CN117420191A - 生物检测芯片及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种生物检测芯片及其应用，所述生物检测芯片包含并联的多个晶体管，每一个所述多个晶体管个别包含基底层、空接闸极、金属连接通道、延伸闸极及生物检测层，所述生物检测芯片经表面修饰制程后结合生物探针，以对待测样品进行生物检测，其包含检测猪繁殖与呼吸障碍症候群病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、猪流行性下痢病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)或皮质醇(Cortisol)。

Description

生物检测芯片及其应用
技术领域
本申请涉及生物检测芯片及其应用，特别涉及具有多个并联的晶体管的生物检测芯片以及使用所述生物检测芯片的检测方法。
背景技术
生物检测技术经常通过检测生物分子的特定交互作用来实现待测样品的分析，如抗原-抗体结合、核酸杂交等，通过键结后产生物理性或化学性变化，再侦测其变化以判断待测样品中是否具有欲检测的目标。然而，传统常见的生物检测法，如免疫蛋白测试与反转录聚合酶连锁反应(reverse transcription-PCR，RT-PCR)等，难以在实验室外操作，流程繁琐并费时，且需要专门的仪器设备及操作人员。例如：传统的猪相关病毒检测流程必须等采样后，将样品从养猪场送到实验室后进列检测，在东南亚等检测设施较稀少的地区，等待结果的时间可能超过一周，具有延误疫情控制等风险。
综观前所述，传统检测法有着灵敏度低、检测时间长、操作复杂等缺点，习知的生物检测方式仍具有改进空间。
发明内容
基于前述内容，本申请提供一种生物检测芯片，其包含排列为一数组的多个晶体管，所述数组包含多个行(row)以及多个列(column)，每一个所述多个晶体管是设置于所述多个行之一以及所述多个列之一，每一个所述多个晶体管个别包含：
一基底层，包含一共享源极、一共享汲极及设置于所述共享源极与所述共享汲极之间的一通道区；
一空接闸极，设置于所述通道区，所述空接闸极包含一多晶硅氧化层；
一金属连接通道，设置于所述空接闸极上；
一延伸闸极，设置于所述金属连接通道上，所述延伸闸极是通过所述金属连接通道电性连接所述空接闸极；以及
一生物检测层，设置于所述延伸闸极上，所述生物检测层上包含一固定区及至少一生物探针，所述生物探针固定于所述固定区上。
在所述数组中，位于同一行(row)的所述多个晶体管是并联连接，位于同一列(column)的所述多个晶体管中，相邻两晶体管的各所述空接闸极，是分别以近似的距离靠近所述两晶体管之间的所述共享源极或所述共享汲极，或分别覆盖所述两晶体管之间的所述共享源极或所述共享汲极的至少一部分。
所述多个晶体管的所述生物检测层于一生物检测芯片表面上形成并联的多个生物检测区。
所述多个生物检测区包含一微流道或一样品槽。
于某些具体实施例中，所述固定区是于所述延伸闸极表面上经由表面修饰制程所得，所述表面修饰制程是选自于由3-氨基丙基三乙氧基硅烷-戊二醛(3-aminopropyltriethoxysilane-Glutaraldehyde，APTES-GA)改质法、3-氨基丙基三乙氧基硅烷-N-羟基琥珀酰亚胺(3-aminopropyltriethoxysilane-N-hydroxysuccinimide，APTES-NHS)改质法、3-氨基丙基三乙氧基硅烷-生物素(3-aminopropyltriethoxysilane-Biotin，APTES-Biotin)改质法以及3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(3-glycidoxypropyltrimethoxysilane，GPTMS)改质法所组成的群组。
于某些具体实施例中，所述固定区包含多个选自于由C3H8NO3Si、C8H14NO4Si及C6H11O5Si所组成的群组。
于某些具体实施例中，其特征在于所述生物探针包含脱氧核糖核酸、核糖核酸、抗体或适体，所述生物探针经由生物接枝固定于所述固定区上。
于某些具体实施例中，所述生物检测芯片是用于检测猪繁殖与呼吸障碍症候群病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，所述生物探针包含如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：11中的至少一种所示的核苷酸序列。
于某些具体实施例中，所述生物检测芯片是用于检测猪流行性下痢病毒(Porcineepidemic diarrhea virus，PEDV)，所述生物探针包含如SEQ ID NO：12至SEQ ID NO：15中的至少一种所示的核苷酸序列。
于某些具体实施例中，所述生物检测芯片是用于检测皮质醇(Cortisol)，所述生物探针为抗皮质醇的抗体。
于一方面，本申请另提供一种生物检测方法，是利用本申请所述生物检测芯片对一待测样品进行生物检测，所述生物检测方法包含：提供一如本申请所述的生物检测芯片；将一空白样品置于并联的所述多个生物检测区，量测所述多个晶体管的一闸极电压及一汲极电流以建立一标准线；将一待测样品置于所述多个生物检测区，放置一预定时间；以所述空白样品冲洗所述多个生物检测区；量测所述多个晶体管的所述闸极电压及所述汲极电流以建立一量测线，将所述量测线与所述标准线比较以判断所述待测样品是否包含一欲检测目标。
