TW202405419A - 生物檢測晶片及其應用 - Google Patents

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高熹騰
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Abstract

本發明涉及一種生物檢測晶片及其應用，該生物檢測晶片包含並聯的複數個電晶體，每一個該複數個電晶體個別包含基底層、空接閘極、金屬連接通道、延伸閘極及生物檢測層，該生物檢測晶片經表面修飾製程後結合生物探針，以對待測樣品進行生物檢測，其包含檢測豬生殖與呼吸綜合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、豬流行性下痢病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)或皮質醇(Cortisol)。

Description

生物檢測晶片及其應用
本發明係關於生物檢測晶片及其應用，特別是關於具有複數個並聯的電晶體的生物檢測晶片以及使用該生物檢測晶片的檢測方法。
生物檢測技術經常透過檢測生物分子的特定交互作用來實現待測樣品的分析，如抗原-抗體結合、核酸雜交等，透過鍵結後產生物理性或化學性變化，再偵測其變化以判斷待測樣品中是否具有欲檢測之標的。然而，傳統常見的生物檢測法，如免疫蛋白測試與反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse transcription-PCR，RT-PCR)等，難以在實驗室外操作，流程繁瑣並費時，且需要專門的儀器設備及操作人員。例如：傳統的豬相關病毒檢測流程必須等採樣後，將樣品從養豬場送到實驗室後進行檢測，在東南亞等檢測設施較稀少的地區，等待結果的時間可能超過一週，具有延誤疫情控制等風險。
綜觀前所述，傳統檢測法有著靈敏度低、檢測時間長、操作複雜等缺點，習知的生物檢測方式仍具有改進空間。
基於前述內容，本發明提供一種生物檢測晶片，其包含排列為一陣列的複數個電晶體，該陣列包含複數個列(row)以及複數個行(column)，每一個該複數個電晶體係設置於該複數個列之一以及該複數個行之一，每一個該複數個電晶體個別包含： 一基底層，包含一共用源極、一共用汲極及設置於該共用源極與該共用汲極之間的一通道區； 一空接閘極，設置於該通道區，該空接閘極包含一多晶矽氧化層； 一金屬連接通道，設置於該空接閘極上； 一延伸閘極，設置於該金屬連接通道上，該延伸閘極係透過該金屬連接通道電性連接該空接閘極；以及 一生物檢測層，設置於該延伸閘極上，該生物檢測層上包含一固定區及至少一生物探針，該生物探針固定於該固定區上。
其中，在該陣列中，位於同一列(row)之該複數個電晶體係並聯連接，位於同一行(column)之該複數個電晶體中，相鄰兩電晶體之各該空接閘極，係分別以近似之距離靠近該兩電晶體之間之該共用源極或該共用汲極，或分別覆蓋該兩電晶體之間之該共用源極或該共用汲極之至少一部分。
其中，該複數個電晶體的該生物檢測層於一生物檢測晶片表面上形成並聯的複數個生物檢測區。
其中，該複數個生物檢測區包含一微流道或一樣品槽。
於某些具體實施例中，該固定區係於該延伸閘極表面上經由表面修飾製程所得，其中該表面修飾製程係選自於由3-氨基丙基三乙氧基矽烷-戊二醛(3-aminopropyltriethoxysilane-Glutaraldehyde，APTES-GA)改質法、3-氨基丙基三乙氧基矽烷- N-羥基琥珀醯亞胺(3-aminopropyltriethoxysilane- N-hydroxysuccinimide，APTES-NHS)改質法、3-氨基丙基三乙氧基矽烷-生物素(3-aminopropyltriethoxysilane- Biotin，APTES-Biotin)改質法以及3-環氧丙醇三甲氧基矽烷(3-glycidoxypropyltrimethoxysilane，GPTMS)改質法所組成的群組。
於某些具體實施例中，其中該固定區包含複數個選自於由 、 及 所組成的群組。
於某些具體實施例中，其中該生物探針包含去氧核糖核酸、核糖核酸、抗體或適體，其中，該生物探針經由生物接枝固定於該固定區上。
於某些具體實施例中，該生物檢測晶片係用於檢測豬生殖與呼吸綜合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，其中該生物探針包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 11中之至少一種所示之核苷酸序列。
於某些具體實施例中，該生物檢測晶片係用於檢測豬流行性下痢病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)，其中該生物探針包含如SEQ ID NO: 12至SEQ ID NO: 15中之至少一種所示之核苷酸序列。
於某些具體實施例中，該生物檢測晶片係用於檢測皮質醇(Cortisol)，其中該生物探針係為抗皮質醇之抗體。
於一方面，本發明另提供一種生物檢測方法，係利用本發明所述生物檢測晶片對一待測樣品進行生物檢測，該生物檢測方法包含：提供一如本發明所述的生物檢測晶片；將一空白樣品置於並聯的該複數個生物檢測區，量測該複數個電晶體的一閘極電壓及一汲極電流以建立一標準線；將一待測樣品置於該複數個生物檢測區，放置一預定時間；以該空白樣品沖洗該複數個生物檢測區；量測該複數個電晶體的該閘極電壓及該汲極電流以建立一量測線，將該量測線與該標準線比較以判斷該待測樣品是否包含一欲檢測標的。
於某些具體實施例中，該欲檢測標的係為豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)、豬流行性下痢病毒(PEDV)或皮質醇(Cortisol)。
