PT2639312T - Imunoensaio para a deteção de mirna - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "IMUNOENSAIO PARA A DETEÇÃO DE miRNA" Área da Invenção A presente invenção refere-se a métodos para detetar um microRNA numa amostra biológica.

Antecedentes da Invenção

Muito recentemente, o diagnóstico molecular tem ganho cada vez mais importância. Teve entrada no diagnóstico clinico de doenças (entre outros, deteção de agentes patogénicos infeciosos, deteção de mutações do genoma, deteção de células doentes e identificação de fatores de risco para predisposição a uma doença). No entanto, entretanto os métodos de diagnóstico molecular também estão encontrando utilização em medicina veterinária, análise ambiental e testes de géneros alimentícios.

Em particular, através da determinação da expressão genética em tecidos, a análise de ácidos nucleicos abre novas e promissoras possibilidades no estudo e diagnóstico de doenças. A fim de reduzir os custos e manter o tempo de processamento desde a receção da amostra até a determinação do resultado analítico (também referido como "tempo até ao resultado") o mais curto possível, é um objetivo prioritário tornar os métodos de deteção de ácidos nucleicos tão eficientes quanto possível e na medida do possível para os executar com automatização. Isto aplica-se particularmente aos diagnósticos. Os métodos que podem ser realizados em recipientes de reação que diferem o menos possível e podem ser realizados em formatos normalizados (por exemplo, formato de placa de microtitulação de 96 poços) são bem adequados para automatização, uma vez que nestes métodos podem ser utilizados robôs eficientes de pipetagem. Portanto, no estado da técnica, existe a necessidade de análises de amostras simples, eficientes e automatizáveis.

Hoje em dia, as sequências específicas de ácidos nucleicos são tipicamente detetadas ou quantificadas, por exemplo, por ensaios de hibridação heterogéneos, métodos de PCR ou sequenciação direta. Estes tipos de ensaios tipicamente têm um tempo bastante longo para resultar, o que dificulta a aplicação para situações médicas críticas, por exemplo, no decurso de eventos cardíacos. Além disso, os testes atuais não são adaptáveis aos analisadores de imunoensaio, que são as plataformas mais proeminentes no laboratório clínico ou em configurações de locais de prestação de cuidados, como salas de emergência.

Os ácidos nucleicos de interesse a serem detetados incluem DNA genómico, mRNA expresso e outros RNAs, como MicroRNAs (abreviado miRNAs) . Os miRNAs são uma nova classe de pequenos RNAs com várias funções biológicas (A. Keller et al. , Nat Methods. 2011 8(10):841-3). São moléculas pequenas (em média 20 a 24 nucleótidos) de ácido ribonucleico (RNA) encontradas em células eucarióticas. Várias centenas de diferentes espécies de microRNAs (ou seja, várias centenas de sequências diferentes) foram identificadas em mamíferos. Estas são importantes para a regulação pós-transcricional de genes e ligam-se a sequências complementares em transcritos de RNA mensageiro (mRNAs) alvo, o que pode levar à repressão translacional ou à degradação do alvo e ao silenciamento de genes. Como tal, eles também podem ser usados como marcadores biológicos para fins de pesquisa, diagnóstico e terapia. Na técnica anterior, os miRNA também são detetados e quantificados por ensaios de hibridação heterogéneos ou sequenciação direta. É um desafio particular quantificar de forma confiável miRNAs uma vez que estes são inerentemente quimicamente instáveis e propensos a degradação. Isto é devido à instabilidade química do RNA, ao facto de que o miRNA está presente como ácido nucleico de uma única cadeia e devido ao seu curto comprimento.

Numa abordagem diferente, Quavit et al (Anal. Chem., 2011, 83 (15), pp. 5949-5956) utilizam sensores gravimétricos revestidos com oligonucleótidos para ligar miRNAs. Os híbridos resultantes estão ligados por anticorpos anti-DNA:RNA e a diferença de massa entre híbridos e híbridos com anticorpo ligado é gravimetricamente detetada. Uma vez que as sondas de ácido nucleico são parte do sensor, esta abordagem é inflexível em relação aos ácidos nucleicos alvo de interesse, uma vez que um sensor individual precisa ser configurado para cada ácido nucleico alvo de interesse.

