KR20060096437A - 비만증에 대한 유전적 표식형질 - Google Patents

비만증에 대한 유전적 표식형질 Download PDF

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KR20060096437A KR1020067007747A KR20067007747A KR20060096437A KR 20060096437 A KR20060096437 A KR 20060096437A KR 1020067007747 A KR1020067007747 A KR 1020067007747A KR 20067007747 A KR20067007747 A KR 20067007747A KR 20060096437 A KR20060096437 A KR 20060096437A
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Abstract

본 발명은 PLIN1:6209T (대립유전자 1)>C (대립유전자 2); PLIN3 10171(대립유전자 1)A>T(대립유전자 2); PLIN4:11482 G(대립유전자 1)>A(대립유전자 2); PLIN5:13041 A(대립유전자 1)>G(대립유전자 2); 및 PLIN6:14995 A(대립유전자 1)>T(대립유전자 2)를 포함하는 페릴리핀 유전자좌(PLIN)에서의 새로운 유전 변이 및 다형성, 및 그들의 비만증 및 비만증 관련 질환(대사 증후군 및 심혈관 질환 등)의 진단 및 예방에 적용하기 위한 용도에 관한 것이다.
비만증, 유전적 표식형질,

Description

비만증에 대한 유전적 표식형질{GENETIC MARKERS FOR OBESITY}
진화하는 동안, 인체는 칼로리 흡수 부족에 대처하기 위해서 정교한 방식으로 발전되어 왔으나, 우리는 단지 최근에서야 이러한 대사 네트워크의 복잡성을 인지하기 시작하였다. 선진 세계에서 풍부한 칼로리를 섭취하는 요즘에는, 이러한 복잡한 복합 시스템이 우리에게 역으로 작동하기 시작하여, 그 결과 비만(obesity) 및 관련 대사질환이 심각하게 다발하고 있다.
지방 세포(adipose tissue)는 인체의 필수 성분이다. 그러나, 너무 많은 체지방은 현재 미국 성인의 약 1/3과 어린이 및 청소년의 14%가 고통받고 있는 심각한 의학적 이상인 비만증을 유발한다. 선진국에서의 에너지원 과다와 앉아서 일하는 라이프스타일에 따른 비만증은 전세계적인 현상이다. 현재, 미국에서, 비만증은 흡연 다음으로 예방가능한 사망의 두번째 주원인으로 불리고 있다(www.obesity. org).
비만증은 환경 및 유전 인자의 조합에 의해 발생하는 대표적인 다인성 질환(multifactorial disease)이다. 인간 비만증이 유전적인 요소에 의한다는 강력한 증거로는, 예를 들면, 가족의 클러스터링(clustering) 및 일란성 쌍둥이 인체조성의 높은 일치성 등을 들 수 있다. 하지만, 유전 인자의 역할은 복잡하며 대부분 여러 유전자의 상호작용에 의해 결정되고, 각 유전자는 비교적 작은 영향을 미친다. 이러한 유전자를 "감수성(susceptibility)" 유전자라 부르며, 그들의 표현형 효과(phenotypic effects)는 영양소 섭취, 신체 활동, 및 흡연 등의 환경적 요인 뿐만 아니라, 상호간의 조합에 의해 나타난다.
지금까지, 적어도 약 80개의 유전자가 비만증과 관련된 것으로 보고되어 있다.(예, Obesity Gene Map Database http://obesitygene.pbrc.edu). 이 유전자들 중 다수는 지방 조직의 형성 및 유지를 조절하는 역할을 한다.
비만증은 종종 다른 질병과 관련되어 있다. 예를 들면, 복부 비만과 관련되어 있으며, 당불내증, 이상지질혈증(dyslipidemia), 및 고혈압을 포함한 "대사 클러스터(metabolic cluster)" 는 종종 대사성 증후군 X(Reaven, 1988) 또는 복부 비만-대사성 증후군(Bjorntorp, 1991)이라고도 불린다. 이러한 증상에 따른 관련성에 근거하여, 복부 지방 패터닝, 총 체지방 과다(total body adiposity), 및 인슐린 저항성이 밀접하게 상호작용하는 것으로 나타나있다. 비만증은 비인슐린 의존 당뇨병(타입 II 당뇨병) 및 기타 수많은 질병이 발병한 성인에게는 이미 존재하는 이상(conditions)이다. 지방 조직 대사에 관한 학문의 진전에도 불구하고, 현재 지방 조직 대사 장애를 치료하는 처방은 아직 불충분하며 신규한 치료법의 개발이 요망되고 있다.
[발명의 개요]
본 발명은 페릴리핀(perilipin) 유전자좌에서의 새로운 유전적 변이 또는 다 형성(polymorphism), 및 비만증 및 관련 대사 질환의 진단 및 예방에 응용하기 위한 그들의 용도에 관한 것이다.
본 발명은
a) 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN1 6209T/C, PLIN3 10171A/T, PLIN4 11482G/A, PLIN5 13041A/G, PLIN6 14995A/T 유전자좌(loci)의 유전자형(genotype)을 결정하는 공정;
b) 상기 공정(a)에서 결정된 PLIN 유전자형에 근거하여 하프로타입(haplotype)을 작성(creating)하는 공정; 및
c) 상기 하프로타입을 상기 개체의 인종적 배경과 관련시키는 공정, 여기서 상기 개체의 인종적 배경에 관련된, PLIN5-G/PLIN6-T; PLIN5-A/PLIN6-T; PLIN1-T/PLIN4-G/PLIN5-G/PLIN6-T; PLIN1-T/PLIN4-G; PLIN1-T/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A; PLIN1-T/PLIN3-A/PLIN4-A/PLIN5-A/PLIN6-T; PLIN1-T/PLIN3-A/PLIN4-A/PLIN5-G/PLIN6-T; PLIN4-A/PLIN5-A/PLIN6-T; PLIN4-A/PLIN5-G/PLIN6-T; PLIN4-G/PLIN5-G/PLIN6-A; PLIN1-T/PLIN3-A 로 이루어진 군에서 선택되는 하프로타입은 개체내의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타냄.
을 포함하는, 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 태양에서는,
a) 코카서스계(Caucasian descent) 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN1 6209T/C, PLIN4 11482G/A, PLIN5 13041A/G, PLIN6 14995A/T 유전자좌의 유전 자형을 결정하는 공정;
b) 상기 공정(a)에서 결정된 PLIN 유전자형에 근거하여 하프로타입을 작성하는 공정; 및
c) 상기 하프로타입을 상기 개체의 인종적 배경과 관련시키는 공정, 여기서 PLIN5-G/PLIN6-T; PLIN5-A/PLIN6-T; 및 PLIN1-T/PLIN4-G/PLIN5-G/PLIN6-T로 이루어진 군에서 선택되는 하프로타입은 코카서스계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타냄.
을 포함하는, 코카서스계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 태양에서는,
a) 지중해연안계(Mediterranian descent) 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN1 6209T/C, PLIN4 11482G/A, PLIN5 13041A/G, PLIN6 14995A/T 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정;
b) 상기 공정(a)에서 결정된 PLIN 유전자형에 근거하여 하프로타입을 작성하는 공정; 및
c) 상기 하프로타입을 상기 개체의 인종적 배경과 관련시키는 공정, 여기서 PLIN1-T/PLIN4-G; PLIN1-T/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A; 및 PLIN1-T/PLIN4-G/PLIN5-G/PLIN6-T로 이루어진 군에서 선택되는 하프로타입은 지중해연안계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타냄.
을 포함하는, 지중해연안계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 태양에서는,
a) 말레이계(Malayan descent) 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN1 6209T/C, PLIN3 10171A/T, PLIN4 11482G/A, PLIN5 13041A/G, PLIN6 14995 A/T 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정;
b) 상기 공정(a)에서 결정된 PLIN 유전자형에 근거하여 하프로타입을 작성하는 공정; 및
c) 상기 하프로타입을 상기 개체의 인종적 배경과 관련시키는 공정, 여기서 PLIN1-T/PLIN3-A/PLIN4-A/PLIN5-A/PLIN6-T; PLIN1-T/PLIN3-A/PLIN4-A/PLIN5-G/PLIN6-T; PLIN4-A/PLIN5-A/PLIN6-T; PLIN4-A/PLIN5-G/PLIN6-T; PLIN4-G/PLIN5-G/PLIN6-A; 및 PLIN1-T/PLIN3-A로 이루어진 군에서 선택되는 하프로타입은 말레이계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타냄.
을 포함하는, 말레이계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 태양에서는,
a) 인도계(Indian descent) 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN1 6209T/C, PLIN3 10171A/T, PLIN4 11482G/A, PLIN5 13041A/G, PLIN6 14995 A/T 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정;
b) 상기 공정(a)에서 결정된 PLIN 유전자형에 근거하여 하프로타입(haplotype)을 작성하는 공정; 및
c) 상기 하프로타입을 상기 개체의 인종적 배경과 관련시키는 공정, 여기서 PLIN1-T/PLIN3-A/PLIN4-A/PLIN5-A/PLIN6-T; PLIN4-A/PLIN5-A/PLIN6-T; PLIN4-G/PLIN5-G/PLIN6-T; 및 PLIN1-T/PLIN3-A로 이루어진 군에서 선택되는 하프로타입은 인도계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타냄.
을 포함하는, 인도계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 태양에서는, 코카서스계 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN5 13041A/G, PLIN6 14995A/T 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정을 포함하고, 상기 PLIN 5 유전자좌의 대립유전자 G(allele G)의 동형접합성(homozigosity) 또는 상기 PLIN 6 유전자좌의 대립유전자 T의 동형접합성이 코카서스계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타내는, 코카서스계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 태양에서는, 말레이계 또는 인도계 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN6 14995A/T 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정을 포함하고, 상기 PLIN 6 유전자좌의 대립유전자 T의 동형접합성은 말레이계 또는 인도계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타내는, 말레이계 또는 인도계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 태양에서는, 말레이계 또는 인도계 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN4 11482G/A 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정을 포함하 고, 상기 PLIN 4 유전자좌의 대립유전자 A의 동형접합성은 말레이계 또는 인도계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타내는, 말레이계 또는 인도계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 태양에서는, 말레이계 또는 인도계 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN5 13041A/G 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정을 포함하고, 상기 PLIN5 유전자좌의 대립유전자 G의 동형접합성은 말레이계 또는 인도계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타내는, 말레이계 또는 인도계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 태양에서는, 상기 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 평가하는 개체가 여성이다.
본 발명의 하나의 태양에서는, 상기 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 평가하는 개체가 체중 감소 다이어트 처치되어 있다.
본 발명의 하나의 태양에서는, 상기 비만증 관련 질환이 심혈관 질환이다.
본 발명의 하나의 태양에서는, 상기 비만증 관련 질환이 대사 증후군(metabolic syndrome)이다.
본 발명의 하나의 태양에서는,
a) 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN1 6209T/C, PLIN3 10171A/T, PLIN4 11482G/A, PLIN5 13041A/G, PLIN6 14995A/T 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정;
b) 상기 공정(a)에서 결정된 PLIN 유전자형에 근거하여 하프로타입을 작성하는 공정; 및
c) 상기 하프로타입을 상기 개체의 인종적 배경과 관련시키는 공정, 여기서 상기 개체의 인종적 배경에 관련된, PLIN5-A/PLIN6-A; PLIN1-C/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A; PLIN1-C/PLIN4-A; PLIN1-C/PLIN4-A/PLIN5-A/PLIN6-A; PLIN1-T/PLIN3-T/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A; PLIN1-C/PLIN3-A/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A; 및 PLIN1-C/PLIN3-T로 이루어진 군에서 선택되는 하프로타입은 개체내의 감소된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타냄.
을 포함하는, 개체에서의 감소된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 태양에서는,
a) 코카스계 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN1 6209T/C, PLIN4 11482G/A, PLIN5 13041A/G, PLIN6 14995A/T 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정;
b) 상기 공정(a)에서 결정된 PLIN 유전자형에 근거하여 하프로타입을 작성하는 공정; 및
c) 상기 하프로타입을 상기 개체의 인종적 배경과 관련시키는 공정, 여기서 PLIN5-A/PLIN6-A 및 PLIN1-C/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A로 이루어진 군에서 선택되는 하프로타입은 코카서스계 개체에서의 감소된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타냄.
을 포함하는, 코카서스계 개체에서의 감소된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 태양에서는,
a) 지중해연안계 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN1 6209T/C, PLIN4 11482G/A, PLIN5 13041A/G, PLIN6 14995A/T 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정;
b) 상기 공정(a)에서 결정된 PLIN 유전자형에 근거하여 하프로타입을 작성하는 공정; 및
c) 상기 하프로타입을 상기 개체의 인종적 배경과 관련시키는 공정, 여기서 PLIN1-C/PLIN4-A 및 PLIN1-C/PLIN4-A/PLIN5-A/PLIN6-A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하프로타입은 지중해연안계 개체에서의 감소된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타냄.
을 포함하는, 지중해연안계 개체에서의 감소된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 태양에서는,
a) 말레이계 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN1 6209T/C, PLIN3 10171A/T, PLIN4 11482G/A, PLIN5 13041A/G, PLIN6 14995A/T 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정;
b) 상기 공정(a)에서 결정된 PLIN 유전자형에 근거하여 하프로타입을 작성하는 공정; 및
c) 상기 하프로타입을 상기 개체의 인종적 배경과 관련시키는 공정, 여기서 PLIN1-T/PLIN3-T/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A; PLIN1-C/PLIN3-A/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A 및 PLIN1-T/PLIN3-T로 이루어진 군에서 선택되는 하프로타입은 말레이계 개체에서의 감소된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타냄.
을 포함하는, 말레이계 개체에서의 감소된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 태양에서는,
a) 인도계 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN1 6209T/C, PLIN3 10171A/T, PLIN4 11482G/A, PLIN5 13041A/G, PLIN6 14995A/T 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정;
b) 상기 공정(a)에서 결정된 PLIN 유전자형에 근거하여 하프로타입을 작성하는 공정; 및
c) 상기 하프로타입을 상기 개체의 인종적 배경과 관련시키는 공정, 여기서 PLIN1-C/PLIN3-A/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A; PLIN1-C/PLIN3-A/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A; 및 PLIN1-C/PLIN3-C로 이루어진 군에서 선택되는 하프로타입은 인도계 개체에서의 감소된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타냄.
을 포함하는, 인도계 개체에서의 감소된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 태양에서는, 감소된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 평가하는 상기 개체가 여성이다.
또한, 본 발명은 PLIN1 6209T/C, PLIN3 10171A/T, PLIN4 11482G/A, PLIN5 13041A/G, PLIN6 14995A/T 다형성(polymorphisms)을 커버하는 핵산 영역을 증폭시키기 위한 프라이머쌍(primer pairs), 및 비만증의 증가 또는 감소된 위험과 연관된 상기 하프로타입과 그들의 인종 군과의 상호 관련성을 포함하는 지시서(instructions)를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 하나의 태양에서는, 상기 키트는 PLIN1 다형성을 커버링하는 핵산 영역을 증폭시키기 위한 서열번호 1 및 서열번호 2; PLIN3 다형성을 커버링하는 핵산 영역을 증폭시키기 위한 서열번호 7 및 서열번호 8; PLIN4 다형성을 커버링하는 핵산 영역을 증폭시키기 위한 서열번호 10 및 서열번호 11; PLIN5 다형성을 커버링하는 핵산 영역을 증폭시키기 위한 서열번호 13 및 서열번호 14; PLIN6 다형성을 커버링하는 핵산 영역을 증폭시키기 위한 서열번호 16 및 서열번호 17의 프라이머쌍, 및 비만증의 증가 또는 감소된 위험과 연관된 상기 하프로타입과 그들의 인종 군과의 상호 관련성을 포함한 지시서를 포함한다.
도 1은 PLIN 다형성의 명명(nomenclature)을 나타낸다. 본 발명에서 조사된 다형성의 위치는 수직의 짧은 선으로 표시되어 있고, 그 아래에 이름이 기재되어 있다. 위의 사각형 유전자 도표는 본 발명의 명명에서 "+1"로 표시된 누클레오티드를 포함하는 서열을 나타낸다. 개시 메티오닌 코돈(initiator Methionine codon) ATG의 A는 굵은 이탤릭체로 표시되어 있고, 위에 라벨된 참조 서열(GenBank accession No.GI21431190)상에서의 그 유전자 위치를 표시하고 있다. 그 대응 아 미노산도 기재되어 있다. 빗금친 사각형은 선택적 스플라이싱(alternative splicing)이 일어날 수 있는 영역을 나타낸다.
도 2는 표본 1의 여성의 PLIN5 및 PLIN6를 조절한 후의, PLIN1 및 PLIN4 SNPs의 조합 유전자형(combined genotype)에 대한 BMI를 나타낸다. 나이-조정 평균(age-adjusted means); 에러 바: SEM.
도 3은 표본 1로부터 여성의 PLIN1 및 PLIN4를 조절한 후의, PLIN5 및 PLIN6 SNPs의 조합 유전자형에 대한 BMI를 나타낸다. 나이-조정법; 에러 바:SEM.
도 4a 및 4b는 다이어트 후에, PLIN4 야생형 대립유전자 1을 가진 여성과 PLIN4 대립유전자 2의 캐리어를 보유자에서의 체중의 증가 또는 감소 결과를 나타내는 그래프이다. 그래프는 이형접합성 PLIN4 대립유전자 2를 가진 여성이 다이어트를 지속하지 않을 경우 훨씬 더 체중이 증가하기 쉽다는 것을 명백하게 나타내고 있다.
도 5는 연구 집단에서의 LD 매트릭스 챠트를 나타낸다. 4개의 유전자형으로 나타낸 PLIN SNPs(6209C>T, 11482G>A, 13041A>G, 및 14995A>T) 사이의 짝짓기(pairwise) LD 측도(D')는 대각선 위쪽에 표시되어 있는 반면, 대응하는 P 값은 대각선 아래쪽에 표시되어 있다.
도 6은 여성의 PLIN 13041A>G 및 14995A>T SNPs의 유전자형 사이의 인체 비만 측도(BMI, %체지방, 및 허리), 및 표준 에러의 차이점을 나타내는 그래프이다. PLIN 13041A>G SNP에 대해서는, 11=AA, 12=AG이고, 14995A>T SNP에 대해서는 11=AA, 및 22=TT이다.
도 7은 싱가포르에서의 인종에 따른 LD 매트릭스 챠트를 나타낸다. 5개의 유전자형으로 나타낸 PLIN SNPs(6209C>T, 10171A>T, 11482G>A, 13041A>G, 및 14995A>T) 사이의 짝짓기 LD 측도(D')는 대각선 위쪽에 표시되어 있는 반면, 대응하는 P 값은 대각선 아래쪽에 표시되어 있다.
도 8은 말레이계 및 인도계의 PLIN 11482G>A, 13041A>G, 및 14995A>T에 대한 비만증(BMI≥30kg/㎡)에 대한 각종 PLINS의 교차비(odds ratio(OR))(다변량 OR 및 95%CI)를 나타내는 그래프이다. 각 SNP에 대하여, 야생형 동형접합체를 가진 유전자형 군 및 그 이형접합체를 참고예로 사용하였다. OR은 동형접합 변이와 상기 참고예를 비교하여 얻었다.
본 발명은 PLIN1:6209T(대립유전자 1)>C(대립유전자 2); PLIN3 10171(대립유전자 1)A>T(대립유전자 2); PLIN4:11482G(대립유전자 1)>A(대립유전자 2); PLIN5:13041A(대립유전자 1)>G(대립유전자 2); 및 PLIN6:14995A(대립유전자 1)>T(대립유전자 2)를 포함하는 페릴리핀 유전자좌(PLIN)에서의 새로운 유전적 변이(genetic variations) 또는 다형성(polymorphism), 및, 이들의 비만증 및 관련 대사 질환에 대한 진단 및 예방적 적용의 용도는 물론, 이들의 비만증 및 관련 대사 질환의 치료의 용도에 관한 것이다. 참고한 서열 번호들은 GenBank sequence ID No.gi21431190이다.
본 발명은 더 낮은 신체비만지수(body mass index(BMI))와 관련이 있고, 그 결과 비만증 및 심혈관 질환 등의 비만증 관련 대사 질환을 막는 신규한 PLIN 하프로타입(haplotype), 또한 증강된 BMI와 관련이 있고, 비만증 및 심혈관 질환 및 대사 증후군(metabolic syndrome) 등의 비만증 관련 대사 질환의 위험 인자인 PLIN 하프로타입에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "지중해연안계(Mediterranean descent) 개체"는, 특히 제한은 없지만, 스페인, 프랑스, 이탈리아, 및 포르투칼 등을 포함하는 지리학적으로 지중해 연안 지역 출신의 조상을 가진 사람을 말한다. 바람직하게는, 적어도 한쪽 조상이 지리학적으로 지중해 연안 지역 출신이다.
본 명세서에서 사용되는 "코카서스계(Caucasian descent) 개체"는, 특히 제한은 없지만, 지리학적으로 북부, 동부, 또는 중앙 유럽 지역 출신의 조상을 가진 사람을 말한다. 통상 이 개체들은 밝은 피부색을 갖고, 특히 제한은 없지만, 북아메리카, 잉글랜드, 러시아, 및 독일 등의 지역 출신이다. 바람직하게는, 적어도 한쪽 조상이 북부, 동부, 또는 중앙 유럽 출신이다.
본 명세서에서 사용되는 "말레이계(Malayan descent) 개체"는, 특히 제한은 없지만, 말레이시아, 인도네시아, 부루네이, 및 싱가포르 등의 지리학적으로 말레이시아 또는 그 주변 지역 출신의 조상을 가진 사람을 말한다. 바람직하게는, 적어도 한쪽 조상이 말레이시아 및 그 주변 지역 출신이다.