於某些具體實施例中，該欲檢測標的係為豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)，其檢測方法係利用本發明所述生物檢測晶片對一待測樣品進行PRRSV檢測；其中，該生物探針包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 11中之至少一種所示之核苷酸序列 ；其中，該生物探針亦可為抗豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)之抗體。
於某些具體實施例中，該欲檢測標的係為豬流行性下痢病毒(PEDV)，其檢測方法係利用本發明所述生物檢測晶片對一待測樣品進行PEDV檢測；其中，該生物探針包含如SEQ ID NO: 12至SEQ ID NO: 15中之至少一種所示之核苷酸序列；其中，該生物探針亦可為抗豬流行性下痢病毒(PEDV)之抗體。
於某些具體實施例中，該欲檢測標的係為皮質醇(Cortisol)，其檢測方法係利用本發明所述生物檢測晶片對一待測樣品進行皮質醇檢測；其中，該生物探針係為抗皮質醇之抗體。
本發明所提供之生物檢測晶片及其用途具有靈敏度高、檢測快速、操作簡便及準確性佳等優勢。其中，生物檢測層結合電晶體結構來偵測生物種類及數量，提高生物檢測的靈敏度與便利性，通過訊號分析縮短檢測時間；另外，其透過延伸閘極避免元件暴露於外在環境，增加生物檢測晶片的穩定性，提高使用壽命；再者，其能透過置換不同生物探針來檢測不同欲檢測標的，增加生物檢測晶片能檢測的標的多樣性，有利於增進產業上之實施利用。
有鑑於傳統檢測技術上之缺失，本發明將生物晶片導入檢測技術中，以優化生物檢測技術，生物晶片透過辨識元件與待測物相互作用產生能量上的變化，並將該能量變化轉化成訊號以進行後續偵測及分析，其具有檢測快速、操作方便及高靈敏度等效果。
應當理解的是，前述一般描述和下面的詳細描述都是示例性和說明性的，但並非用以限制本發明所請之權利。本發明的一個或多個實施例的某些細節闡述於以下說明中。從以下代表性實施例的非窮舉的列表中，亦從所附的權利要求中，本發明的其它特徵或優點將是顯而易見的。
除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域中的技術人員所通常理解相同的含義。
應注意的是，如本文中所使用，單數形式術語「一個」、「一種」及「該」除非明確地限於一個指示物，否則包括複數個指示物。除非上下文另外明確指出，否則術語「或」與術語「和/或」可互換使用。
本文所使用的「約」、「大約」或「近似」一詞實質上代表所述之數值或範圍位於20%以內，較佳為於10%以內，以及更佳者為於5%以內。於本文所提供之數字化的量為近似值，意旨若術語「約」、「大約」或「近似」沒有被使用時亦可被推得。
本文所使用的「近似之距離」係指兩個距離相等，或第二個距離約等於第一個距離，亦即第二個距離為第一個距離的正負10%以內。例如，第一距離為1公分，則與第一距離近似之第二距離為1公分或0.9至1.1公分。
如本文中所使用，詞彙「包含」是開放式的，表示此類實施例可包含額外的元素。反之，詞彙「由…組成」是封閉式的，表示此類實施例不包含額外的元素（痕量雜質除外）。詞彙「基本上由…組成」是部分封閉式的，表示此類實施例還可包含非實質改變此類實施例的基本特徵之元素。
如本文所用，術語「APTES-GA改質法」係指先經過3-氨基丙基三乙氧基矽烷(APTES)進行處理，再經過戊二醛(GA)處理的表面修飾製程；詳細APTES-GA改質法請參閱本案說明書內容。
如本文所用，術語「APTES-NHS改質法」係指先經過3-氨基丙基三乙氧基矽烷(APTES)進行晶片表面改質，再經過N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)處理生物探針，以進行後續生物接枝的表面修飾製程；詳細APTES-NHS改質法請參閱本案說明書內容。
如本文所用，術語「APTES-Biotin改質法」係指先經過3-氨基丙基三乙氧基矽烷(APTES)進行晶片表面改質，再經過生物素(Biotin)處理生物探針，以進行後續生物接枝的表面修飾製程；詳細APTES-Biotin改質法請參閱本案說明書內容。
如本文所用，術語「GPTMS改質法」係指經過3-環氧丙醇三甲氧基矽烷(GPTMS)進行處理的表面修飾製程；詳細GPTMS改質法請參閱本案說明書內容。
除非本文另有定義，否則用以與本文結合的科學與技術術語應具有本領域普通技術人員通常理解的含義。此外，除非上下文另有要求，單數術語應包括複數，並且複數術語應包括單數。本發明的方法與技術一般可根據本領域已知的常規方法進行。一般而言，本文所描述之用以連結以下技術的命名法，以及生物化學、酵素學、分子及細胞生物學、微生物學、遺傳學與蛋白質及核酸化學及雜合反應的技術皆為本領域已知且經常使用者。除非另有說明，本發明的方法與技術一般可根據本領域已知的常規方法進行，且被描述於在本說明書中被引用且討論的各種一般及更具體的參考文獻中。
為利貴審查委員瞭解本發明之技術特徵、內容與優點及其所能達成之功效，茲將本發明配合附圖，並以實施例之表達形式詳細說明如下，而其中所使用之圖式，其主旨僅為示意及輔助說明書之用，未必為本發明實施後之真實比例與精準配置，故不應就所附之圖式的比例與配置關係解讀、侷限本發明於實際實施上的權利範圍，合先敘明。
A. 生物檢測晶片之結構