Um problema adicional é que muitas aplicações em pesquisa e diagnóstico em biologia molecular precisam da determinação da quantidade ou concentração de ácidos nucleicos particulares numa amostra. O método padrão para quantificar ácidos nucleicos é por reação de PCR, utilizando um padrão interno de concentração conhecida e/ou usando PCR em tempo real. Desvantajosamente, no entanto, esses métodos possuem um intervalo dinâmico limitado. O intervalo dinâmico típico é entre 1 a 100 ela 1000, mas o intervalo de concentrações de ácido nucleico a serem medidas com frequência é claramente maior, por exemplo 1 a 1 000 000. Além disso, os métodos de PCR foram considerados como pouco confiáveis para quantificação devido à possibilidade de contaminação e cinética de enzimas não linear.

Definições A menos que definido de outra forma, os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que normalmente entendido por um perito na técnica à qual esta invenção pertence. 0 termo "anticorpo", tal como aqui utilizado, refere-se a uma proteina de imunoglobulina ou um seu fragmento, sendo o referido fragmento capaz de se ligar especificamente a um antigénio. Um anticorpo, incluindo um fragmento de anticorpo, adequado para a invenção pode ser monoclonal, policlonal, de qualquer fonte de organismo hospedeiro, expresso de forma recombinante ou produzido artificialmente e de qualquer tipo de imunoglobulina. No contexto da invenção, o anticorpo é capaz de se ligar a um antigeno compreendendo um hibrido de uma molécula de ácido nucleico de interesse e uma sonda de ácido nucleico. 0 termo "hibridação", tal como aqui utilizado, refere-se ao processo de combinação de ácidos nucleicos complementares de cadeia simples ou análogos de nucleótidos numa única molécula de cadeia dupla, o chamado "hibrido". Nucleótidos ou análogos de nucleótidos ligam-se ao seu complemento em condições normais, então duas cadeias complementares se ligarão facilmente. As sondas de cadeia simples podem ser usadas para encontrar sequências alvo complementares. Se tais sequências existem na amostra, as sondas irão hibridar com as referidas sequências que podem então ser detetadas. 0 termo "imunoensaio", tal como aqui utilizado, refere-se à deteção ou quantificação de um analito - tal como um ácido nucleico de interesse - que compreende uma reação imune entre um anticorpo e um antigénio. No contexto da invenção, o analito a ser detetado ou quantificado compreende um microRNA de interesse.

Uma "fração marcadora", na interpretação da invenção, deve ter o significado comum deste termo que é bem conhecido do perito na técnica da biologia molecular. A fração marcadora pode compreender um parceiro de ligação de um par de ligação específico, em que a respetiva reação de ligação é utilizada para acoplar a fração marcadora a um marcador detetável. Além disso, a própria fração marcadora pode compreender qualquer marcador detetável. A deteção pode ser conseguida de qualquer forma adequada, por exemplo, por deteção ótica, deteção química, deteção eletroquímica, deteção radioativa, deteção magnética ou qualquer outro modo adequado de deteção. Exemplos de frações marcadoras incluem marcadores enzimáticos, marcadores cromogénicos, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminescentes, marcadores radioativos e marcadores magnéticos. 0 termo "marcador" ou "biomarcador" refere-se a uma molécula biológica, por exemplo, um ácido nucleico, péptido, proteína, hormona, etc., cuja presença ou concentração pode ser detetada e correlacionada com uma condição conhecida, tal como um estado de doença. 0 termo "ácido nucleico" destina-se a indicar qualquer molécula de ácido nucleico e/ou moléculas análogas constituídas por uma sequência de nucleótidos incluindo DNA, cDNA e/ou DNA genómico, RNA, preferencialmente miRNA, ácido nucleico peptídico (PNA), ácido nucleico bloqueado (LNA) e/ou morfolino. "Ácido nucleico de interesse", na interpretação da invenção refere-se a um microRNA alvo que deve ser detetado e/ou quantificado. Em particular, este termo refere-se a um microRNA com uma sequência especifica predeterminada.

As "sondas de ácido nucleico", na interpretação da invenção, terão o significado comum deste termo que é bem conhecido do perito na técnica da biologia molecular. Numa forma de realização preferida da invenção, devem ser entendidas como sendo moléculas polinucleotidicas com uma sequência idêntica, complementar ou homóloga ao complemento de regiões de um microRNA alvo de interesse que deve ser detetado ou quantificado. Ainda noutra forma de realização, os análogos de nucleótidos também estão incluídos para utilização como sondas de ácido nucleico.

