro en zonas predeterminadas sobre un soporte en forma de una micromatriz.

5 Olra forma de realización de la invención está caracterizada por que en caso de la muestra biológica se 1rala de la de un ser humano.

Estas secuencias con la secuencia ID: 1 hasta la secuencia ID: 97 están comprendidas conjuntamente mediante el alcance de la presente invención y se dan a conocer en detalle en el protocolo de secuencias adjunto de 70 páginas, 10 que comprende 107 secuencias, que por consiguientes parte de la invención.

Otra forma de realización de la invención está caracterizada por que las sondas inmovilizadas o libres se marcan con secuencias que corresponden a la tabla 1. Para esta forma de realización se usan como sondas oligonucleótidos autocomplementarios, las denominadas balizas moleculares. tstos llevan en sus extremos un par

15 fluoróforolinhibidor, de modo Que se encuentran en ausencia de una secuencia complementaria en una estructura de horquilla plegada y proporcionan en primera lugar una seí'ial de fluorescencia con una correspondiente secuencia de prueba. La estructura de horquilla de la baliza molecular es estable lanto tiempo hasta que la muestra se hibrida en la secuencia de captador especifica, lo que conduce a una modificación de la conformación y con ello también a la liberación de la fluorescencia indicadora.

Otra forma de realización de la invención está caracterizada por que se usan al menos de 1 a 14 sondas de ácido nucleico o sus complementarias para la unión de los transcritos o sus complementarias de los genes control.

Otra forma de realización de la invención está caracterizada por que los análogos sintéticos de los genes controlo 25 los oligonucleótidos sintéticos que se unen a los transcritos de los genes control, comprenden en particular aproximadamente 60 pares de bases.

Otra forma de realización de la invención está caracterizada por Que como AON de genes enumerados en las reivindicaciones se sustituyen por secuencias derivadas de su ARN, análogos sintéticos, aptámeros asl como ácidos 30 peptidonucleicos.

Otra forma de realización de la invención está caracterizada por que como marcador detectable se usa un marcador radiactivo, en particular 32p, 14C, 12\ 3Jp o 3H.

35 Otra forma de realización de la invención está caracterizada por que como marcador detectable se usa un marcador no radiactivo, en particular un marcador de color o de fluorescencia, un marcador enzimático o marcador inmunitario y/o puntos cuánticos o una seí'ial eléctricamente medible, en particular modificación del potencial y/o de la conductividad y/o capacidad durante la hibridación.

40 Olra forma de realización de la invención está caracterizada por que el ARN de muestra y ARN de gen control y/o derivados enzimáticos o qufmicos llevan la misma marcación.

Otra forma de rea1ización de la invención está caracterizada por que el ARN de gen de prueba y ARN de gen control y/o derivados enzimáticos o químiCOS llevan distintas marcaciones.

Olra forma de realización de la invención esté caracterizada por Que las sondas de AON se inmovilizan sobre vidrio

o plástico.

Otra forma de realización de la invención está caracterizada por que las moléculas de AON individuales se 50 inmovilizan a través de un enlace covalente en el material de soporte.

Otra forma de realización de la invención está caracterizada por que las moléculas de AON individuales se inmovilizan por medio de interacciones electrostáticas y/o de dipolo-dipolo y/o hidrófobas y/o puentes de hidrógeno en el material de soporte.

Otra forma de realización de la invención consiste en el uso de secuencias de ácIdo nucleico de gen control especificas recombinanles o preparadas de manera sintética , secuencias parciales de manera individual o en cantidades parciales como calibrador en ensayos de septicemia y/o para la valoración de la acción y toxicidad en la selecci6n de principios activos y/o para la preparaci6n de agentes terapéuticos y de sustancias y mezclas de

60 sustancias que están previstas como agente terapéutico, para la prevención y el tratamiento de SIRS y septicemia.

Eslá claro para el experto que las caracteristicas de la invención individuales expuestas en las reivindicaciones pueden combinarse entre si de manera discrecional sin limitación.

65 Como genes control en el sentido de la invención se entiende todas las secuencias de AON derivadas, secuencias parciales y análogos sintéticos (por ejemplo ácidos peptidonucleicos, PNA). la descripción de la invención en relación con la determinación de la expresión génica en el plano de ARN no representa ninguna limitación sino únicamente un uso a modo de ejemplo.

Un uso del procedimiento de acuerdo con la invención se encuentra en la normalización de dalos de medición de la

5 expresión génica diferencial de sangro completa, por ejemplo para la diferenciación entre $IRS y septicemia y sus grados de gravedad (ambas que corresponden a (4]). Para ello se aisla el ARN de los genes conlrol de la sangre completa del correspondiente paciente y una muestra conlrol de una persona de experimentación sana o pacientes no infecciosos. El ARN se marca a continuación, por ejemplo de manera radiactiva con 32p o con moléculas colorantes (fluorescencia). Como moléculas de marcación pueden usarse todas las moléculas y/o señales de

10 detección conocidas en el estado de la técnica para este fin. El experto conoce igualmente las correspondientes moléculas y/o los correspondientes procedimientos.

El ARN asi marcado se hibrida a continuación con moléculas de ADN inmovilizadas sobre una micro matriz. l as moléculas de ADN inmovilizadas sobre una mlcromatriz representan una elección específica de los genes de 15 acuerdo con la presenle invención para la normalización de datos de expresión génica en la diferenciación de SIRS y septicemia.

l as señales de intensidad de las moléculas hibridadas se miden a continuación mediante aparatos de medición adecuados (reproductor de imagenes de fósforo, eseaner para micromatrices) y se analizan mediante otras

20 valoraciones soportadas por software. A partir de las intensidades de señal medidas se determinan las relaciones de expresión entre los genes de prueba de la muestra del paciente y los genes control. A partir de las relaciones de expresión de los genes sUbrregulados y/o sobrerregulados pueden sacarse conclusiones, tal como en los experimentos descritos a continuación, sobre la diferenciación de SIRS y septicemia.

25 Otro uso de las actividades génicas determinadas por medio de análisis de micromatrices con cuantificación posterior para la normalización de datos de expresión génica consiste en el uso para la diferenciación de SIRS y septicemia para el tratamiento posterior electrónico con el fin de la preparación de software para fines diagnósticos (por ejemplo para la determinación de la localización de una inflamación y para la evaluación de la gravedad de la enfermedad de una respuesta inmunitaria individual en particular en infecciones, también en el contexto de sistemas

30 de gestión de dalaS de pacientes o sistemas de expertos) o para la modelación de vías celulares de transmisión de señales.

Para la realización de la evaluación de las micromatrices para los fines de la presente solicitud de patente se aplica lo siguiente:

Descripción de experimentos de micromatrices

(Según la Minimum Informalion About a Microarray Experiment [MIAMEJ Checkliste -nueva edición enero de 2005, basándose en Brazma A al al., Minimum information about a microarray experiment (MIAME}-toward standards for 40 microarray data, Nature Genetics 29, 365·371 (2001) [17), al que se hace referencia por el presente documento en su totalidad)

lectura de Jos portaobjetos I especificaciones técnicas del escáner

45 al eseaner: GenePix 4000B escáner de fluorescencia de luz incidente confoesl (Axon Instruments) b)Software para el escaneado: GenPix Pro 4.0 c) parámetros de escaneado: potencia de laser: canal Cy3· 100%

canal Cy5 • 100% 50 voltaje PMT: canal Cy3 -700 V canal Cy5 -800 V

d) resolución espaCial (espacio de pixelesl -10 11m.

Lectura y procesamiento de los datos

55 En el contexto de los experimentos se hibridaron mas de 1000 muestras de sangre de pacientes. Cada par de ARN (ARN de paciente contra ARN de comparación) se hibridó conjuntamente sobre una micromatriz. A este respecto se marcó el ARN de paCiente con un colorante fluorescente rojo y el ARN de comparación con un colorante fluorescente verde. las imágenes digitalizadas de la matriz hibridada se evaluaron con el software GenePix Pro 4.0

60 o 5.0 de Axon Instruments. Para la detección de puntos, la cuantificación de señales y la evaluación de la calidad del punto se usó el software de análisis GenePix™. l os puntos se marcaron de manera correspondiente a los ajustes en el software GenePix™ con 100 =·buena~, O="hallada", ·50 ="no hallada", -75 ="ausente", ·100 ="mala". los datos brutos se depositaron en un correspondiente archivo ".gpr.

65 Normalización, transformación y procedimiento de selección de datos

e) Transformación '1 normalización de los datos de señales

Para la normalización y transformación de varianza estabilizada de los dalas brutos se usó el procedimiento de

Huber el al. [51, en el que se estimaron los errores aditivos y multiplicativos de bloque en bloque. Para ello se

5

consultan aproximadamente el 75 % de todos los puntos. las señales se transforman a continuación con la función

aresen. (así corresponde la relación transformada de ± 0,4 a aproximadamente una modificación de 1,5 veces (para

numeros grandes es arcsen (x) casi idéntico con elln (2x)).

Rocke DM, Durbin B, A model for measurement error for gene expression arrays., J Comput Biol. 2001 ;8(6):557·69

10

[18) han desarrollado un modelo para la estimación del error de medición en matrices de expresión génica como

función del nivel de expresión, haciéndose referencia a éste por el presente documento en su totalidad. Este modelo

de error permite junto con otros procedimientos de analisis, transformaciones de datos y valoraciones ya una

comparación mas exacta de los datos de expresión génica '1 proporCiona directrices para analisis de fondo,

determinación de intervalos de confianza y tratamiento de los datos de analisis para su analisis o tratamiento

1 S

posterior multivariado.

Debido al modelo de error mencionado anteriormente de Rocke y Durbin [18) han desarrollado Huber W,

Heydebreck A, '1 Suellmann H, Variance stabilization applied to microarray data calibration and to the quantification

of differential expression., Bioinformatics. 2002;18 supl. 1: pag o 96-104 [19) , un modelo estadístico para datos de

20

expresión génica de micromatrices, al Que se hace referencia por el presente documento en su totalidad. El modelo

comprende una calibración de datos, la cuantificación de distintos niveles de expresión así como [a cuantificación del

error de medición. Huber el al. {1g) han deducido para ello una transformación de datos para mediciones de

intensidad de señal y una estadística de la diferencia, que usando la función de area aresen conduce a una

estabilización de la varianza y normalización de un conjunto de datos de señal a través de todo su intervalo de

25

intensidad. Este procedimiento se mostró en part icular por medio de datos de expresión génica de micromatrices, sin

embargo puede transferirse en el contexto de la presente invención también a otros procedimientos para la medición

de la expresión génica.

Por consiguiente, mediante la transformación mencionada por medio de la función de area se compensa la

30

dependencia de la varianza, observada con frecuencia en la evaluación de señales, de la intensidad de señal,

f) Filtrado

las replicas técnicas (múltiples puntos de la misma muestra) en la micromatriz se separaron por filtración de las

35

intensidades de señal corregidas y transformadas dependiendo de su calidad de punto. Para cada punto se

seleccionaron las replicas con la caracterización mas alta '1 se promedió la correspondiente intensidad de señal. La

expresión de puntos con replicas exclusivamente no medibles se caracteriza con "NA" (not 8vailable, no disponible).

Otro uso del procedimiento de acuerdo con la invención consiste en la medición de la expresión génica diferencial

40

para la detenninación concomitante de la terapia de la probabilidad de que pacientes respondan a la terapia

planificada 'l/o para la determinación de la respuesta a una terapia especializada 'l/o a la determinación del final de

terapia en el sentido de una "monitorización de fármacos~ en pacientes con SIRS y septicemia y sus grados de

gravedad. Para ello se aísla el ARN (ARN de prueba y ARN control) de las muestras de sangre del paciente

recogidas en intervalos temporaJes. Las distintas muestras de ARN se marcan juntas y se hibridan con genes de

45

prueba seleccionados así como genes control que estan inmovilizados sobre una micromatriz. A partir de las

relaciones de expresión entre genes control individuales o varios '1 genes de prueba tales como por ejemplo TNF

alfa puede calificarse por consiguiente que probabilidad existe de Que pacientes respondan a la terapia panificada

yl0 si la terapia iniciada es eficaz 'l/o cuanto tiempo deben someterse a terapia aun los pacientes de manera

correspondiente '110 si el efecto de terapia maximo se ha conseguido 'la con la dosis y la duración usadas.