圖1係為本發明實施例之生物檢測晶片示意圖，如圖所示，生物檢測晶片1的電晶體可排列為陣列的形式，且位於同一列之複數個電晶體可並聯連接，包含並聯的n個電晶體T1~Tn，電晶體並聯數量可視生物檢測晶片1的需求而定。這些並聯的電晶體T1~Tn結構包含上層UL及下層LL的結構，在下層LL部分，以電晶體T1為例，基底層10的結構包含共用源極S與共用汲極D，兩者之間具有通道區，空接閘極FG設置在共用源極S與共用汲極D之間的通道區，空接閘極FG下設置多晶矽氧化層PL，空接閘極FG的X方框位置上設置金屬連接通道MT，金屬連接通道MT延伸至上層UL，如圖1中X’方框對應的位置，金屬連接通道MT上設置延伸閘極EG，通過金屬連接通道MT，使得上層UL的延伸閘極EG電性連接至下層LL的空接閘極FG。
另外，電晶體T1之空接閘極FG與同一行下方相鄰電晶體T1’之空接閘極FG，係可分別以近似之距離靠近同一個共用汲極D，上述同一行下方相鄰電晶體T1’之空接閘極FG和同一行再下方的相鄰電晶體T1’’之空接閘極FG，係可分別以近似之距離靠近同一個共用源極S。
在本實施例中，延伸閘極EG為金屬片狀電極，其通過金屬連接通道MT連接至覆蓋的多晶矽氧化層PL，進而使得上層UL的延伸閘極EG可電性連接於空接閘極FG，在其他實施例中，延伸閘極EG也可為其他形狀的金屬電極，例如為螺旋狀的電極。另一方面，並聯的n個電晶體T1~Tn，也可設置多列而形成複數個檢測列結構，在各個檢測列之間，相鄰的檢測列可以共用相鄰的共用源極S或共用汲極D。當進行電晶體T1~Tn的量測時，由於這些電晶體T1~Tn為並聯設置，共用源極S可連接至接地端，而共用汲極D連接至電流量測端，通過施加於延伸閘極EG的電壓，量測汲極電流總和，以此來做為檢測數據進行生物檢測判斷。
為進行生物檢測，在這些電晶體T1~Tn的延伸閘極EG上會設置生物檢測層BL，生物檢測層BL能結合特定的檢測標的，使得電晶體的電性改變，通過量測電流來判斷是否具有對應的檢測標的。生物檢測層BL的設置請參閱圖2A或圖2B，其分別為圖1中沿著虛線AA’的剖面示意圖的兩種具體實施例。生物檢測晶片1包含複數個檢測列，複數個檢測列的電晶體均包含上層UL及下層LL的結構，而在上層UL的結構上還包含了生物檢測層BL的結構。
如圖2A與圖2B所示，以電晶體Tn為例，其包含了共用源極S與共用汲極D，兩者之間的通道區設置空接閘極FG，空接閘極FG通過金屬連接通道MT電性連接延伸閘極EG。如圖2A所示，於一具體實施例中，電晶體Tn之空接閘極FG與同一行相鄰電晶體Tn’之空接閘極FG係可分別與同一個共用汲極D之至少一部分重疊，上述同一行相鄰電晶體Tn’之空接閘極FG和再一個與其同一行相鄰電晶體Tn’’之空接閘極FG係可分別與同一個共用源極S之至少一部分重疊。如圖2B所示，於另一具體實施例中，電晶體Tn之空接閘極FG與同一行相鄰電晶體Tn’之空接閘極FG，係以近似之距離靠近同一個共用汲極D，該同一行相鄰電晶體Tn’之空接閘極FG和再一個與其同一行相鄰電晶體Tn’’之空接閘極FG，亦以近似之距離靠近同一個共用源極S。
生物檢測層BL設置於延伸閘極EG上，其中，延伸閘極EG表面上經由表面修飾製程產生一固定區11，固定區11係用於將複數個生物探針BP固定，以利後續生物檢測進行。
生物探針BP可為去氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、抗體或適體(aptamer)等生物分子，其經由生物接枝固定於該固定區11上。當進行生物檢測時，藉由這些生物探針BP與待檢測物BT結合所產生的電荷，影響電晶體Tn檢測的汲極電流訊號，進而確認待檢測物BT是否符合對應生物探針BP所欲檢測的檢測標的或數量。
生物檢測晶片1可由多個並聯的電晶體形成檢測列，再由複數個檢測列形成檢測陣列，使得生物檢測晶片1的生物檢測晶片表面上形成複數個生物檢測區。為了使得這些生物檢測區能容納包含生物的待測溶液，生物檢測層BL可設置包含容納區域的樣品槽TA，使得包含待測物BT的待測溶液能夠容納於生物檢測區BA當中，並且讓待測溶液能覆蓋生物檢測晶片1的延伸閘極表面EGS，使其中的待測物OB能與生物檢測層BL的生物探針BP接觸及結合。在本實施例中，容置空間為樣品槽TA的形式，但本發明不侷限於此，在其他實施例中，生物檢測區也可利用微流道的結構來形成容置及檢測的空間。
綜上所述，如圖1、圖2A及2B所示，本發明提供一種生物檢測晶片1，其包含排列為一陣列的複數個電晶體，該陣列包含複數個列(row)以及複數個行(column)，每一個該複數個電晶體係設置於該複數個列之一以及該複數個行之一，每一個該複數個電晶體Tn個別包含： 一基底層10，包含一共用源極S、一共用汲極D及設置於該共用源極S與該共用汲極D之間的一通道區103； 一空接閘極FG，設置於該通道區103，該空接閘極FG包含一多晶矽氧化層PL； 一金屬連接通道MT，設置於該空接閘極FG上； 一延伸閘極EG，設置於該金屬連接通道MT上，該延伸閘極EG係透過該金屬連接通道MT電性連接該空接閘極FG；以及 一生物檢測層BL，設置於該延伸閘極EG上，該生物檢測層BL上包含一固定區11及至少一生物探針BP，該生物探針BP固定於該固定區11上。
其中，在該陣列中，位於同一列之該複數個電晶體T1~Tn係並聯連接，位於同一行之該複數個電晶體(Tn, Tn’, Tn’’…)中，相鄰兩電晶體(如，Tn與Tn’)之各該空接閘極FG，係分別以近似之距離靠近該兩電晶體之間之該共用源極S或該共用汲極D，或分別覆蓋該兩電晶體之間之該共用源極S或該共用汲極D之至少一部分。
其中，該複數個電晶體(Tn, Tn’, Tn’’…)的該生物檢測層BL於一生物檢測晶片1表面上形成複數個生物檢測區BA。
在本實施例中，延伸閘極EG表面上經由表面修飾製程產生一固定區11，其中，該固定區包含複數個選自於由 、 及 所組成的群組。
B. 表面修飾製程
在本實施例中，所述表面修飾製程係選自於由APTES-GA改質法、APTES-NHS改質法、APTES-Biotin改質法以及GPTMS改質法所組成的群組。以下將配合圖示闡釋上述各表面修飾製程。
