CN105586405A - Adrb2，grk5基因多态性的检测方法和临床应用 - Google Patents

Adrb2，grk5基因多态性的检测方法和临床应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种ADRB2，GRK5基因多态性的检测方法和临床应用具体指心衰患者β受体阻滞剂药物治疗疗效评估的遗传标志物，其中，遗传标志物是ADRB2-Arg16Gly(rs1042713)、ADRB2-Gln27Glu(rs1042714)和/或GRK5-Arg304His(rs2230349)多态性位点的基因分型；上述SNP位点在心衰患者预后和/或β受体阻滞剂药物治疗疗效评估中的应用。以及一种检测上述遗传标志物的试剂，该试剂在制备心衰患者预后和/或β受体阻滞剂药物治疗疗效评估的试剂盒的用途，及一种试剂盒。根据本发明的试剂盒可以检测患者的ADRB2-Arg16Gly(rs1042713)、ADRB2-Gln27Glu(rs1042714)和/或GRK5-Arg304His(rs2230349)多态性位点的基因分型，进而评估患者预后和/或β受体阻滞剂药物治疗的疗效。

Description

ADRB2，GRK5基因多态性的检测方法和临床应用
技术领域：
本发明属于生命科学领域，涉及医学和生物技术，具体是提供不同检测方法(Taqman探针分型和改良测序的方法等)同时对β受体信号通路相关基因ADRB2，GRK5上的3个SNP位点(ADRB2：rs1042713，rs1042714以及GRK5：rs2230349)进行快速准确的基因分型，同时提供根据基因型预判β受体阻滞剂疗效及预后评估的方法。
背景技术：
心力衰竭(心衰)是包括高血压、冠心病、心肌病在内的多种心脏疾病的终末阶段。因为人口老龄化的趋势和急性心肌梗死早期再灌注干预后存活患者的增加，使得心衰病人人数迅速增长，心衰已成为社会巨大的负担。随着研究的深入，人们已逐渐认识到交感神经的过度兴奋及相关神经体液因子的过度激活在心衰的发生、进展中起到重要作用。β肾上腺素能系统是维持心脏的正常功能和影响心衰的结构功能改变的重要信号通路，主要由七次跨膜的G蛋白偶联受体(β1型受体ADRB1和β2型受体ADRB2)—腺苷酸环化酶(AC)—环磷酸腺苷(cAMP)—蛋白激酶A(PKA)组成，介导心脏的变时变力作用。G蛋白偶联受体激酶2型和5型(GRK2，GRK5)能磷酸化活化的β受体，抑制其下游的信号的激活，在心衰的病理过程中对β受体信号通路起到调节作用。而在心衰时，机体通过代偿性的激动β肾腺素能系统代偿心脏泵血功能的下降。过度的活化却引起了心肌细胞的重构和凋亡，进一步加重心脏功能的恶化。
β受体阻滞剂因能抑制心衰时过度活化的肾上腺素能系统成为了心衰治疗的革新。超过10000例患者的20多个安慰剂对照临床试验对β受体阻断剂的治疗效果进行了评价。结果表明：β受体阻滞剂的使用不仅能改善心脏功能，更重要的是改善心脏重构和降低死亡和再住院的联合终点。但临床试验同时也报道了β受体的治疗效果存在个体异质性，具体表现为并非所有的个体都能从β受体阻滞剂的治疗中获益和不同人种对β受体阻滞剂的治疗获益并不完全相同。有研究报导，编码β肾腺素能系统的重要信号分子(ADRB1，ADRB2，GRK5等)的基因多态性参与了这个β受体阻滞剂相关的临床表型的异质性。GRK5基因多态性位点Gln41Leu(导致41号氨基酸由谷氨酰胺变成了亮氨酸)在欧洲人种的次要等位频率约为2％，而在非洲人种的次要等位频率为32.6％。有趣的是，Leu41天然的模拟了β受体阻滞剂的抑制效应，从而使Leu41型患者在无药物治疗时比Gln41型患者的生存率更高，而在β受体阻滞治疗的情况下却不能再从β受体阻滞剂治疗中获益。于是在整体层面形成了非洲人对β受体阻滞剂的治疗反应明显比欧洲人群差的表现。ADRB1基因多态性(Arg389Gly)也通过改变β受体信号通路对激动剂和阻滞剂的反应差异而影响了ADRB1Arg389Gly位点不同基因型的人对β受体阻滞剂的治疗效果不同。