Os termos "amostra", "amostra biológica", ou "amostra clinica", tal como aqui utilizados, referem-se a qualquer amostra que contenha um ácido nucleico de interesse. Uma amostra pode ser obtida de um paciente. A amostra pode ser de qualquer tecido ou fluido biológico. Essas amostras incluem, mas não estão limitadas a expetoração, sangue, soro, plasma, células sanguíneas (por exemplo, glóbulos brancos), tecido, amostras de biópsia, amostras de esfregaço, amostras de lavagem, amostras de cotonete, fluidos corporais contendo células, ácidos nucleicos livres flutuantes, urina, fluido peritoneal e liquido pleural, liquido cefalorraquidiano, urina, fezes, liquido lacrimal, ou células a partir destas. As amostras biológicas também podem incluir seções de tecidos, como seções congeladas ou fixas obtidas para fins histológicos ou células microdissecadas ou suas partes extracelulares. 0 termo "fase sólida", tal como aqui utilizado, refere-se a um objeto que consiste num material poroso e/ou não poroso que é insolúvel no sistema solvente utilizado (por exemplo, insolúvel em água). Pode ter uma grande variedade de formas, tais como recipientes de reação, tubos, placas, esferas, micropartícuias, hastes, tiras, papel de filtro, papel de cromatografia, etc. 0 termo "ligação em fase sólida" refere-se a um objeto, como um anticorpo, sendo ligado à fase sólida de tal modo que não se separe e dissolva em solução quando os métodos da invenção aqui descritos são realizados. A ligação pode ser conseguida, por exemplo, por adsorção física, quimissorção, ligação covalente, como é conhecido na técnica.

Objetivos da Invenção 0 problema técnico subjacente à presente invenção é proporcionar um método para a deteção de microRNAs que seja facilmente adaptável a microRNAs com sequências diferentes e que seja facilmente adaptável a plataformas automatizadas de laboratório ou em configurações do tipo de locais de prestação de cuidados. É um objetivo adicional da invenção proporcionar um método para a deteção de microRNA que permita obter resultados quantificáveis com uma gama dinâmica melhorada.

Estes objetivos vão de encontro aos métodos de acordo com as reivindicações independentes da presente invenção. As reivindicações dependentes estão relacionadas com as formas de realização preferidas.

Sumario da Invenção A invenção refere-se a um método de deteção de microRNAs por deteção por imunoensaio. A deteção de um microRNA específico de interesse é conseguida utilizando uma sonda de ácido nucleico em solução que híbrida em solução com a molécula de ácido nucleico de interesse. A deteção por imunoensaio é conseguida usando um anticorpo específico para o híbrido formado por hibridação da sonda de ácido nucleico ao microRNA de interesse. A deteção de um microRNA específico de interesse é conseguida usando uma sonda de ácido nucleico dissolvida que híbrida com o microRNA de interesse. A deteção por imunoensaio é conseguida por um anticorpo específico para o híbrido formado por hibridação da sonda de ácido nucleico ao microRNA de interesse. 0 anticorpo pode ser fornecido numa forma que é ligado a uma fase sólida. Em alternativa, o anticorpo pode ser fornecido em solução e o microRNA de interesse pode ser detetado em um imunoensaio homogéneo. 0 híbrido é fornecido em solução. Esta solução é colocada em contacto com o anticorpo. 0 anticorpo irá ligar o híbrido e o complexo de anticorpo e híbrido ligado pode ser detetado. Isso permite uma fácil adaptação a microRNAs com diferentes sequências e fácil adaptação a plataformas automatizadas de laboratório ou a configurações e dispositivos de locais de prestação de cuidados. Um tal anticorpo pode, por exemplo, ser obtido imunizando um organismo hospedeiro com o respetivo híbrido (por exemplo, um híbrido de RNA:DNA) e recolhendo anticorpos ou células produtoras de anticorpos, como é conhecido na técnica.

Os métodos da invenção permitem uma deteção e quantificação rápida e homogénea de miRNAs específicos. Como os imunoensaios tipicamente têm tempos curtos para resultar e são adaptáveis aos analisadores de imunoensaio, este novo formato de análise supera os problemas dos atuais formatos de análise mencionados acima.

Para atender à necessidade de um sistema de ensaio flexivel para a deteção e/ou quantificação de miRNAs em, por exemplo, uma configuração de laboratório clinico, a presente invenção fornece um método para a deteção por imunoensaio de miRNAs específicos. Isso fornece uma alternativa aos métodos existentes. A invenção refere-se a um método para detetar um microRNA de interesse numa amostra, compreendendo os seguintes passos: - fornecer uma sonda de ácido nucleico em solução; - hibridar o microRNA de interesse para a sonda de ácido nucleico para obter hibridos do referido microRNA de interesse e a referida sonda de ácido nucleico; - ligar o referido hibrido a um anticorpo capaz de se ligar especificamente a hibridos de ácido nucleico, em que o anticorpo é ligado a uma fase sólida; e - detetar o hibrido ligado a anticorpo.