請參閱圖3A至圖4，生物檢測晶片1的製程首先於基底層10上形成源極區101、汲極區102、通道區103，並於通道區103上形成空接閘極FG，空接閘極FG下方包含多晶矽氧化層PL，設置在該空接閘極FG上的金屬連接通道MT進一步連接至延伸閘極EG。
請參閱圖3A，圖3A係為本發明實施例之APTES-GA改質法之示意圖，其中，APTES-GA改質法具體內容包含：將封裝後的晶片浸在丙酮中並以超音波震盪處理，再浸於95%乙醇中並以超音波震盪處理，接著以90-120 C烘烤，用以清洗該延伸閘極的表面；施以氧電漿進行表面改質，使該表面帶有羥基；將該生物檢測晶片浸泡於3-氨基丙基三乙氧基矽烷(APTES)酒精溶液中處理約30分鐘後，以超音波震盪清洗，經90-120 C烘烤脫醇，使得該表面修飾上胺基；將該生物檢測晶片浸泡於戊二醛(GA)溶液中反應約30分鐘，使得該表面修飾上醛基；後續將具有氨基的複數個生物探針BP經生物接枝結合於固定區11之醛基，使該複數個生物探針BP固定於該固定區11；再以牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)等填塞劑(blocking agent)進行填塞(Blocking)及沖洗後，經氮氣噴乾，裝上模具進行真空保存或後續檢測。
經上述APTES-GA改質法進行表面修飾後，該固定區包含複數個如下所示之化學結構： 。
請參閱圖3B，圖3B係為本發明實施例之APTES-NHS改質法之示意圖，其中，APTES-NHS改質法具體內容包含：將封裝後的晶片浸在丙酮中並以超音波震盪處理，再浸於95%乙醇中並以超音波震盪處理，接著以90-120 C烘烤，用以清洗該延伸閘極的表面；施以氧電漿進行表面改質，使該表面帶有羥基；將該生物檢測晶片浸泡於3-氨基丙基三乙氧基矽烷(APTES)酒精溶液中處理約30分鐘後，以超音波震盪清洗，經90-120 C烘烤脫醇，使得該表面修飾上胺基；將帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)的生物探針進行生物接枝反應約30分鐘，使該複數個生物探針BP固定於該固定區11，經超純水沖洗後，以氮氣噴乾；再以牛血清白蛋白(BSA) 等填塞劑進行填塞及沖洗後，以氮氣噴乾，裝上模具進行真空保存或後續檢測。
經上述APTES-NHS改質法進行表面修飾後，該固定區包含複數個如下所示之化學結構： 。
請參閱圖3C，圖3C係為本發明實施例之APTES-Biotin改質法之示意圖，其中，APTES-Biotin改質法具體內容包含：將封裝後的晶片浸在丙酮中並以超音波震盪處理，再浸在95%乙醇中並以超音波震盪處理，接著以90-120 C烘烤，用以清洗該延伸閘極的表面；施以氧電漿進行表面改質，使該表面帶有羥基；將該生物檢測晶片浸泡於3-氨基丙基三乙氧基矽烷(APTES)酒精溶液中處理約30分鐘後，以超音波震盪清洗，經90-120 C烘烤脫醇，使得該表面修飾上胺基；將帶有生物素(Biotin)的生物探針進行生物接枝反應約30分鐘，使該複數個生物探針BP固定於該固定區11，經超純水沖洗後，再以氮氣噴乾；再以牛血清白蛋白(BSA) 等填塞劑進行填塞及沖洗後，以氮氣噴乾，裝上模具進行真空保存或後續檢測。
經上述APTES-Biotin改質法進行表面修飾後，該固定區包含複數個如下所示之化學結構： 。
在某些具體實施例中，亦可將3-氨基丙基三乙氧基矽烷(APTES)替換為環氧樹脂(Epoxy)溶液，以將晶圓修飾上活性層。
請參閱圖4，圖4係為本發明實施例之GPTMS改質法之示意圖，其中，GPTMS改質法具體內容包含：清洗延伸閘極表面EGS，再施以氧電漿進行晶片表面改質，使延伸閘極表面EGS帶有羥基(-OH)；將生物檢測晶片浸泡於無水乙醇配置的3-環氧丙醇三甲氧基矽烷(GPTMS)中，再浸於無水乙醇中進行超音波震盪清洗，清洗後以90-120 C進行烘烤；後續以帶有氨基(-NH 2)的生物探針BP進行生物接枝反應，使該複數個生物探針BP固定於該固定區11，經超純水沖洗後，以氮氣噴乾；再以牛血清白蛋白(BSA) 等填塞劑進行填塞及沖洗後，以氮氣噴乾，即可進行真空保存或後續檢測。
經上述GPTMS改質法進行表面修飾後，該固定區包含複數個如下所示之化學結構： 。
C. 生物檢測方法
請參閱圖5本發明一實施例之生物檢測方法之流程圖，並配合參閱圖2A或2B。在本實施例中，生物檢測晶片1可包含前述的複數個並聯電晶體T1~Tn所形成的檢測列或多個檢測列，通過生物檢測晶片1對一待測樣品進行生物檢測，其檢測方法包含以下步驟(S1~S5)：
步驟S1：提供一如本發明所述的生物檢測晶片1。選定一欲檢測標的，將該欲檢測標的之對應生物探針BP固定於固定區11上，其中，透過更換本發明所述之生物檢測晶片中的生物探針，即可達到檢測不同欲檢測標的之功能。
步驟S2：將空白樣品置於複數個生物檢測區BA，量測複數個電晶體的閘極電壓及汲極電流以建立標準線。請參閱圖6，圖6係為本發明實施例之生物檢測方法之電路示意圖。如圖6所示，生物檢測晶片包含並聯的電晶體nmos所形成的檢測列，其共用源極S可連接至接地端，共用汲極D則連接至電流測量器M，閘極則延伸至延伸閘極EG。當空白樣品，如中性緩衝液置於生物檢測區後，覆蓋延伸閘極EG上的生物檢測層BL，此時通過對延伸閘極EG施加不同閘極電壓，例如提供由0V至2V的電壓，由電流測量器M量測共用汲極D的輸出電流I1~In，由於電晶體nmos是並聯方式，輸出電流I1~In的總和可經由電壓轉換器ADC轉換成數位訊號，由輸出端OUTPUT輸出汲極電流資訊，建立量測的標準線。
