JP2010519893A - 遺伝子発現分析データの正規化のための参照遺伝子 - Google Patents
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Abstract
Description
参照遺伝子を利用する定量データの正規化には、多数の応用の可能性がある。これらの参照遺伝子は、その活性が様々な病的状態において差次的に調節されている遺伝子の同定を可能にし、さらには、それに基づく診断の開発を可能にする。
参照遺伝子は、様々なRNA試料において発現および転写が最小限の変化を示す遺伝子であり、様々な試料の遺伝子活性測定の対照または参照として機能する。全ての組織の亘り不変の活性を示す遺伝子は存在しない。したがって、新しい参照遺伝子、特に血液の診断の為の参照遺伝子が、血液からの発現値が診断において使用されることから、強く求められている。
a)血液試料から参照遺伝子RNAと試験遺伝子RNAを単離する工程。
b)参照遺伝子RNAと試験遺伝子RNAを検出マーカーでマーキングし、ハイブリダイゼーション条件下でDNAと接触させる工程。ここに、前記DNAは、参照遺伝子の転写物、増幅産物、もしくはインビトロ転写物に特異的に結合する遺伝子断片またはオリゴヌクレオチドである。
c)工程b)による参照遺伝子RNAと試験遺伝子RNAのマーキングシグナルを定量的に検出する工程。ならびに、
d)特定遺伝子または遺伝子断片が参照遺伝子のシグナルと比較してより強く発現されているか、またはより弱く発現されているかどうかの指示を出すためにマーキングシグナルの定量的データを比較する工程。
本発明の別の実施形態は、mRNAまたはマイクロRNAが参照遺伝子RNAとして使用されることを特徴とする。
(ブラズマ Aら、ミニマムインフォーメーションアバウトアマイクロアレイエクスペリメント(MIAME)−トワードスタンダーズフォーマイクロアレイデータ,ネイチャー ジェネテックス29,365−371(2000)(New edition January 2005, based on Brazma A et al., Minimum information about a microarray experiment (MIAME)−toward standards for microarray data, Nature Genetics 29, 365 - 371 (2001)) Minimum Information About a Microarray Experiment(MIMAE)文献[17]に基づく2005年1月の新版であるミニマムインフォーメーションアバウトアマイクロアレイエクスペリメント[MIAME]のチェックリストにしたがう。これらの内容は全体が引用により本明細書中に組み入れられる)
a)スキャナ:GenePix4000B共焦点落射式蛍光スキャナ(Axon Instruments)
b)スキャニングソフトウェア:GenePix Pro4.0
c)スキャニングパラメーター:レーザー出力:Cy3チャンネル−100%
Cy5チャンネル−100%
PMT電圧: Cy3チャンネル−700V
Cy5チャンネル−800V
d)空間分析能(画素空間)−10μm
実験の構成においては、1000を超える患者の血液試料をハイブリダイズさせた。個々のRNA対(患者対比較用RNA)をマイクロアレイ上で同時にハイブリダイズさせた。患者のRNAを赤色蛍光色素でマークし、比較用RNAを緑色蛍光色素でマークした。ハイブリダイズしたアレイのデジタル画像を、Axon機器によってGenePix Pro 4.0または5.0ソフトウェアを用いて評価した。スポットの検出、シグナルの定量、およびスポットの質の評価のためには、GenePix(登録商標)分析ソフトウェアを使用した。スポットをGenePix(登録商標)ソフトウェアの設定にしたがって、100=「良好」、0=「見られる」、−50=「見られない」、−75=「存在しない」、−100=「不良」と記した。生のデータは、対応する *gprファイルに保存した。
e)シグナルデータの変換と正規化
生データの正規化および偏差安定化変換のために、ヒューバーら文献[5]の方法を使用した。ここでは、加算的および乗算的エラーがブロックごとに予測される。全てのスポットのうちの約75%がこのために利用される。その後、シグナルは、arsinh関数によって変換される。(したがって、変換された±0.4の比は、1.5倍の変化にほぼ対応する(大きな数については、arsinh(x)はLn(2x)とほぼ同じである)。
マイクロアレイ上での技術の複製(同じ試料の複数のスポット)が、それらのスポットの質に応じて修正され変換されたシグナル強度から除外される(filtered out)。個々のスポットについて最も高い特徴を有している複製が選択され、関連するシグナル強度が平均される。測定不可能な複製しか有していないスポットの発現は「NA」(該当なし)と記載される。