본 명세서에서 사용되는 "인도계(Indian descent) 개체"는, 특히 제한은 없지만, 인디아, 파키스탄, 네팔 및 방글라데시 등의 지리학적으로 인도 또는 그 주변 지역 출신의 조상을 가진 사람을 말한다. 바람직하게는, 적어도 한쪽 조상이 인도 또는 그 주변 지역 출신이다.
심혈관 질환(Cardiovascular diseases:CVD) 또는 순환계 질환은 심장동맥, 대뇌동맥 또는 말초동맥의 죽상경화 장애(atherosclerotic impairment)에 기인한 다양한 임상적인 이상을 나타낸다. CVD는 요즘 선진국에서 남성과 여성의 주요한 사망 원인으로서 고려된다. CVD에 대한 상세한 역학 자료는 위험 인자를 요약해놓은 미국 심장 학회의 "2002 심장 및 통계학적 업데이트(2002 Heart and Statistical Update)"로부터 입수할 수 있다. 61,800,000명의 미국인들은 하나 이상의 유형의 CVD로부터 고통받고 있다(Rational diagnosis of cardiovascular disease, Muller M M, Griesmacher A, eJIFCC Vol 14 no 2: http://www.ifcc.org/ejifcc/vol14no2/ 1402062003012n.htm). 현재, 마이오트로핀(myotropin) 및 심장 트로포닌(Id) 등의 허혈 이상 하에서 심장 근세포로부터 방출되는 소위 "초기" 및 "후기" 표지형질(marker)의 사용을 포함하여 급성 심혈관 질환을 진단하기 위한 여러개의 표지형질가 있다.
대사 증후군은 한 사람내에서의 대사 위험 인자 군에 의해 특징지어진다. 이들은 a)중심 비만(복부 내 및 주변에 과잉의 지방 조직), b)죽종형성 이상지질혈증(플라크를 조성하는 혈액 지방이 동맥 벽에 축적됨), c)상승된 혈압(130/85mmHg 이상), d)인슐린 저항성 또는 당불내성, e)항섬유소용해 상태(prothrombotic state)(예, 혈액내의 증가된 피브리노겐 또는 플라스미노겐 활성화제 저해제-1) 및 f)호염증성 상태(proinflammatory state)(예, 혈액내의 증가된 고감성 C-반응성 단백질)를 포함한다. 이러한 증후군의 근원적인 원인인 과체중/비만, 신체 비활동 및 유전 인자이다. 대사 증후군을 가진 사람들은 관상동맥 심질환, 동맥벽에 축적되는 플라크와 관련된 기타 질환(예, 뇌졸중 및 말초혈관질환), 및 타입 2 당뇨병의 위험이 증가되어 있다.
본 발명의 하나의 태양에서는, 개체내의 PLIN 하프로타입을 결정함으로써 심혈관 질환 및 대사성 증후군에 대한 감수성을 평가하는 신규한 방법을 제공한다.
페릴리핀(PLIN)은 지방세포내의 지질 저장 방울을 에워싸고 있는, 호르몬에 의해 조절되는 인단백질이다(Greenberg, A. S.; Egan, J. J.: Wek, S. A.; Takeda, T.; Londos, C.; Kimmel, A. K. (Abstract) Clin . Res . 39:287A only, 1991). 이것은 지방 세포내의 주요한 세포성 A-kinase 기질로서 세포내 지질 방울을 코팅하고 지방세포의 지질분해 활성을 조정한다. Nishiu 등이 지방 조직 cDNA 라이버러리로부터 인간 페릴리핀을 코드하는 cDNA를 클로닝하였다(Genomics 48:254-527, 1998; GenBank Nucleic Acid ID No.gi:3041990). 이 인간 유전자는 Greenberg 등에 의해 분리된 래트(rat) 호몰로그와 79% 동일한, 522개의 아미노산으로 된 폴리펩티드를 코드한다(Proc . Nat . Acad . Sci . 90:12035-12039, 1993).
본 발명은 비만증 및 심혈관질환 등의 관련 대사 장애와 페릴리핀 유전자좌(PLIN)에서의 수개의 신규한 유전적 변이의 관련성의 확인 및 평가에 근거한 것이며, 상기 변이는 PLIN1:6209T>C; PLIN3:10171A>T; PLIN4:11482G>A; PLIN5:13041A>G 및 PLIN6:14995A>T를 포함한다.
본 발명자들은 지중해연안 집단으로부터 무작위로 선발한 남성 788명과 여성 801명(표본 1), 및 입원한 비만 환자 157명(표본 2)에서의 PLIN 다형성과 하프로타입의 관련성을 측정하였다. 놀랍게도, 전체 집단 중에서, 페릴리핀의 덜 흔한 대립유전자(the less common alleses of perilipin), 즉 PLIN1 대립유전자 2 및 PLIN4 대립유전자 2가, 여성에서의 감소된 비만증 위험과 유의적으로 관련이 있었다(각각 OR=0.65, 95%CI:0.48-0.88 및 OR=0.60, 95%CI:0.44-0.83). 또한, 놀랍게도 본 발명자들은 표본 1의 여성에서, PLIN1 및 PLIN4의 덜 흔한 대립유전자가, 야생형 즉 대립유전자 1에 비해서 더 낮은 BMI와 관련이 있음을 알아내었다. 이 여성들에 있어서, PLIN4도 더 낮은 허리-엉덩이둘레 비율, 공복시 혈당, 및 플라즈마 트리아실글리세롤 농도와 관련이 있었다. 하프로타입 분석에 의해, 모든 여성에서, 이러한 결과가 확증되었으며, BMI에 대한 PLIN1 및 PLIN4의 시너지 효과가 드러났다. 표본 1의 남성에서는 통계학적으로 유의한 관련성이 확인되지 않았다. 그럼에도 불구하고, 비만 남성에서, PLIN4의 덜 흔한 대립유전자의 보유자는 미보유자보다 낮은 BMI를 유의하게 가지고 있었다. 비만 남성 및 여성 모두에서, PLIN1 및 PLIN4의 덜 흔한 대립유전자는 더 높은 혈장 글루코스와 관련이 있었으며, 표본 1과는 달랐다(상호작용에 대한 P<0.05). 따라서, 본 발명의 데이터는, PLIN-2/PLIN4-2 하프로타입이 보호 비만-감수성 하프로타입(protective obesity-susceptibility haplotype)이며 대사 증후군 및 심혈관 질환의 발병에 대해 암시함을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 하나의 태양에서는, 개체의 비만증 및 비만증 관련 질환에 걸리기 쉬운 소인(predisposition)을 평가하는 방법을 제공한다. 이 방법은 개체로부터 채취하여 분리한 핵산 시료 중의 PLIN 다형성을 동정 및 분석하는 것을 포함하며, 여기서 PLIN1 대립유전자 1 및 PLIN4 대립유전자 1이 상기 핵산 시료(예, PLIN1-1/PLIN4-1 하프로타입)의 동일 염색분체에 함께 존재하는 것은 비만증 및 관련 대사 질환에 걸리기 쉬운 유전적 소인이 있음을 나타낸다. 바람직하게는 상기 개체는 지중해연안계 또는 코카서스계이다.
본 발명의 하나의 태양에서는 개체의 심혈관 질환에 걸리기 쉬운 소인을 평가하는 방법을 제공한다. 이 방법은 개체로부터 채취하여 분리한 핵산 시료 중의 PLIN 다형성을 동정 및 분석하는 것을 포함하며, 여기서 PLIN1 대립유전자 1 및 PLIN4 대립유전자 1이 상기 핵산 시료(예, PLIN1-1/PLIN4-1 하프로타입)의 동일 염색분체에 존재하는 것은 심혈관 질환에 걸리기 쉬운 소인이 있음을 나타낸다. 바람직하게는 상기 개체는 지중해연안계 또는 코카서스계이다.
필요에 따라서, 본 발명의 하나의 태양에서는 체중이 잘 증가하지 않고, 또한 다이어트 후에, 감소된 체중을 더 잘 유지할 것으로 예상될 수 있는 개체를 동정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 상기 PLIN 대립유전자들에 대한 개체로부터 분리한 핵산을 분석하는 공정을 포함하며, 여기서 PLIN1 및 PLIN4의 대립유전자 2의 존재는 개체내의 비만증 방어 유전자형(obesity protective genotype)이 존재함을 나타낸다. 바람직하게는 상기 개체는 지중해연안계 또는 코카서스계이다.
또한, 본 발명은 비만증 및/또는 심혈관 질환 등을 포함하는 비만증 관련 질환이 발병할 위험이 있는 개체를 진단하는데 유용한 하프로타입을 제공한다. 이들 하프로타입 중 하나는 PLIN1; PLIN4; PLIN5; 및 PLIN6을 포함하는 다형성으로 이루어진다. 따라서, 하프로타입 1111은 상기 모든 유전자좌에서 대립유전자 1로 이루어지고, 하프로타입 2222는 상기 모든 유전자좌에서 대립유전자 2로 이루어진다. 개체, 바람직하게는 여성으로부터 분리한 핵산 시료의 하프로타입 2211은 그 개체가 비만증 및/또는 심혈관 질환의 발병에 대하여 감소된 위험을 가짐을 나타낸다. 반대로, 하프로타입 1122 또는 1111을 가진 개체는 비만증 및/또는 심혈관 질환의 발병에 대하여 증가된 위험을 갖는다. 바람직하게는, 예방 및/또는 진단을 위해 이들을 사용하는 경우, 상기 개체는 코카서스계 또는 지중해연안계이다.
본 발명의 또다른 태양에서는, 다이어트 후에 체중이 다시 증가할 위험이 있는 개체를 동정하는 방법을 제공한다. 본 방법은 개체로부터 분리한 핵산 시료의 PLIN4 유전자좌를 분석하는 공정을 포함하며, 상기 PLIN4 유전자좌의 하나 또는 두개의 대립유전자에 대립유전자 2가 존재하는 것은 체중 재증가의 증가된 위험을 나타낸다.
또한 본 발명자는 다민족 아시아 집단에서 상기 각종 PLIN 유전자좌에서의 개체의 다형성 및 그 PLIN 하프로타입의 관련성을 측정하였다. 본 발명자는 페릴리핀(PLIN) 유전자좌 PLIN1 , PLIN3 , PLIN4 , PLIN5 및 PLIN6에서의 5개의 흔한 단일염기다형성(SNPs:single nucleotide polymorphisms)을 조사하였으며, 그 다형성은 각각 PLIN 6209C>T, 10171A>T, 11482G>A, 13041A>G, 및 14995A>T 였다. 본 발명자는 비만증 위험 및 대사성 증후군과 관련된 기타 변수와의 그들의 관련성을 조사하였다. 이 연구 집단은 싱가포르에 거주하는 3개의 인종군(중국인, 말레이인, 및 인도인) 4,131명의 피험자를 포함하고 있다. 분석은, 하프로타입 11212는 말레이인 및 인도인 둘 다에 분배되었으며, 가장 흔한 하프로타입 21111에 비해서 증가된 비만증 위험과 유의하게 관련됨을 보여준다(말레이인에 대해서는 OR=1.65, 95%CI 1.11-2.46, 인도인에 대해서는 OR=1.94, 95%CI 1.06-3.53). 나이, 성별, 흡연, 음주, 운동 및 당뇨 상태를 포함한 공변량(covariates)을 보정(adjusting)한 후, 포지티브 LD에 있는 SNP 서브그룹(11482G>A, 13041A>G, 및 14995A>T)을 사용하여 서로서로 하프로타입을 분석한 결과, 하프로타입 212(OR=2.04, 95%CI 1.28-3.25) 및 222(OR=2.05, 95%CI 1.35-3.12)는 말레이인의 증가된 비만 위험과 관련이 있고, 하프로타입 212(OR=2.16, 95%CI 1.10-4.26)는 인도인의 증가된 비만 위험과 유의하게 관련이 있음이 밝혀졌다. 개체의 SNP 분석은, 공변량 보정 후, 상기 PLIN 14995A>T SNP는 말레이인(OR=2.28, 95%CI 1.45-3.57) 및 인도인(OR=2.04, 95%CI 10.8-3.84) 모두에서 증가된 비만증 위험과 유의하게 관련이 있음을 확인되었다. 반면에 상기 PLIN 11482G>A(OR=1.94, 95%CI 1.22-3.08) 및 PLIN 13041A>G(OR=1.87, 95%CI 1.08-3.25)는 말레이인에서만 증가된 비만증 위험과 관련이 있었다.
그러므로, 본 발명의 하나의 태양에서는, 말레이계 또는 인도계 개체에서의 비만증 관련 질환이 발병할 증가된 위험을 평가하는 방법을 제공한다. 이 방법은 상기 개체로부터 채취하여 분리한 핵산 시료에서의 PLIN 다형성을 동정 및 분석하는 공정을 포함하며, 여기서, 하프로타입 PLIN4-2/PLIN6-2, 즉, PLIN4 대립유전자 2 및 PLIN6 대립유전자 2가 상기 핵산 시료의 동일한 염색분체에 함께 존재하는 것은 개체에서의 비만증 및 관련 질환이 발병할 위험이 있음을 나타낸다.
본 발명의 하나의 태양에서는 말레이계 또는 인도계 개체의 심혈관 질환에 걸리기 쉬운 소인을 평가하는 방법을 제공한다. 이 방법은 개체로부터 채취하여 분리한 핵산 시료에서의 PLIN 다형성 및 하프로타입을 동정 및 분석하는 공정을 포함하며, 여기서, 하프로타입 PLIN4-2/PLIN6-2, 즉, PLIN4 대립유전자 2 및 PLIN6 대립유전자 2가 상기 핵산 시료의 동일한 염색분체에 함께 존재하는 것은 심혈관 질환에 걸리기 쉬운 소인이 있음을 나타낸다.
본 발명의 또다른 태양에서는, 말레이계 또는 인도계 개체의 비만증 또는 비만증 관련 질환에 걸리기 쉬운 소인을 평가하는 방법을 제공한다. 이 방법은 개체로부터 채취하여 분리한 핵산 시료에서의 PLIN6 유전자좌를 동정 및 유전자형을 결정하는 공정을 포함하며, 여기서, PLIN6의 대립유전자 T(대립유전자 2)에 대한 동형접합의 존재는 말레이계 또는 인도계 개체의 비만증 및 관련 질환의 증가된 위험을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 태양에서는, 말레이계 또는 인도계 개체의 비만증 또는 비만증 관련 질환에 걸리기 소인을 평가하는 방법을 제공한다. 이 방법은 개체로부터 채취하여 분리한 핵산 시료에서의 PLIN4 유전자좌를 동정 및 유전자형을 결정하는 공정을 포함하며, 여기서, PLIN4의 대립유전자 A(드문 대립유전자(rare allele))에 대한 동형접합의 존재는 말레이계 또는 인도계 개체의 비만증 및 관련 질환의 증가된 위험을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 태양에서는, 말레이계 또는 인도계 개체의 비만증 또는 비만증 관련 질환에 걸리기 쉬운 소인을 평가하는 방법을 제공한다. 이 방법은 개체로부터 채취하여 분리한 핵산 시료에서의 PLIN5 유전자좌를 동정 및 유전자형을 결정하는 공정을 포함하며, 여기서, PLIN5의 대립유전자 G(드문 대립유전자)에 대한 동형접합의 존재는 말레이계 또는 인도계 개체의 증가된 비만증 및 관련 질환 위험을 나타낸다.
또한, 본 발명은 비만증 및/또는 비만증 관련 질환이 발병할 증가된 위험이 있는 말레이인 또는 인도인을 진단하는데 유용한 하프로타입을 제공한다. 하나의 하프로타입은 PLIN1; PLIN3; PLIN4; PLIN5; 및 PLIN6을 포함하는 다형성으로 이루어진다. 따라서, 하프로타입 11111은 상기 모든 유전자좌에서 대립유전자 1로 이루어지고, 하프로타입 22222는 상기 모든 유전자좌에서 대립유전자 2로 이루어진다. 말레이계 개체로부터 분리한 핵산 시료에서의 하프로타입 11212 또는 11222는 그 개체가 비만증 및/또는 심혈관 질환의 발병에 대하여 증가된 위험을 가짐을 나타낸다. 인도계 개체로부터 분리한 핵산 시료에서의 하프로타입 11212는 그 개체가 비만증 및/또는 심혈관 질환의 발병에 대하여 증가된 위험을 가짐을 나타낸다. 말레이계 개체로부터 분리한 핵산 시료에서의 하프로타입 12111 또는 21111는 비만증의 감소된 위험과 관련되어 있다. 또한, 인도계 개체로부터 분리한 핵산 시료에서의 하프로타입 21111는 감소된 비만증 위험과 관련이 있다.
말레이계 및 인도계 개체를 진단하는데 유용한 또다른 하프로타입은 PLIN4; PLIN5; 및 PLIN6을 포함하는 다형성으로 이루어진다. 따라서, 하프로타입 111은 상기 모든 유전자좌에서 대립유전자 1로 이루어지고, 하프로타입 222는 상기 모든 유전자좌에서 대립유전자 2로 이루어진다. 그리고, 말레이계 개체로부터의 하프로타입 212, 222, 또는 121은 그 개체가 비만증 및/또는 심혈관 질환의 발병에 대하여 증가된 위험을 가짐을 나타낸다. 인도계 개체로부터 분리한 핵산에 존재하는 하프로타입 212 또는 122는 그 개체가 비만증 및/또는 심혈관 질환의 발병에 대하여 증가된 위험을 가짐을 나타낸다.
본 발명의 다른 태양에서는, 말레이계 또는 인도계 개체의 비만증 또는 비만증 관련 질환에 걸리기 쉬운 소인을 평가하는 방법을 제공한다. 이 방법은 개체로부터 분리한 핵산내의 PLIN1 및 PLIN3 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정과 이들 2개의 유전자좌를 포함하는 표현형(phenotype)을 작성하는 공정을 포함하며, 여기서, 하프로타입 PLIN1-1/PLIN3-1, 즉, PLIN1 대립유전자 1 및 PLIN3 대립유전자 1이 동일한 염색분체에 함께 존재하는 것은 비만증 및/또는 심혈관 질환 발병에 대한 증가된 위험을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 태양에서는, 체중이 잘 증가하지 않고 또한 다이어트 후에, 감소된 체중을 더 잘 유지할 것으로 예상할 수 있는 말레이계 또는 인도계 개체를 동정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 개체로부터 분리한 핵산내의 상기 PLIN 및 PLIN 3 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정 및 그 PLIN 대립유전자에 대한 하프로타입을 작성하는 공정을 포함하며, 여기서, 하프로타입 PLIN1-1/PLIN3-2, 즉, PLIN1 대립유전자 1 및 PLIN3 대립유전자 2가 동일 염색분체에 함께 존재하는 것은 개체내의 비만증 방어 유전자형의 존재를 나타낸다.
또한, 본 발명자는 미국에 거주하는 코카서스계 개체에서의 PLIN 다형성과 하프로타입의 관련성을 결정하는 연구를 수행하였다. 4개의 PLIN SNPs(PLIN 6209C>T, 11482G>A, 13041A>G, 및 14995A>T)는 주거 라이프스타일 간섭 프로그램에 참여한 734명(남성 373명 및 여성 361명)의 백인 피험자의 유전자형을 결정하였다. 다변량 분석(multivariate analysis)은 여성에서, 상기 SNPs 중 두개(13041A>G, 및 14995A>T)가 %체지방(13041A>G에 대해서는 P=0.016 및 14995A>T에 대해서는 P=0.010) 및 허리 둘레(13041A>G에 대해서는 P=0.020 및 14995A>T에 대해서는 P=0.045)와 유의하게 관련이 있음을 증명하였다. 게다가, 이들 두 SNPs를 이용한 하프로타입 분석은 하프로타입 PLIN5-A/PLIN6-T 및 PLIN5-G/PLIN6-T 둘다, PLIN5-A/PLIN6-A와 비교했을 때, 유의하게 증가된 비만증 위험(하프로타입 PLIN5-A/PLIN6-T에 대해서는 OR=1.76, 95%CI 1.07-2.90이고, 하프로타입 PLIN5-G/PLIN6-T에 대해서는 OR=1.73, 95%CI 1.06-2.82)과 관련이 있음을 나타내었다. 따라서, PLIN은 코카서스인의 비만증 위험에 대한 중요한 유전적인 결정인자(genetic determinant)이며 여성은 남성보다 페릴리핀의 유전적인 효과에 더 민감하다.
따라서, 본 발명의 하나의 태양에서는, 코카서스계 개체의 비만증 및 비만증 관련 질환에 걸리기 쉬운 소인을 평가하는 방법을 제공한다. 이 방법은 코카서스계 개체로부터 채취하여 분리한 핵산 시료에서의 PLIN 다형성의 유전자형을 결정하고 하프로타입을 작성하는 공정을 포함하며, 상기 핵산 시료 중의 하프로타입 PLIN5-2/PLIN6-2 또는 PLIN5-1/PLIN6-2의 존재는 개체에서의 비만증 및 관련 질환이 발병할 증가된 위험을 나타낸다. 바람직하게는 상기 개체는 여성이다.
본 발명의 하나의 태양에서는, 코카서스계 개체의 심혈관 질환에 걸리기 쉬운 소인을 평가하는 방법을 제공한다. 이 방법은 코카서스계 개체로부터 채취하여 분리한 핵산 시료에서의 PLIN 다형성의 유전자형을 결정하고 하프로타입을 작성하는 공정을 포함하며, 상기 핵산 시료 중의 하프로타입 PLIN5-2/PLIN6-2 또는 PLIN5-1/PLIN6-2의 존재는 심혈관 질환이 발병할 증가된 위험을 나타낸다. 바람직하게는 상기 개체는 여성이다.