在本實施例中，生物檢測方法所適用的生物檢測晶片還包含放大器OP，放大器OP的輸入端分別連接參考電壓VREF及並聯的共用汲極D，輸出端耦接於電晶體nmos的控制端，電晶體nmos則耦接於電流測量器M。在其他實施例中，共用源極S與共用汲極D也可以接點外接至電壓源及訊號收集裝置，通過外部裝置收集汲極電流資訊。
步驟S3：將待測樣品置於複數個生物檢測區BA，放置預定時間。將包含待測樣品的溶液注入生物檢測區BA，例如置於樣品槽當中，靜置一段時間使得待測樣品能與生物檢測層BL的生物探針BP結合。待測樣品的放置時間可依據欲檢測的標的有所差異。
步驟S4：以空白樣品沖洗複數個生物檢測區BA。為使待測樣品能與生物探針BP更有效的結合，可在放置預定時間後，沖洗生物檢測區BA，重新再放置待測溶液，經過多次的沖洗及置放，確保待測樣品結合的數量。在本實施例中，並不限定沖洗的次數，其可依據待測樣品濃度及生物探針BP結合特性加以調整。
步驟S5：量測複數個電晶體的閘極電壓及汲極電流以建立量測線，將量測線與標準線比較以判斷待測樣品是否包含欲檢測標的。當完成上述沖洗及置放結合的程序後，再次通過對延伸閘極EG施加不同閘極電壓，由電流測量器M量測共用汲極D的輸出電流I1~In，將輸出電流I1~In的總和經由電壓轉換器ADC轉換成數位訊號，由輸出端OUTPUT輸出汲極電流資訊，建立待測樣品的量測線。比較量測線與標準線的差異，通過差異的變化量判斷待測樣品是否包含欲檢測標的。若是量測線並無明顯偏移，則表示待測溶液中不包含欲檢測標的，也就是生物探針BP並未與待測樣品結合，並不會影響晶片閘極的電荷。相對地，若是偏移量超過預定範圍，則判斷待測樣品中包含欲檢測標的。
在某些具體實施例中，欲檢測標的係為豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)、豬流行性下痢病毒(PEDV)或皮質醇(Cortisol)。然而，本發明所述生物檢測晶片1僅需更換不同的生物探針BP，即能將晶片應用在不同的檢測標的上；且本發明所述生物檢測晶片1亦能檢測許多類型的待測樣品，例：人類唾液、血液中的細菌與蛋白質等樣品。
本發明進一步透過以下的實施例闡釋，其不應以任何方式被解釋為進一步的限縮。本申請案中引用的所有引用文件(包括參考文獻、核准的專利、公開的專利申請，以及一同在申請中的專利申請案)的整體內容，在此透過引用的方式明確地併入本案中。
在某些具體實施例中，於電性量測時，會從樣品槽給予一個0V-2V的電壓(0, 0.03, 0.06…2V)或1.5V-3V的電壓，依不同欲檢測標的而定，共計63個電壓值，量測軟體會紀錄每個電壓下，感應區傳遞到半導體元件的電壓值，並給出63組數值，依照數值做圖以產生電性曲線圖。另外，於圖式中所使用的述語「晶片訊號值」係將訊號進行量化，該量化係透過梯行公式計算，該梯行公式計算係用來計算標準曲線與樣品曲線之間的面積值，計算方式如下所示: |((Target2+Target1)*1/2)-((Baseline2+Baseline1)*1/2))| +|((Target3+Target2)*1/2)-((Baseline3+Baseline2)*1/2))| + …+|((Target63+Target62)*1/2)-((Baseline63+Baseline62)*1/2))|。
實施例 1 豬生殖與呼吸綜合症病毒 ( PRRSV) 檢測
實施例 1.1 抗體探針檢測
在本實施例中，欲檢測標的係為豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV) ；其中，本實施例之生物檢測晶片經APTES-GA改質法進行表面修飾。
在本實施例之一實驗中，使用抗體(PRRSV-N Protein antibody，Biorbyt公司，英國，產品編號：orb526689)作為生物探針；本實施例所使用之待測樣品為PRRSV純化病毒蛋白質樣品及PEDV純化病毒蛋白質樣品，其中，蛋白質樣品製備以磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate buffered saline，PBS)進行序列稀釋後，以放射免疫沉澱法緩衝液(Radioimmunoprecipitation assay buffer，RIPA)進行細胞裂解(lysis)，反應時間15分鐘，置備完的蛋白質樣品進一步以25 mM Tris-HCl 緩衝液稀釋，稀釋完成後，待測樣品之病毒蛋白質濃度分別為1 fg/mL PEDV (樣品1，作為負對照組(negative control))、0.1 fg/mL PRRSV (樣品2)、100 fg/mL PRRSV (樣品3)、100 pg/mL PRRSV (樣品4)，以及100 ng/mL PRRSV (樣品5)。上述樣品用於測試本發明之生物檢測晶片對於豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)的蛋白質檢測效力。
在某些具體實施例中，該生物探針係為抗PRRSV抗體，該抗體可為單株或多株抗體，抗PRRSV抗體的實例可包含，但不限於PRRSV-N Protein antibody (Biorbyt公司，英國，產品編號：orb526689)、Recombinant Mouse Anti-PRRSV ORF7 Antibody (ICA7) (Creative Biolabs 公司，美國，產品編號：EPAF-0626LC)或PRRSV-GP5 Polyclonal Antibody (Bioss公司，美國，產品編號：BS-4504R)。
本實施例之具體實驗流程包含：首先，在樣品槽中注入空白樣品(Bis-tris propane，BTP) 100 µL，室溫靜置約10分鐘之後，進行電性量測，以建立標準曲線(Baseline)；取100 µL待測樣品滴進樣品槽內，室溫靜置約30分鐘進行反應；靜置後，移除待測樣品並沖洗樣品槽；後續再將空白樣品(BTP)注入樣品槽中，室溫靜置約10分鐘後，進行電性量測，取得樣品量測結果，將標準線與樣品量測結果進行比對分析。