ADRB2-Arg16Gly(rs1042713)，ADRB2-Gln27Glu(rs1042714)和GRK5-Arg304His(rs2230349)是ADRB2和GRK5基因上三个多态性位点。rs2230349位点是否影响β受体阻滞剂相关表型尚无报道。有一项735例冠心病病人的研究评估了rs1042713对β受体阻滞剂对冠心病患者的治疗效果，在560例服用β受体阻滞剂的患者中，其多态性影响三年生存率。但对于心衰人群，尚无有力的临床证据，特别国人是否具有种族特异性的临床表型仍未知。另一方面，根据文献报道，目前基于β受体肾上腺素能通路基因多态性检测方法主要为测序的方法，因操作较繁琐，成本较高，不能满足临床低成本、高效准确检测的需求。
发明内容：
为填补现有技术的空白，本发明旨在提供针对以上ADRB2-Arg16Gly(rs1042713)，ADRB2-Gln27Glu(rs1042714)和/或GRK5-Arg304His(rs2230349)3个多态性位点快速准确的联合检测方法，包括但不限于Taqman探针基因分型和改良测序的方法，同时提供分型结果指导临床心衰患者生存预后和药物疗效评估的应用。
为此，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种心衰患者预后和/或β受体阻滞剂药物治疗疗效评估的遗传标志物，其中，所述遗传标志物是ADRB2-Arg16Gly(rs1042713)、ADRB2-Gln27Glu(rs1042714)和/或GRK5-Arg304His(rs2230349)多态性位点的基因分型。优选的，所述遗传标志物是(1)ADRB2-Arg16Gly(rs1042713)或(2)GRK5-Arg304His(rs2230349)多态性位点的基因分型，或者，(3)ADRB2-Arg16Gly(rs1042713)和ADRB2-Gln27Glu(rs1042714)多态性位点的单倍体型。
本发明还提供一种上述ADRB2-Arg16Gly(rs1042713)、ADRB2-Gln27Glu(rs1042714)和/或GRK5-Arg304His(rs2230349)多态性位点的基因分型在心衰患者预后和/或β受体阻滞剂药物治疗疗效评估中的应用。
本发明还提供一些用于检测上述标志物的试剂。
优选的，所述试剂包括，1、针对包含上述3个SNP位点相应的目标序列的特异性扩增引物对；和/或2、识别多态性位点的检测探针。
优选的，所述特异性扩增引物对为14-30个碱基的寡核苷酸，能特异性扩增包含上述多态性位点的目的片段。
更优选的，所述针对以上3个SNP位点相应的目标序列的特异性扩增引物对的结构如SEQIDNo.1-2或者SEQIDNo.5-6或者SEQIDNo.9-10所示或者如SEQINNo.13-18所示。
优选的，用于扩增包含rs1042713位点的目的片段的引物序列为SEQIDNo.1-2；用于扩增rs1042714位点的目的片段的引物序列为SEQIDNo.5-6；用于扩增包含rs2230349位点的目的片段的引物序列为SEQIDNo.9-10。或者用于扩增包含rs1042713位点的目的片段引物序列为SEQIDNo.13-14；用于扩增包含rs1042714位点的目的片段引物序列为SEQINNo.15-16；用于扩增包含rs2230349位点的目的片段的引物序列为SEQIDNo.17-18。
优选的，所述识别多态性位点的检测探针为14-50个核酸的寡核苷酸序列，能特异性的与上述多态性位点特异性杂交。进一步，所述识别探针序列由5’端的荧光报告基团，3’端的非荧光猝灭基团以及与多态性性位点前后序列杂交的序列组成。更优选的，所述荧光报告基团为Fam、Vic等，3‘端的非荧光猝灭基团为MGB修饰基团。