필요에 따라서, 본 발명의 하나의 태양에서는 체중이 잘 증가하지 않고 또한 다이어트 후에, 감소된 체중을 더 잘 유지할 것으로 예상할 수 있는 코카서스계 개체를 동정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 개체로부터 핵산을 분리하는 공정, PLIN 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정을 포함하며, PLIN5 및 PLIN6의 대립유전자 1의 존재는 개체내의 비만 방어 유전자형이 존재함을 나타내고 다이어트 후의 체중을 더 잘 유지할 수 있는 개체임을 나타낸다. 바람직하게는 상기 개체는 여성이다.
본 발명은 또한, 비만증 및/또는 심혈관 질환 등을 포함하는 비만증 관련 질환이 발병할 위험이 있는 코카서스계 개체를 진단하는데 유용한 하프로타입을 제공한다. 이들 하프로타입 중 하나는 PLIN1; PLIN4; PLIN5; 및 PLIN6 유전자좌에서의 대립유전자로 이루어진다. 따라서, 하프로타입 1111은 상기 모든 유전자좌에서 대립유전자 1로 이루어지고, 하프로타입 2222는 상기 모든 유전자좌에서 대립유전자 2로 이루어지며, 코카서스계 개체로부터 분리한 핵산 시료에서의 하프로타입 1122은 그 개체가 비만증 및/또는 심혈관 질환에 더 걸리기 쉬움을 나타내며, 하프로타입 2111을 가진 코카서스인은 비만증 및/또는 심혈관 질환에 덜 걸림을 나타낸다(표 15 참고).
또한, 본 발명은 신규한 PLIN 다형성을 제공하고, 또한 본 발명의 SNP 부위를 포함하여 증폭함에 의한 상기 신규한 PLIN 다형성 분석에 유용한 올리고누클레오티드를 제공한다. 본 발명은 상기 증폭된 서열의 서열분석(sequencing)에 유용한 올리고누클레오티드를 더 제공한다.
본 발명의 하나의 태양에서는, PLIN1 , PLIN2 , PLIN3 , PLIN4 , PLIN5 및 PLIN6을 증폭시키기 위한 프라이머는 각각 서열번호 1 및 2, 서열번호 4 및 5, 서열번호 7 및 8, 서열번호 10 및 11, 서열번호 13 및 14, 및 서열번호 16 및 17에 기재되어 있는 핵산 서열이다.
본 발명은 하기의 신규한 다형성을 더 제공한다:
PLIN1:6209 T(대립유전자 1)>6209 C(대립유전자 2); PLIN3 10171(대립유전자 1)A>10171 T(대립유전자 2); PLIN4:11482 G(대립유전자 1)>11482 A(대립유전자 2); PLIN5:13041 A(대립유전자 1)>13041 G(대립유전자 2); 및 PLIN6:14995 A(대립유전자 1)>14995 T(대립유전자 2). 하기 챠트를 참조한다.
유전자좌 대립유전자 1 대립유전자 2
PLIN1 T C
PLIN3 A T
PLIN4 G A
PLIN5 A G
PLIN6 A T
따라서, 본 발명의 하나의 태양에서는, 지중해연안계 개체의 체중 증가 및/또는 심혈관 질환에 대한 위험 인자 성향인 다형성(polymorphisms)을 제공한다. 하나의 태양에서는, 상기 다형성은 PLIN1(6209 T)의 대립유전자 1이다. 또다른 태양에서는, 상기 다형성은 PLIN4(11482 G)의 대립유전자 1이다.
본 발명의 또다른 태양에서는, 코카서스계 개체의 체중 증가 및/또는 심혈관 질환에 대한 위험 인자 성향인 다형성을 제공한다. 상기 PLIN 유전자좌에서의 동형접합체로서 동정했을 때, 그들은 체중 증가의 증가된 위험과 관련이 있다. 하나의 태양에서는, 상기 다형성은 PLIN5(13041 G)의 대립유전자 G이다. 또다른 태양에서는, 상기 다형성은 PLIN6(14995 T) 대립유전자 T이다.
본 발명의 또 다른 태양에서는, 말레인계 또는 인도계 개체에서, 동형접합 대립유전자로서 존재할 때, 체중 증가 및/또는 심혈관 질환에 대한 위험 인자 성향인 다형성을 제공한다. 이 다형성은 PLIN6(14995 T) 유전자좌의 대립유전자 2, 즉, PLIN6에서의 T/T는 위험 인자이다.
본 발명의 또다른 태양에서는, 말레이계 개체의 체중 증가 및/또는 심혈관 질환에 대한 위험 인자 성향인 다형성을 제공한다. 하나의 태양에서는, 상기 다형성은 PLIN5(13041 G)의 대립유전자 2이다. 또다른 태양에서는, 상기 다형성은 PLIN4(11482 G)의 대립유전자 2이다.
또한, 본 발명은 비만증 및 비만증 관련 질환에 걸릴 성향이 적은 개체를 동정하는 진단 방법을 제공하며, 이 방법은 개체로부터 핵산 시료를 얻는 공정, 분리된 핵산을 분석하는 공정, 시료 중의 대립 유전자 변이의 유전자형을 결정하는 공정 및 그 유전자형으로부터 하프로타입을 작성하는 공정을 포함한다. 표 15는, 표시된 인종군의 개체에 존재할 경우, 그 개체가 비만증 및 비만증 관련 질환에 걸릴 성향이 적음을 나타내는 하프로타입을 설명한다. 표 15에서 하프로타입은 수직으로 읽히며, 예를 들면, 하프로타입(a)은 PLIN5-A/PLIN6-A이고, 하프로타입(h)은 PLIN1-C/PLIN3-A/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A이다.
또한, 본 발명은 비만증 및 심혈관 질환 등의 비만증 관련 질환의 증가된 위험이 있는 개체를 동정하는 진단 방법을 제공한다. 이 방법은 개체로부터 핵산 시료를 얻는 공정, 그 분리된 핵산을 분석하는 공정, 그 시료내의 대립유전자 변이의 유전자형을 결정하는 공정 및 그 유전자형으로부터 하프로타입을 작성하는 공정을 포함한다. 표 16은, 표시된 인종군의 개체에 존재할 경우, 그 개체는 비만증 및 비만증 관련 질환이 발명할 증가된 위험이 있음을 나타내는 하프로타입을 설명한다. 표 16에서 하프로타입은 수직으로 읽히며, 예를 들면, 하프로타입(k)은 PLIN5-G/PLIN6-T이고, 하프로타입(w)은 PLIN1-T/PLIN3-A/PLIN4-A/PLIN5-A/PLIN6-T이다.
본 발명의 또다른 태양에서는, 비만증 및 심혈관 질환 등의 비만증 관련 질환이 발병할 위험이 있는 여성을 동정하기 위한 진단 방법을 제공하며, 이 방법은 여성 개체로부터 핵산 시료를 얻는 공정, 다형성 부위를 포함하여 증폭하기 위해 적당한 PLIN-PCR 프라이머를 사용하여 서열을 증폭시키는 공정, 그 시료 중의 대립유전자 변이를 검출하는 공정, 및 그 결과를 분석하는 공정을 포함한다.
본 발명에서 핵산을 분리하기 위한 원료 물질로 사용된 생물학적 시료는 고형 재료(예, 조직, 세포 펠렛, 생검) 및 생체액(예, 혈액, 타액, 양수, 함수제(含漱劑), 오줌)를 포함한다. 본 발명의 핵산 분자는 DNA 및 RNA를 포함하며, 공지된 어떠한 다수의 공정을 이용하여 특정 생물학적 시료로부터 분리할 수 있고, 선택된 상기 특정한 분리 공정은 특정 생물학적 시료에 적합하다. 상기한 바와 같은 핵산 변이를 분리 및 분석하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들면 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Sambrook and Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.을 참조할 수 있다.
본 발명의 PLIN 다형성은, 서든 블랏 하이브리다이제이션(DNA) 또는 직접 핵산 서열분석(direct nucleic acid sequencing) 등의 분리된 핵산의 직접 분석을 포함하는 기술을 이용하여 분리된 핵산으로부터 검출할 수 있다(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Sambrook and Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001).
상기 PLIN 다형성의 직접 분석을 위한 본 발명에 의한 유용한 또다른 방법은 INVADERTM 분석법(Third Wave Technologies, Inc(Madison, WI)). 이 분석법은, 통상, 표적의존적인 절단 구조(target-dependent cleavage structure)를 절단하는데 사용되는 다양한 효소의 구조 특이적 누클레아제(nuclease) 활성에 의거한 것으로서, 시료내에 특이적 핵산 서열 또는 특이적 변이가 존재함을 나타낸다(참조, 미국 특허 No. 6,458,535).
바람직하게는, PCR에 의거한 기술이 사용된다. PCR 후에, 상기 다형성 핵산은, 예를 들면 방사능 또는 형광 표지된 프라이머 등의 표지 프라이머를 사용하는 직접 서열분석(direct sequencing); 단일가닥 입체 다형성 분석법(SSCP:single-strand conformation polymorphism analysis); 변성 구배 겔 전기영동법(DGGE: denaturing gradient gel electrophoresis); 및 화학 절단 분석(chemical cleavage analysis)을 이용하여 동정할 수 있으며, 이들 모두, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Sambrook and Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001에 상세히 기재되어 있다.
상기 다형성은 프라이머 연장 분석(primer extension analysis)용 다른 방법 등의 자동화될 수 있는 방법을 사용하여 바람직하게 분석할 수 있다. 프라이머 연장 분석은 PYROSEQUENCINGTM (Uppsala, Sweden); MALDI-TOF(Matrix assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight) 등의 질량 분광측정법(mass spectrometry)(Shalon et al., Genome Research 6(7):639-45, 1996; Bernard et al., Nucleic Acids Research 24(8):1435-42, 1996); 고체상 미니-서열분석 기술(solid-phase mini-sequencing technique)(미국특허 No.6,013,421, Suomalainen et al. Mol. Biotechnol. Jun;15(2):123-31, 2000); 이온쌍 고성능 액체 크로마토그래피(ion-pair high-performance liquid chromatography)(Doris et al., J. Chromatogr. A May 8;806(1):47-60, 1998); 및 5' 누클레아제 분석법 또는 실시간 RT-PCR(Holland et al. Proc Natl Acad Sci USA 88:7276-7280, 1991), 또는 미국 특허 No.6,355,433에 기재되어 있는 프라이머 연장법을 포함한 당업자에게 공지된 어느 하나의 방법을 수행할 수 있다. 예를 들면, 어떠한 자동화 서열분석 시스템 및 표지 프라이머나 표지 터미네이터 디데옥시누클레오티드를 사용한 핵산 서열분석도 다형성 검출에 사용될 수 있다. 자동화 서열분석용 시스템으로는, 예를 들면, 히타치 FMBIOTM 및 히타치 FMBIOTM II 형광 스캐너(Hitachi Genetic Systems, Alameda, CA); SpectrumedixTM SCE 9610 완전 자동화 96-캐필러리 전기영동 유전 분석 시스템(SpectruMedix LLC, State College, PA); ABI PRISMTM 377 DNA 서열분석기; ABITM 373 DNA 서열분석기; ABI PRISMTM 310 유전 분석기; ABI PRISMTM 3100 유전 분석기; ABI PRISMTM 3700 DNA 분석기(Applied Biosystems, Headquarters, Foster City, CA); Molecular Dynamics FluorImagerTM 575 및 SI 형광 스캐너 및 Molecular Dynamics FluorImagerTM 595 형광 스캐너(Amersham Biosciences UK Limited, Little Chalfont, Buckingharmshire, England); Genomyx SCTM DNA 서열분석 시스템(Genomyx Corporation(Foster City, Calif.)); Pharmacia ALFTM DNA 서열분석기 및 Pharmacia ALFexpressTM(Amersham Biosciences UK Limited, Little Chalfont, Buckingharmshire, England)를 들 수 있다.
하나의 핵산 시료에 대한 PCR, 핵산 서열분석 및 프라이머 연장 반응은 상기 다형성 PLIN 누클레오티드를 증폭 및 검출하도록 설계된 프라이머를 사용하여 동일 또는 별개의 반응으로 수행할 수 있다.
본 발명의 하나의 태양에서는, PLIN-관련 비만증 및/또는 심혈관 질환 등의 비만증 관련 질환의 발병 위험이 있는 개체, 또는 PLIN-관련 비만증 및/또는 심혈관 질환 등의 비만증 관련 질환으로부터 보호된 개체의 스크리닝을 위한 상기 다형성 PLIN1, PLIN3, PLIN4, PLIN4, 및 PLIN6 대립유전자를 포함하는 핵산 칩을 제공한다. 이러한 칩은 렙틴(leptin), 렙틴 수용체, MC4R 등을 포함하여 다른 비만증 관련 돌연변이 및 다형성의 다수를 포함한다. 비만증 관련 유전자 및 다형성의 목록은, 예를 들면, Chagnon, Y.C., Perusse, L., Weisnagel, S. J., Rankinen, T. 및 Bouchard, C. 인간 비만 유전자 지도:The 1999 Update. Obesity Research 8(1):89-117, 2000, 및 http://www.obesity.chair.ulaval.ca/genemap.html. 웹상에서 확인할 수 있다.
어레이 합성(array synthesis)에 적용할 수 있는 방법 및 기술은 U.S.S.N 09/536,841, WO 00/58516, 미국특허 No. 412,087, 6,147,205, 6,262,216, 6,310,189, 5,889,165, 및 5,959,098, 5,143,854, 5,242,974, 5,252,743, 5,324,633, 5,384,261, 5,405,783, 5,424,186, 5,451,683, 5,482,867, 5,491,074, 5,527,681, 5,550,215, 5,571,639, 5,578,832, 5,593,839, 5,599,695, 5,624,711, 5,631,734, 5,795,716, 5,831,070, 5,837,832, 5,856,101, 5,858,657, 5,936,324, 5,968,740, 5,974,164, 5,981,185, 5,981,956, 6,025,601, 6,033,860, 6,040,193, 6,090,555, 6,136,269, 6,269,846 및 6,428,752, PCT 출원 No. PCT/US99/00730(국제공개번호 WO 99/36760) 및 PCT/US01/04285에 기재되어 있고, 이들 모두, 모든 목적에 대하여 온전히 참고로 기재한다. 부가적인 시료 준비 방법 및 핵산 시료의 복잡성을 줄이기 위한 기술은, 예를 들면, Dong et al., Genomic Research 11, 1418(2001), 미국특허 No. 6,361,947, 6,391,592 및 미국특허출원 No.09/916,135, 09/920,491, 09/910,292, 및 10/013,598에 기재되어 있다.
칩 상에서의 폴리누클레오티드 하이브리다이제이션 분석을 행하는 방법은 잘 개발된 공지의 기술이다. 하이브리다이제이션 분석 방법 및 조건은 그 적용예에 따라서 변경되며, Maniatis et al. Molecular Cloning : A Laboratory Manual(2nd Ed., Cold Spring Harbor, N.Y,1989); Berger 및 Kimmel Methods in Enzymology, Vol.152, Guide to Molecular Cloning Techniques(Academic press, Inc., San Die해, CA, 1987); Young 및 Davism, P.N.A.S, 80:1194(1983).에서 참고하는 것을 포함하여 공지의 통상 결합법(general binding method)에 따라 선택된다. 반복 및 제어된 하이브리다이제이션 반응을 수행하기 위한 방법 및 장치는, 예를 들면, 미국특허 5,871,928, 5,874,219, 6,045,996 및 6,386,749, 6,391,623에 개시되어 있고, 각각은 참고로 여기에 기재하였다.
시그널 검출 및 강도(intensity) 데이터 처리 방법 및 장치의 예는, 예를 들면, 미국특허 5,143,854, 5,547,839, 5,578,832, 5,631,734, 5,800,992, 5,834,758, 5,856,092, 5,902,723, 5,936,324, 5,981,956, 6,025,601, 6,090,555, 6,141,096, 6,141,096, 6,185,030, 6,201,639, 6,218,803, 및 6,225,625, 미국특허출원 60/364,731, 및 PCT 출원 PCT/US99/06097(공개번호 WO99/47964)에 개시되어 있고, 각각은 모든 목적에 대하여 온전히 참고로 여기에 기재하였다.
또한 본 발명의 실시는 종래의 생물학적 방법, 소프트웨어 및 시스템을 적용할 수 있다. 본 발명의 컴퓨터 소프트웨어 제품은 본 발명의 방법의 논리 스텝(step)을 수행하기 위한 컴퓨터-실행가능 지시서를 갖춘 컴퓨터-판독가능 매체(computer-readable medium)를 포함한다. 적합한 컴퓨터-판독가능 매체로는 플로피 디스크, CD-ROM/DVD/DVD-ROM, 하드디스크 드라이브, 플래쉬 메모리, ROM/RAM, 마그네틱 테입 등을 들 수 있다. 상기 컴퓨터로 실행가능한 지시서는 적합한 컴퓨터 언어 또는 여러 언어의 조합으로 기록될 수 있다. 기본적인 전산 생물학법(basic computational biology methods)은, 예를 들면, Setubal 및 Meidanis et al., Introduction to Computational Biology Methods(PWS Publishing Company, Boston, 1997); Salzberg, Searles, Kasif, (Ed.), Computational Methods in Molecular Biology,(Elsevier, Amsterdam, 1998),; Rashidi 및 Buehler, Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine(CRC Press, London, 2000) 및 Ouelette 및 Bzevanis Bioiformatics: A practical Guide for Analysis of Gene and Proteins(Wiley & Sons, Inc. 2nd ed., 2001)에 기재되어 있다.
또한, 본 발명은 프로브 설계, 데이타 조작, 분석, 및 기기 작동 등의 다양한 목적으로, 여러 컴퓨터 프로그램 제품 및 소프트웨어를 사용한다. 예를 들면, 미국특허 No. 5,593,839, 5,795,716, 5,733,729, 5,974,164, 6,066,454, 6,090,555, 6,185,561, 6,188,783, 6,223,127, 6,229,911 및 6,308,170을 참조한다.
부가적으로, 본 발명은 인터넷 등의 네트워크를 통해 유전 정보를 제공하는 방법을 포함하는 바람직한 태양을 가져도 좋다.
본 발명은 진단 키트를 더 제공한다. 본 발명의 하나의 태양에서는, 본 발명의 비만증 관련 다형성 누클레오티드를 포함하는 PLIN 핵산 영역을 증폭시킬 수 있는 하나 이상의 프라이머쌍; PCR 반응용 완충액 및 누클레오티드 혼합물; 동일 또는 별개의 용기에서의 PCR 반응에 적합한 효소; 및, 예를 들면, 하기 실시예에 기재된 바와 같은, PCT 조건을 규정하고 또한 본 명세서에 기재한 것과 같은 비만증 관련 대립유전자 및 하프로타입을 나타낸 지시 메뉴얼을 포함하는 키트를 제공한다. 이 키트는 바람직하게는 표 1에 나타낸 핵산 프로브를, 튜브나 바이알 내에 건조한 형태로 또는 완충액 중에 더 포함해도 좋다. 바람직한 태양에서는, 이들 프라이머는 표 1에 나타낸 것들이다. 프라이머는 튜브나 바이알내에 건조한 형태로, 또는 필요에 따라서, 적당한 수성 완충액에 용해되어 키트에 제공될 수 있다. 상기 키트는 상기한 바와 같은 특이적 PLIN 다형성을 검출하기 위한 프라이머 연장용 프라이머도 포함할 수 있다.
상기 키트는 바람직하게는, 하기에 나타낸 표 15 및 16과 같은, 다양한 인종집단에서의 비만증 위험 하프로타입을 나타내는 표를 포함한다.
본 발명의 하나의 태양에서는 상기 키트의 구성성분은 당업자에게 공지된 다중 비만증 관련 유전자, 다형성 및 돌연변이를 제공하는 키트의 일부이다.
DNA 하프로타입, 수개의 다형성 표지형질(예, SNPs)의 단계 결정 관련성(phase determined association)은 질병 관련성을 결정하기 위한 단일 표지형질 단독으로 사용하는 것보다 통계학적으로 훨씬 더 강력한 방법이다. 본 발명에 의해 하프로타입을 결정 및 동정하기 위한 시도는, 예를 들면 마우스 세포주 하이브리드 방법을 통한 상동 염색체의 분리적 분리, 플라스미드로의 클로닝 및 대립유전자 특이적 PCR은 물론 하프로타입의 전산에 의한 결정을 포함한다.
본 발명에 의하면, PLIN 유전자좌에서의 SNPs의 하프로타입 결정에 사용할 수 있는 방법으로는, 특히 제한은 없으며, 단일가닥 구조 다형성(SSCP) 분석(Orita et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766-2770), 헤테로듀플렉스(heteroduplex) 분석(Prior et al., (1995) Hum. Mutat. 5:263-268), 올리고누클레오티드 연결(ligation)(Nickerson et al.(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8923-8927) 및 하이브리다이제이션 분석(Conner et al.(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:278-282)을 들 수 있다. PCR-RELP, 대립유전자 특이적 증폭(allele-specific amplification:ASA)(Ruano 및 Kidd(1989) Nucleic Acids Res. 17:8392), 단일 분자 희석(single-molecule dilution:SMD)(Ruano et al.(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6296-6300), 및 공역 증폭 및 서열분석(coupled amplification and sequencing:CAS)(Ruano 및 Kidd(1991) Nucleic Acids Res. 19:6877-6882) 등의 전통적인 Taq 폴리머라제 PCR에 근거한 방법이 쉽게 수행되며, 본 발명의 하프로타입을 결정하기 위한 상당히 민감한 방법이다(Michalatos-Beloin et al.(1996) Nucleic Acids Res. 24:4841-4843; Barnes (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699; Ruano 및 Kidd(1991) Nucleic Acids Res. 19:6877-6882).
하나의 태양에서, 장기(long-range) PCR(LR-PCR)은 본 발명의 SNPs의 하프로타입 결정에 사용된다. LR-PCR 산물은 당업자에게 공지된 어느 유전자형 결정법(genotyping method) 이용하여 SNPs에 대한 유전자형이 결정되며, 하프로타입은 수학적 방법(예, 클락의 알고리즘(Clark's algorithm)(Clark(1990) Mol. Biol. Evol. 7:111-122)를 이용하여 추론된다.