實驗結果請參閱圖7A，經量測後所得之電性曲線圖顯示，PRRSV純化病毒蛋白質樣品(樣品2至樣品5)之電性曲線與標準曲線(Baseline)相比有明顯偏移的現象，且待測樣品之病毒蛋白質濃度越高，則電性曲線偏移量越大，顯示本發明之生物晶片具有檢測豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV) 的效力，同時具有類似於定量之效果，而PEDV樣品(樣品1，負控制組)的電性曲線非常接近標準曲線，顯示本發明之生物檢測晶片對於PRRSV檢測具有良好的專一性。另外，將訊號進行量化後，其結果如圖7B所示，本發明之生物檢測晶片在至少含有0.1 fg/mL的PRRS病毒蛋白質濃度(樣品2)下就能檢測到訊號，顯示其具有高度的靈敏性。
實施例 1.2 核酸探針檢測
在本實施例中，欲檢測標的係為豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV) ；其中，本實施例之生物檢測晶片經GPTMS改質法進行表面修飾。
在本實施例之一實驗中，使用核酸探針作為生物探針，其中該生物探針包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 11中之至少一種所示之核苷酸序列；本實施例所使用之待測樣品為含有PRRSV的豬血清樣品。該樣品以PBS進行序列稀釋後，以VLL緩衝液(LabTurbo TMVirus Mini Kit，型號：LVN480-200，列特博生技股份有限公司，台北，台灣)進行裂解，反應時間為15分鐘。製備完的樣品進一步以25 mM Tris-HCl緩衝液進行稀釋；稀釋完成後，待測樣品中PRRS病毒的RNA濃度分別為0.24 copies/µL PRRSV (樣品6)及240 copies/µL PRRSV (樣品7)。而負對照組樣品則僅具有緩衝液。上述樣品用於測試本發明之生物檢測晶片對於豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)的RNA片段檢測效力。
本實施例之具體實驗流程如實施例1.1所述。
實驗結果請參閱圖7C，經量測後所得之電性曲線圖顯示，PRRSV豬血清病毒液RNA樣品(樣品6及樣品7)之電性曲線與標準曲線(Baseline)相比有明顯偏移的現象，且待測樣品之病毒RNA濃度越高(樣品7＞樣品6)，則電性曲線偏移量越大，顯示本發明之生物晶片具有檢測豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV) 的效力，同時具有類似於定量之效果；另外，將訊號進行量化後，其結果如圖7D所示，本發明之生物檢測晶片在待測樣品之PRRS病毒RNA濃度為至少0.24 copies/µL的狀態下就能檢測到明確的病毒訊號；反觀若以0.24 copies/µL之PRRS病毒RNA樣品進行傳統qPCR檢測，其Ct值需大於36以上才能檢測到訊號，顯示本發明之生物檢測晶片相較傳統的檢測技術具有高度的靈敏性。
在本實施例中，本發明所述之生物檢測晶片係用於檢測豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)，其中該生物探針包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 11中之至少一種所示之核苷酸序列。
實施例 2 豬流行性下痢病毒 ( PEDV) 檢測
在本實施例中，欲檢測標的係為豬流行性下痢病毒(PEDV)；其中，本實施例之生物檢測晶片經APTES-NHS改質法進行表面修飾。
在本實施例之一實驗中，使用核酸探針作為生物探針，其中該生物探針包含如SEQ ID NO: 12至SEQ ID NO: 15中之至少一種所示之核苷酸序列，本實施例所使用待測樣品之製備方法係以VLL裂解液(LabTurbo TMVirus Mini Kit，型號：LVN480-200)對各病毒樣本進行裂解，反應時間10分鐘，以獲得各病毒樣本之裂解液，之後再以25 mM Tris-HCl緩衝液進行稀釋調整濃度以進行後續實驗；並將各待測樣品進行檢測，以測試本發明之生物檢測晶片對於豬流行性下痢病毒(PEDV)的檢測效力。
本實施例之具體實驗流程如實施例1.1所述，除了於本實施例中空白樣品(BTP)與待測樣品的靜置時間分別為5分鐘與15分鐘。
實驗結果請參閱圖8A，本實驗中各待測樣品分別為豬流行性下痢病毒樣品(PEDV)、大腸桿菌樣品( Escherichia coli，E. coli)、豬霍亂沙門氏菌樣品( Salmonella choleraesuis，Sal. C)、豬丁型冠狀病毒樣品(swine delta coronavirus，SDCoV)、豬傳染性胃腸炎病毒樣品(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)及輪狀病毒樣品(Rotavirus，RVs)，用以測試本發明之生物檢測晶片的專一性；其中，豬流行性下痢病毒樣品(PEDV)具有最強的訊號，而其他裂解後之病原體樣品如大腸桿菌(E. coli)、沙門氏菌(Sal. C)、豬丁型冠狀病毒(SDCoV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)及輪狀病毒(RVs)的訊號皆明確小於豬流行性下痢病毒樣品，顯示本發明之生物檢測晶片具有檢測豬流行性下痢病毒(PEDV)的效力，且具有高度的專一性。
