ES2336928T3 - Metodos de diagnostico y pronostico de esteatohepatitisno alcoholica (ehna). - Google Patents
Metodos de diagnostico y pronostico de esteatohepatitisno alcoholica (ehna). Download PDFInfo
- Publication number
- ES2336928T3 ES2336928T3 ES05780314T ES05780314T ES2336928T3 ES 2336928 T3 ES2336928 T3 ES 2336928T3 ES 05780314 T ES05780314 T ES 05780314T ES 05780314 T ES05780314 T ES 05780314T ES 2336928 T3 ES2336928 T3 ES 2336928T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- nash
- subject
- genes
- expression
- ehna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Un método para el diagnóstico in vitro de esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) en un sujeto o para el diagnóstico temprano de EHNA en un sujeto o para determinar la predisposición de un sujeto a desarrollar EHNA o para determinar la fase o gravedad de EHNA en un sujeto o para seguir el efecto de la terapia administrada a dicho sujeto con dicha afección, que comprende: a) cuantificar el nivel de expresión del conjunto de 85 genes, mostrados en la tabla 2 y la tabla 3, en una muestra de tejido hepático de dicho sujeto, y b) comparar los niveles de expresión de dichos genes con el nivel de expresión de los mismos genes de una muestra control; en donde un aumento en los niveles de expresión de los genes de la tabla 2 y un descenso en el nivel de expresión de los genes de la tabla 3, relativo al nivel de expresión de los mismos genes de la muestra control, es indicativo de EHNA o indicativo de predisposición del sujeto a desarrollar EHNA.
Description
Métodos de diagnóstico y pronóstico de
esteatohepatitis no alcohólica (EHNA).
La invención se refiere a marcadores génicos
tempranos para esteatohepatitis no alcohólica (EHNA). Dichos genes
se pueden usar en métodos para diagnosticar EHNA, más
específicamente para el diagnóstico temprano de EHNA, así como en
métodos para diagnosticar hígado susceptible a EHNA y para optimizar
estrategias de tratamiento de EHNA.
La esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) es una
enfermedad progresiva del hígado de etiología desconocida
caracterizada histológicamente por la acumulación de ácidos grasos,
daño a hepatocitos e inflamación parecida a la hepatitis
alcohólica. EHNA es una fase crítica en el proceso que abarca desde
la esteatosis hepática a cirrosis e insuficiencia hepática. Un
cuidadoso historial de falta de ingesta significativa de alcohol es
esencial para establecer este diagnóstico. EHNA es una de las causas
más comunes de aminotransferasas elevadas en pacientes remitidos
para evaluación a hepatólogos. La obesidad y la diabetes de tipo 2
están asociadas con EHNA. Puesto que la prevalencia de estas
enfermedades está en aumento, también se espera que aumente la
prevalencia de EHNA y por tanto, esta enfermedad se ha convertido en
un asunto público emergente en los Estados Unidos así como en otros
países.
Se piensa que EHNA se origina de la interacción
de muchos genes diferentes y factores del estilo de vida. Se han
implicado el deterioro mitocondrial, estrés oxidativo y
desregulación metabólica en la patogénesis de la esteatohepatitis.
La evaluación inicial de pacientes en los que se sospecha que existe
EHNA, son fatiga y malestar abdominal superior derecho. La
hepatomegalia se encuentra en el 90 por ciento de casos. El mejor
método para la detección de infiltración grasa del hígado es la
ecografía. La principal y con frecuencia única anormalidad
analítica es un aumento de las aminotransferasas en suero. La
biopsia hepática está indicada en pacientes sintomáticos con
aumentos de aminotransferasas en suero de más de 6 meses de
duración. Las características histológicas de EHNA que en su
mayoría son indistinguibles de las de la hepatitis alcohólica
incluyen infiltración grasa macrovesicular, necrosis hepatocelular
y degeneración por hinchamiento, hialino alcohólico y reacción
inflamatoria.
Como es cierto para otras enfermedades
complejas, los factores genéticos que contribuyen al desarrollo de
EHNA se pueden identificar más fácilmente combinando estudios en
pacientes con EHNA y en modelos animales de la enfermedad. Uno de
estos modelos es el ratón deficiente en MAT1A
(MAT1A-KO). Aproximadamente a los 3 meses de edad,
los hígados de MAT1A-KO tienen histología normal
pero son más sensibles a desarrollar esteatosis grave. Estos
ratones desarrollan espontáneamente EHNA y carcinoma hepatocelular
aproximadamente a los 8 y 15 meses de edad, respectivamente [Lu SC,
2001, PNAS USA 98, 5560-5565]. El gen MAT1A
codifica la metionina adenosiltransferasa I y III, las principales
enzimas responsables de la síntesis de
S-adenosilmetionina (SAMe) en el hígado. Estudios
anteriores concluyeron que los pacientes con cirrosis hepática y
hepatitis alcohólica son deficientes en la síntesis de SAMe; y que
el tratamiento con SAMe mejora la supervivencia en pacientes con
cirrosis hepática
alcohólica.
alcohólica.
En una solicitud de patente anterior
(WO2004/055520), los inventores desarrollaron un método para el
diagnóstico de EHNA usando marcadores moleculares basados en la
determinación proteómica de un conjunto de proteínas detectadas en
muestras de tejido hepático, en lugar de una determinación de la
huella genómica, como el método divulgado ahora en la presente
invención. Ninguno de esos genes se incluye en la presente
invención.
Se ha divulgado un método para detectar y
cuantificar genes diferencialmente expresados en individuos
afectados en la fase cirrótica [Sreekumar R. et al., 2003,
Hepatology, Julio 2003, 244-251]. Sin embargo, dicho
método no se puede usar para el diagnóstico de EHNA, sino para el
diagnóstico de cirrosis.
El diagnóstico temprano de EHNA se ha refrenado
por la falta de marcadores tempranos fiables del desarrollo de
EHNA. La identificación de genes expresados diferencialmente en EHNA
potencialmente útiles como marcadores biológicos o dianas
terapéuticas podría producir el desarrollo de nuevas herramientas
para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de esta
enfermedad.
Es difícil predecir a partir de características
clínicas y patológicas estándar la evolución clínica de sujetos
susceptibles a EHNA o la de pacientes que padecen EHNA. Sin embargo,
es muy importante en el tratamiento de esta población seleccionar y
realizar un control y planteamientos terapéuticos apropiados.
El amplio intervalo de subgrupos susceptibles a
EHNA y las variaciones en la evolución de la enfermedad limitan la
capacidad predictiva del profesional de la salud. Los métodos
disponibles para diseñar estrategias para tratar sujetos
susceptibles a EHNA son complejos y llevan tiempo. El tratamiento en
paciente con sobrepeso consiste en una pérdida de peso gradual
moderada. La hiperglucemia y la hiperlipidemia se controlan con
medicación. Algunos fármacos tales como antibióticos, ácido
ursodesoxicólico y vitamina E se están evaluando. Sin embargo, a
pesar de la mejora en pruebas hepáticas, la infiltración grasa
detectada mediante ecografía permanece sin cambios. El trasplante
de hígado está indicado para pacientes que han desarrollado cirrosis
avanzada.
Por tanto, existe una necesidad para el
diagnóstico, especialmente para el diagnóstico temprano, pronóstico
y tratamiento de EHNA.
Se han analizado datos generados de los perfiles
de expresión en todo el genoma (datos de micromatrices) de muestras
hepáticas de pacientes con EHNA y de un modelo de ratón de EHNA
(MAT1A-KO) para obtener la firma genómica de EHNA.
