CN114088953B - 一种药物靶点筛选蛋白质芯片试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及筛选药物靶点技术领域，具体涉及一种药物靶点筛选蛋白质芯片试剂盒。所述试剂盒包括靶点芯片、样品稀释液、反应检测液和清洗液。本发明通过生物信息学、网络药理学分析，对药物特别是中药小分子药物、天然产物的高频靶点进行了遴选、优化组合，并提出了一种蛋白质芯片制备新方法，进而研发了用于药物靶点筛选的蛋白质芯片试剂盒。与其他产品相比，本发明填补了无专业药物靶点筛选芯片和试剂盒的空白，具有快速、准确、高效、高通量识别药物靶点的优点。

Description

一种药物靶点筛选蛋白质芯片试剂盒
技术领域
本发明涉及筛选药物靶点技术领域，具体涉及一种药物靶点筛选蛋白质芯片试剂盒。
背景技术
随着现代分子生物学技术的发展，药理学的研究尤其是来源于中药、天然产物的活性分子的研究进入了用分子去解释其作用机制的时代。蛋白质构成了生命的基本结构，参与重要的生命进程和生理过程，尤其是那些在级联调控中发挥重要功能的分子，更是被作为解释重大疾病的关键机制，也成为新药研发的重要靶点。
中药中存在天然活性物质，可以直接与细胞中的蛋白质发生直接结合，进而调控生理或者病理过程。很多研究发现，中药中存在天然活性小分子，能够直接与蛋白质结合，发挥抗炎、抗肿瘤的效应。中药-靶蛋白的研究，已经成为中药研究的热点，也是现代分子生物学技术应用于传统中药研究中的重要组成部分。研究和发现中药靶点有助于中药的机制的研究，是中药活性分子成药过程中的必备环节，是中药现代化的关键步骤，也有助于深入了解调控疾病发生和发展的新的重要靶点，为开发新的分子药物提供新的思路。
至今为止，药物靶点的研究方法是通过基于质谱的高通量的技术。该方法价格高昂，周期长，混合样品容易出现相互干扰，出现假阳性，且检测结果依赖于质谱的分辨率，验证手段复杂。另外，市场上存在的为数不多的中药靶点筛选的产品主要是人类全蛋白质芯片。该产品价格高昂，而且每次只能处理一个样品，通量小。能够通过基因工程得到的人蛋白质都被列举在芯片上，没有针对性。检验结果效率很低，尽管能够得到药物靶点蛋白的结果，但是并不针对药物特异性的靶点，检测结果中还有很多非靶点蛋白，而非靶点蛋白对于研究来说结果冗余。
中国专利申请CN1719253A公开了一种适用于高通量药物（非药物靶点）筛选的蛋白质芯片，及其制备技术及其检测方法。具体的，该发明的高通量筛选反向蛋白质芯片是将单一药物作用靶点相关的蛋白质以薄层形式均匀固定于固相载体表面，然后在蛋白层上以点阵形式分布待筛选样品，将选自荧光、同位素以及其他可检测物质的标记物标记的受体蛋白特异性配体与固相载体表面受体蛋白进行结合，检测结果显示背景为结合配基均匀信号，待测样品与受体蛋白有特异性结合后，阳性结果为反向的暗点。采用该发明所述反向蛋白质芯片技术能够实现一个药物作用靶点对化合物、天然产物、中药提取物在生物芯片上的大量快速筛选。但是该芯片不适用于药物靶点筛选，首先，靶点蛋白丰富，不是所有靶点蛋白都能找到适用的配体，也不是所有的配体都能够进行标记，再次配体结合的位点与药物结合位点不一定重合，与药物不一定能够形成竞争结合；然后，该芯片存在靶点通量放大的问题，靶蛋白数量放大后，同时进行多种配体结合的条件和环境难以控制。该芯片在单靶点筛选药物时可能有一定优势，但是作为高通量药物靶点筛选的芯片仍然困难。本发明通过遴选适用于药物尤其是天然产物、中药分子的靶点组合，形成了特色的用于药物靶点筛选的蛋白质组芯片。
随着蛋白质研究的进行，一些关键蛋白作为新的药物被发现在抗炎、抗肿瘤中发挥重要作用，比如PD-1/L1，PD-2/L2，CTLA-4，IL-2，TNF-α等。研究发现，中药小分子可以与这些重要分子发生直接结合，引发一系列的级联调控进而发挥抗炎抗肿瘤的作用。因此，研究和开发中等通量的分子生物学方法，去筛选和检测中药小分子、天然产物以及其他药物分子的靶点，并在中药现代化和新靶点筛选领域推广应用快速、高效、精准、经济实用的产品，是解决药物分子机制研究的关键。
为了解决这个问题，本发明提供了一种特异性检测药物（特别是中药小分子药物、天然产物）和药物靶点蛋白相互作用等的蛋白质芯片试剂盒的产品。通过生物信息学和网络药理学方法，综合文献以及发明人最新的研究成果（Annexin A2作为中药分子绿原酸的作用靶点(Wang, Du and Chen 2020)、谷胱甘肽合成酶GSS作为虎杖苷的作用靶点(Chenet al. 2020)），确定了一批适用于药物特别是中药小分子高频出现的药物靶点组合，并开发了试剂盒产品。
