KR20240012335A - 생물학적 검출 칩 및 그의 적용 - Google Patents

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린 시-웨이
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카오 시-텡
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Abstract

본 발명은 생물학적 검출 칩 및 그 적용을 개시한다. 상기 생물학적 검출 칩은 병렬로 된 복수의 트랜지스터를 포함한다. 각 트랜지스터는 기판층, 플로팅 게이트, 연장 금속 커넥터, 연장 게이트 및 생물학적 검출 층을 포함한다. 상기 생물학적 검출 칩은 생물학적 검출을 위한 표면 개질 공정 후 생물학적 프로브와 결합된다. 생물학적 검출에는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV), 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV) 및 코르티솔 검출이 포함된다.

Description

생물학적 검출 칩 및 그의 적용{Biological detection chip and application thereof}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2022년 7월 19일에 출원된 미국 가출원 번호 63/390,347의 우선권 및 이익을 주장하며, 그 개시 내용은 전체가 참조로 원용된다.
ASCII 텍스트 파일로 서열 목록 제출
본 출원은 전자적으로 제출된 XML 형식의 서열 목록을 포함한다. XML 파일에는 2023년 7월 14일에 생성된 17,193 바이트 크기의 파일명 "P23-0151KR Sequence Listing.xml"의 서열 목록이 포함되어 있다. 이 XML 파일에 포함된 서열 목록은 본 명세서의 일부로서 그 전체 내용은 참조로 본원에 포함된다.
1. 발명의 분야
본 발명은 생물학적 검출 칩 및 그 적용에 관한 것으로, 특히 복수의 트랜지스터를 병렬로 갖는 생물학적 검출 칩 및 상기 생물학적 검출 칩을 이용한 검출 방법에 관한 것이다.
선행 기술의 설명
생물학적 검출 기술은 종종 항원-항체 결합, 핵산 혼성화 등과 같은 생체 분자 간의 특이적 상호 작용에 의존하며 그 결과 시험 샘플에서 생물학적 표적의 존재를 결정하기 위해 물리적 또는 화학적 변화를 검출하는 것으로 이어진다. 그러나, 면역 분석 및 역전사-중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR)과 같은 기존의 생물학적 검출 방법은 실험실 환경 밖에서 수행하기 어려운 경우가 많다. 이들 방법은 복잡하고 시간이 많이 걸리며 특수 장비와 전문 지식이 필요하다. 예를 들어, 종래 돼지 관련 바이러스 검출을 위한 방법의 경우, 돼지 농장에서 샘플을 채취하여 검사를 위해 실험실로 운반해야 한다. 동남아 일부 국가와 같이 검사 시설이 제한된 지역에서는 검사 결과에 대한 대기 시간이 1주일을 초과할 수 있어 방역 조치가 지연될 위험이 있다.
이러한 점에서 종래의 생물학적 검출 방법은 감도가 낮고, 검출 시간이 길며, 조작이 복잡한 등 많은 단점을 가지고 있다. 생물학적 검출 방법을 개선하는 것이 필요하다.
발명의 요약
일 측면에서, 본 발명은 복수의 행(row)과 복수의 열(column)을 갖는 어레이에 배치된 복수의 트랜지스터를 포함하는 생물학적 검출 칩을 제공하며, 상기 복수의 트랜지스터 각각은 복수의 행 중 하나와 복수의 행 중 하나 내에 배치되고, 상기 복수의 트랜지스터 각각은,
공유 소스(shared source), 공유 드레인(shared drain), 및 상기 공유 소스와 상기 공유 드레인 사이에 배치된 채널 영역(channel area)을 포함하는 기판층(substrate layer);
상기 채널 영역 상에 배치되고 폴리실리콘 산화물 층을 포함하는 플로팅 게이트(floating gate);
상기 플로팅 게이트 상에 배치된 연장 금속 커넥터(extending metal connector);
상기 연장 금속 커넥터 상에 배치되고 상기 연장 금속 커넥터를 통해 상기 플로팅 게이트에 전기적으로 연결되는 연장 게이트(extending gate); 및
상기 연장 게이트 상에 배치되고 고정화 영역 및 상기 고정화 영역에 고정된 적어도 하나의 생물학적 프로브를 포함하는 생물학적 검출 층을 포함한다.
일부 실시양태에서, 동일한 행에 배치된 복수의 트랜지스터는 병렬로 연결된다. 동일한 열에 있는 복수의 트랜지스터 중 인접한 트랜지스터의 각각의 플로팅 게이트는 거의 동일한 거리에서 서로 인접하게 배치된다. 인접한 트랜지스터의 각각의 플로팅 게이트는 2개의 트랜지스터 사이의 공유 소스 또는 공유 드레인 영역에 매우 근접하게 위치하며, 즉 동일한 열에 배치된 2개의 인접한 트랜지스터의 플로팅 게이트는 인접한 두 트랜지스터 사이의 공유 소스 또는 공유 드레인과의 거리가 거의 동일하다. 대안적으로, 인접한 트랜지스터의 각각의 플로팅 게이트는 2개의 트랜지스터 사이의 공유 소스 또는 공유 드레인 영역의 적어도 일부와 부분적으로 겹치며, 즉 동일한 열에 배치된 두 인접 트랜지스터의 플로팅 게이트는 두 인접 트랜지스터 사이의 공유 소스 또는 공유 드레인과 겹치는 거리가 거의 동일하다.
일부 실시양태에서, 복수의 생물학적 검출 층은 생물학적 검출 칩의 표면 상에 병렬로 된 복수의 생물학적 검출 영역을 형성한다.
일부 실시양태에서, 복수의 생물학적 검출 영역은 미세 유동 채널 또는 샘플 탱크를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 고정화 영역은 연장 게이트의 표면 상의 표면 개질 공정을 통해 생성되며, 여기서 표면 개질 공정은 3-아미노프로필트리에톡시실란-글루타르알데히드(APTES-GA), 3-아미노프로필트리에톡시실란-N-하이드록시숙신이미드(APTES-NHS), 3-아미노프로필트리에톡시실란-비오틴(APTES-비오틴) 및 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(GPTMS) 표면 개질 방법으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 고정화 영역은 및 로 이루어진 군으로부터 선택된 복수의 화학 구조를 포함한다.
일부 실시양태에서, 생물학적 프로브는 데옥시리보핵산, 리보핵산, 항체 및 앱타머 중 적어도 하나를 포함한다. 생물학적 프로브는 생물학적 접합을 통해 고정화 영역에 고정화된다.
일부 실시양태에서, 생물학적 검출 칩은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)를 검출하기 위한 것이며, 여기서 생물학적 프로브는 서열 번호 1 내지 서열 번호 11의 합성 올리고뉴클레오타이드 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시양태에서, 생물학적 검출 칩은 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)를 검출하기 위한 것이며, 여기서 생물학적 프로브는 서열 번호 12 내지 서열 번호 15의 합성 올리고뉴클레오타이드 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시양태에서, 생물학적 검출 칩은 코르티솔을 검출하기 위한 것이며, 여기서 생물학적 프로브는 항-코르티솔 항체이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 생물학적 표적을 검출하는 방법을 제공하며, 다음 단계를 포함한다:
본 발명의 생물학적 검출 칩을 제공하는 단계;
병렬로 연결된 복수의 생물학적 검출 영역에 블랭크 샘플(blank sample)을 배치하고, 복수의 트랜지스터의 게이트 전압 및 드레인 전류를 측정하여 표준선을 설정하는 단계;
시험 샘플을 상기 복수의 생물학적 검출 영역에 예정된 시간 동안 배치하는 단계;
상기 블랭크 샘플에 의해 상기 복수의 생물학적 검출 영역을 세척하는 단계;
상기 복수의 트랜지스터의 게이트 전압 및 드레인 전류를 측정하여 측정선을 설정하는 단계; 및
상기 측정선을 상기 표준선과 비교하여 상기 시험 샘플이 생물학적 표적을 포함하고 있는지 여부를 결정하는 단계.
일부 실시양태에서, 생물학적 표적은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV), 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV) 또는 코르티솔이다.