50

Otro uso del procedimiento de acuerdo con la invención consiste en el uso del ARN de los genes de acuerdo con la

invención para la obtención de información cuantitativa mediante procedimientos dependientes de la hibridación, en

particular hidrólisis enzimatica o qulmica, procedimiento de resonancia de plasmón de superfiCie (procedimiento

SPR), cuantificación posterior de los acidos nucleicos y/o de derivados y/o fragmentos de los mismos.

55

Los transcritos amplificados por medio de PCR (también otros procedimientos de amplificación tales como por

ejemplo NASBA) '1 cuantificados de genes control representan otra forma de realización de acuerdo con la presente

invención para la normalización de datos de expresión génica en la diferenciación de SIRS '1 septicemia '1 sus

gradas de gravedad. Las señales de intensidad de los transcritos amplificados se miden a continuación mediante

60

aparatos de medición adecuados (PCR·detector de fluorescenCia) y se analizan mediante otras evaluaciones

asistidas por el software. A partir de las inlensidades de señal medidas se detenninan las relaciones de expresión

entre los genes de prueba de la muestra de paciente y los genes control. A partir de las relaciones de expresión de

los genes subrregulados 'l/o sobrerregulados pueden sacarse conclusiones, tal como en los experimentos descritos

a continuación, sobre la diferenciación de SIRS y septicemia '1 sus grados de gravedad.

65

65 El0196834 01·12-2014

Otro uso del procedimiento de acuerdo con la invención consiste en el uso de las actividades génicas determinadas por medio de PCR u otros procedimientos de amplificación con cuantificación posterior para la normalización de datos de expresión génica para la diferenciación de SIRS y septicemia y sus grados de gravedad para el tratamiento posterior electrónico con el fin de fabricar software para fines diagnósticos (por ejemplo para la determinación del foco de una inflamación y para la estimación de la gravedad de una respuesta inmunitaria individual en particular en caso de infección bacteriana, también en el contexto de sistemas de gestión de datos de pacientes o sistemas de expertos) o para la modelación de vias celulares de transmisión de señales.

Otro uso del procedimiento de acuerdo con la invención consiste en la determinación de una cantidad de ARNm en una muestra que comprende a) aislamiento de los ácidos nucleicos, b) una medición del valor de expresión de uno o varios ácidos nucleicos seleccionados de SEC ID 22 a SEC ID 97; c) una comparación de los valores de expresión de los ácidos nucleicos seleccionados con valores de porcentaje conocidos de los ácidos nucleicos en la cantidad total de ARNm; d) extrapolación de los valores de expresión de uno o varios ácidos nucleicos seleccionados de SEC ID 22 a SEC ID 97 con respecto a la cantidad total de ARNm y d) determinación de la cantidad total de ARNm en la muestra.

Otro uso del procedimiento de acuerdo con la invención consiste en la normalización de una cantidad de ARNm eventuatmente amplificada en varias muestras de sangre que comprende a) una comparación de los valores de expresión de uno o varios ácidos nucleicos seleccionados de SEC ID 22 a SEC ID 97 a través de distintas muestras; b) deducción de un valor para la normalización de valores de expresión de uno o varios ácidos nucleicos seleccionados de SEe ID 22 a SEe ID 97 a través de varias muestras y c) una normalización de la expresión de otros ácidos nucleicos que se aislaron de otras muestras, basandose en la etapa b).

la invención puede referirse además a un kit que contiene una selección de secuencias de acuerdo con SEC ID 22 a SEC ID 97 y/o fragmentos génicos de las mismas con al menos 1·100, en una realización preferente 1-5 y 1·10 nucle6tidos para la determinación de perfiles de expresión génica in vitro en una muestra de paciente, para su uso como genes control.

la invención puede referirse además también a un kit que contiene una selección de sondas de hibridación de acuerdo con SEC ID N.O 1 a SEC ID N.O 7 y/o fragmentos génicos de las mismas con al menos 50 nucle6tidos para la determinación de perfiles de expresión génica in vitro en una muestra de paciente, para su uso como genes control.

la invención puede referirse igualmente a un kit que contiene una selección de sondas de cebador de acuerdo con SEC ID N.O 8 a SEC ID N.O 21 y/o fra9mentos génicos de las mismas con al menos 15 nUcleótidos para la determinación de perfiles de expresión génica in vitro en una muestra de paciente, para su uso como genes conltol.

En su versión más amplia y más general, la presente invención se refiere a las si9uientes formas de realización:

A) al menos un gen control para la normalización de datos de análisis de expresión génica de muestras de sangre de un paciente, seleccionándose el gen control de las siguientes secuencias de ARN : SEC ID 22 a SEC ID 97, en particular SEC 10 87, SEC ID 89, SEC ID 90, SEC ID 91, SEC 10 93, SEC ID 95 y SEC ID 96.

B) Al menos un cebador, derivado de los genes control de acuerdo con A) para la normalización de datos de análisis de expresión génica basados en la amplificadón de ácido nudeico, de muestras de sangre de un paciente, seleccionándose el cebador de las siguientes secuencias de ADN: SEe ID 8 a SEC ID 21.

e) Al menos una sonda, derivada de los genes control de acuerdo con B) para la normalización de datos de análisis de expresión génica de muestras de sangre de un paciente, comprendiendo el conjunto de sondas las siguientes secuencias de ADN: Sec ID 1 a Sec ID 7 asl como sus secuencias de ácido nucleico complementarias.

D) Un procedimiento para la normalización de datos de análisis de expresión génica con al menos un ácido nucleico control, seleccionado de los genes control de acuerdo con A) o un conjunto de cebadores de acuerdo con B) o un conjunto de sondas de acuerdo con C), en el que

a) se realiza in vitro al menos un ensayo de análisis de expresión génica de muestras de sangre de un paciente; b) como base para la normalización de los datos de análisis de expresión génica de las muestras que van a someterse a prueba se somete a prueba conjuntamente al menos un ácido nucleico control en el mismo ensayo; c) se detectan señales de los análisis de expresión génica, que reproducen la magnitud de la expresi6n genica de una multiplicidad de genes asi como del al menos un ácido nucleico control; d) los datos de señales obtenidos en la etapa c) se someten a una transformación matemática para al menos atenuar la variabilidad técnica de los datos de señales; y por conSiguiente e) normalizar los datos de señales de las muestras que van a someterse a estudio.

El Las formas de realización preferentes del procedimiento de acuerdo con D) son: Un procedimiento según O), en el que la transformación matemática de los datos de señal se realiza por medio del arcsen o por medio de una aproximación logarítmica:

,lo

el ensayo de expresión génica se selecciona de:

f} aislamiento de acidos nucleicos de una muestra de sangre: g) eventualmente una amplificación conjunta de un conjunto de ácidos nucleicos control as! como los ácidos 10 nucleicos que van a someterse a ensayo: y h) hibridación de sondas;

,10

15 los ácidos nucleicos comprenden ARNm o microARN;

,lo

los ácidos nucleicos se amplifican por medio de peR, PCR en tiempo real, NASBA, TMA o SDA;

,lo

los valores de expresión de los ácidos nucleicos control y de prueba se determinan por medio de procedimientos de hibridación; y/o

se realiza la medición de los valores de expresión de los ácidos nucleicos control y/o de prueba en disolución o de ácidos nucleicos Que están inmovilizados en un soporte;

,lo

el soporte es una micromatriz, partícula. perla, vidrio, metal o membrana;

,10

35 los Bcidos nucleicos control y/o de prueba están acoplados al soporte indirectamente a través de otros componentes de unión tales como anticuerpos, antlgenos, oligonucleótidos, balizas moleculares o enzimas:

,10

40 los valores de expresión de los ácidos nucleicos control y de prueba, determinados in vitro a partir de una muestra de paciente, se usan como parámetro de entrada para la fabricación de software para la descripción del pronóstico individual de un paciente, para fines de diagnostico, para decisiones de terapia y/o sistemas de gestión de datos de pacientes.

45 F) Un uso al menos de un ácido nucleico control, seleccionado de los genes control de acuerdo con A) o un cebador de acuerdo con B) o una sonda de acuerdo con C), para la normalización de un procedimiento de análisis de expresión génica para el diagnóstico de enfermedades con reacción inmunitaria sistémica.

G) l as formas de realización preferentes del uso de acuerdo con F) son:

Un uso según F), en el Que las enfermedades se seleccionan de: septicemia, septicemia grave, choque septicémico

o fallo multiorgánico:

,lo

en un procedimiento para el diagnóstico in vi/ro de SIRS, septicemia, septicemia grave, choque septicémiCO o fallo multiorgánico en un individuo usando conjuntos de ácidos nucleicos control y ácidos nucleicos de prueba, cuya expresión es especifica para SIRS o septicemia, Que comprende las siguientes etapas:

60 al aislamiento simultáneo de los ácidos nucleicos control y de prueba de una muestra del individuo, bl eventualmente amplificación de los ácidos nucleicos control y de prueba, cl determinación de los valores de expresión de los ácidos nucleicos control y de prueba d) una normalización de la expresión génica de los ácidos nucleicos de prueba basándose en los \latores de

expreSión de los ácidos nucleicos control 65 e) determinación de si los \lalores de expresión normalizados del ácido nucleico de prueba han alcanzado un valor especifico para SIRS, septicemia, septicemia grave, choque septicémico o fallo multiorgánico,

Básicamente para la transformación de datos/normalización en el contexto de la presente invención se aplica también lo siguiente:

5 1-Variante: (se propone en experimentos de PCR o también en pequeñas matrices diagnósticas como normalización)

Las señales de los genes control se agregan y a continuación se calcula la relación de las señales de los genes de prueba con respecto a la señal agregada de los genes control. En el caso de señales logaritmicas está constituida la 10 relación entonces por la diferencia.

2-Variante: (por ejemplo Huber el al. (19) en enfoques de "genoma completo· o matrices grandes) Las señales de los genes control se usan para estimar los parámetros de una transformación adecuada o la propia transformación.

A continuación se aplica esta transformación en los genes de prueba. Otras ventajas y caracterlsticas de la presente invención resultan debido a la descripción de ejemplos de realización.

20 Ejemplo de realización 1 Identificación de genes control de sangre y de células sanguíneas Medición de la expresión génica:

Se midió la expresión génica de 372 pacientes de unidad de cuidados intensivos (pacientes UCI). Todos los pacientes se trataron con medicina de cuidados intensivos. A este respecto se consideraron por paciente siete días en VC! como máximo. En caso de pacientes con más de siele dlas en UCI se seleccionaron sietes días al azar. En lotal se introdujeron los datos de 1261 experimentos de micromatrices en los análisis.

Las caracterlsticas seleccionadas de los pacientes están representadas en las tablas 4 y 5. Se realizan indicaciones con respecto a la edad, sexo y categorías ACCP/SCCM. Como muestras de referencia sirvieron el ARN total de lineas celulares SIG·M5. Todas las muestras de pacientes se hibridaron conjuntamente con la muestra de referencia respectivamente en una micro matriz.

Tabla 4: Datos generales de

Están indicados respectivamente la mediana y entre parénteSiS el intervalo intercuartil (lOR) para el registro 1ST (es pOSible seleccionar una o más opciones)

Descripción experimental: Extracción de sangre y aislamiento de ARN

60 01·12-2014

la sangre completa de los pacientes se extrajo en la unidad de cuidados intensivos de los pacientes por medio del kit PAXGene de acuerdo con las especificaciones del fabricante (Qiagen). Tras la extracción de la sangre completa se aisló el ARN total de las muestras usando el kit PAXGene Blood RNA de acuerdo con las especificaciones del fabricante (Qiagen).

