JP4538637B2

JP4538637B2 - アポリポタンパクｅ遺伝子多型検出方法、アポリポタンパクｅ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法及び試薬

Info

Publication number: JP4538637B2
Application number: JP2005504287A
Authority: JP
Inventors: 弘詔川嵜; 祐樹小林; 博志光安
Original assignee: Kyushu University NUC
Current assignee: Kyushu University NUC
Priority date: 2003-03-31
Filing date: 2004-03-31
Publication date: 2010-09-08
Anticipated expiration: 2024-03-31
Also published as: WO2004087961A1; JPWO2004087961A1

Description

本発明は、アポリポタンパクＥの遺伝子多型検出方法及びそれに用いる試薬に関するものであり、より詳細には、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）法を利用したヒト・アポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプを判定（ゲノタイピング）するのに有用なアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法、アポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法及びそれに用いる試薬に関するものである。

アポリポタンパク（以下「Ａｐｏ」という。）Ｅは、血中コレステロールの運搬に重要な役割を果たす血漿タンパクであり、主要なアイソフォームとして、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４（それぞれ、以下「Ｅ２」、「Ｅ３」、「Ｅ４」という。）がある。これらＡｐｏＥ遺伝子多型をコードする遺伝子ε２、ε３、ε４は第１９染色体上に存在する。ＡｐｏＥ遺伝子多型の一つであるＥ４は、アルツハイマー病及び心血管疾患の非常に強い危険因子であることが知られており、現在までに多くの報告がなされ、ほぼ確立した知見になっている（例えば、非特許文献１〜５参照。）。

例えば、ＡｐｏＥのＥ４型を持つ人では、アルツハイマー病の発症率が持たない人に比較して１０倍以上になることが知られており、一見メンデルの法則のような遺伝的家族内集積を示す場合があるほどである。又、高齢者のアルツハイマー型痴呆非罹患群では、ＡｐｏＥのＥ４型を持つ固体の頻度は非常に低いところからも、この多型がこの疾患の大きな危険因子であることが考えられる。

現在では、ＡｐｏＥ遺伝子多型は臨床検査にも応用されており、アルツハイマー型痴呆或いは心血管疾患の危険因子として、個々の患者の診断、治療を行う上で重要な臨床的情報となっている。

従来、ＡｐｏＥ遺伝子多型を判別する実験的手法がいくつか報告されている。例えば、下記のものが挙げられる。非特許文献５には、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism：ＲＦＬＰ）によるタイピング法が記載されている。この方法の基本的な手法は、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction：ＰＣＲ）によって、ゲノタイピングを行なう目的の遺伝子領域であるＡｐｏＥ特定の領域を増幅し、そのＲＦＬＰをポリアクリルアミドゲル電気泳動（Polyacrylamide Electrophoresis）による泳動パターンでゲノタイピングするというものである。この方法は、現在でも多くの研究室等で用いられている方法である。

この方法では、先ず、ヒト・染色体ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）を血液より抽出した後、ＡｐｏＥ遺伝子に特異的なプライマー対を用いてＰＣＲで増幅し、増幅したＤＮＡを制限酵素ＨｈａＩによって断片化する。

図１３は、この方法によるゲノタイピングの概念図である。ＡｐｏＥ遺伝子多型は、それぞれ１つのアミノ酸の置換により生じる。即ち、１１２番目、１５８番目のアミノ酸が、それぞれＥ２ではシステイン、システイン、Ｅ３ではシステイン、アルギニン、Ｅ４ではアルギニン、アルギニンである。制限酵素ＨｈａＩは、塩基配列ＧＣＧＣを認識するため、同図に示すように、ＡｐｏＥのＥ２、Ｅ３、Ｅ４の多型により、制限酵素ＨｈａＩが認識してＤＮＡを切断する部位の組み合わせが異なる。つまり、制限酵素ＨｈａＩは、１１２番目アルギニン（Ｅ４）及び１５８番目のアルギニン（Ｅ３、Ｅ４）をコードするコドンの領域にわたるＧＣＧＣを認識して切断するが、１１２番目のシステイン（Ｅ２、Ｅ３）及び１５８番目のシステイン（Ｅ２）をコードするコドンの領域にわたるＧＴＧＣは切断しない（図中、四角で囲んだＴ又はＣはそれぞれのコドンのはじめの塩基を示す。）。従って、それぞれのＡｐｏＥ遺伝子多型に特異的な長さのＤＮＡ制限酵素切断断片（以下「ＤＮＡ制限断片」という。）が得られるので、各ＡｐｏＥ遺伝子多型の判別が可能となる。

ヒトはアリルを２つ持つため、いずれかのＡｐｏＥ遺伝子多型の２つの組合せを持つことになる。即ち、ＡｐｏＥ遺伝子多型のアリルの組合せのパターン（遺伝子型：ゲノタイプ）には、図１３に示すように、Ｅ２／Ｅ２、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ４／Ｅ４、Ｅ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ４がある。

ホモ接合体について、Ｅ２／Ｅ２では、制限酵素ＨｈａＩでの切断によって８３ｂｐ（塩基対）及び９１ｂｐの２種類の長さのＤＮＡ制限断片が得られるが、Ｅ３／Ｅ３では、３５ｂｐ、４８ｂｐ及び９１ｂｐ、Ｅ４／Ｅ４では１９ｂｐ、３５ｂｐ、４８ｂｐ及び７２ｂｐのＤＮＡ制限断片が得られる。同様に、ヘテロ接合体であるＥ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ４についても、図１３に示すようにそれぞれ異なったＤＮＡ制限断片の組合せが得られる。従って、制限酵素ＨｈａＩによる切断によって得られたそれぞれの長さのＤＮＡ制限断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分離することで、ＡｐｏＥ遺伝子多型のタイピングが可能になる。尚、１９ｂｐ以下の長さのＤＮＡ制限断片はポリアクリルアミドゲル電気泳動では検出されない。以下、この方法の手順を、非特許文献５に基づき更に説明する。

［ＤＮＡ抽出］
先ず、セプラテック社のSepracell-MN gradientsを用いて血液から白血球を取り出す。次いで、白血球を５％のＳＤＳと１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫで５５℃、１６時間処理する。そして、フェノール抽出を行い、その後エタノールでＤＮＡを精製する。

［ＡｐｏＥ領域のＤＮＡ増幅］
上記方法により抽出したＤＮＡから、既に報告されている（非特許文献６）の塩基配列を用いた下記のＡｐｏＥ遺伝子に特異的なプライマー対(pair of primers)を用いて、ＰＣＲによってＡｐｏＥ特定の領域を増幅する。増幅は、Ｔａｑポリメラーゼ（Parkin Elmer Cetus社）を用い、その供給元の指定の条件に従って行う。
ａ）プライマー対
Ｆ４（５’−ＡＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＡＣ−３’）
Ｆ６（５’−ＴＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＧＧＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＡ−３’）
ｂ）ＰＣＲ反応混合物
白血球より抽出したゲノムＤＮＡ：１μｇ
プライマー対：１μＭ
ＤＭＳＯ(dimethyl sulfoxide)：１０％
Ｔａｑポリメラーゼ：０．０２５ｕｎｉｔｓ／μｌ
総反応量：３０μｌ
ｃ）ＰＣＲサイクルの条件
９５℃、５分間（変性）
次いで、以下のサイクルを３０回繰り返す。
９５℃，１分間（変性）
６０℃，１分間（プライマーアニーリング）
７０℃，２分間（伸長反応）
上記ＰＣＲ条件にて増幅されたＤＮＡフラグメントの量は約３００ｎｇである。

［ＲＦＬＰ］
ＲＦＬＰによってＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピングを行なうために、上記ＰＣＲ産物に直接制限酵素ＨｈａＩを５ｎｕｉｔ加え、３７℃で３時間以上反応させて、該制限酵素による切断を行う。非特許文献５には、斯かる方法で、ほとんどのＤＮＡ試料において切断が成功したと記述されている。

［制限酵素切断断片の分離とゲノタイピング］
制限酵素ＨｈａＩによるＤＮＡ制限断片を８％非変性ポリアクリルアミドゲル (polyacrylamaide non-denaturing gel)（厚さ１．５ｍｍ×長さ２５ｃｍ）で３時間電気泳動する。電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドで処理した後、ＤＮＡ制限断片のパターンをＵＶ照射により可視化してゲノタイピングを行う。

非特許文献５に記載される上述の方法がＡｐｏＥ遺伝子多型をタイピングした最初の報告である。その後、現在までに、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピング方法については多数の報告がある。しかし、それらの多くは、基本的に最初の方法の変法である。例えば、非特許文献７、８に記載されるＰＣＲ−ＲＦＬＰによるタイピング法が挙げられる。その他に、例えば、非特許文献９に記載されるような、抗体を用いて変異したタンパク質を同定する方法により間接的にゲノタイピングを行う方法が開発されている。この方法は、現在臨床検査業務で一般的に使用されている。

しかしながら、上記非特許文献５に記載の方法において、制限酵素ＨｈａＩで得られるＤＮＡ制限断片の長さは１００ｂｐ未満と極めて短いため、実験室において通常用いられ、且つ、安価なＤＮＡ分離方法であるアガロースゲル電気泳動法（Agarose Gel Electrophoresis）では、解像度の低さのため分離が不可能であった。つまり、より短いＤＮＡ断片を分離するためには、ゲルをより高濃度にする必要があるが、アガロースゲルでは４％程度が限界であり、この濃度では上記１００ｂｐより短い短鎖ＤＮＡを高解像度にて分離することはできない。そのため、従来、より操作が煩雑で、時間を要するポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いる必要があった。

又、近年、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザ（Agilent 2100 BioAnalyzer：以下「Ａｇｉｌｅｎｔ２１００」という。）（Agilent Technologies社製）の電気泳動用セット、日立マイクロチップ電気泳動解析システムＳＶ１２１０コスモアイ（以下「日立ＳＶ１２１０」という。）（日立ハイテクノロジーズ社製）、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００（或いは３７００）ジェネティックアナライザ（以下「ＡＢＩ３１００」、或いは「ＡＢＩ３７００」という。）（Applied Biosystems社製）等の多くのＤＮＡ分離方法が開発されている。これらのＤＮＡ分離方法は、基本的には電気泳動法を利用しているが、迅速に大量のサンプルを（順次に若しくは同時に）処理することができ、又、分析の自動化に対応可能である。

しかし、本発明者らの検討によれば、これら近年開発された種々のＤＮＡ分離方法を用いる場合にも、上記非特許文献５に記載されるように制限酵素ＨｈａＩで切断したＤＮＡ制限断片では、正確なゲノタイピングを行うには、満足いく解像度を得ることができなかった。

更に、上述のように、ＡｐｏＥ遺伝子多型の臨床検査業務では、抗体法を用いた生化学的な解析手法（非特許文献９）が一般的に使用されている。しかしながら、斯かる方法は、遺伝子を直接タイピングする方法ではなく、タンパク質の種類を判別する手法を用いているため、擬陽性（false-positive）が多く正確さに欠けるものである。更に、この方法は、実験に用いる試料の作成に時間がかかり、簡便さや、経済性の面で問題がある。

このように、より長鎖のＤＮＡ制限断片を得て、より高解像度で正確にＡｐｏＥ遺伝子多型をゲノタイピングをし得るＡｐｏＥ遺伝子多型の検出方法、それに用いる試薬に対する要求がある。又、自動化が可能で迅速、且つ、簡便に大量のサンプルについてＡｐｏＥ遺伝子多型をゲノタイピングし得ることも求められている。

又、非特許文献１０は、ゲノムＤＮＡから下記のプライマー対、
Ｆ５’−ＴＣＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＧＣＡ
Ｒ５’−ＧＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＡＣＴＧＣＣＡ
を用いてＰＣＲにて２１８ｂｐのＡｐｏＥ遺伝子特異的な領域を増幅し、２種類の制限酵素ＡｆｌＩＩＩ、ＨａｅＩＩを用いて断片化する。そして、このＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離して、ＤＮＡ制限断片の長さからＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピングを行うことを開示する。この方法によれば、それぞれＥ３、Ｅ２、Ｅ４に特異的な１４５ｂｐ、１６８ｂｐ、１９５ｂｐのＤＮＡ制限断片が得られる。しかしながら、本発明者の検討によれば、詳しくは後述するように、斯かる方法は、機械化、製品化を考慮すると、正確性、信頼性の点で満足ゆくものではなかった。
Corder E.H., Saunders A.M., Strittmatter W.J., Schmechel D.E., Gaskell P.C., Small G.W., Roses A.D., Haines J.L., Pericak-Vance M.A. Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer's disease in late onset families. Science 1993 Aug 13;261(5123):921-3 Ueki A., Kawano M., Namba Y., Kawakami M., Ikeda K. A high frequency of apolipoprotein E4 isoprotein in Japanese patients with late-onset nonfamilial Alzheimer's disease. Neurosci Lett 1993 Dec 12;163(2):166-8 Saunders A. M., Strittmatter W. J., Schmechel D., St. George-Hyslop P. H., Pericak-Vance M. A., Joo S. H., Rosi B. L., Gusella J. F., Crapper-MacLachlan D. R., Alberts M. J., Hulette C., Crain B., Goldgaber D., Roses A. D. Association of apolipoprotein E allele E4 with late-onset familial and sporadic Alzheimer's disease. Neurology 1993;43:1467-1472. Eichner J.E., Dunn S.T., Perveen G., Thompson D.M., Stewart K.E., Stroehla B.C. Apolipoprotein E polymorphism and cardiovascular disease: a HuGE review. Am J Epidemiol 2002 Mar 15;155(6):487-95 James E. H. and Daniel T. V. Restriction of human apolipoprotein E by gene amplification and cleavage with HhaＩ. J. Lipid. Res .1990; 31: 545-548. Emi M., L. L. Wu ,M. A. Robertson, R. L. Myers,R. A. Hegele, R. R. Williams,R. White, and J-M. Lalouel. Genotyping and sequence analysis of apolipoprotein E isoforms. Genomics. 1988; 3: 373-379. Murphy G. M. Jr., Taylor J., Kraemer H. C., et al. No association between apolipoprotein E ε４ allele and rate of decline in Alzheimer's disease. Am. J. Psychiatry. 1997; 154: 603-608. Nakagawa Y. and Ogomori K. A Simple Detection Method for Apolipoprotein E ε4 Allele. Int. Med. J. 2000; 7(3): 201-202 Vicente G., Concepcio F., Isabel H., et al. An Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Method to Measure Human Apolipoprotein E Levels Using Commercially Available Reagents. Anal. Biochem. 1994; 223: 212-217 Zivelin, A., Rosenberg, N., Peretz, H., Amit, Y., Kornbrot, N., and Seligsohn, U., Improved Method for Genotyping Apolipoprotein E Polymorphisms by a PCR-Based Assay Simultaneously Utilizing Two Distinct Restriction Enzymes. Clinical Chemistry, 43, No9, 1657-1659, 1997

従って、本発明の目的は、正確、迅速、且つ、簡便にＡｐｏＥ遺伝子多型を検出し、ゲノタイプを判定することを可能とするＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法及び試薬を提供することである。

本発明の他の目的は、安価、且つ、簡便なＤＮＡ分離方法を用いてＡｐｏＥ遺伝子多型を検出し、ゲノタイプを判定することを可能とするＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法及び試薬を提供することである。

本発明の他の目的は、様々なＤＮＡ分離方法の利用を可能とし、高速、且つ、大量処理化を可能とするＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法及び試薬を提供することである。

本発明の他の目的は、正確性、信頼性の向上したＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法及び試薬を提供することである。

本発明の他の目的は、機械化、製品化に際しての正確性、信頼性を更に向上させることができるＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法及び試薬を提供することである。

本発明の更に他の目的は、アルツハイマー病、心血管疾患など、ＡｐｏＥ遺伝子多型が関連する疾患の診断、治療にとって有用な情報となるＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプの判別を正確、且つ、迅速に行うことのできるＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法及び試薬を提供することである。

上記目的は本発明に係るアポリポタンパク遺伝子多型検出方法、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法及び試薬にて達成される。要約すれば、第１の本発明は、アポリポタンパクＥ遺伝子に特異的なプライマー対を用いてＤＮＡを増幅する段階；増幅したＤＮＡを、アポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１１２の一塩基多型部位を認識配列に含む第１の制限酵素と、アポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１５８の一塩基多型部位を認識配列に含む第２の制限酵素と、を用いて、前記コドン１１２の一塩基多型部位を含む認識配列での第１の切断位置及び前記コドン１５８の一塩基多型部位を含む認識配列での第２の切断位置で切断する段階；切断したＤＮＡ断片を分離する段階；分離されたＤＮＡ断片を検出する段階；を含み、前記プライマー対及び前記第１、第２の制限酵素は、それぞれのアポリポタンパクＥ遺伝子多型に特異的なそれぞれ１００ｂｐ以上のＤＮＡ断片を生成し得るように選択され、前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記第１の切断位置より、６０ｂｐ以上、１３６ｂｐ以下の上流の位置に５’末端が設定され、前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第２の切断位置より７０ｂｐ以上の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とするアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法である。本発明の一実施態様によると、本発明の一実施態様によると、前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第２の切断位置より２０２ｂｐ以下の下流の位置に５’末端が設定される。

第２の本発明によると、アポリポタンパクＥ遺伝子に特異的なプライマー対を用いてＤＮＡを増幅する段階；増幅したＤＮＡを２種類の制限酵素を用いてアポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１１２の一塩基多型部位を含む認識配列での第１の切断位置及びアポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１５８の一塩基多型部位を含む認識配列での第２の切断位置で切断する段階；切断したＤＮＡ断片を分離する段階；分離されたＤＮＡ断片を検出する段階；を含み、前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記第１の切断位置より、６０ｂｐ以上、１３６ｂｐ以下の上流の位置に５’末端が設定され、前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第２の切断位置より７０ｂｐ以上の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とするアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法が提供される。本発明の一実施態様によると、前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第２の切断位置より２０２ｂｐ以下の下流の位置に５’末端が設定される。

第３の本発明によると、上記本発明のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法により検出したＤＮＡ断片長の存否の組み合わせからアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプを判定することを特徴とするアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法が提供される。

第３の本発明の一実施態様によると、前記第１の切断位置より上流の配列Ａのみを含むＤＮＡ断片を断片Ａ（一実施態様では１０６ｂｐ）、前記第２の切断位置より下流の配列Ｂのみを含むＤＮＡ断片を断片Ｂ（一実施態様では３５ｂｐ、１８ｂｐ、１３ｂｐ、他の実施態様では８０ｂｐ、１８ｂｐ、１３ｂｐ）、前記第１の切断位置と前記第２の切断位置との間の配列Ｃのみを含むＤＮＡ断片を断片Ｃ（一実施態様では１４５ｂｐ）、前記配列Ａ及びＣを含むＤＮＡ断片を断片Ｄ（一実施態様では２５１ｂｐ）、前記配列Ｂ及びＣを含むＤＮＡ断片を断片Ｅ（一実施態様では１８０ｂｐ）としたとき、断片Ｃ、断片Ｄ及び断片Ｅの存否をアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプの判定に用い、（ａ）断片Ｅのみの存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ２を判定し；（ｂ）断片Ｃのみの存在によりゲノタイプＥ３／Ｅ３を判定し；（ｃ）断片Ｄのみの存在によりゲノタイプＥ４／Ｅ４を判定し；（ｄ）断片Ｅ及び断片Ｃのみの存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ３を判定し；（ｅ）断片Ｄ及び断片Ｅのみの存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ４を判定し；（ｆ）断片Ｄ及び断片Ｃのみの存在によりゲノタイプＥ３／Ｅ４を判定する。

第３の本発明の他の実施態様によると、断片Ａ、断片Ｃ、断片Ｄ及び断片Ｅの存否をアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプの判定に用い、（ａ）断片Ｅ及び断片Ａのみの存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ２を判定し；（ｂ）断片Ｃ及び断片Ａのみの存在によりゲノタイプＥ３／Ｅ３を判定し；（ｃ）断片Ｄの存在及び断片Ａの非存在によりゲノタイプＥ４／Ｅ４を判定し；（ｄ）断片Ｅ、断片Ｃ及び断片Ａのみの存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ３を判定し；（ｅ）断片Ｄ、断片Ｅ及び断片Ａのみの存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ４を判定し；（ｆ）断片Ｄ、断片Ｃ及び断片Ａのみの存在によりゲノタイプＥ３／Ｅ４を判定する。

第３の本発明の他の実施態様では、前記配列Ａ、配列Ｂ及び配列Ｃを含むヘテロ二本鎖（一実施態様では２８６ｂｐ）の存否をアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプの判定に用い、該ヘテロ二本鎖の存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ４を判定する。又、他の実施態様では、更に、アポリポタンパクＥ遺伝子多型Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成する断片Ｂの存在により、前記切断段階における有効な切断反応の存在を判断し、該有効な切断の存在を判断した場合に、ＤＮＡ断片長の存否の組み合わせからアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプを判定する。

第３の本発明の他の実施態様では、更に、アポリポタンパクＥ遺伝子多型Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成する断片Ｂ（一実施態様では３５ｂｐ、１８ｂｐ若しくは１３ｂｐ、他の実施態様では８０ｂｐ）を定量した結果に基づいて、断片Ａ、断片Ｃ、断片Ｄ及び／又は断片Ｅの存否を判断する。他の実施態様では、更に、前記（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）の各場合の判定に際し、アポリポタンパクＥ遺伝子多型Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成する断片Ｂを定量した結果に基づいて求めたヘテロ二本鎖の生成割合に基づいて、断片Ａ、断片Ｃ、断片Ｄ及び／又は断片Ｅの存否を判断する。

第３の本発明の他の実施態様によると、前記第１の切断位置より上流の配列Ａのみを含むＤＮＡ断片を断片Ａとしたとき、断片Ａの存否をアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプの判定に用い、断片Ａの非存在によりゲノタイプＥ４／Ｅ４を判定する。

第４の本発明によると、アポリポタンパクＥ遺伝子の制限酵素切断断片を検出することでアポリポタンパクＥ遺伝子多型を検出するために用い得る、アポリポタンパクＥ遺伝子増幅用のプライマー対を備えるアポリポタンパクＥ遺伝子多型の検出試薬であって、前記プライマー対のうち上流側プライマーは、アポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１１２の一塩基多型部位を含む認識配列での第１の切断位置より、６０ｂｐ以上、１３６ｂｐ以下の上流の位置に５’末端が設定され、前記プライマー対のうち下流側プライマーは、アポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１５８の一塩基多型部位を含む認識配列での第２の切断位置より７０ｂｐ以上の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とするアポリポタンパクＥ遺伝子多型の検出試薬が提供される。本発明の一実施態様によると、前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第２の切断位置より２０２ｂｐ下流の位置に５’末端が設定される。

尚、本明細書において、遺伝子配列における位置は、５’末端から３’末端方向に一本鎖でみていうものであり、その上流とは該一本鎖でみたときの５’末端側、下流とは３’末端側をいう。

又、ＡｐｏＥ遺伝子について、いずれかの遺伝子多型において制限酵素による切断位置（或いは認識配列）がある場合、その位置に相当する他の遺伝子多型における配列上の位置については、切断されない（或いは認識されない）場合についても切断位置（或いは認識配列）の語を用いて説明する。

本発明によれば、正確、迅速、且つ、簡便にＡｐｏＥ遺伝子多型を検出することができる。又、本発明によれば、安価なＤＮＡ分離方法を用いてＡｐｏＥ遺伝子多型を検出することが可能となり、一方で、様々なＤＮＡ分離方法の利用を可能とし、高速、且つ、大量化が可能となる。又、本発明によれば、ＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法及び試薬の正確性、信頼性を向上させることができる。又、機械化、製品化に際しての正確性、信頼性を更に向上させることができる。更に、本発明によれば、アルツハイマー病、血管疾患等、ＡｐｏＥ遺伝子多型が関連する疾患の診断、治療にとって有用な情報となるＡｐｏＥ遺伝子のタイピングを正確、且つ、迅速に行うことができる。

以下、本発明に係るアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法及び試薬を図面に則して更に詳しく説明する。

本発明に係るアポリポタンパクＥ（ＡｐｏＥ）遺伝子多型検出方法は、詳しくは後述するように、一実施態様では、ＡｐｏＥ遺伝子に特異的なプライマー対を用いてＰＣＲにより目的のＤＮＡ領域を増幅し、増幅されたＤＮＡを所定の制限酵素を用いて切断し、切断したＤＮＡ制限断片を分離し、分離されたＤＮＡ断片を検出する各段階を含む。

ＡｐｏＥ遺伝子に特異的なプライマー対は、ゲノムＤＮＡをテンプレート（鋳型）として、ＡｐｏＥ遺伝子の２つの変異箇所を含む、即ち、２箇所の一塩基多型部位を挟んだ所定領域（以下「多型領域」という。）のＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅するように設計されたオリゴヌクレオチド対（プライマー対）である。プライマー対の一方は、５’末端から３’末端方向に一本鎖でみて、上記ＡｐｏＥ遺伝子の多型領域の上流側にハイブリダイズ可能な適当な長さのオリゴヌクレオチドで、他方は同多型領域の下流側の相補鎖にハイブリダイズ可能な適当な長さのオリゴヌクレオチドである。これらプライマーは、通常通り、２つのプライマーのＴｍが同程度となり、又増幅効率が良好であるように設計するのが好ましい。

特に、本発明においては、後述の所定の制限酵素による切断で、典型的にはアガロースゲル電気泳動によって十分な解像度にて分離可能な十分な長さのＤＮＡ制限断片が得られるように設計される。好ましい一実施態様では、下記の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから成るプライマーの対を用いる。
ＡＥ−Ｆ１プライマー（配列番号１）：
５’−ＡＡＴＣＧＧＡＡＣＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡＡＣＴＧ−３’
ＡＥ−Ｒ１プライマー（配列番号２）：
５’−ＧＣＣＣＧＣＡＣＧＣＧＧＣＣＣＴＧＴＴＣ−３’

上記オリゴヌクレオチド配列のプライマー対によれば、ＡｐｏＥ遺伝子多型の２箇所の一塩基多型部位、即ち、ＡｐｏＥの１１２番目のアミノ酸をコードするＡｐｏＥ遺伝子領域（以下「コドン１１２」という。）、ＡｐｏＥの１５８番目のアミノ酸をコードするＡｐｏＥ遺伝子領域（以下「コドン１５８」という。）の一塩基多型部位を含み、７５番目〜１９１番目のアミノ酸をコードするコドン領域にわたる３５２ｂｐのオリゴヌクレオチド配列をＰＣＲ法によって増幅することができる。斯かるオリゴヌクレオチド配列の各プライマーは、斯界にて周知のＤＮＡ合成方法、装置を用いて得ることができる。

増幅したＤＮＡ産物を切断する所定の制限酵素は、ＡｐｏＥ遺伝子多型間の遺伝子変異で認識部位が出現又は消失するもの、即ち、いずれかのＡｐｏＥ遺伝子多型の一塩基多型部位が認識配列内に存在するものであって、切断後のＤＮＡ制限断片が典型的にはアガロースゲル電気泳動法によって十分な解像度にて分離可能な長さを有し得るものである。好ましい一実施態様では、増幅したＤＮＡ産物を切断する２種類の制限酵素の組合せを用いる。又、好ましくは、上記プライマー対を用いて増幅されたＤＮＡに関し、２種類の制限酵素のいずれか一方の制限酵素のみによる切断、及び両方の制限酵素による切断によって、いずれかのアポリポタンパクＥ遺伝子多型に帰属させ得る１００ｂｐ以上のＤＮＡ断片が生成する２種類の制限酵素の組合せを用いる。このような本発明に従う制限酵素の組合せは、好ましい一実施態様では、ＡｆｌＩＩＩとＨａｅＩＩである。

図１に示すように、制限酵素ＡｆｌＩＩＩは、塩基配列ＡＣＲＹＧＴ（ＲはＡ又はＧ，ＹはＣ又はＴ）を認識する。又、制限酵素ＨａｅＩＩは、塩基配列ＲＧＣＧＣＹ（ＲはＡ又はＧ，ＹはＣ又はＴ）を認識する。即ち、制限酵素ＡｆｌＩＩＩは、１１２番目のシステイン（Ｅ２、Ｅ３）をコードするコドンの領域にわたるＡＣＧＴＧＴを認識して切断するが、１１２番目のアルギニン（Ｅ４）をコードするコドンの領域にわたるＡＣＧＴＧＣは切断しない。又、制限酵素ＨａｅＩＩは、１５８番目のアルギニン（Ｅ３、Ｅ４）をコードするコドンの領域にわたるＡＧＣＧＣＣを認識して切断するが、１５８番目のシステイン（Ｅ２）をコードするコドンの領域にわたるＡＧＴＧＣＣは切断しない（図中、四角で囲んだＴ又はＣはそれぞれのコドンのはじめの塩基を示す。）。

これらの制限酵素で、上記プライマー対を用いて増幅されたＤＮＡを断片化すると、図１に示すように、ホモ接合体について、Ｅ２／Ｅ２では１０６ｂｐ及び１８０ｂｐ、Ｅ３／Ｅ３では１０６ｂｐ及び１４５ｂｐ、Ｅ４／Ｅ４では２５１ｂｐのＤＮＡ制限断片が得られる。又、ヘテロ接合体であるＥ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ４についても、図１に示すようにそれぞれ異なったＤＮＡ制限断片の組合せが得られる。

このように、本発明の好ましい一実施態様では、上記プライマー対（配列番号１、２）及び２種類の制限酵素の組合せ（ＡｆｌＩＩＩ、ＨａｅＩＩ）を用いることにより、非特許文献５において制限酵素ＨｈａＩによる切断で得られたものよりも長いＤＮＡ制限断片が出現する。

図１３に示すように、従来用いられていた制限酵素ＨｈａＩは、コドン１１２、１５８の一塩基多型部位を含む切断位置以外（それぞれの上流側）に他の多くの切断位置を持つ。これに対して、図１に示すように、本発明にて好適に使用されるＡｆｌＩＩＩは、コドン１１２の一塩基多型部位を含む切断位置より上流及び下流に他の切断位置を持たず、又ＨａｅＩＩは、コドン１５８の一塩基多型部位を含む切断位置より上流に他の切断位置を持たない。又、ＤＮＡ制限断片間の鎖長差は、本発明に従う上記プライマー対及び２種類の制限酵素の組合せを用いると、従来の制限酵素ＨｈａＩを用いる場合よりも大きくなり、ＤＮＡ制限断片の分離を容易ならしめている。

本発明にて用い得る制限酵素及びプライマー対の選択について更に説明する。

［制限酵素］
本発明にて用いることが可能である制限酵素は下記の条件を満たす。

（１）第１の制限酵素は、ＡｐｏＥ遺伝子のコドン１１２の一塩基配列多型部位を含む認識配列をもち、切断されるか切断されないかが該一塩基多型によって決定するもの。認識配列について上記の条件を満たせば、切断される部位はコドン１１２から離れていても良い。

（２）第２の制限酵素は、ＡｐｏＥ遺伝子のコドン１５８の一塩基配列多型部位を含む認識配列をもち、切断されるか切断されないかが、該一塩基多型によって決定するもの。認識配列について上記の条件を満たせば、切断される部位はコドン１５８から離れていても良い。

（３）ＡｐｏＥ遺伝子の多型領域（ＡｐｏＥ遺伝子の２つの一塩基多型部位を含む領域）を含む増幅された所定のＤＮＡ断片を上記第１、第２の制限酵素を用いて切断することにより得られるＤＮＡ断片が、ＡｐｏＥ遺伝子多型の判定に利用可能となるもの、即ち、それぞれのＡｐｏＥ遺伝子多型を特定可能な、特異的な少なくとも１つのＤＮＡ断片若しくは少なくとも１つのＤＮＡ断片の組合せ（或いは電気泳動によって分離することによって得られる流出パターン）が得られるもの。

（４）それぞれのＡｐｏＥ遺伝子多型が特定可能な、少なくとも１つの特異的なＤＮＡ断片若しくは少なくとも１つの特異的なＤＮＡ断片の組合せを構成するＤＮＡ断片が、実質的に１００ｂｐ以上になるもの。尚、ＤＮＡ断片長は、ＡｐｏＥ遺伝子の多型領域（ＡｐｏＥ遺伝子の２つの一塩基多型部位を含む領域）に用いられる所定のプライマーとの関係で許容される最長長さ以下となる。

（５）更に、第１、第２の制限酵素は、認識配列或いは切断部位が、ＡｐｏＥ遺伝子のコドン１１２の一塩基多型部位を含む認識配列とコドン１５８の一塩基多型部位を含む認識配列との間には存在しないものであることが望ましい。

上述の本発明の好ましい一実施態様における２種類の制限酵素、ＡｆｌＩＩＩ及びＨａｅＩＩは、上記条件（１）〜（４）の条件を満たす制限酵素の組み合わせである。これに対して、従来の方法における制限酵素ＨｈａＩは、上記条件（４）を満たさず、更に上記条件（５）をも満たさない。

尚、第１、第２の制限酵素は、上記条件（１）〜（４）を満たせば同一のものであっても２種類以上であってもよい。

［プライマー］
ＡｐｏＥ遺伝子多型の判定に必要なＤＮＡ断片長は、使用する第１、第２の制限酵素によって変化するため、ＡｐｏＥの多型領域の増幅に必要なプライマー対の設計は、切断されたＤＮＡ断片を分離する際に、いずれかのＡｐｏＥ遺伝子多型に特異的なＤＮＡ断片のパターンが形成されるように行われなければならない。以下、第１、第２の制限酵素として、上記制限酵素の組み合わせ、つまりＡｆｌＩＩＩ及びＨａｅＩＩの２種類を使用する場合（以下「本実施例」という。）に即して説明する。

（上流側プライマー）
ここで、図２、図３、図５、図７を参照して、コドン１１２の一塩基多型部位を含む認識配列での切断位置（以下「第１の切断位置」という。）より上流の配列（配列Ａ）のみを含むＤＮＡ断片を「ＤＮＡ断片Ａ」、コドン１５８の一塩基多型部位を含む認識配列での切断位置（以下「第２の切断位置」という。）より下流の配列（配列Ｂ）のみを含むＤＮＡ断片を「ＤＮＡ断片Ｂ」、第１の切断位置と第２の切断位置との間の配列（配列Ｃ）のみを含むＤＮＡ断片を「ＤＮＡ断片Ｃ」、配列Ａ及び配列Ｃを含むＤＮＡ断片を「ＤＮＡ断片Ｄ」、前記配列Ｂ及び配列Ｃを含むＤＮＡ断片を「ＤＮＡ断片Ｅ」とする。

この場合、本発明によれば、上流側プライマーは、図２中領域ａで示す如く、第１の切断位置より、６０ｂｐ以上、１３６ｂｐ以下の上流の位置（即ち、第１の切断位置より６０〜１３６ｂｐ上流の位置）に５’末端を設定する。このような上流側プライマーは、ＡｐｏＥ遺伝子に特異的であり、且つ、Ｔｍが下流側のプライマーと同程度ものであればよい。これに限定されるものではないが、プライマーの長さに関しては、プライマーのＰＣＲの特性、他のゲノムの領域における特異性を考慮して、２０〜２５ｍｅｒが好適である。

ＤＮＡ断片Ａは、Ｅ２とＥ３では生成するがＥ４では生成しない。そして、Ｅ４では断片長が（Ａ＋１４５）ｂｐのＤＮＡ断片Ｄが特異的に生成される。つまり、上流側プライマーの５’末端を第１の切断位置より６０ｂｐ以上の上流の位置に設定することで、ＤＮＡ断片Ｄは、ＤＮＡ断片Ｃ（１４５ｂｐ）と分離可能であると共に、ＤＮＡ断片Ｅとも良好に分離可能であり、Ｅ４に特異的なものとなる。又、斯かる設定により、第１の切断位置が制限酵素で切断されなくなる虞などを低減し、より正確性、信頼性を高めるためることができる。又、上流側プライマーの５’末端を第１の切断位置の上流１３６ｂｐ以下の位置に設定することで、ＤＮＡ断片Ａと、ＤＮＡ断片Ｃとを良好に分離することができる。但し、極めて良好にＤＮＡ断片ＡとＤＮＡ断片Ｃとを分離するには、第１の切断位置より１２０ｂｐ以下の上流の位置（即ち、第１の切断位置より６０〜１２０ｂｐ上流の位置）に上流側プライマーの５’末端を設定するのが好ましい。この位置については更に詳しく後述する。

即ち、この条件によって、少なくともＥ４の判定が可能となる。

本実施例における配列番号１の上流側のプライマーは、第１の切断位置から１０６ｂｐ上流にプライマーの５’末端を設定している。この場合、Ｅ２及びＥ３において生成されるがＥ４では生成されないＤＮＡ断片Ａの長さは１０６ｂｐ、又Ｅ４に特異的なