CN117512095A - 耳聋相关基因检测引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请属于基因检测技术领域，具体涉及一种耳聋相关基因的引物组、试剂盒及其应用。本申请基于二代测序，覆盖180个致病突变位点，涉及基因和基因突变位点范围广，覆盖更多的突变位点。相对常规20个位点的筛查项目，本申请对于新生儿耳聋基因筛查可提高耳聋基因突变检出率29％以上，检测覆盖度广。同时，本申请采用单碱基分辨率，对于PCR、基因芯片等技术难以区分的GJB2基因的c.94C>T和c.94C>A、c.250G>C和c.250G>T、c.35del和c.35dup，MYO7A基因的c.397del和c.397dup等，检测可准确区分和检测，检测灵敏度高。

Description

耳聋相关基因检测引物组、试剂盒及其应用

技术领域

本申请属于基因检测技术领域，具体涉及一种耳聋相关基因检测引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

耳聋是一种听觉系统中传音、感音，以及听觉传导通路中的听神经或各级中枢的其中之一或部分发生病变，导致听觉功能障碍、听力减退的疾病，是人类最常见的感觉障碍性疾病之一。

目前研究发现，约60％的耳聋由遗传所致，但大部分情况下无法根据临床表现作出病因诊断。遗传性耳聋异质性较高，包含综合征型和非综合征型耳聋，分别占30％和70％，其中非综合征型耳聋主要包括常染色体显性遗传性耳聋、常染色体隐性遗传性耳聋、X连锁遗传性耳聋和线粒体遗传性耳聋，分别占非综合征性遗传性耳聋的80％、15％、1％～4％和1％。

流行病学统计结果还显示，正常听力人群耳聋基因突变携带率为4％～6％，80％～90％的耳聋患儿是由听力正常的父母所生。因此对新生儿的耳聋基因进行筛查，有助于耳聋的早发现、早诊断、早干预，同时为预防药物性耳聋提供重要的参考信息。对正常人群的，尤其是将要生育后代的夫妇进行耳聋基因的携带者筛查，可为耳聋的产前诊断提供了必不可少的信息，是避免耳聋患儿出生，预防出生缺陷的重要手段。

但是基因突变异质性较高，涉及的基因和突变位点较多，耳聋数据库Deafness、Variation、Database(DVD)显示耳聋致病基因多达224个，超过8000个致病和可能致病突变位点。因此对耳聋基因的筛查需要考虑建立一种高通量、高效率、兼顾性价比的耳聋基因突变检测方法，以实现大规模的产前筛查和新生儿筛查。

目前，耳聋基因检测传统上基于聚合酶链式反应(PCR)、一代测序(sanger测序)、变性高效液相色谱分析、(DHPLC)、基因芯片等，然而这些检测方法存在检测基因位点较少(目前主流的耳聋基因筛查试剂盒的检测基因位点在10个～25个之间)，通量较低，对药物性耳聋相关的基因位点检测灵敏度不高等局限性，同时对同一个基因位点的不同突变类型，基于PCR、基因芯片等方法学还可能存在无法区分或存在漏检等情况。对于罕见或未知致病变异，基于PCR和基因芯片等非测序技术无法检出，存在检测灵敏度与覆盖度低的技术问题。

发明内容

基于此，本申请一实施例提供一种耳聋相关基因检测引物组以解决传统技术中对于耳聋相关基因检测灵敏度与覆盖度低的问题。

本申请一方面提供一种检测耳聋相关基因的引物组，所述引物组包括针对下述180个突变位点进行设计的引物:

在其中一个实施例中，所述引物组包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.162所示的引物。

本申请另一方面还提供一种耳聋相关基因检测试剂盒，包括所述的引物组。

在其中一个实施例中，所述引物组中的每条引物的5’端连接有建库测序所需的通用序列。

在其中一个实施例中，所述通用序列包括公共引物、接头和特异性标签。

本申请还提供一种耳聋相关基因的建库方法，包括以下步骤：

利用权利要求1所述的引物组或权利要求2～5任一项所述的试剂盒，对模板DNA进行多重PCR扩增，获得扩增子文库，对扩增子文库进行混合、纯化，获得耳聋相关基因的文库。

在其中一个实施例中，所述多重PCR扩增包括第一次PCR扩增耳聋基因位点序列与第二次PCR扩增加入样本特异性的序列。

在其中一个实施例中，所述第一次PCR扩增的引物包括YK DF panel Mix；第二次PCR扩增的引物包括B1-index M、B1-index N。

在其中一个实施例中，所述第一次PCR扩增的反应条件为：93℃～95℃，2min～4min；5～7个循环扩增，每个循环为94℃～96℃，8s～12s，56℃～60℃，4min～6min，66℃～70℃，28s～32s；3℃～5℃保持；

所述第二次PCR扩增的反应条件为：93℃～95℃，2min～4min；14～16个循环扩增，每个循环为97℃～99℃，8s～12s，58℃～62℃，28s～32s，66℃～70℃，28s～32s；66℃～70℃，4min～6min；3℃～5℃保持。

本申请还提供所述建库方法获得的耳聋相关基因的文库。

与传统技术相比，本申请具有如下有益效果：

本申请基于二代测序，覆盖180个致病突变位点，涉及基因和基因突变位点范围广，覆盖更多的突变位点。相对常规20个位点的筛查项目，本申请对于新生儿耳聋基因筛查可提高耳聋基因突变检出率29％以上，检测覆盖度广。

同时，本申请采用单碱基分辨率，对于PCR、基因芯片等技术难以区分的GJB2基因的c.94C>T和c.94C>A、c.250G>C和c.250G>T、c.35del和c.35dup，MYO7A基因的c.397del和c.397dup等，检测可准确区分和检测。对于线粒体基因组，覆盖常见的药物性耳聋基因突变，测序深度在5000×以上，检测下限为1％突变丰度，对于线粒体基因突变，本申请能够检出一代测序可能无法检出的突变丰度低于10％的线粒体突变，其中丰度最低的为3％的突变其次，检测灵敏度高。

具体实施方式

下面结合实施方式和实施例，对本申请作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为充分地理解，应理解，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。

除非另有定义，本申请所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

术语

在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非与本申请的申请目的和/或技术方案相冲突，否则，本申请涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本申请中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本申请中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本申请为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。

本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

术语“及/或”或“和/或”均是指包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

术语“基因”是指编码产生氨基酸多肽链的DNA区段，它包括参与基因转录/翻译和转录/翻译调控的位于编码区和非编码区的序列，以及外显子和内含子序列。

术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本公开内容中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。

术语“测序深度”：例如在本申请的一个实施方案中，测序深度为100×，即代表该条特异PCR扩增产物被测序100次。

随着高通量测序(NGS)技术的发展和测序成本的降低，利用高通量测序的方法检测100个以上的耳聋基因高频突变位点的筛查已经成为可能。基于NGS技术的耳聋基因检测有几个重要的优势，包括：检测通量高，更容易开展大规模人群筛查；检测位点数量较多，不仅可针对最常见的20个位点进行筛查，还可以覆盖相对常见的位点，甚至可检测罕见或未知的新发位点；对线粒体基因组的突变位点检测灵敏度更高；单碱基分辨率，可以区分同一个位点的不同突变类型，提高检测准确性等。

基于NGS技术的检测，一般需要对靶基因或热点位点进行富集和捕获，构建NGS文库后，进行上机测序。根据靶基因/位点的捕获的差异，又分为液相芯片捕获法和多重PCR扩增法两种方法学。其中多重PCR扩增建库法适用于基因和位点数量适中(一般来说1000个位点以下)的基因的检测，其检测准确性较高，同时相对于液相芯片捕获法具有更高的性价比和成本优势。

本申请基于二代测序检测技术，与其他耳聋基因筛查方法相比，具有以下优点：

1、基于二代测序，覆盖180个致病突变位点，涉及基因和基因突变位点范围广，覆盖更多的突变位点，可显著提高耳聋基因突变的检出率。

2、基于多重PCR建库方法，每例样本数据量较低，可用于低通量测序仪、中通量测序仪，通量灵活。

3、采用多重PCR建库方法，相对于液相芯片捕获法建库，检测步骤较少、检测时间较短，检测成本低。

4、对于线粒体基因组，覆盖常见的药物性耳聋基因突变，测序深度在5000X以上，检测下限为1％突变丰度，对于线粒体基因突变，检测灵敏度更高。

5、单碱基分辨率，对于PCR、基因芯片等技术难以区分的GJB2基因的c.94C>T和c.94C>A、c.250G>C和c.250G>T、c.35del和c.35dup，MYO7A基因的c.397del和c.397dup等，检测可准确区分和检测。

综上所述，本申请主要提供了覆盖更多耳聋基因和突变位点、检测灵敏度更高、检测性价比更高的解决方案。

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

实施例1

本申请采用的具体方案如下：

一、引物设计与合成

本申请对一些常见的耳聋基因进行了筛选，共筛选出GJB2、GJB3、COL11A1、KCNJ10、USH2A、PCDH15、CDH23、MYO7A、TECTA、DIABLO、GJB2、COCH、MYO15A、USH1G、OTOF、PJVK、SOX10、WFS1、DSPP、ADGRV1、TCOF1、GSDME(DFNA5)、SLC26A4、TMC1、PRPS1、COL4A5、MT-RNR1、MT-TL1、MT-CO1、MT-TS1、MT-TH、MT-TE等31个基因，共180个基因位点(见附表1)，其中包括25个核基因(171个位点)和5个线粒体基因(9个位点)。在筛选完成后，对以上基因位点进行多重引物设计。此外，引物设计还覆盖了GJB2、GJB3、SLC26A4三个常见基因的蛋白编码区。具体检测位点如表1所示。

表1

根据设计完成的引物序列进行引物合成，并混为一个pool，命名为YK DF panelMix，引物如表2所示。

表2

二、样本前处理与核酸提取

本申请涉及样本类型包括EDTA抗凝血和新生儿干血片。对于EDTA抗凝管保存的外周血2mL，48小时内处理置于2℃～8℃保存，长期保存需置于-20℃或-80℃；对于干血片，需要至少2个8mm直径的新生儿足跟血的干血斑。

核酸提取，对于外周血样本，取EDTA抗凝血200μL，采用广州达安基因股份有限公司的酸提取或纯化试剂(磁珠法)(货号：DA0643)进行核酸提取，也可以采用其他类似的核酸提取试剂盒。对于干血片样本，取3mm打孔器取4～6片干血片或用其他规格打孔器取面积不小于28mm²的干血片，置于1.5mL无菌离心管中，加入200μL消化液，20μL蛋白酶K，55℃温育40min后，再转移液体至另一个1.5mL无菌离心管，并加入325μL裂解液，震荡混匀后65℃温育20min。再采用广州达安基因股份有限公司的酸提取或纯化试剂(磁珠法)(货号：DA0643)进行核酸提取。

核酸提取后如未立即继续后续实验，可置于-20℃保存。

三、建库测序

本申请采用多重PCR建库，相对于液相芯片捕获法建库，检测步骤较少、检测时间较短，同时由于采用多重PCR建库，可较为容易地适配自动化建库工作站，可自动化大规模筛查。

多重PCR扩增建库，采用KAPA多重PCR建库试剂盒进行多重PCR建库，第一步扩增引物为YK DF panel Mix，其目的为扩增耳聋基因位点序列。第二步扩增加入引物为B1-indexM和B1-index N，其目的为在扩增产物序列中加入样本特异性的Barcode序列，以识别不同的样本。其中不同的中M和N分别为1～16和1～24，不同编号的Barcode序列存在10个碱基的差异。

(1)第一步扩增的DNA模板量为50ng，反应体系包括：KAPA多重PCR Enzyme Mix(1.0U/ul)1μL，KAPA 2x PCR Buffer 12.5μL，YK DF panel Mix 2μL，样本核酸(DNA)1～5μL，无核酸酶水补足至10μL。扩增程序为：预变性：94℃3min；扩增，(95℃10s，58℃5min，68℃30s)*6个循环；hold：4℃。

(2)第一步扩增产物的纯化：以KAPAHyperPure beads(1.2×)吸附第一步扩增产物，并以80％乙醇洗涤两次，尽量吸弃管中剩余的80％乙醇，室温放置至干燥，最后以20μL的无核酸酶水重悬磁珠洗脱为纯化产物，置于-20℃冰箱。

(3)第二步扩增反应，反应体系为：KAPA 2x PCR Buffer 25μL，KAPA多重PCREnzyme Mix(1.0U/ul)1μL，第一步纯化后产物18μL，B1-index M 1μL，B2-index N 1μL，无核酸酶水补足至50μL。

第二步扩增反应条件为：预变性：94℃3min；扩增：(98℃10s，60℃30s，68℃30s)*15个循环；延伸：68℃5min；hold：4℃。

(4)第二步扩增产物的纯化：以KAPAHyperPure beads(1.2×)吸附第一步扩增产物，并以80％乙醇洗涤两次，尽量吸弃管中剩余的80％乙醇，室温放置至干燥，最后以50μL的无核酸酶水重悬磁珠洗脱为纯化产物。

(5)Qubit3.0测定文库浓度，进行Agilent 2100检测，正常文库主峰片段为380bp，无接头及大片段污染为质控合格。此时的洗脱产物已是可上机的文库，置于-20℃冰箱中长期储存。

(6)上机测序，根据测序仪的通量和文库总量要求，以及样本文库的浓度情况，将所有样本的文库按照一定数据量分配完成混池(pooling)，使用Nextseq 500测序仪(Illumina)双端150bp测序(PE150)，得到样本的双端测序数据。

四、数据分析

(1)原始数据过滤，使用fastp过滤软件(Shifu Chen，et a1)去除低质量、含接头、polyG序列。

(2)数据比对，使用bwa软件(Li H，et al)将过滤后的数据与参考基因组hg19比对，并使用GATK软件对比对后的结果进行碱基质量校正。

(3)变异识别，使用GATK软件对比对到参考基因组的序列进行变异识别(variantcalling)，并根据质量值、测序深度、变异丰度等对变异进行过滤。

(5)数据注释，将所有变异以自建数据库进行变异注释，包括变异对应的基因、突变位置、变异在核苷酸和氨基酸层面的改变、致病等级和关联疾病等。

实施例2

基于本申请的对检测范围内基因变异位点的检测参数和性能。

采集105份新生儿足跟血的干血片，按照上述技术方案进行样本前处理、核酸提取、文库构建、上机测序和数据分析，得到所有样本的数据质控和检测结果。具体质控见表3。

从数据质控来看，本申请对于检测范围内的耳聋基因突变位点的数据覆盖较为均一，可以满足检测范围内所有位点的突变检测。同时，105例样本的数据合格率100％，说明本申请对于干血片样本的耳聋基因检测成功率高。

同时，性能验证还分析了10例有预期结果(一代测序验证)的临床样本，本申请检出结果与预期结果的符合率为100％，其中准确检出了GJB2 c.35del和GJB2 c.94C＞T(见表4)。

表3：105例新生儿样本的数据质控

参数	数值	参考范围
			下机总数据量(base)	平均103.7Mb	-
Q30比例	平均97.02％，最低91.70％	≥85％
			数据回帖率(mapping rate)	平均99.21％，最低98.74％	≥95％
核基因平均测序深度	平均1779X，最低986X	≥500X
			核基因50×覆盖度	平均100％，最低100％	≥98％
线粒体基因平均测序深度	平均16160X，最低7540X	≥3000X
			线粒体基因500X覆盖度	平均99.16％，最低98.76％	≥95％

表4：10例临床样本的检测一致性分析

本申请具有单碱基分辨率，对于PCR、基因芯片等技术难以区分的GJB2基因的c.94C>T和c.94C>A、c.250G>C和c.250G>T、c.35del和c.35dup，MYO7A基因的c.397del和c.397dup等，检测可准确区分和检测。

同时，本申请基于多重PCR建库，每例样本数据量平均约103Mb，对于MGI-SEQ 2000测序仪110G芯片，本申请的检测可一次性检测1000例以上，适用于大规模人群筛查。对于MGI-SEQ 200测序仪20G芯片或其他约10-20Gb等低通量芯片来说，一次性检测数十例到100例样本，适用于普通临床实验室检测。因此本申请可用于低通量测序仪、中通量测序仪，通量灵活。

实施例3

5467例新生儿筛查阳性样本的耳聋突变特点

对新生儿听力未通过的样本采集干血片样本，参照实施例1的方法对样本进行检测和数据分析，检测共发现阳性样本5467例。其中GJB2基因突变5096例(其中GJB2 c.109G>A突变4667例)；SLC26A4基因突变465例；GJB3基因突变22例；线粒体基因RNR1突变72例。

在常规耳聋基因筛查一般包括2～4个基因，检测基因位点不超过25个。以广州市达瑞生物技术股份有限公司的二十项遗传性耳聋基因突变检测试剂盒(飞行时间质谱法)为例，其检测基因位点主要包括GJB2基因的35del G、176_191del16、235del C、299_300delAT、167delT，GJB3上的538C>T、547G>A，SLC26A4上的IVS7-2A>G、2168A>G、281C>T、589G>A、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T，和线粒体12S rRNA上的m.1555A>G、m.1494C>T。

在本实施例中，5467例新生儿筛查阳性样本中检出GJB2、SLC26A4、RNR1和GJB3基因以外基因变异124例，检出以上4个基因但在以上20个位点的基因变异的样本数为263例，其中GJB2基因20位点以外阳性检出24例，SLC26A4基因20位点以外阳性检出115例，GJB3基因20位点以外阳性检出1例，RNR1基因20位点以外阳性检出123例。

在本实施例中，所有阳性样本中仅检出GJB2 c.109G>A突变的有4145例，除此之外的阳性样本1322例，在1322例样本中，20位点以外的基因突变检出共387例，占比29.7％。

综上所述，本申请对常规20个基因位点之外的158个位点进行检测，可显著提高耳聋基因突变的检出率。基于二代测序，覆盖180个致病突变位点，涉及基因和基因突变位点范围广，覆盖更多的突变位点。相对常规20个位点的筛查项目，本申请对于新生儿耳聋基因筛查可提高耳聋基因突变检出率29％以上。

实施例4

315例线粒体基因突变阳性的临床样本筛查结果

参照实施例2的方法对6944例外周血(耳聋患者)和干血片样本(新生儿筛查初筛未通过)进行检测和分析，对其中线粒体基因的变异情况进行统计和分析，发现线粒体基因变异的比例为4.53％(315/6944)，其中在听力未通过的新生儿中线粒体基因变异的比例为4.63％(259/5589)(具体结果见表5)。

在本实施例中，6944例样本的线粒体基因变异的检出比例高于文献报道的约为2.5％，其原因主要在于本实施例检测的样本中，部分来源于有临床表型的样本。但对于5589例耳聋初筛未通过的新生儿样本来说，由于线粒体基因突变主要与药物性耳聋相关，本实施例检出的线粒体基因阳性比例高于文献报道，更多的原因在于本实施例覆盖位点更多，且对于异质性变异的检出效率更高。

在315例线粒体基因突变阳性样本中，异质性变异共40例，其中6例样本变异丰度低于10％，最低丰度为3％。对于这部分样本，常规PCR或基因芯片检测可能无法检出。

表5：315例样本的线粒体基因突变检测结果

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对于线粒体基因组，覆盖常见的药物性耳聋基因突变，测序深度在5000X以上，检测下限为1％突变丰度，对于线粒体基因突变，检测灵敏度更高，在以上实施例中，本申请检出了多例一代测序可能无法检出的突变丰度低于10％的线粒体突变，其中丰度最低的为3％的突变。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，便于具体和详细地理解本申请的技术方案，但并不能因此而理解为对申请专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种检测耳聋相关基因的引物组，其特征在于，所述引物组包括针对下述180个突变位点进行设计的引物:

其中，参考基因组为hg19。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组包括如SEQ ID NO.1～SEQID NO.162所示的引物。

3.一种耳聋相关基因检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～2任一项所述的引物组。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组中的每条引物的5’端连接有建库测序所需的通用序列。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述通用序列包括公共引物、接头和特异性标签。

6.一种耳聋相关基因的建库方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用权利要求1所述的引物组或权利要求2～5任一项所述的试剂盒，对模板DNA进行多重PCR扩增，获得扩增子文库，对扩增子文库进行混合、纯化，获得耳聋相关基因的文库。

7.根据权利要求6所述的建库方法，其特征在于，所述多重PCR扩增包括第一次PCR扩增耳聋基因位点序列与第二次PCR扩增加入样本特异性的序列。

8.根据权利要求7所述的建库方法，其特征在于，所述第一次PCR扩增的引物包括YK DFpanel Mix；第二次PCR扩增的引物包括B1-index M、B1-index N。

9.根据权利要求7所述的建库方法，其特征在于，所述第一次PCR扩增的反应条件为：93℃～95℃，2min～4min；5～7个循环扩增，每个循环为94℃～96℃，8s～12s，56℃～60℃，4min～6min，66℃～70℃，28s～32s；3℃～5℃保持；

所述第二次PCR扩增的反应条件为：93℃～95℃，2min～4min；14～16个循环扩增，每个循环为97℃～99℃，8s～12s，58℃～62℃，28s～32s，66℃～70℃，28s～32s；66℃～70℃，4min～6min；3℃～5℃保持。

10.权利要求6～9任一项所述建库方法获得的耳聋相关基因的文库。