De acordo com este aspeto, a ligação do anticorpo ao hibrido é conseguida por colocar em contacto o anticorpo ligado à fase sólida com a solução contendo o hibrido. Uma vez que um dos parceiros de ligação que formam o complexo detetável de anticorpo e hibrido está ligado a fase sólida, este aspeto da invenção pode ser referido como um formato "heterogéneo". Uma vantagem particular deste formato reside na capacidade de fornecer uma fase sólida com um anticorpo ligado, em que o anticorpo serve como uma fração de captura universal para os hibridos. Isto permite formatos de ensaio convenientes, em que o anticorpo é pré-revestido em formatos de fase comercialmente utilizados, tais como placas de microtitulação, tiras de teste, artigos e semelhantes. Num outro aspeto, a invenção refere-se a um método para detetar um microRNA de interesse numa amostra, compreendendo os seguintes passos: - fornecer uma sonda de ácido nucleico em solução; - hibridar o microRNA de interesse para a sonda de ácido nucleico para obter hibridos do referido microRNA de interesse e da referida sonda de ácido nucleico; - ligar o referido hibrido a um anticorpo capaz de se ligar especificamente a hibridos de ácido nucleico, em que o anticorpo está em solução; e - detetar o hibrido ligado a anticorpos em solução.

De acordo com este aspeto alternativo, a ligação do anticorpo ao hibrido é conseguida por colocar o anticorpo em solução em contacto com a solução contendo o hibrido. Uma vez que ambos os parceiros de ligação formando o complexo detetável de anticorpo e hibrido estão em solução, este aspeto da invenção pode ser referido como um formato "homogéneo". Tanto no formato homogéneo como heterogéneo, a sonda de ácido nucleico é fornecida em solução e a hibridação ocorre em solução. Isso torna ambos os formatos facilmente adaptáveis à deteção de diferentes microRNA de interesse (através da seleção da sonda de ácido nucleico em conformidade), e também torna ambos os formatos facilmente adaptáveis a sistemas de análise automatizados, como são normalmente usados em laboratórios clinicos. 0 anticorpo é ligado a um antigénio competitivo antes da ligação do referido primeiro hibrido e o referido hibrido é detetado pelo deslocamento do antigénio competitivo. 0 antígeno competitivo é um híbrido competitivo de ácidos nucleicos. Além disso, o híbrido competitivo possui uma fração marcadora. Podem ser utilizadas tecnologias de deteção bem conhecidas para imunoensaios competitivos, como FRET (transferência de energia de ressonância por fluorescência) ou EMIT (técnica de imunoensaios Enzimáticos múltiplos).

Vantajosamente, os métodos da invenção permitem a deteção de muitas espécies diferentes (isto é, com diferentes sequências) de microRNA de interesse com o mesmo anticorpo que serve como uma fração de captura universal. A deteção específica de uma espécie individual é conseguida usando uma sonda de ácido nucleico que hibridará com as espécies individuais do ácido nucleico de interesse. Além disso, vantajosamente, esses métodos oferecem um grande intervalo dinâmico. Os imunoensaios oferecem rotineiramente um intervalo dinâmico de 1:1000 a 1:100000, que pode ser facilmente aumentado através da realização de uma série de diluições simples.

De acordo com um outro aspeto da invenção, a sonda de ácido nucleico é um DNA.

De acordo com um outro aspeto da invenção, o anticorpo é específico para híbridos de DNA/miRNA. A sonda de ácido nucleico pode ser marcada com uma fração marcadora. De acordo com uma forma de realização preferida, a fração marcadora é fornecida por biotinilação da sonda de ácido nucleico.

Como são conhecidas várias centenas de espécies de miRNA em seres humanos, os métodos da invenção são particularmente adequados para a deteção e quantificação de miRNAs. Simplesmente através do fornecimento da sonda de ácido nucleico apropriada é possível adaptar os métodos da invenção para a deteção de qualquer número de miRNA.

