ES2358182T3 - Genes de control para la normalización de datos de análisis de la expresión génica. - Google Patents
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Abstract
Conjunto de genes de control para la normalización de datos de análisis de la expresión génica de muestras de sangre de un paciente, en el que el conjunto de genes de control comprende las siguientes secuencias de ARN: SEQ ID 87, SEQ ID 89, SEQ ID 90, SEQ ID 91, SEQ ID 93, SEQ ID 95 y SEQ ID 96.
Description
Genes de control para la normalización de datos
de análisis de la expresión génica.
La presente invención se refiere a genes de
control, especialmente a un conjunto de genes de control según la
reivindicación 1 para la normalización de datos de análisis de la
expresión génica, a cebadores de PCR derivados de los genes de
control, especialmente al conjunto de cebadores de PCR según la
reivindicación 2, a sondas derivadas de genes de control,
especialmente al conjunto de sondas según la reivindicación 3, así
como a un procedimiento para la normalización de análisis de la
expresión génica según la reivindicación 4.
Al igual que antes existe la necesidad de
identificar genes, especialmente de células sanguíneas, que en su
expresión sólo muestren una mínima variación bajo distintas
condiciones. Estos llamados "genes de mantenimiento"
("Housekeeper") se usan como referencias, controles internos y
valores de referencia en la cuantificación de la expresión génica y
de ARN y ARNm con procedimientos como transferencia Northern, ensayo
de protección de ribonucleasas, electroforesis capilar,
micromatrices y PCR cuantitativa en tiempo real, así como mediante
otros procedimientos para la medición directa de la transcripción y
la medición después de la amplificación previa.
A continuación se resumen los términos genes de
mantenimiento y genes de control de la expresión por el término
genes de control. Esta simplificación se realiza por razones de
legibilidad y no representa ninguna limitación de la invención.
Una normalización de datos cuantitativos
mediante genes de control tiene numerosas posibilidades de
aplicación. Los genes de control hacen posible una identificación
de genes cuya actividad se regula de forma diferente en distintos
estados de enfermedad, así como el desarrollo de diagnósticos
basados en ellos.
Un gen de control es un gen que muestra un
cambio mínimo de la expresión y la transcripción a través de
distintas muestras de ARN y por tanto sirve de control para la
medición de actividades génicas variables a través de distintas
muestras. Ningún gen muestra actividad inalterada a través de todos
los tejidos. Por tanto, existe una gran necesidad de nuevos genes
de control, especialmente para la sangre, ya que diagnósticamente se
aplican valores de expresión de la sangre.
Aunque en la bibliografía se conocen distintos
genes de control [1], no se conoce ningún gen de control ni sus
transcritos, así como su uso combinado, para la normalización de la
expresión génica y la transcripción de muestras de sangre completa
y células sanguíneas. Los transcritos (también ARNm y microARN, así
como otros ARN) con concentración constante en células sanguíneas y
en células de órganos y tejido periférico que están localizados en
sangre completa constituyen una condición previa para la
normalización de las actividades génicas y para la determinación de
cambios de otras actividades génicas y, por tanto, una condición
previa para el diagnóstico basado en sangre. Igualmente ya se han
publicado distintos estudios para la medición de la actividad
génica para el diagnóstico/pronóstico de SIRS y sepsis, por ejemplo
[2, 3]; sin embargo, todavía no se ha descrito un uso y
cuantificación de estas señales de actividad génica mediante genes
de control de la sangre.
Por tanto, existe la necesidad de genes de
control de la sangre y de células sanguíneas robustos y que
dispongan de una estabilidad que haga posible una normalización y
cuantificación de la expresión génica de genes específicos para
enfermedad o conjuntos de genes.
El punto de partida para la invención dada a
conocer en la presente solicitud de patente es el conocimiento de
que actividades génicas de distintos genes que están presentes en
células sanguíneas en muestras de un individuo al que se le
diagnosticaron fenómenos patológicos típicos de sepsis
(correspondientemente a la definición en [4]) no se diferencian de
las actividades génicas de los mismos genes en individuos en los que
no se diagnosticó sepsis y pueden usarse conjuntamente o
individualmente como genes de control para la normalización de
actividades génicas de células sanguíneas y para la determinación
de la concentración de transcritos de sangre. Esto permite la
normalización y la cuantificación relativa de actividades de otros
genes, lo que puede usarse para el diagnóstico, el pronóstico, la
terapia y el control de seguimiento.
Por tanto, el objetivo de la presente invención
se basa en poner a disposición agentes y procedimientos que hagan
posible un punto de referencia para la diferenciación de cambios en
la expresión génica debidos a enfermedad y, por tanto, un
diagnóstico o control de seguimiento de la terapia.
Este objetivo se alcanza mediante genes de
control y especialmente un conjunto de genes de control con las
características caracterizadoras de la reivindicación 1.
El objetivo se alcanza además mediante un
cebador derivado del conjunto de genes de control según la
reivindicación 1, especialmente el conjunto de cebadores según la
reivindicación 2, así como por sondas, especialmente el conjunto de
sondas según la reivindicación 3.
Desde el punto de vista de la ingeniería de
procesos, el objetivo se alcanza mediante las características
caracterizadoras de la reivindicación 4.
La invención describe la identificación de
nuevos genes de control de sangre, sondas de micromatrices adecuadas
y cebadores de PCR y su uso, también en combinación, para la
normalización de datos de expresión cuantitativa de sangre y
células sanguíneas en micromatrices, ensayos de PCR en tiempo real y
otros sistemas con o sin amplificación y con distintas
posibilidades de visualización para la determinación, así como su
aplicación al diagnóstico de cambios debidos a enfermedad en
inflamaciones locales de diferente localización y en la reacción
sistémica a los mismos como SIRS, sepsis, sepsis grave con
insuficiencia orgánica.
En estas investigaciones es de importancia
decisiva la normalización del análisis de expresión génica. Para
los fines de la presente invención por normalización se entenderá lo
siguiente:
"Por una normalización se entiende hacer
comparables mediciones de distintas matrices o PCR o especialmente
experimentos de RT-PCR reduciéndose o eliminándose
la variabilidad técnica. Dentro de estos experimentos hay una
pluralidad de fuentes que pueden falsear las mediciones. Las
posibles fuentes de perturbación técnica son una eficiencia
diferente en la transcripción inversa, el marcado o las reacciones
de hibridación, así como problemas con las matrices, efectos de
carga en los reactivos o condiciones específicas del
laboratorio".
El procedimiento según la invención se
caracteriza porque en una muestra de sangre de un individuo puede
diferenciarse la actividad de uno o varios genes que van a
investigarse mediante la comprobación de la presencia y la cantidad
del producto génico con respecto a las cantidades de los productos
génicos de los genes de control entre SIRS y sepsis.