a)少なくとも1回の遺伝子発現分析アッセイが患者の血液試料についてインビトロ(試験管レベル)で行われる工程。
b)少なくとも1つの対照核酸が、試験される試料(被験試料)の遺伝子発現分析データの正規化のための基準として同じアッセイにおいて一緒に試験される工程。
c)遺伝子発現分析により、複数の遺伝子、および少なくとも1つの対照核酸の遺伝子発現の程度を反映するシグナルが検出される工程。
d)工程c)で得られたシグナルデータを、シグナルデータの検出技術上不可避の変動幅を少なくとも小さくするために、数学的に変換される工程。そしてそれにより、
e)被験試料のシグナルデータが正規化される工程。
シグナルデータの数学的変換がarsinhにより、または対数的アプローチにより行われるD)に記載の方法。
ならびに/あるいは
遺伝子発現アッセイが、以下から選択されるD)に記載の方法。
f)血液試料からの核酸の単離;
g)必要に応じて行われる、対照核酸のセットと試験される核酸のセットの同時増幅;および
h)プローブのハイブリダイゼーション;
ならびに/あるいは
核酸にはmRNAとマイクロRNAが含まれるD)に記載の方法。
ならびに/あるいは
核酸が、PCR、リアルタイムPCR、NASBA、TMA、またはSDAによって増幅されるD)に記載の方法。
ならびに/あるいは
対照核酸と試験核酸の発現値が、ハイブリダイゼーション方法によって決定されるD)に記載の方法。
ならびに/あるいは
対照核酸および/または試験核酸の発現値の測定が、溶液中、または支持体上に固定された核酸上で行われるD)に記載の方法。
ならびに/あるいは
支持体が、マイクロアレイ、粒子、ビーズ、硝子、金属、または膜であるD)に記載の方法。
ならびに/あるいは
対照核酸および/または試験核酸が、抗体、抗原、オリゴヌクレオチド、分子ビーコン、または酵素のような他の結合パートナーを介して支持体に間接的に結合させられるD)に記載の方法。
ならびに/あるいは
患者の試料からインビトロ(試験管レベル)で決定された対照核酸と試験核酸の発現値が、患者の個体の予後診断の説明、診断目的、治療の決定、および/または患者データの管理システムのためのソフトウェアの開発のための入力パラメーターとして利用されるD)に記載の方法。
上記障害が敗血症、重症敗血症、敗血症ショック、または多臓器不全からなる群より選択される、F)に記載された対照核酸の使用。
ならびに/あるいは
以下の工程を含む、対照核酸のセットと、その発現がSIRSまたは敗血症に特異的である試験核酸のセットを使用することにより、個体のSIRS、敗血症、重症敗血症、敗血症ショック、または多臓器不全のインビトロ(試験管レベル)での診断のための方法。
a)個体の試料からの対照核酸と試験核酸の同時単離
b)必要に応じ、対照核酸と試験核酸の増幅
c)対照核酸と試験核酸の発現値の決定
d)対照核酸の発現値に基づく試験核酸の遺伝子発現の正規化
e)正規化された試験核酸の発現値が、SIRS、敗血症、重症敗血症、敗血症ショック、または多臓器不全についての特有な値に達しているかどうかの決定
参照遺伝子のシグナルが集められ、次いで、集められた参照遺伝子のシグナルに対する試験遺伝子のシグナルの比率が計算される。シグナルが対数化されている場合には、この比率はSIRSと敗血症との差異を示す。
参照遺伝子のシグナルを用いて、適切な変換のパラメーターあるいは変換それ自体が予測される。この変換は、その後、試験遺伝子に適用される。
「血液からおよび血球からの参照遺伝子の同定」
遺伝子発現の測定:
372人の集中治療室にいる患者(ITU患者)の遺伝子発現を測定した。患者は全て、集中治療による医学的治療中(under intensive−care medical treatment)であった。最長7日間のITU日数をそれぞれの患者について検討した。7日間よりも長いITU日数があった患者については、7日間を無作為に選択した。全部で1261のマイクロアレイ実験のデータを分析に入力した。
患者の選択した特徴を表4および5に示す。年齢、性別、およびACCP/SCCMカテゴリーに関する情報が提供される。細胞株SIG−M5由来の全RNAを参照試料とした。患者試料を全て、1つの個々のマイクロアレイ上の参照試料とそれぞれ同時にハイブリダイズさせた。表4に患者の一般的データを、表5に被験者の適応症を夫々示した。
(血液の採取とRNAの単離)
患者の全血を、製造業者(Qiagen)の説明書にしたがってPAXGeneキット(PAXGene Kit)を利用して集中治療室にいる患者から採取した。全血の採取後、試料の全RNAを、製造業者(Qiagen)の説明書にしたがってPAXGene血液RNAキット(PAXGene Blood RNA Kit)を使用することによって単離した。
