CN104561310A - 心源性猝死突变基因检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学和医学领域，具体涉及一种准确性高、预测性好的心源性猝死突变基因检测试剂盒，包括心源性猝死相关的8个主效基因的12个SNP位点的多态性检测，结合特异性等位基因PCR和温度梯度降落PCR特点，对每个SNP位点分别采用上游和下游共三条特异性引物，通过温度梯度降落PCR程序扩增，经琼脂糖凝胶电泳分析可同时测定12个SNP位点的突变情况。本发明提供的检测试剂盒特异性强、检出率高，效率高、成本低，可以筛查心源性猝死的高危人群，评估受检者患心源性猝死的风险程度，并从基因水平明确患者猝死的病因，为临床猝死疾病的预防、诊断和治疗提供了一个新途径。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和医学领域，具体涉及一种心源性猝死突变基因检测试剂盒。
背景技术
心源性猝死(Sudden Cardiac Death，SCD)系指由于各种心脏原因所致的突然死亡。可发生于原来有或无心脏病的患者中，常无任何危及生命的前期表现，突然意识丧失，在急性症状出现后1小时内死亡，属非外伤性自然死亡，特征为出乎意料的迅速死亡。心源性猝死是一种受环境因素和遗传因素等多因素影响的复杂性疾病，目前，猝死的年轻化趋势日益明显，严重威胁到青壮年人群及老年人群的身体健康和家庭幸福。
目前临床上主要通过心电图和心脏彩超对猝死高危人群进行诊断，通过提高个人健康意识，对高危人群结合一些药物和植入型心脏复律除颤器(ICD)的植入来抢救猝死患者、减少猝死死亡率。但是ICD的治疗仍然存在一定的局限性，近期急性心梗除颤器研究(Defibrillator in acute myocardial infarction trial，DINAMIT)研究，心肌梗死严重者不能植入ICD，另外，ICD价格昂贵、有痛性治疗容易给患者造成心理负担、加之植入技术和随访流程复杂以及ICD不能从根本上消除心律失常等原因限制了ICD在国内的推广应用。因此，目前心源性猝死一旦发生便无有效的抢救治疗方法，于是其预防显得尤为重要，有效的一级预防是降低心源性猝死的最佳途径。即在猝死未发生时，提前对猝死易感性进行评估和控制，采取针对危险因素(病因)的预防措施，从而达到使猝死不发生或迟发的目的。
随着临床医学和分子生物学技术的发展，科学工作者发现了多种因编码控制细胞膜转运Na+、K+、Ca2+离子通道蛋白基因突变导致心肌细胞膜离子通道异常、心电节律紊乱，从而诱发猝死的情况，中国人的猝死基因与外国人有所不同，发现在以往的Na+、K+、Ca2+离子通道蛋白基因突变基础上，NOS1AP基因和NUP155基因的两个新的突变点是中国人群特有的，这两个突变点已获国际权威基因库的认可。这种基因突变可遗传给后代并使家族成员患猝死呈现出年轻化趋势，由于其疾病的隐匿性在某些外界诱发因素的影响下可发生猝死，也可在睡眠中猝死，因此，检测猝死突变基因对家族其他成员预防发生意外猝死和及时治疗具有重要意义。猝死易感基因检测可以在人们还未出现任何症状的时候就提前了解自己是否携带猝死突变基因，有助于高危人群在出现症状前进行诊断和有针对性的选用相应受体阻滞剂进行治疗。
综上所述，针对中国人群，为了实现心源性猝死的提前预防和协助早期治疗，本领域迫切需要建立心源性猝死突变基因检测体系、开发检测试剂盒并建立猝死易感性风险评估体系。
NUP155、SCN5A、CASQ2、RYR2、KCNH2、KCNQ1、NOS1AP、ADRB2基因等与心源性猝死相关，下面为上述基因分子生物学机理及其与心源性猝死相关性分析。
NUP155(nucleoporin 155kDa)为核孔复合物基因，是一个编码核孔复合物组分的基因，其主要功能是控制遗传物质mRNA由细胞核到细胞质的转运，以便翻译成为蛋白质。NUP155是一个处于比较上游位置的调控基因，能够对其他很多基因和蛋白质的表达进行调控。该基因多态性对核孔蛋白的定位及核被膜的形成产生负面作用，影响了维持心房正常功能关键基因的mRNA从细胞核到细胞质的转运，导致基因表达分子的重调并且会延迟心肌细胞的有丝分裂，减少心肌细胞存活导致心肌细胞凋亡和纤维化从而导致房颤的发生，进而增加了散发性房颤和心源性猝死的危险性。
SCN5A(sodium channel，voltage-gated，type V)为钠通道α基因，编码钠通道α，是人类电压门控制钠通道基因家族一员。心脏钠通道介导心脏中钠离子内流形成心肌细胞动作电位的快速上升相，对兴奋传导起重要作用。该基因多态性对钠离子通道蛋白的数目及动力学特征产生负面影响，使钠离子内流受阻，影响了心肌细胞动作电位的形成，易导致心肌细胞去极化异常、心律失常，易导致房颤、LQT、BrS等心脏疾病的发生，增加了猝死的风险性。