다른 측면에서, 본 발명은 전술한 생물학적 검출 칩을 이용하여 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)를 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은 생물학적 검출 칩을 사용하여 시험 샘플에서 PRRSV 검출을 수행하는 것을 포함한다. 생물학적 프로브는 서열 번호 1 내지 서열 번호 11의 합성 올리고뉴클레오타이드 중 적어도 하나를 포함한다. 또한, 생물학적 프로브는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)에 대한 항체일 수도 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 전술한 생물학적 검출 칩을 사용하여 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)를 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은 생물학적 검출 칩을 사용하여 시험 샘플에서 PEDV 검출을 수행하는 것을 포함한다. 생물학적 프로브는 서열 번호 12 내지 서열 번호 15의 합성 올리고뉴클레오타이드 중 적어도 하나를 포함한다. 또한, 생물학적 프로브는 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)에 대한 항체일 수도 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 전술한 생물학적 검출 칩을 이용하여 코르티솔을 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은 생물학적 검출 칩을 사용하여 시험 샘플에서 코르티솔 검출을 수행하는 것을 포함한다. 생물학적 프로브는 항 코르티솔 항체이다.
본 발명이 제공하는 생물학적 검출 칩은 고감도, 신속한 검출, 용이한 작동 및 우수한 정확도를 비롯한 몇 가지 장점을 제공한다. 트랜지스터 구조에 생물학적 검출 층을 통합하여 생물학적 검출의 감도와 편의성을 높였다. 검출 기능이 향상되었으며 신호 분석을 통한 검출 시간이 단축되었다. 또한 게이트 전극의 연장으로 부품이 외부 환경에 노출되는 것을 방지하여 생물학적 검출 칩의 안정성과 수명을 늘렸다. 또한, 서로 다른 생물학적 프로브를 교체함으로써 칩은 다양한 생물학적 표적을 검출할 수 있어 생물학적 검출 칩의 다양성을 향상시키고 다양한 산업에서 구현을 용이하게 한다.
첨부된 도면은 본 발명의 하나 이상의 실시양태를 예시하고, 서면 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 한다. 가능한 한 실시양태의 동일하거나 유사한 요소를 나타내기 위해 도면 전체에서 동일한 참조 번호가 사용된다.
도 1은 본 개시의 일 실시양태에 따른 생물학적 검출 칩의 개략도이다.
도 2A는 본 개시의 일 실시양태에서 도 1의 점선 AA'를 따른 생물학적 검출 칩의 단면도이다.
도 2B는 본 개시의 다른 실시양태에서 도 1의 점선 AA'를 따른 생물학적 검출 칩의 단면도이다.
도 3A는 본 개시의 일 실시양태에 따른 3-아미노프로필트리에톡시실란-글루타르알데히드(APTES-GA) 개질 방법의 개략도이다.
도 3B는 본 개시의 또 다른 실시양태에 따른 3-아미노프로필트리에톡시실란-N-하이드록시숙신이미드(APTES-NHS) 개질 방법의 개략도이다.
도 3C는 본 개시의 또 다른 실시양태에 따른 3-아미노프로필트리에톡시실란-비오틴(APTES-비오틴) 개질 방법의 개략도이다.
도 4는 본 개시의 또 다른 실시양태에 따른 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(GPTMS) 개질 방법의 개략도이다.
도 5는 본 개시의 일 실시양태에 따른 생물학적 검출 방법의 흐름도이다.
도 6은 본 개시의 일 실시양태에 따른 생물학적 검출 방법의 회로도이다.
도 7A는 본 개시의 실시예 1에 따른 항체 프로브를 이용하여 생물학적 검출 칩에 의해 검출된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)의 전기적 곡선도이다.
도 7B는 본 개시의 실시예 1에 따른 항체 프로브를 이용하여 생물학적 검출 칩에 의해 검출된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)의 신호 양자화도이다.
도 7C는 본 개시의 실시예 1에 따른 DNA 프로브를 이용하여 생물학적 검출 칩에 의해 검출된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)의 전기적 곡선도이다.
도 7D는 본 개시의 실시예 1에 따른 DNA 프로브를 이용하여 생물학적 검출 칩에 의해 검출된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)의 신호 양자화도이다.
도 8A는 본 개시의 실시예 2에 따른 생물학적 검출 칩에 의한 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV) 검출에 대한 특이성 시험의 신호 양자화도이다.
도 8B는 본 개시의 실시예 2에 따른 생물학적 검출 칩에 의한 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV) 검출에 대한 백그라운드 신호 테스트의 신호 양자화도이다.
도 8C는 본 개시의 실시예 2에 따른 생물학적 검출 칩에 의한 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV) 검출에 대한 감도 시험의 신호 양자화도이다.
도 9A는 본 개시의 실시예 3에 따른 생물학적 검출 칩에 의해 검출된 코르티솔의 전기적 곡선도이다.
도 9B는 본 개시의 실시예 3에 따른 생물학적 검출 칩에 의해 검출된 코르티솔의 신호 양자화도이다.
바람직한 실시양태의 상세한 설명
본 발명은 생물학적 검출을 위한 종래 기술의 단점을 고려하여, 생물학적 검출을 최적화하기 위해 생물학적 검출 기술에 칩을 통합하였다. 본 발명의 생물학적 칩은 인식 소자를 통해 표적 물질과 상호 작용함으로써 에너지 변화를 일으킨다. 이러한 에너지 변화는 이어 후속 검출 및 분석을 위한 신호로 변환된다. 이 생물학적 칩은 신속한 검출, 편리한 작동 및 높은 감도 등의 장점을 제공한다.
상기 일반적인 설명 및 이하의 상세한 설명은 모두 예시적이고 설명을 위한 것이며, 본 발명을 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 본 발명의 하나 이상의 실시양태의 특정 세부사항이 다음 개시에서 설명된다. 본 발명의 다른 특징 또는 이점은 아래의 대표적인 실시양태의 비제한적 목록 및 이어지는 청구범위로부터 명백해질 것이다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시와 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함한다. 본 개시의 방법 및 기술은 일반적으로 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라 수행된다. 일반적으로, 본원에 기술된 생화학, 효소학, 분자 및 세포 생물학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 일반적으로 사용되는 것들이다. 본 개시의 방법 및 기술은 달리 나타내지 않는 한 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라 일반적으로 수행된다.
본원에서 사용된 단수형 "a", "an" 및 "the"는 달리 나타내지 않는 한 복수 참조를 포함한다. 예를 들어, "an" 부형제는 하나 이상의 부형제를 포함한다.
본원에서 사용된 "포함하는"이라는 문구는 개방형이며, 이는 그러한 실시양태가 추가 요소를 포함할 수 있음을 나타낸다. 대조적으로, "이루어진"이라는 문구는 폐쇄형이며, 이는 이러한 실시양태가 추가 요소(미량의 불순물 제외)를 포함하지 않는다는 것을 나타낸다. "필수적으로 이루어진"이라는 문구는 부분적으로 폐쇄형이며, 이는 이러한 실시양태가 이러한 실시양태의 기본 특성을 실질적으로 변경하지 않는 요소를 더 포함할 수 있음을 나타낸다.
본원에서 상호 교환적으로 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 단일 가닥 DNA(ssDNA), 이중 가닥 DNA(dsDNA), 단일 가닥 RNA(ssRNA) 및 이중 가닥 RNA(dsRNA), 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오사이드 또는 이들의 조합을 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 선형 또는 원형으로 구성될 수 있거나, 올리고뉴클레오타이드는 선형 및 원형 세그먼트를 모두 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 통해 결합된 뉴클레오사이드의 중합체이지만, 포스포로티오에이트 에스테르와 같은 대체 결합도 올리고뉴클레오타이드에 사용될 수 있다. 뉴클레오사이드는 당에 결합된 퓨린(아데닌(A) 또는 구아닌(G) 또는 이의 유도체) 또는 피리미딘(티민(T), 시토신(C) 또는 우라실(U) 또는 이의 유도체) 염기로 구성된다. DNA에 있는 4개의 뉴클레오시드 단위(또는 염기)는 데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 티미딘 및 데옥시시티딘으로 지칭된다. 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드의 인산염 에스테르이다.