De acordo com um outro aspeto da invenção, a deteção é uma deteção quantitativa. Se desejado, a concentração pode ser medida como uma concentração absoluta, por exemplo, usando um padrão interno (um ácido nucleico conhecido com uma concentração inicial conhecida, que é adicionado à amostra ou é amplificado e medido em paralelo). Em muitos casos, pode ser suficiente determinar a concentração relativa do ácido nucleico de interesse na amostra de teste contra uma amostra de referência, por exemplo, comparando uma amostra de um paciente contra uma amostra de um controlo saudável. De acordo com um outro aspeto da invenção, uma pluralidade de microRNAs de interesse diferentes são detetados usando uma respetiva pluralidade de sondas de ácido nucleico. É ainda divulgado um kit para detetar um microRNA de interesse numa amostra, sendo o referido kit útil para a realização dos métodos da invenção, compreendendo pelo menos uma sonda de ácido nucleico em solução ou numa forma dissolúvel e um anticorpo capaz de ligar um híbrido do referido microRNA de interesse para a referida sonda de ácido nucleico. A sonda de ácido nucleico pode ser fornecida numa solução, quer como solução de trabalho, quer como solução mãe diluível. Alternativamente, pode ser fornecida numa forma dissolúvel, por exemplo em forma liofilizada. 0 kit pode ainda incluir qualquer ou todos os seguintes: controlos, padrões, soluções de revelação de calibradores para a revelação de reações de marcação detetáveis, soluções de paragem para parar a revelação de reações de marcação, soluções de bloqueio para bloquear a ligação ou hibridação inespecífica, soluções de lavagem para redução do sinal de fundo inespecífico, etc., como é conhecido na técnica. 0 kit pode ainda compreender o anticorpo ligado a uma fase sólida. Uma vantagem particular deste tipo de kit reside na capacidade de proporcionar uma fase sólida com um anticorpo ligado, em que o anticorpo serve como uma fração de captura universal para os hibridos. Isto permite formatos de ensaio convenientes, em que o anticorpo é pré-revestido em formatos comercialmente utilizados, tais como placas de microtitulação, tiras de teste, artigos e semelhantes. 0 kit pode ainda compreender um suporte para suportar a fase sólida à qual o anticorpo está ligado. A fase sólida pode ter uma grande variedade de formas, por exemplo as de recipientes de reação, tubos, placas de microtitulação, esferas, microparticulas, hastes, tiras, papel de filtro, papel cromatográfico, etc. Como regra, a superfície da fase sólida é hidrofilica ou pode ser tornada hidrofilica. A fase sólida pode consistir numa grande variedade de materiais, por exemplo, em materiais inorgânicos e/ou orgânicos, em materiais sintéticos, em materiais de ocorrência natural e/ou em materiais de ocorrência natural modificados. Exemplos de materiais em fase sólida são polímeros, tais como celulose, nitrocelulose, acetato de celulose, cloreto de polivinilo, poliacrilamida, moléculas de dextrano reticuladas, agarose, poliestireno, polietileno, polipropileno, polimetacrilato ou nylon; cerâmica, vidro ou metais, em especial metais preciosos, tais como ouro e prata; magnetita; misturas ou combinações destes; etc. As células, lipossomas e vesículas de fosfolipidos também são cobertas pelo termo fase sólida. A fase sólida também pode possuir um revestimento constituído por uma ou mais camadas, por exemplo de proteínas, hidratos de carbono, substâncias lipofílicas, biopolimeros ou polímeros orgânicos, ou suas misturas, de modo, por exemplo, a suprimir ou prevenir a ligação não especifica dos constituintes da amostra à fase sólida ou, por exemplo, para obter melhorias em relação à estabilidade da suspensão de fases sólidas particulares, em termos de estabilidade de armazenamento, em termos de estabilidade dimensional ou em relação à resistência à luz UV, micróbios ou outros agentes que tenham um efeito destrutivo. 0 suporte pode compreender uma placa de microtitulação. 0 suporte pode compreender uma tira de teste. A tira de teste pode ser de um formato de imersão simples, em que a tira é mergulhada num fluido de amostra. Também pode ser incorporado numa cassete, em que uma gota de fluido de amostra é transferida para uma abertura apropriada da cassete.

Deve ser entendido que o próprio suporte ou uma sua porção pode servir como fase sólida à qual o anticorpo está ligado. No caso de o suporte ser uma placa de microtitulação com pelo menos um ou vários poços, o anticorpo pode ser revestido na superfície interior (ou numa porção desta) do(s) poço(s) . No caso de o suporte ser uma tira de teste, o anticorpo pode ser revestido numa porção da tira de teste, por exemplo, numa ou várias bandas distintas na tira produzindo assim um padrão correspondente de bandas marcadas quando o teste é realizado. 0 suporte pode ter porções distintas dedicadas aos controlos, como é conhecido na técnica. 0 kit pode compreender o anticorpo numa forma de ligação em fase sólida em placas de microtitulação pré-revestidas, esferas revestidas, tiras reativas e semelhantes. Desta forma, o ensaio multiplex é facilmente possível, em que uma combinação do anticorpo ligado a fase sólida com uma pluralidade de sondas de ácido nucleico pode ser utilizada para detetar uma pluralidade correspondente de microRNAs de interesse. Por exemplo, numa placa de microtitulação, como uma placa de 96 poços, pode ser pré-revestida com o anticorpo e diferentes sondas de ácido nucleico podem ser usadas em diferentes poços para detetar diferentes microRNAs de interesse.