在本實施例之一實驗中，進一步測試不同陰性(不含PED病毒)樣品類型的背景值，以測試不同樣品類型是否會影響訊號的表現，本實驗重複6次(n=6)，實驗結果請參閱圖8B，其中，不含PED病毒之直腸拭子樣品、回腸內容物樣品、糞便樣品與小腸黏膜乳劑樣品的背景訊號值皆顯著低於裂解後的PED病毒液(豬流行性下痢病毒樣品)，顯示本發明之生物晶片能檢測不同類型之樣品，而不易受背景訊號干擾。
在本實施例之一實驗中，將PED病毒樣品(PEDV)進行不同程度的稀釋後進行測試，以檢測不同樣品濃度下的訊號強度；PED病毒樣品的RNA濃度以qPCR進行定量，再進行序列稀釋，檢測樣品包含空白樣品(Blank)、1.5x10 2copies/µL PEDV (樣品1)、1.5x10 5copies/µL PEDV (樣品2)及1.5x10 8copies/µL PEDV (樣品3)，再以本實施例所述生物檢測晶片對各樣品進行檢測。
實驗結果請參閱圖8C，本實施例所述生物檢測晶片可檢測到含有至少1.5x10 2copies/µL的RNA濃度之豬流行性下痢病毒(PEDV)樣品，顯示本發明之生物晶片具有高度的靈敏性，且樣品之PED病毒RNA濃度越高(樣品3＞樣品2＞樣品1)，則有越強之訊號，亦顯示本發明所述生物檢測晶片具有類似於定量之效果。
實施例 3 皮質醇 (Cortisol) 檢測
在本實施例中，欲檢測標的係為皮質醇(Cortisol)；其中，本實施例之生物檢測晶片經APTES-Biotin改質法進行表面修飾。
在本實施例之一實驗中，使用皮質醇特異性抗體作為生物探針，其中該生物探針係為抗皮質醇之抗體(Anti-Cortisol antibody [F4P1A3]，Abcam公司，英國)，並將待測樣品進行檢測，以測試本發明之生物檢測晶片對於皮質醇(Cortisol)的檢測效力。待測樣品包含空白樣品(Blank)、不含皮質醇之樣品(控制組樣品，Quality Control)、含0.1 µg/dL皮質醇濃度之樣品(樣品1)及含6 µg/dL皮質醇濃度之樣品(樣品2)。
本實施例之具體實驗流程如實施例1.1所述，除了於本實施例中待測樣品的靜置時間為15分鐘。
實驗結果請參閱圖9A，經量測後所得之電性曲線圖顯示，含有皮質醇的樣品(樣品1及樣品2)之電性曲線與標準曲線(Baseline)相比有明顯偏移的現象，且待測樣品皮質醇濃度越高(樣品2 ＞ 樣品1)，則電性曲線偏移量越大，顯示本發明之生物晶片具有檢測皮質醇的效力，同時具有類似於定量之效果；另外，將訊號進行量化後，其結果如圖9B所示，本發明之生物檢測晶片在含有至少0.1 µg/dL的皮質醇濃度下(樣品1)就能檢測到訊號，其具有高度的靈敏性，且越高濃度的皮質醇樣品則有越顯著之訊號，顯示本發明之生物晶片同時具有類似於定量之效果。
其中，該生物探針係為抗皮質醇抗體，該抗體可為單株或多株抗體。
綜上所述，根據本發明實施例之實驗結果所示，本發明所述之生物檢測晶片確實具有檢測豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)、豬流行性下痢病毒(PEDV)及皮質醇(Cortisol)之功效，且相較於傳統檢測流程，本發明所述之生物檢測晶片具有高專一性、高靈敏度、高準確度、流程簡單、操作方便、檢測快速及定量的能力，可有效解析生命現象、探究生理活動和疾病過程，以進一步尋求後續治療方案及改善方式等，在生命科學、臨床診斷和食品安全等領域皆具有廣泛的應用前景。
本發明所提供的生物檢測晶片以豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)、豬流行性下痢病毒(PEDV)或皮質醇(Cortisol)檢測為實施例進行說明與解析，唯本發明所提供的生物檢測晶片除上述檢測外，其餘應用也應涵蓋於本發明所宣稱的範圍內。
上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。
綜上所述，本案所揭露之技術特徵已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請　貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。
1:生物檢測晶片 10:基底層 101:源極區 102:汲極區 103:通道區 11:固定區 ADC:電壓轉換器 BP:生物探針 BA:生物檢測區 BL:生物檢測層 BT:待檢測物 D:共用汲極 EG:延伸閘極 EGS:延伸閘極表面 FG:空接閘極 I1~In:輸出電流 LL:下層 M:電流測量器 MT:金屬連接通道 OP:放大器 OUTPUT:輸出端 PL:多晶矽氧化層 S:共用源極 S1~S4:檢測步驟 TA:樣品槽 T1~Tn,nmos:電晶體 UL:上層 VREF:參考電壓
圖1係為本發明之一具體實施例之生物檢測晶片之示意圖。
圖2A係為本發明之一具體實施例中，沿著圖1虛線AA’之生物檢測晶片之剖面示意圖。
圖2B係為本發明之另一具體實施例中，沿著圖1虛線AA’之生物檢測晶片之剖面示意圖。
圖3A係為本發明之一具體實施例之APTES-GA改質法之示意圖。
圖3B係為本發明之一具體實施例之APTES-NHS改質法之示意圖。
圖3C係為本發明之一具體實施例之APTES-Biotin改質法之示意圖。
圖4係為本發明之一具體實施例之GPTMS改質法之示意圖。
圖5係為本發明之一具體實施例之生物檢測方法之流程圖。
圖6係為本發明之一具體實施例之生物檢測方法之電路示意圖。
圖7A係為本發明實施例1之生物檢測晶片(抗體探針)對於豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV) 檢測的電性曲線圖。