상호 교환적으로 사용되는 "대략", 약" 및 "거의"는 일반적으로 그것이 사용되는 수치의 ± 10%를 의미할 것이다. 따라서, 약 1%는 0.9% 내지 1.1%의 범위를 의미한다. 본원에 주어진 수치적 양은 대략적이며, 즉 용어 "대략", 약" 및 "거의"는 명시적으로 언급되지 않은 경우 유추일 수 있음을 의미한다.
본원에서 사용된 "거의 동일한 거리" 라는 용어는 두 거리가 동일하거나, 또는 제2 거리가 제1 거리의 ±10%인 것을 의미한다. 예를 들어 제1 거리는 1 cm이고 제2 거리는 1 cm 또는 0.9 내지 1.1 cm이다.
본원에서 사용된 용어 "APTES-GA 개질 방법"은 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES) 처리 후 글루타르알데히드(GA) 처리를 포함하는 표면 개질 방법을 의미한다. APTES-GA 개질 방법에 대한 자세한 내용은 이하 섹션 B "표면 개질 공정"의 설명을 참조한다.
본원에서 사용된 용어 "APTES-NHS 개질 방법"은 생물학적 탐침을 NHS(N-하이드록시숙신이미드)로 처리하는 것과 함께 APTES(3-아미노프로필트리에톡시실란)를 사용하여 칩 표면을 변형시킨 다음 생물학적 접합을 통해 생물학적 프로브를 칩 표면에 접합하는 표면 개질 공정을 지칭한다. APTES-NHS 개질 방법에 대한 자세한 내용은 이하 섹션 B "표면 개질 공정"의 설명을 참조한다.
본원에서 사용된 용어 "APTES-비오틴 개질 방법"은 생물학적 프로브를 비오틴으로 처리하는 것과 함께 칩 표면을 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)으로 개질한 후 생물학적 프로브를 생물학적 접합을 통해 칩 표면에 접합시키는 표면 개질 공정을 의미한다. APTES-비오틴 개질 방법에 대한 자세한 내용은 이하 섹션 B "표면 개질 공정"의 설명을 참조한다.
본원에서 사용된 용어 "GPTMS 개질 방법"은 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(GPTMS)의 처리를 수반하는 표면 개질 공정을 의미한다. GPTMS 개질 방법에 대한 자세한 내용은 이하 섹션 B "표면 개질 공정" 설명을 참조한다.
본원에서 사용된 용어 "생물학적 표적"은 본 발명의 생물학적 검출 칩에 의해 검출될 대상을 지칭한다. 생물학적 표적은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 및 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)와 같은 병원체, 또는 코르티솔과 같은 생체분자를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 개시의 기술적 특징, 내용 및 장점, 그리고 이를 통해 달성할 수 있는 효과에 대한 이해를 용이하게 하기 위해, 첨부된 도면을 참조하여 실시양태를 통해 본 개시를 자세히 설명할 것이다. 한편, 본원에 사용된 도면들은 단지 개략적이고 명세서를 보조하기 위한 것일 뿐, 본 개시를 구현한 후의 실제 규모 및 정확한 구성일 필요는 없다. 따라서, 첨부된 도면의 축척 및 구성에 따라 본 개시의 실시범위가 실제 구현에 대한 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
A. 생물학적 검출 칩의 구조
본 개시의 일 실시양태에 따른 생물학적 검출 칩의 개략도인 도 1을 참조한다. 생물학적 검출 칩(1)은 어레이의 열에 배열된 n개의 트랜지스터들(T1-Tn)을 포함한다. 어레이는 복수의 행들과 복수의 열들을 갖는다. 각 트랜지스터는 행 중 하나와 열 중 하나에 배치된다. 같은 행의 트랜지스터는 병렬로 연결된다. 트랜지스터의 개수는 생물학적 검출 칩(1)의 수요에 따라 결정될 수 있다. 병렬로 연결된 트랜지스터들(T1-Tn)의 구조는 상부층(UL)과 하부층(LL)을 포함한다. 트랜지스터(T1)을 예로 들어 보면; 기판층(10)은 공유 소스(S), 공유 드레인(D), 및 공유 소스(S)와 공유 드레인(D) 사이에 배치된 채널 영역을 포함한다. 공유 소스(S)와 공유 드레인(D) 사이의 채널 영역에 플로팅 게이트(FG)가 배치된다. 플로팅 게이트(FG) 아래에 폴리실리콘 산화물 층(PL)이 배치된다. 연장 금속 커넥터(MT)는 X 블록 위치의 플로팅 게이트(FG) 상에 배치되고 플로팅 게이트(FG)를 통해 X' 블록 위치의 연장 게이트(EG)로 연장된다. 연장 게이트(EG)는 연장 금속 커넥터(MT) 상에 배치된다. 따라서, 연장 게이트(EG)는 상부층(UL)의 연장 게이트(EG) 및 하부층(LL)의 플로팅 게이트(FG)에 전기적으로 연결된다.
또한, 도 1에 도시된 바와 같이, 트랜지스터(T1)의 플로팅 게이트(FG)와 하부 행의 인접한 트랜지스터(T1')의 플로팅 게이트(FG)는 각각 동일한 공유 드레인(D)에 거의 동일한 거리로 근접할 수 있으며, 하부 열의 인접 트랜지스터(T1')의 플로팅 게이트(FG)와 하부 열의 인접 트랜지스터(T1'')의 플로팅 게이트(FG)는 각각 동일한 공유 소스(S)에 거의 동일한 거리에서 근접할 수 있다. 즉, 트랜지스터들(T1, T1' 및 T1'')은 동일한 열에 배치되고, 트랜지스터(T1)의 플로팅 게이트(FG)와 트랜지스터(T1')의 플로팅 게이트(FG)는 트랜지스터 (T1)과 (T1') 사이의 공유 드레인(D)까지의 거리가 거의 동일하다. 마찬가지로, 트랜지스터(T1')의 플로팅 게이트(FG)와 트랜지스터(T1'')의 플로팅 게이트(FG)는 트랜지스터 (T1')과 (T1'') 사이의 공유 소스(S)까지의 거리가 거의 동일하다.
본 실시양태에서 연장 게이트(EG)는 금속판 전극이다. 연장 게이트(EG)는 연장 금속 커넥터(MT)를 통해 덮인 폴리실리콘 산화물 층(PL)과 연결되어 상부층(UL)의 연장 게이트(EG)와 플로팅 게이트(FG)를 전기적으로 연결할 수 있다. 다른 실시양태들에서, 연장 게이트(EG)는 다른 형태의 금속 전극일 수 있다. 예를 들어, 연장 게이트(EG)는 나선 형태의 전극일 수 있다. 또한 병렬로 연결된 n개의 트랜지스터들(T1-Tn)의 여러 행이 복수의 검출 층들을 갖는 구조를 형성할 수 있도록 배열된다. 각 검출 층 사이에서 인접한 검출 층들은 공유 소스(S) 또는 공유 드레인(D)을 공유한다. 트랜지스터들(T1-Tn)을 측정할 때 트랜지스터들(T1-Tn)은 병렬로 연결된다. 공유 소스(S)는 접지(ground)에 연결되고 공유 드레인(D)은 전류 측정 단자에 연결될 수 있다. 연장 게이트(EG)에 인가되는 전압을 기초로, 생물학적 검출 결과를 판단하기 위한 검출 데이터로서 드레인 전류의 합을 측정할 수 있다.