Ao utilizar um anticorpo ligado a uma fase sólida como uma fração de captura universal para hibridos compreendendo diferentes combinações de microRNAs de interesse e respetivas sondas de ácido nucleico, uma pluralidade de ensaios pode ser realizada em paralelo, por exemplo, usando a mesma fase sólida, tal como uma placa de microtitulação revestida com anticorpo. A hibridação pode ser, por exemplo, realizada numa máquina de PCR ou dispositivo de aquecimento semelhante que permite selecionar uma temperatura predeterminada para hibridação. Se um tal dispositivo de aquecimento permitir a aplicação de um gradiente de temperatura em todo o campo da placa de microtitulação, uma temperatura de hibridação ideal pode ser determinada rapidamente. Além disso, utilizando um anticorpo ligado a uma fase sólida como uma fração de captura universal torna-se possivel realizar hibridações com uma pluralidade de sondas de ácido nucleico numa pluralidade correspondente de temperaturas ótimas de hibridação diferentes. Isso pode ser feito, por exemplo, em poços separados da mesma placa de microtitulação. 0 método da invenção, em que o anticorpo como uma fração de captura universal para hibridos é fornecido numa forma ligada à fase sólida e o hibrido (que compreende a sonda de ácido nucleico) como alvo de captura é adicionado em solução oferece assim muitas vantagens tanto em termos de adaptação do método aos ensaios multiplex como adaptação do método aos sistemas analisadores, dispositivos e fluxos de trabalho existentes.

De acordo com uma forma de realização preferida da invenção, o anticorpo é ligado a uma fase sólida e a sonda de ácido nucleico é marcada com uma fração de marcação. Esta forma de realização prevê um protocolo de ensaio direto e tempo de ensaio curto para resultar.

Os métodos da invenção fornecem uma maneira simples, específica e sensível para detetar um microRNA de interesse que é facilmente adaptável aos sistemas de analisadores automatizados existentes, como são utilizados no laboratório central de hospitais ou consultórios médicos.

Os métodos da invenção provaram ser particularmente úteis para a deteção de miRNAs. Eles permitem uma deteção rápida e precisa que pode ser realizada em sistemas de analisadores automatizados.

Breve descrição dos exemplos

Detalhes adicionais, funcionalidades, características e vantagens são ainda divulgados na descrição em seguida dos exemplos respetivos. Resumidamente, num primeiro passo, uma quantidade definida de oligonucleótido de DNA específico de sequência marcado com biotina é hibridado com o miRNA de, por exemplo, uma amostra de um paciente em condições que apenas uma única espécie de miRNA pode hibridar.

A quantidade de RNA:híbridos de DNA gerada durante este passo é proporcional à quantidade de espécies específicas de miRNA presentes nessa amostra. Num segundo passo, a mistura de hibridação é transferida para uma fase sólida revestida com um mAb para RNA:híbridos de DNA; qualquer híbrido presente irá se ligar à fase sólida. A ligação de RNAihíbridos de DNA é detetada por um sistema de marcação adequado, por exemplo, Estreptavidina-peroxidase (Estreptavidina-POD). A quantidade de POD ligada é proporcional à quantidade de RNA:hibridos de DNA presentes na amostra original. A deteção e quantificação de miRNA é intrinsecamente dificil. Surpreendentemente e inesperadamente, verificou-se que este método permite uma deteção altamente especifica, sensivel e reprodutível de miRNA. Sem querer estar ligado a esta teoria, os inventores suspeitam que isto pode ser devido à estabilização de miRNA num hibrido de cadeia dupla em solução, em particular em heteroduplexos de RNA:DNA. Pode-se mostrar que os hibridos em solução podem ser congelados, armazenados por longos periodos de tempo e subsequentemente serem detetados com alta sensibilidade no método da invenção.

Numa experiência, os miRNA miR-7, miR-380 ou miR-1254 foram hibridados com oligonucleótidos complementares de DNA ou com um oligonucleótido não especifico de DNA como controlo. Após a hibridação, as soluções hibridas de DNA:RNA foram transferidas para os poços de uma placa ELISA que foi pré-revestida com um anticorpo contra hibridos de DNA:RNA. Após as etapas de lavagem e deteção por Estreptavidina-peroxidase do anticorpo ligado aos hibridos de DNA:RNA, a atividade de peroxidase de cada poço foi testada.