CASQ2(calsequesttrin gene 2)为储钙蛋白基因，编码储钙蛋白，CASQ2基因位于心肌细胞肌浆网终末池腔内，参与心肌细胞肌浆网钙离子的储存与释放。是心肌细胞的主要钙库，在每次的收缩与舒张的循环中结合并释放大量的钙离子。该基因多态性使心肌细胞肌浆网储存和释放钙离子的能力降低，使细胞内钙离子超载，引起延迟后除极，运动或激动后可能诱发心律失常，易导致晕厥或猝死的发生。
RYR2(cdrdiac ryanodine recptor)为心脏兰尼受体基因，编码心脏兰尼受体，是心肌细胞肌浆网上的Ca2+释放受体。主要调节细胞内钙离子水平，维持心肌细胞正常的生理功能。该基因多态性导致RyR2通道功能发生异常，肌浆网释放过多Ca2+，引起延迟后除极，心电图上表现为双向室速。当交感神经兴奋时，导致通道通透性增加，使Ca2+外流增加，容易诱发早期和延迟后除极，从而导致室性快速性心律失常的发生，增加了心源性猝死的易感性。
KCNH2(human ether-a-go-go-related gene)为快速激活延迟整流钾离子通道基因，编码快速激活延迟整流(cardiac rapidly activating delayed rectifier K+current，IKr)钾离子通道，在心肌细胞动作电位的复极化过程中发挥着重要的作用。该基因多态性使IKr通道功能增益，即在动作电位的各个时期通道功能增强，钾离子外流增加，复极加速，动作电位时程缩短，心房和心室肌复极的离散度增加，从而易发生折返性心律失常，增加了心源性猝死的易感性。
KCNQ1(Potassium voltage-gated channel，KQT-like subfamily，member 1)为缓慢型延迟整流钾离子流通道的α亚基基因，编码缓慢型延迟整流钾离子流通道(Isk)的α亚基，其与KCNE1基因编码的β亚单位-mink蛋白共同组成完整的缓慢激活延迟整流钾通道(Iks)，参与动作电位2相平台期的终止和3相复极过程，是心肌复极过程中的关键电流。该基因多态性导致通道蛋白功能缺陷，复极延迟，动作电位时程延长，心电图表现为QT间期延长、尖端扭转型室性心动过速(torsade de pointes，TdP)或心室颤动，增加了心源性猝死的易感性。
NOS1AP(nitric oxide synthase 1adaptor protein)为一氧化氮合成酶适配蛋白基因，编码神经型一氧化氮合成酶适配蛋白，它与神经型一氧化氮合酶(nNOS)相互作用通过抑制L型钙通道来加速心肌细胞的复极化。位于心肌肌浆网的除与钾钠泵联系外，还可以通过其PDZ结构域与心肌质膜钙泵相联系。位于肌质网的nNOS与兰尼受体(RyR2)和肌质网钙泵(SERCA2a)一起参与细胞内钙循环和兴奋---收缩的调控。该基因多态性可改变心脏肌肉收缩时间即QT间期，导致心律失常，增加猝死的易感性。
ADRB2(β2adrenergic receptor)为肾上腺素受体2基因，编码肾上腺素受体2，交感神经活动异常是猝死发生的重要机制，β2-肾上腺素能受体(β2-AR)作为交感神经作用的重要环节，调节心肌收缩功能。该基因多态性可影响交感神经兴奋性，影响心房肌细胞兴奋性，加快心率，增强心肌收缩力，从而影响了心源性猝死的易感性。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种心源性猝死突变基因检测试剂盒。具体涉及NUP155、SCN5A、CASQ2、RYR2、KCNH2、KCNQ1、NOS1AP、ADRB2基因SNP(单核苷酸的多态性)位点多态性与心源性猝死相关性的检测试剂盒。参照心源性猝死突变基因筛查体系，利用等位基因特异性PCR技术，综合检测与分析受检人群是否携带“心源性猝死易感基因”，并评估其患心源性猝死的风险，将易感人群从普通人群中筛选出来，给予个性化指导建议，改变不良的生活习惯，达到预防的目的。
本发明所采用的技术方案为：
本发明提供一种心源性猝死突变基因检测试剂盒，具体涉及NUP155、SCN5A、CASQ2、RYR2、KCNH2、KCNQ1、NOS1AP、ADRB2基因这8个基因的12个基因位点：
即，NUP155(核孔复合物基因)的R391H位点；
SCN5A(钠通道α基因)的rs1805124(H558R)位点，rs1805126(C5457T)位点和3666+69G＞C位点；
CASQ2(储钙蛋白基因)的rs121434549(D307H)位点；
RYR2(心脏兰尼受体基因)的rs3766871位点和rs790896位点；
KCNH2(快速激活延迟整流钾离子通道基因)的rs104894021(N588K)位点；
KCNQ1(缓慢型延迟整流钾离子流通道的α亚基基因)的rs2283222位点和rs199472709(R231H)位点；
NOS1AP(一氧化氮合成酶适配蛋白基因)的rs12143842位点；
ADRB2(肾上腺素受体2基因)的rs1042714(Gln27Glu)位点。