생물학적 검출을 수행하기 위해, 트랜지스터들(T1-Tn)의 연장 게이트(EG) 상에는 생물학적 검출 층(BL)이 배치된다. 생물학적 검출 층(BL)이 특정 생물학적 표적(BT)에 결합할 수 있다. 생물학적 검출 층(BL)이 특정 생물학적 표적(BT)와 결합하면 트랜지스터의 전자적 특성이 변한다. 전류 측정은 특정 생물학적 표적(BT)이 있는지 여부를 결정하는 데 사용된다. 생물학적 검출 층(BL)과 관련하여, 도 2A 및 도 2B는 도 1의 점선 AA'에 따른 생물학적 검출 칩의 단면도의 두 실시양태를 도시한다. 도 2A 및 도 2B에 도시된 바와 같이, 생물학적 검출 칩(1)은 복수의 검출 층들을 포함한다. 복수의 검출 층 각각은 상부층(UL) 및 하부층(LL)을 포함하고, 생물학적 검출 층(BL)은 상부층(UL) 상에 배치된다.
도 2A 및 도 2B에 도시된 바와 같이, 트랜지스터(Tn)를 예로 들면; 트랜지스터(Tn)는 공유 소스(S)와 공유 드레인(D)을 포함한다. 플로팅 게이트(FG)가 공유 소스(S)와 공유 드레인(D) 사이의 채널 영역에 배치된다. 플로팅 게이트(FG)는 금속 커넥터(MT)를 통해 연장 게이트(EG)에 전기적으로 연결된다. 도 2A에 도시된 바와 같이, 일 실시양태에서, 트랜지스터(Tn)의 플로팅 게이트(FG) 및 인접한 트랜지스터(Tn')의 플로팅 게이트(FG) 각각은 동일한 공유 드레인(D)의 적어도 일부를 덮을 수 있다; 인접한 트랜지스터(Tn')의 플로팅 게이트(FG) 및 인접한 트랜지스터(Tn')와 접하는 다른 트랜지스터(Tn'')의 플로팅 게이트(FG) 각각은 동일한 공유 소스(S)의 적어도 일부를 덮을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 트랜지스터들(Tn, Tn', Tn'')은 동일한 열에 배치되며, 트랜지스터(Tn)의 플로팅 게이트(FG)와 트랜지스터(Tn')의 플로팅 게이트(FG)는 트랜지스터들(Tn, Tn') 사이의 공유 드레인(D)과 겹치는 거리가 거의 동일하다. 마찬가지로, 트랜지스터(Tn'')의 플로팅 게이트(FG)와 트랜지스터(Tn'')의 플로팅 게이트(FG)는 트랜지스터들(Tn', Tn'') 사이의 공유 소스(S)와 겹치는 거리가 거의 동일하다. 도 2B에 도시된 바와 같이, 다른 실시양태에서, 트랜지스터(Tn)의 플로팅 게이트(FG) 및 인접한 트랜지스터(Tn')의 플로팅 게이트(FG) 각각은 동일한 공유 드레인(D)에 매우 근접하게 위치할 수 있다; 트랜지스터(Tn')의 플로팅 게이트(FG) 및 인접한 다른 트랜지스터(Tn'')의 플로팅 게이트(FG) 각각은 동일한 공유 소스(S)에 매우 근접하게 위치할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 트랜지스터들(Tn, Tn' 및 Tn)은 동일한 열에 배치될 수 있으며, 트랜지스터(Tn)의 플로팅 게이트(FG)와 트랜지스터(Tn')의 플로팅 게이트(FG)는 트랜지스터들(Tn, Tn') 사이의 공유 드레인(D)까지의 거리가 거의 동일하다. 마찬가지로, 트랜지스터(Tn'')의 플로팅 게이트(FG)와 트랜지스터(Tn'')의 플로팅 게이트(FG)는 트랜지스터들(Tn', Tn'') 사이의 공유 소스(S)까지의 거리가 거의 동일하다.
생물학적 검출 층(BL)은 연장 게이트(EG) 상에 배치된다. 고정화 영역(11)은 표면 개질 공정을 통해 연장 게이트(EG) 표면에 생성된다. 복수의 생체 프로브들(BP)이 고정화 영역(11)에 고정화될 수 있다.
본원에 사용된 생물학적 프로브(BP)는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 항체 및 압타머를 포함하지만 이에 제한되지 않는 생체 분자일 수 있다. 생물학적 프로브(BP)는 생물학적 접합을 통해 고정화 영역(11)에 고정화된다. 생물학적 검출이 수행되면 생물학적 프로브(BP)는 샘플 내의 생물학적 표적(BT)과 결합하며, 생성된 전하가 트랜지스터(Tn)에서 검출되는 드레인 전류 신호에 영향을 미칠 수 있다. 드레인 전류 신호에 기초하여, 그에 따라 특정 생물학적 프로브(BP)에 대응하는 생물학적 표적(BT) 또는 생물학적 표적(BT)의 양이 결정될 수 있다.
생물학적 검출 칩(1)은 병렬로 연결된 여러 트랜지스터에 의해 검출 층을 형성할 수 있다. 복수의 검출 층들은 검출 층을 추가로 형성하여 생물학적 검출 칩(1)의 표면 상에 복수의 생물학적 검출 영역들(BA)을 형성할 수 있다. 샘플 탱크(TA)가 생물학적 검출 층(BL)에 설치되어 생물학적 검출 영역(BA)에 생물학적 검출 용액을 수용하기 위한 수용 공간을 생성할 수 있다. 따라서, 생물학적 검출 용액 내의 생물학적 표적(BT)이 생물학적 검출 영역들(BA) 내에 수용될 수 있다. 생물학적 검출 용액은 생물학적 검출 칩(1)의 표면을 덮어 생물학적 표적(BT)과 생물학적 검출 층(BL)의 생물학적 프로브(BP)가 서로 접촉하여 결합할 수 있도록 한다. 본 실시양태에서 수용 공간은 샘플 탱크(TA)이다. 그러나, 수용 공간은 생물학적 검출 층(BL)에 배치된 마이크로플로우 채널과 같이 다른 형태일 수 있으며 이에 제한되지는 않는다.
요약하면, 본 발명은 복수의 행과 복수의 열을 갖는 어레이에 배치된 복수의 트랜지스터를 포함하는 생물학적 검출 칩을 제공하며, 상기 복수의 트랜지스터 각각은 복수의 행 중 하나와 복수의 행 중 하나 내에 배치되고, 상기 복수의 트랜지스터 각각은,
공유 소스, 공유 드레인, 및 상기 공유 소스와 상기 공유 드레인 사이에 배치된 채널 영역을 포함하는 기판층;
상기 채널 영역 상에 배치되고 폴리실리콘 산화물 층을 포함하는 플로팅 게이트;
상기 플로팅 게이트 상에 배치된 연장 금속 커넥터;
상기 연장 금속 커넥터 상에 배치되고 상기 연장 금속 커넥터를 통해 상기 플로팅 게이트에 전기적으로 연결되는 연장 게이트; 및
상기 연장 게이트 상에 배치되고 고정화 영역 및 상기 고정화 영역에 고정된 적어도 하나의 생물학적 프로브를 포함하는 생물학적 검출 층을 포함한다.
일부 실시양태에서, 동일한 행에 배치된 복수의 트랜지스터들은 병렬로 연결된다. 동일한 열에 있는 복수의 트랜지스터 중 인접한 트랜지스터들의 각각의 플로팅 게이트는 거의 동일한 간격으로 서로 인접하여 배치된다. 동일한 열에 배치된 2개의 인접한 트랜지스터들의 플로팅 게이트는 2개의 인접한 트랜지스터들 사이의 공유 소스 또는 공유 드레인까지의 거리가 거의 동일하다. 대안적으로, 동일한 열에 배치된 2개의 인접한 트랜지스터들의 플로팅 게이트는 2개의 인접한 트랜지스터들 사이의 공유 소스 또는 공유 드레인과 겹치는 거리가 거의 동일하다.
일부 실시양태에서, 복수의 생물학적 검출 층들은 생물학적 검출 칩의 표면 상에 병렬로 복수의 생물학적 검출 영역을 형성한다.
일부 실시양태에서, 고정화 영역은 및 로 이루어진 군으로부터 선택된 복수의 화학 구조를 포함한다.
B. 표면 개질 공정
본 개시의 생물학적 검출 칩의 고정화 영역은 연장 게이트의 표면 상에 표면 개질 공정을 통해 생성된다. 일부 실시양태에서, 표면 개질 공정은 APTES-GA 개질 방법, APTES-NHS 개질 방법, APTES-비오틴 개질 방법 및 GPTMS 개질 방법 중 하나이다. 이하 각 표면 개질 공정에 대한 자세한 정보가 설명된다.