하나의 태양에서, 본 발명에 의한 유용한 하프로타입 결정법(haplotyping method)은 클로닝에 의한 대립유전자의 물리적 분리 후에, 서열분석하는 방법이다. 본 발명에 의한 유용한, 다른 하프로타입 결정법으로는, 특히 제한은 없지만, 단일대립유전자 변이 분석(monoallelic mutation analysis:MAMA)(Papadopoulos et al.(1995) Nature Genet. 11:99-102) 및 카본 나노튜브 프로브(Woolley et al.(2000) Nature Biotech. 18:760-763)를 들 수 있다. 미국특허출원 No.US2002/ 0081598도 PCR 증폭을 포함한 유용한 하프로타입 결정법을 개시하고 있다.
기대값-최대화(expectation-maximization:EM), 차감(substraction) 및 PHASE 등의 계산 알고리즘(computational algorithm)은 하프로타입의 통계적 추정을 위한 유용한 방법이다(예, Clark, A.G. 이배체 집단의 PCR-증폭 시료로부터 하프로타입의 추정. Mol Biol Evol 7, 111-22.(1990); Stephens, M., Smith, N.J. & Donnelly, P. 집단 데이터로부터 하프로타입 재구성을 위한 새로운 통계학적 방법. Am J Hum Genet 68, 978-89.(2001); Templeton,A.R., Sing, C.F., Kessling, A. & Humphries, S. 제한 누클레아제 맵핑 II로부터 추정된 하프로타입과의 표현형 관련성에 대한 분기(分岐)적 분석(cladistic analysis). 자연 집단 분석. Genetics 120, 1145-54(1988)).
상술한 모든 방법들은 본 발명의 방법에 따른 하프로타입의 결정에 적용할 수 있는 유용한 방법이다.
[ 실시예 1: 스페인 동부 지중해연안 출신 개체에서의 비만증 관련 변수에 대한 PLIN 다형성( polymorphisms )의 성별 특이적 효과]
재료 및 방법
피험자 및 연구 설계
총 1746명의 서로 관련없는 백인 피험자가 이 보고에 포함되었다. 이 연구 집단은 스페인 동부 지중해연안의 발렌시아 지역에서 무작위로 선발된 1589명의 개체(표본 1)와, 동일 지역에 위치한 대학종합병원(University General Hospital)에 입원한 157명의 비만 피험자(표본 2)를 포함한다. 간단히, 표본 1은 남성 788명과 여성 801명으로 이루어지고, 나이가 18~85세이며, 지중해연안 스페인인 집단에서 유전적 및 환경적인 심혈관 질환 위험 인자의 유병률을 확인할 목적의 연구에 참여하는 개체들 중에서 선택되었다(14,15). 이 표본은 컴퓨터에 지속적으로 갱신되어 등록된 인구 명부를 사용하여, 무작위로 선발한 노동자와, 일반 집단(general population)으로부터 무작위로 선발한 피험자도 포함한다(15,16). 이 피험자들 모두 1999년과 2002년 사이에 조사되었다. 나이가 18∼78세인 남성 29명과 여성 128명으로 이루어진 표본 2는 2001년과 2002년 사이에 연속하여 체중 감량 치료를 받은 개체들 중에서, 발렌시아 대학종합병원 내분비학 유니트로부터 무작위로 선발하였다. 기초 자료는 본 연구를 위해 사용되었다. 이 연구 프로토콜은 발렌시아 대학 및 대학종합병원의 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 포함된 모든 피험자는 참여에 대한 고지에 입각한 동의서를 작성하였고 이용가능한 PLIN 유전자형과 조사되는 다른 변수들에 대한 데이터를 제공하였다. 표본 1 피험자의 평균 나이는 41.5 ±13.4세 였고, 표본 2 피험자의 평균 나이는 47.0±13.7세였다. 단면(cross-sectional) 연구법, 또한 사례-대조 연구법(case-control approach)이 통계학적 분석에 응용되었다. 상기 사례-대조 연구법에서, 438명의 피험자(병원에서 157명 및 일반 집단 중 281명)는 그들의 신체비만지수(BMI:body mass index) ≥ 30Kg/㎡ 일 때 비만으로 분류하였다. 일반 집단 중의 나머지 1308명의 피험자는 미비만(non-obese)으로 분류하였다.
인체 측정 및 혈압 측정
인체 측정은 표준 기법을 사용하여 행하였다: 디지탈 저울로 얇은 옷을 입고 체중을 달고; 고정된 스타디오메터(stadiometer)로 신발을 신지 않고 키를 측정하였다. BMI는 몸무게(kg)/키(㎡)로 계산하였다. 허리 둘레는 제일아래 갈비뼈 끝과 엉덩뼈 능선 사이의 중간쯤을 수평으로 측정하였다. 엉덩이 둘레는 엉덩이 위의 최고 둘레를 형성하는 지점에서 측정하였다. 혈압은, 표준화된 수은 맥압계를 이용하여, WHO MONICA 프로토콜에 따라서, 수축기 혈압(SBP)과 확장기 혈압(DBP)의 첫번째 및 5번째 코로코프음을 두번 연속으로 읽은 값의 평균으로 구하였다.
생화학, 임상 및 라이프스타일 데이터
참여자들에게 아침 검사 전 12시간 동안 금식하도록 지시하였다. 정맥혈을 EDTA-함유 유리 튜브에 모은 후, Technicon Chem 분석법(Technicon Instruments, Tarrytown, NY)에 의해 혈장 총 콜레스테롤 및 TAGs를 측정하고, 헤파린-염화망간 으로 지질단백질을 함유하는 아포지방단백질을 침전시킨 후에 상징액 중의 고밀도 지질단백질 콜레스테롤(high-density lipoprotein cholesterol:HDL-C)을 측정하였다. 혈청 TAG 농도가 400mg/dL 이하인 시료에 대해서는 Friedewald et al.(17)의 식에 따라 저밀도 지질단백질 콜레스테롤(LDL-C)를 계산하였다. 공복시 혈당치는 헥소키나제(hexokinase) 시약 키트를 사용하여 프레쉬한 시료 상태로 측정하였다.
성별, 생년월일, 인종, 결혼 여부, 교육, 의학, 건강 문제, 타입 2 당뇨병 병력, 흡연 여부, 음주 여부 및 신체 활동에 관한 데이터는 이미 보고된 바와 같이 자가기입식 설문지로 평가하였다(14). 현재 흡연자는 하루에 한 개비 이상을 피우는 사람으로 규정하였다. 음주는 평일 및 주말동안 알콜성 음료의 음용에 대한 22개의 질문 세트로 주의 깊게 평가하였다. 신체 활동은 규칙적으로 여가 시간에 하는 신체 운동 및 각 활동에 소비하는 주당 평균 시간에 대한 질문으로부터 추정하였다. 종류 및 시간에 따라서, 피험자를, 비활동(신체 운동하지 않음), 중간(하나의 스포츠를 주당 3시간 미만으로 함), 높음(하나의 스포츠를 주당 3시간 이상 하거나 주당 2개 이상의 스포츠를 함)으로 분류하였다. 그 다음, 이 변수를 비활동성(신체 운동 안함) 대 활동성(중간 + 높음)의 둘로 나누었다. 교육은 초등, 중등 및 대학(사이클 I(3년) 및 사이클 II(5년 이상) 포함함)의 3개의 카테고리로 분류하였다(14,15).
DNA 추출 및 유전자형 결정
게놈 DNA는 백혈구로부터 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 분리 하였다. 이 연구에서 조사된 6개의 단일염기다형성(SNPs)에 대한 설명 및 명명법은 도 1 및 표 1에 나타낸다. 상기 다형성은 가장 최근 권고에 따라서 명명하였다(18). 참고 서열은 GI21431190(GenBank)이다. 유전자형 결정(genotyping)은 단일 누클레오티드 연장(Single Nucleotide Extension)을 이용하여 수행하였다. 우선, 4개의 다형성을 포함하는 DNA 단편을 다중 PCR에 의해 증폭시켰다. 사용된 프라이머는 표 1에 나타낸다. PCR 산물은 PLIN1 , PLIN2 , PLIN3 , PLIN4 , PLIN5 및 PLIN6에 대하여, 각각 422bp, 391bp, 318bp, 350bp, 190bp, 및 469bp였다. PCR 증폭은 각 dNTP 0.2mmol/L, 각 프라이머 0.2μmol/L, 염화마그네슘 3.0mmol/L , 및 Qiagen Hotstar Taq 폴리머라제 0.8U를 함유하는 10㎕의 반응 용적으로 수행하였다. PCR 사이클링 조건은 95℃에서 10분간 반응한 후, 95℃에서 30초, 70℃에서 30초, 및 72℃에서 1분의 사이클을 7사이클 행한 다음, 95℃에서 30초, 65℃에서 30초, 및 72℃에서 1분의 사이클을 41사이클 행하였다. 72℃에서 2분의 최종 연장 단계는 프로토콜의 마지막에 포함된다. 상기 PCR 산물에 엑소누클레아제 I(New England Biolabs,Inc. Beverly, MA) 및 소내장 인산분해효소(calf intestinal phosphatase)(New England Biolabs,Inc. Beverly, MA)를 2.5U 첨가하고, 37℃에서 60분간 배양하여 결합되지 않은 dNTP와 프라이머를 제거하였다. 그 다음, 75℃에서 15분간 배양하여 상기 효소들을 비활성화시켰다.
그 다음, ABI Prism SnaPshot 다중 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 단일 누클레오티드 연장을 수행하였다. 단일 누클레오티드 연장에 사용된 프로브는 표 1에 나타내었다. 상기 연장 반응은 PCR 반응기(PCR thermocycler)를 사용하여, 1.5㎕ Snapshot Ready Reaction Mastermix(Applied Biosystems, Foster City, CA), 물 1.0㎕, 다중 PCR 산물 1.5㎕ 및 프로브 혼합물(PLIN1 , PLIN2 , PLIN3 및 PLIN4에 대해서는 1.5μmol/L, PLIN5 및 PLIN6 에 대해서는 2.0μmol) 1.0㎕을 함유하는 5㎕의 반응 혼합물에서 수행하였다. 상기 반응 조건은 96℃에서 30초, 50℃에서 30초, 및 60℃에서 30초의 사이클을 35사이클로 하였다. 상기 반응 산물은 소내장 인산분해효소 3U를 첨가하고 37℃에서 60분간 배양하여, 결합되지 않은 dNTP를 제거한 다음, 75℃에서 15분간 배양하여 상기 효소들을 비활성화시켰다. Genotyper version 3.7((Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 ABI Prism 3100 유전 분석기((Applied Biosystems, Foster City, CA) 상에서, 상기 최종 산물의 유전자형을 결정하였다.
통계학적 분석
대립유전자 빈도는 유전자 카운팅으로 추정하였으며, 95% 신뢰구간(CI)으로 계산하였다. χ2 테스트(피어슨의 카이제곱검정법, 피셔의 직접확률검정법, 또는 몬테칼로 방법)를 사용하여 관측 빈도와 예상 빈도 사이의 차이를 테스트하고, 하디-와인버그 평형을 취하면서, 연쇄불균형(linkage disequilibrium)을 테스트하고, 퍼센트 차이를 테스트하였다. 짝짓기 연쇄불균형 계수(pairwise linkage disequilibrium coefficient)는 LINKAGE 프로그램에 의해 추정하였다. D 및 D'(D/Dmax) 계수를 계산하였다. 하프로타입은 기대-최대화 알고리즘(expectation- maximization algorithm)을 이용하는 EH 프로그램에 의해 추정하여, 하프로타입 빈도의 최우도 추정(maximum-likelihood estimate)을 얻었다. 모든 연속 변수에 대한 정상 분포가 체크되었다. 트리글리세라이드는 정규성(normality)을 향상시키기 위해서 대수적으로 변형되었다. 모수적 시험(parametric test)은 평균을 비교하는데 적용되었다. 또한, 각 하위집단에서의 사례의 수가 매우 작을 때는, 비모수적 시험(Mann-Whitney 또는 Kruskal-Wallis)을 적용하였다. 유전적 변이와 비만증 관련 표현형 사이에 관련성이 없다는 귀무 가설을 테스트하기 위해서는 범주형 조항에 대한 더미변수를 이용하는 다변량 선형 회귀 분석(multivariate linear regression analysis)이 이용되었다. 이러한 통계학적 모델에 의해, 공변량 보정 후 유전적 다형성과 각 종속 변수(비만증 관련 표현형)의 관련성을 추정할 수 있다. 주 공변량은 성별, 나이, BMI 또는 라이프스타일 인자(흡연, 음주, 신체 활동, 및 교육)이다. 각 예측값에 대한 회귀 계수 및 보정 평균(adjusted mean)은 상기 모델로부터 추정할 수 있다. 성별 또는 유전적 및 환경적 요인에 따른 대립유전자 동질성 효과는 더 간명한 선형 회귀 모델에서 대응하는 상호작용 조항을 도입하여 테스트하였다. 표준 회귀 진단 방법은 이 모델의 타당성을 확보하기 위해 이용되었다. 범주형 분석에서, 비만증은 BMI≥30kg/㎡로 이분법적으로 정의되었다. 로지스틱 회귀 모델(logistic regression model)은 야생형과 비교하여 각 유전적 변이의 존재와 관련된 비만증의 위험(교차비(OR) 및 95% 신뢰구간)을 추정하도록 맞춰져 있다. 상호작용 조항을 갖거나 갖지 않은 다중 로지스틱 회귀 모델은 공변량 및 효과 변수의 효과를 조절하도록 맞춰져 있다. 관련성 분석(association anaylsis)은 SPSS, 윈도우 버젼 10.0를 사용하여 행하였다.
결과
신규한 다형성, 빈도 및 연쇄불균형의 동정
본 발명자는 PLIN 유전자좌에서의 다형성을 조사하기 위해 2개의 다른 전략을 사용하였다. 첫째, 우리는 PLIN 유전자 조절에 강하게 관여하는 흔한 돌연변이(common mutation)를 조사하기 위해서, 40명의 서로 관련없는 피험자의 PLIN 유전자의 5'부위를 서열분석하였다. 본 발명자는 인간과 생쥐의 서열 사이에 유의하게 보존된 유전자 영역에 집중하였다(21). 이들 분석에 의해 상기 조사된 영역내에서 어떠한 흔한 돌연변이도 밝혀내지 못했다. 본 발명의 두번째 방법은 공개된 SNP 데이터베이스 중 하나에서 흔한 다형성(common polymorphism)에 대한 조사에 근거하였다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?locusId=5346). 본 발명자는 하기 기준에 근거한 초기 타겟을 선별하였다:1)엑손에서의 SNP는 인트론에서의 SNP보다 우세하였다; 2)인접한 영역내의 수개의 SNP 클러스터가 있는 경우, 그들 중 단지 한개만 선택하였다. 6개의 보고된 SNP를 초기에 선택하였으며(표 1), 그들 중 2개(PLIN2 및 PLIN3)는 다형성을 갖지 않았고 우리의 분석은 나머지 4개의 SNP(PLIN1, PLIN4, PLIN5 및 PLIN6)에 근거하였다.
표 2는, 이번 연구에서 조사된 1746명의 서로 관련없는 피험자(일반 집단 1589명(표본 1), 및 입원한 병적으로 비만인 한자 157명(표본 2))의 인구통계학적, 생화학적 및 라이프스타일 특성을 나타낸다. 표본 1에서, BMI 범위는 16.2∼52.5 Kg/㎡이며, BMI≥35Kg/㎡인 피험자는 단지 4%였다. 표본 2에서, BMI 범위는 30.1∼79.1Kg/㎡이며, BMI≥35Kg/㎡인 피험자는 88%이다. 표본 1 집단의 PLIN 유전자형, 대립유전자 빈도 및 연쇄불균형 계수는 표 3에 나타낸다. 유전자형 분포는 하디-와인버그 기대치로부터 벗어나지 않았다. 유전자형 분포에서의 성별에 따른 차이가 어떤 다형성에 대해서는 유의하지 않기 때문에, 남성 및 여성에 대한 데이터를 통합하였으며, 대립유전자 빈도 및 짝짓기 연쇄불균형 파라미터는 전체 표본에 대해서 추정하였다. PLIN5 유전자좌에서의 대립유전자 2(G)는 표본 1에서 가장 우세한 유전자 변이이며(대립유전자 빈도:0.385; 95%CI 0.368∼0.402); 반면에 PLIN4 유전자좌에서의 대립유전자 2(A)는 덜 우세하였다(대립유전자 빈도:0.262; 95%CI 0.247∼0.278). 가장 강한 짝짓기 연쇄불균형이 PLIN1 다형성과 PLIN4 다형성 사이에서 확인되었다(D':0.958;p<0.001). 통계학적으로 유의함에도 불구하고, 나머지 다형성 사이에서는 D' 계수가 0.453∼0.149의 범위인 훨씬 더 낮은 포지티브 연쇄불균형이 관찰되었다(표 3). 표본 2에서의 PLIN 다형성 간의 우성 및 연쇄불균형이 표본 1과 차이가 없었다. 마찬가지로, 표본 2에서의 유전자형 분포는 여성과 남성 간에 차이가 없었다. PLIN1 , PLIN4 , PLIN5 및 PLIN6 다형성의 덜 흔한 대립유전자의 빈도는 각각 0.37(0.32-0.43); 0.24(0.19-0.29); 0.40(0.35-0.46); 및 0.38(0.33-0.46)이었다. 하지만, 이 군의 표본 크기가 작은 것은 이들 추정값의 확률적 오차에 큰 영향을 미친다. 그래서, 하프로타입은 단지 표본 1의 모든 유전자형 개체로부터 추정하였다(표 4). 16개의 가능한 4-다형성 하프로타입 전부가 지중해연안계 집단에 존재하는 것으로 추정되었다. 각 다형성에서 가장 고빈도의 대립유전자로 이루어진 하프로타입("6209T/11482G/13041A/14995A";"1111"이라고도 함)은 상대 빈도가 0.388로, 가장 우세하다. 15개의 나머지 하프로타입 중에서는, 각 다형성의 가장 저빈도 대립유전자로 이루어지는 하프로타입("6209C/11482A/13041G/14995T";"2222"이라고도 함)을 포함하여, 단지 4개만이 0.08보다 높은 대립유전자 빈도를 가지고 있었다.
PLIN 다형성과 비만증관련 표현형 간의 관련성. 단일 다형성 유전자형 분석
다음으로 본 발명자는 PLIN 다형성과 비만증관련 변수 사이의 관련성을 조사하였다. 표본 1과 표본 2 간의 임상적 및 라이프스타일 차이를 고려하여, 일반 집단에서 선발한 피험자와 비만 환자에 대하여 각각 별개로 수행하였다. 통계학적 검증력을 증가시키기 위해서, 유전적 성질의 우성, 또는 적어도 공우성(codominant) 모델과 양립할 수 있는 대립유전자 효과가 존재함을 입증한 후에, 각 다형성에 대하여 가장 흔한 대립유전자(the most common allele)에 대한 동형접합체로서 또는 덜 흔한 대립유전자(1/2+2/2)의 보유자로서, 개체를 분류하였다.
표본 1에서의 관련성
우선, 본 발명자는 성별에 의한 유전적 효과의 동질성을 평가하여 여러 중요한 상호작용을 확인하였다. 따라서, 우리는 각 성별을 별도로 분석하였다. 표 5는, 4개의 PLIN 다형성 각각 내에서 대립유전자 2 변이의 보유 상태에 따라서, 표본 1의 남성의 BMI 및 다른 비만증 관련 변수의 나이 보정 평균(age-adjusted means)을 나타낸다. BMI, 체중, 허리-엉덩이둘레 비, 혈당, 총콜레스테롤, HDL-C, LDL-C, TAG 및 혈압에 관하여 유전자형 군 사이에 유의한 차이가 확인되지 않았다. 그러나, 표본 1의 여성에서는, 더 낮은 BMI와 관련된 대립유전자 2를 가진, PLIN1과 PLIN4 다형성에 대한 유전자형 사이에서, BMI가 유의하게 다름이 확인되었다(표 6). BMI에 대한 평균값은, 1/1 동형접합체에서는 26.3±0.3Kg/㎡임에 대해 PLIN1 다형성에 대한 대립유전자 2를 보유한 여성에서는 25.3Kg/㎡±0.2Kg/㎡(p=0.004)였으며; 1/1 동형접합체에서 26.1±0.2Kg/㎡임에 대해 PLIN4 다형성에 대한 대립유전자 2의 보유자에서는 25.2Kg/㎡±0.3Kg/㎡ (p=0.004)였다. 마찬가지로, PLIN1 유전자좌에서의 대립유전자 2의 보유자는 야생형 유전자형에 대한 여성 동형접합체보다 유의하게 적은(p=0.007) 체중을 가졌다. PLIN4 유전자좌의 저빈도 대립유전자의 보유자에 대해서도 똑같이 적용되었다(p=0.01). 더욱이, PLIN4 다형성에 대한 대립유전자 2의 여성 보유자는, 1/1 동형접합체에 비해서, 더 낮은 허리-엉덩이둘레 비(p=0.032), 더 낮은 공복 혈당치(p=0.008) 및 더 낮은 혈장 TAG 농도(p=0.005)를 나타내었다. 공복 혈당치에 대해 0.090, TAG에 대해 0.099의 경계 P 값을 갖는 PLIN1 다형성에서도, 유사한 차이점이 확인되었다. 두 SNPs(PLIN1 및 PLIN4)는 BMI 및 체중 측정 시에 유의한 유전자-성별 상호작용의 증거가 된다. 또한, 본 발명자는, PLIN4 다형성에 대하여, 허리-엉덩이둘레 비(p=0.023) 및 TAG(p=0.009) 결정에 있어서 유의한 유전자-성별 상호작용을 확인하였다. PLIN5 다형성이나 PLIN6 다형성 어느 것에서도 유의한 유전자-성별 상호작용이 검출되지 않았다.