更优选的，所述的针对以上3个SNP位点的检测探针结构如SEQIDNo.3-4或者SEQIDNo.7-8或者SEQIDNo.11-12所示。
优选的，用于识别rs1042713位点等位基因A/G的探针序列为SEQIDNo.3-4；用于识别rs1042714位点等位基因C/G的探针序列SEQIDNo.7-8；用于识别rs2230349位点等位基因G/A的探针序列SEQIDNo.11-12。
本发明还提供一种检测上述遗传标志物的试剂在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒用于评估心衰患者预后和/或β受体阻滞剂药物治疗疗效。
本发明还提供一种用于评估心衰患者预后和/或β受体阻滞剂药物治疗疗效的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种选自上述任意一项的引物或探针序列。优选的，所述试剂盒还包括用于检测反应的合适的缓冲体系和检测体系。
优选的，所述β受体阻滞剂包括但不仅限于美托洛尔、比索洛尔、布新洛尔、卡维地洛。
本发明还提供检测患者样本中上述遗传标志物的方法，其中，所述方法中利用上述试剂。
优选的，所述方法包括(1)Taqman基因探针分型的检测方法；(2)改良测序的方法和/或(3)其他基于特异性扩增和/或识别以上多态性位点及周围序列的方法。
更优选的，所述(1)Taqman探针分型检测方法中，包括使用针对包含上述SNP位点相应的目标序列的特异性扩增引物对和上述识别多态性位点的检测探针对遗传标志物进行检测。
更优选的，所述(1)Taqman探针基因分型检测方法中，所述针对包含上述SNP位点相应的目标序列的特异性扩增引物对的结构如SEQIDNo.1-2或者SEQIDNo.5-6或者SEQIDNo.9-10所示。所述识别多态性位点的探针结构如SEQIDNo.3-4或者SEQIDNo.7-8或者SEQIDNo.11-12。
更优选的，所述(2)改良测序的方法中，包括使用针对包含上述SNP位点相应目标序列的特异性扩增引物。
进一步，所述(2)改良测序的方法中，所述针对包含上述SNP位点相应的目标序列的特异性扩增引物对结构如SEQIDNo.13-18所示。
进一步，所述(3)其他基于特异性扩增和/或识别以上多态性位点及周围序列的方法还包括高分辨率溶解曲线的方法、液相DNA芯片分型技术、固相DNA芯片分型技术、针对包含目的片段的PCR产物的质谱分析技术、限制性内切酶分型技术、等位基因特异性杂交技术、寡核苷酸连接实验等。
本发明还提供一种评估心衰患者预后以及β受体阻滞剂药物治疗疗效的方法，其中，所述方法包括对患者样本的ADRB2基因多态性位点rs1042713，rs1042714和/或GRK5基因多态性位点rs2230349进行基因分型。
优选的，所述样本选自：外周血细胞、白细胞、血清、尿样、唾液、体液和/或(活检)组织样本，优选的，所述样本预先进行纯化，例如分离总DNA。
优选的，ADRB2rs1042713位点的基因多态性作为一个遗传标志物与心衰患者的预后有关，具体表现为：AA基因型的预后较好，AG基因型次之，GG基因型预后最差。
更优选的，当患者的ADRB2基因多态性位点rs1042713为AA型或者GRK5基因多态性位点rs2230349为AA型时予以β受体阻滞剂药物治疗无效；当患者的基因多态性位点rs1042713为AG/GG型或者GRK5基因多态性位点rs2230349为GG/GA型时予以β受体阻滞剂治疗有效。
更优选的，我们定义ADRB2基因rs1042713和rs1042714两个多态性位点的基因型为Arg16Arg/Gln27Gln时为单倍体型-1，rs1042713和rs1042714两个多态性位点的基因型为Gly16Gly/Glu27Glu时为单倍体型-3，除此外其它单倍体型组合为单倍体型-2(Arg16Arg/Gln27Glu，Arg16Arg/Glu27GluArg16Gly/Gln27Gln，Arg16Gly/Gln27Glu，Arg16Gly/Glu27Glu，Gly16Gly/Gln27Gln以及Gly16Gly/Gln27Glu的组合)。