Cultivo de células

Para el cultivo de células (muestras control) se usaron 19 cnocultivos celulares (SIGM5) (congelados en nitrógeno Ifquido). las células se inocularon respectivamente con 2 mi de medio Iscove (Biochrom AG) complementado con suero de temero fetal (FCS) al 20 %. los cultivos celulares se incubaron a continuación durante 24 horas a 37 oC con un 5 % de C02 en placas de 12 pocillos. Después se dividió el contenido de 18 pocillos en 2 partes con respectivamente el mismo volumen, de modo que finalmente estaban a disposición 3 placas del mismo formato (en total 36 pocillos). El cultivo se continuó a continuación durante 24 horas en las mismas condiciones. A continuación de esto se combinaron los cultivos resultantes de 11 pocillos de cada placa y se centrifugaron (1000 x g, 5 min, temperatura ambiente). El sobrenadan te se descartó y el sedimento de células se disolvió en 40 mi del medio mencionado anteriormente. Estos 40 mi de células disueltas se dividieron en dos matraces de 250 mi en partes iguales y tras incubación de 48 horas y adición de 5 mi del medio mencionado anteriormente se incubaron de nuevo. De los 2 mi restantes de las dos placas que quedan se añadieron 80 f.l1 en pocillos vados de las mismas placas, que ya estaban preparadas previamente con 1 mi del medio mencionado anteriormente. Tras incubación de 48 horas se procesó únicamente una de las placas de 12 pocillos tal como sigue: de cada pocillo se tomaron 500 ~I Y se combinaron. los 6 mi que resultan de esto se añadieron en un matraz de 250 mi, que contenía aproximadamente 10 mi de medio fresco. Esta mezcla se centrifugó con 1000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente y se disolvió en 10 mi del medio mencionado anteriormente. El recuento de células ~osterior dio el siguiente resultado: 1,5 x 10' células por mi, 10 mi de volumen total, número total de células: 1,5 x 10 . Dado que el número de células aún no era suficiente se añadieron 2,5 mi de la suspensión celular mencionada anteriormente en 30 mi del medio mencionado anteriormente en un matraz de 250 mi (75 cm2) (en total 4 matraces). Tras un tiempo de incubación de 72 horas se añadieron respectivamente 20 mi de medio fresco en los matraces. Tras incubación siguiente de 24 horas se realizó el recuento de células tal como se describió anteriormente, que dio como resultado un número de células total de 3,8 x 108 células. Para conseguir el número de células deseado de 2 x 106 células se resuspendieron las células en 47,5 mi del medio mencionado anterionnente en 4 matraces, Tras un tiempo de incubación de 24 horas se centrifugaron las células y se lavaron dos veces con tampón fosfato sin Ca?' y Mg2+ (Biochrom AG).

El aislamiento del ARN total se realizó por medio del kit NucleoSpin RNA l (Machery&Nagel) de manera correspondiente a las indicaciones del fabricante. El procedimiento descrito anteriormente se repitió hasta que se consiguió el número de células necesario. Esto era necesario para conseguir la cantidad necesaria de 6 mg de ARN total, lo que corresponde a una eficiencia de 600).lg de ARN por 108 células.

Transcripción inversa I marcación I hibndación

Tras la extracción de la sangre completa se aisló el ARN total de las muestras usando el kit PAXGene Bload RNA

(PreAnalytiX) de acuerdo con las especificaciones del fabricante y se sometió a prueba su calidad. De cada muestra se tomaron alícuotas de 10 f.lg de ARN tolal y junto con 10 ~Ig de ARN total de células SIGM5 como ARN de referencia se transcnbieron en ADN complementario (ADNc) con la Iranscriptasa inversa Superscript 11 (Invitrogen) y a continuación se eliminó de la mezcla el ARN mediante hidrólisis alcalina. En la mezcla de reacción se sustituyó una parte del dTIP por aminoalil·dUTP (AA·dUTP) para permitir más tarde el acoplamiento del colorante de fluorescencia al ADNc.

Tras la purificaCión de la mezcla de reacción se marcaron covalentemente el ADNc de las muestras y controles con los colorantes de fluorescencia Alexa 647 '1 Alexa 555 y se hibridaron en una micromatriz de la empresa SIRS·lab. Sobre la micromatriz usada se encuentran 5308 polinucleótidos inmovilizados con una longitud de 55 -70 pares de bases, que representan respectivamente un gen humano y puntos control para el control de calidad. Una micromatriz se subdivide en 28 submatrices con un patrón de 15x15 puntos.

La hibridación y el lavado o secado posterior se realizó en la unidad de hibridación HS400 (Tecan) según las indicaciones del fabricante durante 10,5 horas a 42 OC. la disolución de hibndación usada está compuesta de las respectivas sondas de ADNc marcadas. 3,5x SSC (Ix SSC contienen cloruro de sodio 150 mM y citrato de sodio 15 mM), un 0,3 % de dodecilsulfato de sodio (VN), un 25 % de formamida (VN) y en cada caso 0,8).1g ).11-1 cot-1 de ADN, ARN·t de levadura y ARN poli-A. El lavado posterior de las micromatrices se realizó con el siguiente programa a temperatura ambiente: en cada caso lavar durante 90 segundos con tampón de lavado 1 (2)( sse, un 0,03 % de dodecilsutfato de sodiO), con tampón de lavado 2 (1x SSC) '1 finalmente con tampón de lavado 3 (0,2x SSC). Después se secaron las micromatrices bajo una corriente de nitrógeno con una presión de 2,5 bar a 30 oC durante 150 segundos.

Tras la hibridación se leyeron las señales de hibridación de las micromatrices con un escáner GenePix 4000B (Axon) y se determinaron las relaciones de expresión de los genes expresados de manera diferenciada con el software GenePix Pro 4.0 (Axon ).

5 Evaluación:

Para la evaluación se determinó la intensidad promedio de un punto como el valor de mediana de los correspondientes píxeles de punto.

10 Preselección de mu(!stras de genes:

Para una primera preselección de las sondas de genes se realizó la corrección de errores sistemáticos según el planteamiento de Huber el al. (5). A este respecto se estimaron los sesgos estadísticos aditivos y los multiplicativos dentro de una micromatriz del 75 % de las muestras de genes existentes.

A continuación se evaluaron las relaciones normalizadas y transformadas de las señales de las muestras de pacientes contra los controles generales. Es decir, para el j·ésimo de la k-ésima matriz, el cálculo dio como resultado el valor

20 Gj.1t = arcsen(Scy5(j,k» -arcsen(Scy3(j,k»

en el que [Scy3(j,k), Scy5(j,k») designa el correspondiente par de señales de fluorescencia. Para todas [as sondas de genes se calculó a continuación la mediana de las desviaciones absolutas de la mediana (MAD), es decir MAD{G¡." ... , Gj.1 2fi,), Y el 10 % de las sondas de genes se seleccionaron con la MAD más pequeña. Como segundo criterio 25 para la preselección se consulta la intensidad de señal promedio arcsen(Scy5(j,k)) + arcsen{Scy3(j.k)). En los análisis posteriores se consideraron únicamente sondas de genes, cuya mediana de la intensidad de señal promedio se encontraba en el denominado intervalo de señal dinámico, preferentemente entre 6 y 8 (en la escala logarítmica).

Selección de los genes control:

30 Para [as sondas de genes preseleccionadas se calcularon cantidades relativas, colocándose el valor de expresión más alto en 1, A continuación se calculó la medida de estabilidad génica M de Vandesompele el al, (6). Por medio del procedimiento por elapas descrito igualmente en Vandesompele et al., en el que en cada etapa se separa el gen con la estabilidad más baja, se dispusieron las sondas de genes según su estabilidad, Como valor umbral superior

35 para la selección de las sondas de genes sirvió de base el valor (redondeado) 0,6 para el valor promedio de la medida de estabilidad M (Tabla 6),

la definición matemática para la medida de estabilidad génica M era de acuerdo con Vandesompele el al.

40 Para cada combinación de dos genes control internos j y k, se proporciona una matriz ~de m elementos, que está constituida por las relaciones de expresión transformadas con 1092 al a ... (ecuación 1), la variación por parejas V,.. para los genes control j y k se define además como desviación estándar de los elementos Aj,. (ecuación 2), siendo SO la desviación estándar. La medida de estabilidad génica MJ para el gen control j es entonces la media aritmética de todas las variaciones por parejas V~ (ecuación 3):

(para todas las j,k se aplica E (1 ,n] y j -;. k):

(1 )

(2)

i;v,

Mj=~ (3)

"-1

Se determinó una agrupación de 76 secuencias especificas con actividad genica no modificada que corresponden a las SEC ID N.O 22 a SEC ID N.O 97, que son parte constituyente del protocolo de secuencias adjunto.

Ejemplo de realización 2

5 Ensayo de estabilidad de los genes control por medio de ensayos de expresión génica de pacientes con y sin septicemia.

Se muestra en este ejemplo de realización que los genes control determinados en el primer ejemplo de realización son estables también en pacientes tratados con medicina de cuidados intensivos con y sin septicemia. Para ello se 10 consideraron datos de micromatrices de 118 pacientes. En lotal se analizaron 394 dlas de paciente (micromatrices), considerandose como máximo siete dfas por paciente.

Tabla 7: Datos generales de los pacientes

Numero de pacientes

micromatrices 118 394

Mortalidad

31 263%

Sexo M/H

41n7

Edad en años mediana

IOR 68,5 14,8

15 Tabla 8: Distribución de los días de paciente segun la categoria ACCP/SCCM asl como otros parámetros

Está indicado respectivamente la mediana y entre paréntesis el intervalo intercuartil (laR)

Para demostrar la aplicabilidad de los genes control por medio de una comparación de pacientes con SIRS y septicemia se seleccionaron los siguientes genes de prueba (véase la tabla 9).

Estos genes de prueba se han descrito en la bibliograffa científica en relación con septicemia.

Para los análisis estadlsticos se seleccionaron 6 pacientes con SIRS grave (SIRS + disfunciones orgánicas) y 9 pacientes con septicemia grave (septicemia + disfunciones orgánicas) (tabla 10).

en¡;ePa¡~;;i85i5el intervalo intercuartil (laR).

La normalización de los diez genes de prueba se realizó por medio de los siguientes cinco genes control seleccionados al azar. Para ello se usa el procedimiento de Vandesompele et al. (6) (tabla 11).

Una comparación por medio de la prueba de t de dos muestras al azar proporcionó el siguiente resultado (tabla 12)

Para demostrar la reproducibilidad de los resultados se repitió la comparación estadistica, seleccionándose al azar de nuevo cinco genes control (conjunto 2) (tabla 13)

Tras la normalización por medio del procedimiento de Vandesompele et al. se obtienen los siguientes resultados para la prueba de t de dos muestras al azar (tabla 14):

Los resultados muestran una reproducibilidad muy buena de los resultados. En las dos comparaciones, los marcadores idénticos son significativos hasta el nivel del 5 % o ellO %. 5

Ejemplo de realización 3

Detenninación de los valores de estabilidad de genes control seleccionados mediante sus cebadores especificas por medio de PCR en tiempo real

Aislamiento de ARN A partir de sanore completa se aisló ARN con ayuda del kit PAXgene (preAnaMiXl segun las indicaciones del fabricante.

15 PCR con transcriptasa inversa cuantitativa (RT ·PCR)

Mediante transcripción inversa se transcribieron con ayuda de un cebador de oligo·dT ARNm, independientemente de su secuencia, en AONc. Las cadenas de AONc Que se producen a este respecto de manera complementaria al ARNm usado se usaron a continuación como moldes para distintas reacciones de PCR.

a) Para la mezcla de reacción se pipetearon conjuntamente los siguientes componentes:

)19 de ARN concentrado 10 )11 de HzO 1 )11 de dNTP (dGTP, dATP, dCTP, dTTP)

25 1 )11 de aligo dT (0,5 )1g/)1l)

b) 5 min a 70 oC, a continuación 5 min hasta hielo

e) A continuación se añadió la siguiente mezcla:

30 4 )11 de tampón RT 2)11 de DTT 0,1 M 1 )11 de ARNasa out (inhibidor de ARNasa) 1 )11 de transcriptasa inversa SuperScript

35 d) Incubar durante 1 ha 42 cC

el Incubar durante 15 min a 70 ce

Reacción en cadena de la pollmerasa

40 Con ayuda de la PCR se amplificó la sección de ADN seleccionada y se cuantificó a continuación y con ello se determinó la intensidad de la expresión génica de los genes control:

Para la PCR se usó el sistema de AccuPrime Taq AON polimerasa de Invitrogen. 45

Para una mezcla de 25 )11se pipetean conjuntamente los siguientes componentes en un tubo de 200 )11:

2,5 )11 de 10X tampón para PCR AccuPrime 20 )11 de ARNasa libre de H20 de molde de ADN diluido 1:10 (aproximadamente 0,82 ng/J.lI)

1 .'