각 다형성에 대한 대립유전자 2의 보유자와 미보유자는, 남성 및 여성 모두에서, 흡연, 음주, 교육, 신체 활동 및 당뇨병의 관점에서 유의한 차이는 없었다(결과는 기재하지 않음). 따라서, PLIN1과 PLIN4 다형성에 대하여 확인된 차이점은 이들 잠재 교란요인에 대한 보정 후에조차 통계학적으로 유의하게 된다(PLIN1 다형성의 BMI 및 체중 각각에 대한 p=0.012 및 p=0.020; PLIN4 다형성의 BMI, 체중, 허리-엉덩이둘레 비, 혈당 및 TAG 각각에 대한 p=0.014, p=0.029, p=0.046, p=0.003 및 p=0.042). BMI 및 약물치료에 대한 부가적인 보정에 의해, 공복시 혈당 및 혈장 지질과 PLIN4 유전자형 사이의 관련성의 중요성이 변형되는 것은 아니다[대립유전자 2의 미보유자 116.4±1.3mg/dL 대 대립유전자 2의 보유자 113.7±1.7mg/dL(p=0.010)]. 그러나, TAG 농도에서의 차이는 통계학적으로 유의하지 않았다(p=0.327).
표본 2에서의 관련성
본 발명자는 심한 비만 피험자(표본 2) 군에서의 유사한 관련성 분석을 수행했을 때, 남성과 여성 모두에서, PLIN1 및 PLIN4 다형성의 대립유전자 2와 관련된 BMI의 감소가 검출되었다. 이 감소는 PLIN4 다형성의 대립유전자 2를 보유하고 있는 남성에서 더 높았으며 통계학적으로 유의하였다. 일반 집단의 남성에서 관찰된 결과와는 대조적으로, 이 심한 비만 남성 군에서는, 상기 PLIN SNPs는 BMI에서의 현저한 차이와 관련이 있었다. 따라서, PLIN4에 대하여, 상기 대립유전자 2의 남성 미보유자 대 보유자의 BMI의 나이 보정 평균은 45.9±1.9Kg/㎡ 대 35.6±1.3Kg/ ㎡(p=0.001)였다. 마찬가지로, 상기 대립유전자 2의 미보유자 대 보유자의 체중의 보정 평균은 141.3±6.0Kg/㎡ 대 107.9±6.3Kg/㎡(p=0.001)이었다. 사례의 수가 적음에도 불구하고, 비만 남성에서 이러한 결과는 일치하였으며, 모수적 또는 비모수적 검증에서 통계학적으로 유의하였다. 표본 2의 비만 여성에서, PLIN4 다형성에 대한 대립유전자 2의 보유자에게서 관찰된 BMI와 체중의 감소는 일반 집단의 여성에서 관찰된 것과 유사하였으나, 이 군의 여성의 수가 작기 때문에, 그 차이는 통계학적으로 유의하지 않았다[PLIN4 SNP의 대립유전자 2의 미보유자 대 보유자의 나이 보정 평균은 43.1±0.9Kg/㎡ 대 41.1±6.3Kg/㎡(p=0.112) 및 108.2±2.1Kg/㎡ 대 102.4±2.9Kg/㎡(p=0.112)였다.]. 또한, 흡연, 음주, 교육, 신체 활동, 및 당뇨병에 대한 다변량 보정은 이러한 결과들에 대한 통계학적 유의에 영향을 미치지 않았다. 비만 피험자의 대립유전자 2와 관련된 BMI의 감소에도 불구하고, TAG 농도는 유전자형에 따른 유의 차가 없었다. 그러나, 이 피험자들 중에서, PLIN4 다형성에 대한 대립 유전자 2의 보유자는 미보유자보다 높은 혈당 농도를 나타내었다. 이러한 결과는 남성과 여성 모두에서 인지되었으며, 일반 집단의 피험자의 동일 대립유전자에 대해서 관찰된 것과는 달랐다. 따라서, 표본 2의 남성에서, PLIN4 대립유전자 2의 미보유자 대 보유자의 공복시 혈당 농도는 94.5±7.9mg/dL 대 117.1±7.7mg/dL(상호 작용에 대한 P:PLIN4*비만=0.028)인 반면, 표본 1의 남성에서는 차이가 인지되지 않았다. 역으로, 일반 집단의 여성에서는, 대립유전자 2와 관련된 혈당의 감소가 확인된 반면, 표본 2의 여성에서는, 혈당 농도의 증가가 관찰되었다(PLIN2 대립유전자의 미보유자 대 보유자의 혈당 농도는 102.4± 3.5mg/dL 대 108.2±3.9mg/dL). 또한, 공복시의 혈당 농도 결정에 있어서, 비만증과 PLIN1, PLIN5 및 PLIN6 다형성에 대해서도 통계학적을 유의한 상호작용 조항이 얻어졌다.
PLIN 하프로타입과 대사 증후군 관련 변수의 관련성
본 발명자는 대사 증후군의 위험과 관련된 여러 변수에 대한 PLIN 하프로타입의 효과를 평가하였다(BMI, TAG 및 공복시 혈당). 16개의 가능한 하프로타입 중 11개는 매우 낮은 상대빈도를 갖는 것으로 나타났다(5% 미만). 따라서, 본 발명자는 그들의 빈도에 따라, 가장 흔한 하프로타입에 대한 동형접합성의 효과와 선택된 유전자형의 조합의 효과를 비교함에 의한 슈도하프로타입 어프로치를 이용하여, 그 특이적 관련성을 분석하였다. 먼저, 이 변수들을 다중 회귀 모델에 제어 인자로서 포함시킴에 의해 다른 다형성의 해당 혼란 효과에 대하여 표 5 및 6의 결과를 보정하였다. PLIN1과 PLIN4 간의 더 높은 관련성을 고려하여, 이 변수들은 다중공선성 편향(multicollinearity bias)을 회피하기 위해서 서로 동시에 보정한 것은 아니다. 그래서, PLIN1과 PLIN4 관련성은 PLIN5 및 PLIN6 다형성에 대하여, PLIN5는 PLIN4 및 PLIN6에 대하여, PLIN6은 PLIN4 및 PLIN5에 대하여 보정되었다. 이러한 보정 후에, 여성에서의 PLIN1 다형성과 BMI 간의 관련성은 통계학적으로 유의하였다(p=0.002). 게다가, 여성에서의 PLIN1 다형성과 공복시 혈당의 경계성 통계학적 유의한 관련성은 PLIN6 다형성(p=0.032)에 대한 보정 후에 통계학적으로 유의에 도달하였으며, 트리글리세라이드에 대한 P 값의 약간의 감소가 PLIN5(p=0.056) 및 PLIN6(p=0.085)에 대한 보정 후에 확인되었다. 마찬가지로, 여성에서의 PLIN4 다형성의 독립 효과는 PLIN5 및 PLIN6 다형성에 대한 보정 후에 확인되었으며, 표 6에 앞서 보고된 관련성은 이들의 보정 후에 통계학적으로 유의하였다(PLIN5 및 PLIN6에 대한 동시 보정 후에 BMI, 공복시 혈당 및 TAG 각각에 대하여 p=0.023;p=0.015;p=0.035). 남성에서는, 표 5의 결과가 부가적인 유전적 변이에 대하여 보정되었을 때, 유의한 변동은 검출되지 않았다.
또한, 본 발명자들은 PLIN1 및 PLIN4와 관련 변수 간의 잠정적인 시너지 관련성을 조사하였다. 표본 1의 피험자들을 3개의 카테고리로 나누었다: 1)PLIN1 및PLIN4 SNPs 둘다의 대립유전자 1에 대한 동형접합성; 2)PLIN1 또는 PLIN4 중 어느 한쪽의 대립유전자 2의 보유자, 및 3)PLIN1 및 PLIN4 둘다의 대립유전자 2의 보유자. 도 2는, 표본 1의 여성의, 조합 유전자형(combined genotype)에 의존적인 BMI에 대한 나이 보정 평균을 나타낸다. 또한, 이 모델은 PLIN5 및 PLIN6 SNPs에 대하여 보정되었다. 상기 조합된 두 SNPs 변수는 BMI(p=0.07)과 유의하게 관련되어 있으며, 가장 흔한 하프로타입 "11" 에 대한 여성 동형접합체는 PLIN1 및 PLIN4 SNPs 둘다에 적어도 하나의 대립유전자 2를 보유하는 여성의 BMI(25.1±0.3Kg/㎡)보다 더 높은 BMI(26.3±0.3Kg/㎡;p=0.002)를 나타낸다. PLIN1 또는 PLIN4 SNP의 어느 한쪽에 적어도 하나의 대립유전자 2를 보유하는 보유자는 중간 BMI 표현형을 나타낸다. 또한, 본 발명자는 조합 SNP 변수와 TAG(p=0.020) 및 혈당(p=0.004) 사이에 통계학적으로 유의한 관련성이 있음을 확인하였으며, 가장 흔한 하프로타입에 대한 동형접합이 가장 높은 농도를 가졌다.
PLIN1 및 PLIN4에 대한 부가적인 조절 후에, PLIN5 및 PLIN6 다형성에 대하여 이러한 조합 유전자형 분석을 수행한 경우, 표본 1의 남성과 여성에서는 이 하프로타입 변수와 어떠한 비만증 관련 파라미터 사이의 관련성이 검출되지 않았다. 도 3은 여성(표본 1)에서의 조합 유전자형에 의존적인 BMI에 대한 나이 보정 평균을 나타낸다. 유의하지는 않을지라도, 가장 고빈도 하프로타입의 동형접합 보유자는 다른 하프로타입에 비해서 가장 낮은 BMI값을 가지고 있었다.
본 발명자는 4개의 다형성 모두를 사용하여 유사한 분석을 행하였다. 이 목적으로 4개의 군을 고려하였다:1) 가장 흔한 대립유전자에 대한 피험자 동형접합체, 하프로타입 "1111"; 2)PLIN1 및 PLIN4 둘다의 가장 흔한 대립유전자에 대한 동형접합체; 3)PLIN1 및 PLIN4의 대립유전자 2의 보유자 및 PLIN5 및 PLIN6의 가장 흔한 대립유전자에 대한 동형접합체; 4)PLIN1 , PLIN4 , PLIN5, 및 PLIN5의 대립유전자 2의 보유자. 어떠한 다른 유전자형 조합을 보유하는 피험자는 이 분석에는 포함되지 않는다. 통계학적 검증력을 증가시키기 위해서, 표본 1 및 표본 2의 개체를 통합하여 함께 분석하였다. 표 7은 상기 조합 유전자형에 따른, 남성 및 여성의 체중과 BMI의 나이 보정 평균을 나타내었다. 여성에서는, 조합 유전자형 변수와 체중 및 BMI 사이에 상당히 통계학적으로 유의한 관련성이 확인되었으며, PLIN1 및 PLIN4 유전자좌에서의 대립유전자 2의 보유자와, PLIN5 및 PLIN6 둘다에서의 가장 흔한 대립유전자에 대한 동형접합체는 가장 낮은 값을 나타내었다. 남성에서는, 유전자군과 BMI 또는 체중 사이에 어떠한 유의한 관련성도 발견되지 않았다.
PLIN 유전자 변이와 관련된 비만증 위험
마지막으로, PLIN 변이와 관련된 비만증의 위험을 추정하기 위해, 표본 1 및 표본 2의 피험자를 통합하여, BMI의 카테고리에 따라서 세분하였다: 미비만(non-obese) 피험자(BMI<30kg/㎡)와 비만 피험자(BMI≥30kg/㎡). 남성에서는, 비만과 미비만 사이에서 PLIN 다형성의 유병률에 유의한 차이가 없었다. 그러나, 여성에서는, 대립유전자 2를 보유하는 비만 피험자가 미비만 피험자에 비해 PLIN1 다형성에 대하여 더 낮은 유병률을 가짐이 검출되었다.(50.2% 대 60.4%;p=0.004). 로지스틱 회귀 모델에서, 비만과 미비만은 나이에 따라 다르기 때문에, 상기 위험(OR)의 추정은 나이에 대해 보정되었다. 이 보정 후에, PLIN1 다형성에 대립유전자 2를 보유하는 여성은 미비만자와 비교하여 더 낮은 비만증 위험을 갖는다(OR:0.65; 95% CI. 0.48-0.88). 마찬가지로, PLIN4 다형성에 대립유전자 2를 보유하는 여성의 유병률은 미비만 군보다 비만 군에서 더 낮았다(45.2% 대 32.5%; p=0.001). 나이에 대한 보정 후, PLIN4 유전자좌의 대립유전자 2는 여성에서 더 낮은 비만 위험과 관련이 있었다(OR:0.60; 95%CI:0.44-0.83). 게다가, 이러한 추정은 흡연, 음주, 신체 활동, 당뇨병 및 교육에 관하여 더 보정한 후에 통계학적으로 유의하였다. 상기 두 다형성의 조합 유전자형 분석에서, 나이 보정 후에, PLIN1 및 PLIN4 SNP 둘다에 대립유전자 2를 보유하는 여성은 가장 낮은 비만증 위험(가장 흔한 대립유전자에 대한 동형접합체와 비교하여, OR:0.56; 95%CI:0.39-0.79; p=0.001)을 나타내고, 반면에, PLIN1 또는 PLIN4 유전자좌에 단지 하나의 대립유전자 2의 보유자는, 가장 흔한 대립유전자에 대한 동형 접합체와 비교하여, 비만증 위험에 있어 서 통계학적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(OR:0.95; 95%CI:0.63-1.43). 이러한 결과들은 PLIN5 및 PLIN6 다형성에 대하여 더 보정한 후에도 변경되지 않았다. PLIN5 및 PLIN6 유전자좌에 대하여, 단일 다형성 분석(single polymophism anaylsis)이나 조합 유전자형 분석(combined genotype analysis) 둘다에서 비만 위험과의 통계학적으로 유의한 관련성이 확인되지 않았다.
토의( discussion )
실험 모델을 이용한 연구들에 의해 페릴리핀(perillipin)이 기초 지방분해나 호르몬에 의해 유발된 지방대사의 속도를 조절하여 지방세포에의 TAG 저장에 중요한 역할을 함이 입증되어있다(7,11,12). 본 발명자는, 코카서스 개체의 표본 중에서, 4개의 공통된 신규한 PLIN 다형성과, 비만증 측도, 지질 대사 및 인슐린 감성지수의 관련성을 조사하여, 인간 PLIN 유전자좌에서의 변이가 비만 관련 변수와 상당히 관련있음을 최초로 입증하였으며, 페릴리핀이 인간 비만증, 고중성지방혈증, 및 잠정적으로 대사 증후군의 발병에 중요한 역할을 함을 시사하였다. 더욱이, 일반 집단에서, 상기 관련성의 대부분은 주로 여성에 영향을 미치는 성별(gender)-특이적임을 알아내었다.
PLIN 다형성과 비만증 관련 표현형 간의 관련성, 단일 다형성 유전자형 분석( Single polymorphism genotype analysis )
본 분석에서, 본 발명자는 PLIN 다형성과 비만 관련 측도 간의 관련성을 조 사하기 위해서 사례-대조 연구 및 단면 연구를 둘다 적용하였다. 일반 집단 및 입원한 비만 환자로부터 선발한 비만 피험자를 포함하는 사례-대조 설계에서, 나이 및 다른 잠재적인 혼란변수(potential confounder)에 대한 보정 후, PLIN1 다형성에 대립유전자 2를 보유한 여성에 있어서 일정한 통계학적으로 유의한 낮은 비만증 위험이 있음을 알아내었다. 이러한 PLIN4 SNP에서의 대립유전자 2와의 관련성은 발견되었으나, PLIN5 또는 PLIN6 다형성과의 관련성은 발견되지 않았다. PLIN1과 PLIN4 간의 강한 연쇄불균형(D'>0.9), 및 그들의 다른 2개의 SNP와의 더 적은 관련성이 이 결과들을 지지한다. 또한, 더 낮은 비만증 위험은 PLIN1 및 PLIN4 SNP에 대한 덜 흔한 대립유전자와 관련이 있으며, 여성에서는, 페릴리핀의 절제와 마른 표현형을 연결한 페릴리핀 무효 마우스(perilipin null mouse)에 관한 유사한 결과들을 보였다. 또한, PLIN 유전자의 불활성화는 Lepr(db/db) 마우스(렙틴 저항성에 의해 유발되는 비만증의 유전적 모델)의 비만증 발병을 방지하였다. 일반 집단의 남성에서의 유의한 관련성 부재는 체중 조절 및 인간의 지방 분포의 조절에서의 성호르몬 인자의 중요성을 부각시킨다.
일반 집단의 표본에서, PLIN1 및 PLIN4 SNP에 대한 덜 흔한 대립유전자의 여성 보유자는 가장 흔한 대립유전자에 대한 여성 동형 접합체보다 통계학적으로 유의한 더 낮은 BMI를 갖는다. 또한, 본 발명자는 PLIN4 SNP의 덜 흔한 대립유전자의 여성 보유자도 더 낮은 혈당과 TAG 농도를 유의하게 가짐을 발견하였다. 게다가, PLIN4 다형성은, 여성의 복부 지방 축적에 대해 더 큰 효과를 나타내는 감소된 허리-엉덩이둘레 비와 관련되어 있었다. 복부 지방은 대사 증후군(당 불내증, 인 슐린 저항성, 고혈압, 및 심혈관 질환 및 타입 2 당뇨병(19))과 강하게 관련되기 때문에, 이러한 결과는 특히 중요하다. 또한, 동일한 대립유전자는 더 낮은 공복시 혈당치와 관련이 있었다. 이러한 내용 중에서, 본 연구의 가장 흥미로운 결과는 혈장 농도 결정에 있어서 PLIN 다형성과 비만증 간의 일관된 통계학적으로 유의한 상호작용이다. 반대로, 일반 집단의 남성에서는 유의한 관련성이 관찰되지 않았다.
표본 2의 비만 여성에서, PLIN4 SNP의 대립유전자 2와 더 낮은 BMI 사이의 일관된 관련성에도 불구하고, 이 대립유전자는 더 높은 혈장 농도와 관련되어 있었다. 그러나, 이러한 결과는 페릴리핀 유전자가 결여된 마우스에서의 Tansey et al.(11)의 관찰과 일치하며 Martinez-Botas et al.(13)의 조사 결과와 일치한다. 지방 조직으로부터의 지방산 방출은 타입 2 당뇨병의 발병을 의미하며, Peri 무효 마우스(Peri null mouse)는 인슐린 저항성으로 되기 쉬운 것으로 예상할 수 있다. Martinez-Botas et al(13)은 그들의 Peri 무효 동물에서 당불내성을 검출하는데 실패하였으며, Tansey et al.(11)에 의한 더 강화된 연구에서도 체중이 30g보다 적은 동물에서, Martinez-Botas et al의 결과를 반복하였다. 그러나, 동물이 30g을 넘었을 때, 야생형에 비해서 Per 무효 마우스에서 유의한 당불내성이 발생하였다. 이것은 비만증을 방지하는 페릴리핀이 개체가 비만해졌을 때 더 불리한 표현형으로 될 수 있다는 개념과 일치한다. 또한, 일반 집단의 남성에서는 공복시 혈당에 대한 PLIN 대립유전자의 효과가 발견되지 않았지만, 비만 남성에서는 대립유전자 2가 더 높은 혈당 농도와 관련이 있었으며, 이는 비만증-상호작용 가설의 효과에 대한 증거가 된다. 비만과 PLIN SNP의 상호작용에 관한 또다른 흥미로운 조사 결과는 표본 2의 남성에서의 PLIN4 유전자좌의 대립유전자 2와 더 낮은 BMI의 관련성에 관한 것이다. 이러한 결과는 여성에서의 이 대립 유전자의 효과와 일치하는 것이며, 더 높은 지방 과다증 또는 비만 남성 특유의 몇몇 검출되지 않은 환경적 인자가 PLIN 대립유전자의 효과를 야기하는데 필요하다는 가설을 제안한다.
이들 관련성의 생물학적 근거는 불분명하다. 본 연구에서 조사된 다형성의 어느 것도 기능적으로 나타나지 않았다. PLIN1 및 PLIN4 둘다 인터론 변이이다. PLIN5는 엑손 8에서의 침묵 변이(silent mutation)이며, PLIN6은 엑손 9의 미번역된 영역내에 있다. 그러한 변이 중 어느 것도 단백질 구조를 변형하지 않으며, 전통적으로, 그들은 조절 기능을 갖는 것으로 고려되지는 않는다. 그러나, 인트론 다형성도 핵인자 1(nuclear factor 1)의 결합에 영향을 미침으로써 유전자 발현을 조절할 수 있음을 제안하는 몇몇 증거가 있다(20). 페릴리핀은 지방세포내의 지질 방울의 표면을 코팅하고 있는 가장 많은 단백질이다(4-6). 그들의 생리학적 관련성은, PLIN 무효 마우스는 현저하게 감소된 지방의 저장성을 갖고, 그들의 분리된 지방 세포내에서의 기초 지방분해가 야생형 마우스에 비해서 증가함을 보여주는 최근 보고서에 따라 증명되었다(11,13). 이러한 데이터에 기초하여, 우리의 조사 결과에 대한 가능한 설명은 PLIN1 및 PLIN4 다형성이 PLIN 유전자의 더 낮은 발현 또는 손상된 페릴리핀 활성과 관련될 수 있다는 것이다. 대립 가설(alternative hypothesis)은, 이들 다형성이 직접으로 포함되거나 또는 mRNA 스플라이싱을 변경하는 변이를 가진 LD에 포함된다는 것이다. PLIN4 , PLIN5 및 PLIN6은 모두 선택적 으로 스플라이싱되기 쉬운 영역과 가깝다(참조, 도 1), 모든 페릴리핀은 이상적인 22-kDa 아미노 말단과 다양한 길이의 별개의 카르복실 말단을 공유한다(21). PLIN 유전자의 두가지 주요한 스플라이스 변이인, 페릴리핀 A 및 페릴리핀 B는 PKA 활성화에 대한 다른 반응을 보였으며 지방분해에 대하여 다른 방어를 나타내었다. 이들 스플라이스 변이 간의 구조적 차이점인, 특히 상기 지질 방울의 랩핑(wrapping)에 영향을 미치는 C 말단 꼬리의 길이는 그들의 기능을 결정할 수 있다.
PLIN 유전자형의 성별 특이적 효과는 지방 조직의 발달 및 분포에서의 성(sex)특이적 차이점 뿐만 아니라, 비만증 관련 질환의 위험과 일치한다. 지방 조직 축척에 가장 중요한 결정인자인 지질 분해 능력도 성별 의존적인 것으로 나타났다(22,23). 본 발명의 데이터는 성호르몬이 PLIN 유전자의 효과를 변형할 수 있는지를 보여주는 것은 아니며, 성호르몬과 페릴리핀 기능의 상호작용을 이번에 설명할 수 있는 데이터는 아니다. 본 발명자는, 밝힐 필요가 있는 알려지지 않은 메카니즘을 통해 에스트로겐은 PLIN 변이의 방어 효과를 증폭할 수 있지만 테스토스테론은 PLIN 변이의 방어 효과에 영향을 미치지 않거나 최소화할 수 있는 것으로 가정한다.
PLIN 다형성과 비만증 관련 표현형 간의 관련성. 하프로타입 분석
본 발명의 데이타는, PLIN1 및 PLIN4 SNP 둘다에 대립유전자 2를 보유하는 여성에서 가장 낮은 비만 위험이 발견됨을 나타내며, 이들 SNP는 부가적 또는 시너지 방식으로 작동할 수 있음을 나타낸다. 복합적인 성향의 감수성은 종종 유전자 내의 여러 다른 변이의 조합된 작용에 의해 지배될 수 있다. 따라서, 본 발명자는 이 표지형질들의 생물학적 효과가 서로 관련되어 있지만 동일한 기능적 돌연변이와는 상관 없음을 제안한다.
별개로, PLIN5 및 PLIN6 SNP 둘다 BMI 및 다른 비만증 관련 측도와는 관련이 없다. 그러나, 하프로타입 분석은 더 흥미있는 그림을 보여주었다. 본 발명자들은 PLIN1 및 PLIN4의 대립유전자 변이는 보유하지만 PLIN5 및 PLIN6의 대립유전자 변이는 보유하지 않는 여성이 가장 낮은 체중과 BMI(62.9Kg 및 24.8kg/㎡)을 나타냄을 발견하였다. 역으로, PLIN1 및 PLIN4에 대한 덜 흔한 대립유전자의 부재 시 PLIN5 및 PLIN6의 대립유전자 변이의 존재는 가장 높은 체중 및 BMI(72.2Kg 및 28.7kg/㎡)와 관련이 있었으며, 상반되는 하프로타입간의 생물학적 유의차는 약 15%였다.
결론적으로, 본 발명은 인간의 PLIN 유전자형과 비만증 관련 측도 사이의 관련성을 보고하는 최초의 것이다. 이것은 연결 분석의 최근 조사 결과뿐만 아니라 동물 모델로부터 나타낸 데이터와 일치한다. 남아있는 밝혀야할 관련 문제는 이들 SNP와 식이 인자 간의 잠재적인 상호작용에 관한 것이다. 이것은 페릴리핀의 발현과 지방산 대사 사이의 관계와 상당히 관련이 있다(24).
[실시예 I 참조문]
Figure 112006027945861-PCT00001
Figure 112006027945861-PCT00002
Figure 112006027945861-PCT00003
[ 실시예 II : 미국 출신 백인 집단에서의 페릴리핀 ( PLIN ) 유전자 하프로타입과 비만증 위험의 성별 특이적 관련성]
재료 및 방법
피험자 및 연구 설계
주거 라이프스타일 간섭 프로그램(The Pritikin Longevity Center, Santa Monica, CA)(19)에 참여한 총 734명의 백인 피험자, 남성 373명(평균 나이 58.6세) 과 여성 361명(평균 나이 56.1세)이 본 연구에 포함되었다. 이 집단에서, 피험자의 10.2%가 현재 흡연자였고, 46.8%가 음주자로 보고되어 있다. 약물 이용은 다음과 같았다: 10.1%는 경구혈당강하제를 복용 중이었고, 16.1%는 콜레스테롤 저하제를 복용 중이었고, 14.9%는 갑상선 치료제를 복용 중이었으며, 여성 피험자의 35.7%는 호르몬 대체 요법 중이었다. DNA 가용성(DNA availability)에서의 한계 때문에, PLIN 6209T>C 및 13041A>G에 대한 유전자형은 706명의 피험자로부터, 또한 PLIN 11482G>A 및 14995A>T에 대한 유전자형은 705명의 피험자로부터 성공적으로 얻었다. 비만증은 BMI≥30kg/㎡로 규정하였다. 유전자형 정보가 있는 개체와 없는 개체간의 인체측정학적 및 생화학적 측도에서의 유의한 차이는 없었다.
생화학적 측정
프로그램(baseline)에 기입된 모든 피험자로부터 공복시 혈액 시료를 채취하였다. 상기 혈액 시료를, 지질 및 글루코스 측정용 SST clot-activating gel이나 아포지질단백질 측정용 0.1% EDTA 중 어느 하나를 포함하는 튜브에 넣었다. 이 지질 및 글루코스 측정용 시료를 응고시킨 다음, 2500rpm에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 총 콜레스테롤(TC), 고밀도 지질단백질 콜레스테롤(HDL-C), 트리글리세라이드(TG), 및 혈당치를, 표준화된 자동화 효소적 분해법(Smith-Kline Beecham Laboratories)으로 측정하는 한편, 저밀도 지질단백질 콜레스테롤(LDL-C)을 앞서 기재한 바와 같이 계산하였다(20).
DNA 분리 및 유전자형 결정
QIA amp Blood Kit(Qiagen)를 사용하여 전체 혈액으로부터 유전체 DNA를 분리하였다. 먼저, 표적 SNP를 포함하는 DNA 단편을 다중 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 증폭시켰다. 사용된 프라이머는 표 1에 나타낸다. PCR 반응은 각 dNTP 0.2mmol/L, 각 프라이머 0.2μmol/L, 염화마그네슘 3.0mmol/L , 및 Qiagen Hotstar Taq 폴리머라제 0.8U를 포함하는 10㎕의 반응 용적으로 수행하였다. PCR 사이클링 조건은 95℃에서 10분간 반응한 후, 95℃에서 30초, 70℃에서 30초, 및 72℃에서 1분의 사이클을 7사이클 행한 다음, 95℃에서 30초, 65℃에서 30초, 및 72℃에서 1분의 사이클을 41사이클 행하였다. 72℃에서 5분의 최종 연장 단계(extension phase)는 프로토콜의 마지막에 포함된다. 상기 PCR 산물에 엑소누클레아제 I(New England Biolabs,Inc. Beverly, MA) 및 소내장 인산분해효소(calf intestinal phosphatase)(New England Biolabs.,Inc. Beverly, MA)를 2.5U 첨가하여, 37℃에서 60분간 배양하여 결합되지 않은 dNTP와 프라이머를 제거하였다. 그 다음, 75℃에서 15분간 배양하여 상기 효소들을 비활성화시켰다. 그 다음, ABI Prism SnaPshot 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 단일 누클레오티드 연장을 수행하였다. 사용된 프로브는 표 1에 나타낸다.
상기 연장 반응용 반응 혼합물은 Snapshot Ready Reaction Mastermix(Applied Biosystems, Foster City, CA) 1.5㎕, 물 1.0㎕, 다중 PCR 산물 1.5㎕ 및 프로브 혼합물(각 프로브에 대해 2μmol/L) 1.0㎕을 함유한다. 상기 반응 조건은 96℃에서 30초, 50℃에서 30초, 및 60℃에서 30초의 사이클을 35사이클 로 하였다. 반응 산물은 소내장 인산분해효소 3U를 첨가하고 37℃에서 60분간 배양하여, 결합되지 않은 dNTP를 제거한 다음, 75℃에서 15분간 배양하여 상기 효소들을 비활성화시켰다. 마지막으로, Genotyper version 3.7((Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 ABI Prism 3100 유전 분석기((Applied Biosystems, Foster City, CA) 상에서, 유전자형을 결정하였다.
통계학적 분석
유전적 변이와, 공변량(나이, BMI, 흡연, 음주, 및 약물치료 상태)을 보정한 표현형 결과 사이에 관련이 없다는 귀무 가설을 테스트하기 위해서, 다변량 선형 회귀 분석을 이용하였다. 공변량에 대해 다중 보정된 유전자형 군간의 표현형을 비교하기 위해서, ANCOVA(Tukey test)를 사용하였다. 부가적인 유전 모델(각 다형성 부위의 변이 대립유전자의 수에 근거하여 군집화)은 관찰된 대립유전자 효과에 따라서 마지막에 사용하였다. 성별과 PLIN 유전자형 간의 상호작용은 그 대응 곱 조항을 상기 모델에 도입하여 테스트하였다. SAS 8.0 통계학 패키지를 사용하여 가설 테스트를 수행하였다. 0.05보다 작은 통계적 P 값은 유의한 경계점으로서 고려된다. 공복시 글루코스 및 트리글리세라이드는 통계학적 테스트 전에 대수적으로 변환되어 정상 분포를 얻었다. THESIAS 프로그램을 사용하여, 대립유전자 빈도를 계산하고, 짝짓기 연쇄불균형(LD)를 테스트하고, 하프로타입을 추정하였다. 이러한 컴퓨터 프로그램은 Tregouet et al.(21)에 의해 기재된 최우도 모델(maximum likelihood model)에 근거한 것이다. 비만증 위험과 하프로타입 관련성은 상기한 공변량에 대한 다중 보정으로 조사되었다.
결과
40명의 서로 관련없는 피험자에서, 인간과 마우스 간의 보존된 영역을 재염기서열분석하고, 공개된 SNP 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp _ref.cgi?locusId=5346)중 하나를 조사하여, PLIN 유전자좌의 흔한 다형성을 동정하였다. 4개의 흔한 다형성, PLIN 6209T>C, 11482G>A, 13041A>G, 및 14995A>T가 동정되어 본 연구용으로 선택되었다. 이들 SNP의 넘버링은 "+1"로 넘버링되어 있는 PLIN의 개시 메티오닌 코돈 ATG의 A(참고 서열상의 157157 위치, 접근 번호 GI21431190)에 대한 그들의 상대 위치를 반영한다. 유전자형 분포는 하디-와인버그 기대치로부터 벗어나지 않았다. 조사된 SNP에 대한 드문(minor) 대립유전자 빈도는 6209T에 대하여 0.453, 11482A에 대하여 0.299, 13041G에 대하여 0.336, 및 14995T에 대한 0.360 이었다. 짝짓기 연쇄불균형(LD) 조사는 PLIN 6209T>C와 11482G>A 둘다 강한 LD(D'=0.92, P<0.001)에 있음을 나타내었다. 이들 SNP와 13041 A>G SNP 사이에는 유의한 LD가 검출되지 않았다(6209T>C/13041A>G 쌍에 대한 D'=0.04, P=0.224이고, 11482G>A/13041A>G 쌍에 대한 D'=0.05, P=0.110임). 결국, PLIN 14995A>T는 도 5에 나타낸 바와 같은 상이한 수준의 LD를 나타내었다.
본 발명자는 상기 결과 변수에 대하여 PLIN 유전자형과 성별 사이의 유의한 상호작용을 확인하였다. 따라서, 본 발명자는 남성과 여성에 대한 별개의 분석을 행하였다. 우선, BMI, %체지방, 및 허리 둘레를 포함한 체지방 측도와 각 SNP에 대한 대립유전자의 관련성을 조사하였다. 여성에서는 %체지방 및 허리 둘레에서 유의한 대립유전자 차이가 확인되었다. PLIN 13041A>G에 대하여, AA, AG, 및 GG 군에 대한 평균 %체지방 값은 각각 30.6%, 32.7%, 및 33.3%였다(P=0.0166). 유사한 관련성이 평균 허리 둘레에 대해서도 관찰되었다:AA, AG 및 GG 피험자 각각에 대하여 95.1;96.9 및 105.1cm(P=0.020)임. 본 발명자는 PLIN 14995A>T SNP에 대해서도 유사한 관련성을 관찰하였다. AA, AT, 및 TT 피험자의 평균 %체지방은 각각 30.5%, 32.5%, 및 33.7%(P=0.0104)였고; 평균 허리둘레는 각각 95.7, 98.9, 및 102.6cm(P=0.0453)이었다. PLIN 13041A>G에 G/A 및 G/G 유전자형을 보유하는 피험자는 AA 피험자보다 높은 BMI 값, 1.25kg/㎡ 및 1.60kg/㎡을 가졌다. 마찬가지로, PLIN 14995A>T SNP에 대하여, AT 및 TT 피험자는 AA 피험자보다 높은 BMI 값, 0.87kg/㎡ 및 2.32kg/㎡를 가졌다(도 6). 여성에서, PLIN 6209T>C 및 PLIN 11482G>A 유전자형과 체지방 측도 간의 유의한 관련성은 확인되지 않았다. 남성에서는, 조사된 어떠한 변수에 대해서도 유의한 유전자형 관련 차이가 없었다(데이터는 나타내지 않음).
또한, 본 발명자는 PLIN 변이와 비만증 위험 간의 관련성을 조사하였다. 4개의 SNP로부터 하프로타입을 추정하여 이 군들을 다른 위험 분석에 사용하였다. 여성에서, SNP 13041 또는/및 14995에 드문 대립유전자(minor allele)를 포함하는 하프로타입은 증가된 비만증 위험을 갖는 경향이 있는 반면, 6209 또는/및 11482에 드문 대립유전자를 포함하는 하프로타입은 감소된 비만증 위험을 갖는 경향이 있었다. 이들 중, 앞서 기재한 바와 같이 다변량에 대한 보정 후에, 하프로타입 T/G/G/T는 가장 높은 비만증 위험(OR=2.09, 95%CI 0.83-5.23)과 관련이 있었고, 하프로타입 C/G/A/A는 가장 높은 비만증 방어(OR=0.58, 95%CI 0.25-1.34)와 관련이 있었다(표 2). 그러나, 이들 관련성의 어느 것도 표본 크기의 한계 때문에 통계학적으로 유의하지 않았다. 또한, 본 발명자들은 연구 검증력을 향상시키기 위해서, 6209T>C/11482G>A 또는 13041A>G/14995A>T 하프로타입의 어느 하나에 근거한 하프로타입 관련성을 분석하였다. 하지만, 여성과 남성 모두에서, 6209T>C/11482G>A 로부터 추정된 하프로타입 간에는 어떠한 유의한 관련성도 확인되지 않았다. 여성에서, 13041A>G/14995A>T로부터 추정한 하프로타입을 조사하면, 하프로타입 A/T(OR=1.76, 95%CI 1.07-2.90)와 하프로타입 G/T(OR=1.73, 95%CI 1.06-2.82) 모두, 하프로타입 A/A에 비해서, 증가된 비만증 위험과 유의하게 관련이 있었다(표 8). 그러나, 남성에서는, 13041A>G/14995A>T 하프로타입과 비만 위험 간의 유의한 관련성이 확인되지 않았다.
그 다음, 신체 비만과 에너지 항상성 사이의 견고한 관계 때문에, 본 발명자는 에너지 항상성과 관련된 몇몇 대사 측도와 PLIN 유전자형 사이의 관련성을 분석하였다. 여성 피험자에서, 증가된 신체 비만과는 관련되더라도, PLIN 13041A>G 및 14495A>T는 조사된 대사 측도와는 유의하게 관련되지 않았다(표 9). 반대로, PLIN 6209T>C 및 11482G>A는 LDL-C 레벨과 관련이 있었다(PLIN 6209T>C 에 대해서는 P=0.007이고 PLIN 11482G>A에 대해서는 P=0.028임, 표 9). 또한, PLIN 11482G>A는 TC 레벨과 한계 유의 수준으로 관련이 있었다(P=0.068). 신체 비만에 대한 PLIN 13041A>G/14995A>T에 의해 나타난 부가적인 대립유전자 효과와는 달리, 단지 PLIN 6209T>C/11482G>A의 동형접합 변이를 가진 보유자가 더 높은 LDL-C 또는/및 TC를 갖는 경향이 있는 한편, 다른 유전자형을 가진 보유자들은 이들 측도에서 비슷한 수준을 갖는다. 남성에서는, PLIN 13041G를 보유한 연구 피험자는 야생형 동형접합체를 보유한 피험자에 비해서 더 낮은 TC 및 LDL-C 수준을 갖는 경향이 있음을 확인되었다. 이러한 관련성은 모두 한계 유의수준임이 확인되었다(TC에 대해서는 P=0.051이고 LDL-C에 대해서는 P=0.049임). 또한, 한계유의수준의 관련성은 PLIN 13041A>G와 HDL-C 수준(P=0.047) 사이에서 관찰되었다. 그러나, GA 군과 AA 군 사이에는 HDL-C 수준의 주요한 차이가 있는 것으로 나타났다. 남성에서의 PLIN 6209T>C, 11482G>A, 및 14995A>T의 유전자형은 조사된 어떠한 대사 측도와도 관련이 없었다(표 10).
토의
1990년대 초에 처음으로 보고된 페릴리핀은 지방 세포에서의 지질 분해 및 체지방 축척의 주요 조절자로서 밝혀져 있다(14-17,22-24). 또한, 더 최근에, PLIN 유전자좌에서의 유전적 변이는 감소된 페릴리핀 함량 및 인간 지방세포에서의 증가된 지질분해 활성과 관련이 있으며(18), 이에 의해 일반 집단에서의 비만증에 대한 후보 유전자로서의 PLIN의 역할이 뒷받침되었다. 본 연구에서는, 증강된 평균 BMI를 가진 백인 집단에서, PLIN 유전자좌에서의 변이성과 인체측정 및 대사 변수 사이의 관련성을 조사하였다. 이 집단에서 동정되고 유전자형이 결정된 4개의 흔한 SNP 중에서, 3' 미번역 영역에 위치하는 두개의 SNP(PLIN 13041A>G 및 14495A>T)가 여성 피험자에서 증가된 %체지방 및 허리 둘레와 유의하게 관련이 있었는 동시에, 증가된 BMI와 한계 유의하게 관련이 있었다. 또한, PLIN 13041A>G 및 14995A>T SNP를 사용한 추정된 하프로타입 분석 결과는 A/T 및 G/T 하프로타입에 대한 증가된 비만증 위험을 입증하였다. 반대로, 남성에서, PLIN 다형성은 어떠한 체지방 측정 파라미터와도 유의하게 관련되지 않았다.
페릴리핀은 주로 지방 세포 및 스테로제닉(sterogenic) 세포에서 발현된다. 그들의 지방 저장소 내의 물리적 위치선정 때문에, 페릴리핀은 지방 저장 및 체지방 축적의 가동을 조절하는 그들의 역할에 대해 조사되었으며, 여러 시험관내(in vitro) 연구에 의해 이 개념이 뒷받침되었다(13,23,25). 또한 이러한 역할에 대한 생체내(in vivo) 증거는 녹아웃(knockout) 마우스 모델로부터 분명해졌다(15,16). 인간 PLIN 유전자 변이와 관련된 우리의 이 발견도 상기 실험 모델로부터 도출된 결과와 일치하였으며, 이는 다른 종들을 포함하여 지질대사에서의 페릴리핀의 보존된 역할을 시사한다.
수개의 페릴리핀 동위형태(isoform)가 선택적 스플라이싱의 결과 동정되었으며(9,26), 이들 동위형태는 기능적으로 달라도 좋다(24). PLIN 13041A>G 및 14995A>T 둘다, 전사하는 동안 선택적 스플라이싱이 일어나는 3' 미번역 영역에 위치한다. 이들 다형성은 스플라이싱에 영향을 미침으로써 전사 산물을 변경시킬 수 있다. PLIN 13041A>G 및 14995A>T는 서로 유의한 LD에 있다. 따라서, 본 발명자는 이 두 다형성과 체지방 측도 사이의 관찰된 관련성이 동일한 우발 돌연변이(casual mutation)를 일으킬 수 있다고 주장하며, 14995T 대립유전자는 증가된 비만증 위험과 관련된 하프로타입에 일률적으로 존재하는 것을 고려하여, 이 대립 유전자와 상기 우발 돌연변이가 더 밀접하게 관련이 있다고 가정한다.
본 발명자는, 본 연구에서, 여러 인체측정 측도(BMI, %체지방 및 허리 둘레)를 조사하였다. 그들이 유의하게 상호관련된다 해도, 이들 측도가 체지방을 나타냄에 있어서 일치하는 것은 아니다. 그래서, BMI는 날씬한 집단으로부터는 비만을 구별하지 못한다. 더욱이, 이러한 상관관계는 나이 의존적이다(27,28). 다른 한편, 허리 둘레는 대사 증후군에 걸릴 위험이 높은 개체를 동정하기 위한 더 정확한 측도로서 제안되어 있다(29). 그러한 차이에도 불구하고, 이것은 본 발명자가 PLIN 다형성과 비만증의 여러 지수(index) 사이의 일관된 관련성을 확인했음을 재입증한다.
비만증 측도는 통상 글루코스 및 지질 대사 이상과 상관관계가 있다. 그러나, 본 연구에서는 PLIN 13041A>G 및 14995A>T SNP와 글루코스 또는 지질 관련 측도 사이에 유의한 관련성이 확인되지 않았다. 유사한 결과가 실험 모델에서 관찰되었다. 따라서, PLIN 녹아웃 마우스는, 산화적 이화 경로의 상향 조절 및 지질/스테롤 합성 경로의 하향조절을 통하여 이들 지질분해 산물을 처리하는 메카니즘을 활성화시킴으로써, PLIN 유전자 삭제(gene ablation)에 의해 유발된 구성적 활성화 지질대사에 적응하는 것으로 나타난다(30). 본 발명자는, 지질분해가 감퇴될 때, 이러한 보상 메카니즘이 일어나는 것으로 제안한다.
본 연구에서, 조사된 다른 두 SNP(PLIN 6209T>C 및 11482G>A)는 신체 비만과 관련이 없었다. PLIN 11482G>A는, 비만 여성에서의 감소된 페릴리핀 함량 및 증가 된 지질 대사율과 관련하여, Mottagui-Tabar et al.에 의해 이미 보고되어 있다(18). 따라서, 본 발명자는 PLIN 11482A는 날씬한 표현형과 관련이 있는 것으로 예상하였다. 본 발명에서의 이 다형성과 체지방 측도 간의 무의미한 관련성에 대해서 설명할 수 있는 여러 가지 논거가 있다: 우선, 본 연구 집단은 일반 집단 보다 비만 피험자가 더 많다(평균 BMI=29.6kg/㎡). 이 피험자들은 다른 유전자좌의 영향에 의하여 비만증에 걸리기 쉬운 유전적 소인이 있을 수 있으며, PLIN 11482A의 방어 효과의 발현은 이들 조건하에서는 감퇴될 수 있다. 또한, Mottagui-Tabar 등에 의해 보고된 PLIN 11482G>A 다형성은 대개 기능적 돌연변이를 가진 LD에서의 인트론 SNP이다. 이와 같이, PLIN 11482G>A와 표현형 변수 사이의 관련성은 집단 특이적 유전자 구조에 의해 영향을 받을 수 있으며, PLIN 11482G>A과 기능적 변이 사이의 짝짓기 LD(pairwise LD)의 중요성이 본 발명의 집단에서는 축소될 수 있다.
PLIN 11482AA 유전자형을 보유하는 여성은 더 높은 TC 및 LDL-C를 갖는다는 상기 결과는, AA 유전자형이 증가된 지방 지질분해율과 관련이 있다는 Mottagui-Tabar 연구와 일치하였다(18). 순환 시 증가된 지방산은 간으로의 그들의 흐름이 증가하여 지질 대사가 변경되어 콜레스테롤 생성을 촉진시킨다(31). PLIN 6209T>C 및 11482G/A는 거의 완전한 LD에 있기 때문에, 본 발명자는 PLIN 6209와 LDL-C 농도 사이에 관찰된 관련성이 PLIN 11482G>A SNP와 동일한 유전적 근거를 가질 수 있음을 주장한다.
상기 PLIN 유전자좌는, 남성 피험자에서는 비만증 관련 측도와 관련이 없었다. 남성과 여성은 다른 세트의 비만증 감수성 유전자를 가질 수 있는 것으로 제 안되어 있다(7). 또한, 쌍둥이 연구는 비만증이 남성보다 여성에서 더 유전될 수 있음을 제안한다(32). 그러나, PLIN이 남성에서 비만증 관련 표현형에 대한 후보 유전자가 아니라고 결론짓기 전에 더 많은 연구가 필요하다. 남성과 여성에서의 페릴리핀의 구별된 발현 수준은 그들의 PLIN의 유전적 효과에 대한 상이한 감수성을 설명할 수 있다.
요약하면, 본 발명자는 백인 여성에서의, PLIN 유전자의 3' 미번역 영역에서의 2개의 SNP(PLIN 13041A>G 및 14495A>T)와 비만 위험 사이의 유의한 관련성을 확인하였다. 이들 두 SNP의 변이 대립유전자의 보유자는 야생형 유전자형의 보유자에 비해서 증가된 평균 체지방 함량, 허리 둘레, 및 BMI를 가지고 있었다. 반대로, 남성에서는 PLIN 다형성과 신체 비만 측도 사이에 유의한 관련성이 확인되지 않았다. 본 발명의 조사 결과들은 여성에서의 비만증 측도에 대한 후보 유전자로서의 PLIN의 중요한 역할을 뒷받침한다.
[실시예 II 참조]
Figure 112006027945861-PCT00004
Figure 112006027945861-PCT00005
Figure 112006027945861-PCT00006
Figure 112006027945861-PCT00007
[ 실시예 III : 인간 페릴리핀 유전자( PLIN )의 유전자내 연쇄불균형 구조와 다인종 아시아인 집단에서의 증가된 비만증 위험과 하프로타압 관련성]
재료 및 방법
피험자 및 연구 설계
NHS 98에 참여한 총 4,131명의 피험자가 본 연구에 포함되었다. 이 NHS 98은 싱가폴에서 주요한 비전염성 질환에 대한 위험 인자를 결정하기 위해 시작된 것이다. 그 상세한 방법론은 이미 기재되어 있다(11). NHS 98에 사용된 방법은 당뇨병 및 기타 비전염성 질환 분야를 조사하기 위한 WHO MONICA에 의해 권장된 프로토콜과 방법 및 집단 조사를 위한 WHO MONICA(Multi-national Monitoring of Trends and Determinants in Cardiovascular Disease) 프로토콜에 근거한 것이다. 요컨대, 주거에 관한 국가 데이터베이스에서, 전체 싱가폴 거주 집단의 하우스-타 입(사회경제적 지위 대리) 분포를 나타내는 주소로부터 11,200명의 개체를 선발하였다. 이 개체들로부터, 불균형 층별 및 계통 표집에 의해 임의 표본을 선발하였다. 말레이인 및 인도인을 과하게 표집하여, 이들 소수 집단에 대한 유병률 추정이 신뢰할 수 있음을 보증하였다. 본 연구에, 총 4723명의 피험자가 참여하였으며, 그 인종 구성은 중국인 64%, 말레이인 21%, 및 아시안 인도인 15%였다. 이 조사의 모든 참여자로부터 사전동의를 얻었다. 본 연구는 싱가폴의 보건국과 싱가폴 종합병원의 윤리위원회에 의해 승인되었다.
라이프스타일 인자에 관한 데이터는 면접 조사 설문지를 사용하여 수집하였다. 신체 비만도는, 체중, 신체비만지수(BMI), 허리둘레, 엉덩이둘레, 및 허리/엉덩이둘레 비(WHR)을 포함하여, 큰 규모의 전염병 연구에 통상 적용되는 인체측정 측도를 사용하여 평가하였다. 요컨대, 체중은 표준화된 디지탈 저울(SECA, Hamburg, Germany)을 사용하여, 신발을 신지 않고 얇은 실내복을 입은 채로 정확도 0.1kg으로 측정하였다. 키는 벽에 고정된 스테디오미터를 사용하여 신발을 신지않고 거의 0.1cm까지, 프랑크푸르트 수평면(Frankfurt plane horizontal)으로 측정하였다. BMI는 체중을 키의 제곱으로 나누어 계산하였다(체중 kg/ 키 ㎡). 허리 둘레는 제일아래 갈비뼈 끝과 엉덩뼈 능선 사이의 중간쯤을 거의 0.1cm 까지 측정하였다. 피부에 직접 접촉하여 측정하였다. 엉덩이 둘레는 제일 큰 전자(trochanter) 위를 내의를 입은 채로 거의 0.1cm까지 직접 측정하였다. 비만증은 BMI≥30kg/㎡으로서 이분법적으로 규정하고, 과체중은 30kg/㎡≥BMI≥25kg/㎡로 규정하였다. 상기 기준을 사용할 때 총 300명의 비만 사례가 있었으며, 1,333명의 피험자가 과체중으로 분류되었다.
주요 인체측정 및 생화학적 측도에 있어서, PLIN 유전자상의 유전자형을 결정하거나 하지 않은 피험자 사이에 어떠한 차이도 확인되지 않았다.
DNA 분리 및 유전자형 결정
유전자형 결정은 단일 누클레오티드 연장법을 사용하여 수행하였다. 우선, 다중 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해, 5개의 새롭게 동정된 PLIN 유전자좌에서의 SNP를 포함하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 상기 SNP는 "+1"로 넘버링된, PLIN의 개시 메티오닌 코돈 ATG의 A(참고 서열상의 157157 위치, 접근 번호 GI21431190)에 대한 그들의 상대 위치에 따라서 넘버링되었다(6209 T>C, 10171 A>T, 11482 G>A, 13041 A>G, 14995 A>T). 사용된 프라이머는 표 1에 나타낸다. PCR 증폭은 각 dNTP 0.2mmol/L, 각 프라이머 0.2μmol/L, 염화마그네슘 3.0mmol/L , 및 Qiagen Hotstar Taq 폴리머라제 0.8U를 함유하는 10㎕의 반응 용적으로 수행하였다. PCR 사이클링 조건은 95℃에서 10분간 반응한 후, 95℃에서 30초, 70℃에서 30초, 및 72℃에서 1분의 사이클을 7사이클 행한 다음, 95℃에서 30초, 65℃에서 30초, 및 72℃에서 1분의 사이클을 41사이클 행하였다. 72℃에서 2분의 최종 연장 단계는 프로토콜의 마지막에 포함된다. 상기 PCR 산물에 엑소누클레아제 I(New England Biolabs,Inc. Beverly, MA) 및 소내장 인산분해효소(calf intestinal phosphatase)(New England Biolabs,Inc. Beverly, MA)를 2.5U 첨가하고, 37℃에서 60분간 배양하여 결합되지 않은 dNTP와 프라이머를 제거하였다. 그 다음, 75℃에 서 15분간 배양하여 상기 효소들을 비활성화시켰다.
그 다음, ABI Prism SnaPshot 다중 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 단일 누클레오티드 연장을 수행하였다. 단일 누클레오티드 연장에 사용된 프로브는 표 1에 나타내었다. 상기 연장 반응은 PCR 반응기를 사용하여, 1.5㎕ Snapshot Ready Reaction Mastermix(Applied Biosystems, Foster City, CA), 물 1.0㎕, 다중 PCR 산물 1.5㎕ 및 프로브 혼합물(6209 T>C, 10171 A>T, 및 11482 G>A에 대해서는 1.5μmol/L; 13041 A>G 및 14995 A>T에 대해서는 2.0μmol) 1.0㎕을 함유하는 5㎕의 반응 혼합물에서 수행하였다. 상기 반응 조건은 96℃에서 30초, 50℃에서 30초, 및 60℃에서 30초의 사이클을 35사이클로 하였다. 상기 반응 산물은 소내장 인산분해효소 3U를 첨가하고 37℃에서 60분간 배양하여, 결합되지 않은 dNTP를 제거한 다음, 75℃에서 15분간 배양하여 상기 효소들을 비활성화시켰다. Genotyper version 3.7((Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 ABI Prism 3100 유전자 분석기((Applied Biosystems, Foster City, CA) 상에서, 상기 최종 산물을 사용하여 유전자형 결정을 수행하였다. 유전자형 결정의 질(quality) 조절이 이루어졌으며 그 결과는 두 명 조사자에 의해 독립적으로 해석되었다.
통계적 분석
Arlequin(http://lgb.unige.ch/arlequin/에서 입수가능)을 사용하여, 대립 유전자 빈도를 추정하고, 하디-와인버그 평형을 이룬 각 SNP 유전자좌에서의 유전 자형 빈도의 일치성을 테스트하고, 조사된 SNP간의 짝짓기 LD(pairwise LD)를 추정하였다. 각 SNP쌍 간의 LD의 통계학적 유의성은 우도비 시험(likehood-ratio test)을 이용하여 테스트하였다. 하프로타입은, 공변량을 보정하면서 서로 관련없는 피험자의 하프로타입 효과를 테스트하기 위해 설계된, THESIAS 프로그램(http://ecgene.net/genecanvas/modules/mydownloads/singlefile.php?cid1&lid=1에서 입수가능)을 이용하여 추정하였다. 이 컴퓨터 프로그램은 Tregouet et al.(13)에 의해 기재된 최우도 모델에 근거한다. 개체의 관련성 분석에는 SAS(윈도우 버젼 8.0)가 사용되었으며, 통계학적 유의성은 5% 수준으로 규정되었다. 비만 사례와 미비만 사례 간의 PLIN 유전자형의 유병률에서의 차이는 χ2 분석에 의해 분석되었다. 95% 신뢰구간의 교차비(OR)를 이용하여 비만증의 상대 위험도를 추정하였다. 다변량 로지스틱 회귀 분석을 이용하여 비만증에 대한 잠재 공변량(나이, 성별, 흡연, 음주, 운동, 및 당뇨병 상태)을 제어하였다. 유전적 효과와 성별 간의 상호작용은 상기 모델에 그 대응 곱 조항을 도입하여 테스트하였다. 일반 유전 모델(피험자가 각 SNP의 유전자형에 따라 군집화됨)을 적용하여 대립유전자 효과를 조사하고, 관찰된 대립유전자 효과에 근거하여 적합한 유전 모델(우성, 열성, 또는 부가)을 최종적으로 사용하였다.
결과
싱가폴 NHS 98 집단에서, 5개의 흔한 이대립유전자(diallelic) 다형 성(6209T>C, 10171A>T, 11482G>A, 13041A>G, 및 14995A>T)을 선발하여 유전자형을 결정하였다. 이 SNP들은 각각 인트론 2(6209), 인트론 5(10171), 인트론 6(11482), 엑손 8(13041) 및 엑손 9(14995)에 위치한다. 상기 5개의 PLIN 다형성에 관한 유전자형 정보는 4,131명의 연구 피험자로부터 얻었다. 이 유전자형이 결정된 참여자의 특색은 표 11에 나타낸다. 중국인이 67.28%, 말레이인이 18.16%, 인도인이 14.56%였다. 전체적으로, 인도인은 더 나이가 많았고 중국인이 더 젊었다. 남성에서는, 말레이인과 인도인이 유사한 평균 BMI를 가졌으며, 중국인의 평균 BMI보다 ~1.0kg/㎡ 높았다. 여성에서는, 말레이인이 가장 높은 BMI(26.3±5.6kg/㎡)를 가졌으며, 그 다음으로 인도인(25.6±5.0kg/㎡)과 중국인(22.1±3.6kg/㎡)이 이었다. 여성과 남성 모두, 비만증(BMI≥30kg/㎡)과 과체중(BMI≥25kg/㎡)이 말레이인에서 가장 우세하였으며, 그 다음이 인도인이었다. 이 두 인종군에서의 비만증과 과체중의 유병률은 중국인보다 훨씬 더 높았다. 인도인 남성과 여성은 가장 높은 당뇨병 비율(남성 18.2%, 여성 17.4%)을 갖고, 말레이인에서 관찰된 것(남성 10.9%, 여성 14.8%)보다 높았으며, 반면에, 중국인에서는 남성 7.2%이고 여성 6.6%로 훨씬 더 낮았다. 말레이인은 현재 흡연자의 비율이 가장 높았으나, 음주는 중국인이 가장 높은 빈도였다.
상기 3 인종 군 중에서, 드문 대립유전자(minor allele)에 대한 빈도는 PLIN 6209C>T에 대해서는 0.320-0.462이고, PLIN 10171A>T에 대해서는 0.135-0.255이고, PLIN 11482G>A에 대해서는 0.326-0.439이고, PLIN 13041A>G에 대해서는 0.296-0.471이고, PLIN 14995A>T에 대해서는 0.361-0.444의 범위였다. 상기 관찰 예측된 유전자형 빈도는 3개의 인종군의 모든 다형성에 대하여 하디-와인버그 평형과 일치하였다. 동질성(homogeneity)에 대한 카이제곱 시험은 조사된 5개의 SNP 중 어느 것에 대해서도 남성과 여성 간의 유전자형/대립유전자 분포에 유의 차가 없음을 보여주었다. 반대로, 본 발명자는 각 다형성 부위에서의 유전자형 분포에서 인종간 유의 차를 확인하였다. 유의한 비임의(non-random) 대립유전자 관련성은, 도 7에 짝짓기 LD에 대한 D'로 나타낸 바와 같이, 각 SNP쌍 사이에서 확인되었다. PLIN내의 LD 구조는 균일하지 않은 것으로 나타났다. PLIN 6209C>T와 10171A>T SNP 모두 모든 다른 SNP와 네거티브 LD에 있는 반면, PLIN 11482G>A, 13041A>G 및 14995A>T SNP는 3 인종군에서 서로 포지티브 LD에 있었다. 이 포지티브 관련성 중에서, 가장 강한 LD는, 3 인종 군 중에서 D'가 0.76-0.83의 범위인, PLIN 11482G>A와 14995A>T 사이에서 확인되었다.
본 발명자는 상기 3 인종 군에서의 추정된 PLIN 하프로타입과 비만증(BMI≥30kg/㎡) 위험 사이의 잠정적인 관련성을 조사하였으며, 하프로타입 재구성을 위해 최우도 알고리즘에 근거한 THESIAS를 이용하였다(13). 본 발명자는 유전자와 성별간의 유의한 상호작용을 검출하지 못하였다. 따라서, 남성과 여성을 함께 분석하였다. 5개의 SNP를 사용하여, 중국인, 말레이인, 및 인도인에 대하여, 각각 24개, 18개, 및 18개의 하프로타입을 추정한 다음, 흔한 하프로타입(~5%보다 높은 빈도를 가짐)과 비만증 위험 간의 관련성을 조사하였다(표 12). 말레이인에서는, 하프로타입 11222(OR=1.64, 95%CI 1.08-2.48)과 11212(OR=1.65, 95%CI 1.11-2.46)가 가장 우세한 하프로타입 21111에 비해서 증가된 비만증 위험과 관련이 있음이 확인되었 다. 또한, 하프로타입 11212도 인도인의 비만증 위험과 유의하게 관련이 있었다(OR=1.94, 95%CI 1.06-3.53). 반대로, 하프로타입 12111은 인도인에서, 한계 유의에 도달한 하프로타입 21111에 비해서 증가된 비만증 위험과 관련이 있었다(OR=0.30, 95%CI 0.09-1.06). 마찬가지로, 이 하프로타입은 말레이인에서는 약간 감소된 비만증 위험과 관련이 있었다. 관련 공변량(나이, 성, 흡연, 음주, 운동, 및 당뇨병 상태)에 대한 보정이 말레이인에서는 관찰된 관련성의 유의성을 변화시키지 않았지만 인도인에서는 유의성이 약간 감소되었다. 하지만, 중국인에서는 PLIN 하프로타입과 비만증 위험 간의 유의한 관련성을 발견하지 못하였다.
또한, 본 발명자는 서로 포지티브 LD에 있는 SNP의 서브그룹(PLIN 11482, 13041, 및 14995)을 사용하여 하프로타입 관련성을 조사하였다. 이들 3 SNP를 이용하여, 각 인종 군내에서 8개의 하프로타입을 추정하였다. 개별 하프로타입(~5%보다 높은 빈도)과 비만증 위험 간의 관련성 시험은, 말레이인에서, 하프로타입 212, 222, 및 121가 가장 흔한 하프로타입 111에 비해서 증가된 비만증 대응비(odds)와 유의하게 관련이 있음을 나타내었다(212에 대하여 OR=2.12, 95%CI 1.36-3.32, 222에 대하여 OR=2.02, 95%CI 1.36-3.01, 및 121에 대하여 OR=1.89, 95%CI 1.05-3.41). 인도인에서, 하프로타입 212는 하프로타입 111에 비해서 증가된 비만증 대응비와 유의하게 관련이 있었다(OR=2.39, 95%CI 1.26-4.50). 하프로타입 122는 증가된 비만증 위험과 한계 유의하게 관련이 있었다. 주요 비만증 위험 인자(나이, 성, 흡연, 알콜, 운동 및 당뇨병 상태)에 대한 보정은, 말레이인에서의 하프로타입 121과의 관련성이 한계 유의한 것 외에는, 상기 관찰된 관련성을 변화시키지 않았다(표 13 및 표 14).
또한, 본 발명자는 개별 SNP 각각의 비만증 위험과의 관련성에 대하여 조사하였다. PLIN 6209C>T와 PLIN 11482G>A의 유의한 관련성이 확인되지 않았다. PLIN 14995A>T에서의 T 대립유전자에 대한 동형접합성은 말레이인과 인도인 모두에서 다른 유전자형에 비해서 증가된 비만증 대응비와 유의하게 관련이 있었다(말레이인에 대해서는 다변량 OR=2.28, 95%CI 1.45-3.57, 인도인에 대해서는 다변량 OR=2.04, 95%CI 1.08-3.84). PLIN 11482G>A 또는 13041A>G 중의 어느 하나의 드문 대립유전자에 대한 동형접합성도 인도인과 말레이인에서 증가된 비만증 대응비와 관련이 있음이 확인되었으나, 후자 군에서만 통계학적으로 유의성이 있었다(PLIN 11482G>A에 대해서는 다변량 OR=1.94, 95%CI 1.22-3.08, PLIN 13041A>G에 대해서는 다변량 OR=1.87, 95%CI 1.08-3.25)(도 8 참조). 중국인에서는 이들 다형성과 비만증 위험 간에 유의한 관련성이 확인되지 않았다.