于某些具体实施例中，所述欲检测目标为猪繁殖与呼吸障碍症候群病毒(PRRSV)、猪流行性下痢病毒(PEDV)或皮质醇(Cortisol)。
于某些具体实施例中，所述欲检测目标为猪繁殖与呼吸障碍症候群病毒(PRRSV)，其检测方法是利用本申请所述生物检测芯片对一待测样品进行PRRSV检测；所述生物探针包含如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：11中的至少一种所示的核苷酸序列；所述生物探针亦可为抗猪繁殖与呼吸障碍症候群病毒(PRRSV)的抗体。
于某些具体实施例中，所述欲检测目标为猪流行性下痢病毒(PEDV)，其检测方法是利用本申请所述生物检测芯片对一待测样品进行PEDV检测；所述生物探针包含如SEQ IDNO：12至SEQ ID NO：15中的至少一种所示的核苷酸序列；所述生物探针亦可为抗猪流行性下痢病毒(PEDV)的抗体。
于某些具体实施例中，所述欲检测目标为皮质醇(Cortisol)，其检测方法是利用本申请所述生物检测芯片对一待测样品进行皮质醇检测；所述生物探针为抗皮质醇的抗体。
本申请所提供的生物检测芯片及其用途具有灵敏度高、检测快速、操作简便及准确性佳等优势。生物检测层结合晶体管结构来侦测生物种类及数量，提高生物检测的灵敏度与便利性，通过信号分析缩短检测时间；另外，其通过延伸闸极避免组件暴露于外在环境，增加生物检测芯片的稳定性，提高使用寿命；再者，其能通过置换不同生物探针来检测不同欲检测目标，增加生物检测芯片能检测的目标多样性，有利于增进产业上的实施利用。
附图说明
图1为本申请的一具体实施例的生物检测芯片的示意图。
图2A为本申请的一具体实施例中，沿着图1虚线AA’的生物检测芯片的剖面示意图。
图2B为本申请的另一具体实施例中，沿着图1虚线AA’的生物检测芯片的剖面示意图。
图3A为本申请的一具体实施例的APTES-GA改质法的示意图。
图3B为本申请的一具体实施例的APTES-NHS改质法的示意图。
图3C为本申请的一具体实施例的APTES-Biotin改质法的示意图。
图4为本申请的一具体实施例的GPTMS改质法的示意图。
图5为本申请的一具体实施例的生物检测方法的流程图。
图6为本申请的一具体实施例的生物检测方法的电路示意图。
图7A为本申请实施例1的生物检测芯片(抗体探针)对于猪繁殖与呼吸障碍症候群病毒(PRRSV)检测的电性曲线图。
图7B为本申请实施例1的生物检测芯片(抗体探针)对于猪繁殖与呼吸障碍症候群病毒(PRRSV)检测的信号量化图。
图7C为本申请实施例1的生物检测芯片(核酸探针)对于猪繁殖与呼吸障碍症候群病毒(PRRSV)检测的电性曲线图。
图7D为本申请实施例1的生物检测芯片(核酸探针)对于猪繁殖与呼吸障碍症候群病毒(PRRSV)检测的信号量化图。
图8A为本申请实施例2的生物检测芯片对于猪流行性下痢病毒(PEDV)检测的专一性测试信号量化图。
图8B为本申请实施例2的生物检测芯片对于猪流行性下痢病毒(PEDV)检测的各类型样品背景信号量化图。
图8C为本申请实施例2的生物检测芯片对于猪流行性下痢病毒(PEDV)检测的灵敏度测试信号量化图。
图9A为本申请实施例3的生物检测芯片对于皮质醇(Cortisol)检测的电性曲线图。
图9B为本申请实施例3的生物检测芯片对于皮质醇(Cortisol)检测的信号量化图。
1：生物检测芯片
10：基底层
101：源极区
102：汲极区
103：通道区
11：固定区
ADC：电压转换器
BP：生物探针
BA：生物检测区
BL：生物检测层
BT：待检测物
D：共享汲极
EG：延伸闸极
EGS：延伸闸极表面
FG：空接闸极
I1～In：输出电流
LL：下层
M：电流测量器
MT：金属连接通道
OP：放大器
OUTPUT：输出端
PL：多晶硅氧化层
S：共享源极
S1～S5：检测步骤
TA：样品槽
T1～Tn,nmos：晶体管
UL：上层
VREF：参考电压
具体实施方式
有鉴于传统检测技术上的缺失，本申请将生物芯片导入检测技术中，以优化生物检测技术，生物芯片通过辨识组件与待测物相互作用产生能量上的变化，并将所述能量变化转化成信号以进行后续侦测及分析，其具有检测快速、操作方便及高灵敏度等效果。
应当理解的是，前述一般描述和下面的详细描述都是示例性和说明性的，但并非用以限制本申请所请的权利。本申请的一个或多个实施例的某些细节阐述于以下说明中。从以下代表性实施例的非穷举的列表中，亦从所附的权利要求中，本申请的其它特征或优点将是显而易见的。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域中的技术人员所通常理解相同的含义。
应注意的是，如本文中所使用，单数形式术语”一个”、”一种”及”所述”除非明确地限于一个指示物，否则包括多个指示物。除非上下文另外明确指出，否则术语”或”与术语”和/或”可互换使用。
本文所使用的”约”、”大约”或”近似”一词实质上代表所述的数值或范围位于20％以内，较佳为于10％以内，以及更佳者为于5％以内。于本文所提供的数字化的量为近似值，意旨若术语”约”、”大约”或”近似”没有被使用时亦可被推得。
本文所使用的”近似的距离”是指两个距离相等，或第二个距离约等于第一个距离，亦即第二个距离为第一个距离的正负10％以内。例如，第一距离为1公分，则与第一距离近似的第二距离为1公分或0.9至1.1公分。
如本文中所使用，词汇”包含”是开放式的，表示此类实施例可包含额外的元素。反之，词汇”由…组成”是封闭式的，表示此类实施例不包含额外的元素(痕量杂质除外)。词汇”基本上由…组成”是部分封闭式的，表示此类实施例还可包含非实质改变此类实施例的基本特征的元素。