由于PCR过程中引物3′末端的碱基对引物的延伸来说处于至关重要的位置，因此，只要将突变与野生等位基因所不同的那个碱基安排在上游或下游引物3′最末端，进行PCR时，如果得到特异扩增带，表明被测基因含有相应野生或突变等位基因。利用此原理，对每一个SNP位点分别采用上游和下游共三条引物，其中有两条上游引物和一条共用下游引物，或两条下游引物和一条共用上游引物，通过温度梯度降落PCR扩增，可同时测定12个SNP位点的可能基因型。
进一步的，一种心源性猝死突变基因检测试剂盒，所述试剂盒包括：
检测NUP155(核孔复合物)基因R391H位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括一条共用的上游引物和两条下游引物，所述共用的上游引物的序列号为SEQ NO：F-NU，两条所述下游引物的序列号分别为SEQ NO：R1-NU和SEQ NO：R2-NU；
检测SCN5A(钠通道α)基因rs1805124(H558R)位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括两条上游引物和一条共用的下游引物，两条所述上游引物的序列号分别为SEQ NO：F1-SC和SEQ NO：F2-SC，所述共用的下游引物的序列号为SEQ NO：R1-SC；
检测SCN5A(钠通道α)基因rs1805126(C5457T)位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括一条共用的上游引物和两条下游引物，所述共用的上游引物的序列号为SEQ NO：F3-SC，两条所述下游引物的序列号分别为SEQ NO：R2-SC和SEQ NO：R3-SC；
检测SCN5A(钠通道α)基因3666+69G＞C位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括两条上游引物和一条共用的下游引物，两条所述上游引物的序列号分别为SEQ NO：F4-SC和SEQ NO：F5-SC，所述共用的下游引物的序列号为SEQ NO：R4-SC；
检测CASQ2(储钙蛋白)基因rs121434549(D307H)位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括一条共用的上游引物和两条下游引物，所述共用的上游引物的序列号为SEQ NO：F-CA，两条所述下游引物的序列号分别为SEQ NO：R1-CA和SEQ NO：R2-CA；
检测RYR2(心脏兰尼受体)基因rs3766871位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括两条上游引物和一条共用的下游引物，两条所述上游引物的序列号分别为SEQ NO：F1-RY和SEQ NO：F2-RY，所述共用的下游引物的序列号为SEQ NO：R1-RY；
检测RYR2(心脏兰尼受体)基因rs790896位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括两条上游引物和一条共用的下游引物，两条所述上游引物的序列号分别为SEQ NO：F3-RY和SEQ NO：F4-RY，所述共用的下游引物的序列号为SEQ NO：R2-RY；
检测KCNH2(快速激活延迟整流钾离子通道)基因rs104894021(N588K)位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括两条上游引物和一条共用的下游引物，两条所述上游引物的序列号分别为SEQ NO：F1-NH和SEQ NO：F2-NH，所述共用的下游引物的序列号为SEQ NO：R-NH；
检测KCNQ1(缓慢型延迟整流钾离子流通道的α亚基)基因rs2283222位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括一条共用的上游引物和两条下游引物，所述共用的上游引物的序列号为SEQ NO：F1-NQ，两条所述下游引物的序列号分别为SEQ NO：R1-NQ和SEQ NO：R2-NQ；
检测KCNQ1(缓慢型延迟整流钾离子流通道的α亚基)基因rs199472709(R231H)位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括一条共用的上游引物和两条下游引物，所述共用的上游引物的序列号为SEQNO：F2-NQ，两条所述下游引物的序列号分别为SEQ NO：R3-NQ和SEQ NO：R4-NQ；
检测NOS1AP(一氧化氮合成酶适配蛋白)基因rs12143842位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括两条上游引物和一条共用的下游引物，两条所述上游引物的序列号分别为SEQ NO：F1-NO和SEQ NO：F2-NO，所述共用的下游引物的序列号为SEQ NO：R-NO；