토의
본 연구에서, 본 발명자는 SNP와 하프로타입에 의거한 분석을 이용하여, 다른 인종적 배경을 가진 4,131명의 피험자의, PLIN 유전자 변이와 비만증 위험 간의 관련성을 조사하였다. 본 발명자는, 3 인종군(중국인, 말레이인 및 인도인)을 포함하는 아시아인 집단에서, 비만증에 대한 후보 유전자인 PLIN 유전자좌(PLIN 6209C>T, 10171A>T, 11482G>A, 13041A>G, 및 14995A>T)에서의 5개의 이대립유전자 다형성의 유전자형을 결정하였다. 본 발명자는, 비만증 위험과 추정된 하프로타입 의 관련성을 조사함으로써, PLIN 11212 하프로타입이 말레이인과 인도인의 증가된 비만 위험과 유의하게 관련이 있음을 밝혔다. 상기 SNP 중 포지티브 연쇄불균형(LD)에 있는 3개(11482G>A, 13041A>G, 및 14995A>T)를 이용한 부가적인 하프로타입 분석은, 공변량 보정 후, 하프로타입 212 및 222는 말레이인의 증가된 비만 위험과 유의하게 관련이 있고, 하프로타입 212는 인도인의 증가된 비만 위험과 유의하게 관련이 있음을 나타내었다. 결국, 개개의 SNP 분석 결과, PLIN 14995A>T가 말레이인과 인도인의 비만 위험과 유의하게 관련이 있음이 밝혀졌다.
본 발명의 조사 결과는 PLIN을 인간의 비만 위험에 대한 후보 유전자로서의 고려하는 것에 대한 강력한 증거를 제공한다(http://obesitygene.pbrc.edu/ 참조). 페릴리핀은 지방세포내의 우세한 지질 방울 관련 단백질이다(2,3,14). 페릴리핀은 지방세포내의 PKA-관여 세포내 지질분해를 조절하고 저장된 TAG의 턴오버에 영향을 미치는 중요한 역할을 함이 밝혀져 있다(4,5,15). 생체내(in vivo) 시험 모델에서, PLIN 유전자 산물은 체지방 조성의 결정에 결정적인 역할을 함이 밝혀져 있다(6,7). 인간에서, 지방 조직내에 페릴리핀이 풍부한 것은 지질분해 속도와 관련이 있으며, 그 유전적 변이의 하나는 페릴리핀 함량과 지질대사율 모두에 영향을 미칠 수 있다(8).
본 발명의 데이터는 조사된 3 인종 중 2 인종에서 PLIN 하프로타입과 비만증 위험 간에 일치된 관련성을 보인다. 하프로타입 11212는 말레이인과 인도인의 증가된 비만증 위험과 일치되게 관련이 있었으며, 이는 이 하프로타입이 기능적 돌연변이를 포함할 수 있음을 시사한다. 또한, 11482, 13041, 및 14995 부위에서의 SNP를 사용한 하프로타입 분석은 상기 관련성의 중요성과 통계학적 유의성을 증가시켰다. 하프로타입 212(11482, 13041, 및 14995에서의)는, 관련 공변량을 조정한 후에, 말레이인과 인도인 모두에서, 야생형 하프로타입(111)에 비해서 증가된 비만증 위험과 관련이 있었다. 본 발명자는, 두 인종 군에서 증가된 비만증 위험과 일치된 관련성이 주어지는 경우에는, 11482G>A, 13041A>G, 및 14995A>T SNP에서 유도된 하프로타입 212는 기능적 돌연변이를 숨기거나 상호분리하는 것으로 가정한다.
상기 개개의 SNP를 분석하여 얻은 결과들은, PLIN 14995A>T가 비만증과 관찰된 하프로타입의 관련성에 대한 가장 유의한 단일 유전 공헌자(genetic contributor)임을 시사하였다. 이 다형성은 말레이인과 인도인 모두에서 비만증 위험과 일치되게 관련이 있었으며, 가장 높은 교차비를 보유하였다. 나머지 두 SNP, PLIN 11482G>A 및 13041A>G도 증가된 비만증 위험과 관련이 있음이 확인되었지만, 단지 하나의 인종 군에만 제한된다는 상기 조사 결과와 사실의 더 낮은 중요성은 그들의 관련성이 PLIN 14995A>T SNP와의 그들의 LD에 기인할 수 있음을 나타낸다.
본 발명자는 PLIN 변이와 중국인의 비만증 위험 간의 유의한 관련성을 확인하지 못하였다. 몇몇 연구자들은, 아시아인의 비만증을 규정할 때에는 더 낮은 컷오프(cutoff)가 적용되어야 한다고 제안하였다(16,17). 그러나, 본 발명의 분석에서 더 낮은 컷오프(27kg/㎡)를 사용하는 것이 상기 결과들의 중요성을 변화시키지 않았다. 필요에 따라서, 본 발명자는, 유전 효과의 분별 침투도(differential penetrance)가, PLIN과 비만증의 관계 면에서 중국인과 다른 두 인종 간에 관찰되 는 불일치를 설명하는 근원적인 근거가 될 수 있다고 주장한다. 싱가폴에서, 말레이인과 인도인은 유사한 평균 BMI를 가지며, 비슷한 환경에 거주함에도 불구하고,중국인의 평균 BMI보다는 유의하게 높으며, 이는 중국인이 비만증에 걸릴 유전적 소인이 더 낮음을 시사한다.
PLIN 13041A>G 및 PLIN 14995A>T SNP는 PLIN 전사 동안 일어나는 선택적 스플라이싱으로 여러 페릴리핀 동위형태(isoform)가 생기는 영역에 위치한다(18). 최근 데이터는 페릴리핀 동위형태들이 PKA-관여 지질분해로부터 저장 지방을 보호함에 있어서 상이한 효율로 작동할 수 있음을 나타내었다(19). 따라서, 이론에 의한 경계 짓지 않는다면, PLIN 13041A>G와 PLIN 14995A>T의 관련성의 기초가 되는 유전 효과는 스플라이싱과 상이한 페릴리핀 동위형태의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 또한, PLIN 11482G>A는, 이들 관련성에 있어서, 기능적 변이보다는 오히려 유전적 표식형질을 나타낸다. 본 발명자는 PLIN 유전자에 대하여 아시아인과 코카서스인 집단 사이의 LD 구조에서 중요한 차이를 확인하였으며(데이터 기재하지 않음), 다른 인종군 간의 상이한 유전자내 LD 구조는 여러 인종 군에서의 상이한 관련성에 기인한다고 주장한다. LD 구조에서의 이러한 차이는 본 발명의 조사 결과와 이미 이루어진 연구 결과 간의 불일치를 설명할 수 있다. Mottagui-Tabar et al.은 최근 PLIN 11482G>A SNP에서의 대립유전자 A가 증강된 기저 및 노어아드레날린 유도 지질대사와 관련이 있음을 보고하였다. 또한, 동일 대립유전자는 비만 여성에서의 낮은 페릴리핀 함량과 관련이 있었다(8). 본 발명의 관찰에 반대되는 이러한 결과에 따라서, PLIN 11482AA 유전자형과 체지방 사이에 네거티브 관련성을 예 측될 수 있다. 그러나, Mottagui-Tabar et al.에 의한 연구에서, 피험자는 코카서스계 여성이었다. LD 구조에서의 인종적 차이는 중국인에서 이 유전자좌에서의 유전 변이와 비만증 간의 관련성의 부족을 설명할 수도 있다.
요약하면, 본 발명자는, 싱가포르에 사는 말레이인과 중국인에서, PLIN 하프로타입과 증가된 비만증 위험도 사이의 일치된 관련성을 확인하였다. 흔한 위험 하프로타입은 말레이인과 인도인에 분배되어 있으며 이들 인종 군에서 비만에 걸리기 쉬운 소인을 형성한다. 단일 SNP 분석은 PLIN 14995A>T가 상기 관찰된 하프로타입 관련성에 대한 더 적절한 유전적 표식형질이 될 수 있음을 시사한다.
[실시예 III의 참조문]
Figure 112006027945861-PCT00008
Figure 112006027945861-PCT00009
Figure 112006027945861-PCT00010
명세서 전반에 걸쳐 인용된 상기 참고예는 단지 참고로서 삽입하였다.
<표 1>
Figure 112006027945861-PCT00011
Figure 112006027945861-PCT00012
<표 2>
Figure 112006027945861-PCT00013
<표 3>
Figure 112006027945861-PCT00014
<표 4>
Figure 112006027945861-PCT00015
<표 5>
Figure 112006027945861-PCT00016
<표 6>
Figure 112006027945861-PCT00017
<표 7>
Figure 112006027945861-PCT00018
<표 8>
Figure 112006027945861-PCT00019
<표 9>
Figure 112006027945861-PCT00020
<표 10>
Figure 112006027945861-PCT00021
<표 11>
Figure 112006027945861-PCT00022
<표 12>
Figure 112006027945861-PCT00023
<표 13>
Figure 112006027945861-PCT00024
<표 14>
Figure 112006027945861-PCT00025
<표 15>
Figure 112006027945861-PCT00026
<표 16>
Figure 112006027945861-PCT00027
<110> TUFTS UNIVERSITY <120> GENETIC MARKERS FOR OBESITY <130> 700355-54223-PCT <140> PCT/US2004/018743 <141> 2004-06-10 <150> 60/504,830 <151> 2003-09-22 <150> 60/519,109 <151> 2003-11-12 <150> 60/544,524 <151> 2004-02-13 <160> 20 <170> PatentIn Ver. 3.2 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide primer <400> 1 ctctgttctc cagggaccaa gtcagat 27 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide primer <400> 2 cctacactct ggggatgcgg agat 24 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide probe <400> 3 gactgactga ctgactgact gaccccactg cctagaa 37 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide primer <400> 4 gagggagaag agaggtgtga gaggga 26 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide primer <400> 5 catctgggct ctctgctgct tgag 24 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide probe <400> 6 gactgactga ctgactgact gactgactgt gcccccggag ag 42 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide primer <400> 7 ttggccttgg gagacttctg gg 22 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide primer <400> 8 ttgtcacaca cactgcctgg gaat 24 <210> 9 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide probe <400> 9 gactgactga ctgactgact gactgactga ctgcaggagg tggctca 47 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide primer <400> 10 aagtgttgcc cctgcaggaa t 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide primer <400> 11 gagtggaact gctgggccat a 21 <210> 12 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide probe <400> 12 gactgactga ctgactgact gactgactga ctgacttgtg gggctcccta ga 52 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide primer <400> 13 ctcaccggca cgtaatgcac 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide primer <400> 14 ccctccagac caccatctcg 20 <210> 15 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide probe <400> 15 gactgactga ctgactgact gactgactga ctgactgacc ttggttgagg agacagc 57 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide primer <400> 16 aagcagctgg ctctacaaag ca 22 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide primer <400> 17 agcatccttt ggggcttca 19 <210> 18 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide probe <400> 18 gactgactga ctgactgact gactgactga ctgactgact gactgactgc ctgctgggag 60 cct 63 <210> 19 <211> 59 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (15)..(59) <400> 19 cttgaggagc gagg atg gca gtc aac aaa ggc ctc acc ttg ctg gat gga 50 Met Ala Val Asn Lys Gly Leu Thr Leu Leu Asp Gly 1 5 10 gac ctc cct 59 Asp Leu Pro 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Ala Val Asn Lys Gly Leu Thr Leu Leu Asp Gly Asp Leu Pro 1 5 10 15

Claims (21)

  1. 하기 공정을 포함하는, 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법:
    a) 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN1 6209T/C, PLIN3 10171A/T, PLIN4 11482G/A, PLIN5 13041A/G, PLIN6 14995A/T 유전자좌(loci)의 유전자형(genotype)을 결정하는 공정;
    b) 상기 공정(a)에서 결정된 PLIN 유전자형에 근거하여 하프로타입(haplotype)을 작성(creating)하는 공정; 및
    c) 상기 하프로타입을 상기 개체의 인종적 배경과 관련시키는 공정, 여기서 상기 개체의 인종적 배경에 관련된, PLIN5-G/PLIN6-T; PLIN5-A/PLIN6-T; PLIN1-T/PLIN4-G/PLIN5-G/PLIN6-T; PLIN1-T/PLIN4-G; PLIN1-T/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A; PLIN1-T/PLIN3-A/PLIN4-A/PLIN5-A/PLIN6-T; PLIN1-T/PLIN3-A/PLIN4-A/PLIN5-G/PLIN6-T; PLIN4-A/PLIN5-A/PLIN6-T; PLIN4-A/PLIN5-G/PLIN6-T; PLIN4-G/PLIN5-G/PLIN6-A; PLIN1-T/PLIN3-A 로 이루어진 군에서 선택되는 하프로타입은 개체내의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타냄.
  2. 하기 공정을 포함하는, 코카서스계(Caucasian descent) 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법;
    a) 상기 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN1 6209T/C, PLIN4 11482G/A, PLIN5 13041A/G, PLIN6 14995A/T 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정;
    b) 상기 공정(a)에서 결정된 PLIN 유전자형에 근거하여 하프로타입을 작성하는 공정; 및
    c) 상기 하프로타입을 상기 개체의 인종적 배경과 관련시키는 공정, 여기서 PLIN5-G/PLIN6-T; PLIN5-A/PLIN6-T; 및 PLIN1-T/PLIN4-G/PLIN5-G/PLIN6-T로 이루어진 군에서 선택되는 하프로타입은 코카서스계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타냄.
  3. 하기 공정을 포함하는, 지중해연안계(Mediterranian descent) 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법;
    a) 상기 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN1 6209T/C, PLIN4 11482G/A, PLIN5 13041A/G, PLIN6 14995A/T 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정;
    b) 상기 공정(a)에서 결정된 PLIN 유전자형에 근거하여 하프로타입을 작성하는 공정; 및
    c) 상기 하프로타입을 상기 개체의 인종적 배경과 관련시키는 공정, 여기서 PLIN1-T/PLIN4-G; PLIN1-T/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A; PLIN1-T/PLIN4-G/PLIN5-G/PLIN6-T로 이루어진 군에서 선택되는 하프로타입은 지중해연안계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타냄.
  4. 하기 공정을 포함하는, 말레이계(Malayan descent) 개체에서의 증가된 비만 증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법;
    a) 상기 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN1 6209T/C, PLIN3 10171A/T, PLIN4 11482G/A, PLIN5 13041A/G, PLIN6 14995A/T 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정;
    b) 상기 공정(a)에서 결정된 PLIN 유전자형에 근거하여 하프로타입을 작성하는 공정; 및
    c) 상기 하프로타입을 상기 개체의 인종적 배경과 관련시키는 공정, 여기서 PLIN1-T/PLIN3-A/PLIN4-A/PLIN5-A/PLIN6-T; PLIN1-T/PLIN3-A/PLIN4-A/PLIN5-G/PLIN6-T; PLIN4-A/PLIN5-A/PLIN6-T; PLIN4-A/PLIN5-G/PLIN6-T; PLIN4-G/PLIN5-G/PLIN6-A; PLIN1-T/PLIN3-A로 이루어진 군에서 선택되는 하프로타입은 말레이계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타냄.
  5. 하기 공정을 포함하는, 인도계(Indian descent) 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법;
    a) 상기 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN1 6209T/C, PLIN3 10171A/T, PLIN4 11482G/A, PLIN5 13041A/G, PLIN6 14995A/T 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정;
    b) 상기 공정(a)에서 결정된 PLIN 유전자형에 근거하여 하프로타입을 작성하는 공정; 및
    c) 상기 하프로타입을 상기 개체의 인종적 배경과 관련시키는 공정, 여기서 PLIN1-T/PLIN3-A/PLIN4-A/PLIN5-A/PLIN6-T; PLIN4-A/PLIN5-A/PLIN6-T; PLIN4-G/PLIN5-G/PLIN6-T; 및 PLIN1-T/PLIN3-A로 이루어진 군에서 선택되는 하프로타입은 인도계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타냄.
  6. 코카서스계 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN5 13041A/G 및 PLIN6 14995A/T 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정을 포함하고, 상기 PLIN 5 유전자좌에서의 대립유전자 G(allele G)의 동형접합성(homozigosity) 또는 상기 PLIN 6 유전자좌에서의 대립유전자 T의 동형접합성은 코카서스계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타내는, 코카서스계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법.
  7. 말레이계 또는 인도계 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN6 14995A/T 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정을 포함하고, 상기 PLIN 6 유전자좌에서의 대립유전자 T의 동형접합성은 말레이계 또는 인도계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타내는, 말레이계 또는 인도계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법.
  8. 말레이계 또는 인도계 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN4 11482G/A 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정을 포함하고, 상기 PLIN 4 유전자좌에서의 대립유전자 A의 동형접합성은 말레이계 또는 인도계 개체에서의 증가된 비 만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타내는, 말레이계 또는 인도계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법.
  9. 말레이계 또는 인도계 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN5 13041A/G 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정을 포함하고, 상기 PLIN 5 유전자좌에서의 대립유전자 G의 동형접합성은 말레이계 또는 인도계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타내는, 말레이계 또는 인도계 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체가 여성인, 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체가 체중 감소 다이어트 처치된, 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비만증 관련 질환이 심혈관 질환(cardivascular disease)인, 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비만증 관련 질환이 대사 증후군(metabolic syndrome)인, 개체에서의 증가된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법.
  14. 하기 공정을 포함하는, 개체에서의 감소된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법:
    a) 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN1 6209T/C, PLIN3 10171A/T, PLIN4 11482G/A, PLIN5 13041A/G, PLIN6 14995A/T 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정;
    b) 상기 공정(a)에서 결정된 PLIN 유전자형에 근거하여 하프로타입을 작성하는 공정; 및
    c) 상기 하프로타입을 상기 개체의 인종적 배경과 관련시키는 공정, 여기서 상기 개체의 인종적 배경에 관련된, PLIN5-A/PLIN6-A; PLIN1-C/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A; PLIN1-C/PLIN4-A; PLIN1-C/PLIN4-A/PLIN5-A/PLIN6-A; PLIN1-T/PLIN3-T/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A; PLIN1-C/PLIN3-A/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A; 및 PLIN1-C/PLIN3-T로 이루어진 군에서 선택되는 하프로타입은 개체내의 감소된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타냄.
  15. 하기 공정을 포함하는, 코카서스계 개체에서의 감소된 비만증 및 비만증 관 련 질환 위험의 결정 방법;
    a) 상기 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN1 6209T/C, PLIN4 11482G/A, PLIN5 13041A/G, PLIN6 14995A/T 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정;
    b) 상기 공정(a)에서 결정된 PLIN 유전자형에 근거하여 하프로타입을 작성하는 공정; 및
    c) 상기 하프로타입을 상기 개체의 인종적 배경과 관련시키는 공정, 여기서 PLIN5-A/PLIN6-A 및 PLIN1-C/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A로 이루어진 군에서 선택되는 하프로타입은 코카서스계 개체에서의 감소된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타냄.
  16. 하기 공정을 포함하는, 지중해연안계 개체에서의 감소된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법;
    a) 상기 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN1 6209T/C, PLIN4 11482G/A, PLIN5 13041A/G, PLIN6 14995 A/T 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정;
    b) 상기 공정(a)에서 결정된 PLIN 유전자형에 근거하여 하프로타입을 작성하는 공정; 및
    c) 상기 하프로타입을 상기 개체의 인종적 배경과 관련시키는 공정, 여기서 PLIN1-C/PLIN4-A 및 PLIN1-C/PLIN4-A/PLIN5-A/PLIN6-A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하프로타입은 지중해연안계 개체에서의 감소된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타냄.
  17. 하기 공정을 포함하는, 말레이계 개체에서의 감소된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법;
    a) 상기 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN1 6209T/C, PLIN3 10171A/T, PLIN4 11482G/A, PLIN5 13041A/G, PLIN6 14995 A/T 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정;
    b) 상기 공정(a)에서 결정된 PLIN 유전자형에 근거하여 하프로타입을 작성하는 공정; 및
    c) 상기 하프로타입을 상기 개체의 인종적 배경과 관련시키는 공정, 여기서 PLIN1-T/PLIN3-T/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A; PLIN1-C/PLIN3-A/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A 및 PLIN1-C/PLIN3-T로 이루어진 군에서 선택되는 하프로타입은 말레이계 개체에서의 감소된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타냄.
  18. 하기 공정을 포함하는, 인도계 개체에서의 감소된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법;
    a) 상기 개체로부터 채취한 생물학적 시료로부터 PLIN1 6209T/C, PLIN3 10171A/T, PLIN4 11482G/A, PLIN5 13041A/G, PLIN6 14995 A/T 유전자좌의 유전자형을 결정하는 공정;
    b) 상기 공정(a)에서 결정된 PLIN 유전자형에 근거하여 하프로타입을 작성하 는 공정; 및
    c) 상기 하프로타입을 상기 개체의 인종적 배경과 관련시키는 공정, 여기서 PLIN1-C/PLIN3-A/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A; PLIN1-C/PLIN3-A/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A; 및 PLIN1-C/PLIN3-C로 이루어진 군에서 선택되는 하프로타입은 인도계 개체에서의 감소된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험을 나타냄.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체가 여성인, 개체에서의 감소된 비만증 및 비만증 관련 질환 위험의 결정 방법.
  20. PLIN1 6209T/C, PLIN3 10171A/T, PLIN4 11482G/A, PLIN5 13041A/G, 및 PLIN6 14995A/T 다형성(polymorphisms)을 커버(cover)하는 핵산 영역을 증폭시키기 위한 프라이머쌍(primer pairs), 및
    증가 또는 감소된 비만 위험과 관련된 상기 하프로타입과 그들의 인종 군과의 상호 관련성을 포함하는 지시서(instructions)
    를 포함하는 키트.
  21. PLIN1 다형성을 커버하는 핵산 영역을 증폭시키기 위한 서열번호 1 및 서열번호 2; PLIN3 다형성을 커버하는 핵산 영역을 증폭시키기 위한 서열번호 7 및 서열번호 8; PLIN4 다형성을 커버하는 핵산 영역을 증폭시키기 위한 서열번호 10 및 서열번호 11; PLIN5 다형성을 커버하는 핵산 영역을 증폭시키기 위한 서열번호 13 및 서열번호 14; PLIN6 다형성을 커버하는 핵산 영역을 증폭시키기 위한 서열번호 16 및 서열번호 17,의 프라이머쌍, 및
    증가 또는 감소된 비만 위험과 연관된 상기 하프로타입과 그들의 인종 군과의 상호 관련성을 포함한 지시서
    를 포함하는 키트.
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