1 pI de mezcla de cebadores (en cada caso 0,5 )11 de cebadores directos/inversos que corresponden a la tabla 2) 0,51-11 de AccuPrime Taq ADN polimerasa

Se realiza el siguiente programa en el termociclador de PCR en tiempo real (corbett research RG 3000):

5 94 oC 2 min 94 oC

30, }

58 oC 30 s 30 ciclos 68 OC 1 min 68 OC 2 min

10 En primer lugar se desnaturalizó completamente a 94 oC el molde de ADN y se activó la enzima. A continuación siguieron 30 ciclos de amplificación que están constituidos por desnaturalización a 94 ce, apareamiento a 58 ce y elongación a 68 OC. A continuación de la peR se aplicaron las muestras en un gel de agarosa al 1,5 % para comprobar a través del tamaño de los fragmentos la autenticidad de los productos.

Tabla 15: Valores de estabilidad de genes control seleccionados (base de ARN) determinados mediante cebadores

25 Sepsis·like conditions and systemic infections

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Protocolo de secuencias

<110> SIRS·lab GmbH

5

< 120> Genes control para la normalización de datos de análisis de expresión génica

<130> SL0630

10

<140> <141>

<160> 107

15 20

<170> Patent Prepare 0.5.2 <210> 1 <211> 67 <212> AON <213> Hamo sapiens <400> 1 gagttagagg ccagcctgge gaaaccecat etetactaaa aataeaaaa! ceaggegtgg 60

tggeaea

67

25

<210> 2 <211> 69 <212> AON <213> Horno sapiens

<400> 2 ttataggtgt gagetaetgt aeeeagectt aaectgttte acagttgatt ataetteatg

60

30

etgttttec 69

35

<210> 3 <21 1> 69 <212> AON <213> Horno sapiens

<400> 3 ccacactacc acattaaaaa aattagaaag tagccacgta tggtggctca tgtctataat

60

eeeageaet

69

40

<210> 4 <2 11>64 <2 12> AON <213> Homo sapiens

45

<400> 4 cccaaatget gggattaeag acatgaacca ccacgcctgg ctggaatact tactcttgtc 60

ggga

64

50

<210> 5 <211> 65 <212> AON <213> Horno sapiens

<400> 5 acgtagatag ag9tggagac aggaaaaaga ctaagccaga cgt99t99ct

cacacctgta 60

55

atece <210> 6 65

<211>70 <212> ADN <213> Homo saplens

5

<400> 6 gttcaaaacg aagactagct

tcccagccct

10

<210> 7 <211>70 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 7 cttggcctcc caaagtgcta

15 20

t tgaggggct <210> 8 <211> 19 <2 12> ADN <213> Homo sapiens <400> 8 tgacagagcc agtgggaag

25

<210> 9 <211>19 <212> ADN <213> Homo sapiens

30

<400> 9 aggtgtgagc tactgtacc

35

<210> 10 <211>20 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 10 gctaaattcc acactaccac

40

<210> 11 <2 11>20 <212> ADN <213> Homo sapiens

45

<400> 11 ccacgctcgt ctccaactcc

50

<210> 12 <21 1> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 12 cac:tgtgc:ct gagctctgac:

55 60

<210> 13 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 13

attaaaattt catgccgggc gcagtggctc acgcctgtaa

60 70

gtattatggg cgtgaaccac catgcccagc cgaaaagctt

60 70

19

19

20

20

20

gatgaattgg gggatagatc

5

<210> 14 <211> 19 <212> ADN <213> Homo sapiens

10 15

<400> 14 gagatggggt ttcaccatc <210> 15 <211> 19 <212> AON <213> Homo sapiens <400> 15 caattctcct acctcaacc

20

<210> 16 <211> 19 <212> AON <213> Horno sapiens

25

<400> 16 ggattacagg catgcaacc

30

<210> 17 <211> 20 <212> AON <213> Horno sapiens

<400> 17 ttgagtgcag cggtgtgaac

35

<210> 18 <211>21 <212> AON <2 13> Horno sapiens

40

<400> 18 ccacagcata atgaattctg

45

<210> 19 <211>20 <212> AON <213> Horno sapiens

50 55

<400> 19 tgttggccag gctggtttcg <210> 20 <211>19 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 20 cctgacctct ggtgatctg

60

<210> 21 <211>21 <2 12> AON <213> Horno sapiens

<400> 21

e

ttagaaaagt cctagaaatg e

<210> 22

<211> 2015

<212> ARN

<213> Horno sspiens

<400> 22

cccggaccga ggcaggacct caccccgcgc aggceettce eaggtttgcg cgegggggce gcgtcgccga ggtttgaggg cgccggagac aagaagagcc tctggcccgg gggctgctgg cagttgccag actatgttta cgcttctggt ggggtttcct cattgcgcaa gaggtccaaa taeatcaaaa gaagaagcaa actttttcat tctggagctc ttcactcccg gcaacctaga tgaggaagcc agagagattt ttgtggatga ttcagctaaa ggaccaacca caaaatcaga ccttctgact ggattaattg ctgctggagt ctatctttgt ateactaagt gtaataggct aagggggagg cacactccct ccatcatttt attgeegect tetgtggagg atgcaggatt cagaaaacac agtgtttcac caccaccacc atttaaaaaa tctatgtctc t cccatctca tttgtgttat ttgataggcc gggcatggtg ggccaggagt tcgagaccag cctg9ccaac aaaaattacc taggcgtcat ggggcatgcc aggagaattg ctcgaacctg ggaggcagag ttccagcctg ggcgacagag caagaetcca gaaaagaaga agaaaagaga agaaggagaa gaagaagaag aagaagaaga ccacaaaaga caaggaataa aggaagaata agtccatgta gtgttccccg ggcgcccctc tgcgaacccc atecagaccc tgcggagagc gaggcccgga cgagggcctg gcggccgaag gaaccgcccc aacatgtgeg gggggaeaca gtttgtttga tctactcagc caactgccca cagttaccct ggcttctaag catgcgggag aagaagtgtt acatagacgc cttctgtata atagatttga aagagagtgc aatgaagaac tttgcaatta agataaaacg attgcatttt ggcaggaata tggcaacaga gagaaaatag atgttatggg atttttggtt atttttggat tacttggcta acaacatcca tgctcttcag ccgtctatga cagaagacct gaggaggctg ccttgtctcc acettettat gaacaggeag tggege tgac atatcctggg cacacaaaag gatttagggt ctgactacct tgtcattttg gtataagaaa gctcatgcct gtaatcccag cactttggga atggtgaaac ccggtctcta ctaaaaattc tgtagtccca cctacttggg aggctgaagc gttgcagtaa gctgagatca cgccactgca tetcaaaaat aaaataaaaa aagaaagaaa ggagatgaag gaggaggagg aggagaagga catgactatc caacttttta tgacaaactg ctgtaccaea gaagttetgt etgcatcttg

11

60 110 180 140 300 360 410 480 540 600 660 710 780 840 900 960 1010 1080 1140 1100 1160 1310 1380 1440

gacctgaact tgatcattat taagaagaaa gcactttttt aaagagcata ggtagaatta tttcttgtgt tgaatattaa ggctgggcgc agtggctcac tcacctgagg tcaggagttt aaaatacaaa agaaattagc aggct:gaggt gggagaatcg tgccattgca ctccaacctg aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa

<210> 23

<211>356 5 <212> ARN

<213> Hamo sapiens

<400> 23

gttttgtttg ttttgttttt gaatgagaaa atgagaaaga tgtggcctat aaaggctaac ctggcctaga acatgggtgg aacagtttaa aactcagctt gggaggccga 99cg9gcgga

<210> 24 <211>451

<212> ARN

<213> Hamo sapiens

<400> 24

aatggagacg agttcttact ctctcccacc teaetctccc taatccacaa actgtctaga aaataaatct ctttgtggca actacaataa agattacata atttactaat ctcagcgaat attcaacctt ttactcaatc aaactttaag taattcctte

<210> 25 20 <211> 397

<212> ARN

<213> Hamo sapiens

<400> 25

cagcttgata agagactttt

gtaatgtttg ttttaatggt

gtgaactctt tggatccttt

aaaagcaagg atgtctaacc

gcctgtaatc ccagcacttt

gagaccagcc tggccaacat

cagacatgat ggc999t9cc

cttgaactcg ggaggtggag

ggcgacagag tgagactcca

aaaaaaaaaa aaaaa

ttttttaata ttttttaaga attattatta ttattggtgg atattcactg tctgaccctt cttcttacta gggctcagta tgccgggcgc agtggctcac tcatgaggtc aggagttcga

atgttgccca ggcaagtctc aaagtgttgg gattaeaggc agcaaacaac caaacatatc tgattctatt acagatcact caccagactt taaataattg gctcaattta ttgagcattt ctgaatcatc tgtataaatt actgggtacc n

tgactctata tccttgcagt tcaaaaaaaa tctttcttat gtacagataa aggttataga attaagatta tccaaagtca gggagggata ggtgggcgga ggcaaaaccc cgtctctaca tctaatccca gctactgggg gttgtagtga ggcgagattg tctcaaaaaa aaaaaaaaaa

gctgtaaaga aggagaagag tagtagtgat agagactgta tagagaaagt ttgtcaaccc agtgtctgaa tgaaggaagg gcctgcaatc ccagcaccct gaccagcccg gccaac

aaactcctgg gttcaagcga gtgaggeaet gcacctggcc gagaattttt ctgagtgtaa ggtatgcctg attaaagtgg caatccactg aaataacagc acacctgacc aaatgtctta ggaaataaca gttgtcatac

1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2015

60 120 180 240 300 356

60 120 180 240 300 360 420 451

tttttttttt tttttgagac gtagtctttc tctgtcacct aatcttggct cactgcaacc tccaectccc aggttgaagc ctgagtagct gggattacag gcatgcacea tcacacctga cggggtttcg ccatgttgcc aggetggtct caaaetcctg cttggcctcc caaaatgctg ggattacagg cgtgacacta gtaccatata caagcctgca ataaatctgt ttagacataa ctgtgggaca aatccctaga attgctgggt caaaggg

<210> 26

<211> 457 5 <212> ARN

<213> Horno sapiens

<400> 26

tgaccaggat ctcaetcagt cactcaggct agagtgcagt cagacttgac etcccagact caggtgattc teccacetca tacaggcgtg cgccaccacg cctggactaa tttttccata tgccccagge tggtctcgaa ctcttgtgct taagagatcc gtgctgggat tacaggtgtg agccacggtg cctggcctat caataactta caaatgaaga aactagggct tacagaggtt tggtaggaaa tcagaattct aacctaeate tatgcaacce ttecattaaa aacatgtagg ctgcaaaaaa ecacagg

<210> 27

<211> 2811

<212> ARN

<213> Horno sapiens

<400> 27

acaaggcagg atgtgtgcgt gggaggaa9a ttgacagtga ccaggtatga ggtetgaagc aectggaaea gaaaggaeag aegtgtagaa tcaaaggaet gacageaggt egaatgtgag eaggaetcaa gtgecateet ggetgeetca aaaaatgata aaagataaea atagttaetg etttgtggcg taeatgtgat cagtaggata tccaagtgga aatgcceagt aagccttaga gagaaaaatt gaggttgaae cataatatgt ettteeeete ttgeettctt tcattggcct aagtggtcct aaatgctact cgactgttgt ttgcacccca ccttttecea aaggtaatet ttaaggtggt taacctgeag ctttgetgtt eaaagcttgg aaettaatga gtactteaae ttgagteaaa ttagtattgt cetetatgtg tgactetagg tcttaeaaaa tcaaggtgtc

aggttgaagt gcagtggtgc gattctcctg cctcagcctc ctttgtattt ttagtagaga agctcagcca atctgcccgc gt gcctggcc tggtctttca tgtcatagaa gtgagtgtat

ggcatgatca tggctcacca gcctcccgag tagctacgac gaaacggggt tttaceatgt tcctgcctca cactcccaaa actatetett t caactctct aagggttaag taggggcaca cgacatctgt gctccttcca

ctgagcetgg acggggga9a gaeagatgtg ggeaeaetgc gaatgaggga gggaaagaat etgtctteea gagggaaagg gaattteatt ttggaeattc cataaggatc tggatcteaa gaateatgta ggtttctett gctgatgctg t cttagtttg gtagacttgc atggattggg ettcecacta ecagtttgcc teeaaatate etaatagtat etttetcatt gagactteet