在开发试剂盒的过程中，制备芯片过程中存在行业中普遍的一个技术痛点，就是芯片基片的制备问题，普通的醛基、环氧基芯片蛋白固定效率低，凝胶、PVDF等基底膜芯片的制作技术门槛高且制作成本高，各有优缺点。上述芯片的点制思路都是通过芯片的修饰来完成蛋白质的固定，本专利利用反向思维（由修饰基片变为更换点样液），通过改进芯片点样液组成，芯片点样液点样时为液体，蛋白与点样液体固定到芯片基片时会慢慢的变成凝胶固体，这样在有蛋白的点的地方就形成了固体的凝胶，该技术方法操作简单，成本低，普通的光学玻璃片就可以应用，大大的降低了蛋白质芯片的技术门槛，为该芯片的应用推广提供了技术手段。
综上，目前的专利和文献虽然有一些用于检测的抗体芯片、蛋白质组芯片出现，但是专业的用于药物靶点筛选蛋白质芯片及试剂盒还没有出现。
因此，开发一种能解决上述技术问题的药物靶点筛选蛋白质芯片试剂盒是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种快速、准确、高效、高通量、低成本识别药物靶点的蛋白质芯片试剂盒。
本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种药物靶点筛选蛋白质芯片试剂盒，包括药物靶点芯片、样品稀释液、反应检测液和清洗液。
优选地，所述药物靶点芯片由芯片、靶蛋白和点样缓冲液制备得到。
更优选地，所述靶蛋白包括激酶、免疫检查点、信号通路调控蛋白、炎症因子等。
更优选地，所述靶蛋白包括ALK1；CDK1；CDK2；CDK4；EPHA1；DDR1；FLT1；MEK1；HDAC4；Lck；AKR1B1；TRKa；ABL1 ；ACK；AKT1；ALK4；AurA；AXL ；BTK；CK1；CLK3 ；DAPK1；DCLK1；DYRK3 ；EphB1；FES；FGFR1；FGR；FLT3；GALK1；GSK3B；ITK；JNK1；c-Kit ；Mer ；PDGFRA；PRKD2 ；PRKAR1A ；PLK1 ；RET ；MST3 ；TGFBR2 ；TIE2 ；NEDP1；PKM2；ROR1；CKB；HGFR；HTRA2；HER3；DKK-1；ABP1；ACYP1；ALCAM；ANXA2；ANGPTL4；ApoA1；ApoE；B2M；CD80/B7-1；Bcl-w；BTLA；BTN1A1；CA-I；CALCB；CD137；CD47；CD244；CD27；CD28；CD40；CD59；CD62P；CD86；CDH1；CDH3；CRYAA；CTLA-4；CXCL1；CXCL7；DCBLD2；Decorin；EFNA3；EGF；Ephrin-B2；FABP1；FGF-1；FGF-2；FKBP3；FKBP4；GFRA1；GITR；HB-EGF；HVEM；ICAM-2；IFNGR1；IFNα2a；IGF-I；IL-10RB；IL-17A；IL-18RAcP；IL-1R3；IL-2；ISG15；KRAS(G12C)；KRAS4B(G12V, N-6His)；LEPR；LGALS3；LILRB1；LILRB2；M-CSFR；MYDGF；NKG2-A；PD-1；PDGFRB；PD-L1；PRDX1；S100A6；SIRPA；SIRPB2；SLAMF7；SNCG；SUMO1；TACI；TNFRSF10B；TNFRSF10C；TNFSF5；TNFα；TP44；Transferrin；TrkB；TROP-2；TXN；VISTA；VMCM；VTN；β-NGF(Ser122-Ala241)和GSS中的至少一种。
本发明经过生物信息学、网络药理学方法遴选，含有适用于中药小分子、天然产物小分子、以及大分子药物高频蛋白靶点。
更优选地，所述点样缓冲液按照重量份数计，包括如下组分：0.000001-0.00001份四甲基乙二胺，0.1-2.0份过硫酸铵，30-70份聚乙烯醇，5-15份丙烯酰胺\甲叉丙烯酰胺，所述丙烯酰胺\甲叉丙烯酰胺中丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺质量比为29:0.5-1，且pH=6.0-8.0。
更优选地，所述点样缓冲液按照百分比计，包括如下组分：0.000001-0.00001%四甲基乙二胺，0.1-2.0%过硫酸铵，30-70%聚乙烯醇，5-15%丙烯酰胺\甲叉丙烯酰胺，余量为水。
所述点样缓冲液为缓慢凝结水凝胶体系。
更优选地，所述芯片为光学玻璃片，尺寸2.5 * 7.5cm。
更优选地，所述药物靶点芯片的制备工艺包括如下步骤：将靶蛋白与点样缓冲液混合后稀释到0.1-2 mg/mL，在微阵列芯片点样仪上对芯片进行点样，点间距200-300 μm，预点样点数30-50个，每个蛋白重复点三个点；点样完成后37-40 ℃固定6-24小时，然后-80℃冷冻保存。
本发明提供了一种全新的药物靶点芯片制备方法，该方法通过上述点样缓冲液可以在未经任何修饰处理的普通光学玻璃片上制作药物靶点芯片。
优选地，所述样品稀释液为pH=6.0-7.5的PBS缓冲液。
更优选地，所述样品稀释液为pH=7.0的PBS缓冲液。
优选地，使用试剂盒检测前，药物标记生物素或者自发荧光或者标记荧光或者偶联后发出荧光。
更优选地，所述反应检测液包括含有质量浓度为0.1%-1%的5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和质量浓度为0.3%-3%的2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮的PBS缓冲液，pH=6.0-7.5。
更优选地，所述反应检测液pH=7.0。
更优选地，当药物标记生物素时，所述反应检测液还包括5-20 μM的链霉亲和素标记的Cy3或者Cy5荧光基团。
更优选地，当药物为自发荧光或标记荧光或偶联后发出荧光时，所述反应检测液不含有链霉亲和素标记的Cy3或者Cy5荧光基团。
更优选地，当药物为大分子时，所述反应检测液还含有大分子抗体对应种属的二抗抗体并标记Cy3或者Cy5荧光基团以及2-7 %牛血清蛋白。
更优选地，所述牛血清蛋白质量浓度为5%。
优选地，所述清洗液为含有0.01-0.1 %，最佳0.05%，吐温20的PBS溶液，pH=6.0-7.5，最佳为pH=7.0。
本发明还涉及一种采用上述的试剂盒检测药物靶点的方法，包括如下步骤：
（1）将药物靶点芯片在室温复温30-60min，最优30min；
（2）将用样品稀释液稀释的不同浓度药物放置于药物靶点芯片的不同围栏中，23-37 ℃孵育1-3小时，最优2小时；
（3）去掉药物，用清洗液清洗2-5次，最优3次，震荡，每次5-10 min；去掉清洗液，在500-3000 rpm，最优1500rpm，离心1-2 min；
（4）加入反应检测液，室温孵育25-45 min，最优30 min，去掉反应检测液，用清洗液清洗2-5次，最优3次；
（5）荧光检测仪读取荧光数据。
优选地，步骤（4）中还包括用清洗液清洗2-5次后，超纯水洗涤1次，离心除去芯片表面的水。
优选地，所述药物靶点芯片中的靶蛋白对照为BSA，IgG，BSA-Cy3和BSA-Cy5。
本发明的有益效果是：
本发明在应用于药物靶点的筛选中有着快速、高效、精准，经济实用的优点，相关科研或者技术人员只需要按照简单的操作即可进行高效的中药靶点的筛选。相比于传统的中药靶点筛选方法，本发明能够针对性地、快速地筛选高频的药物靶点，节约人力物力成本，也能同时进行多样本的同时检测，适合推广应用。
本发明的点样缓冲液使得药物靶点芯片无需醛基、环氧基等修饰，无需纤维素膜、PVDF膜、凝胶膜，极大地降低了药物靶点芯片的制备成本。
附图说明
图1为药物靶点芯片矩阵分布图。
图2 为药物靶点芯片制备、工作流程图。
图3为药物靶点芯片点阵设计图。
图4为本发明药物靶点芯片点样液与甘油点样缓冲液的对比图。其中，图4-1为传统50%甘油点样缓冲液点样效果图，图4-2为本发明实施例1点样缓冲液点样效果图。
图5为药物靶点芯片抗体质控图。其中，图5-1为Cy3通道下矩阵扫描图，图5-2为Cy5通道下矩阵扫描图，图5-3 为抗Annexin-A2抗体检测结果。
图6为药物靶点芯片小分子药物靶点筛选应用示范图。其中，图6-1为药物靶点芯片的对照实验，图6-2为药物靶点芯片筛选到的人参皂苷Rg2相对于对照实验的作用蛋白靶点。
图7为实施例1点样缓冲液与对比例1点样缓冲液的对比图。其中，图7-1为实施例1点样缓冲液靶蛋白固定效果图，图7-2为对比例1靶蛋白固定效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 一种药物靶点蛋白质芯片和试剂盒的制备
制备步骤如下：
1.药物靶点芯片制备
所有靶蛋白被点样缓冲液调整到1.0 mg/mL后，在微阵列芯片点样仪上对芯片进行点样：所有靶蛋白对应的基因名称、Uniprot数据库登录号和NCBI参考序列登录号如表1所示。
（1）芯片采用光学玻璃片（2.5 * 7.5 cm），洗净晾干；
（2）点样缓冲液：0.00001%四甲基乙二胺TEMED，1%的过硫酸铵，以及70%聚乙烯醇，10%丙烯酰胺\甲叉丙烯酰胺（质量比29:1），余量为水，pH=7.0的缓慢凝结水凝胶体系。点间距300 μm，预点样点数30个，每个蛋白重复点三个点；
（3）芯片点制完成后，37.0℃固定6.0小时，然后-80 ℃冷冻保存。
表1
基因名称 Uniprot数据库登录号 NCBI参考序列登录号
1 ALK1 P37023 NM_000020
2 CDK1 P06493 NM_001320918
3 CDK2 P24941 NM_001290230
4 CDK4 P11802 NM_000075
5 EPHA1 P21709 NM_005232
6 DDR1 Q08345 NM_001202521
7 FLT1 P17948 NM_001159920
8 MEK1 Q02750 NM_002755
9 HDAC4 P56524 NM_006037
10 Lck P06239 NM_001042771
11 AKR1B1 P15121 NM_001628
12 TRKa P04629 NM_001007792
13 ABL1 P00519 NM_005157
14 ACK Q07912 NM_001010938
15 AKT1 P31749 NM_001014431
16 ALK4 P36896 NM_004302
17 AurA O14965 NM_001323303
18 AXL P30530 NM_001699
19 BTK Q06187 NM_000061
20 CK1 P48729 NM_001025105
21 CLK3 P49761 NM_001130028
22 DAPK1 P53355 NM_001288729
23 DCLK1 O15075 NM_001195415
24 DYRK3 O43781 NM_001004023
25 EphB1 P54762 NM_004441
26 FES P07332 NM_001143783
27 FGFR1 P11362 NM_001174063
28 FGR P09769 NM_001042729
29 FLT3 P36888 NM_004119
30 GALK1 P51570 NM_000154.2
31 GSK3B P49841 NM_001146156
32 ITK Q08881 NM_005546
33 JNK1 P45983 NM_001278547
34 c-Kit P10721 NM_000222
35 Mer Q12866 NM_006343
36 PDGFRA P16234 NM_001347829
37 PRKD2 Q9BZL6 NM_001079880
38 PRKAR1A P10644 NM_001276289
39 PLK1 P53350 NM_005030
40 RET P07949 NM_020630
41 MST3 Q9Y6E0 NM_001032296
42 TGFBR2 P37173 NM_001024847
43 TIE2 Q02763 NM_000459
44 NEDP1 Q96LD8 NM_001166340
45 PKM2 P14618 NM_001206796
46 ROR1 Q01973 NM_001083592
47 CKB P12277 NM_001823
48 HGFR P08581 NM_000245
49 HTRA2 O43464 NM_001321727
50 HER3 P21860 NM_001005915
51 DKK-1 O94907 NM_012242
52 ABP1 P33487 NM_116532
53 ACYP1 P07311 NM_001107
54 ALCAM Q13740 NM_001243280
55 ANXA2 P07355 NM_001002857.2
56 ANGPTL4 Q9BY76 NM_001039667
57 ApoA1 P02647 NM_000039
58 ApoE P02649 NM_000041
59 B2M P61769 NM_004048
60 CD80/B7-1 P33681 NM_005191
61 Bcl-w Q92843 NM_001199839
62 BTLA Q7Z6A9 NM_001085357
63 BTN1A1 Q13410 NM_001732
64 CA-I P00917 NM_001337342
65 CALCB P10092 NM_000728
66 CD137 Q07011 NM_001561
67 CD47 Q08722 NM_001777
68 CD244 Q9BZW8 NM_001166663
69 CD27 P26842 NM_001242
70 CD28 P10747 NM_001243077
71 CD40 P29965 NM_000074
72 CD59 P13987 NM_000611
73 CD62P P16109 NM_003005
74 CD86 P42081 NM_001206924
75 CDH1 Q9UM11 NM_001136197
76 CDH3 P22223 NM_001317195
77 CRYAA P02489 NM_000394
78 CTLA-4 P16410 NM_001037631
79 CXCL1 P09341 NM_001511
80 CXCL7 P02775 NM_002704
81 DCBLD2 Q96PD2 NM_080927
82 Decorin P07585 NM_001920
83 EFNA3 P52797 NM_004952
84 EGF P01133 NM_001178130
85 Ephrin-B2 P52799 NM_004093
86 FABP1 P07148 NM_001443
87 FGF-1 P05230 NM_000800
88 FGF-2 P09038 NM_002006
89 FKBP3 Q00688 NM_002013
90 FKBP4 Q02790 NM_002014
91 GFRA1 P56159 NM_001145453
92 GITR Q9Y5U5 NM_004195
93 HB-EGF Q99075 NM_001945
94 HVEM Q92956 NM_003820
95 ICAM-2 P13598 NM_000873
96 IFNGR1 P15260 NM_000416
97 IFNα2a P01563 NM_000605
98 IGF-I P05019 NM_000618
99 IL-10RB Q08334 NM_000628
100 IL-17A Q16552 NM_002190
101 IL-18RAcP O95256 NM_003853
102 IL-1R3 Q9NPH3 NM_001167928
103 IL-2 P60568 NM_000586
104 ISG15 P05161 NM_005101
105 KRAS(G12C) P01116 NM_004985.4
106 KRAS4B(G12V, N-6His) P01116 NM_004985.4
107 LEPR P48357 NM_001003679
108 LGALS3 P17931 NM_002306
109 LILRB1 Q8NHL6 NM_001081637
110 LILRB2 Q8N423 NM_001080978.4
111 M-CSFR Q76KE8 NM_001124739
112 MYDGF Q969H8 NM_019107
113 NKG2-A P26715 NM_002259
114 PD-1 Q15116 NM_005018
115 PDGFRB P09619 NM_002609
116 PD-L1 Q9NZQ7 NM_001267706
117 PRDX1 Q06830 NM_001202431
118 S100A6 P06703 NM_014624
119 SIRPA P78324 NM_001040022
120 SIRPB2 Q5JXA9 NM_001122962
121 SLAMF7 Q9NQ25 NM_001282588
122 SNCG O76070 NM_001330120
123 SUMO1 P63165 NM_001005781
124 TACI O14836 NM_012452
125 TNFRSF10B O14763 NM_003842
126 TNFRSF10C O14798 NM_003841
127 TNFSF5 P29965 NM_000074
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129 TP44 P10747 NM_001243077
130 Transferrin P02786 NM_001128148
131 TrkB Q16620 NM_001007097
132 TROP-2 P09758 NM_002353
133 TXN Q9M7X9 NM_111553
134 VISTA Q9H7M9 NM_022153
135 VMCM Q02763 NM_000459
136 VTN P04004 NM_000638
137 β-NGF(Ser122-Ala241) P01138 NM_002506
138 GSS P48637 NM_000178.4
2.点样程序和设置
首先，进行点样前清洗，清洗程序为：
针清洗5s——超声5s——烘干5s ——针清洗5s——超声5s——烘干5s ——针清洗5s——超声5s——烘干5s。
设置芯片点样区域：
设置距离横向芯片边缘距离OX为6.0mm，设置距离纵向芯片边缘距离OY为6.0mm。
设置单矩阵：
针点距为X方向为0.3 mm，Y方向为0.3 mm；
针阵点数：X方向24，Y方向21；
样品重复点数为3。
设置多矩阵：
阵间间隔为X方向7.5 mm，Y方向7.5 mm；
阵数为X方向2，Y方向5；
阵列重复。
预点样数50，预点样间距为0.5 mm。
湿度要求：50 %。
药物靶点芯片矩阵分布图如图1所示，药物靶点芯片制备、工作流程图如图2所示，从左到右依次为靶蛋白经过点样制备蛋白芯片、蛋白芯片点样后凝固得到药物靶点芯片、药物靶点芯片孵育药物确定药物靶点，图3为药物靶点芯片点阵设计图。
同时，本发明为了解决芯片基片制作复杂，成本高的问题，改进了芯片点样缓冲液的配方，采用本发明的芯片点样缓冲液，相对于其他点样液，采用常规光学玻璃片就可以制备蛋白质芯片，点样完成后，经过测试（孵育不同的探针，常温1h，洗涤液洗涤3次，每次5min），本发明的芯片点样液采用普通光学基片即可。该试剂盒含有发明内容中具体配方的其他试剂，按照规格瓶装，组装成盒。图4为芯片点样缓冲液与传统50%甘油点样液的对比图，图4-1为对比的传统50%甘油点样缓冲液，由图4-1可知，使用传统的点样液，无法完成靶点蛋白的固定。图4-2为本发明实施例1点样缓冲液点样效果图。
进一步的，本发明点样缓冲液的中四甲基乙二胺TEMED和过硫酸铵的适用浓度经过了筛选，70%聚乙烯醇，10%丙烯酰胺\甲叉丙烯酰胺（质量比29:1）条件下不同比例TEMED和过硫酸铵的点样缓冲液凝固时间，配制和点样时间37℃条件下一般大于2小时，且凝固时间在37℃条件下小于24小时，根据此条件本发明确定了TEMED和过硫酸铵的适用浓度范围。
实施例2 本发明药物靶点筛选蛋白质芯片抗体反应质控
将药物靶点芯片从-80℃冰箱转入-20℃冰箱，放置过夜。实验前将药物靶点芯片放入4℃冰箱，平衡30 min。
本实施例采用的样品稀释液为pH=7.0的PBS缓冲液；清洗液为含有0.1 % 吐温20的PBS溶液，pH=7.0。
pH=7.0，0.1 % 吐温20的PBS清洗液清洗药物靶点芯片3次，5 min。孵育盒中加入pH=7.0的PBS样品稀释液1:1000稀释后的蛋白抗体（抗AnneixnA2抗体，购买自武汉三鹰生物科技有限公司），将药物靶点芯片放入，盖上盖子，摇匀，避光，置于水平摇床，50 rpm，室温，孵育1 h。培养皿中加入30 mL清洗液，将药物靶点芯片转移其中，50 rpm，室温，洗涤3次，每次5 min。
培养皿中加入10 mL反应检测液，反应检测液为含有质量浓度为1%的5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和质量浓度为3%的2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮的PBS缓冲液，pH=7.0，并含有2%BSA，以及0.1 %Cy3标记的羊抗小鼠IgG二抗，将药物靶点芯片放入，置于水平摇床，避光，50 rpm，室温反应30 min。
培养皿中加入30 mL清洗液，将药物靶点芯片转移其中，置于水平摇床，50 rpm，室温，洗涤3次，每次5 min。去离子水清洗药物靶点芯片2次，每次5 min。将药物靶点芯片置于离心机中，1000 rpm，离心2 min干燥。避光，GenePix 400扫描仪，于Cy3、Cy5双通道，Power（100%）下扫描药物靶点芯片。结果如图5所示，图5-1为Cy3通道下矩阵扫描图，图5-2为Cy5通道下矩阵扫描图，图5-3 为抗Annexin-A2抗体检测结果。
实施例3 本发明应用于小分子药物的靶点筛选