도 3A 및 도 4에 도시된 바와 같이, 생물학적 검출 칩의 제조 공정은 먼저 소스 영역(101), 드레인 영역(102) 및 채널 영역(103)을 형성한다. 그 다음 채널 영역(103) 상에 플로팅 게이트(FG)를 형성한다. 폴리실리콘 산화물 층(PL)이 플로팅 게이트(FG) 아래에 배치되고, 연장 게이트(EG)에의 추가 연결을 위해 플로팅 게이트(FG) 상에 금속 커넥트가 배치된다.
도 3A에 도시된 바와 같이, APTES-GA 개질 방법에 관련된 단계는 다음과 같이 설명된다:
패키징된 칩을 먼저 아세톤에서 초음파 처리하고 이어 95% 에탄올에서 초음파 처리한 다음, 90-120℃에서 건조시켜 에탄올을 제거하였다. 그 다음, 칩을 산소 플라즈마 처리하여 연장 게이트(EGS)의 표면에 하이드록실기(-OH)를 도입하였다. 그 후, 칩을 약 30분 동안 에탄올에 용해된 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)에 담근 후 초음파 처리하였다. 그런 다음 칩을 90-120℃에서 건조시켜 에탄올을 제거하고 APTES의 아민기(-NH2)가 연장 게이트(EGS)의 하이드록실화 표면에 결합되도록 하였다.
이어, 칩을 글루타르알데히드(GA) 용액에 약 30분 동안 담가서 연장 게이트(EGS)의 표면을 알데히드기(-CHO)로 개질시켰다. 이어서, 아미노기(-NH2)를 갖는 다수의 생물학적 프로브(BP)를 고정화 영역(11)의 알데히드기에 접합시켜 생물학적 프로브(BP)가 칩 상에 고정되도록 하였다.
소 혈청 알부민(BSA)과 같은 차단제로 처리한 후, 칩을 세척하고 질소 가스로 건조한 뒤, 진공 보관 또는 추가 사용을 위해 몰드에 넣었다.
상술한 APTES-GA 개질 방법에 의한 표면 개질 후, 고정화 영역은 하기와 같은 복수의 화학 구조를 포함한다:
도 3B에 도시된 바와 같이, APTES-NHS 개질 방법에 관련된 단계가 다음과 같이 설명된다:
패키징된 칩을 먼저 아세톤에서 초음파 처리하고 이어 95% 에탄올에서 초음파 처리한 다음, 90-120℃에서 건조시켜 에탄올을 제거하였다. 그 다음, 칩을 산소 플라즈마 처리하여 연장 게이트(EGS)의 표면에 하이드록실기(-OH)를 도입하였다. 그 후, 칩을 약 30분 동안 에탄올에 용해된 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)에 담근 후 초음파 처리하였다. 그런 다음 칩을 90-120℃에서 건조시켜 에탄올을 제거하고 APTES의 아민기(-NH2)가 연장 게이트(EGS)의 하이드록실화 표면에 결합되도록 하였다.
이어, N-하이드록시숙신이미드(NHS)기를 갖는 다수의 생물학적 프로브(BP)를 고정화 영역(11)의 아민기에 약 30분 동안 접합하여 생물학적 프로브(BP)가 칩 상에 고정되도록 하였다.
BSA와 같은 차단제로 처리한 후, 칩을 세척하고 질소 가스로 건조한 뒤, 진공 보관 또는 추가 사용을 위해 몰드에 넣었다.
상술한 APTES-NHS 개질 방법에 의한 표면 개질 후, 고정화 영역은 하기와 같은 복수의 화학 구조를 포함한다:
도 3C에 도시된 바와 같이, APTES-비오틴 개질 방법에 관련된 단계가 다음과 같이 설명된다:
패키징된 칩을 먼저 아세톤에서 초음파 처리하고 이어 95% 에탄올에서 초음파 처리한 다음, 90-120℃에서 건조시켜 에탄올을 제거하였다. 그 다음, 칩을 산소 플라즈마 처리하여 연장 게이트(EGS)의 표면에 하이드록실기(-OH)를 도입하였다. 그 후, 칩을 약 30분 동안 에탄올에 용해된 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)에 담근 후 초음파 처리하였다. 그런 다음 칩을 90-120℃에서 건조시켜 에탄올을 제거하고 APTES의 아민기(-NH2)가 연장 게이트(EGS)의 하이드록실화 표면에 결합되도록 하였다.
이어서, 비오틴기를 갖는 다수의 생물학적 프로브(BP)를 약 30분 동안 고정화 영역(11)의 아민기에 접합시켜 생물학적 프로브(BP)가 칩 상에 고정되도록 하였다.
BSA와 같은 차단제로 처리한 후 칩을 세척하고 질소 가스로 건조한 뒤, 진공 보관 또는 추가 사용을 위해 몰드에 넣었다.
상술한 APTES-비오틴 개질 방법에 의한 표면 개질 후, 고정화 영역은 하기와 같은 복수의 화학 구조를 포함한다:
일부 실시양태에서, 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)은 칩 상의 연장 게이트 EGS의 표면을 개질하기 위해 에폭시 수지 용액으로 대체될 수 있다.
도 4에 도시된 바와 같이, GPTMS 개질 방법에 관련된 단계는 다음과 같이 기술된다:
패키징된 칩을 먼저 아세톤에서 초음파 처리하고 이어 95% 에탄올에서 초음파 처리한 다음, 90-120℃에서 건조시켜 에탄올을 제거하였다. 그 다음, 칩을 산소 플라즈마 처리하여 연장 게이트(EGS)의 표면에 하이드록실기(-OH)를 도입하였다. 그 후, 칩을 약 30분 동안 무수 에탄올에 용해된 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(GPTMS)에 담근 후 무수 에탄올에서 초음파 처리하였다. 그런 다음 칩을 90-120℃에서 건조시켜 에탄올을 제거하고 GPTMS의 에폭시드기가 연장 게이트(EGS)의 하이드록실화 표면에 결합되도록 하였다.
이어서, 아미노기(-NH2)를 갖는 다수의 생물학적 프로브(BP)를 고정화 영역(11)의 에폭시드기에 접합시켜 생물학적 프로브(BP)가 칩 상에 고정되도록 하였다.
BSA와 같은 차단제로 처리한 후 칩을 세척하고 질소 가스로 건조한 뒤, 진공 보관 또는 추가 사용을 위해 몰드에 넣었다.
상술한 GPTMS 개질 방법에 의해 표면 개질된 후, 고정화 영역은 하기와 같은 다수의 화학 구조를 포함한다:
C. 생물학적 검출 방법
본 발명은 또한 도 5에 도시된 바와 같이 다음 단계(S1-S5)를 포함하는 생물학적 검출 방법을 제공한다:
단계 S1: 본 발명의 생물학적 검출 칩을 제공하는 단계.
단계 S2: 병렬로 연결된 복수의 생물학적 검출 영역에 블랭크 샘플을 위치시키고, 복수의 트랜지스터의 게이트 전압 및 드레인 전류를 측정하여 표준선을 설정하는 단계. 본 개시의 일 실시양태에 따른 생물학적 검출 방법의 회로도인 도 6에 도시된 바와 같이, 생물학적 검출 칩은 병렬로 연결된 트랜지스터들(nmos)에 의해 형성된 검출 층을 포함한다. 트랜지스터들(nmos)의 공유 소스(S)를 접지(ground)에 연결하고, 공유 드레인(D)을 전류 측정 장치(M)에 연결한다. 게이트 전극을 연장된 게이트(EG)까지 연장한다. 중성 버퍼와 같은 블랭크 샘플을 생물학적 검출 영역에 배치하여 생물학적 검출 층의 연장 게이트(EG)를 덮은 후, 상이한 게이트 전압, 예를 들어 0V 내지 2V를을 연장 게이트(EG)에 인가한다. 그런 다음 전류 측정 장치(M)로 공유 드레인(D)의 출력 전류(I1-In)를 측정한다. 트랜지스터들(nmos)이 병렬로 연결되어 있기 때문에, 출력 전류(I1-In)의 합은 전압 변환기(ADC)를 통해 디지털 신호로 변환될 수 있다. 드레인 전류의 정보가 출력 단자(OUTPUT)에서 출력되고 이에 따라 측정의 표준선이 설정된다.