如本文所用，术语”APTES-GA改质法”是指先经过3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)进行处理，再经过戊二醛(GA)处理的表面修饰制程；详细APTES-GA改质法请参阅本申请说明书内容。
如本文所用，术语”APTES-NHS改质法”是指先经过3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)进行芯片表面改质，再经过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)处理生物探针，以进行后续生物接枝的表面修饰制程；详细APTES-NHS改质法请参阅本申请说明书内容。
如本文所用，术语”APTES-Biotin改质法”是指先经过3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)进行芯片表面改质，再经过生物素(Biotin)处理生物探针，以进行后续生物接枝的表面修饰制程；详细APTES-Biotin改质法请参阅本申请说明书内容。
如本文所用，术语”GPTMS改质法”是指经过3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)进行处理的表面修饰制程；详细GPTMS改质法请参阅本申请说明书内容。
除非本文另有定义，否则用以与本文结合的科学与技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。本申请的方法与技术一般可根据本领域已知的常规方法进行。一般而言，本文所描述的用以连结以下技术的命名法，以及生物化学、酵素学、分子及细胞生物学、微生物学、遗传学与蛋白质及核酸化学及杂合反应的技术皆为本领域已知且经常使用者。除非另有说明，本申请的方法与技术一般可根据本领域已知的常规方法进行，且被描述于在本说明书中被引用且讨论的各种一般及更具体的参考文献中。
为利贵审查委员了解本申请的技术特征、内容与优点及其所能达成的功效，兹将本申请配合附图，并以实施例的表达形式详细说明如下，而所使用的图式，其主旨仅为示意及辅助说明书之用，未必为本申请实施后的真实比例与精准配置，故不应就所附的图式的比例与配置关系解读、局限本申请于实际实施上的权利范围，合先叙明。
A.生物检测芯片的结构
图1为本申请实施例的生物检测芯片示意图，如图所示，生物检测芯片1的晶体管可排列为数组的形式，且位于同一行的多个晶体管可并联连接，包含并联的n个晶体管T1～Tn，晶体管并联数量可视生物检测芯片1的需求而定。这些并联的晶体管T1～Tn结构包含上层UL及下层LL的结构，在下层LL部分，以晶体管T1为例，基底层10的结构包含共享源极S与共享汲极D，两者之间具有通道区，空接闸极FG设置在共享源极S与共享汲极D之间的通道区，空接闸极FG下设置多晶硅氧化层PL，空接闸极FG的X方框位置上设置金属连接信道MT，金属连接信道MT延伸至上层UL，如图1中X’方框对应的位置，金属连接信道MT上设置延伸闸极EG，通过金属连接通道MT，使得上层UL的延伸闸极EG电性连接至下层LL的空接闸极FG。
另外，晶体管T1的空接闸极FG与同一列下方相邻晶体管T1’的空接闸极FG，可分别以近似的距离靠近同一个共享汲极D，上述同一列下方相邻晶体管T1’的空接闸极FG和同一列再下方的相邻晶体管T1”的空接闸极FG，可分别以近似的距离靠近同一个共享源极S。
在本实施例中，延伸闸极EG为金属片状电极，其通过金属连接通道MT连接至覆盖的多晶硅氧化层PL，进而使得上层UL的延伸闸极EG可电性连接于空接闸极FG，在其他实施例中，延伸闸极EG也可为其他形状的金属电极，例如为螺旋状的电极。另一方面，并联的n个晶体管T1～Tn，也可设置多列而形成多个检测列结构，在各个检测列之间，相邻的检测列可以共享相邻的共享源极S或共享汲极D。当进行晶体管T1～Tn的量测时，由于这些晶体管T1～Tn为并联设置，共享源极S可连接至接地端，而共享汲极D连接至电流量测端，通过施加于延伸闸极EG的电压，量测汲极电流总和，以此来做为检测数据进行生物检测判断。
为进行生物检测，在这些晶体管T1～Tn的延伸闸极EG上会设置生物检测层BL，生物检测层BL能结合特定的检测目标，使得晶体管的电性改变，通过量测电流来判断是否具有对应的检测目标。生物检测层BL的设置请参阅图2A或图2B，其分别为图1中沿着虚线AA’的剖面示意图的两种具体实施例。生物检测芯片1包含多个检测列，多个检测列的晶体管均包含上层UL及下层LL的结构，而在上层UL的结构上还包含了生物检测层BL的结构。
如图2A与图2B所示，以晶体管Tn为例，其包含了共享源极S与共享汲极D，两者之间的通道区设置空接闸极FG，空接闸极FG通过金属连接通道MT电性连接延伸闸极EG。如图2A所示，于一具体实施例中，晶体管Tn的空接闸极FG与同一列相邻晶体管Tn’的空接闸极FG可分别与同一个共享汲极D的至少一部分重叠，上述同一列相邻晶体管Tn’的空接闸极FG和再一个与其同一列相邻晶体管Tn”的空接闸极FG可分别与同一个共享源极S的至少一部分重叠。如图2B所示，于另一具体实施例中，晶体管Tn的空接闸极FG与同一列相邻晶体管Tn’的空接闸极FG，是以近似的距离靠近同一个共享汲极D，所述同一列相邻晶体管Tn’的空接闸极FG和再一个与其同一列相邻晶体管Tn”的空接闸极FG，亦以近似的距离靠近同一个共享源极S。