Para esto se dan a conocer genes de control y
secuencias de genes de sangre y células sanguíneas, así como
cebadores y sondas derivados de los mismos, que pueden usarse para
determinar, visualizar y normalizar y cuantificar actividades
génicas y transcritos. Las secuencias de las sondas de
oligonucleótidos en la realización preferida se exponen en la Tabla
1 y se corresponden en la lista de secuencias adjunta con SEQ ID 1 a
SEQ ID 7, las secuencias de cebadores usadas en la Tabla 2 se
corresponden en la lista de secuencias adjunta con SEQ ID 8 a SEQ
ID 21. A este respecto, las secuencias de las sondas de
oligonucleótidos también pueden asumir otras secuencias, en la
realización preferida de una longitud de 50-100
nucleótidos, que unen específicamente transcritos de los genes
representados en la Tabla 3 con las secuencias SEQ ID 22 a SEQ ID
97. La longitud de las secuencias usadas en los procedimientos de
amplificación como PCR puede ser discrecional en tanto que apoyen la
manipulación enzimática deseada y la amplificación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores en la Tabla 2 pueden usarse para
preparar productos de amplificación que contienen la región deseada
(secuencia) de los genes mencionados. En la realización habitual, el
producto tiene 150-200 nucleótidos de longitud.
Los genes de control pueden usarse por separado
o en combinación de varios. Normalmente, la actividad de los genes
de control puede determinarse como aquí se describe con sondas de
hibridación para micromatrices o cebadores de PCR y PCR en tiempo
real. Sin embargo, los genes de control y sus productos de expresión
también pueden determinarse después de la amplificación con otros
procedimientos conocidos para el experto como, por ejemplo, NASBA
(amplificación basada en secuencias de ácido nucleico, de Nucleic
Acid Sequence-based Amplification) y en distinta
combinación. También pueden determinarse con una serie de otros
procedimientos o posibilidades de visualización como, por ejemplo,
con ayuda de anticuerpos monoclonales. Los cebadores y las sondas
pueden utilizarse para el gen, el producto de expresión (ARNm) o
los productos intermedios de expresión que no se procesan
completamente en ARNm.
En otras realizaciones, los cebadores y las
sondas se unen a una región específica de los genes de control aquí
dados a conocer o de sus transcritos. Pero las sondas y los
cebadores pueden interaccionar con cualquier región de las
secuencias de genes aquí dadas a conocer o secuencias transcritas a
partir de éstas. Los cebadores y las sondas pueden interaccionar
mediante apareamiento de bases sucesivo, pero no deben interaccionar
continuamente con la secuencia complementaria completa. Aquí pueden
elegirse de forma variable las composiciones de tampones, las
concentraciones de sales, las etapas de lavado y las
temperaturas.
Igualmente, estos cambios de los genes de
control y de los genes de prueba pueden compararse con los valores
de expresión (o los datos derivados a partir de éstos como, por
ejemplo, valores promedio) de una o varias muestras de referencia
que no se determinan al mismo tiempo con la muestra diana.
Una forma de realización de la revelación se
caracteriza porque se determinan valores de expresión aplicando
genes de control de la Tabla 3, así como ácidos nucleicos y
transcritos de estos genes de control de sangre y de células
sanguíneas, como genes de control mediante comparación de los
valores de expresión con uno o varios ácidos nucleicos de prueba y
mediante cuantificación en relación con el ácido nucleico de
prueba.
Otra forma de realización de la revelación se
caracteriza porque se usan ácidos nucleicos y sondas de ADN con las
secuencias según la Tabla 1 y su unión de ARN, incluyendo microARN,
y de transcritos (ARN o ARNm) en sangre o de células sanguíneas de
genes según la Tabla 3 en disolución o inmovilizados sobre
superficies o partículas o perlas y el uso de los transcritos
unidos de estos genes para la normalización mediante comparación de
las cantidades unidas (valores de expresión) de los ácidos nucleicos
con uno o varios ácidos nucleicos de prueba unidos a sondas y para
la cuantificación en relación con el ácido nucleico de prueba
unido.
Una forma de realización de la revelación se
caracteriza porque el procedimiento para la diferenciación ex
vivo, in vitro entre SIRS y sepsis (ambos
correspondientemente a [4]) basado en establecer una relación entre
cantidades de ARN del gen de control y del gen de prueba comprende
las siguientes etapas:
- a)
- aislar el ARN del gen de control, así como el ARN del gen de prueba, de una muestra de sangre
- b)
- marcar el ARN del gen de control y del gen de prueba con un marcador detectable y poner en contacto con el ADN bajo condiciones de hibridación, siendo el ADN un fragmento de gen u oligonucleótido que se une específicamente a transcritos, productos de amplificación o transcritos in vitro de genes de control
- c)
- registrar cuantitativamente las señales de marcado del ARN del gen de control y del gen de prueba correspondientemente a b) y
- d)
- comparar los datos cuantitativos de las señales de marcado para facilitar información de si un gen específico o fragmento de gen se expresa más fuertemente o más débilmente en comparación con las señales de los genes de control.
Otra forma de realización de la invención se
caracteriza porque el ARN del gen de control se hibrida con el ADN
antes de la medición del ARN del gen de prueba y se registran las
señales de marcado del complejo de ARN de control/ADN, dado el caso
se transforman adicionalmente y dado el caso se archivan en forma de
una curva o tabla de calibrado.
Otra forma de realización de la invención se
caracteriza porque el ARN de los genes de control o partes de los
mismos se identifica y se cuantifica mediante secuenciación o
secuenciación parcial, por ejemplo, mediante pirosecuenciación.
Otra forma de realización de la invención se
caracteriza porque como ARN del gen de control se usa ARNm o
microARN.
Otra forma de realización de la invención se
caracteriza porque el ADN se dispone, especialmente se inmoviliza,
para la unión específica del ARN del gen de control o sus
transcritos in vitro en zonas previamente determinadas sobre
un soporte en forma de una micromatriz.
Otra forma de realización de la invención se
caracteriza porque en el caso de la muestra biológica se trata de
un ser humano.
Estas secuencias con la ID de secuencia: 1 a ID
de secuencia: 97 están englobadas por el alcance de la presente
revelación y se dan a conocer en particular en la lista de
secuencias de 70 páginas adjunta que comprende 107 secuencias que,
por tanto, es parte de la revelación.
Otra forma de realización de la revelación se
caracteriza porque las sondas inmovilizadas o libres se marcan con
secuencias correspondientes a la Tabla 1. Para esta forma de
realización se usan como sondas oligonucleótidos
autocomplementarios, las llamadas balizas moleculares ("molecular
beacons"). Llevan en sus extremos un par de
fluoróforos/extintores de fluorescencia de manera que en ausencia de
una secuencia complementaria están presentes en una estructura de
horquilla plegada y sólo proporcionan una señal de fluorescencia con
una secuencia de sonda correspondiente. La estructura de horquilla
de las balizas moleculares ("molecular beacons") es estable
hasta que la muestra se hibrida con la secuencia secuestrante
específica, lo que conduce a un cambio de conformación y, por
tanto, también a la liberación de la fluorescencia indicadora.
Otra forma de realización de la revelación se
caracteriza porque por lo menos 1 a 14 sondas de ácidos nucleicos o
sus complementos se usan para la unión de los transcritos, o sus
complementos, de los genes de control.
Otra forma de realización de la invención se
caracteriza porque los análogos sintéticos de los genes de control
o los nucleótidos sintéticos que se unen a los transcritos de los
genes de control comprenden especialmente aproximadamente 60 pares
de bases.
Otra forma de realización de la invención se
caracteriza porque los genes enumerados como ADN en las
reivindicaciones se sustituyen por secuencias derivadas de su ARN,
análogos sintéticos, aptámeros, así como ácidos nucleicos de
péptidos.
\newpage
Otra forma de realización de la invención se
caracteriza porque como marcador detectable se usa un marcador
radiactivo, especialmente ^{32}P, ^{14}C, ^{125}I, ^{33}P o
^{3}H.
Otra forma de realización de la invención se
caracteriza porque como marcador detectable se usa un marcador no
radiactivo, especialmente un marcador coloreado o fluorescente, un
marcador enzimático o inmunomarcador, y/o puntos cuánticos o una
señal eléctricamente medible, especialmente cambio de potencial y/o
de conductividad y/o de capacidad en las hibridaciones.
Otra forma de realización de la invención se
caracteriza porque el ARN de muestras y el ARN del gen de control
y/o derivados enzimáticos o químicos llevan el mismo marcado.
Otra forma de realización de la invención se
caracteriza porque el ARN del gen de prueba y el ARN del gen de
control y/o derivados enzimáticos o químicos llevan diferentes
marcados.
Otra forma de realización de la invención se
caracteriza porque las sondas de ADN se inmovilizan sobre vidrio o
plástico.
Otra forma de realización de la invención se
caracteriza porque las moléculas de ADN individuales se inmovilizan
al material de soporte mediante un enlace covalente.
Otra forma de realización de la invención se
caracteriza porque las moléculas de ADN individuales se inmovilizan
al material de soporte mediante interacciones electrostáticas y/o
dipolo-dipolo y/o hidrófobas y/o puentes de
hidrógeno.
Otra forma de realización de la invención
consiste en el uso de secuencias de ácidos nucleicos de genes de
control específicos recombinantes o preparados sintéticamente,
secuencias parciales individualmente o en cantidades parciales como
calibrador en ensayos de sepsis y/o para la evaluación de la acción
y la toxicidad en el cribado de principios activos y/o para la
preparación de agentes terapéuticos y de sustancias y mezclas de
sustancias que están previstas como agente terapéutico para la
prevención y el tratamiento de SIRS y sepsis.
Es evidente para el experto que las
características individuales de la invención expuestas en las
reivindicaciones pueden combinarse discrecionalmente entre sí sin
limitación.
Como genes de control en el sentido de la
invención se entiende todas las secuencias de ADN derivadas,
secuencias parciales y análogos sintéticos (por ejemplo, ácidos
nucleicos de péptidos, PNA). La descripción de la invención
referida a la determinación de la expresión génica al nivel del ARN
no representa ninguna limitación, sino sólo una aplicación a modo
de ejemplo.
Una aplicación del procedimiento según la
invención se encuentra en la normalización de datos de medición de
la expresión génica diferencial de sangre completa, por ejemplo,
para diferenciar entre SIRS y sepsis y sus grados de gravedad
(ambos correspondientemente a [4]). Para esto, el ARN de los genes
de control se aísla de la sangre completa de pacientes
correspondientes y una muestra de control de un probando sano o
paciente no infeccioso. A continuación se marca el ARN, por
ejemplo, radiactivamente con ^{32}P o con moléculas de colorante
(fluorescencia). Como moléculas de marcado pueden utilizarse todas
las moléculas y/o señales de detección conocidas para este fin en
el estado de la técnica. La moléculas y/o los procedimientos
correspondientes también son conocidos para el
experto.
experto.
El ARN así marcado se hibrida a continuación con
moléculas de ADN inmovilizadas sobre una micromatriz. Las moléculas
de ADN inmovilizadas sobre la micromatriz representan una selección
específica de los genes según la presente invención para la
normalización de datos de expresión génica en la diferenciación de
SIRS y sepsis.
Las señales de intensidad de las moléculas
hibridadas se miden a continuación mediante aparatos de medición
adecuados (sistema de detección y cuantificación de la
radiactividad, escáner de micromatrices) y se analizan mediante
otras evaluaciones asistidas por ordenador. A partir de las
intensidades de señal medidas se determinan las relaciones de
expresión entre los genes de prueba de la muestra del paciente y los
genes de control. A partir de las relaciones de expresión de los
genes regulados en defecto y/o en exceso pueden sacarse conclusiones
sobre la diferenciación de SIRS y sepsis como en los siguientes
experimentos representados.
Otra aplicación de las actividades génicas
determinadas mediante análisis de micromatrices con posterior
cuantificación para la normalización de los datos de expresión
génica consiste en la aplicación para la diferenciación de SIRS y
sepsis para el procesamiento electrónico con el fin de la
preparación de software para fines de diagnóstico (por ejemplo,
para la determinación de la localización de una inflamación y para
la estimación de la gravedad de enfermedad de una respuesta
inmunitaria individual, especialmente en infecciones, también en el
marco de sistemas de gestión de datos de pacientes o sistemas de
expertos), o para la modelación de rutas de transmisión de
señales
celulares.
celulares.
Para la realización de la evaluación de la
micromatriz para los fines de la presente solicitud de patente es
válido lo siguiente:
(según Minimum Information About a Microarray
Experiment [MIAME] Checkliste - nueva edición de enero de 2005,
basado en Brazma A y col., Minimum information about a microarray
experiment (MIAME)-toward standards for microarray
data, Nature Genetics 29, 365-371 (2001) [17), a
cuyo contenido completo se hace referencia mediante la
presente)
d) Resolución espacial (espacio entre píxeles) -
10 \mum.
En el marco de los experimentos se hibridaron
más de 1000 muestras de sangre de pacientes. Cada par de ARN (ARN
de paciente contra comparativo) se cohibridó en una micromatriz. A
este respecto, los ARN de pacientes se marcaron con un colorante
fluorescente rojo y los ARN comparativos con un colorante
fluorescente verde. Las imágenes digitalizadas de la matriz
hibridada se evaluaron con el software GenePix Pro 4.0 ó 5.0 de Axon
Instruments. Para la detección de puntos, la cuantificación de
señales y la evaluación de la calidad de los puntos se usó el
software de análisis GenePix^{TM}. Los puntos se marcaron
correspondientemente a los parámetros en el software GenePix^{TM}
con 100 = "buenos" ("good") , 0 = "encontrados"
("found"), -50 = "no encontrados" ("not found"), -75
= "ausentes" ("absent"), -100 = "malos" ("bad").
Los datos brutos se archivaron en un archivo *.gpr
correspondiente.