본 실시양태에서, 생물학적 검출 칩은 증폭기(OP)를 더 포함한다. 증폭기(OP)의 입력 단자는 기준 전압(VREF)과 공유 드레인(D)에 병렬로 연결된다. 증폭기(OP)의 출력 단자는 트랜지스터들(nmos)의 제어 단자에 연결된다. 트랜지스터(n mos)는 전류 측정 장치(M)에 연결된다. 다른 실시양태에서, 공유 소스(S) 및 공유 드레인(D)은 접점을 통해 전압 소스 및 신호 수집 장치에 연결될 수 있다. 소스 전류의 정보는 외부 장치에서 수집할 수 있다.
단계 S3: 시험 샘플을 복수의 생물학적 검출 영역에 예정된 시간 동안 배치하는 단계. 시험 샘플 용액을 생물학적 검출 영역에 배치한다. 예를 들어, 생물학적 표적이 생물학적 검출 층의 생물학적 프로브에 결합할 수 있도록 시험 샘플을 일정 시간 동안 샘플 탱크에 배치한다. 시험 샘플의 반응 시간은 생물학적 표적 종에 의해 결정된다.
단계 S4: 상기 블랭크 샘플에 의해 상기 복수의 생물학적 검출 영역을 세척하는 단계. 일부 실시양태에서, 시험 샘플의 생물학적 표적이 생물학적 프로브에 완전히 결합하는 것을 보장하기 위해 단계 S3 및 S4를 여러 번 반복한다. 반복 횟수는 시험 샘플의 농도 및 생물학적 프로브의 결합 특성과 같은 다양한 매개변수에 의해 결정된다.
단계 S5: 복수의 트랜지스터들의 게이트 전압 및 드레인 전류를 측정하여 측정선을 설정하고, 측정선과 표준선을 비교하여 시험 샘플이 생물학적 표적을 포함하는지 여부를 결정하는 단계. 반응(S3) 및 세척(S4) 단계 후에, 다시 연장 게이트(EG)에 상이한 게이트 전압을 인가한다. 공유 드레인(D)의 출력 전류(I1-In)를 전류 측정기(M)에 의해 측정하고 출력 전류(I1-In)의 합을 전압 변환기(ADC)를 통해 디지털 신호로 변환한다. 드레인 전류의 정보는 출력 단자(OUTPUT)에서 출력되고, 그에 따라 시험 샘플의 측정선이 설정된다. 그런 다음 측정선을 표준선과 비교하여 측정선이 표준선에서 얼마나 벗어났는지 확인하고 편차의 정도에 따라 시험 샘플에 생물학적 표적이 포함되어 있는지 여부를 추가로 확인한다. 시험 샘플에 생물학적 표적이 포함되어 있지 않은 경우 검출 칩의 생물학적 프로브는 어떤 것과도 결합하지 않는다; 칩의 게이트 전하의 변화가 없으므로 측정선이 표준선에서 뚜렷하게 벗어나지 않는다. 대조적으로, 시험 샘플이 생물학적 표적을 포함하는 경우, 검출 칩 상의 생물학적 프로브는 생물학적 표적에 결합한다; 칩의 게이트 전하의 변화가 있어 측정선이 표준선에서 벗어난다. 따라서, 측정선이 표준선과 뚜렷한 편차가 없다면 시험 샘플은 생물학적 표적을 포함하고 있지 않은 것으로 결정된다. 그러나, 측정선과 표준선의 편차가 일정 수준 이상이면 시험 샘플은 생물학적 표적을 포함하는 것으로 결정된다.
일부 실시양태에서, 생물학적 표적은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV), 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV) 및 코르티솔 중 하나이다. 상이한 생물학적 프로브를 사용함으로써, 본 발명의 생물학적 검출 칩은 상이한 생물학적 표적을 검출하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 생물학적 검출 칩은 인간의 타액이나 혈액에 존재하는 병원균이나 단백질 등 다양한 종류의 시험 샘플을 검출할 수 있다.
일부 실시양태에서, 전기 측정 동안, 검출될 생물학적 표적에 따라 0V 내지 2V(0, 0.03, 0.06... 2V) 또는 1.5V 내지 3V 범위의 전압을 샘플 탱크에 인가한다. 총 63개의 전압값이 있다. 측정 소프트웨어는 각 인가 전압 하에서 센싱 영역에서 반도체 소자로 전달되는 전압값을 기록한다. 이 과정으로 63개의 숫자 값 세트를 생성한 다음 전기 곡선을 생성하기 위해 플로팅한다. 또한, 본원에서 사용된 "칩 신호 값"이라는 용어는 신호를 정량화하는 것을 지칭한다. 이 정량화는 표준 곡선과 샘플 곡선 사이의 면적을 계산하는 데 사용되는 사다리꼴 공식을 통해 계산된다. 계산은 다음과 같이 수행된다:
본 발명이 하기 실시예에 의해 추가로 설명되며, 이는 어떠한 방식으로도 더 이상 제한적인 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 출원 전체에 인용된 모든 참고 문헌(문헌 참조, 발행된 특허, 공개된 특허 출원 및 공동 계류 중인 특허 출원 포함)의 전체 내용은 본 출원에 명시적으로 참조에 의해 통합된다.
실시예
실시예 1 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)의 검출
실시예 1.1 항체 프로브를 이용한 검출
본 실시예에서 생물학적 표적은 PRRSV이다. 본 실시예에서는 APTES-GA 개질 방법을 사용하여 생물학적 검출 칩의 표면을 개질하였고, 생물학적 프로브로는 항체(PRRSV-N 단백질 항체, Cat# orb526689, Biorbyt Ltd., Cambridge, UK)를 사용하였다.
본 실시예에서 시험 샘플은 정제된 PRRSV 바이러스 단백질 및 정제된 PEDV 바이러스 단백질이었다. 단백질 샘플은 인산염 완충 염수(PBS)로 일련적으로 희석한 다음 RIPA(radioimmunoprecipitation assay buffer: 방사면역 침전 분석 버퍼)로 15분 동안 세포 용해하여 제조하였다. 제조된 단백질 샘플을 25 mM 트리스(Tris)-HCl 버퍼로 추가 희석하였다. 희석 후, 시험 샘플 내 바이러스 단백질의 농도는 다음과 같았다: 1 fg/mL PEDV(샘플 1, 음성 대조군), 0.1 fg/mL PRRSV(샘플 2), 100 fg/mL PRRSV(샘플 3), 100 pg/mL PRRSV(샘플 4) 및 100 ng/mL PRRSV(샘플 5). 이들 샘플은 PRRSV에 대한 생물학적 검출 칩의 단백질 검출 효능을 조사하기 위해 제조되었다.
일부 실시양태에서, 생물학적 프로브는 단클론 또는 다클론 항체일 수 있는 항-PRRSV 항체이다. 항-PRRSV 항체의 예는 PRRSV-N 단백질 항체(Cat# orb526689, Biorbyt Ltd.), 재조합 마우스 항-PRRSV ORF7 항체(ICA7)(Cat# EPAF-0626LC, Creative Biolabs Inc., Shirley, NY, USA) 및 PRRSV-GP5 다클론 항체(Cat# BS-4504R, Bioss Antibodies, Wobum, MA,USA)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 실시예의 실험 절차는 다음 단계를 포함한다:
100 μL의 블랭크 샘플(비스-트리스 프로판(Bis-tris propane, BTP))을 샘플 탱크에 첨가하고 실온에서 약 10분 동안 인큐베이션한다;
전기 측정을 수행하여 기준선(표준 곡선)을 설정한다;
100 μL의 시험 샘플을 샘플 탱크에 첨가하고 실온에서 약 30분 동안 인큐베이션한다;
시험 샘플을 제거하고 샘플 탱크를 블랭크 샘플로 세척한다;
블랭크 샘플(BTP)을 샘플 탱크에 다시 첨가하고 실온에서 약 10분 동안 인큐베이션한다;
전기 측정을 수행하여 샘플 측정 결과의 전기 곡선(샘플 곡선)을 얻는다;
추가 분석을 위해 표준 곡선과 샘플 곡선을 비교한다.
실험 결과는 도 7A 및 7B를 참조한다. 도 7A에 도시된 바와 같이, 샘플 2 내지 5(PRRSV 정제된 바이러스 단백질을 포함하는 샘플)의 전기적 곡선은 농도 의존 방식으로 표준 곡선(기준선)에서 크게 벗어났고 따라서 본 발명의 생물학적 검출 칩의 잠재적인 정량적 효과를 나타낸다. 또한, PEDV 샘플(샘플 1, 음성 대조군)의 전기적 곡선은 샘플 2 내지 5의 전기적 곡선에 비해 표준 곡선에 상당히 근접하여 본 발명의 생물학적 검출 칩이 PRRSV에 대해 고도로 특이적임을 나타낸다. 또한, 도 7B에 도시된 바와 같이, 신호 정량화 후, 본 발명의 생물학적 검출 칩은 0.1 fg/mL(샘플 2)의 극히 낮은 농도에서 PRRSV 바이러스 단백질의 존재를 검출한 것으로 나타났고 이는 칩의 고감도를 입증한다.
실시예 1.2 핵산 프로브를 사용한 검출
본 실시예에서 표적은 PRRSV이다. 본 실시예에서는 GPTMS 개질 방법을 사용하여 생물학적 검출 칩의 표면을 개질하였으며, 생물학적 프로브로는 핵산 프로브를 사용하였다. 핵산 프로브는 서열 번호 1 내지 서열 번호 11의 합성 올리고뉴클레오타이드 중 적어도 하나를 포함하였다.
본 실시예에서는 PRRSV를 포함하는 샘플을 사용하였다. 샘플을 VLL 버퍼(LabTurboTM Virus Mini Kit, LVN480-200, LabTurbo Biotech Corporation, Taipei, Taiwan)로 15분간 세포 용해한 후, 25 mM 트리스(Tris)-HCl 버퍼로 0.24 카피/μL의 PRRSV(샘플 6) 및 240 카피/μL의 PRRSV(샘플 7)의 농도로 희석하였다. 본 실시예의 품질 대조군(음성 대조군)은 버퍼 용액만을 함유하였다. 이들 샘플은 PRRSV에 대한 생물학적 검출 칩의 RNA 단편 검출 효능을 조사하기 위해 제조되었다. 실험 절차는 실시예 1.1에 기재된 것과 동일하였다.
실험 결과는 도 7C 및 7D를 참조한다. 도 7C에 도시된 바와 같이, 샘플 6 및 7의 전기적 곡선은 표준 곡선(기준선)에서 약간 농도 의존 방식으로 상당히 벗어나 있으며, 이는 본 발명의 생물학적 검출 칩의 잠재적인 정량적 효과를 나타낸다. 또한, 도 7D에 도시된 바와 같이, 신호 정량화 후, 결과는 본 발명의 생물학적 검출 칩이 시험 샘플에서 적어도 0.24 카피/μL의 농도로 PRRSV RNA의 존재를 검출할 수 있음을 보여준다. 대조적으로, 기존 qPCR에 의해 0.24 카피/μL의 PRRSV RNA 샘플의 양성 신호를 검출하려면 36 이상의 Ct 값이 필요하다. 이러한 결과는 본 발명의 생물학적 검출 칩이 종래의 검출 기술에 비해 고감도를 나타냄을 입증한다.
실시예 2 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)의 검출
본 실시예에서 생물학적 표적은 PEDV이다. 본 실시예에서는 APTES-NHS 개질 방법을 사용하여 생물학적 검출 칩의 표면을 개질하였으며, 생물학적 프로브로는 핵산 프로브를 사용하였다. 핵산 프로브는 서열 번호 12 내지 서열 번호 15의 합성 올리고뉴클레오타이드 중 적어도 하나를 포함한다.
실시예 2.1 상이한 병원체를 함유하는 샘플을 사용한 특이성 시험
본 실시예에서 시험 샘플은 대장균(Escherichia coli(E. coli)), 돼지 콜레라균(Salmonella choleraesuis)(Sal. C), 돼지 델타 코로나바이러스(SDCoV), 전염성 위장염 바이러스(TGEV), 로타바이러스(RV) 및 PEDV를 비롯한 다양한 돼지 병원체를 포함하는 샘플이었다. 이들 샘플을 VLL 용해 버퍼(LabTurboTM Virus Mini Kit, LVN480-200)로 10분 동안 세포 용해시켜 각 샘플의 용해 용액을 얻었다. 그런 다음, 샘플의 농도를 25 mM 트리스(Tris)-HCl 버퍼로 희석하여 조정하였다. 이들 샘플은 PEDV에 대한 생물학적 검출 칩의 검출 특이성을 조사하기 위해 제조되었다.
실험 절차는 본 실시예에서 블랭크 샘플(BTP) 및 시험 샘플에 대한 인큐베이션 시간이 각각 5분 및 15분인 것을 제외하고는 실시예 1.1에 기재된 것과 동일하였다.
시험 결과를 도 8A에 나타내었다. PEDV 샘플이 가장 강한 신호를 나타낸 반면, E. coli, Sal. C, SDCoV, TGEV 및 RV와 같은 다른 용해된 병원체의 신호는 모두 PEDV 샘플보다 현저히 낮았으며, 이는 본 발명의 생물학적 검출 칩이 PEDV에 대한 특이성이 높다는 것을 나타낸다.
실시예 2.2 PEDV가 없는 돼지의 다른 부분으로부터의 샘플을 사용한 시험
본 실시예에서는 본 발명의 생물학적 검출 칩으로 돼지 병원체를 검출하기 위해, PEDV 음성 샘플의 배경 신호 값을 결정하고, 낮은 배경 신호를 갖는 적합한 샘플 유형을 추가 결정하기 위해, PEDV가 없는 돼지의 다른 부위에서 수집된 샘플을 시험하였다. 본 실시예에서 사용된 PEDV-음성 샘플은 직장 면봉 샘플(RI), 회장 내용물 샘플(CI), 대변 샘플(FC) 및 소장 점막 에멀젼 샘플(SI)을 포함하였다. 용해된 PEDV 용액을 양성 대조군으로 사용하였다. 실험을 6회 반복하였다(n=6). 실험 절차는 실시예 2.1에 기술된 것과 동일하였다.
시험 결과를 도 8B에 나타내었다. RI 샘플, CI 샘플, FC 샘플 및 SI 샘플의 신호 값은 모두 용해된 PEDV 용액 샘플(PEDV)보다 현저히 낮았으며, 이는 본 발명의 생물학적 검출 칩이 배경 신호의 간섭 없이 다양한 유형의 샘플을 정확하게 검출할 수 있음을 제시한다.
실시예 2.3 감도 테스트
본 실시예에서는 본 발명의 생물학적 검출 칩의 감도 시험을 위해 상이한 RNA 농도를 갖는 PEDV 샘플을 사용하였다. PEDV 원액의 RNA 농도를 qPCR로 정량한 다음 일련의 희석을 실시하였다. 시험 샘플은 품질 대조군(음성 대조군, 버퍼만), 1.5x102 카피/μL PEDV(샘플 1), 1.5x105 카피/μL PEDV(샘플 2) 및 1.5x108 카피/μL PEDV(샘플 3)를 포함하였다. 각 샘플을 생물학적 검출 칩에 의해 시험하였다. 실험 절차는 실시예 2.1에 기술된 것과 동일하다.