Os miRNAs miR-7, miR-380 e miR-1254 foram utilizados como ácidos nucleicos alvo de interesse. Cada miRNA foi hibridado com três diferentes sondas de ácido nucleico especificas para o respetivo miRNA de interesse. A hibridação foi realizada a temperaturas variáveis como indicado na tabela 2 abaixo. Como controlo, o miRNA também foi incubado com uma sonda de ácido nucleico não especifico sob condições de hibridação idênticas. As sondas de ácido nucleico foram marcadas com biotina.

Os miRNAs foram diluídos para 100 pmol/pL num tampão de armazenamento adequado (tal como tampão Tris HC1/EDTA (TE)) e os oligonucleótidos de DNA sintéticos foram diluídos para 100 pmol/pL em tampão salino lx TrisHCl (TBS) . 30 pL de solução de RNA e 30 pL de solução de DNA foram incubados durante 2 min a 95 °C para dissolver as estruturas secundárias e depois hibridados a 40-65 °C. Depois disso, os híbridos podem ser usados imediatamente ou congelados (por exemplo, a -20 °C) e armazenados para uso posterior.

As sequências para as sondas de ácido nucleico e miRNAs são apresentadas na tabela 1 abaixo:

Tabela 1: Sequências de sondas de ácido nucleico e miRNAs

As placas ELISA foram pré-revestidas com um anticorpo anti-DNA:RNA-híbrido sob condições padrão (5 yg/mL em solução salina tamponada com fosfato (PBS)). Após o revestimento, as placas ELISA foram lavadas com uma solução de lavagem comercialmente disponível ou um tampão TRIS/ácido cítrico.

Os híbridos foram diluídos 1:100, 1:1000, 1:10000 e 1:100000 em - PBS, - PBS com 1 yg/mL de BSA e 0,1 yg/mL de Tween 20, - PBS com 0,5 yg/mL de BSA e 0,05 yg/mL de Tween 20, ou - PBS com 0,25 yg/mL de BSA e 0,025 yg/mL de Tween 20, respetivamente e incubados em placas ELISA revestidas durante 1 hora a 37 °C. Após a incubação, as placas foram lavadas e incubadas com um conjugado de Estreptavidina POD comercialmente disponível. As placas foram lavadas e uma solução de substrato cromogénico (tetrametil benzidina) foi adicionada às placas. O desenvolvimento da cor foi interrompido pela adição de uma solução de paragem de ácido sulfúrico e a densidade ótica (OD) foi lida a 450 nm. Resultados para diluições de 1:100000 de híbridos 1 a 12 são apresentados na tabela 2 abaixo.

Tabela 2 - Valores de OD

(c o n t i nu 3 ç ê. o}

Como pode ser facilmente observado a partir dos resultados apresentados na tabela 2, o método permite uma deteção precisa, sensivel, especifica e reprodutível de miRNAs. Todos os hibridos de DNA:RNA complementares totais testados resultaram em ODs >> 1, enquanto que os hibridos de DNA:RNA inespecificos ou tampão, resultaram em ODs << 0,1. Os valores de OD para controlos não específicos (isto é, hibridos 4, 8 e 12) estavam na mesma ordem de grandeza que os valores de linha de base obtidos apenas com PBS em vez de uma amostra hibrida. Foi assim demonstrado pela primeira vez que os miRNAs podem ser detetados com alta sensibilidade e especificidade por meio de um método de imunoensaio. O ensaio descrito no exemplo acima foi repetidamente realizado com diferentes combinações de tamões e soluções de lavagem, todos com resultados comparáveis, demonstrando assim um método robusto e reprodutível de deteção de miRNA. As séries de diluição mostram uma boa deteção em várias ordens de grandeza com alta linearidade e reprodutibilidade. 0 formato de ensaio ELISA como usado, por exemplo, no exemplo acima é conhecido por ser bem adequado para uma deteção também quantitativa de analitos.