圖7B係為本發明實施例1之生物檢測晶片(抗體探針)對於豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)檢測的訊號量化圖。
圖7C係為本發明實施例1之生物檢測晶片(核酸探針)對於豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV) 檢測的電性曲線圖。
圖7D係為本發明實施例1之生物檢測晶片(核酸探針)對於豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV) 檢測的訊號量化圖。
圖8A係為本發明實施例2之生物檢測晶片對於豬流行性下痢病毒(PEDV)檢測的專一性測試訊號量化圖。
圖8B係為本發明實施例2之生物檢測晶片對於豬流行性下痢病毒(PEDV)檢測的各類型樣品背景訊號量化圖。
圖8C係為本發明實施例2之生物檢測晶片對於豬流行性下痢病毒(PEDV)檢測的靈敏度測試訊號量化圖。
圖9A係為本發明實施例3之生物檢測晶片對於皮質醇(Cortisol)檢測的電性曲線圖。
圖9B係為本發明實施例3之生物檢測晶片對於皮質醇(Cortisol)檢測的訊號量化圖。
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1:生物檢測晶片
10:基底層
D:共用汲極
EG:延伸閘極
FG:空接閘極
LL:下層
MT:金屬連接通道
PL:多晶矽氧化層
S:共用源極
T1~Tn:電晶體
UL:上層

Claims (10)

  1. 一種生物檢測晶片，其包含排列為一陣列的複數個電晶體，該陣列包含複數個列(row)以及複數個行(column)，每一個該複數個電晶體係設置於該複數個列之一以及該複數個行之一，每一個該複數個電晶體個別包含： 一基底層，包含一共用源極、一共用汲極及設置於該共用源極與該共用汲極之間的一通道區； 一空接閘極，設置於該通道區，該空接閘極包含一多晶矽氧化層； 一金屬連接通道，設置於該空接閘極上； 一延伸閘極，設置於該金屬連接通道上，該延伸閘極係透過該金屬連接通道電性連接該空接閘極；以及 一生物檢測層，設置於該延伸閘極上，該生物檢測層上包含一固定區及至少一生物探針，該生物探針固定於該固定區上； 其中，該複數個電晶體的該生物檢測層於一生物檢測晶片表面上形成並聯的複數個生物檢測區； 其中，設置於該陣列之同一列之該複數個電晶體係並聯連接；以及 其中，設置於該陣列之同一行之兩相鄰電晶體之各該空接閘極係分別以近似之距離靠近該兩相鄰電晶體之間之該共用源極或該共用汲極，或分別覆蓋該兩相鄰電晶體之間之該共用源極或該共用汲極之至少一部分。
  2. 如請求項1所述之生物檢測晶片，其中該固定區係於該延伸閘極表面上經由表面修飾製程所得，其中該表面修飾製程係選自於由3-氨基丙基三乙氧基矽烷-戊二醛(3-aminopropyltriethoxysilane-Glutaraldehyde，APTES-GA)改質法、3-氨基丙基三乙氧基矽烷- N-羥基琥珀醯亞胺(3-aminopropyltriethoxysilane-N-hydroxysuccinimide，APTES-NHS)改質法、3-氨基丙基三乙氧基矽烷-生物素(3-aminopropyltriethoxysilane- Biotin，APTES-Biotin)改質法以及3-環氧丙醇三甲氧基矽烷(3-glycidoxypropyltrimethoxysilane，GPTMS)改質法所組成的群組。
  3. 如請求項1所述之生物檢測晶片，其中該固定區包含複數個選自於由 、 及 所組成的群組。
  4. 如請求項1所述之生物檢測晶片，其中該生物檢測晶片係用於檢測豬生殖與呼吸綜合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，其中該生物探針包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 11中之至少一種所示之核苷酸序列。
  5. 如請求項1所述之生物檢測晶片，其中該生物檢測晶片係用於檢測豬流行性下痢病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)，其中該生物探針包含如SEQ ID NO: 12至SEQ ID NO: 15中之至少一種所示之核苷酸序列。
  6. 如請求項1所述之生物檢測晶片，其中該生物檢測晶片係用於檢測皮質醇(Cortisol)，其中該生物探針係為抗皮質醇之抗體。
  7. 一種生物檢測方法，係利用生物檢測晶片對一待測樣品進行生物檢測，該生物檢測方法包含： 提供一如請求項1所述之生物檢測晶片； 將一空白樣品置於並聯的該複數個生物檢測區，量測該複數個電晶體的一閘極電壓及一汲極電流以建立一標準線； 將一待測樣品置於該複數個生物檢測區，放置一預定時間； 以該空白樣品沖洗該複數個生物檢測區；以及 量測該複數個電晶體的該閘極電壓及該汲極電流以建立一量測線，將該量測線與該標準線比較以判斷該待測樣品是否包含一欲檢測標的。
  8. 如請求項7所述之生物檢測方法，其中該欲檢測標的係為豬生殖與呼吸綜合症病毒(PRRSV)，該生物探針包含如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 11中之至少一種所示之核苷酸序列。
  9. 如請求項7所述之生物檢測方法，其中該欲檢測標的係為豬流行性下痢病毒(PEDV)，該生物探針包含如SEQ ID NO: 12至SEQ ID NO: 15中之至少一種所示之核苷酸序列。
  10. 如請求項7所述之生物檢測方法，其中該欲檢測標的係為皮質醇(Cortisol)，該生物探針係為抗皮質醇之抗體。
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