生物检测层BL设置于延伸闸极EG上，延伸闸极EG表面上经由表面修饰制程产生一固定区11，固定区11是用于将多个生物探针BP固定，以利后续生物检测进行。
生物探针BP可为脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、抗体或适体(aptamer)等生物分子，其经由生物接枝固定于所述固定区11上。当进行生物检测时，通过这些生物探针BP与待检测物BT结合所产生的电荷，影响晶体管Tn检测的汲极电流信号，进而确认待检测物BT是否符合对应生物探针BP所欲检测的检测目标或数量。
生物检测芯片1可由多个并联的晶体管形成检测列，再由多个检测列形成检测数组，使得生物检测芯片1的生物检测芯片表面上形成多个生物检测区。为了使得这些生物检测区能容纳包含生物的待测溶液，生物检测层BL可设置包含容纳区域的样品槽TA，使得包含待测物BT的待测溶液能够容纳于生物检测区BA当中，并且让待测溶液能覆盖生物检测芯片1的延伸闸极表面EGS，使待测物OB能与生物检测层BL的生物探针BP接触及结合。在本实施例中，容置空间为样品槽TA的形式，但本申请不局限于此，在其他实施例中，生物检测区也可利用微流道的结构来形成容置及检测的空间。
综上所述，如图1、图2A及2B所示，本申请提供一种生物检测芯片1，其包含排列为一数组的多个晶体管，所述数组包含多个行(row)以及多个列(column)，每一个所述多个晶体管是设置于所述多个行之一以及所述多个列之一，每一个所述多个晶体管Tn个别包含：
一基底层10，包含一共享源极S、一共享汲极D及设置于所述共享源极S与所述共享汲极D之间的一通道区103；
一空接闸极FG，设置于所述通道区103，所述空接闸极FG包含一多晶硅氧化层PL；
一金属连接通道MT，设置于所述空接闸极FG上；
一延伸闸极EG，设置于所述金属连接通道MT上，所述延伸闸极EG是通过所述金属连接通道MT电性连接所述空接闸极FG；以及
一生物检测层BL，设置于所述延伸闸极EG上，所述生物检测层BL上包含一固定区11及至少一生物探针BP，所述生物探针BP固定于所述固定区11上。
在所述数组中，位于同一行的所述多个晶体管T1～Tn是并联连接，位于同一列的所述多个晶体管(Tn,Tn’,Tn”…)中，相邻两晶体管(如，Tn与Tn’)的各所述空接闸极FG，是分别以近似的距离靠近所述两晶体管的间的所述共享源极S或所述共享汲极D，或分别覆盖所述两晶体管之间的所述共享源极S或所述共享汲极D的至少一部分。
所述多个晶体管(Tn,Tn’,Tn”…)的所述生物检测层BL于一生物检测芯片1表面上形成多个生物检测区BA。
在本实施例中，延伸闸极EG表面上经由表面修饰制程产生一固定区11，所述固定区包含多个选自于由C3H8NO3Si、C8H14NO4Si及C6H11O5Si所组成的群组。
B.表面修饰制程
在本实施例中，所述表面修饰制程是选自于由APTES-GA改质法、APTES-NHS改质法、APTES-Biotin改质法以及GPTMS改质法所组成的群组。以下将配合图示阐释上述各表面修饰制程。
请参阅图3至图4，生物检测芯片1的制程首先于基底层10上形成源极区101、汲极区102、通道区103，并于通道区103上形成空接闸极FG，空接闸极FG下方包含多晶硅氧化层PL，设置在所述空接闸极FG上的金属连接通道MT进一步连接至延伸闸极EG。
请参阅图3A，图3A为本申请实施例的APTES-GA改质法的示意图，APTES-GA改质法具体内容包含：将封装后的芯片浸在丙酮中并以超音波震荡处理，再浸于95％乙醇中并以超音波震荡处理，接着以90-120℃烘烤，用以清洗所述延伸闸极的表面；施以氧电浆进行表面改质，使所述表面带有羟基；将所述生物检测芯片浸泡于3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)酒精溶液中处理约30分钟后，以超音波震荡清洗，经90-120℃烘烤脱醇，使得所述表面修饰上胺基；将所述生物检测芯片浸泡于戊二醛(GA)溶液中反应约30分钟，使得所述表面修饰上醛基；后续将具有氨基的多个生物探针BP经生物接枝结合于固定区11的醛基，使所述多个生物探针BP固定于所述固定区11；再以牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)等填塞剂(blocking agent)进行填塞(Blocking)及冲洗后，经氮气喷干，装上模具进行真空保存或后续检测。
经上述APTES-GA改质法进行表面修饰后，所述固定区包含多个如下所示的化学式：C8H14NO4Si。
请参阅图3B，图3B为本申请实施例的APTES-NHS改质法的示意图，APTES-NHS改质法具体内容包含：将封装后的芯片浸在丙酮中并以超音波震荡处理，再浸于95％乙醇中并以超音波震荡处理，接着以90-120℃烘烤，用以清洗所述延伸闸极的表面；施以氧电浆进行表面改质，使所述表面带有羟基；将所述生物检测芯片浸泡于3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)酒精溶液中处理约30分钟后，以超音波震荡清洗，经90-120℃烘烤脱醇，使得所述表面修饰上胺基；将带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的生物探针进行生物接枝反应约30分钟，使所述多个生物探针BP固定于所述固定区11，经超纯水冲洗后，以氮气喷干；再以牛血清白蛋白(BSA)等填塞剂进行填塞及冲洗后，以氮气喷干，装上模具进行真空保存或后续检测。