进一步，当患者ADRB2基因为单倍体型-1时，β受体阻滞剂药物治疗无效；当患者ADRB2基因型为单倍体型-2或单倍体型-3时，β受体阻滞剂治疗有效。
本发明的优点在于：
1.本发明首次提供了ADRB2基因多态性位点rs1042713，rs1042714和GRK5基因多态性位rs2230349位点基因分型对心衰预后及患者β受体阻滞剂药物治疗疗效评估的方法，这是前所未有的，使我们对β受体肾上腺素能系统的基因多态性对心衰的预后及β受体阻滞剂的疗效有了全新的认识。
2.本发明首次提供了多中心的临床观察数据，将为心衰的治疗指南的更新，特别是基因基因型的个体化、精确化的医疗方案提供根据新的证据。基于基因型的个体化用药使得患者避免了无用的治疗，减少了他们的痛苦，并大大降低了医疗成本。
3.优选的，本发明提供的Taqman探针分型的方法，在引物和探针序列设计和实验方案上做出优化，在保证实验结果准确性的前提下，采用半量试剂的方法，有效的节约了检测成本，能更好满足临床应用的需求。作为优选3‘端的非荧光猝灭基团为MGB修饰基团，保证检测的特异性和成功率。
4.进一步，本发明提供的针对ADRB2rs1042713，rs1042714和GRK5rs2230349位点的改良测序的检测方法在传统测序方法的基础上优化引物设计，PCR扩增引物同时可作为测序引物，降低了引物设计成本，简化了操作。
5.本发明提供的改良测序的方法在传统测序方法的基础上优化反应体系，在保证正确正确率的前提下将核心试剂2.5×BigdyeBuffer的用量减为标准用量的1/16，大大降低了检测成本。
6.本发明提供的改良测序的方法在传统测序方法的基础上优化操作流程，1天内从样本处理到得到检测结果，大大简化了操作步骤，实现了快速检测，符合临床试剂运用的需要。
附图说明：
图1.利用Taqman探针的方法对ADRB2rs1042713Arg16Gly位点进行基因分型的图示
右下散点表示样品中只检测到Fam荧光，受试者基因型为野生型AA(右下)。左上散点代表样品中只检测到Vic荧光，受试者基因型为纯合突变基因型GG(左上)。中间散点代表样品中既检测到Fam荧光，又检测到Vic荧光，受试者基因型为野生突变混合基因型AG(中间)。
图2.利用Taqman探针的方法对ADRB2rs1042714Gln27GluC>G位点进行基因分型的图示
右下散点表示样品中只检测到Fam荧光，受试者基因型为野生型CC(右下)。左上散点代表样品中只检测到Vic荧光，受试者基因型为纯合突变基因型GG(左上)。中间散点代表样品中既检测到Fam荧光，又检测到Vic荧光，受试者基因型为野生突变混合基因型CG(中间)。
图3.利用Taqman探针的方法对GRK5rs2230349Arg304HisG>A位点进行基因分型的图示
右下散点表示样品中只检测到Fam荧光，受试者基因型为野生型GG(右下)。左上散点代表样品中只检测到Vic荧光，受试者基因型为纯合突变基因型AA(左上)。中间散点代表样品中既检测到Fam荧光，又检测到Vic荧光，受试者基因型为野生突变混合基因型GA(中间)。
图4.ADRB2rs1042713Arg16GlyA>G位点对心衰预后的影响
X轴坐标代表随访时间，Y轴坐标代表累计生存率，粗黑实线代表AA基因型的患者，虚线代表AG基因型的患者，细黑实线代表GG基因型的患者。图4-AADRB2rs1042713Arg16GlyA>G位点对联合终点事件的影响；图4-B在服用β受体阻滞剂的亚组中ADRB1rs1042713Arg16GlyA>G位点对联合终点事件的影响。图4-C在未服用β受体阻滞剂的亚组中ADRB1rs1042713Arg16GlyA>G位点对联合终点事件的影响。
图5.ADRB2rs1042713Arg16Gly位点预测β受体阻滞剂药物疗效