60 120 180 240 lOO 360 197

60 120 180 240 lOO 360 420 457

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720

tattaataaa atatttcttc tattaaattc cacacacaat gactgtttat tgaatgaatg caattcatcc taagcagcta attttctcct tgtgtgtgtg tgtgtctgaa atgtcccatc aaagaagaaa aatacctatt aagtgttttg atatcattta ttcctgaaga gaaatctaga ttggtcctta atgctaatat agataccagc cgaaggttgt agacacacag egtatgtaea cacateteaa gcctaaccca gactgaaaag atcattatag aaagcagggc tggcccaagg ctetgateag tgttgtagct caaatataaa aatgateeee tegttettct cceataaaaa cagtgeggea ttcecagagg cgaeagaacc caagaagacc acctgggatg tcttacataa tetctattct ggttcaagcc agcatcacag ttgtattttg agaaccctca tccgttagea agttgteatc tgtttgagaa agattttgat ttctccaggg gctttttaaa aagatgaatg aaaccaeaag caaattetet tetetcttee tggceatetg tgcattatgt teccattgcc gaattcagaa aettcaaatt ataaaggaca etgteecetg tgetgetgcc agatteettc ettgagcttg teegtatetg tgagaaaatg cagggaaaaa aatgaeagcc attgeaeaag aatgatactt tgagaataea gttaaggggt gtgtgagaat aacaeaagct gtcactgcaa atgt:gaacat ttaatatttg getcaattaa aatttgaaaa taccttttgt acggaatact cttttaaaat atggagaata tggggaaatt taaaacctct ctacctgttt ggeacaacag ggeaaaggat tcacttgcat ctctgtgttt tcacatgatt aaageagaca gaaeaagaga aaaatattga geeaggcect ggggaagtgg gtctagggca gtgctatcca atettttggc

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aegaatgata getgatgagc t

780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760

2811 ccccgtcacc caagctggaa caggtttaag tgattctcct actacaccca gctaattttt ctggtctcga actcttgacc acaggcgtgc gactgcgtcc agctaggaga tcttgtgtgg cagggggagt ggcc

5

<210> 28 <211>394 <212> ARN <213> Horno sapiens <400> 28 ttttttggag acggagtcgt

tcactgcaaa ctctgcctcc

tgggattaca gaagcgcgcc

gtttcagtat gttggtc.gg

cctcccaaag tgctgggatt

taagagacta aacataggaa

tcaggggtag gacactgggg

10

<210> 29 <211>497 <212> ARN <213> Horno sapiens

<400> 29 gcacgagaag agtctcattc

ctgctgtagc cagecaagat

aatctagcct gaccctcata

aaatagttag gaatgccctt

tgccagcttt gatccagccc

tacactgtaa agaatttcca

gggaggccga ggagggcgga

tgaaactccg tctctactaa

15

gtcccagcta cttggg.

20

<210> 30 <211>206 <212> ARN <213> Horno sapiens

<400> 30 tgagacagtg tcttactcag

tctaeetatc gacctgagac

gtgatctcgg ctccctatag

tcacgagtag ctgggattac

25

<210> 31 <211>376 <212> ARN <213> Homo sapiens

30

<400> 31

caggaaccct ttgtagttag gagtgcacct aggccctcaa tctgtggttg cctctgagac ggcagaactg aagctcttat ctcagtctcg g.gtt.tggg ggctgggcgc ggtggctcat tcacaaggtc aagagattga aaatacaaaa attagctggg

ttgggactac aagtgtgtgc agggtctccc cttctgttgc cetccacctc ttgggcccaa agctgc

cgcatggtgt ggatctcggc gccccagcct cccaagtagc gtatttttag tagagacagg tagtgatcca cccgcctcgg ggcctgattc acatatattt tggcaggttt cttctgccac

ttggctggca tgtttacttg aaaggatttt tttttacctc gaacatccat gctagtataa taaatggtgg acagagctct gc.gggttgg ggggc.gtgc gcctgtaatc ccagcacttt gatcatcctg gccaacatgg catggtggca cgtgcctgta

caccatgccc ggctatctta ctgggctgga gtgcaccggt gtgatcctcc aacctcagtc

120 180 240

60 120 180 240 300 360 420 480 497

60 120 180 206

tttttttttt taagtgtcag tgttcataaa

aagtgttact cggccgaacg cggtggctca

ggcgtgagcg accgcgccca gccgaacttc

gtacagtgag gtggtaacta gcaaaagcta

gctctttcac ttatctttgt ggctttacgc

tcatttgtaa aaggaagata ataacagtgc

gagatagtat atataa

5

<2 10> 32 <2 11 >337 <212> ARN <213> Homo S8piens

<400> 32 tttttttttt ttttattttt agacaaagtc

gcacaatcat agctcactat aaccctcgac

gcctcccgaa tagctgggac tacaggcatg

tgtttttcat agagacagag tctggccatg

cagcctctca aggaatttgc attgttttta

10 15

aagtgggaga attgaacagc cctaaaatca <210> 33 <211>381 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 33 aagatggagt cttactctgt cgcccagact

tccaactcct gggttcaagc aattctcctg

gtgtgcgccg ccacacccag ctaatttttg

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taagtgctgg gattacagtt gtgagccacc

gcatcctaat ggtctgtagt atagacatat

caaaaagaag ctaaaaaaca t

20

<210> 34 <211> 494 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 34 ttatttggct aaattattga tcctacttca

25

gtggtgctga agtctgggga gtgagtttag

ggcccttttt ctttttcaag gatgggtata cacctgtaat tccaacactt tgggattaca tgcctcttaa atccagggtt ctccctgtca tgagatatga ctgcctgggt acatatccca aaattactta acctctttat gattgtttct ctatatatag ggtttttatg aagaataaat

ttgctctatt gcccaggctg tagtgcagtg ctcccgggct caagcaatcc tcccacctca caccaccaag cctggctaat ttgctatttt ttgcttaggc aggtttcgaa ttccttgcct atgaaaaaac acacatatgg tgaacagtaa agtagtc

ggagtggtgc gatctcggct cactgcaacc cctcagcttt ccaagtagct gggactacag tattttttag tagagacagg gcttcactat cctcaggtaa tctgcctgcc ttggcttccc acgcccagcc agcactacct tttctattgt ttatagggga aagaaaggaa tagatgtggg

gagggaaagt gtaccaggca gttttggtgg tcttcagact attcttggcg acatcaccag

60 120 180 240 300 360 376

60 120 180 240 300 337

60 120 180 240 300 360 381

60 120 tgttgcaagc accaeeattc atctggaaca ctccttttgt caggaaagcc tttatggtgt cttctccctg gttccagttg tattttccag ecaggcatgg caggcggatc acctgggatt ctcttctgag agta

<210> 35

<211> 521 5 <212> ARN

<213> Horno sapiens

<400> 35

tttttttttt tttttacttg ttttgaattt ttatgcctaa atctataaga aataacagae taaggtagac aeaaaagtca caagttggca gggcacagtg ggctgatcac gaggtcagga tactaaaaat acaaaaatta ggaggctgag gcaggagaat tgcctcactg eact ccagec

<210> 36 <211>351

<212> ARN

<213> Horno sapiens

<400> 36

tttggtctct ctttttatat gtetgaacag aatgggcatg gtgttcttga ccggcatata ttccctattg ctatgtgaac ttaettacct tececataca gcatccatac tgtgcctctt

<210> 37 20 <211> 451

<212> ARN

<213> Horno sapiens

<400> 37

tttttgagac acagtcttgc tccacctccc aagttcaagc

ccagttaggc actttttgtc cctggtaaga ccctagagtg gggacctaag gctcagcaaa ggctaaagga gtggceagag cettgggaet tctttagatt ttcacggctc ttactgctgt tggttcacgc ctctggtccc tgeaetttgg gggagttcgg gaccagcetg tccaacatgg

ataatagatt aagatttatt tattcagtaa tggtattaac ttaaaataat aatacaagca aaatctataa tcatagaagg aaatttcagc gtaaggttgc aaaaggtgag cagaatgatt gctcatgcat gtaatcccag cactttagga gttcaagacc agcctggcca acatggtaaa tccgggtgta gtggtgcatg cctgtaatcc tgcttgaatc caggagggag agattgtggt tggggaacag agaaaggccc t

ttattaactt ttgtagtaaa taagtataat gtggctcatg cctgtaatgc caacacatcc ttgttagtgt gcatgtattt taactgatat atataatcca ttactttgaa tcactacaca gacttccaat tcctgccccc aacaattaat gcggtcctct gtgagagctt cctgagagac

tctgtcaccc gggctggaat acagtggtac aattctcctg cctcagccte ccaagtagct

cttgaccttt agggcagaat cctttgctgc tacttaacag gaggeegagg cgaacetcgt

gcgataacaa atattgagaa eactgetaga aaaaatttaa ggccgaggca accccatctc cagctactcg gagccaagat

t ttataaatt agccttgtat aaatgataag ttttcacatt attgtgacca

aatcttggcc aggattacag

180 240 300 360 420 480 494

60 120 180 240 300 360 420 480 521

60 120 180 240 300 351

60 120 geaceeaeea eeaegeeegg ttaacttttg gttttaagae aggctagggt geaatggtgc eatettgget eaeegeaacc aattctcctg ccteageete eegagtaget gggattaeaa ctaatttttg tatttttagt agagacggag ttteaccatg ctcctgaeet caagtgatce gcccgeetcg gcctcccaag agccaccgct cceageegca eegttttttt e

<210> 38

<211> 674 5 <212> ARN

<213> Horno sapiens

<400> 38

ttatttggtg ttaaacaggt ttaatgaegg tcatggeaae atcgeccatg ateaacgtgt tetgttctgg ggaaggggge tettaaaaag tatagcteaa gttgggagtg cagagggaat gcctgtgtcg aagtgcagga gcccccacce ccatacteac gaaagaagg9 gtgcatgaac tccccttagt ccacaggcgc tcttcacact ceat ettgta gceccagcag gagctatttt aggcgtgagc cactgtgccc agctgagatc tgatggtttt atgagatctc actttttgcc tgctaeeatt tatgtaagat ttccatcatg actgtgaagc ttcecccace atatggaatt tttctttgga anttcnaaag eeetccettt acaettgeaa t9a9999999 gceecgtaec ccaattcgce ctttggtgga gcccgccgtt ttaa

..;;210> 39 <211>330

<212> ARN

<213> Horno sapiens

<400> 39

tttttttaga aagaagtggg gtctcacatg ctgtccaggc eaagccatcc tetcacctcg gcctcccaaa 9tgct999at ccggccctca attaataact t gacttaaga taatctagtt gcatacaaaa actatgcttc atttcttcct tccattattc tttgtgttat aagcccattg acacagttta taattattgc taaateagag ataagagaat aaaatatcta

<210> 40

20 <211>446 ..;;212> ARN

<213> Horno sapiens

<400> 40

ggtgtcttge tctgttgcce tecaectcat gggttcaagc gegeaeeeea eeaeacccgg ttggccagge tggtctggaa gtgetaggat taeaggcgtg

tttttggcac aatgaaaaat aaaggcaggg tgaatcactt 9gg9agaaaa eeetteeget ctgagtccag ccectetggg ctccctgtgg cccaaggccc eegaaaagtg etgggattae aaaaagagga gctcccctgc gtgacttget ecttcttgcc gtaagttcaa ttaaaettct agggtcccaa aatacttect gtegttttaa caattecctg

tagtctcaaa ctcctgggct tcaggcatga gccaccactc catattaact taatttcata tatcatgaat atggcaeett ttatgcaggt gggtgtcttt

180 240 300 360 420 451

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 674

60 120 180 240 300 330

ccagtttgta tttatttatt tatttattta ggggggtgca gtggcgcaat ctcagctcac tctcctgcct cagcctcctg agtagctggg attttttgta. tttttagtag agacagggtt cctgacctca tgatccgtcc gcctcagcct actgcgcctg gcccaattta tttttttttg acagctttcc ctccttttgt ggggtcccca gtgcctccac acagttctga agtten