Para la normalización y la transformación
estabilizada por varianza de los datos brutos se aplicó el
procedimiento de Huber y col. [5] en el que los errores aditivos y
multiplicativos se estimaron bloque por bloque. Para esto se
recurrió a aproximadamente el 75% de todos los puntos. Las señales
se transforman a continuación con la función arsenh (por tanto, la
relación transformada de \pm0,4 se corresponde con aproximadamente
un cambio de 1,5 veces {para números mayores el arsenh (x) es casi
idéntico al ln (2x)}.
Rocke DM, Durbin B, A model for measurement
error for gene expression arrays, J Comput Biol. 2001;
8(6):557-69 [18] han desarrollado un modelo
para estimar el error de medición en matrices de expresión génica
como función del nivel de expresión, a cuyo contenido completo se
hace referencia mediante la presente. Este modelo de error, junto
con otros procedimientos de análisis, transformaciones de datos y
ponderaciones, ya permite una comparación más precisa de los datos
de expresión génica y proporciona pautas para análisis del fondo,
determinación de intervalos de confianza y procesamiento de los
datos de análisis para su posterior procesamiento o análisis
multifactorial.
Basándose en el modelo de error anteriormente
mencionado de Rocke y Durbin [18], Huber W, Heydebreck A y Sueltmann
H, Variance stabilization applied to microarray data calibration
and to the quantification of differential expression,
Bioinformatics. 2002; 18 Suppl 1:S96-104 [19], han
desarrollado un modelo estadístico para datos de expresión génica
de micromatrices, a cuyo contenido completo se hace referencia
mediante la presente. El modelo comprende un calibrado de datos, la
cuantificación de diferentes niveles de expresión, así como la
cuantificación del error de medición. Huber y col. [19] han deducido
para esto una transformación de datos para las mediciones de la
intensidad de señal y una estadística diferencial que con uso de la
función de área arsenh conduce a una estabilización de la varianza
y a una normalización de un conjunto de datos de señales a lo largo
de un intervalo de intensidad completo. Este procedimiento se mostró
especialmente mediante datos de expresión génica en micromatrices,
pero en el marco
de la presente invención también puede transferirse a otros procedimientos para la medición de la expresión génica.
de la presente invención también puede transferirse a otros procedimientos para la medición de la expresión génica.
Por tanto, la dependencia de la varianza
frecuentemente observada en la evaluación de señales de la
intensidad de señal se compensa por la transformación mencionada
mediante la función de área.
Los replicados técnicos (múltiples puntos de la
misma muestra) sobre la micromatriz se separan por filtración de
las intensidades de señal corregidas y transformadas en función de
su calidad de puntos. Para cada punto se seleccionan los replicados
con la mayor caracterización y se promedia la intensidad de señal
correspondiente. La expresión de puntos con replicados
exclusivamente no medibles se caracteriza con "ND" (no
disponible, "NA", not available).
Otra aplicación del procedimiento según la
invención consiste en la medición de la expresión génica diferencial
para la determinación concomitante con la terapia de la
probabilidad de que pacientes respondan a la terapia planteada y/o
para la determinación de la respuesta a una terapia especializada
y/o a la fijación del fin de la terapia en el sentido de una
"monitorización de fármacos" ("drug monitoring") en
pacientes con SIRS y sepsis y sus grados de gravedad. Para esto, el
ARN (ARN de prueba y ARN de control) se aísla de muestras de sangre
del paciente recogidas a intervalos temporales. Las distintas
muestras de ARN se marcan juntas y se hibridan con genes de prueba
seleccionados, así como genes de control que están inmovilizados
sobre una micromatriz. Por tanto, a partir de las relaciones de
expresión entre genes de control individuales o varios genes de
control y genes de prueba como, por ejemplo, TNF alfa, puede
valorarse qué probabilidad existe de que los pacientes respondan a
la terapia planteada y/o si la terapia empezada es eficaz y/o cuánto
tiempo deben todavía tratarse correspondientemente los pacientes
y/o si ya se ha alcanzado el efecto máximo de la terapia con la
dosis y la duración usadas.
Otra aplicación del procedimiento según la
invención consiste en el uso del ARN de los genes según la invención
para la obtención de informaciones cuantitativas mediante
procedimientos independientes de la hibridación, especialmente
hidrólisis enzimática o química, procedimiento de resonancia de
plasmones superficiales (procedimiento de SPR), posterior
cuantificación de los ácidos nucleicos y/o de derivados y/o
fragmentos de los mismos.
Los transcritos de genes de control amplificados
y cuantificados mediante PCR (también otros procedimientos de
amplificación como, por ejemplo, NASBA) representan otra forma de
realización según la presente invención para la normalización de
datos de expresión génica en la diferenciación de SIRS y sepsis y
sus grados de gravedad. Las señales de intensidad de los
transcritos amplificados se miden a continuación mediante aparatos
de medición adecuados (detector de fluorescencia de PCR) y se
analizan mediante otras evaluaciones asistidas por ordenador. A
partir de las intensidades de señal medidas se determinan las
relaciones de expresión entre los genes de prueba de la muestra del
paciente y los genes de control. A partir de las relaciones de
expresión de los genes regulados en defecto y/o en exceso pueden
sacarse conclusiones sobre la diferenciación de SIRS y sepsis y sus
grados de gravedad como en los experimentos representados más
adelante.
Otra aplicación del procedimiento según la
invención consiste en el uso de las actividades génicas determinadas
mediante PCR u otros procedimientos de amplificación con posterior
cuantificación para la normalización de datos de expresión génica
para la diferenciación de SIRS y sepsis y sus grados de gravedad
para el procesamiento electrónico con el fin de la preparación de
software para fines de diagnóstico (por ejemplo, para la
determinación del foco de una inflamación y para la estimación de
la gravedad de una respuesta inmunitaria individual, especialmente
en infección bacteriana, también en el marco de sistemas de gestión
de datos de pacientes o sistemas de expertos), o para la modelación
de rutas de transmisión de señales celulares.
Otra aplicación del procedimiento dado a conocer
consiste en la determinación de una cantidad de ARNm en una muestra
que comprende a) aislamiento de los ácidos nucleicos, b) una
medición del valor de expresión de uno o varios ácidos nucleicos
seleccionados de SEQ ID 22 a SEQ ID 97; c) una comparación de los
valores de expresión de los ácidos nucleicos seleccionados con
valores de porcentaje conocidos de los ácidos nucleicos en la
cantidad total de ARNm; d) extrapolación de los valores de
expresión de uno o varios ácidos nucleicos seleccionados de SEQ ID
22 a SEQ ID 97 a la cantidad total de ARNm y d) determinación de la
cantidad total de ARNm en la muestra.
Otra aplicación del procedimiento dado a conocer
consiste en la normalización de una cantidad de ARNm dado el caso
amplificado en varias muestras que comprende a) una comparación de
los valores de expresión de uno o varios ácidos nucleicos
seleccionados de SEQ ID 22 a SEQ ID 97 a través de distintas
muestras; b) derivación de un valor para la normalización de
valores de expresión de uno o varios ácidos nucleicos seleccionados
de SEQ ID 22 a SEQ ID 97 a través de varias muestras y c) una
normalización de la expresión de otros ácidos nucleicos que se
aislaron a partir de varias muestras basándose en la etapa b).
Además, se da a conocer un kit que contiene una
selección de secuencias según SEQ ID 22 a SEQ ID 97 y/o fragmentos
de genes de las mismas con por lo menos 1-100, en
una realización preferida 1-5 y 1-10
nucleótidos, para determinar perfiles de expresión génica in
vitro en una muestra de paciente para uso como genes de
control.
Además, también se da a conocer un kit que
contiene una selección de sondas de hibridación según SEQ ID No. 1
a SEQ ID No. 7 y/o fragmentos de genes de las mismas con por lo
menos 50 nucleótidos para determinar perfiles de expresión génica
in vitro en una muestra de paciente para uso como genes de
control.
Igualmente también se da a conocer un kit que
contiene una selección de sondas de cebadores según SEQ ID No. 8 a
SEQ ID No. 21 y/o fragmentos de genes de las mismas con por lo menos
15 nucleótidos para determinar perfiles de expresión génica in
vitro en una muestra de paciente para uso como genes de
control.
En su versión más amplia y más general, la
presente revelación se refiere a las siguientes formas de
realización:
A) Por lo menos un gen de control para la
normalización de datos de análisis de la expresión génica de
muestras de sangre de un paciente, en el que el gen de control se
selecciona de las siguientes secuencias de ARN: SEQ ID 22 a SEQ ID
97, especialmente SEQ ID 87, SEQ ID 89, SEQ ID 90, SEQ ID 91, SEQ ID
93, SEQ ID 95 y SEQ ID 96.
\newpage
B) Por lo menos un cebador derivado de los genes
de control según A) para la normalización de datos de análisis de
la expresión génica basados en la amplificación de ácidos nucleicos
de muestras de sangre de un paciente, en el que el cebador se
selecciona de las siguientes secuencias de ADN: SEQ ID 8 a SEQ ID
21.
C) Por lo menos una sonda derivada de los genes
de control según B) para la normalización de datos de análisis de
la expresión génica de muestras de sangre de un paciente, en el que
el conjunto de sondas comprende la siguientes secuencias de ADN:
SEQ ID 1 a SEQ ID 7, así como sus secuencias de ácidos nucleicos
complementarios.
D) Un procedimiento para la normalización de
datos de análisis de la expresión génica con por lo menos un ácido
nucleico de control seleccionado de los genes de control según A) o
un conjunto de cebadores según B) o un conjunto de sondas según C),
en el que
- a)
- se realiza por lo menos un ensayo de análisis de la expresión génica de muestras de sangre de un paciente in vitro;
- b)
- como base para la normalización de los datos de análisis de la expresión génica de las muestras que van a investigarse se investiga conjuntamente por lo menos un ácido nucleico de control en el mismo ensayo;
- c)
- se registran las señales de los análisis de la expresión génica que reflejan el grado de expresión génica de una pluralidad de genes, así como de por lo menos un ácido nucleico de control;
- d)
- los datos de señales obtenidos en la etapa c) se someten a una transformación matemática para debilitar por lo menos la variabilidad técnica de los datos de señales; y, por tanto,
- e)
- para normalizar los datos de señales de las muestras que van a investigarse.
E) Formas de realización preferidas del
procedimiento según D) son:
Un procedimiento según D), en el que la
transformación matemática de los datos de señales se realiza
mediante el arsenh o mediante un enfoque logarítmico;
y/o
el ensayo de la expresión génica comprende las
siguientes etapas:
f) aislamiento de ácidos nucleicos de una
muestra de sangre;
g) dado el caso una coamplificación de un
conjunto de ácidos nucleicos de control, así como de los ácidos
nucleicos que van a probarse; e
h) hibridación de sondas;
y/o
los ácidos nucleicos comprenden ARNm o
microARN;
y/o
los ácidos nucleicos se amplifican mediante PCR,
PCR en tiempo real, NASBA, TMA o SDA;
y/o
los valores de expresión de los ácidos nucleicos
de control y de prueba se determinan mediante procedimientos de
hibridación;
y/o
la medición de los valores de expresión de los
ácidos nucleicos de control y de prueba se realiza en disolución o
en ácidos nucleicos que están inmovilizados en un soporte;
y/o
el soporte es una micromatriz, partícula, perla,
vidrio, metal o membrana;
y/o
los ácidos nucleicos de control y/o de prueba
están acoplados indirectamente al soporte mediante otros componentes
de unión como anticuerpos, antígenos, oligonucleótidos, balizas
moleculares o enzimas;
y/o
los valores de expresión de los ácidos nucleicos
de control y de prueba determinados in vitro a partir de una
muestra de paciente se utilizan como parámetros de entrada para la
preparación de software para la descripción del pronóstico
individual de un paciente, para fines de diagnóstico, para las
decisiones de terapia y/o sistemas de gestión de datos de
pacientes.
F) Un uso de por lo menos un ácido nucleico de
control seleccionado de los genes de control según A) o un cebador
según B) o una sonda según C) para la normalización de un
procedimiento de análisis de la expresión génica para el
diagnóstico de enfermedades con reacción inmunitaria sistémica.
G) Formas de realización preferidas del uso
según F) son:
Un uso según F), en el que las enfermedades se
seleccionan de: sepsis, sepsis grave, choque séptico o insuficiencia
multiorgánica;
y/o
en un procedimiento para el diagnóstico in
vitro de SIRS, sepsis, sepsis grave, choque séptico o
insuficiencia multiorgánica en un individuo usando conjuntos de
ácidos nucleicos de control y ácidos nucleicos de prueba cuya
expresión es específica para SIRS o sepsis, que comprende las
siguientes etapas:
- a)
- aislamiento simultáneo de los ácidos nucleicos de control y de prueba de una muestra del individuo,
- b)
- dado el caso amplificación de los ácidos nucleicos de control y de prueba,
- c)
- determinación de los valores de expresión de los ácidos nucleicos de control y de prueba,
- d)
- una normalización de la expresión génica de los ácidos nucleicos de prueba basada en los valores de expresión de los ácidos nucleicos de control,
- e)
- determinación de si los valores de expresión normalizados del ácido nucleico de prueba han alcanzado un valor específico para SIRS, sepsis, sepsis grave, choque séptico o insuficiencia multiorgánica.
En principio, lo siguiente también es válido
para la transformación/normalización de datos en el marco de la
presente invención:
1ª variante: (se propone en experimentos de PCR
o también en matrices diagnósticas pequeñas como normalización)
Se suman las señales de los genes de control y a
continuación se calcula la relación de las señales de los genes de
prueba con respecto a la señal sumada de los genes de control. En el
caso de señales logarítmicas la relación consiste entonces en la
diferencia.
2ª variante: (por ejemplo, Huber y col. [19] en
conjuntos de "genoma completo" ("whole genome") o matrices
grandes)
Se usan las señales de los genes de control para
estimar los parámetros de una transformación adecuada o la propia
transformación.
A continuación se aplica esta transformación a
los genes de prueba.
Otras ventajas y características de la presente
invención resultan de la descripción de los ejemplos de
realización.
Ejemplo de realización
1
Se midió la expresión génica de 372 pacientes en
cuidados intensivos (pacientes en UCI). Todos los pacientes se
trataron bajo tratamiento médico de cuidados intensivos. A este
respecto, por paciente se consideraron como máximo siete días en la
UCI. En pacientes con más de siete días en la UCI se eligieron
aleatoriamente siete días. En total, en los análisis entraron los
datos de 1261 experimentos de micromatriz.
Las características seleccionadas de los
pacientes se representan en las Tablas 4 y 5. Se facilitan datos
sobre la edad, sexo y categorías de ACCP/SCCM. Como muestras de
referencia sirvieron los ARN totales de las líneas celulares
SIG-M5. Todas las muestras de pacientes se
cohibridaron en una micromatriz con la muestra de referencia,
respectivamente.
Se especifican respectivamente medianas y en
paréntesis el intervalo intercuartil (IQR)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La sangre completa de los pacientes se extrajo
de los pacientes en la unidad de cuidados intensivos mediante el
kit PAXGene según las especificaciones del fabricante (Qiagen).
Después de extraerse la sangre completa, el ARN total de las
muestras se aisló usando el kit PAXGene Blood RNA según las
especificaciones del fabricante (Qiagen).
Para el cultivo de células (muestras de control)
se utilizaron 19 criocultivos celulares (SIGM5) (congelados en
nitrógeno líquido). Las células se inocularon respectivamente con 2
ml de medio Iscove (Biochrom AG) complementado con suero bovino
fetal al 20% (SBF). Los cultivos celulares se incubaron a
continuación durante 24 horas a 37ºC con 5% de CO_{2} en placas
de 12 pocillos. Después se dividió el contenido de 18 pocillos en 2
partes con respectivamente el mismo volumen de manera que
finalmente estuvieran a disposición 3 placas de la misma forma (en
total 36 pocillos). El cultivo continuó a continuación durante 24
horas bajo las mismas condiciones. A continuación se reunieron los
cultivos resultantes de 11 pocillos de cada placa y se centrifugaron
(1000 x g, 5 min, temperatura ambiente). El sobrenadante se desechó
y el sedimento celular se disolvió en 40 ml del medio anteriormente
mencionado. Estas células disueltas en 40 ml se repartieron a partes
iguales en dos matraces de 250 ml y se incubaron de nuevo después
de 48 horas de incubación y adición de 5 ml del medio anteriormente
mencionado. 80 \mul de los 2 ml restantes de las dos placas
restantes se añadieron a pocillos vacíos de las mismas placas que
ya se habían preparado previamente con 1 ml del medio anteriormente
mencionado. Después de 48 horas de incubación sólo se procesó una
de las placas de 12 pocillos del siguiente modo: de cada pocillo se
extrajeron 500 \mul y se reunieron. Los 6 ml resultantes de esto
se añadieron a un matraz de 250 ml que contenía aproximadamente 10
ml de medio fresco. Esta mezcla se centrifugó 5 minutos a 1000 x g a
temperatura ambiente y se disolvió en 10 ml del medio anteriormente
mencionado. El posterior recuento de células produjo el siguiente
resultado: 1,5 x 10^{7} células por ml, 10 ml de volumen total,
número total de células: 1,5 x 10^{8}. Como el número de células
no era todavía suficiente se añadieron 2,5 ml de la suspensión de
células anteriormente mencionada en 30 ml del medio anteriormente
mencionado en un matraz de 250 ml (75 cm^{2}) (en total 4
matraces). Después de 72 horas de tiempo de incubación, a los
matraces se les añadieron respectivamente 20 ml de medio fresco.
Después de la siguiente incubación de 24 horas se realizó el
recuento de células como se ha descrito anteriormente, que dio un
número de células total de 3,8 x 10^{8} células. Para alcanzar el
número de células deseado de 2 x 10^{6} células, las células se
resuspendieron en 47,5 ml del medio anteriormente mencionado en 4
matraces. Después de un tiempo de incubación de 24 horas, las
células se centrifugaron y se lavaron dos veces con tampón fosfato
sin Ca^{2+} ni Mg^{2+} (Biochrom AG).
El aislamiento del ARN total se realiza mediante
el kit NucleoSpin RNA L (Machery&Nagel) correspondientemente a
las indicaciones del fabricante. El procedimiento anteriormente
descrito se repitió hasta que se alcanzó el número de células
necesario. Esto fue necesario para alcanzar la cantidad necesaria de
6 mg de ARN total, lo que se corresponde con aproximadamente una
eficiencia de 600 \mug de ARN por 10^{8} células.
Después de extraer la sangre completa, el ARN
total de las muestras se aisló usando el kit PAXGene Blood RNA
(PreAnalytiX) según las especificaciones del fabricante y se
comprobó para su calidad. De cada muestra se tomaron alícuotas de
10 \mug de ARN total y junto con 10 \mug de ARN total de células
SIGM5 como ARN de referencia se transcribieron en ADN
complementario (ADNc) con la transcriptasa inversa Superscript II
(Invitrogen) y el ARN se eliminó a continuación de la mezcla
mediante hidrólisis alcalina. En la mezcla de reacción se sustituyó
una parte del dTTP por aminoalil-dUTP
(AA-dUTP) para hacer posible posteriormente el
acoplamiento del colorante de fluorescencia al ADNc.
Después de la purificación de la mezcla de
reacción, los ADNc de las muestras y los controles se marcaron
covalentemente con el colorante de fluorescencia Alexa 647 y Alexa
555 y se hibridaron sobre una micromatriz de la empresa
SRIS-Lab. Sobre la micromatriz usada se encuentran
5308 polinucleótidos inmovilizados con una longitud de
55-70 pares de bases que representan respectivamente
un gen humano y puntos de control para el aseguramiento de la
calidad. Una micromatriz está dividida en 28 submatrices con una
rejilla de 15x15 puntos.
La hibridación y el posterior lavado o secado se
realizó en la estación de hibridación HS 400 (Tecan) según las
indicaciones del fabricante durante 10,5 horas a 42ºC. La disolución
de hibridación usada está constituida por las muestras de ADNc
marcadas respectivas, 3,5x SSC (1x SSC contiene cloruro sódico 150
mM y citrato sódico 15 mM), dodecilsulfato de sodio al 0,3% (v/v),
formamida al 25% (v/v) y 0,8 \mug \mul^{-1} de cada uno de
cot-1 DNA, ARNt de levadura y ARN de
poli-A. El posterior lavado de las micromatrices se
realizó con el siguiente programa a temperatura ambiente: cada 90
segundos lavado con tampón de lavado 1 (2x SSC, dodecilsulfato de
sodio al 0,03%), con tampón de lavado 2 (1x SSC) y por último con
tampón de lavado 3 (0,2x SSC). Después, las micromatrices se
secaron bajo una corriente de nitrógeno con una presión de 2,5 bar
(0,25 MPa) a 30ºC durante 150 segundos.
Después de la hibridación, las señales de
hibridación de las micromatrices se leyeron con un escáner GenePix
4000B (Axon) y las relaciones de expresión de los genes
diferencialmente expresados se determinaron con el software GenePix
Pro 4.0 (Axon).
Para la evaluación, la intensidad media de un
punto se determinó como la mediana del valor de los píxeles de
puntos correspondientes.
Para una primera preselección de las sondas de
genes la corrección de errores sistemáticos se realizó según el
enfoque de Huber y col. [5]. A este respecto, el sesgo aditivo y
multiplicativo dentro de una micromatriz se estimó a partir del 75%
de las muestras de genes presentes.
A continuación, las relaciones normalizadas y
transformadas de las señales de las muestras de pacientes se
calcularon frente a los controles generales. Es decir, para el gen j
de la matriz k el cálculo dio el valor
G_{j,k}=arsenh(Scy5(j,k)
-
arsenh(Scy3(j,k))
en la que [Scy3(j,k),
Scy5(j,k)] designa el par de señales de fluorescencia
respectivo. Para todas las sondas de genes se calculó a
continuación la mediana de las desviaciones absolutas de la mediana
(DAM), es decir, DAM(G_{j,1}, ..., G_{j,1261}), y se
seleccionó el 10% de las sondas de genes con la DAM más pequeña.
Como segundo criterio para la preselección se empleó la intensidad
de señal media arsenh(Scy5(j,k)) +
arsenh(Scy3(j,k)). En los otros análisis sólo se
consideraron sondas de genes cuya mediana de la intensidad de señal
media se encontraba en el intervalo de señales dinámico,
preferiblemente entre 6 y 8 (en la escala
logarítmica).
Se calcularon cantidades relativas para las
sondas de genes preseleccionadas fijando el mayor valor de expresión
a 1. A continuación se calculó la medida de estabilidad génica M de
Vandesompele y col. [6]. Las sondas de genes se dispusieron según
su estabilidad mediante el procedimiento escalonado también descrito
en Vandesompele y col. en el que en cada etapa se elimina el gen
con la menor estabilidad. Como valor umbral superior para la
selección de las sondas
de genes se tomó por base el valor (redondeado) de 0,6 para el valor medio de la medida de estabilidad M (Tabla 6).
de genes se tomó por base el valor (redondeado) de 0,6 para el valor medio de la medida de estabilidad M (Tabla 6).
La definición matemática para la medida de
estabilidad génica M es según Vandesompele y col.:
Para cada combinación de dos genes de control
internos j y k se especifica una matriz A_{jk} de m elementos que
está constituida por las relaciones de expresión transformadas por
log_{2} a_{ij}/a_{ik} (Ecuación 1). La variación V_{jk} de
datos emparejados para los genes de control j y k se define además
como la desviación estándar de los elementos A_{jk} (Ecuación 2),
en la que DE es la desviación estándar. La medida de estabilidad
génica M_{j} para el gen de control j es entonces la media
aritmética de todas las variaciones de datos emparejados V_{jk}
(Ecuación 3):
(Para cada j,k es válido \in [1,n] y j \neq
k):
Se determinó un conjunto de 76 secuencias
específicas con actividad génica invariable correspondientemente a
SEQ ID No. 22 a SEQ ID No. 97 que son constituyentes de la lista de
secuencias adjunta.
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Ejemplo de realización
2
Los inventores muestran en este ejemplo de
realización que los genes de control determinados en el primer
ejemplo de realización también son estables en pacientes tratados
con cuidados intensivos con y sin sepsis. Los inventores
consideraron para esto datos de micromatrices de 118 pacientes. En
total se analizaron 394 días de pacientes (micromatrices),
considerándose como máximo siete días por paciente.
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* pacientes tratados con cuidados intensivos que
no han desarrollado SIRS ni sepsis
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Se especifica respectivamente la mediana y en
paréntesis el intervalo intercuartil (IQR).
Se eligieron los siguientes genes de prueba para
demostrar una aplicabilidad de los genes de control mediante una
comparación de pacientes con SIRS y sepsis (véase la Tabla 9).
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Estos genes de prueba se describen en la
bibliografía científica en relación con la sepsis.
\newpage
Para el análisis estadístico se seleccionaron 6
pacientes con SIRS grave (SIRS + disfunciones orgánicas) y 9
pacientes con sepsis grave (sepsis + disfunciones orgánicas) (Tabla
10).
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Se especifica respectivamente la mediana y en
paréntesis el intervalo intercuartil (IQR).
La normalización de los diez genes de prueba se
realizó mediante los siguientes cinco genes de control seleccionados
aleatoriamente. Para esto se usó el procedimiento de Vandesompele y
col. [6] (Tabla 11).
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Una comparación mediante la prueba de la t de
dos muestras proporciona el siguiente resultado (Tabla 12)
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\newpage
Para demostrar la reproducibilidad de los
resultados se repitió la comparación estadística seleccionándose
aleatoriamente de nuevo cinco genes de control (conjunto 2) (Tabla
13)
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la normalización mediante el
procedimiento de Vandesompele y col. los inventores obtienen los
siguientes resultados para la prueba de t de dos muestras (Tabla
14):
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Los resultados muestran una reproducibilidad muy
buena de los resultados. En ambas comparaciones, marcadores
idénticos al 5% o al 10% de nivel son significativos.
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Ejemplo de realización
3
Mediante la transcripción inversa, el ARNm se
transcribió independientemente de su secuencia en ADNc con ayuda de
un cebador oligo(dT). Las hebras de ADNc formadas a este
respecto complementarias al ARNm utilizado se utilizaron a
continuación como molde para distintas reacciones de PCR.
a) Para el lote se pipetearon juntos los
siguientes constituyentes:
- -
- 5 \mug de ARN concentrado
- -
- 10 \mul de H_{2}O
- -
- 1 \mul de dNTP (dGTP, dATP, dCTP, dTTP)
- -
- 1 \mul de oligo(dT) (0,5 \mug/\mul)
b) 5 min a 70ºC, a continuación 5 min sobre
hielo
c) a continuación se añadió la siguiente
mezcla:
- -
- 4 \mul de tampón de RT
- -
- 2 \mul de DTT 0,1 M
- -
- 1 \mul de RNasa OUT (inhibidor de RNasa)
- -
- 1 \mul de transcriptasa inversa SuperScript
d) incubar 1 h a 42ºC
e) incubar 15 min a 70ºC
Con ayuda de PCR se amplificó el fragmento de
ADN seleccionado y a continuación se cuantificó y así se determinó
la intensidad de la expresión génica de los genes de control:
Para la PCR se usó el sistema de Taq ADN
polimerasa AccuPrime de Invitrogen.
Para un lote de 25 \mul se pipetean juntos los
siguientes constituyentes en un tubo de 200 \mul:
| 2,5 \mul | de 10x tampón I de PCR AccuPrime |
| 20 \mul | de RNasa libre de H_{2}O |
| 1 \mul | de molde de ADN diluido1:10 (aproximadamente 0,82 ng/\mul) |
| 1 \mul | de mezcla de cebadores (0,5 \mul de cada uno de cebador directo/inverso correspondientemente a la |
| Tabla 2) | |
| 0,5 \mul | de Taq ADN polimerasa AccuPrime |
Se realiza el siguiente programa en el ciclador
térmico de PCR en tiempo real (Corbett Research RG 3000):
El ADN de molde se desnaturalizó primero
completamente a 94ºC y la enzima se activó. A continuación siguieron
30 ciclos de amplificación constituidos por desnaturalización a
94ºC, hibridación a 58ºC y extensión a 68ºC. A continuación de la
PCR, las muestras se aplicaron sobre un gel de agarosa al 1,5% para
comprobar la exactitud de los productos mediante el tamaño de los
fragmentos.
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\vskip0.400000\baselineskip
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85SL0593
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<211> 5133
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<211> 2357
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 92
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<211> 4034
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<212> DNA
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<212> DNA
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (15)
1. Conjunto de genes de control para la
normalización de datos de análisis de la expresión génica de
muestras de sangre de un paciente, en el que el conjunto de genes
de control comprende las siguientes secuencias de ARN: SEQ ID 87,
SEQ ID 89, SEQ ID 90, SEQ ID 91, SEQ ID 93, SEQ ID 95 y SEQ ID
96.
2. Conjunto de cebadores derivado del conjunto
de genes de control según la reivindicación 1 para la normalización
de datos de análisis de la expresión génica basados en la
amplificación de ácidos nucleicos de muestras de sangre de un
paciente, en el que el conjunto de cebadores comprende las
siguientes secuencias de ADN: SEQ ID 8 a SEQ ID 21.
3. Conjunto de sondas derivado del conjunto de
genes de control según la reivindicación 1 para la normalización de
datos de análisis de la expresión génica de muestras de sangre de un
paciente, en el que el conjunto de sondas comprende las siguientes
secuencias de ADN: SEQ ID 1 a SEQ ID 7, así como sus secuencias de
ácidos nucleicos complementarios.
4. Procedimiento para la normalización de datos
de análisis de la expresión génica con un conjunto de ácidos
nucleicos de control seleccionado de un conjunto de genes de control
según la reivindicación 1 o de un conjunto de cebadores según la
reivindicación 2 o de un conjunto de sondas según la reivindicación
3, en el que
- a)
- se realiza por lo menos un ensayo de análisis de la expresión génica de muestras de sangre de un paciente in vitro;
- b)
- como base para la normalización de los datos de análisis de la expresión génica de las muestras que van a investigarse, en el mismo ensayo se investigan conjuntamente un conjunto de ácidos nucleicos de control según la reivindicación 1 o un conjunto de cebadores según la reivindicación 2 o un conjunto de sondas según la reivindicación 3;
- c)
- se registran las señales de los análisis de la expresión génica que reflejan el grado de expresión génica de una pluralidad de genes, así como del conjunto de ácidos nucleicos de control;
- d)
- los datos de señales obtenidos en la etapa c) se someten a una transformación matemática para debilitar por lo menos la variabilidad técnica de los datos de señales; y
- e)
- para así normalizar los datos de señales transformados de las muestras que van a investigarse.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado porque la transformación matemática de los
datos de señales se realiza mediante el arsenh o mediante un
enfoque logarítmico.
6. Procedimiento según la reivindicación 4 ó 5,
caracterizado porque el ensayo de expresión génica comprende
las siguientes etapas:
- a)
- aislamiento de los ácidos nucleicos de una muestra de sangre;
- b)
- dado el caso una coamplificación de un conjunto de ácidos nucleicos de control, así como los ácidos nucleicos que van a probarse; e
- c)
- hibridación de sondas.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que los ácidos nucleicos comprenden ARNm o microARN.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 4-7, en el que los ácidos nucleicos
se amplifican mediante PCR, PCR en tiempo real, NASBA, TMA o
SDA.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 6-8, en el que los valores de
expresión de los ácidos nucleicos de control y de prueba se
determinan mediante procedimientos de hibridación.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 4-9, en el que la medición de los
valores de expresión de los ácidos nucleicos de control y/o de
prueba se realiza en disolución o en ácidos nucleicos que están
inmovilizados en un soporte.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que el soporte es una micromatriz, partícula, perla, vidrio,
metal o membrana.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 4-11, en el que los ácidos
nucleicos de control y/o de prueba están acoplados indirectamente
al soporte mediante otros componentes de unión como anticuerpos,
antígenos, oligonucleótidos, balizas moleculares o enzimas; y/o en
el que los valores de expresión de los ácidos nucleicos de control
y de prueba determinados in vitro a partir de una muestra de
paciente se utilizan como parámetros de entrada para la preparación
de software para la descripción del pronóstico individual de un
paciente, para fines de diagnóstico, para las decisiones de terapia
y/o sistemas de gestión de datos de pacientes.
13. Uso de un conjunto de ácidos nucleicos de
control seleccionado de un conjunto de genes de control según la
reivindicación 1 o de un conjunto de cebadores según la
reivindicación 2 o de un conjunto de sondas según la reivindicación
3 para la normalización de un procedimiento de análisis de la
expresión génica para el diagnóstico de enfermedades con reacción
inmunitaria sistémica.
14. Uso según la reivindicación 13, en el que
las enfermedades se seleccionan de: sepsis, sepsis grave, choque
séptico o insuficiencia multiorgánica.
15. Uso según la reivindicación 13 ó 14 en un
procedimiento para el diagnóstico in vitro de SIRS, sepsis,
sepsis grave, choque séptico o insuficiencia multiorgánica en un
individuo usando conjuntos de ácidos nucleicos de control y ácidos
nucleicos de prueba cuya expresión es específica para SIRS o sepsis
que comprende las siguientes etapas:
- a)
- aislamiento simultáneo de los ácidos nucleicos de control y de prueba de una muestra del individuo;
- b)
- dado el caso amplificación de los ácidos nucleicos de control y de prueba;
- c)
- determinación de los valores de expresión de los ácidos nucleicos de control y de prueba;
- d)
- una normalización de la expresión génica de los ácidos nucleicos de prueba basada en los valores de expresión de los ácidos nucleicos de control; y
- e)
- determinación de si los valores de expresión normalizados del ácido nucleico de prueba han alcanzado un valor específico para SIRS, sepsis, sepsis grave, choque séptico o insuficiencia multiorgánica.
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