经上述APTES-NHS改质法进行表面修饰后，所述固定区包含多个如下所示的化学式：C3H8NO3Si。
请参阅图3C，图3C为本申请实施例的APTES-Biotin改质法的示意图，APTES-Biotin改质法具体内容包含：将封装后的芯片浸在丙酮中并以超音波震荡处理，再浸在95％乙醇中并以超音波震荡处理，接着以90-120℃烘烤，用以清洗所述延伸闸极的表面；施以氧电浆进行表面改质，使所述表面带有羟基；将所述生物检测芯片浸泡于3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)酒精溶液中处理约30分钟后，以超音波震荡清洗，经90-120℃烘烤脱醇，使得所述表面修饰上胺基；将带有生物素(Biotin)的生物探针进行生物接枝反应约30分钟，使所述多个生物探针BP固定于所述固定区11，经超纯水冲洗后，再以氮气喷干；再以牛血清白蛋白(BSA)等填塞剂进行填塞及冲洗后，以氮气喷干，装上模具进行真空保存或后续检测。
经上述APTES-Biotin改质法进行表面修饰后，所述固定区包含多个如下所示的化学式:C3H8NO3Si。
在某些具体实施例中，亦可将3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)替换为环氧树脂(Epoxy)溶液，以将晶圆修饰上活性层。
请参阅图4，图4为本申请实施例的GPTMS改质法的示意图，GPTMS改质法具体内容包含：清洗延伸闸极表面EGS，再施以氧电浆进行芯片表面改质，使延伸闸极表面EGS带有羟基(-OH)；将生物检测芯片浸泡于无水乙醇配置的3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)中，再浸于无水乙醇中进行超音波震荡清洗，清洗后以90-120℃进行烘烤；后续以带有氨基(-NH2)的生物探针BP进行生物接枝反应，使所述多个生物探针BP固定于所述固定区11，经超纯水冲洗后，以氮气喷干；再以牛血清白蛋白(BSA)等填塞剂进行填塞及冲洗后，以氮气喷干，即可进行真空保存或后续检测。
经上述GPTMS改质法进行表面修饰后，所述固定区包含多个如下所示的化学式:C6H11O5Si。
C.生物检测方法
请参阅图5本申请一实施例的生物检测方法的流程图，并配合参阅图2A或2B。在本实施例中，生物检测芯片1可包含前述的多个并联晶体管T1～Tn所形成的检测列或多个检测列，通过生物检测芯片1对一待测样品进行生物检测，其检测方法包含以下步骤(S1～S5)：
步骤S1：提供一如本申请所述的生物检测芯片1。选定一欲检测目标，将所述欲检测目标的对应生物探针BP固定于固定区11上，通过更换本申请所述的生物检测芯片中的生物探针，即可达到检测不同欲检测目标的功能。
步骤S2：将空白样品置于多个生物检测区BA，量测多个晶体管的闸极电压及汲极电流以建立标准线。请参阅图6，图6为本申请实施例的生物检测方法的电路示意图。如图6所示，生物检测芯片包含并联的晶体管nmos所形成的检测列，其共享源极S可连接至接地端，共享汲极D则连接至电流测量器M，闸极则延伸至延伸闸极EG。当空白样品，如中性缓冲液置于生物检测区后，覆盖延伸闸极EG上的生物检测层BL，此时通过对延伸闸极EG施加不同闸极电压，例如提供由0V至2V的电压，由电流测量器M量测共享汲极D的输出电流I1～In，由于晶体管nmos是并联方式，输出电流I1～In的总和可经由电压转换器ADC转换成数字信号，由输出端OUTPUT输出汲极电流信息，建立量测的标准线。
在本实施例中，生物检测方法所适用的生物检测芯片还包含放大器OP，放大器OP的输入端分别连接参考电压VREF及并联的共享汲极D，输出端耦接于晶体管nmos的控制端，晶体管nmos则耦接于电流测量器M。在其他实施例中，共享源极S与共享汲极D也可以接点外接至电压源及信号收集装置，通过外部装置收集汲极电流信息。
步骤S3：将待测样品置于多个生物检测区BA，放置预定时间。将包含待测样品的溶液注入生物检测区BA，例如置于样品槽当中，静置一段时间使得待测样品能与生物检测层BL的生物探针BP结合。待测样品的放置时间可依据欲检测的目标有所差异。
步骤S4：以空白样品冲洗多个生物检测区BA。为使待测样品能与生物探针BP更有效的结合，可在放置预定时间后，冲洗生物检测区BA，重新再放置待测溶液，经过多次的冲洗及置放，确保待测样品结合的数量。在本实施例中，并不限定冲洗的次数，其可依据待测样品浓度及生物探针BP结合特性加以调整。
步骤S5：量测多个晶体管的闸极电压及汲极电流以建立量测线，将量测线与标准线比较以判断待测样品是否包含欲检测目标。当完成上述冲洗及置放结合的程序后，再次通过对延伸闸极EG施加不同闸极电压，由电流测量器M量测共享汲极D的输出电流I1～In，将输出电流I1～In的总和经由电压转换器ADC转换成数字信号，由输出端OUTPUT输出汲极电流信息，建立待测样品的量测线。比较量测线与标准线的差异，通过差异的变化量判断待测样品是否包含欲检测目标。若是量测线并无明显偏移，则表示待测溶液中不包含欲检测目标，也就是生物探针BP并未与待测样品结合，并不会影响芯片闸极的电荷。相对地，若是偏移量超过预定范围，则判断待测样品中包含欲检测目标。
在某些具体实施例中，欲检测目标为猪繁殖与呼吸障碍症候群病毒(PRRSV)、猪流行性下痢病毒(PEDV)或皮质醇(Cortisol)。然而，本申请所述生物检测芯片1仅需更换不同的生物探针BP，即能将芯片应用在不同的检测目标上；且本申请所述生物检测芯片1亦能检测许多类型的待测样品，例：人类唾液、血液中的细菌与蛋白质等样品。
本申请进一步通过以下的实施例阐释，其不应以任何方式被解释为进一步的限缩。本申请案中引用的所有引用文件(包括参考文献、核准的专利、公开的专利申请，以及一同在申请中的专利申请案)的整体内容，在此通过引用的方式明确地并入本申请中。
在某些具体实施例中，于电性量测时，会从样品槽给予一个0V-2V的电压(0,0.03,0.06…2V)或1.5V-3V的电压，依不同欲检测目标而定，共计63个电压值，量测软件会纪录每个电压下，感应区传递到半导体组件的电压值，并给出63组数值，依照数值做图以产生电性曲线图。另外，于图式中所使用的述语”芯片信号值”是将信号进行量化，所述量化是通过梯行公式计算，所述梯行公式计算是用来计算标准曲线与样品曲线之间的面积值，计算方式如下所示:|((Target2+Target1)*1/2)-((Baseline2+Baseline1)*1/2))|+|((Target3+Target2)*1/2)-((Baseline3+Baseline2)*1/2))|+…+|((Target63+Target62)*1/2)-((Baseline63+Baseline62)*1/2))|。
实施例1猪繁殖与呼吸障碍症候群病毒(PRRSV)检测
实施例1.1抗体探针检测
在本实施例中，欲检测目标为猪繁殖与呼吸障碍症候群病毒(PRRSV)；本实施例的生物检测芯片经APTES-GA改质法进行表面修饰。
在本实施例的一实验中，使用抗体(PRRSV-N Protein antibody，Biorbyt公司，英国，产品编号：orb526689)作为生物探针；本实施例所使用的待测样品为PRRSV纯化病毒蛋白质样品及PEDV纯化病毒蛋白质样品，蛋白质样品制备以磷酸盐缓冲生理盐水(Phosphatebuffered saline，PBS)进行序列稀释后，以放射免疫沉淀法缓冲液(Radioimmunoprecipitation assay buffer，RIPA)进行细胞裂解(lysis)，反应时间15分钟，置备完的蛋白质样品进一步以25mM Tris-HCl缓冲液稀释，稀释完成后，待测样品的病毒蛋白质浓度分别为1fg/mL PEDV(样品1，作为负对照组(negative control))、0.1fg/mLPRRSV(样品2)、100fg/mL PRRSV(样品3)、100pg/mL PRRSV(样品4)，以及100ng/mL PRRSV(样品5)。上述样品用于测试本申请的生物检测芯片对于猪繁殖与呼吸障碍症候群病毒(PRRSV)的蛋白质检测效力。
在某些具体实施例中，所述生物探针为抗PRRSV抗体，所述抗体可为单株或多株抗体，抗PRRSV抗体的实例可包含，但不限于PRRSV-N Protein antibody(Biorbyt公司，英国，产品编号：orb526689)、Recombinant Mouse Anti-PRRSV ORF7 Antibody(ICA7)(CreativeBiolabs公司，美国，产品编号：EPAF-0626LC)或PRRSV-GP5 Polyclonal Antibody(Bioss公司，美国，产品编号：BS-4504R)。
本实施例的具体实验流程包含：首先，在样品槽中注入空白样品(双三丙烷，Bis-tris propane，BTP)100μL，室温静置约10分钟之后，进行电性量测，以建立标准曲线(Baseline)；取100μL待测样品滴进样品槽内，室温静置约30分钟进行反应；静置后，移除待测样品并冲洗样品槽；后续再将空白样品(BTP)注入样品槽中，室温静置约10分钟后，进行电性量测，取得样品量测结果，将标准线与样品量测结果进行比对分析。
实验结果请参阅图7A，经量测后所得的电性曲线图显示，PRRSV纯化病毒蛋白质样品(样品2至样品5)的电性曲线与标准曲线(Baseline)相比有明显偏移的现象，且待测样品的病毒蛋白质浓度越高，则电性曲线偏移量越大，显示本申请的生物芯片具有检测猪繁殖与呼吸障碍症候群病毒(PRRSV)的效力，同时具有类似于定量的效果，而PEDV样品(样品1，负控制组)的电性曲线非常接近标准曲线，显示本申请的生物检测芯片对于PRRSV检测具有良好的专一性。另外，将信号进行量化后，其结果如图7B所示，本申请的生物检测芯片在至少含有0.1fg/mL的PRRS病毒蛋白质浓度(样品2)下就能检测到信号，显示其具有高度的灵敏性。
实施例1.2核酸探针检测
在本实施例中，欲检测目标为猪繁殖与呼吸障碍症候群病毒(PRRSV)；本实施例的生物检测芯片经GPTMS改质法进行表面修饰。
在本实施例的一实验中，使用核酸探针作为生物探针，所述生物探针包含如SEQID NO:1至SEQ ID NO:11中的至少一种所示的核苷酸序列；本实施例所使用的待测样品为含有PRRSV的猪血清样品。所述样品以PBS进行序列稀释后，以VLL缓冲液(LabTurboTM VirusMini Kit，型号：LVN480-200，列特博生技股份有限公司，台北，中国台湾)进行裂解，反应时间为15分钟。制备完的样品进一步以25mM Tris-HCl缓冲液进行稀释；稀释完成后，待测样品中PRRS病毒的RNA浓度分别为0.24copies/μL PRRSV(样品6)及240copies/μLPRRSV(样品7)。而负对照组样品则仅具有缓冲液。上述样品用于测试本申请的生物检测芯片对于猪繁殖与呼吸障碍症候群病毒(PRRSV)的RNA片段检测效力。
本实施例的具体实验流程如实施例1.1所述。
实验结果请参阅图7C，经量测后所得的电性曲线图显示，PRRSV猪血清病毒液RNA样品(样品6及样品7)的电性曲线与标准曲线(Baseline)相比有明显偏移的现象，且待测样品的病毒RNA浓度越高(样品7>样品6)，则电性曲线偏移量越大，显示本申请的生物芯片具有检测猪繁殖与呼吸障碍症候群病毒(PRRSV)的效力，同时具有类似于定量的效果；另外，将信号进行量化后，其结果如图7D所示，本申请的生物检测芯片在待测样品的PRRS病毒RNA浓度为至少0.24copies/μL的状态下就能检测到明确的病毒信号；反观若以0.24copies/μL的PRRS病毒RNA样品进行传统qPCR检测，其Ct值需大于36以上才能检测到信号，显示本申请的生物检测芯片相较传统的检测技术具有高度的灵敏性。
在本实施例中，本申请所述的生物检测芯片是用于检测猪繁殖与呼吸障碍症候群病毒(PRRSV)，所述生物探针包含如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中的至少一种所示的核苷酸序列。
实施例2猪流行性下痢病毒(PEDV)检测
在本实施例中，欲检测目标为猪流行性下痢病毒(PEDV)；本实施例的生物检测芯片经APTES-NHS改质法进行表面修饰。
在本实施例的一实验中，使用核酸探针作为生物探针，所述生物探针包含如SEQID NO:12至SEQ ID NO:15中的至少一种所示的核苷酸序列，本实施例所使用待测样品的制备方法是以VLL裂解液(LabTurboTM Virus Mini Kit，型号：LVN480-200)对各病毒样本进行裂解，反应时间10分钟，以获得各病毒样本的裂解液，的后再以25mM Tris-HCl缓冲液进行稀释调整浓度以进行后续实验；并将各待测样品进行检测，以测试本申请的生物检测芯片对于猪流行性下痢病毒(PEDV)的检测效力。
本实施例的具体实验流程如实施例1.1所述，除了于本实施例中空白样品(BTP)与待测样品的静置时间分别为5分钟与15分钟。
实验结果请参阅图8A，本实验中各待测样品分别为猪流行性下痢病毒样品(PEDV)、大肠杆菌样品(Escherichia coli，E.coli)、猪霍乱沙门氏菌样品(Salmonellacholeraesuis，Sal.C)、猪丁型冠状病毒样品(swine delta coronavirus，SDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒样品(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)及轮状病毒样品(Rotavirus，RVs)，用以测试本申请的生物检测芯片的专一性；猪流行性下痢病毒样品(PEDV)具有最强的信号，而其他裂解后的病原体样品如大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌(Sal.C)、猪丁型冠状病毒(SDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)及轮状病毒(RVs)的信号皆明确小于猪流行性下痢病毒样品，显示本申请的生物检测芯片具有检测猪流行性下痢病毒(PEDV)的效力，且具有高度的专一性。
在本实施例的一实验中，进一步测试不同阴性(不含PED病毒)样品类型的背景值，以测试不同样品类型是否会影响信号的表现，本实验重复6次(n＝6)，实验结果请参阅图8B，不含PED病毒的直肠拭子样品、回肠内容物样品、粪便样品与小肠黏膜乳剂样品的背景信号值皆显著低于裂解后的PED病毒液(猪流行性下痢病毒样品)，显示本申请的生物芯片能检测不同类型的样品，而不易受背景信号干扰。
在本实施例的一实验中，将PED病毒样品(PEDV)进行不同程度的稀释后进行测试，以检测不同样品浓度下的信号强度；PED病毒样品的RNA浓度以qPCR进行定量，再进行序列稀释，检测样品包含空白样品(Blank)、1.5x102copies/μL PEDV(样品1)、1.5x105 copies/μL PEDV(样品2)及1.5x108copies/μL PEDV(样品3)，再以本实施例所述生物检测芯片对各样品进行检测。
实验结果请参阅图8C，本实施例所述生物检测芯片可检测到含有至少1.5x102copies/μL的RNA浓度的猪流行性下痢病毒(PEDV)样品，显示本申请的生物芯片具有高度的灵敏性，且样品的PED病毒RNA浓度越高(样品3>样品2>样品1)，则有越强的信号，亦显示本申请所述生物检测芯片具有类似于定量的效果。
实施例3皮质醇(Cortisol)检测
在本实施例中，欲检测目标为皮质醇(Cortisol)；本实施例的生物检测芯片经APTES-Biotin改质法进行表面修饰。
在本实施例的一实验中，使用皮质醇特异性抗体作为生物探针，所述生物探针为抗皮质醇的抗体(Anti-Cortisol antibody[F4P1A3]，Abcam公司，英国)，并将待测样品进行检测，以测试本申请的生物检测芯片对于皮质醇(Cortisol)的检测效力。待测样品包含空白样品(Blank)、不含皮质醇的样品(控制组样品，Quality Control)、含0.1μg/dL皮质醇浓度的样品(样品1)及含6μg/dL皮质醇浓度的样品(样品2)。
本实施例的具体实验流程如实施例1.1所述，除了于本实施例中待测样品的静置时间为15分钟。