시험 결과를 도 8C에 나타내었다. 본 실시예에 사용된 생물학적 검출 칩은 최소 1.5x102 카피/μL PEDV(샘플 1) 농도에서 신호를 검출할 수 있고 따라서 칩의 고감도를 입증한다. 또한, 신호 값이 농도 의존 방식으로 증가(즉, 샘플 3 > 샘플 2 > 샘플 1)하였으며, 이는 본 발명의 생물학적 검출 칩의 잠재적인 정량적 효과를 나타낸다.
실시예 3 코르티솔의 검출
본 실시예에서 생물학적 표적은 코르티솔이다. 본 실시예에서는 APTES-비오틴 개질 방법을 사용하여 생물학적 검출 칩의 표면을 개질하였으며, 생물학적 프로브로는 코르티솔 특이 항체(항-코르티솔 항체 [F4P1A3], Abcam, Cambridge, UK)를 사용하였다.
시험 샘플은 품질 대조군(음성 대조군, 버퍼만), 0.1 μg/dL 코르티솔(샘플 1) 및 6 μg/dL 코르티솔(샘플 2)을 포함하였다. 이들 시험 샘플은 코르티솔에 대한 생물학적 검출 칩의 검출 효능을 조사하기 위해 제조되었다. 실험 절차는 본 실시예에서 시험 샘플의 배양 시간이 15분인 것을 제외하고는 실시예 1.1에 설명된 것과 동일하다.
실험 결과는 도 9A 및 9B를 참조한다. 도 9A에 도시된 바와 같이, 코르티솔을 함유하는 샘플(샘플 1 및 샘플 2)의 전기적 곡선은 농도 의존 방식으로 표준 곡선(기준선)으로부터 상당히 벗어나 있으며, 이는 본 발명의 생물학적 검출 칩의 잠재적인 정량적 효과를 나타낸다. 또한, 도 9B에 도시된 바와 같이, 신호 정량화 후, 결과는 본 발명의 생물학적 검출 칩이 시험 샘플(샘플 1)에서 적어도 0.1 μg/dL의 농도로 코르티솔의 존재를 검출하였고 이는 칩의 고감도를 입증한다.
결론적으로, 실시예들의 결과에 기초하여, 본 발명의 생물학적 검출 칩은 PRRSV, PEDV 및 코르티솔을 검출하는데 유효성을 입증하였다. 기존의 검출 공정과 비교하여, 본 발명의 생물학적 검출 칩은 고도의 특이성, 고감도, 높은 정확도, 공정 단순성, 조작 용이성, 신속한 검출 및 잠재적인 정량적 효과를 나타낸다. 본 발명의 생물학적 검출 칩은 생물학적 현상을 효과적으로 분석하고, 생리 활성 및 질병 과정을 탐색하고, 치료 및/또는 개선 방법을 추가로 개발하는 데 사용될 수 있다. 이는 생명 과학, 임상 진단 및 식품 안전 분야에서 광범위한 응용 전망을 가진다.
물론, 본 발명의 전술한 실시양태에서 많은 변경 및 수정이 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않고 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명은 과학 및 유용한 기술의 진보를 촉진하기 위해 개시되며, 이어지는 청구범위의 영역에 의해서만 제한되도록 의도된다.
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Claims (10)

  1. 복수의 행(row)과 복수의 열(column)을 갖는 어레이에 배치된 복수의 트랜지스터를 포함하는 생물학적 검출 칩으로서, 상기 복수의 트랜지스터 각각은 복수의 행 중 하나와 복수의 행 중 하나 내에 배치되고, 상기 복수의 트랜지스터 각각은
    공유 소스(shared source), 공유 드레인(shared drain), 및 상기 공유 소스와 상기 공유 드레인 사이에 배치된 채널 영역(channel area)을 포함하는 기판층(substrate layer);
    상기 채널 영역 상에 배치되고 폴리실리콘 산화물 층을 포함하는 플로팅 게이트(floating gate);
    상기 플로팅 게이트 상에 배치된 연장 금속 커넥터(extending metal connector);
    상기 연장 금속 커넥터 상에 배치되고 상기 연장 금속 커넥터를 통해 상기 플로팅 게이트에 전기적으로 연결되는 연장 게이트(extending gate); 및
    상기 연장 게이트 상에 배치되고 고정화 영역 및 상기 고정화 영역에 고정된 적어도 하나의 생물학적 프로브를 포함하는 생물학적 검출 층을 포함하며;
    상기 복수의 생물학적 검출 층은 상기 생물학적 검출 칩의 표면 상에 병렬로 복수의 생물학적 검출 영역을 형성하고;
    상기 복수의 열의 동일한 열에 배치된 복수의 트랜지스터는 병렬로 연결되며;
    상기 복수의 열 중 동일한 열에 배치된 인접한 두 트랜지스터의 플로팅 게이트는 상기 인접한 두 트랜지스터 사이의 공유 소스 또는 공유 드레인에 대해 거의 동일한 거리를 가지거나, 상기 복수의 열 중 동일한 열에 배치된 인접한 두 트랜지스터의 플로팅 게이트는 상기 인접한 두 트랜지스터 사이의 공유 소스 또는 공유 드레인과 겹치는 거리가 거의 동일한,
    생물학적 검출 칩.
  2. 제1항에 있어서, 고정화 영역은 연장 게이트의 표면 상에 표면 개질 공정을 통해 생성되며, 상기 표면 개질 공정은 3-아미노프로필트리메톡시실란-글루타르알데히드(APTES-GA) 개질 방법, 3-아미노프로필트리메톡시실란-N-하이드록시숙신이미드(APTES-NHS) 개질 방법, 3-아미노프로필트리메톡시실란-비오틴(APTES-비오틴) 개질 방법 및 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(GPTMS) 개질 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 생물학적 검출 칩.
  3. 제1항에 있어서, 고정화 영역은 및 로 이루어진 군으로부터 선택되는 복수의 화학 구조를 포함하는, 생물학적 검출 칩.
  4. 제1항에 있어서, 생물학적 검출 칩은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)를 검출하기 위한 것이고, 생물학적 프로브는 서열 번호 1 내지 서열 번호 11의 합성 올리고뉴클레오타이드 중 적어도 하나를 포함하는, 생물학적 검출 칩.
  5. 제1항에 있어서, 생물학적 검출 칩은 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)를 검출하기 위한 것이고, 생물학적 프로브는 서열 번호 12 내지 서열 번호 15의 합성 올리고뉴클레오타이드 중 적어도 하나를 포함하는, 생물학적 검출 칩.
  6. 제1항에 있어서, 생물학적 검출 칩은 코르티솔을 검출하기 위한 것이고, 생물학적 프로브는 항-코르티솔 항체인, 생물학적 검출 칩.
  7. 생물학적 표적을 검출하는 방법으로서,
    제1항의 생물학적 검출 칩을 제공하는 단계;
    병렬로 연결된 복수의 생물학적 검출 영역에 블랭크 샘플(blank sample)을 배치하고, 복수의 트랜지스터의 게이트 전압 및 드레인 전류를 측정하여 표준선을 설정하는 단계;
    시험 샘플을 상기 복수의 생물학적 검출 영역에 예정된 시간 동안 배치하는 단계;
    상기 블랭크 샘플에 의해 상기 복수의 생물학적 검출 영역을 세척하는 단계;
    상기 복수의 트랜지스터의 게이트 전압 및 드레인 전류를 측정하여 측정선을 설정하는 단계; 및
    상기 측정선을 상기 표준선과 비교하여 상기 시험 샘플이 생물학적 표적을 포함하고 있는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 생물학적 표적은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)이고, 생물학적 프로브는 서열 번호 1 내지 서열 번호 11의 합성 올리고뉴클레오타이드 중 적어도 하나를 포함하는, 생물학적 검출 방법.
  9. 제7항에 있어서, 생물학적 표적은 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)이고, 생물학적 프로브는 서열 번호 12 내지 서열 번호 15의 합성 올리고뉴클레오타이드 중 적어도 하나를 포함포함하는, 생물학적 검출 방법.
  10. 제7항에 있어서, 생물학적 표적은 코르티솔이고, 생물학적 프로브는 항-코르티솔 항체인, 생물학적 검출 방법.
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