X轴代表随访时间，Y轴代表累积风险，黑色实线代表服用β受体阻滞剂的患者，虚线代表未服用β受体阻滞剂的患者。图5-AADRB2rs1042713Arg16GlyA>GAA基因型的患者是否服用β受体阻滞剂的生存预后；图5-BADRB1rs1042713Arg16GlyA>GAG基因型的患者是否服用β受体阻滞剂的生存预后；图5-CADRB1rs1042713Arg16GlyA>GGG基因型的患者是否服用β受体阻滞剂的生存预后。
图6.GRK5rs2230349Arg304HisG>A多态性位点对β受体阻滞剂治疗疗效的影响
X轴代表随访时间，Y轴代表累积风险，黑色实线代表服用β受体阻滞剂的患者，虚线代表未服用β受体阻滞剂的患者。图6-AGRK5rs2230349Arg304HisG>AGG基因型患者是否服用β受体阻滞剂的生存预后；图6-BGRK5rs2230349Arg304HisG>AGA基因型患者是否服用β受体阻滞剂的生存预后；图6-CGRK5rs2230349Arg304HisG>AAA基因型患者是否服用β受体阻滞剂的生存预后。
图7.ADRB2rs1042713Arg16Gly,rs1042714Gln27Gly联合预测β受体阻滞剂药物疗效
X轴代表随访时间，Y轴代表累积风险，黑色实线代表服用β受体阻滞剂的患者，虚线代表未服用β受体阻滞剂的患者。图7-AADRB2基因为单倍体型-1的患者是否服用β受体阻滞剂的生存预后；图7-BADRB2基因为单倍体型-2的患者是否服用β受体阻滞剂的生存预后；图7-CADRB2基因为单倍体型-3的患者是否服用β受体阻滞剂的生存预后。
图8.利用改良测序的方法对ADRB2rs1042713Arg16Gly位点进行基因分型的图示
图8-上部表示ADRB2rs1042713位点基因型为AA型，图8-中部表示ADRB2rs1042713位点基因型为AG型，图8-下部表示ADRB2rs1042713位点基因型为GG型。
图9.利用改良测序的方法对ADRB2rs1042714Gln27Glu位点进行基因分型的图示
图9-上部表示ADRB2rs1042714位点基因型为CC型，图9-中部表示ADRB2rs1042714位点基因型为CG型，图9-下部表示ADRB2rs1042714位点基因型为GG型。
图10.利用改良测序的方法对GRK5rs2230349Arg304His位点进行基因分型的图示
图10-上部表示GRK5rs2230349位点基因型为GG型，图10-中部表示ADRB2rs1042713位点基因型为GA型，图10-下部表示ADRB2rs1042713位点基因型为AA型。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。可以理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，其并不作为对本发明的限制。在不偏离于本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。本领域的技术人员将会意识到或能够确认，仅仅使用常规实验，许多等同物都能应用于本文所描述的特定步骤中。这些等同物被认为处在本发明的范围之内，并且被权利要求所覆盖。
实施例1心衰患者ADRB2，GRK5基因上3个多态性位点的基因型检测
我们入选了2403例武汉同济医院心内科住院的心衰病人，患者的入选标准为：1、18-80岁因心衰住院的患者；2、经至少三名临床医师评估确定心功能NYHA分级在Ⅱ-Ⅳ级；3、收缩性心功能不全或舒张性心功能不全都包括在内。4、纳入患者均经过完善的体格检查、血液检查、心电图以及影像学检查。
(1)外周血样本DNA提取：所有受试者在入院未服药情况下，使用EDTA-K2抗凝的采血管采集外周静脉血5ml。以3000转/min离心8分钟，分离白细胞层。使用血液基因组DNA提取试剂盒(TIANGENBIOTECH[BEIJING]GO.,Ltd)提取白细胞DNA.
(2)用Taqman探针基因分型的方法确定ADRB2rs1042713，rs1042714以及GRK5rs2230349多态性位点的基因型，具体方案为：
所有引物及探针的序列由上海基康生物技术有限公司合成，引物及探针序列合成后用Tris-EDTA溶液溶解为100Um/L的浓度保存。其它主要试剂为2*GenotypeMasterMix(购买于美国ABI公司)。
基因分型反应试剂的配制(1/2384孔板用量)：
以上试剂混合均匀，以4.5μl分装于384孔板，每孔加入受试者DNA模板0.6μl，覆盖透明膜，密封。3000g/min离心一分钟后，上机进行PCR反应(AppliedBiosystems7900实时定量PCR仪，ABI,美国)
参数设定为：
扩增以后384孔板放入AppliedBiosystems7900HT进行基因分型程序。
结果解读：入选的2403例样本分型后的结果用SDS2.3软件进行解读。如图1-3所示：右下散点表示样品中只检测到Fam荧光，受试者基因型为野生型(右下)。左上散点代表样品中只检测到Vic荧光，受试者基因型为纯合突变基因型(左上)。中间散点代表样品中既检测到Fam荧光，又检测到Vic荧光，受试者基因型为野生突变混合基因型(中间)。统计如表1：
表1.Taqman探针分型结果统计
(3)准确性验证：
我们针对此批次样品50人检测结果(图1-3)与金标准一代测序结果进行比对，确定准确性。
经一代测序验证后表明：Taqman探针分型的结果与测序分型结果完全一致。
实施例1中所用引物及探针的核酸序列如表2所示：
表2.探针方法中涉及的用于扩增目的片段和特异性识别多态性位点的引物序列
实施例2心衰患者预后和/或β受体阻滞剂药物治疗疗效评估的方法
根据实施例1的检测结果，我们对患者进行了长期随访，在完成基因检测的2403名患者中，随访成功2387例(99.3％)，最长随访时间60个月，平均随访时间20.3个月。
随访信息通过电话随访或走访获得，心源性死亡和心脏移植作为观察的终点事件，SPSS17.0用于统计分析。Kaplan-Meier和Cox-比例风险模型用于评估多态性对于患者生存预后的分析。HR和95％CI用于表示五年心源性死亡和心脏移植的相对危险度。性别、年龄、吸烟、既往病史(包括高血压、高脂血症、糖尿病)和心功能NYHA分级，血NTpro-BNP水平，药物治疗情况在Cox模型中作为影响预后的校正因素。双侧检验p<0.05认为差异显著。
(1)针对ADRB2rs1042713(Arg16Gly，A>G)位点，我们得出以下结论：
(1.1)rs1042713位点的基因型影响患者终点事件发生率，具体表现为：AA型患者(14.0％)，AG型患者(18.8％),GG型患者(22.8％)(Logrankp<0.001)(图4A)。Cox风险比例模型显示：AG型患者和AA型患者相比，风险比(HazardRatio，HR)＝1.41，95％置信区间(95％CI)＝1.13-1.76，p＝0.002；GG型患者与AG型患者相比，HR＝1.22,95％CI，0.94-1,57，p＝0.133；AG/GG型患者相对于AA型患者，HR＝1.49,95％CI，1.21-1.83，p<0.001。
(1.2)在服用β受体阻滞剂的患者中，三种基因型的患者终点事件发生率无统计学差异，具体表现为：AA型患者(10.9％)，AG型患者(10.5％)，GG型患者(12.3％)(Logrankp＝0.732)(图4B)。
(1.3)在未服用β受体阻滞剂的患者中，rs1042713位点基因型影响患者的终点事件发生率，具体表现为：AA型患者(18.4％)，AG型患者(19.8％)，GG型患者(35.6％)(Logrankp＝0.022)(图4C)。Cox风险比例模型显示：AG型患者相对于AA型患者，HR＝1.69，95％CI，1.27-2.24)，p<0.001；GG型患者与AG型患者相比，HR＝1.20，95％CI，0.88-1.63，p＝0.246；AG/GG型患者相对于AA型患者，HR＝1.77，95％CI，1.35-2.32，p<0.001)。
(1.4)β受体阻滞剂能改善rs1042713位点基因型为AG/GG型患者的终点事件发生风险，并呈现G等位基因个数依赖性的特征，然而rs1042713位点AA型的心衰患者并不能从β受体阻滞剂药物治疗中获益。具体表现为：校正传统风险因素后，GG基因型的患者中HR＝0.38；95％置信区间(0.23-0.62)，p<0.001；AG基因型患者HR＝0.62(0.43-0.89)，p＝0.010；AA基因型患者HR＝0.70[0.45-1.10]，p＝0.121)(图5A-C)。
(2)针对GRK5rs2230349(Arg304His，G>A)位点，我们得出以下结论：
β受体阻滞剂能改善GRK5rs2230349等位基因位点为GG型或者GA型的患者的终点事件发生风险，但不能改善在此位点为AA型的患者的终点事件发生风险。具体表现为：在校正传统危险因素后，GG基因型患者中HR＝0.54(0.38-0.76)，p<0.001；AG基因型患者中HR＝0.59(0.40-0.87)，p＝0.008；AA基因型患者中HR＝0.52(0.21-1.27)，p＝0.148(图6A-C)。
(3)针对ADRB2rs1042713以及rs1042714两个多态性位点组成的各种单倍体型，我们得出以下结论：β受体阻滞剂不能改善ADRB2基因单倍体型-1(Arg16Arg/Gln27Gln)的患者的终点事件发生风险，但显著改善ADRB2基因单倍体型-2(以上两个多态性位点不同时为野生型或突变型的单倍体型组合)或ADRB2基因单倍体型-3(Gly16Gly/Glu27Glu)的患者的终点事件发生率。具体表现为：在校正传统危险因素后，单倍体型-1的患者中HR＝0.70(0.44-1.11),p＝0.131；单倍体型-2的患者中HR＝0.60(0.43-0.86),p＝0.004；单倍体型-3的患者中HR＝0.35(0.19-0.65),p＝0.001(图7A-C)。
根据以上分析可知，确定ADRB2rs1042713，rs1042714和GRK5rs2230349的基因分型可以判断心衰患者的长期预后以及对β受体阻滞剂治疗的疗效。其中，(1)当患者rs1042713位点基因型AA基因型的预后较好，AG基因型次之，GG基因型预后最差。(2)当患者的ADRB2基因多态性位点rs1042713为AA型或者GRK5基因多态性位点rs2230349为AA型时予以β受体阻滞剂药物治疗无效；当患者的基因多态性位点rs1042713为AG/GG型或者GRK5基因多态性位点rs2230349为GG/GA型时予以β受体阻滞剂治疗有效。(3)我们定义ADRB2基因rs1042713和rs1042714两个多态性位点的基因型为Arg16Arg/Gln27Gln时为单倍体型-1，rs1042713和rs1042714两个多态性位点的基因型为Gly16Gly/Glu27Glu时为单倍体型-3，其它在以上两个多态性位点并非同时为野生型或突变型的单倍体型组合为单倍体型-2。当患者ADRB2基因为单倍体型-1时，β受体阻滞剂药物治疗无效；当患者ADRB2基因型为单倍体型-2或单倍体型-3时，β受体阻滞剂治疗有效。基于患者基因型的临床治疗方案可以有效的使患者避免无用的治疗，减少患者的痛苦，降低医疗成本，从而真正实现个体化医疗和精确医疗。
实施例3改良测序的方法确定ADRB2rs1042713，rs1042714，rs2230349多态性位点的基因型
抽取实施例1中的50例案例用改良测序的方法确定ADRB2rs1042713，rs1042714，rs2230349多态性位点的基因型，具体如下：
所需引物序列由华大生物科技有限公司合成，引物序列合成后用Tris-EDTA溶液溶解为100Um/L的浓度保存。其它主要试剂为PCR反应体系(包括热启动酶，2*GCbuffer，2.5MdNTP，购于上海大连宝生物公司)、测序反应体系(2.5*bigdyebuffer，5*sequencingbuffer，HIDI，购于美国ABI公司)、醋酸钠、聚乙二醇、乙醇、0.125MEDTA等。
(I)从DNA样品中进行目的片段的特异性扩增，反应体系为：
(II)PCR产物单一条带鉴定，醇/EDTA的方法纯化后再次鉴定目的片段，具体方法为：
(A)每管25μl体系中加入10μl醋酸钠(3M)，40μl聚乙二醇(PDE8000),静置1h以上.