取出药物靶点芯片恢复室温30 min，用pH=7.0的PBS样品稀释液将生物素标记的人参皂苷Rg2稀释成10μM的浓度，加入到药物靶点芯片的围栏中100 μL，37℃反应1h，反应完成后，用pH=7.5，0.1 % 吐温20的PBS清洗液清洗3次，每次5min，最后加入含有5μM的链霉亲和素标记的Cy3，含有质量浓度为1%的5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和质量浓度为3%的2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮的PBS缓冲液，pH=7.0的反应检测液100μL，37℃反应30 min，反用清洗液清洗3次，每次5min，超纯水清洗1次，离心机除去药物靶点芯片表面的水。干燥后，用荧光扫描仪读取每个点的荧光值，用计算机分析与对照组的差异，进而找到人参皂苷Rg2新的药物作用靶点。结果如图6所示。图6-1为药物靶点芯片的对照实验，图6-2为药物靶点芯片筛选到的人参皂苷Rg2相对于对照实验的作用蛋白靶点。
对比例1
US20080241944A1 权24公开了一种与利用丙烯酰胺\甲叉丙烯酰胺和甘油混合体系作为点样缓冲液制备蛋白质芯片的方法，该缓冲液缺乏丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺形成聚丙烯酰胺的引发剂和加速剂，只能在玻璃片表面形成粘稠点样滴，而难以聚集形成聚丙烯酰固体凝胶滴，本案与上述点样缓冲液进行了对比，用0.5 μg/μLBSA-Cy3蛋白点样，相同条件固定后，用0.1%PBST浸泡玻璃片2小时，用清水洗涤3次每次5min后观察蛋白固定效果，本案点样缓冲液点样点无明显弥漫、拖尾，点样点均匀饱满，对比结果如图7所示。图7-1为实施例1点样缓冲液靶蛋白固定效果图，图7-2为对比例1靶蛋白固定效果图。
对比例2
一种点样缓冲液，与实施1的区别仅在于点样缓冲液的组成不同，10%丙烯酰胺\甲叉丙烯酰胺（质量比29:1）替换为10%丙烯酰胺，其余条件均相同，结果表明，单纯的丙烯酰胺凝胶24小时以内无法凝固，蛋白无法固定在玻璃基片表面。
对比例3
一种点样缓冲液，与实施1的区别仅在于点样缓冲液的组成不同，10%丙烯酰胺\甲叉丙烯酰胺（质量比29:1）替换为10%甲叉丙烯酰胺，其余条件均相同，结果表明，单纯的甲叉丙烯酰胺凝胶24小时以内无法凝固，蛋白无法固定在玻璃基片表面。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (8)

1.一种药物靶点筛选蛋白质芯片试剂盒，其特征在于，包括药物靶点芯片、样品稀释液、反应检测液和清洗液；所述药物靶点芯片由芯片、靶蛋白和点样缓冲液制备得到；
所述药物靶点芯片的制备工艺包括如下步骤：将靶蛋白与点样缓冲液混合后稀释到靶蛋白质量浓度为0.1-2 mg/mL，在微阵列芯片点样仪上对芯片进行点样；
所述点样缓冲液按照重量份数计，包括如下组分：0.000001-0.00001份四甲基乙二胺，0.1-2.0份过硫酸铵，30-70份聚乙烯醇，5-15份丙烯酰胺\甲叉丙烯酰胺，其中丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺质量比为29:0.5-1，且pH=6.0-8.0。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述靶蛋白包括ALK1；CDK1；CDK2；CDK4；EPHA1；DDR1；FLT1；MEK1；HDAC4；Lck；AKR1B1；TRKa；ABL1 ；ACK；AKT1；ALK4；AurA；AXL ；BTK；CK1；CLK3 ；DAPK1；DCLK1；DYRK3 ；EphB1；FES；FGFR1；FGR；FLT3；GALK1；GSK3B；ITK；JNK1；c-Kit ；Mer ；PDGFRA ；PRKD2 ；PRKAR1A ；PLK1 ；RET ；MST3 ；TGFBR2 ；TIE2 ；NEDP1；PKM2；ROR1；CKB；HGFR；HTRA2；HER3；DKK-1；ABP1；ACYP1；ALCAM；ANXA2；ANGPTL4；ApoA1；ApoE；B2M；CD80/B7-1；Bcl-w；BTLA；BTN1A1；CA-I；CALCB；CD137；CD47；CD244；CD27；CD28；CD40；CD59；CD62P；CD86；CDH1；CDH3；CRYAA；CTLA-4；CXCL1；CXCL7；DCBLD2；Decorin；EFNA3；EGF；Ephrin-B2；FABP1；FGF-1；FGF-2；FKBP3；FKBP4；GFRA1；GITR；HB-EGF；HVEM；ICAM-2；IFNGR1；IFNα2a；IGF-I；IL-10RB；IL-17A；IL-18RAcP；IL-1R3；IL-2；ISG15；KRAS(G12C)；KRAS4B(G12V, N-6His)；LEPR；LGALS3；LILRB1；LILRB2；M-CSFR；MYDGF；NKG2-A；PD-1；PDGFRB；PD-L1；PRDX1；S100A6；SIRPA；SIRPB2；SLAMF7；SNCG；SUMO1；TACI；TNFRSF10B；TNFRSF10C；TNFSF5；TNFα；TP44；Transferrin；TrkB；TROP-2；TXN；VISTA；VMCM；VTN；β-NGF(Ser122-Ala241)和GSS中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述药物靶点芯片：点间距200-300 μm，预点样点数30-50个，每个蛋白重复点三个点；点样完成后37-40 ℃固定6-24小时，然后-80℃冷冻保存。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为pH=6.0-7.5的PBS缓冲液；所述清洗液为含有0.01-0.1 % 吐温20的PBS溶液，pH=6.0-7.5。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述反应检测液包括含有质量浓度为0.1%-1%的5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和质量浓度为0.3%-3%的2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮的PBS缓冲液，pH=6.0-7.5。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，当药物标记生物素时，所述反应检测液还包括5μM的链霉亲和素标记的Cy3或者Cy5荧光基团；当药物为大分子时，所述反应检测液还含有大分子抗体对应种属的二抗抗体并标记Cy3或者Cy5荧光基团以及2-7 %牛血清蛋白。
7.一种采用权利要求1-6任一所述的试剂盒检测药物靶点的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将药物靶点芯片在室温复温30-60min；
（2）将用样品稀释液稀释的不同浓度药物放置于药物靶点芯片的不同围栏中，23-37℃孵育1-3小时；
（3）去掉药物，用清洗液清洗2-5次，震荡，每次5-10 min；去掉清洗液，在500-3000rpm，离心1-2 min；
（4）加入反应检测液，室温孵育25-45 min，去掉反应检测液，用清洗液清洗2-5次；
（5）荧光检测仪读取荧光数据。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述药物靶点芯片中的靶蛋白对照为BSA，IgG，BSA-Cy3和BSA-Cy5。
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CN100458443C (zh) * 2004-07-09 2009-02-04 中国医学科学院药物研究所 一种高通量筛选反向蛋白质芯片、制备方法及其检测方法
DE102005017522A1 (de) * 2005-04-15 2006-10-26 Siemens Ag Immobilisierungs- und Reaktionsmatrix für Biosensoren
CN101074950B (zh) * 2007-06-26 2011-02-09 东南大学 凝胶芯片检测方法与检测装置
CN100590204C (zh) * 2008-02-27 2010-02-17 东南大学 一种无需激发剂三维凝胶微阵列芯片的制备方法
CN101629953A (zh) * 2009-08-07 2010-01-20 中国海洋大学 一种现场检测免疫芯片及其制备方法与应用
CN102095874A (zh) * 2011-01-05 2011-06-15 盛世泰科生物医药技术(苏州)有限公司 一种生物素标记探针联合蛋白芯片寻找小分子化学药靶点的方法

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