Listagem de Sequências

<110> Siemens AG

<120> Imunoensaio para detetar sequências específicas de ácido nucleico tais como miRNA <130> 201204166 <160> 12 <170> BiSSAP 1.0 <210> 1 <211> 23

<212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> origem <222> 1..23 <223> /tipo_molécula="RNA" /organismo="Homo sapiens" <400> 1 uggaagacua gugauuuugu ugu 23 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> origem <222> 1..21 <223> /tipo_mólecula="DNA" /nota="oligonucleótido" /organismo="Artificial" <400> 2 aacaaaatca ctagtcttcc a 21 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> origem <222> 1..18 <223> /tipo_molécula="DNA" /nota="oligonucleóido" /organismo="Artificial" <400> 3 aaaatcacta gtcttcca 18 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> origem <222> 1..15 <223> /tipo_molécula="DNA" /nota="oligonucleótido" /organismo="Artificial" <400> 4 atcactagtc ttcca 15 <210> 5 <211> 22

<212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> origem <222> 1..22 <223> /tipo_molécula="RNA" /organismo="Homo sapiens" <400> 5 uauguaauau gguccacauc uu 22 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> origem <222> 1..21 <223> /tipo_molécula="DNA" /nota="oligonucleótido" /organismo="Artificial" <400> 6 agatgtggac catattacat a 21 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> origem <222> 1..18 <223> /tipo_molécula="DNA" /nota="oligonucleótido" /organismo="Artificial" <400> 7 tgtggaccat attacata 18 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> origem <222> 1..15 <223> /tipo_molécula="DNA" /nota="oligonucleótido" /organismo="Artificial" <400> 8 ggaccatatt acata 15 <210> 9 <211> 24

<212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> origem <222> 1..24 <223> /tipo_molécula="RNA" /nota="miR-1254" /organismo="Homo sapiens" <400> 9 agccuggaag cuggagccug cagu 24 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> origem <222> 1..21 <223> /tipo_molécula="DNA" /nota="oligonucleótido" /organismo="Artificial" <400> 10 gcaggctcca gcttccaggc t 21 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> origem <222> 1..18 <223> /tipo_molécula="DNA" /nota="oligonucleótido" /organismo="Artificial" <400> 11 ggctccagct tccaggct 18

<210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> origem <222> 1..15 <223> /tipo_molécula="DNA" /nota="oligonucleótido" /organismo="Artificial" <400> 12 tccagcttcc aggct 15

Claims (7)

REIVINDICAÇÕES

1. Um método para detetar uma molécula de ácido nucleico de interesse numa amostra, em que a molécula de ácido nucleico de interesse é um microRNA, compreendendo os seguintes passos: - fornecer uma sonda de ácido nucleico em solução; - hibridar a molécula de ácido nucleico de interesse para a sonda de ácido nucleico para obter híbrido da referida molécula de ácido nucleico de interesse e a referida sonda de ácido nucleico; - ligar o referido híbrido a um anticorpo capaz de se ligar especificamente a híbridos de ácido nucleico, em que o anticorpo é ligado a uma fase sólida; e - detetar o híbrido ligado a anticorpos, em que o anticorpo está ligado a um antigénio competitivo antes da ligação do referido primeiro híbrido e o referido híbrido é detetado pelo deslocamento do antigénio competitivo, em que o antigénio competitivo é um híbrido competitivo de ácidos nucleicos, o referido híbrido competitivo sendo portador de uma fração marcadora.

2. Um método para detetar uma molécula de ácido nucleico de interesse numa amostra, em que a molécula de ácido nucleico de interesse é um microRNA, compreendendo os seguintes passos: - fornecer uma sonda de ácido nucleico em solução; - hibridar a molécula de ácido nucleico de interesse da sonda de ácido nucleico para obter híbridos da referida molécula de ácido nucleico de interesse e a referida sonda de ácido nucleico; - ligar o referido hibrido a um anticorpo capaz de se ligar especificamente a hibridos de ácido nucleico, em que o anticorpo está em solução; e - deteção do hibrido ligado a anticorpos em solução, em que o anticorpo é ligado a um antigénio competitivo antes da ligação do referido primeiro hibrido e o referido hibrido é detetado pelo deslocamento do antigénio competitivo, em que o antigénio competitivo é um hibrido competitivo de ácidos nucleicos, o referido hibrido competitivo sendo portador de uma fração marcadora.

3. 0 método, de acordo com qualquer uma das reivindicações acima mencionadas, em que a sonda de ácido nucleico é um DNA.

4. 0 método, de acordo com qualquer uma das reivindicações acima mencionadas, em que o anticorpo é especifico para os hibridos de DNArRNA.

5. 0 método, de acordo com qualquer uma das reivindicações acima mencionadas, em que a sonda de ácido nucleico é marcada com uma fração marcadora.

6. 0 método, de acordo com qualquer uma das reivindicações acima mencionadas, em que a deteção é uma deteção quantitativa.

7. 0 método, de acordo com qualquer uma das reivindicações acima mencionadas, em que uma pluralidade de diferentes ácidos nucleicos de interesse é detetada pela utilização de uma respetiva pluralidade de sondas de ácido nucleico.