(B)3000g/min离心40min，300r/min倒置离心1min。
(C)每管加入75％乙醇70μl，3000g/min离心30min，300r/min倒置离心1min。
(D)待乙醇彻底挥发后，每管加入10μlddH2O溶解。
(III)Bigdye测序反应(ABI,BigDyeTeminatorV3.1)，反应体系为：
反应条件为：
(IV)bigdye产物纯化，具体方法为：
(A)每管10μl体系加入75％异丙醇100μl，静置30min以上，3000g/min离心30min，300r/min倒置离心1min。
(B)加入含EDTA的75％乙醇(含0.125MEDTA,以70:2的体积比与75％乙醇混合)70μl，3000g/min离心15min，300r/min离心1min。
(C)待乙醇彻底晾干后，加入10μlHIDI，热变性(95℃5min，冰浴5min)后转测序板，上测序仪。
结果解读：测序峰图由Chromas软件截图，如图8-10所示，其中，
图8-上部表示ADRB2rs1042713位点基因型为AA型，图8-中部表示ADRB2rs1042713位点基因型为AG型，图8-下部表示ADRB2rs1042713位点基因型为GG型。
图9-上部表示ADRB2rs1042714位点基因型为CC型，图9-中部表示ADRB2rs1042714位点基因型为CG型，图9-下部表示ADRB2rs1042714位点基因型为GG型。
图10-上部表示GRK5rs2230349位点基因型为GG型，图10-中部表示ADRB2rs1042713位点基因型为GA型，图10-下部表示ADRB2rs1042713位点基因型为AA型。
改良测序方法检测结果统计如表3所示：
表3.改良测序方法结果统计
经传统测序方法鉴定，正确率为100％。
实施例3中所用引物的核酸序列如表4所示：
表4.改良测序方法中涉及的用于扩增目的片段和测序的引物序列

Claims (10)

1.一种检测ADRB2-Arg16Gly(rs1042713)、ADRB2-Gln27Glu(rs1042714)和/或GRK5-Arg304His(rs2230349)多态性位点的基因分型的试剂。
2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述基因多态性位点是(1)ADRB2-Arg16Gly(rs1042713)，或者(2)GRK5-Arg304His(rs2230349)或者(3)ADRB2-Arg16Gly(rs1042713)和ADRB2-Gln27Glu(rs1042714)。
3.如权利要求1或2任一所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括：1、针对包含上述3个SNP位点相应的目标序列的特异性扩增引物对；和/或2、识别多态性位点的检测探针。
4.如权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述特异性扩增引物对为14-30个碱基的寡核苷酸序列，能特异性扩增包含上述多态性位点的目的片段。
5.如权利要求3或4任一所述的试剂，其特征在于，所述检测探针为14-50个核酸的寡核苷酸序列，能特异性的与上述多态性位点特异性杂交。
6.权利要求1-5任一所述试剂在制备试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂盒用于评估心衰患者预后和/或β受体阻滞剂药物治疗疗效。
7.一种用于评估心衰患者预后和/或β受体阻滞剂药物治疗疗效的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-5任一所述的试剂。
8.一种检测ADRB2-Arg16Gly(rs1042713)、ADRB2-Gln27Glu(rs1042714)和/或GRK5-Arg304His(rs2230349)多态性位点的基因分型的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1-5任一所述试剂对样本进行检测。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，包括(1)Taqman探针基因分型的方法；(2)改良测序方法；(3)其他基于特异性扩增和/或识别以上多态性位点及周围序列的方法，如：高分辨率溶解曲线的方法、液相DNA芯片分型方法、固相DNA芯片分型方法、针对包含目的片段的PCR产物的质谱分析技术、限制性内切酶分型技术、等位基因杂交技术、寡核苷酸连接实验等。
10.如权利要求8-9任一所述的方法，其特征在于，所述样本选自：外周血细胞、白细胞、血清、尿样、唾液、体液和/或(活检)组织样本。优选的，所述样本预先进行纯化，例如分离总DNA。
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