細胞培養(対照試料)には、19の細胞冷凍保存(SIGM5)(液体窒素の中で凍結させた)を利用した。細胞をそれぞれ、20%のウシ胎児血清(FCS)を補充した2mlのイスコヴ培地(Iscove’s Medium)(バイオクロムAG(Biochrom AG))に接種した。その後、細胞培養物を12ウェルプレートの中で、5%CO2、37℃で24時間インキュベートした。その後、18個のウェルの内容物をそれぞれ同じ容量を有している2つに分け、結果として、最終的には同じ形式の3つのプレート(全部で36ウェル)を利用した。その後、培養を、同じ条件下で24時間続けた。
この後、それぞれのプレートの11個のウェルの得られた培養物を1つにし、遠心分離した(1000×g、5分間、室温)。上清を廃棄し、細胞ペレットを40mlの上記培地中に溶解させた。これらの40mlの溶解させた細胞を、2つの250mlの試験管に等しく分け、48時間インキュベーション、および5mlの上記培地の添加後にもう一度インキュベートした。残りの2つのプレートの残っている2mlのうち、80μlを、1mlの上記培地を用いてあらかじめ準備しておいた同じプレートの空のウェルに入れた。48時間のインキュベーションの後、12ウェルプレートを1つだけ、以下のように処理した。
それぞれのウェルから500μlを取り出し、1つにした。得られた6mlを、およそ10mlの新しい培地を含む250mlの試験管に入れた。この混合物を、室温で5分間、1000×gで遠心分離し、10mlの上記培地の中に溶解させた。その後の細胞の計数により以下の結果が得られた:1.5×107細胞/ml、10mlの全量、細胞の総数:1.5×108。細胞数がまだ十分ではなかったので、2.5mlの上記細胞懸濁液を、250ml(75cm2)の試験管(全部で4つの試験管)中の30mlの上記培地の中に入れた。
72時間のインキュベーションの後、それぞれ20mlの新しい培地を試験管に入れた。24時間のインキュベーション後、細胞の計数を上記にしたがって行い、3.8×108細胞の全細胞数を得た。2×106細胞の所望される細胞数を得るために、細胞を、4つの試験管の中の47.5mlの上記培地に再懸濁した。24時間のインキュベーション期間の後に細胞を遠心分離し、Ca2+もMg2+も含まないリン酸緩衝液(バイオクロムAG)で2回洗浄した。
全血の採取後、試料の全RNAを単離し、説明書にしたがってPAXGene血液RNAキット(PAXGene Blood RNA Kit)(プレアナリティX(PreAnalytiX))を使用することによってその性質を試験した。それぞれの試料から10μgの全RNAをアリコートし、参照RNAとしてのSIGM5細胞由来の10μgの全RNAとともに、逆転写酵素スーパースクリプトII(Reverse Transcriptase Superscript II(インビトロジェン(Invitrogen))を用いて相補的DNA(cDNA)に作り直し、その後、RNAをアルカリ加水分解によってバッチ(回分)から除去した。反応バッチの中で、dTTPの部分を、あとでcDNAに対して蛍光色素を結合させることができるように、アミノアリル−dUTP(AA−dUTP)で置き換えた。
評価のために、スポットの平均強度を、関連するスポット画素の中央値として決定した。
遺伝子プローブの最初の事前選択のために、システム誤差の補正を、フーバーら文献[5]のアプローチにしたがって行った。マイクロアレイの中での加算的および乗算的バイアスを、存在する遺伝子試料の75%から推定した。
Gj、k=arsinh(Scy5(j,k))−arsinh(Scy3(j,k))
式中、[Scy3(j,k)、Scy5(j,k)]は、関連する蛍光シグナルの対を示す。全ての遺伝子プローブについて、中央値からの絶対偏差の中央値(MAD)、すなわち、MAD(Gj、1、...、Gj、1261)を続いて計算し、最も低いMADを有している10%の遺伝子プローブを選択した。事前選択の第2の基準として、平均シグナル強度arsinh(Scy5(j,k))+arsinh(Scy3(j,k))を使用した。さらなる分析においては、いわゆるダイナミックシグナルレンジの中、好ましくは(対数目盛で)6と8の間に平均シグナル強度の中央値を有している遺伝子プローブだけを、考慮に入れた。
前もって選択した遺伝子プローブについて、相対的な量を最も高い発現値を1に設定することによって計算した。続いて、ヴァンデソンペールら文献[6]の遺伝子安定性の測定値Mを計算した。ヴァンデソンペールらに記載されたものと同じ段階的手順(ここでは、最も低い安定性を有している遺伝子がそれぞれの工程において除外される)により、遺伝子プローブをそれらの安定性にしたがって並べた。遺伝子プローブの選択のための上限値は、安定性の測定値Mの平均値についての(おおよその)値0.6に基づいた(表6−1、表6−2参照)。
2つの内部参照遺伝子jとkのそれぞれの組み合わせについて、要素mのアレイAjkが提供され、これは、log2に変換された発現比aij/ajkからなる(方程式1)。参照遺伝子jとkについての対となる変分Vjkは、要素Ajkの標準偏差としてさらに定義され(方程式2)、SDは標準偏差である。次いで、参照遺伝子jについての遺伝子安定性の測定値Mjは、全ての対となる変分Vjkの算術平均である(方程式3):
(それぞれのj、kについて、[1,n]とj k):
「敗血症患者と敗血症に罹患していない患者の遺伝子発現試験による参照遺伝子の安定性の試験」
本実施例において、本発明者らは、第1の実施例において決定した参照遺伝子がまた、集中治療を受けている敗血症患者および敗血症に罹患していない患者の場合にも安定であることを示す。この目的のために、本発明者らは、118人の患者のマイクロアレイデータを検討した。全部で394日ののべ入院日数(マイクロアレイ)を分析し、1人の患者について最長7日間を考慮に入れた。表7に患者の一般的データ、表8にACCP/SCCMカテゴリーによるのべ入院日数の分類ならびに付加的な診断パラメーターを夫々示す。
リアルタイムPCRによるそれらの特異的プライマーを通じた選択した参照遺伝子の安定性値の決定
RNAを、説明書にしたがってPAXgeneキット(プレアナリティX)を活用して全血から単離した。
逆転写により、mRNAをその配列とは無関係なオリゴdTプライマーを利用してcDNAに作り直した。使用したmRNAに対する相補性のプロセスにおいて形成されたcDNA鎖を、続いて、様々なPCR反応の鋳型として使用した。
a)バッチについては、次の成分をまとめてピペットで採取した。
− 5μgの濃縮したRNA
− 10μlのH2O
− 1μlのdNTP(dGTP、dATP、dCTP、dTTP)
− 1μlのオリゴdT(0.5μg/μl)
b)70℃で5分間、その後、氷上で5分間処理した。
c)次の混合物をその後添加した。
− 4μlのRT緩衝液
− 2μlの0.1M DTT
− 1μlのRNaseアウト(RNase阻害剤)
− 1μlのスーパースクリプト(SuperScript)逆転写酵素
d)42℃で1時間インキュベートした。
e)70℃で15分間インキュベートした。
選択したDNA部分を、PCRを活用して増幅させ、その後に定量し参照遺伝子の遺伝子発現の強度を決定した。
PCRには、インビトロジェンによるアッキュプライムタックDNAポリメラーゼシステム(AccuPrime Taq DNA Polymerase System)を使用した。
2.5μlの10×アキュプライムPCR緩衝液I(AccPrime PCR buffer I)
20μlのRNaseを含まないH2O
1μlの1:10希釈された鋳型DNA(およそ0.82ng/μl)
1μlのプライマー混合物(表2に対応する、それぞれ0.5μlの正方向プライマー/逆方向プライマー)
0.5μlのアキュプライムタックDNAポリメラーゼ(AccuPrime Taq DNA polymerase)。
次いで、以下のプログラムを、リアルタイムPCRサーモサイクラー(コルベットリサーチ(corbett research)RG3000)の中で行った。
94℃ 2分間
94℃ 30秒間
58℃ 30秒間 30サイクル
68℃ 1分間
68℃ 2分間
最初に、鋳型DNAを94℃で完全に変性させ、酵素を活性化させた。この後、94℃での変性、58℃でのアニーリング、そして68℃での伸長からなる増幅を30サイクル行った。PCR後、試料を、断片の大きさによって生成物の正確性を試験するために、1.5%のアガロースゲル上に移した。表15に、特異的プライマーとリアルタイムPCRによって決定した選択された参照遺伝子(RNA塩基)の安定性値を示す。
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Claims (16)
- 患者の血液試料から採取した遺伝子発現分析データの正規化のための参照遺伝子セットであって、前記参照遺伝子セットが配列番号87、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号93、配列番号95、および配列番号96のRNA配列を含むことを特徴とする参照遺伝子セット。
- 患者の血液試料から採取した、核酸の増幅に基づく遺伝子発現分析データの正規化のために用いられる、請求項1に記載の参照遺伝子セットに由来するプライマーセットであって、前記プライマーセットが、配列番号8から配列番号21のDNA配列を含むことを特徴とするプライマーセット。
- 患者の血液試料から採取した遺伝子発現分析データの正規化のために用いられる、請求項1に記載の参照遺伝子セットに由来するプローブセットであって、前記プローブセットが配列番号1から配列番号7、ならびにそれらの相補的核酸配列のDNA配列を含むことを特徴とするプローブセット。
- 請求項1に記載の参照遺伝子セット、請求項2に記載のプライマーセット、または請求項3に記載のプローブセットから選択された対照核酸セットを用いる遺伝子発現分析データの正規化のための方法であって、前記方法が下記a)からe)の工程を含むことを特徴とする遺伝子発現分析データの正規化のための方法。
a)少なくとも1回の遺伝子発現分析アッセイを、患者の血液試料についてインビトロで行う工程
b)対照核酸の1つのセットを、被験試料の遺伝子発現分析データの正規化のための基準として、同じアッセイにおいて一緒に試験する工程
c)遺伝子発現分析の結果として得られたシグナルであって、複数の遺伝子および前記対照核酸のセットの遺伝子発現の程度を反映するシグナルを検出する工程
d)工程c)で得られたシグナルデータを、シグナルデータの検出技術上不可避の変動幅を少なくとも小さくするために、数学的に変換する工程、そして
e)それにより、被験試料の数学的に変換されたシグナルデータを正規化する工程 - シグナルデータの数学的変換が、逆関数arsinhにより、または対数的アプローチにより行われることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 遺伝子発現アッセイが、以下から選択されることを特徴とする請求項4または5に記載の方法。
a)血液試料からの核酸の単離
b)必要に応じて行われる、対照核酸のセットと試験される核酸との同時増幅、および
c)プローブのハイブリダイゼーション - 前記核酸にmRNAまたはマイクロRNAが含まれることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 前記核酸が、PCR、リアルタイムPCR、NASBA、TMA、またはSDAによって増幅されることを特徴とする請求項4から7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対照核酸の発現値と試験核酸の発現値が、ハイブリダイゼーション方法によって決定されることを特徴とする請求項6から8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対照核酸および/または前記試験核酸の発現値の測定が、溶液中、または支持体上に固定された核酸上で行われることを特徴とする請求項4から9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記支持体が、マイクロアレイ、粒子、ビーズ、硝子、金属、または膜であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記対照核酸および/または前記試験核酸が、抗体、抗原、オリゴヌクレオチド、分子ビーコン、または酵素のような他の結合パートナーを介して支持体に間接的に結合させられることを特徴とする請求項4から11のいずれか1項に記載の方法。
- 患者の試料からインビトロで決定された前記対照核酸と前記試験核酸の発現値が、患者の個体の予後診断の説明、診断目的、治療の決定のためのソフトウェアの開発、および/または患者データの管理システムの入力パラメーターとして利用されることを特徴とする請求項4から12のいずれか1項に記載の方法。
- 全身的免疫反応を含む障害の診断のための遺伝子発現分析方法の正規化を行うための、請求項1に記載の参照遺伝子セット、請求項2に記載のプライマーセット、または請求項3に記載プローブのセットから選択される対照核酸セットの使用。
- 前記障害が敗血症、重症敗血症、敗血症ショック、または多臓器不全からなる群より選択される、請求項14に記載の対照核酸セットの使用。
- 次の工程を含む、対照核酸のセットと、SIRSまたは敗血症に特異的な発現を有している試験核酸とを使用することにより、個体のSIRS、敗血症、重症敗血症、敗血症ショック、または多臓器不全のインビトロでの診断のための方法における、請求項14または15に記載の対照核酸の使用。
a)個体の試料からの対照核酸と試験核酸の同時単離
b)必要に応じ、対照核酸と試験核酸の増幅
c)対照核酸と試験核酸の発現値の決定
d)対照核酸の発現値に基づく試験核酸の遺伝子発現の正規化、および
e)正規化された試験核酸の発現値が、SIRS、敗血症、重症敗血症、敗血症ショック、または多臓器不全に特有な値に達しているかどうかの決定
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