检测ADRB2(肾上腺素受体2)基因rs1042714(Gln27Glu)位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括一条共用的上游引物和两条下游引物，所述共用的上游引物的序列号为SEQ NO：F-AD，两条所述下游引物的序列号分别为SEQ NO：R1-AD和SEQ NO：R2-AD。
进一步的，所述试剂盒还包括：Taq酶，dNTP混合液，MgCl2溶液，10×Taq Buffer反应缓冲液，去离子水。
进一步的，应用所述试剂盒进行PCR扩增的反应体系为25μL，所述反应体系包括1μL的模板，1μL的下游引物，1μL的上游引物，0.5μL的Taq酶，2μL的dNTP混合液，1.5μL的MgCl2溶液，2.5μL的10×Taq Buffer反应缓冲液，15.5μL的去离子水。
进一步的，所述模板为人口腔粘膜细胞基因组DNA。
进一步的，应用所述试剂盒进行PCR扩增的程序如下：
94℃，5min，循环1次；
94℃，30sec，62℃，30sec，72℃，1min，循环2次；
94℃，30sec，59℃，30sec，72℃，1min，循环2次；
94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1min，循环2次；
94℃，30sec，53℃，30sec，72℃，1min，循环2次；
94℃，30sec，50℃，30sec，72℃，1min，循环2次；
94℃，30sec，48℃，30sec，72℃，1min，循环24次；
72℃，10min，循环1次。
上述扩增程序为温度梯度降落PCR扩增，设定温度降落扩增程序，采用温度从62℃到48℃梯度降落，将所有位点的退火温度都能够包括进去，每个温度点设计两个循环，该方法实现了所有位点不同引物的同时扩增，节省了检测时间，提高了筛查的效率。该方法可针对不同退火温度的引物条件，在一次PCR实验中同时测定多个SNP位点所包含的三种可能基因型。
利用琼脂糖凝胶电泳进行基因型分型。如果在含野生碱基的引物PCR管中有特异扩增带出现，而在含突变碱基的引物PCR管中没有特异扩增带，则表明被测基因没有这种突变，属于野生纯合型；如果在含野生碱基的引物PCR管中没有特异扩增带，而在含突变碱基的引物PCR管中得到特异扩增带，则表明被测基因属于突变纯合型；如果两种扩增带都存在，则表明被测基因属于突变杂合型。
本发明提供还提供一种对个体的心源性猝死易感性进行评估的方法，通过检测个体的上述8个基因的12个位点的基因型，参考基因型与心源性猝死相关系数OR值，以此判断个体患心源性猝死的发病风险的大小，各基因位点基因型相关系数OR值及风险程度如下表格：
风险程度一栏中，“——”代表基因型是保护基因型，能够降低心源性猝死的发病风险，属于有利的因素；“-”代表风险较低，与普通正常人群相当；“+”代表有轻度风险，会增加患心源性猝死的风险；“++”代表风险较高，会大大增加患心源性猝死的风险。
本发明的有益效果为：应用本发明的心源性猝死突变基因检测试剂盒及其评估体系，能够综合检测与分析受检人群是否携带“心源性猝死易感基因”，并评估其患心源性猝死的风险，将易感人群从普通人群中筛选出来，给予个性化指导建议，改变不良的生活习惯，达到预防的目的。
附图说明
图1是本发明的样品基因组电泳图谱；
图2为本发明样品DNA位点检测结果；
图3为NUP155基因R391H位点测序图谱；
图4为SCN5A基因H558R位点测序图谱；
图5为SCN5A基因C5457T位点测序图谱；
图6为SCN5A基因3666+69G＞C位点测序图谱；
图7为CASQ2基因D307H位点测序图谱；
图8为RyR2基因rs3766871位点测序图谱；
图9为RyR2基因rs790896位点测序图谱；
图10为KCNH2基因N588K位点测序图谱；
图11为KCNQ1基因rs2283222位点测序图谱；
图12为KCNQ1基因R231H位点测序图谱；
图13为NOS1AP基因rs12143842位点测序图谱；
图14为ADRB2基因Gln27Glu位点测序图谱。
图中，图1的1-5：同一个客户样品的基因组；M：DL 2000 DNA maker；图2的1-12：野生纯合型；图2的1’-12’：纯合突变型。
具体实施方式
(1)采集受检者的口腔粘膜细胞，利用硅胶膜吸附法提取其基因组DNA，如图1所示，为本发明的样品基因组电泳图谱。使用本发明提供的检测试剂盒，对基因组DNA进行以下8个心源性猝死突变基因的12个位点检测：
检测NUP155基因R391H位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括一条共用的上游引物和两条下游引物，所述共用的上游引物的序列号为SEQ NO：F-NU，两条所述下游引物的序列号分别为SEQ NO：R1-NU和SEQ NO：R2-NU；
检测SCN5A基因rs1805124(H558R)位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括两条上游引物和一条共用的下游引物，两条所述上游引物的序列号分别为SEQ NO：F1-SC和SEQ NO：F2-SC，所述共用的下游引物的序列号为SEQ NO：R1-SC；
检测SCN5A基因rs1805126(C5457T)位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括一条共用的上游引物和两条下游引物，所述共用的上游引物的序列号为SEQ NO：F3-SC，两条所述下游引物的序列号分别为SEQ NO：R2-SC和SEQ NO：R3-SC；
检测SCN5A基因3666+69G＞C位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括两条上游引物和一条共用的下游引物，两条所述上游引物的序列号分别为SEQ NO：F4-SC和SEQ NO：F5-SC，所述共用的下游引物的序列号为SEQ NO：R4-SC；
检测CASQ2基因rs121434549(D307H)位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括一条共用的上游引物和两条下游引物，所述共用的上游引物的序列号为SEQ NO：F-CA，两条所述下游引物的序列号分别为SEQ NO：R1-CA和SEQ NO：R2-CA；
检测RYR2基因rs3766871位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括两条上游引物和一条共用的下游引物，两条所述上游引物的序列号分别为SEQ NO：F1-RY和SEQ NO：F2-RY，所述共用的下游引物的序列号为SEQ NO：R1-RY；
检测RYR2基因rs790896位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括两条上游引物和一条共用的下游引物，两条所述上游引物的序列号分别为SEQ NO：F3-RY和SEQ NO：F4-RY，所述共用的下游引物的序列号为SEQ NO：R2-RY；
检测KCNH2基因rs104894021(N588K)位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括两条上游引物和一条共用的下游引物，两条所述上游引物的序列号分别为SEQ NO：F1-NH和SEQ NO：F2-NH，所述共用的下游引物的序列号为SEQ NO：R-NH；
检测KCNQ1基因rs2283222位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括一条共用的上游引物和两条下游引物，所述共用的上游引物的序列号为SEQ NO：F1-NQ，两条所述下游引物的序列号分别为SEQ NO：R1-NQ和SEQ NO：R2-NQ；
检测KCNQ1基因rs199472709(R231H)位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括一条共用的上游引物和两条下游引物，所述共用的上游引物的序列号为SEQ NO：F2-NQ，两条所述下游引物的序列号分别为SEQ NO：R3-NQ和SEQ NO：R4-NQ；
检测NOS1AP基因rs12143842位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括两条上游引物和一条共用的下游引物，两条所述上游引物的序列号分别为SEQ NO：F1-NO和SEQ NO：F2-NO，所述共用的下游引物的序列号为SEQ NO：R-NO；
检测ADRB2基因rs1042714(Gln27Glu)位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括一条共用的上游引物和两条下游引物，所述共用的上游引物的序列号为SEQ NO：F-AD，两条所述下游引物的序列号分别为SEQ NO：R1-AD和SEQ NO：R2-AD。
(2)结合温度梯度降落PCR扩增方法，设定温度降落扩增程序，同时测定8个基因的12个SNP位点分别包含的三种可能基因型；所述试剂盒的反应体系为25μL，所述反应体系包括1μL的模板，1μL的下游引物，1μL的上游引物，0.5μL的Taq酶，2μL的dNTP混合液，1.5μL的MgCl2溶液，2.5μL的10×Taq Buffer反应缓冲液，15.5μL的去离子水；
应用所述试剂盒进行PCR扩增的程序如下：