实验结果请参阅图9A，经量测后所得的电性曲线图显示，含有皮质醇的样品(样品1及样品2)的电性曲线与标准曲线(Baseline)相比有明显偏移的现象，且待测样品皮质醇浓度越高(样品2>样品1)，则电性曲线偏移量越大，显示本申请的生物芯片具有检测皮质醇的效力，同时具有类似于定量的效果；另外，将信号进行量化后，其结果如图9B所示，本申请的生物检测芯片在含有至少0.1μg/dL的皮质醇浓度下(样品1)就能检测到信号，其具有高度的灵敏性，且越高浓度的皮质醇样品则有越显著的信号，显示本申请的生物芯片同时具有类似于定量的效果。
所述生物探针为抗皮质醇抗体，所述抗体可为单株或多株抗体。
综上所述，根据本申请实施例的实验结果所示，本申请所述的生物检测芯片确实具有检测猪繁殖与呼吸障碍症候群病毒(PRRSV)、猪流行性下痢病毒(PEDV)及皮质醇(Cortisol)的功效，且相较于传统检测流程，本申请所述的生物检测芯片具有高专一性、高灵敏度、高准确度、流程简单、操作方便、检测快速及定量的能力，可有效解析生命现象、探究生理活动和疾病过程，以进一步寻求后续治疗方案及改善方式等，在生命科学、临床诊断和食品安全等领域皆具有广泛的应用前景。
本申请所提供的生物检测芯片以猪繁殖与呼吸障碍症候群病毒(PRRSV)、猪流行性下痢病毒(PEDV)或皮质醇(Cortisol)检测为实施例进行说明与解析，然而本申请所提供的生物检测芯片除上述检测外，其余应用也应涵盖于本申请所宣称的范围内。
上列详细说明是针对本申请的一可行实施例的具体说明，然而该实施例并非用以限制本申请的专利范围，凡未脱离本申请技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本申请的专利范围中。

Claims (11)

1.一种生物检测芯片，其包含排列为一数组的多个晶体管，所述数组包含多个行以及多个列，每一个所述多个晶体管是设置于所述多个行之一以及所述多个列之一，每一个所述多个晶体管个别包含：
一基底层，包含一共享源极、一共享汲极及设置于所述共享源极与所述共享汲极之间的一通道区；
一空接闸极，设置于所述通道区，所述空接闸极包含一多晶硅氧化层；
一金属连接通道，设置于所述空接闸极上；
一延伸闸极，设置于所述金属连接通道上，所述延伸闸极是通过所述金属连接通道电性连接所述空接闸极；以及
一生物检测层，设置于所述延伸闸极上，所述生物检测层上包含一固定区及至少一生物探针，所述生物探针固定于所述固定区上；
其特征在于，所述多个晶体管的所述生物检测层于一生物检测芯片表面上形成并联的多个生物检测区；
设置于所述数组的同一行的所述多个晶体管是并联连接；
设置于所述数组的同一列的两相邻晶体管的各所述空接闸极是分别以近似的距离靠近所述两相邻晶体管之间的所述共享源极或所述共享汲极，或分别覆盖所述两相邻晶体管之间的所述共享源极或所述共享汲极的至少一部分。
2.如权利要求1所述的生物检测芯片，其特征在于所述固定区是于所述延伸闸极表面上经由表面修饰制程所得，所述表面修饰制程是选自于由3-氨基丙基三乙氧基硅烷-戊二醛改质法、3-氨基丙基三乙氧基硅烷-N-羟基琥珀酰亚胺改质法、3-氨基丙基三乙氧基硅烷-生物素改质法以及3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷改质法所组成的群组。
3.如权利要求1所述的生物检测芯片，其特征在于所述固定区包含多个选自于由C3H8NO3Si、C8H14NO4Si及C6H11O5Si所组成的群组。
4.如权利要求1所述的生物检测芯片，其特征在于所述生物探针包含脱氧核糖核酸、核糖核酸、抗体或适体。
5.如权利要求1所述的生物检测芯片，其特征在于所述生物检测芯片是用于检测猪繁殖与呼吸障碍症候群病毒，所述生物探针包含如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中的至少一种所示的核苷酸序列。
6.如权利要求1所述的生物检测芯片，其特征在于所述生物检测芯片是用于检测猪流行性下痢病毒，所述生物探针包含如SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:15中的至少一种所示的核苷酸序列。
7.如权利要求1所述的生物检测芯片，其特征在于所述生物检测芯片是用于检测皮质醇，所述生物探针为抗皮质醇的抗体。
8.一种生物检测方法，是利用生物检测芯片对一待测样品进行生物检测，其特征在于,所述生物检测方法包含：
提供一如权利要求1所述的生物检测芯片；
将一空白样品置于并联的所述多个生物检测区，量测所述多个晶体管的一闸极电压及一汲极电流以建立一标准线；
将一待测样品置于所述多个生物检测区，放置一预定时间；
以所述空白样品冲洗所述多个生物检测区；
量测所述多个晶体管的所述闸极电压及所述汲极电流以建立一量测线，将所述量测线与所述标准线比较以判断所述待测样品是否包含一欲检测目标。
9.如权利要求8所述的生物检测方法，其特征在于所述欲检测目标为猪繁殖与呼吸障碍症候群病毒，所述生物探针包含如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中的至少一种所示的核苷酸序列。
10.如权利要求8所述的生物检测方法，其特征在于所述欲检测目标为猪流行性下痢病毒，所述生物探针包含如SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:15中的至少一种所示的核苷酸序列。
11.如权利要求8所述的生物检测方法，其特征在于所述欲检测目标为皮质醇，所述生物探针为抗皮质醇的抗体。
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