<210> 41

<2 11 >406 5 <212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 41

ttttttetga gacggagtct tgctctgtcc tctcactgca agctccgcct cccgggttca gctgggacta caggcgcccg ccaccacgcc gggtttcacc gtgttagcca taatggtctc agccteccaa agtgetagga ttaeaggegt tttcaaaaac attgtggcaa tggacaaaat cgctctgtga tacgtgtacc aacgacaagg

<210> 42 <211>320

<212> ARN

<213> Horno sapiens

<400> 42

caeacccagc taactttttg tattttttgt gtcttcaact tctgggctca agcaatccac caggcgtgag ccattgcgcc cagcctcaaa atgctagaaa attagtatca ttcctttaca t ccttagact tggtcctaaa tgatt tttgg aggataaaga taaaagaatg

<210> 43 20 <2 11>448

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 43

tttcttttag acagggtctc actctgttgc ct cactgcag cctcaacgtc ttgggctcaa

tttagagaca gagtctcgct tgcaacctcc acctcccggg attacaggcg tgtgccacca tcaccgtgtt agccagggtg cccagagtgc tgggattaca tagtttcatt ctcctcacat aaccaagtct cttttcagga

cccaggccgg agtgcagtgg cgccct tct c ctgcct cagc cggctaattt ttgtattttt gatctcctga cct catgatc gageeagcge geecggeeta tcacatgtac aaccgatcat gctgaaataa tgactg

agacagggtt tcaccttatt ccgcctcagt cacccaaaat actcttctac ctaaaatcac atcggaatcc aacttggcca attgtttcaa aacctgaaaa

ccagactgga atgcagtggt gcgatcctcc catctcagcc ctgtcgccta ttcaagcgat tgcccagcta gtcttgatct ggcatgagcc ccaaacagct gagcagacat

cgccatctca ctcccgagtt agtagagaag cacccgtctc eeetecetat tacaatcaga

tctcaggctg gctaggatta cttcagagcc ctaaaatgtt acaccttcac

gcagtcttgg tttcaagtac

60 120 180 240 300 360 420 446

60 120 180 240 300 360 406

60 120 180 240 300 320

60 120

ttgggactac aggcatgctc caccacatcc

nngttttgcc atgctgcttc tcgaactcct acctacaaaa gtgccggaac tataagcatg aataaaatat atcatttatt tttcaaagac attttaaatt gtcttccctg gtacatcatt tatgctannn nnnggtgcat anaangaa

<210> 44

<211> 270 5 <212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 44

tttttttttt tttttgctca cagaatgtat gccgggtgtt gtggctccca cctgtaatcc cacctgaggt caggagttca agatcagcct aaaatacaaa aattagccag gtgtgatggc ctgagacagg agaatcgctt gaatctggga

<210> 45

<211> 386

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 45

taaaataata gaggcatagt ctctctatgt caatectcee acetcagcct cccaaagtgc gccaaeatgg gacatttcta actcgagggt gattgccett gaggagatgc tceeaggtgg tggaaaacgg atttttctgc tgcctctggg cagaggcagc accggcagct taggggaagt tcttteagga tgctctgagg ctgcca

<210> 46 20 <211> 413

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 46

tggtgagaca gagatttact cttgttgccc caccgcatec teeacateet ccgcctccca tgagtatctg ggattacagg catgtgccac agagacgggg tttcatagtg ttgcctaggc gcccgcctct gcetcccaaa gtactgggat

cagaactaat ttttaatcaa atttcataaa aggaccagca aaatcatetg ttgggacttg

agctaatttt tgtattntgc gtaaagatgg 180 ggag9gg9nc aagtaattct gtccacctca 240 agccactgac ccagcttgaa atg9taatnt 300 tagatctacc catganccac agatctgaat 360 gccattacct nnnaatggta cactctacan 420 448

acgtttattt tttaacggag ttaattcatg 60 cagcactttg ggaggctgag gcgggtggat 120 ggccaaaatg gtgaaacctc atctctacta 180 atgtacctat aatcccagct actcaggagg 240 270

caggctggtc teaaaaetec tggceteaag 60 tgggattaca ggcatgagcc actgtgccta 120 attgtcaggc catgtaggaa agggagcaga 180 cagatttgtc ctacttgata gattccaaaa 240 gacactgaaa aaagaacctc cacatgagtt 300 catggcttcc actgcgtgtc taggaagcgc 360 386

aggctggagt gcaatggcat gatctcagct bU ggttcaagtg attcteetgc ctcagcctcc 120 cacgcccggc taattttgta cttttttagt 180 tgatctcaaa ctcctgacct caggtgatct 240 tacaggcgtg agccactgcg cccggcctac 300

taaatctagc caatcttagc tggttcatta 360 ttagtggagc tctcctagat agt

<210> 47 <211>438

<212> ARN

<213> Horno sapiens

<400> 47

ttettttete ettttttttt gcagtggtgg gatcttggct cctcagcctc ctgagtagct tatttttagg agacagggtt agtgattcge ctgeetceca gggttttttt ttcctgaagg tctgcttgga actggacaga acatgaaaaa ctttatgg

<210> 48 10 <211>651

<212> ARN

<213> Hamo sapiens

<400> 48

tceatttgaa agacacteat ggatgaatct gcgaaaccta aaaacatatt tggcttccaa tggctcatgc ctgtaatccc gagatggaga ccattctagc tatctgggta tggtggtacg atcactttca cctggaaggg ttggtgacag agtgagaetc tcagagtgec actagggaga gttgccggtg gctggctcac gaggtcaggt cgaaceagee

<210> 49

<211> 428

<212> ARN

20 <213> Hamo sapiens

<400> 49

ceactgttgc tgagaeattt tgtccctaaa caatatttag taaatatgat cgtctacagt

tttetttttt tgagteagag cactgcaatc tctgccttcc gggactacag gcetgeaeta tcaccatgtt ggccaggctg aagtgatggg attacaggcg gctgateatg getttgttee agtteeaata agctaetgtc

ttatttgtta ataacacaag ctagggttaa aattttactt aacagattea aattcaaaaa agcaetttgg gaggceaagg caacatggtg aaaccecgtc tgcctggagt cccagctaet cgaggttgca gtgagctgag tgtctcanaa aaatggaata ggtatattca ttagaatgga gcctgatcce acaactttgg tgacceaaat gtgaaacctg

ttattggcat aggttatatg caagttgact gtttttaaac ttgettttac agctcaatag

tctgtcgccc agcctggagg aggctcaagc aattctcctg eeacaectgg etaaettttg gtctcgaaet ectggcttca tgagccactg tgcccggcca aetcactgtg eeettettee ttetattaag taaggaccag

eeaaaeaaaa acatatctgg ctcttaattg tttggcttcc atatttaegg ceagetgtgg

tgggeggatc aegaggtcag tctactaaaa atgcaaaaat tcggaggctg aggctggaga atttgccact gcactccaac attaaataaa aaataattgt caatgccttt taatggtatg agggegaggn gggegaaeaa cttactaaaa a

tttgtgtgtg tgtgtgtgtg tttatateaa tggtgtatat tttaaaaaca aaacaaaaca

60 120 180 240 300 360 420

43B

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 651

60 120 180

aaaagctgca gtaatccccc tgccgttatt

gatgtctaaa actagattag tactaaatcc

tgatggttta atttataatg tttgcacggg

gaataactag agcaggceag gcaaggtgac

ctgaggtg

5

<210> 50 <211>436 <212> ARN <213> Hamo sapiens

<400> 50 ttttttttta aaggatgaga aaaaattggt

gagaaaggca aaatctaage atattataag

gggctgccac tgtgatgggt gggaatgaag

gggaaagccc gctgtcgggc agtgtgtgtg

tgtgaagaat ggaagactgg gactacattt

tacccatgaa gatggtteta tttgaaagta

tgggattaaa cgcgtgagcc aceacacccg

acagggatat attatt

10 15

<210> 51 <211> 475 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 51 tatgagatgg gggtcttact atgttgccca

tceteetgct

caggctctgg actagctggg

tcccaetaat tctgttcetg etagtttctt

tgtgagaaae teagaaatac teacttttcc

ggccactgta ctttgtagga aagacctagg

ggagaagttt eccgagaagg eeettetett

tgatactcga ttgtcaagtg eaacagaggg

tgtgctgact gttgaaaggc cacattcaca

20

<210> 52 <211> 439 <212> ARN <213> Hamo sapiens

<400> 52 tggagagttg gatetegtat eetgcctaga

25

tccacttcag cctccccaag ttcttggact

catgaggatt acatttcacg tgtatacatt ttcctataca agattaaaaa caataactaa tcaegcctgt aatcccagct

aeaeacgaac aatgctcaea ggtgggattc agaatacagg aaagggaact gctactgctc cagagacagg aaactggctg cccaaattct acttgtgtat atatttaggc egggcgtaat gcccaagtct taaaaagaaa

ggatggattt gaaatcctgg attacaggtg tgtgecacca eeettacaag taaggtgggt aggacagctg gggtgaagag gctgcccagc cagatgcagg gcetgagtag catctttgtg agaaggttgt catcatctag teatgctcag ttactgcagt

ctggtcttga acacctgggc acaggcgtca gccaccatgc

acccccagtg tatgtaccta taataaaata ctttgggagg

aaaeggetgg agggcagagg tgaaggagaa aagcatccae tataaactgc ctcagcactt aaacaaaacg

gettaaggga eaccttgctt catatttacc aatatgtagt ggcttcccgg ctcctttccg caataccttg

999t9

taagcgatcc ccagctccta

240 300 360 420

42B

60 120 180 240 300 360 420 436

60 120

1BO

240 300 360 420 475

60 120 agggaatctt gattaactag ct ccatacag acagcaatta ggctgagtaa ctttttcctg ttcactggac attagatcta ataaatggac ttt9999tct

gtgtcctttt t agggtctta agcaccacaa

aacaagtcca cagccttgct

cctagcctgc

gtgtaaactg caggagagta gttcaaattt

accggctcta at9act a9tt cattccagat

ttgtttgcaa catttcctat ttgcccacac

t9ct cttcaa

atggacatg

5

<210> 53 <21 1> 519 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 53 tctttcct ca aatctttatt gtcagtctat

catatagagc

aagg9tgcac t ccagatata

t tgcaat gtg ccaggtgctc ttttaaaagc

aaacatttct tttaaaagta tgttatcagt

aggccagt ag

tttacttctt ggaatatcat

caeetgttt c aacagtgatt ateattgt at

aaagggttgt gacacatetc tatgtacatt

gaattaaatt ttggaaagaa

taaaaaat at

10 15

t tntaaaagt cctcaaaatg ttttaattgt <210> 54 <211> 319 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 54 ttttttaatg tgacccattt atttatttat

aaagaaagaa aaacaattct t gtaat ccca

ggagttggag acgagcctga

ccaacatgaa

ttgcaaacaa cettg9tgea

aaagtttact

tagtgtgctt ggtgggtgg. caagaaaaca

aaga9ta9t a gcacctcaa

20

<210> 55 <211>352 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> SS tttttttttt tttttttaat ttttttttat

tcccccaggc tgg.gtg(.g t ggtacgatc

25

tcaagcgatt ctcctgcctc agcctgccga

cacctatata tctatagtta tgattcatct actaattaat atttagatgt tttaacttat aatgaaaatg gcctacat ee ettggtcagt eatgatctga aaaatttttg aaacaeettt ctcagtaatg aaaattttta ctaggccagg catggtggct agcattgcg

ttatttatga tggagtctca gcacttt 999 aggcatatca accctatctc taaaaaagaa actaceattt eattetcaae aatctaggaa agggaaagct

ttatttattt t gagacagag ttggctcact gcagcctccg gtggctggga ttacaggtgt

tgacaatcac

aataccacct gcatgaaaga gtgctttgtt aaggccccac

gggaagcttt aatgaataac ttaaatctgt taetetataa ggagaatata tg9aattact acttcaggga ctaaaggtaa

aaaaaaaaaa cttgaggtca aaagacctct attaaggaec tttct acaca

tcteattctg cctcct99at gcaccaccat

180 240 300 360 420 439

60 120 180 240 300 360 420 480 519

60 120 180 240 300 319

60 120 180 gcccggctaa tcttttgtat ttttagtaga tctcaagctc ctgacctcaa ggatccgccc ggcgtgagcc accatgccca gccagaatgc

<210> 56

<211>232 5 <212> ARN

<213> Hamo sBpiens

<400> 56

ttgagacgaa gtgtcgctct tgttgcccag ctgcatcctc cacctcctgg gctcaagtga gactacaggc gcccaccacc gggcccagct ttcaccatgt tggccaggct ggtctggaac

<210> 57 <211>446

<212> ARN

<213> Hamo s8piens 15

<400> 57

tgagacggag tcttagttgt ccaggctgga ccactgactc ecaggttcaa gcaattettc aggeaagtgc caccacgcct ggctaacttt tatcgctcag gctggtctca aacttctgac 9t9tt99g·t taeaggegtg agctaccacg tctcatcatt gggtatetae ccaaagaaaa cttgcacatt tattgcagca tgctcacaac attcaaaata tatagaaaat tcaaag

<210> 58 20 <21 1> 510

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 58

aattagctgg gcatggtggt gcacacctat aegactgctt gagecgagga gtttgaagge aaatgtaaag acaaatttct eettcetett actcctatat tttttagatt aatcaaactc gatcttgcct ceeaagatta accetteeag ttecatcttt ttaaaataga gcttatcaaa teaccggaat gatctgtgat cacattagga tctttecatt ttaagattte tgaatacaaa

aattcactga cttaatgggt ettattcttt

<210> 59 <211>245

tatggggttt caccatgttg accttggctt cccaaagtgg aaccatatgt ttaaagataa

cctggagtgc aatagcgcaa ttctcccgcc tgagcctccc aattttttgt atttttagta ttctgacctc aggtgatcca

gtgcagtggt acgatctcag tgtgtcagec tcetgaggag tgtattttta gtagagacgg ctcatgacct gcccgcctct ectggceaga actatcattt atagtttatt atatgaaaat agcaaactgt atatatcaga

agtcctaact acttaggagg aatagagaga gactetgttt eaaatatgag aatcateata agatttctca aacattctag aaetttttaa ctttgttaaa gaatttctgt gaaagtttcc ttecatcttt gaaaactact aaaaaaatcc ctttttetta

gccaggttgg ctgggttaca

t.

tctccaccca gagtagctag gagatggggt ee

ctcactgcaa ttggggctgc ggtttcaeca acctcccaaa gattcagaaa gatacgtata aaagcttaat

ctgaggtggg eaaagaaata gccctceeta aaeaeaactt gtgcetgtct ctttgcttec atetaagcea atttctetaa

240 300 352

60 120 180 232

60 120 180 240 300 360 420 446

60 120 180 240 300 360 420 480

<212> ARN <213> Horno sapiens

<400> 59 ttetttaaga gatggggeet etetatgttg

atgatectcc eaccttgget tctceaagtg

ggeeagatca teacttttet gtcacttaaa

ttetettctt taccttagct cctataceac

5

ctttt

10

<210> 60 <211>479 <2 12> ARN <213> Horno sapiens

<400> 60 tttttttgag atggggtcte gctctgtcgc

tcggctcacg geaaaetctg cctcccagat

ctgagggtta actgagggct gaggggttca

ggcagtgaga ggcagtgggg ccaatggcgt

cccggggcgt gaatccggcc ccatgagtgc

taacagcgtg gcctteggca agtgactaaa

aaeagaggat aacaatggca tgtactggat

tagaaaagaa tgttttaaaa cetcagagat

15

<210> 61 <211>480 <212> ARN <213> Homo sapiens

20

<400> 61 tgagacagag tetcaecctg tcacccaggc

eactgeaage tcegcetcet gggtteacac

gactacaggc gcccgceacc acgcccaget

gttteaecgt gttaaccagg atggtctcga

cctcccaaag tgctgggatt acaggcgtga

ttaetgtgac tgggtcgttt ttaagaaagg

tgataaaaat ctatcaaaaa cattataatt

ggaaccagaa agaaatagca tttettatct

25

<210> 62 <211> 179 <212> ARN <213> Horno sapiens

<400> 62

eteaggetgg teatgaattc etgggattae aggtgtgaet tctcttgata aaggtgcttg taaagtcttc tttgaaaaaa

ccaggetgga gtgcgtgeag aecacacaag gacttctecg agaaggagga cacgggeaea gaggagcacc agagagcagg tcttcggccg cccaaaaccg gggetteetg eetcagcttc etggeataaa gtaaatgtte acattaggcg aaaataaaag

tggatggagt gcagtggtgt ttetcctgcc tcagcctcct aatttttttt gtagttttag tctcctgccc ttgtgatccg gctaccacgc ccggccgtct ttatcagctt tgtgtttggt tgcaaggaaa aaggtttttc gtataaacac aaacatttaa eagcectcaa eaccatgete atctcaaatt aaaaaaatca

tggcacaatc agccagcttt gggaeteacg agggaacggg gtcccatggg eccacctgta aatagatage ctgggctac

gatetcggct gagtagctgg tagagtcggg cccgcctcgg tgtgtcttct ttcccacagt aatggctgca agctagtcac

60 120 180 240 245

60 120 180 240 300 360 420 479

60 120 180 240 300 360 420 480

ttttttttta atttcagaca

at etcggctc actgcaacct

tgagtagctg ggattacagg

5

<210> 63 <211> 307 <212> ARN <213> Horno sapiens

<400> 63 gtatttttag tagagacggg

ttgtgateea cccaeetcgg

ccggccctaa acatttgtta

caaatcattc agctcataaa

aaataatact attttacatt

cactaaa

10 15

<2 10> 64 <211>275 <212> ARN <2 13> Homo sapiens <400> 64 tgtattttca gtagagacaa

cet cagectc ccaaagttct

teattttttt

tttttttttt

tctcaaaetc ctgggctcaa

ctcanatagt tttaaaatgg

20

<210> 65 <211> 306 <212> ARN <213> Horno sapiens

<400> 65 tttttttttt ttgagacagt

caatcttggc tcactgeaae

cctaagtagc tgggattaca

tagaaagggg gtttacccat

accegcctcg gctt ceaaaa

25

aacctt

30

<210> 66 <211>444 <212> ARN <213> Horno sapiens

<400> 66

gaatctcact cggtegccca ggctggagtg ctgcetectg gattcaggca attetcctgg cacccaccac catgcccagc tattntctgt

gttteaccat gttggttagg ctggtctega ect cccaaag tgctgggatt acaggcatga gacaatactt ccgaatgttt tgtctatgta tcaacttgtc tagactcatg ccctgggttc agggactact aagaaeaacc aggatgatga

ggtttcagtc ttgaattcet aaeetceggt gggattacag geatgagaaa ccatgcceag ttttaagaga eaaggtgcte gctgtgttgc gcaatcctcc tgccttggcc tcctgagtca atgtgcaata tttag

ctcactttgt cgccaggctg g'9t9t99'9 etetgeetce tgggtteaag cgattctcet ggcacaeecc aceacaeccg gctaattttt gttggccage tgggtettga actectacct gggggaagte actgcaccca gccttgctgg caatggtgcg eteageet ec atttttagt

accccteace gccaccgcac atttagttca acagaattag taatagtcat

gatceacetg cegatttctc ecaggnctgg aaaagtgcat

tgcagtggea gctteageet atatttttag ntntggatcc atttttctaa

60 120 179

60 120 180 240 300 307

60 120 180 240 275

60 120 180 240 300 306

tttttttttt tttttttttt gcaatggggt gatctcggct ctcaaaaaaa aaaaattctt ttaaaaatca cagagagcca cacaagcgct ctgatccaag aaaaatattt tagagcattt attttaatat cttaacatgc ttaaaaatte tgcatcatta

<210> 67

<211>311 5 <212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 67

tttttttttt tttttttttt aggntggagt gcagtggcat aactcttaca cttcagcctc ctaacacaca cacacacaca atacaeatat atttgatata tatatatatg t

<210> 68

<211> 441

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 68

tttttttttt tttgagacag tctcggctta ctgcaacctc gagtaactag gaccacaggc agacagggct tcaccatgtt agcatcggcc tcatgatgtg tattcaattt tacagggcag cacagganca gtnaggaacc acantggatt taaantacag

<210> 69 20 <211>435

<212> ARN

<213> Horno sapiens

<400> 69

ttttgagatg gaattttgtt cttgttgtcc

caccgaaacc tccagcctgg gtgacagagt

cattgctcat atacgtcaga ttattacaat

aataaggtgg ccaagagaga agaaaatgat

ttaaaaacaa gcaaagtaag gtatgggagt

taaaaagggg gctattataa ttatettctt

caccaaatta aattcttcct gaatagagaa

ctgg

tttttttttt atttagagat ggggttttgc gatcatagct cacagcagcc tctaactcat caaagtagct gggactacag gcatgagaaa cacacacaca cacacataat tgctatcatc tatgtatatt t9t9t9t9t9 t9t9t9t9t9

ggtctcactc tgtcacccag gctagagtac tgcctcccag gttcaagcga ttctcctgcc acacaccacc atgcccggct aatttttgca ggccagggct ggtctcaatt tcttgacctc ctggggatta cagggcatga gncaacgcac ggccacctet tacetatttt cacaggaaaa actggaattc agtnggtctt ttcn999999

aggctggagt gacaccctat tttggtatgc aagttgtcca acaaaatcac ttaattatta agataagctt

tctgttgecc gggctcaagc ccacacttgg tctatcaaat tatatatata

agtggcacaa tcagcctccc tttttagtag atgatccacc tcgggcctag ccagtnttta ttntaggttc

60 120 180 240 300 360 420 444

60 120 180 240 300 311

60 120 180 240 300 360 420 441

tgttgttgaa tattccttaa tgtttgattc ctttcatgac gttgtgtgtt tagaaaggat tagcttagta ggatatatgg caaattctgg cctggggcat aagcgggcag gtcgtctgag aatcctgtct cntgctaaaa ccngctaCtt 9999a

<210> 70

<211>348 5 <212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 70

tttttttttt tttttttttt gatggtctca aactcctggg attacaggtg tgagccactg aaaaaattgc aaaaatactg tgttaacatc ttaaataacc tacagacttg actcaaaatt

<210> 71

<211> 304

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 71

tgtagagaca ggcgcttact atcctcctgc cttggattcc ttcccatgac ttttttgtga ccaggctctg cggtaaacac cattaaatgt taacgcctta tnaa

<210> 72 20 <21 1> 192

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 72

gggcgtctcc ctatgttacc cctcagcctc ccaaagtact atgcttctct tgaat aagca

cccaaacatc gt

<210> 73

tggagtcgat gaatttgcag catcacccta gaccttcaag aacaagcttg tcatgggcta ctttttctat gaaaggtgga ggtggcttat gcctgttaat ggtcagggag ttttgagacc ctaccaaaan tagcntgggc

tttttttttt aaagagatgg ctcaagcgag tctcctgcct tgcccagcca acttctcatt cgagagaatc cncatatact atattatgnt gatcaaaacc caccaactgt ctgcctaatt

atgttgccca ggctcggttt aaagtgctgg gattatagtt aggaggcatt caccaagctt cccacaataa atgtttatca atctgatact gaaaataaaa

caggctggtc ttgaagtcct gggattatgg gcatgagcac gttattagag gaattaaaca agacccctcc aagattcttt tttgctgact agatttgggg gaacctgtgg tcttcataaa gaacatgcat taaaaatggg cccagcactt 9999a99ct9 agcctggccc aaaataatgn ntggtagcac acccntagtc

agtcttgcca tcttacgcag tggtgtttca aagtgctggg ttaaaagaat ttcagattta tttcacccag atccaccaaa agaaatacta ttaactactc ttagtcca

taaactccaa gcctcaagtg gtgagccact gcgcccaaca ttcctaatct ttaccataag gaggacttag cagggaagta gataatttca acttggtttt

gggctcaagc aatgctcctg tgccctgcac ccagtcagaa ttcaagaacc ctaacatgcc

60 120 180 240 300 360 420 435

60 120 180 240 300 348

60 120 180 240 300 304

60 120 180

<211> 487

<212> ARN

<213> Homo sapiens

5 <400> 73 tttttttttt tntctatttt tagcagagac agagctcctg acctcaggcg atccacccgc catgagccac agcgtctggc cagaatcata ccagaaatac catagtcaat tttacagggt taagattaaa gaatatttta aaatattgtt tgcaaaagta attgtagttt ttgccattaa aataggngtt acttctaggc ttgnaagggn tgggcaaaaa ctggcaattg tttttggcac ctttttg

<210> 74

<21 1> 446 10 <212> ARN

<213> Homo sap;ens

<400> 74

tttttttttt aatagagatg ggggatct ca atcacagctc gct gcagcct ccacctcctg ggactacagg cactcaccac cacactgggc gaagtggtct tgctatgtca cccaggttga cgcattatcc tcccaaagtg ctgaggatta ttaggggctt ctaattcact ttccttttcc ctggcatttt attttaaggt natcttcaan gcttaacctg tgtaggaaae enttt t

<210> 75

<211> 6213

<212> ARN

<213> Horno sapiens

<400> 75

cagtctttga ttggttgctg agag9cg999 ggtgaggaga gccatgggac gggcagtcaa gaccagacaa caagttttta aaaatgatgc aaatgaagaa ttCaaaaata ataaaagtga gaaaataggt tctgatgttg aattattact agaccacaat acactgaaac tggtccctag ggggtttcac catgttggtc ctcagcctcc caaaatgctg tcttaatagc aatcccataa gggttcagtt tttcttaaat ataagngaca taactaaact aaggcaatta taaaggaaaa taacattctt ttttggctac caacctatta gggcaagaga

tcgtcaccca ggttggaatg ggatcaaccc ctacctcatt taattaaaaa aaaaaattct t ctagaactc ctgacctcaa cagacgtgag gccactgcac ttcttgtcta aattcttgtg t ccttttggg aagtagtgag

ctactcgact gctctggagg ggttttaeag etctttaaaa cagagcatta gaagcagcca aaettcttct aagaaaatag cagaacatct gttatacaag gaaagacctt cttgtagaaa

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<210> 76 <211>354

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<213> Hamo sapiens

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5

<210> 77 <211>399 <212> ARN <213> Homo sapiens

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10 15

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20

<210> 79 <2 11 >392 <2 12> ARN <213> Horno sapiens

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25

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20

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120 180 240 300 360 420 480 49B

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<210> 83

<211> 2350

<212> ARN

<213> Horno sapiens

<400> 83

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<2 10> 84

<211> 184 5 <212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 84

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<210> 86 20 <211> 16459

<212> ARN

<213> Hamo sapiens

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60 120 180 184

60 120 180 240 300 360 410

<400> 86

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<213> Homo sapiens

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<213> Homo sapiens

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<400> 90

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<213> Homo sapiens

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<213> Horno sapiens

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<210> 99

<21 1> 2962

<212> ADN

<213> Hamo sapiens

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<210> 100

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<2 13> Homo sapiens

<400> 100

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<210> 101

<211> 1873

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<213> Horno sapiens

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<210> 102

<21 1> 4082

<212> ADN

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<210> 103

<211> 2887 5 <212> ADN

<213> Horno sapiens

<400> 103

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4020 4080 4082

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680

tctgcgggca gtgcctgtgc cacaccagcg actgcgagtg tgacaccatc aactgtgagc ggagggggct ctgcuctgc gggaagtgcc gccagtgcga gaggaccact gagggctgcc gtggccggtg ccgctgcaac gtatgcgagt aggagtgccc cggctgcccc tcaccctgtg agttcgaaaa gggccccttt gggaagaact cgaacaaccc cgtgaagggc aggacctgca cctacacgct ggagcagcag gacgggatgg gagagtgtgt ggcaggcccc aacatcgccg tgctgatcgg cattctcctg ctggtcatct gggagtacag gcgctttgag aaggagaagc ttttcaagag cgccaccacg acggtcatga tggtgaagac aaggccgtca ggacccacca cttgccacag ctcttgagga tgtcaccaat aaaatgacag ccatggccgg ccgggtgctt ctgactggca cagtctttgc atggagactt aggtgcgtgt ttcctgtgca agtcaggaca ttacatttaa acttgtcagg gtataaaatg acgtgtatag aaaaaaaata aaacttcaat aaaaaaa

<210> 104

<211> 1902

<212> ADN

<213> Horno sapiens

<400> 104

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<210> 105

<211> 2826

<212> ADN

<213> Horno sapiens

<400> 105

tcgagacctc aagggtagag gtgggcaccc attgtagggc agggcggcgc ttctcggaaa caggagaaag aggaagcgct ggcagacaat gcccgccatg gctgcaggag gtcccggcgc ctcccttccc ctggctgctc tcaacatgcg cgtgcggaca c.ggtggcgg eegactggae cttggagatc cggcaactgg agacacaagc gcagggacgc cctggcgcct ctgtaggccg ccactccgcc aacgtgctcc accgagatct 600 ctgcgacctt aagatttgtg atttcggcct 660 caccggcttc ctgacggagt atgtggctac 720 gaactccaag ggctatacca agtccatcga 780 gatgctctct aaccggccca tcttccctgg 840 tctgggcatc ctgggctccc catcccagga 900 ccgaaactac ctacagtctc tgccctccaa 960 caagtcagac tccaaagccc ttgacctgct 1020 acggatcaca gtggaggaag cgctggctca 1080 ggatgagcca gtggccgagg agcccttcac 1140 99'9c99ct9 aaggagctca tcttccagga 1200 ggccccctag cccagacaga catctctgca 1260 ccctctcccg ccagactgtt agaaaatgga 1320 '99CC999gt ggagcatggg cctggccacc 1380 gcaggccaag gcettctect ececaeccge 1440 gccccagttc aatctcccgc tgctgctgct 1500 ctggcagttc tggaatggaa gggttctggc 1560 999t999999 cgctgagtag ggactcaggg 1620 cccaccctag tttccctgaa ggaacattcc 1680 ccaggccggg ccgaatcccc tccctgteaa 1740 tgt9t9t99t gagcagaagt 99'9ctg999 1800 ccctgacccg tctaatatat aaatatagag 1860 aaaaaaaaaa •• 1902

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540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520

tetttgetee acttteagee aggetggage aaggtaeett aatggatgee eetetetgea tgatettgtt gaggeattta etttaatact gggcatttta aageeatctc aagaggeatc ttaaaataat tteaaagata tetgagaaaa geegatattt gaatatatet tgeateetga gtttataata ataaataata aaaaaa

<210> 106

<211> 1669

<212> AON

<213> Homo sapiens

<400> 106

etceeteage aaggaeagca gaggaecage taagagggag cetgaaaaca aeeetcagae gceacatccc ctgacaaget cteaeataet gaeecacggc tecaeeetet etecectgga aageatgatc egggaegtgg agetggeega ggaggcgcte eeagggctee aggeggtget tgttcetcag eetettetee eaeeaegete ttetgeetge tgeactttgg agtgategge eagggaectc tctctaatca gccctctggc ccaggcagtc gagtgaeaag cctgtageee atgttgtage aaaeeetcaa gctgaaecgc cgggccaatg cectcctggc eaatggcgtg ggtggtgcca teagagggcc tgtacctcat ctactcccag ctgccectcc acceatgtgc teetcaccea eaccatcagc gaccaaggte aacctcctct ctgccatcaa gagcccctge ggctgaggcc aagecctggt atgagcccat ctatctggga gggtgacega cteagegctg agatcaatcg geccgactat geaggtctae tttgggatca ttgccctgtg aggaggacga cctcccctgc eeeaateect ttattacccc ctccttcaga teaaaaagag aattgggggc ttagggtcgg aacccaagct ccaeeaettc gaaaeetggg attcaggaat gtgtggcctg cactaagaat tcaaactggg gcetecagaa ctcactgggg eatctggaat etggagacea gggagcettt ggttctggee aagacctcac ctagaaattg aeacaagtgg accttaggcc cagacttect tgagacaegg agceeagcce tecceatgga tttgcacttg tgattattta ttatttattt attatttatt tatttgggag accggggtat cctgggggae ccaatgtagg ttettaggat ettgggaggg getgeeatge aeetgteeee ttctacatgt tttgtacgea geeattctte etatateetg ttetaecttg gaaaaaaaaa

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2580 2640 2700 2760 2820 2826

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440

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<210> 107

<211> 948 5 <212> ADN

<213> Horno sapiens

<400> 107

attgtggtgc cttgtagctg tcccgggagc aaggatgagg aagaccaggc tctgggggct agctgcaact aaattaactg aggaaaagta gaaatgtgac t acacgctag agaagtttgc ggacggagag atgcccaaga ccctggcatg agtccaagtg gggaggatca tactagaaga aatggtcaac cttcaagtgg aagattctgg caaggagcct cacatgctgt t cgatcgcat gacccctggc tccaatgaga attctaccca taaggccttg tgcccactct ataccagccc aactgccgat gtctccactc ctgactctga cagggttccg gtgttcaaca ttgtcattct ggtcttctct gtcctgtttg ctgtcacgct cacgagaatg tcctctgact t ccagccaca gaggaggtaa aaggcaggga gttaataaca taaagtcagc gtctcacctt aaaaaaaaaa

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a999a99a99 cagctatttc

1500 1560 1620 1669

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 948

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para la normalización de una expresión de ARNm en varias muestras de sangre que comprende:

   a) una comparación de los valores de expresión de uno o varios ácidos nucleicos seleccionados de SEC ID 22 a SEC ID 97 a través de distintas muestras de sangre; b) derivación de una medida de estabilidad génica para la normalización de valores de expresión de uno o varios ácidos nucleicos, seleccionados de SEC ID 22 a SEC ID 97 a través de varias muestras de sangre; y

   10 cl una normalización de la expresión de otros ácidos nucleicos, que se aislaron de varias muestras de sangre, basándose en la etapa b).
2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que el ARNm se amplifica, en el que mediante transcripción inversa con ayuda de un cebador oligo-dT se transcribe ARNm en AONc y las cadenas de AONc

   15 producidas de manera complementaria al ARNm usado se usan como molde para reacciones en cadena de la polimerasa (PCR).

3. 3.

   Procedimiento según la reivindicación 2, en el que los ácidos nucleicos se amplifican por medio de PCR o PCR en tiempo real.

4. 4.

   Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-3, en el que los valores de expresión de los ácidos nucleicos se determinan por medio de procedimientos de hibridación.

5. 5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1·4, en el que la medición de los valores de expresión de los 25 ácidos nucleicos se realiza en disolución o en ácidos nucleicos que están inmovilizados en un soporte.
6. 6. Procedimiento segun la reivindicación 5, en el que el soporte es una micromatriz, partícula, perla, vidrio, metal o membrana.

   30 7. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1-6, en el qve los ácidos nucleicos están acoplados al soporte de manera indirecta a través de otros componentes de unión tales como anticuerpos, anligenos, oligonucleótidos, balizas molecvlares o enzimas.
7. 8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1·7, en el que los valores de expresión de los ácidos nucleicos

   35 determinados in vitro a partir de una muestra de paciente se usan como parámetro de entrada para la fabricación de software para la descripción del pronóstico individual de un paciente, para fines de diagnóstico, para decisiones de terapia y/o sistemas de gestión de dalos de pacientes.
8. 9. Uso de ácidos nucleicos, seleccionados del grupo que está constituido por: SEC ID 22·86, 88, 92, 94 Y 97 como 40 gen control para la normalización de datos de análisis de expresión génica de muestras de sangre.
9. 10. Uso de un conjunto de genes control para la normalización de datos de análisis de expresión génica de muestras de sangre de un paciente, en el que el conjunto de genes control comprende las siguientes secuencias de ácido nuclelco: SEC ID 32, SEC ID 38, SEC ID 64, SEC ID 82 Y SEC ID 94.
10. 11 . Uso de un conjunto de genes control para la normalización de datos de análisis de expresión génica de muestras de sangre de un paciente, en el que el conjunto de genes control comprende las siguientes secuencias de ácido nuclelco: SEC ID 49, SEC ID 59, SEC ID 67, SEC ID 76 YSEC ID 95.