94℃，5min，循环1次；
94℃，30sec，62℃，30sec，72℃，1min，循环2次；
94℃，30sec，59℃，30sec，72℃，1min，循环2次；
94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1min，循环2次；
94℃，30sec，53℃，30sec，72℃，1min，循环2次；
94℃，30sec，50℃，30sec，72℃，1min，循环2次；
94℃，30sec，48℃，30sec，72℃，1min，循环24次；
72℃，10min，循环1次。
(3)利用琼脂糖凝胶电泳进行基因型分型；应用本发明试剂盒对一个受检者的上述8个基因12个位点的琼脂糖凝胶电泳图。如图2所示，为本发明样品DNA位点检测结果，图2上1-12泳道分别代表12位点的野生纯合型；1’-12’泳道分别代表12个位点的突变纯合型；若每一位点所对应的野生纯合型和突变纯合型两泳道都出现相应目的条带，则说明样本为杂合突变型；M代表DL 2000DNA maker。12个突变位点从左向右顺序及检测结果依次为：NUP155基因R391H位点，杂合GA型；SCN5A基因H558R位点，杂合AG型；SCN5A基因C5457T位点，杂合CT型；SCN5A基因3666+69G＞C位点，杂合GC型；CASQ2基因D307H位点，杂合GC型；RyR2基因rs3766871位点，杂合GA型；RyR2基因rs790896位点，杂合GA型；KCNH2基因N588K位点，杂合CA型；KCNQ1基因rs2283222位点，杂合CT型；KCNQ1基因R231H位点，杂合GA型；NOS1AP基因rs12143842位点，杂合CT型；ADRB2基因Gln27Glu位点，杂合CG型。
(4)为了验证上述信息，可以将扩增产物通过大肠杆菌PMD18-T质粒载体连接进行克隆后在ABI3700基因测序仪上进行基因序列分析，以验证本发明上述检测结果。各位点克隆测序图谱如图3至图14所示，其中，图3为NUP155基因R391H位点测序图谱，杂合GA型；图4为SCN5A基因H558R位点测序图谱，杂合AG型；图5为SCN5A基因C5457T位点测序图谱，杂合CT型；图6为SCN5A基因3666+69G＞C位点测序图谱，杂合GC型；图7为CASQ2基因D307H位点测序图谱，杂合GC型；图8为RyR2基因rs3766871位点测序图谱，杂合GA型；图9为RyR2基因rs790896位点测序图谱，杂合GA型；图10为KCNH2基因N588K位点测序图谱，杂合CA型；图11为KCNQ1基因rs2283222位点测序图谱，杂合CT型；图12为KCNQ1基因R231H位点测序图谱，杂合GA型；图13为NOS1AP基因rs12143842位点测序图谱，杂合CT型；图14为ADRB2基因Gln27Glu位点测序图谱，杂合CG型。由此可见，本发明所述方法检测结果与克隆测序结果完全一致。
(5)根据心源性猝死相关系数OR值，判断个体患心源性猝死的发病风险的大小；各基因位点基因型相关系数OR值如下表格：
风险程度一栏中，“——”代表基因型是保护基因型，能够降低心源性猝死的发病风险，属于有利的因素；“-”代表风险较低，与普通正常人群相当；“+”代表有轻度风险，会增加患心源性猝死的风险；“++”代表风险较高，会大大增加患心源性猝死的风险。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种心源性猝死突变基因检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：
检测NUP155基因R391H位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括一条共用的上游引物和两条下游引物，所述共用的上游引物的序列号为SEQ NO：F-NU，两条所述下游引物的序列号分别为SEQ NO：R1-NU和SEQ NO：R2-NU；
检测SCN5A基因rs1805124位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括两条上游引物和一条共用的下游引物，两条所述上游引物的序列号分别为SEQ NO：F1-SC和SEQ NO：F2-SC，所述共用的下游引物的序列号为SEQ NO：R1-SC；
检测SCN5A基因rs1805126位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括一条共用的上游引物和两条下游引物，所述共用的上游引物的序列号为SEQ NO：F3-SC，两条所述下游引物的序列号分别为SEQ NO：R2-SC和SEQ NO：R3-SC；
检测SCN5A基因3666+69G＞C位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括两条上游引物和一条共用的下游引物，两条所述上游引物的序列号分别为SEQ NO：F4-SC和SEQ NO：F5-SC，所述共用的下游引物的序列号为SEQ NO：R4-SC；
检测CASQ2基因rs121434549位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括一条共用的上游引物和两条下游引物，所述共用的上游引物的序列号为SEQ NO：F-CA，两条所述下游引物的序列号分别为SEQ NO：R1-CA和SEQ NO：R2-CA；
检测RYR2基因rs3766871位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括两条上游引物和一条共用的下游引物，两条所述上游引物的序列号分别为SEQ NO：F1-RY和SEQ NO：F2-RY，所述共用的下游引物的序列号为SEQ NO：R1-RY；
检测RYR2基因rs790896位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括两条上游引物和一条共用的下游引物，两条所述上游引物的序列号分别为SEQ NO：F3-RY和SEQ NO：F4-RY，所述共用的下游引物的序列号为SEQ NO：R2-RY；
检测KCNH2基因rs104894021位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括两条上游引物和一条共用的下游引物，两条所述上游引物的序列号分别为SEQ NO：F1-NH和SEQ NO：F2-NH，所述共用的下游引物的序列号为SEQ NO：R-NH；
检测KCNQ1基因rs2283222位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括一条共用的上游引物和两条下游引物，所述共用的上游引物的序列号为SEQ NO：F1-NQ，两条所述下游引物的序列号分别为SEQ NO：R1-NQ和SEQ NO：R2-NQ；
检测KCNQ1基因rs199472709位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括一条共用的上游引物和两条下游引物，所述共用的上游引物的序列号为SEQ NO：F2-NQ，两条所述下游引物的序列号分别为SEQ NO：R3-NQ和SEQ NO：R4-NQ；
检测NOS1AP基因rs12143842位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括两条上游引物和一条共用的下游引物，两条所述上游引物的序列号分别为SEQ NO：F1-NO和SEQ NO：F2-NO，所述共用的下游引物的序列号为SEQ NO：R-NO；
检测ADRB2基因rs1042714位点多态性的三条特异性扩增引物，所述三条特异性扩增引物包括一条共用的上游引物和两条下游引物，所述共用的上游引物的序列号为SEQ NO：F-AD，两条所述下游引物的序列号分别为SEQ NO：R1-AD和SEQ NO：R2-AD。
2.根据权利要求1所述的心源性猝死突变基因检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：Taq酶，dNTP混合液，MgCl2溶液，10×Taq Buffer反应缓冲液，去离子水。
3.根据权利要求2所述的心源性猝死突变基因检测试剂盒，其特征在于：应用所述试剂盒进行PCR扩增的反应体系为25μL，所述反应体系包括1μL的模板，1μL的下游引物，1μL的上游引物，0.5μL的Taq酶，2μL的dNTP混合液，1.5μL的MgCl2溶液，2.5μL的10×Taq Buffer反应缓冲液，15.5μL的去离子水。
4.根据权利要求3所述的心源性猝死突变基因检测试剂盒，其特征在于：所述模板为人口腔粘膜细胞基因组DNA。
5.根据权利要求4所述的心源性猝死突变基因检测试剂盒，其特征在于：应用所述试剂盒进行PCR扩增的程序如下：
94℃，5min，循环1次；
94℃，30sec，62℃，30sec，72℃，1min，循环2次；
94℃，30sec，59℃，30sec，72℃，1min，循环2次；
94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1min，循环2次；
94℃，30sec，53℃，30sec，72℃，1min，循环2次；
94℃，30sec，50℃，30sec，72℃，1min，循环2次；
94℃，30sec，48℃，30sec，72℃，1min，循环24次；
72℃，10min，循环1次。
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