Se ha usado una técnica de análisis que combina bioinformática y
métodos estadísticos. Esta firma genómica de EHNA distingue con
precisión entre pacientes con EHNA de fase temprana y controles
sanos.
Un aspecto de la invención se refiere a un
método para diagnosticar in vitro esteatohepatitis no
alcohólica
(EHNA) en muestras de tejido hepático, basado en la coexpresión de un conjunto de 85 genes que muestran diferencias específicas en la expresión génica entre pacientes y controles. El método permite la evaluación fácil y fiable del riesgo potencial de un sujeto a desarrollar EHNA, lo que significa que permite la determinación de este sujeto, en un grupo de población, para el riesgo de desarrollar EHNA. El sujeto mencionado puede ser un sujeto al que no se le ha diagnosticado previamente EHNA o un sujeto al que se le ha diagnosticado EHNA para confirmar. Como ejemplo, se puede analizar un sujeto al que previamente no se le ha diagnosticado EHNA o que no tiene síntomas para obtener información sobre la posibilidad de que ese sujeto desarrolle EHNA en el futuro. Por lo tanto, en una forma de realización particular, el método permite evaluar la predisposición (diagnóstico temprano) de un sujeto a desarrollar EHNA, mientras que en otra forma de realización particular, el mismo método permite el diagnóstico de confirmación de la existencia de EHNA en un sujeto.
(EHNA) en muestras de tejido hepático, basado en la coexpresión de un conjunto de 85 genes que muestran diferencias específicas en la expresión génica entre pacientes y controles. El método permite la evaluación fácil y fiable del riesgo potencial de un sujeto a desarrollar EHNA, lo que significa que permite la determinación de este sujeto, en un grupo de población, para el riesgo de desarrollar EHNA. El sujeto mencionado puede ser un sujeto al que no se le ha diagnosticado previamente EHNA o un sujeto al que se le ha diagnosticado EHNA para confirmar. Como ejemplo, se puede analizar un sujeto al que previamente no se le ha diagnosticado EHNA o que no tiene síntomas para obtener información sobre la posibilidad de que ese sujeto desarrolle EHNA en el futuro. Por lo tanto, en una forma de realización particular, el método permite evaluar la predisposición (diagnóstico temprano) de un sujeto a desarrollar EHNA, mientras que en otra forma de realización particular, el mismo método permite el diagnóstico de confirmación de la existencia de EHNA en un sujeto.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para determinar in vitro la predisposición de un
sujeto a desarrollar EHNA o para determinar la fase o gravedad de
EHNA en un sujeto o para seguir el efecto de la terapia
administrada a dicho sujeto con dicha afección.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a una
matriz de ácidos nucleicos en fase sólida. La matriz comprende un
conjunto de sondas útiles para detectar e identificar el conjunto de
marcadores génicos tempranos de EHNA, que consiste esencialmente en
todos los genes mostrados en las tablas 2 y 3, fijados a un sustrato
sólido.
Un kit que comprende un conjunto de sondas para
detectar e identificar el conjunto de marcadores génicos tempranos
de EHNA, opcionalmente fijados en un sustrato sólido, constituye
otro aspecto de la presente divulgación.
Un aspecto adicional de la presente invención se
refiere a un método in vitro para identificar y/o evaluar la
eficacia de un agente potencialmente terapéutico contra EHNA.
La figura 1 muestra la expresión hepática de las
98 sondas humanas de Affymetrix, que corresponden a los 85
marcadores génicos tempranos de EHNA validados, en pacientes de
EHNA, controles sanos y pacientes con esteatosis hepática. Los
falsos colores indican expresión diferencial (rojo, aumento; verde,
disminución; negro, sin cambio de expresión). Los valores mostrados
son la diferencia entre los niveles de expresión y el nivel de
expresión medio medido en desviaciones estándar. Nombre, nombre del
gen; EHNA, pacientes con esteatohepatitis no alcohólica; Control,
controles sanos; Esteatosis, pacientes con esteatosis hepática.
Para facilitar la comprensión de la presente
solicitud de patente a continuación se enumera el significado de
algunos términos y expresión dentro del contexto de la
invención.
El término "sujeto", como se usa aquí, se
refiere a todos los animales clasificados como mamíferos e incluye,
pero no está restringido a, animales domésticos y de granja,
primates y humanos, por ejemplo, seres humanos, primates no
humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o
roedores. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano hombre o
mujer de cualquier edad o raza. Ejemplos ilustrativos, no
limitantes, de sujetos según la invención incluyen seres humanos
que se sospecha que tienen infiltración grasa del hígado o
pacientes con aumentos de las aminotransferasas en suero durante un
periodo largo (más de 6 meses de duración) o pacientes sospechosos
de tener EHNA. Los métodos para identificar pacientes sospechosos de
tener EHNA pueden incluir exploración física, antecedentes médicos
de la familia del sujeto, antecedentes médicos del sujeto, biopsia
hepática o ciertas tecnologías de diagnóstico por imagen tal como
ecografía.
El término "EHNA" se refiere a
esteatohepatitis no alcohólica. El experto en las técnicas médicas
conoce bien métodos de diagnóstico para EHNA y la delineación
clínica de los diagnósticos de EHNA.
La expresión "marcadores génicos tempranos
para EHNA" se refiere a genes que mediante su sobreexpresión
(aumento) o represión (disminución) indican EHNA en fases tempranas
de dicha patología o la predisposición de un sujeto con el tiempo
de padecer EHNA. Según la invención, los marcadores génicos
tempranos para EHNA comprenden el conjunto de 85 genes enumerados
en las tablas 2 y 3 que constituyen además la firma (huella)
genómica de EHNA (temprana).
El término "gen" se refiere a una secuencia
de nucleótidos en un ácido nucleico genético que codifica un
polipéptido y variantes del mismo y puede representar una parte de
la secuencia codificante o la secuencia codificante entera o una
parte de una secuencia no codificante.
La invención descrita aquí se refiere a la
identificación de un conjunto de genes expresados en tejido hepático
susceptible a EHNA que son predictivos del desenlace clínico de la
patología hepática. Los cambios en el fenotipo celular en EHNA con
frecuencia son el resultado de uno o más cambios en la expresión del
genoma de la célula. Algunos genes se expresan en diferentes fases
de EHNA, que tienen distintos pronósticos y requieren distintas
pautas de tratamiento para optimizar el desenlace del paciente. Se
puede examinar la expresión diferencial de genes asociados a EHNA,
por ejemplo, mediante la evaluación de la expresión de ácido
nucleico en una muestra de tejido hepático.
La presente invención se basa en la
identificación de un conjunto de 85 genes diferencialmente
expresados en muestras de tejido hepático susceptible a EHNA
comparadas con muestras de tejido hepático de sujetos control (por
ejemplo, sujetos sin EHNA). La tabla 1 muestra el conjunto de los 85
marcadores génicos discriminatorios (tempranos) específicos de EHNA
en muestras de tejido hepático humano que constituyen la firma
(huella) genómica de EHNA (temprano) en seres humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Entre los genes que comprenden la firma genómica
de EHNA, hay 34, más de lo que esperaría por casualidad, que son
enzimas, la mayoría de ellas son hidrolasas, transferasa y
oxidorreductasas. La lista en la tabla 1 también incluye varios
genes de unión a ligandos (unión a metales pesados, unión a
nucleótidos, unión a proteínas, receptores y factores de
transcripción), transportadores (de hidratos de carbono,
transportadores de electrones y transportadores de proteínas);
reguladores de apoptosis; chaperonas; factores de coagulación
sanguíneos y varios genes con función desconocida. Sin embargo,
todos los genes comprendidos en el grupo que constituye la firma
genómica de EHNA, incluso aquellos con función desconocida, tienen
valor como herramienta integrada de diagnóstico para la enfermedad,
midiendo la coexpresión de los genes comprendidos en el grupo, en
pacientes comparados con la coexpresión de los genes de referencia
en muestras control.
La firma genómica de EHNA proporcionada por la
presente invención distingue con precisión entre pacientes con EHNA
de fase temprana y controles sanos. Los pacientes con esteatosis
hepática tienen una firma genómica intermedia entre la de los
pacientes con EHNA y los controles, lo que ofrece la posibilidad de
un diagnóstico temprano, que mejora la probabilidad de intervenir
con un tratamiento eficaz.
Los genes identificados en la firma genómica de
EHNA permiten, entre otros, un cribado rápido de muestras
patológicas mediante técnicas convencionales, tal como, por ejemplo,
mediante tecnología de hibridación en micromatriz de ácidos
nucleicos, para determinar la expresión de los genes específicos y
de esta manera predecir el desenlace de EHNA. Tal cribado es
beneficioso, por ejemplo, para seleccionar el tratamiento a
proporcionar al paciente y para seguir la eficacia de un
tratamiento ya administrado a un paciente. Según esto, la evaluación
y comparación de dichos niveles de expresión génica en muestras de
tejido hepático puede ser tanto diagnóstica como pronóstica de
EHNA. Por ejemplo, un nivel de expresión elevado de los genes
descritos en la tabla 2 (posteriormente) junto con un nivel de
expresión disminuido de los genes descritos en la tabla 3
(posteriormente), en una muestra de tejido hepático, es indicativo
de EHNA o es indicativo de riesgo o predisposición del sujeto a
desarrollar EHNA. Por lo tanto, se puede usar el descubrimiento
anteriormente mencionado, por ejemplo, en cualquiera de los
siguientes métodos: ensayos diagnósticos, ensayos pronósticos,
seguimiento del tratamiento, seguimiento de ensayos clínicos y
ensayos de cribado como se describe aquí adicionalmente.
La invención simplifica la determinación
pronóstica proporcionando un conjunto identificado de genes
tempranos cuya expresión en sujetos susceptibles a EHNA o sujetos
diagnosticados con EHNA, predice el desenlace clínico definido por
EHNA, cirrosis, carcinoma hepatocelular o muerte.
El conjunto de genes de expresión tiene
múltiples usos incluyendo, pero no limitado a, los siguientes
ejemplos. El conjunto de genes de expresión se puede usar como una
herramienta de pronóstico para pacientes susceptibles a EHNA, para
hacer posible un diagnóstico más refinado de EHNA y permitir a los
profesionales de la salud ajustar el tratamiento a las necesidades
del paciente individual. La invención también puede evaluar la
eficacia de un tratamiento de EHNA determinando la progresión o
regresión de EHNA en pacientes antes, durante y después del
tratamiento de EHNA. Otra utilidad del conjunto de genes de
expresión es en la investigación de las industrias biotecnológicas
y farmacéuticas en el descubrimiento de vías de enfermedad para el
direccionamiento terapéutico. La invención puede identificar
alteraciones en la expresión génica en EHNA y también se puede usar
para descubrir y probar agentes farmacéuticos candidatos para
tratar EHNA. La invención también presenta dianas potenciales para
el desarrollo de fármacos porque identifica genes que se expresan
diferencialmente en el desenlace en tejido hepático con EHNA, que
se puede utilizar en el desarrollo de fármacos para tratar tal
patología, por ejemplo, reduciendo la expresión de los genes (tabla
2) o reduciendo la actividad de las proteínas codificadas por
dichos genes o, de forma alternativa, aumentando la expresión de los
genes (tabla 3) o aumentando la actividad de las proteínas
codificadas por dichos genes.
La firma genómica de EHNA en seres humanos se
obtuvo mediante análisis de los datos generados de perfiles de
expresión en todo el genoma (datos de micromatrices) de muestras de
hígado de pacientes con EHNA y de un modelo de ratón de EHNA
(MAT1A-KO) por medio de una técnica de análisis que
combina bioinformática y métodos estadísticos (ejemplo 1).
En un aspecto, la invención se refiere a un
método in vitro para el diagnóstico de EHNA en un sujeto o
para el diagnóstico temprano de EHNA en un sujeto o para determinar
la predisposición de un sujeto a desarrollar EHNA o para determinar
la fase o gravedad de EHNA en un sujeto o para seguir el efecto de
la terapia administrada a dicho sujeto con dicha afección, de aquí
en adelante denominado el método de la invención, que comprende:
- a)
- cuantificar el nivel de expresión del conjunto de 85 genes, mostrados en la tabla 2 y la tabla 3, en una muestra de tejido hepático de dicho sujeto, y
- b)
- comparar los niveles de dichos genes con los niveles de los mismos genes de una muestra control;
en donde un aumento en los niveles de expresión
de los genes de la tabla 2 y un descenso en los niveles de
expresión de los genes de la tabla 3, relativo a los niveles de los
mismos genes de la muestra control, es indicativo de EHNA, es
decir, es una indicación de que dicho sujeto padece EHNA o
indicativo de una predisposición del sujeto a desarrollar EHNA.
Para llevar a cabo el método de la invención, se
obtiene una muestra del sujeto en estudio. En una forma de
realización particular, la muestra es una muestra de tejido
hepático, que se puede obtener por métodos convencionales, por
ejemplo, biopsia, usando métodos que conoce bien el experto en las
técnicas médicas relacionadas. Los métodos para obtener la muestra
de la biopsia incluyen partición en trozos grandes de una masa, o la
microdisección u otros métodos de separación celular conocidos en
la técnica. Las muestras se pueden obtener de sujetos previamente
diagnosticados o no con EHNA, o de sujetos que están recibiendo o
han recibido previamente tratamiento anti-EHNA. En
una forma de realización, la muestra es una muestra de un sujeto que
tiene tejido de función hepática normal, es decir, un tejido
determinado, por el experto en la técnica médica, que no tiene
evidencia de infiltración grasa del hígado, con frecuencia
acompañado por daño hepatocelular con inflamación.
Debido a la variabilidad de los tipos celulares
en material de biopsia de tejidos enfermos y a la variabilidad en
la sensibilidad de los métodos de diagnóstico usado, el tamaño de la
muestra requerido para el análisis puede variar desde 1, 10, 50,
100, 200, 300, 500, 1.000, 5.000, 10.000 a 50.000 células o más. Se
puede determinar el tamaño apropiado de muestra basado en la
composición celular y el estado de la biopsia, y los pasos
preparativos estándar para esta determinación y posterior
aislamiento del ácido nucleico para uso en la invención los conoce
bien el experto en la materia. Un ejemplo de esto, aunque no se
pretende que sea limitante, es que en algunos casos una muestra de
una biopsia puede ser suficiente para evaluar la expresión de ARN
sin amplificación, pero en otros casos la falta de células
adecuadas en una región de biopsia pequeña puede requerir el uso de
métodos de conversión de ARN y/o amplificación u otros métodos para
aumentar la resolución de las moléculas de ácido nucleico. Tales
métodos, que permiten el uso de materiales limitados de biopsia, los
conoce bien el experto en la materia e incluyen, pero no están
limitados a: amplificación directa de ARN, transcripción inversa de
ARN a ADNc, amplificación de ADNc o la generación de ácidos
nucleicos radiomarcados.
Las tablas 2 y 3 identifican el conjunto de 85
genes que distinguen con precisión entre pacientes con EHNA de fase
temprana y controles sanos. Dichos genes se identificaron analizando
los datos generados del perfil de expresión en todo el genoma de
muestras de hígado de pacientes con EHNA y de ratones
MAT1A-KO para obtener la firma genómica de EHNA en
seres humanos (ejemplo 1).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
La cuantificación del nivel de expresión del
conjunto de 85 genes mostrados en las tablas 2 y 3, en una muestra
de tejido hepático, se puede llevar a cabo mediante virtualmente
cualquier técnica adecuada para detectar y cuantificar una
pluralidad de genes. Un planteamiento para cuantificar, en una
muestra de tejido hepático, el nivel de expresión del conjunto de
85 genes mostrados en las tablas 2 y 3 comprende identificar y
cuantificar los transcritos de ARN correspondientes en la muestra
de tejido hepático mediante análisis de la expresión génica en
dicha muestra de tejido hepático. El análisis de la expresión génica
se puede llevar a cabo usando matrices de ácidos nucleicos basado
en métodos de hibridación.
El experto en la materia conoce bien métodos de
hibridación para ácidos nucleicos (véase, por ejemplo, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds.,
Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, N.Y., 1989, o Current Protocols in Molecular Biology, F. M.
Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., Nueva
York). Las moléculas de ácido nucleico de una muestra de tejido
hepático hibridan en condiciones rigurosas con los marcadores de
ácido nucleico expresados en hígado con EHNA, dichos marcadores son
el conjunto de genes mostrados en las tablas 2 y 3.
En una forma de realización particular, la
cuantificación de los niveles de expresión de dicho conjunto de 85
genes mostrados en las tablas 2 y 3 se lleva a cabo mediante
tecnología de hibridación en micromatriz de ácidos nucleicos. Según
la presente invención, se usan técnicas estándar de hibridación de
tecnología de micromatriz para evaluar patrones de expresión génica
e identificar la expresión de marcadores génicos. La tecnología de
micromatrices, que también se conoce por otros nombres incluyendo:
tecnología de chips de ADN, tecnología de chips génicos y
tecnología de matriz de ácidos nucleicos en fase sólida, es bien
conocida para el experto en la materia y se basa en, pero no
limitado a, obtener una matriz de sondas génicas identificadas
fijadas en un sustrato sólido, marcar moléculas diana con moléculas
indicadoras (por ejemplo, etiquetas radioactivas,
quimioluminiscentes o fluorescentes tales como fluoresceína,
Cye3-dUTP o Cye5-dUTP), hibridar los
genes diana con las sondas y evaluar la hibridación
diana-sonda. Una sonda con una secuencia de ácido
nucleico que se empareja perfectamente con la secuencia diana, en
general, producirá la detección de una señal
indicador-molécula más fuerte que sondas con
emparejamientos menos perfectos. Muchos componentes y técnicas
utilizadas en la tecnología de micromatrices de ácidos nucleicos se
presenten en The Chipping Forecast, Nature Genetics, Vol.21, Enero
1999.
Según la invención, las sondas se seleccionan
del grupo de ácidos nucleicos que incluyen, pero no están limitados
a, ADN, ADN genómico (ADNg), ADNc y oligonucleótidos; y pueden ser
naturales o sintéticos. Las sondas de oligonucleótidos
preferiblemente son oligonucleótidos de 20 a
25-meros mientras que las sondas de ADN/ADNc
preferiblemente tienen de 500 a 5.000 bases de longitud; no
obstante, en ambos casos, se pueden usar otros tamaños.
Se puede usar para trabajar la invención
virtualmente cualquier sonda capaz de detectar o identificar
cualquiera de los genes enumerados en la tabla 1. Las secuencias de
nucleótidos de los 85 genes enumerados en la tabla 1 se conocen y/o
se pueden obtener de bases de datos adecuadas, tal como, por
ejemplo, la Colección Internacional de Bases de Datos de Secuencias
de Nucleótidos, una colección que incluye el banco de bases de datos
de ADN de Japón (DDBJ), Laboratorio Europeo de Biología Molecular
(EMBL/EBI) y la base de datos de secuencias de nucleótidos
(GenBank, EE. UU.) [http://www.ncbi.nim.nih.gov/collab]. Por tanto,
el experto en la materia puede diseñar las sondas que se van a usar
para identificar y cuantificar los 85 genes enumerados en la tabla
1. El experto en la materia puede usar software disponible para
alcanzar ese fin. Normalmente, dichas sondas se marcarán para la
detección directa o indirecta. En una forma de realización
particular, las sondas se marcan enzimáticamente con un isotopo
radioactivo o con un marcador fluorescente para la detección
directa, mientras que en otra forma de realización particular, las
sondas se marcan química o enzimáticamente para la detección
indirecta mediante, por ejemplo, técnicas luminiscentes o
fluorimétricas.
fluorimétricas.
Según la presente invención, los sustratos de
micromatrices pueden incluir pero no están limitados a vidrio,
sílice, aluminosilicatos, borosilicatos, óxidos de metales tal como
alúmina y óxido de níquel, varias arcillas, nitrocelulosa o nailon,
preferiblemente, el sustrato es un sustrato de vidrio.
El método de la invención también incluye el
paso de comparar los niveles de expresión génica de los genes
enumerados en las tablas 2 y 3 cuantificados en una muestra de
tejido hepático del sujeto en estudio con los niveles de expresión
génica de los mismos genes en una muestra control (es decir, nivel
basal o valor de referencia). Un aumento en los niveles de
expresión de los genes de la tabla 2 junto con un descenso en los
niveles de expresión de los genes de la tabla 3, relativos a los
niveles de los mismos genes de la muestra control, es indicativo de
EHNA o indicativo de una predisposición del sujeto a desarrollar
EHNA.
En una forma de realización, la muestra control
es una muestra de tejido hepático de sujetos sin EHNA, es decir, de
un sujeto que tiene tejido con función hepática normal (es decir,
sujetos control con respecto a EHNA). Esto es particularmente útil
para el diagnóstico temprano de EHNA y/o para determinar la
predisposición de un sujeto a desarrollar EHNA.
En otra forma de realización, la muestra control
es una muestra de tejido hepático de un sujeto al que previamente
se ha diagnosticado EHNA o de sujetos que reciben o han recibo
previamente tratamiento anti-EHNA, lo que es
particularmente útil para determinar la fase o gravedad de EHNA en
un sujeto o para seguir el efecto de la terapia administrada a
dicho sujeto con dicha afección, proporcionando así al médico una
herramienta importante para tratar EHNA.
El método de la invención, basado en la medida
de los niveles de expresión génica de un conjunto (pluralidad) de
genes en muestras de tejido hepático es muy sensible y específico.
Dicho método se diferencia de las técnicas tradicionales de
diagnóstico y clasificación de EHNA con respecto a la velocidad,
sencillez y reproducibilidad de la histología diagnóstica de EHNA.
De esta manera, la invención simplifica la determinación pronóstica
proporcionando un conjunto identificado de genes tempranos cuya
expresión, en sujetos susceptibles a EHNA o sujetos diagnosticados
con EHNA, predice el desenlace clínico definido por EHNA, cirrosis,
carcinoma hepatocelular o muerte.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso
del conjunto de 85 genes, mostrados en las tablas 2 y 3, es decir,
la firma genómica de EHNA, para el diagnóstico in vitro de
EHNA en un sujeto o para el diagnóstico temprano de EHNA en un
sujeto o para determinar la predisposición de un sujeto a
desarrollar EHNA o para determinar la fase o gravedad de EHNA en un
sujeto o para seguir el efecto de la terapia administrada a dicho
sujeto con dicha afección. En una forma de realización particular,
los niveles de expresión de dicho conjunto de 85 genes mostrados en
las tablas 2 y 3 se cuantifican mediante tecnología de hibridación
en micromatriz de ácidos nucleicos en fase sólida.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a una
matriz de ácidos nucleicos en fase sólida. La matriz comprende un
conjunto de sondas útiles para detectar e identificar el conjunto de
marcadores génicos tempranos de EHNA, que consiste esencialmente de
todos los genes mostrados en las tablas 2 y 3 (o en la tabla 1),
fijados a un sustrato sólido. En una forma de realización
particular, la matriz proporcionada por la presente invención
consiste en un conjunto de sondas útiles para detectar e identificar
el conjunto de marcadores génicos tempranos de EHNA, es decir,
todos los genes mostrados en las tablas 2 y 3, junto con algunos
controles de hibridación positivos y/o negativos. Ejemplos
ilustrativos, no limitantes, de dichos controles de hibridación
incluyen una o más sondas útiles para detectar e identificar uno o
más genes diana que se deben expresar [dichos genes diana son genes
no incluidos entre los genes que constituyen la firma genómica de
EHNA según esta invención, es decir, son genes diferentes de los
incluido en las tablas 2 y 3, por ejemplo, genes constitutivamente
expresados tal como la subunidad ribosómica 18S, etc.] y, por
consiguiente, se espera un producto de hibridación entre
dicha(s) sonda(s) y dicho(s) gen(es)
diana (controles positivos de hibridación) así como una o más sondas
útiles para detectar e identificar uno o más genes que no se deben
expresar en las condiciones analizadas [es decir, genes que se sabe
que no se expresan en la enfermedad EHNA (dichos genes se conocen de
los ensayos que produjeron la firma genómica de EHNA) o incluso
genes que no están presentes en una muestra de tejido de mamífero,
por ejemplo, un gen de Drosophila melanogaster que no tiene
gen ortólogo en mamíferos, etc.)] y, por consiguiente, no se espera
un producto de hibridación entre dicha(s) sonda(s) y
dicho(s) gen(es) diana (controles negativos de
hibridación).
En una forma de realización particular, las
sondas se seleccionan del grupo de ácidos nucleicos que incluyen,
pero no están limitados a, ADN, ADNg, ADNc y oligonucleótidos; y
pueden ser de origen natural o sintético. Las sondas de
oligonucleótidos preferiblemente son oligonucleótidos de 20 a
25-meros mientras que las sondas de ADN/ADNc
preferiblemente tienen de 500 a 5.000 bases de longitud; no
obstante, en ambos casos, se pueden usar otros tamaños. Se puede
usar virtualmente cualquier sonda capaz de detectar o identificar
cualquiera de dichos genes en la fabricación de la matriz
proporcionada por la presente divulgación. Como se ha mencionado
anteriormente, las secuencias de nucleótidos de los 85 genes
enumerados en la tabla 1 se conocen y/o se pueden obtener de bases
de datos adecuadas, tales como las mencionadas previamente. Por lo
tanto, el experto en la materia puede diseñar las sondas a ser
usadas para identificar y cuantificar los 85 genes enumerados en la
tabla 1. Los expertos en la materia pueden usar software disponible
para alcanzar tal fin. Normalmente, dichas sondas se marcarán para
la detección directa o indirecta. En una forma de realización
particular, las sondas se marcan enzimáticamente con un isotopo
radioactivo o con un marcador fluorescente para la detección
directa, mientras que en otra forma de realización particular, las
sondas se marcan química o enzimáticamente para la detección
indirecta mediante, por ejemplo, técnicas luminiscentes o
fluorimétricas.
Además, se puede usar virtualmente cualquier
sustrato en la fabricación de la matriz proporcionada por la
presente divulgación. Ejemplos ilustrativos, no limitantes de
sustratos sólidos que se pueden usar incluyen vidrio, sílice,
aluminosilicatos, borosilicatos, óxidos de metales tal como alúmina
y óxido de níquel, arcilla, nitrocelulosa o nailon,
preferiblemente, vidrio.
Las sondas se pueden fijar (inmovilizar) al
sustrato sólido mediante cualquier técnica convencional, por
ejemplo, mediante técnicas de inmovilización no covalentes (por
ejemplo, mediante inmovilización electrónica) o mediante técnicas
de inmovilización basadas en la unión covalente de las sondas al
sustrato sólido por medios químicos tal como activar el sustrato
sólido o la sonda con grupos químicos adecuados, tales como grupos
aldehído o amina o estreptavidina (sustrato) o grupos amino o tiol
o biotina (sonda). En una forma de realización particular, las
sondas se fijan al sustrato sólido mediante unión covalente.
La matriz proporcionada por la presente
divulgación se puede fabricar por cualquier método adecuado, por
ejemplo, inyección de tinta, jeringuilla solenoide, impresión con
agujas, microdosificación, fotolitografía, etc.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a un
kit, de aquí en adelante denominado kit de la divulgación, que
comprende un conjunto de sondas para detectar e identificar el
conjunto de 85 genes mostrados en las tablas 2 y 3, en donde el
conjunto de sondas comprende, o consiste en, al menos, una sonda
para cada gen a ser identificado. El kit también puede contener una
o más sondas útiles como controles de hibridación. En una forma de
realización, el kit comprende una pluralidad de sondas que hibridan
con fragmentos de secuencia específicos de cada ácido nucleico
(ADN, ARNc, etc.) correspondientes a cada uno de los 85 genes
divulgados en las tablas 2 y 3. Preferiblemente, el conjunto de
sondas se deposita en un sustrato sólido (soporte) formando, por
ejemplo, una matriz como se ha mencionada anteriormente.
En una forma de realización particular, el kit
es útil para el diagnóstico in vitro de EHNA en un sujeto o
para el diagnóstico temprano de EHNA en un sujeto o para determinar
la predisposición de un sujeto a desarrollar EHNA o para determinar
la fase o gravedad de EHNA en un sujeto o para seguir el efecto de
la terapia administrada a dicho sujeto con dicha afección. Dichos
fines se pueden alcanzar cuantificando los niveles de expresión de
dicho conjunto de 85 genes mostrados en las tablas 2 y 3 por métodos
convencionales, por ejemplo mediante tecnología de hibridación en
matrices de ácidos nucleicos.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método in vitro para identificar y/o evaluar la eficacia de
un agente potencialmente terapéutico contra EHNA, que comprende:
- a)
- poner en contacto un cultivo de células hepáticas con un compuesto de prueba en las condiciones apropiadas y durante el periodo de tiempo requerido para que interaccionen;
- b)
- determinar los niveles del conjunto de 85 genes mostrados en la tabla 2 y la tabla 3;
- c)
- comparar dichos niveles obtenidos en el paso b) con los de un cultivo control de células hepáticas que carecen de dicho compuesto de prueba; y
- d)
- seleccionar un compuesto de prueba que produzca (i) un descenso de los niveles de los genes mostrados en la tabla 2, y (ii) un aumento en los niveles de los genes mostrados en la tabla 3 para ensayos adicionales como potencial agente para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de EHNA.
En una forma de realización particular, las
células hepáticas derivan de un modelo animal de EHNA, tal como,
por ejemplo, un ratón MAT1A-KO o de un sujeto al que
se le ha diagnosticado EHNA. Prácticamente se puede usar cualquier
sustancia como compuesto de prueba en el trabajo del método
anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se determinó la expresión génica en muestras de
hígado de camadas de machos homocigotos MAT1A-KO y
salvajes (WT), alimentados con dieta estándar. Las muestras de
hígado se obtuvieron quince días, uno, tres, cinco y ocho meses
después del nacimiento. Las muestras de hígado se congelaron
instantáneamente para el análisis de expresión génica y se
almacenaron a -80ºC. Se usaron al menos tres muestras hepáticas
independientes para el aislamiento de ARN y medida de la expresión
génica para cada edad y condición. Se obtuvieron los perfiles de
expresión génica de muestras hepáticas de ratones
MAT1A-KO y WT a los 15 días, 1, 3, 5 y 8 meses de
edad usando el chip correspondiente (véase posteriormente).
- -
- Sujetos con hígado normal: función hepática normal con histología hepática normal, n=6 (3 mujeres, 3 hombres; edad mediana 57,6 años; intervalo 23-79 años);
- -
- Sujetos susceptibles a EHNA: EHNA de grado 1 diagnosticado histológicamente, n=9 (7 mujeres, 2 hombres; edad mediana 41,1 años; intervalo 24-61 años) [EHNA de grado 1 se estableció histológicamente (esteatosis macrovesicular, inflamación lobulillar portal y cuerpos de Mallory) en ausencia de otras causas (víricas, alcohol, metabólicas) de EHNA [Brunt EM, et al., 1999, Am. J. Gastroenterol. 94, 2467-2474]; y
- -
- Sujetos diagnosticados con esteatosis: acumulación de ácidos grasos sin necrosis, histológicamente diagnosticada, n=6 (4 mujeres, 2 hombres; edad mediana 43,3 años; intervalo 23-72 años).
Las biopsias hepáticas se dividieron en dos
partes, una se procesó para histología de rutina y la otra se
congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80ºC
para el posterior aislamiento de ARN y medida de la expresión
génica.
Para establecer una herramienta de pronóstico
para diseñar las pautas de tratamiento de EHNA, se evaluaron los
patrones de expresión en muestras de EHNA de grado 1 y se
correlacionaron con el desenlace clínico.
El ARN aislado de muestras hepáticas de ratones
(MAT1A-KO y WT) y muestras hepáticas humanas (EHNA,
esteatosis y control) se sometió a transcripción inversa y el ADNc
resultante se usó para la síntesis transcripcional in vitro
de sondas de ácidos nucleicos marcados con fluorescencia según las
instrucciones del fabricante. Brevemente, después de la limpieza en
columna del ARN (Rneasy de Qiagen), se sintetizó el ADNc usando un
cebador oligo-dT (Superscript Choice System; Life
Technology) unido a una secuencia de la región promotora de T7.
Este ADNc se usó después para realizar la transcripción in
vitro usando un promotor de la ARN polimerasa de T7 e
incorporando nucleótidos marcados con biotina (kit de marcaje IVT,
Affymetrix). Se purificó el ARNc marcado; se cuantificó por
espectrofotometría, se fragmentó y se hibridó por separado con la
matriz de expresión correspondiente.
Para las muestras de tejido hepático de ratón,
cada sonda derivada de tejido resultante se hibridó por separado
con una única matriz de expresión de ratón, es decir, la matriz
GeneChip Mouse Genome 430A 2.0 (Affymetrix), que contiene más de
22.600 conjuntos de sondas que representan transcritos y variantes
de más de 14.000 genes de ratón bien caracterizados que se pueden
usar para explorar los mecanismos detrás de procesos biológicos y
de enfermedad. Las secuencias usadas en el diseño de la matriz se
seleccionaron de GenBank, dbEST y RefSeq. Se creó el grupo de
secuencia a partir de la base de datos UniGene (Versión 107, junio
2002) y después se refinó mediante análisis y comparación con el
ensamblaje borrador públicamente disponible del genoma de ratón del
Centro para Investigación Genómica del Instituto Whitehead (MSCG,
abril 2002). Se sintetizaron sondas de oligonucleótidos
complementarias a cada secuencia correspondiente in situ en
la matriz. Se usaron once pares de sondas de oligonucleótidos para
medir el nivel de transcripción de cada secuencia representada en
la matriz GeneChip Mouse Genome 430A 2.0.
Para las muestras de tejido hepático humano,
cada sonda derivada de tejido resultante se hibridó por separado
con la matriz GeneChip Human Genome U133A 2.0 (Affymetrix), una
matriz única que representa 14.500 genes humanos bien
caracterizados que se puede usar para explorar procesos humanos de
biología y enfermedad. Proporciona cobertura de genes bien
sustanciados en el genoma humano transcrito en una única matriz.
Analiza el nivel de expresión de 18.400 transcritos y variantes,
incluyendo 14.500 genes humanos bien caracterizados. Comprende más
de 22.000 conjuntos de sondas y 500.000 características de
oligonucleótidos distintos. Todos los conjuntos de sondas
representados por la matriz GeneChip Human Genome U133A 2.0 se
replican de forma idéntica en la matriz GeneChip Human Genome U133A
2.0. Las secuencias usadas en el diseño se la matriz se
seleccionaron de GenBank®, dbEST y RefSeq. Se crearon los grupos de
secuencias a partir de la base de datos UniGene (Versión 133, 20 de
abril, 2001) y después se refinaron mediante análisis y comparación
con otras bases de datos públicamente disponibles incluyendo el
depósito de seguimiento de EST de la Universidad de Washington y la
base de datos del genoma humano Golden-Path Santa
Cruz, Universidad de California (boletín de abril 2001).
En ambos casos, las matrices se lavaron, se
tiñeron y barrieron usando un escáner confocal (Affymetrix) y las
imágenes de hibridación se analizaron usando Genechips Operating
Software (GCOS) versión 1.1 (Affymetrix) para generar una matriz de
datos de sondas nombradas mediante niveles de expresión cuantitativa
en cada tejido.
Para seleccionar un conjunto de marcadores
génicos tempranos para EHNA, los datos de expresión generados por
el análisis de expresión génica se analiza para determinar qué genes
en los diferentes grupos, por ejemplo ratones KO frente a WT, o
muestras de tejido hepático, presentan una expresión
significativamente diferente. Se determinaron las diferencias
significativas en los niveles de expresión génica usando el software
Affymetrix MAS 5.0. Se normalizaron las señales para cada entrada.
El nivel final de expresión es la diferencia de la expresión media
de la señal para cada gen medido en desviaciones estándar. Se usaron
dos filtros estadísticos para seleccionar marcadores génicos de
EHNA en ratones. Primero se analizaron los genes estadísticamente
usando una prueba ANOVA de tipo I
(http://www.uv.es/-leiarza/anova/anova.html) y 3.508 genes
pasaron esta primera prueba (p<0,025). Como se sabe, esta prueba
muestra qué genes se comportan coherentemente dentro de cada clase.
Esta prueba es útil para eliminar genes cuyo perfil varía debido a
razones diferentes a la edad o al tipo de ratón. Las clases en las
que se dividieron los genes fueron 10 (WT 15 días, 1, 3, 5 y 8
meses; y MAT1A-KO 15 días, 1, 3, 5 y 8 meses). Los
genes se analizaron después estadísticamente usando una prueba t
(http://home.clara.net/sisa/t-thlp.htm) y
3.266 genes pasaron esta segunda prueba (p<0,025). Esta prueba
selecciona genes que tienen una expresión media significativamente
diferente entre ratones WT y MAT1A-KO sin considerar
la edad del ratón. Emparejando estos dos conjuntos de genes, se
identificó un grupo de 1.496 genes comunes a ambas pruebas. Estos
son genes que tienen expresión diferente entre ratones WT y KO y se
comportan de forma coherente dentro de cada grupo.
Para validar cuales de dichos genes de ratón
eran también marcadores génicos de EHNA en seres humanos, se llevó
a cabo un análisis en micromatriz de la expresión génica para
determinar qué genes humanos en los diferentes grupos, por ejemplo,
muestras de tejido hepático sin EHNA y de EHNA, presentan una
expresión significativamente diferente, usando el mismo proceso
descrito anteriormente. El conjunto de genes humanos que presentan
niveles de expresión diferentes entre los dos grupos después de los
dos filtros estadísticos, corresponde a un conjunto de genes
homólogos de ratón. Por lo tanto, se analizaron los perfiles de
expresión génica de muestras hepáticas de 6 sujetos con función
hepática normal y 9 pacientes con EHNA de grado 1 usando la matriz
GeneChip Human Genome U133A 2.0 (Affymetrix) con 54.675 entradas.
El análisis estadístico de estos dos conjuntos de muestras humanas
usando una prueba t (p<0,05) identificó un grupo de 4.272 genes
humanos discriminatorios (4.679 sondas de Affymetrix) que
corresponden a 1.700 genes homólogos de ratón (2.556 sondas de ratón
de Affymetrix). Emparejando este conjunto de 1.700 genes con los
1.496 genes discriminatorios identificados anteriormente como
marcadores génicos de EHNA en ratón, se reveló un conjunto de 218
marcadores génicos comunes de EHNA a seres humanos y ratón.
Por último, para validar cual de este conjunto
de genes son marcadores génicos tempranos/pronósticos de EHNA, se
examinaron los perfiles de expresión génica de tejidos hepáticos de
ratones WT y MAT1A-KO de 15 y 30 días
(representativos de una fase muy temprana en el desarrollo de EHNA).
Esta comparación permite seleccionar genes que tienen una expresión
media significativamente diferente entre ratones WT y KO temprano en
el desarrollo de EHNA. Se realizó el análisis estadístico de estos
dos conjuntos de muestras, prueba t con p<0,025, y se identificó
un grupo de 1.346 genes discriminatorios. Emparejar este conjunto de
genes con los 218 marcadores génicos comunes de EHNA para seres
humanos y ratones identificados anteriormente reveló un conjunto de
85 genes discriminatorios (tablas 2 y 3) que cumplen los siguientes
cuatro criterios:
- están asociados a una enfermedad tanto en seres humanos como en ratón,
- son marcadores génicos tempranos de la enfermedad en estudio,
- permanecen diferencialmente expresados durante el desarrollo de la enfermedad, y
- su variación es pequeña durante el desarrollo de la enfermedad.
Como se ha mencionado previamente, para analizar
y comparar patrones de expresión génica, se usó el software
Affymetrix MAS 5.0, se normalizaron las señales para cada entrada y
el nivel de expresión final era la diferencia de la expresión media
de la señal para cada gen medido en desviaciones estándar. Además,
se aplicó una transformación no lineal (arcsinh) a dichos valores
para disminuir el efecto de valores atípicos. Se usaron análisis
estadísticos adicionales (ANOVA y prueba t como se ha descrito
anteriormente) aunque se puede usar cualquier paquete estadístico
estándar que pueda discriminar diferencias significativas en
expresión.
El conjunto de genes, que se ha denominado firma
genómica de EHNA, se identificó y clasificó según su función
molecular siguiendo los criterios de las bases de datos del
Consorcio de Ontología Génica
(http://www.geneontology.
org/external2go/tigr2go) y las bases de datos de Gene Atlas (http://www.citi2fr/GENATLAS/welcome.htlm) y otras fuentes públicas usando GARBAN (http://www.garban.org). Usando este tipo de firma genómica, se pueden dividir los grupos en ratones KO con ratones KO y ratones WT con ratones WT, por ejemplo usando este grupo de 85 genes asociados a EHNA es posible agrupar los MAT1A-KO con MAT1A-KO, ratones WT con ratones WT, pacientes con EHNA con pacientes con EHNA, y controles sanos con controles sanos.
org/external2go/tigr2go) y las bases de datos de Gene Atlas (http://www.citi2fr/GENATLAS/welcome.htlm) y otras fuentes públicas usando GARBAN (http://www.garban.org). Usando este tipo de firma genómica, se pueden dividir los grupos en ratones KO con ratones KO y ratones WT con ratones WT, por ejemplo usando este grupo de 85 genes asociados a EHNA es posible agrupar los MAT1A-KO con MAT1A-KO, ratones WT con ratones WT, pacientes con EHNA con pacientes con EHNA, y controles sanos con controles sanos.
Las tablas 2 y 3 (mostradas anteriormente)
identifican 85 genes que distinguen con precisión entre pacientes
con EHNA de fase temprana y controles sanos, ofreciendo así la
probabilidad de un diagnóstico temprano de EHNA, así como la
posibilidad de identificar pacientes que tienen un cierto riesgo
para el desarrollo de EHNA, lo que mejora la probabilidad de
intervenir con un tratamiento eficaz.
Claims (7)
1. Un método para el diagnóstico in vitro
de esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) en un sujeto o para el
diagnóstico temprano de EHNA en un sujeto o para determinar la
predisposición de un sujeto a desarrollar EHNA o para determinar la
fase o gravedad de EHNA en un sujeto o para seguir el efecto de la
terapia administrada a dicho sujeto con dicha afección, que
comprende:
- a)
- cuantificar el nivel de expresión del conjunto de 85 genes, mostrados en la tabla 2 y la tabla 3, en una muestra de tejido hepático de dicho sujeto, y
- b)
- comparar los niveles de expresión de dichos genes con el nivel de expresión de los mismos genes de una muestra control;
en donde un aumento en los niveles de expresión
de los genes de la tabla 2 y un descenso en el nivel de expresión
de los genes de la tabla 3, relativo al nivel de expresión de los
mismos genes de la muestra control, es indicativo de EHNA o
indicativo de predisposición del sujeto a desarrollar EHNA.
2. Método según la reivindicación 1, en donde la
muestra a ser analizada es de un sujeto previamente no diagnosticado
con EHNA o de un sujeto diagnosticado previamente con EHNA o de un
sujeto que recibe tratamiento anti-EHNA o de un
sujeto que ha recibido previamente tratamiento
anti-EHNA.
3. Método según la reivindicación 1, en donde la
cuantificación de dicho nivel de expresión génica se lleva a cabo
mediante tecnología de hibridación en micromatrices de ácidos
nucleicos en fase sólida.
4. Uso del conjunto de 85 genes, mostrados en la
tabla 2 y la tabla 3, para el diagnóstico in vitro de
esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) en un sujeto o para el
diagnóstico temprano de EHNA en un sujeto o para determinar la
predisposición de un sujeto a desarrollar EHNA o para determinar la
fase o gravedad de EHNA en un sujeto o para seguir el efecto de la
terapia administrada a dicho sujeto con dicha afección.
5. Una matriz de ácidos nucleicos en fase sólida
que consiste en un conjunto de sondas útiles para detectar e
identificar todos los genes mostrados en las tablas 2 y 3, fijados a
un sustrato sólido, junto con uno o más controles de
hibridación.
6. Uso de un kit que comprende un conjunto de
sondas para detectar e identificar el conjunto de 85 genes mostrados
en las tabla 2 y la tabla 3, en donde el conjunto de sondas
comprende, al menos, una sonda para cada gen a ser identificado o
una matriz de ácidos nucleicos en fase sólida según la
reivindicación 5 para el diagnóstico in vitro de
esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) en un sujeto o para el
diagnóstico temprano de EHNA en un sujeto o para determinar la
predisposición de un sujeto a desarrollar EHNA o para determinar la
fase o gravedad de EHNA en un sujeto o para seguir el efecto de la
terapia administrada a dicho sujeto con dicha afección.
7. Un método in vitro para identificar
y/o evaluar la eficacia de un agente potencialmente terapéutico
contra EHNA, que comprende:
- a)
- poner en contacto un cultivo de células hepáticas con un compuesto de prueba en las condiciones apropiadas y durante el periodo de tiempo requerido para que interaccionen;
- b)
- determinar el nivel de expresión génica del conjunto de 85 genes mostrados en la tabla 2 y la tabla 3;
- c)
- comparar dicho nivel obtenido en el paso b) con el de un cultivo control de células hepáticas que carecen de dicho compuesto de prueba; y
- d)
- seleccionar un compuesto de prueba que produce (i) un descenso del nivel de expresión génica de todos los genes mostrados en la tabla 2, y (ii) un aumento en los niveles de expresión de todos los genes mostrados en la tabla 3 para ensayos adicionales como un potencial agente para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de EHNA.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP04103540A EP1619257A1 (en) | 2004-07-23 | 2004-07-23 | Method for the in vitro diagnosis of non-alcoholic steatohepatitis |
| EP04103540 | 2004-07-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2336928T3 true ES2336928T3 (es) | 2010-04-19 |
Family
ID=34929372
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES05780314T Active ES2336928T3 (es) | 2004-07-23 | 2005-07-08 | Metodos de diagnostico y pronostico de esteatohepatitisno alcoholica (ehna). |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20070231811A1 (es) |
| EP (2) | EP1619257A1 (es) |
| AT (1) | ATE449189T1 (es) |
| DE (1) | DE602005017788D1 (es) |
| ES (1) | ES2336928T3 (es) |
| WO (1) | WO2006008031A1 (es) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090111136A1 (en) * | 2006-03-29 | 2009-04-30 | Yamasa Corporation | Method for detection, determination or prediction of hepatic disorder |
| CA2669260C (en) | 2006-11-09 | 2019-01-15 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Differential gene expression in physiological and pathological angiogenesis |
| US7824871B2 (en) * | 2007-06-14 | 2010-11-02 | George Mason Intellectual Properties | Methods of diagnosing non-alcoholic steatohepatitis (NASH) |
| EP2546649B1 (en) * | 2007-11-02 | 2015-02-25 | Metabolon Inc. | Biomarkers for fatty liver disease and methods using the same |
| EP2157431A1 (en) * | 2008-08-11 | 2010-02-24 | One Way Liver Genomics, S.L. | Method for the diagnosis of NASH using metabolic profiles |
| EP2309276A1 (en) | 2009-09-22 | 2011-04-13 | One Way Liver Genomics, S.L. | Method for the diagnosis of non-alcoholic steatohepatitis based on a metabolomic profile |
| CN111929440A (zh) * | 2020-07-29 | 2020-11-13 | 西南医科大学附属中医医院 | 一种基于磁微粒化学发光免疫法检测dnase1l3的方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5474796A (en) * | 1991-09-04 | 1995-12-12 | Protogene Laboratories, Inc. | Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface |
| US7625697B2 (en) * | 1994-06-17 | 2009-12-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for constructing subarrays and subarrays made thereby |
| AU2006236588A1 (en) * | 2005-04-15 | 2006-10-26 | Becton, Dickinson And Company | Diagnosis of sepsis |
-
2004
- 2004-07-23 EP EP04103540A patent/EP1619257A1/en not_active Withdrawn
-
2005
- 2005-07-08 DE DE602005017788T patent/DE602005017788D1/de active Active
- 2005-07-08 AT AT05780314T patent/ATE449189T1/de not_active IP Right Cessation
- 2005-07-08 EP EP05780314A patent/EP1771580B1/en not_active Not-in-force
- 2005-07-08 US US11/572,562 patent/US20070231811A1/en not_active Abandoned
- 2005-07-08 WO PCT/EP2005/007535 patent/WO2006008031A1/en active Application Filing
- 2005-07-08 ES ES05780314T patent/ES2336928T3/es active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE449189T1 (de) | 2009-12-15 |
| EP1619257A1 (en) | 2006-01-25 |
| DE602005017788D1 (de) | 2009-12-31 |
| WO2006008031A1 (en) | 2006-01-26 |
| EP1771580A1 (en) | 2007-04-11 |
| US20070231811A1 (en) | 2007-10-04 |
| EP1771580B1 (en) | 2009-11-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2336928T3 (es) | Metodos de diagnostico y pronostico de esteatohepatitisno alcoholica (ehna). | |
| JP2016082984A (ja) | 遺伝子分析のための方法 | |
| Phatak et al. | Prevalence and penetrance of HFE mutations in 4865 unselected primary care patients | |
| ES2358182T3 (es) | Genes de control para la normalización de datos de análisis de la expresión génica. | |
| Gashaw et al. | Gene signatures of testicular seminoma with emphasis on expression of ets variant gene 4 | |
| WO2016193977A2 (en) | Methods for predicting hepatotoxicity | |
| US20060099593A1 (en) | Method of diagnosing integration dysfunction syndrome using blood | |
| JP3507884B2 (ja) | 遺伝子発現を指標とする統合失調症の客観的診断法 | |
| Krafft et al. | Analysis of gene expression in canine idiopathic pulmonary fibrosis | |
| ES2340459B1 (es) | Metodo para diagnosticar o determinar la predisposicion genetica a desarrollar miocardiopatia hipertrofica. | |
| JP5990871B2 (ja) | 疲労の判定方法 | |
| WO2006117945A1 (en) | Method for detecting lipid metabolism disorder, and diagnostic agent for use therein | |
| ES2856232B2 (es) | Biomarcadores para predecir la respuesta de un sujeto a una terapia con bcg, metodos y usos basados en los mismos | |
| KR20190048509A (ko) | 약물 부작용과 관련된 HLA 대립 유전자의 tSNP를 이용한 고속 검출 방법 | |
| CN109402228A (zh) | RT-qPCR检测树鼩SLC2A9/Glut9基因转录水平的方法 | |
| JP4925063B2 (ja) | 片頭痛の診断マーカー及びその利用 | |
| CN114729395A (zh) | 检查脑肿瘤的方法 | |
| CN101429540A (zh) | 实时定量pcr检测细胞周期蛋白b2基因表达的方法 | |
| JP2003235557A (ja) | 精神分裂病により発現量が変化する遺伝子を規定する核酸を解析する方法 | |
| CN113817818B (zh) | 用于诊断过敏性气道炎症的工具 | |
| US10253367B1 (en) | Biomarkers for locally advanced breast cancer (LABC) and inflammatory breast cancer (IBC) | |
| US20100129790A1 (en) | Method for Determining Phospholipidosis | |
| CN113817819B (zh) | Linc01996在诊断过敏性气道炎症中的应用 | |
| CN117947154A (zh) | 一种用于诊断肥厚型心肌病的方法及其相关产品和用途 | |
| US20190316167A1 (en) | Methods for Treating and Detecting Johne's Disease in Cattle |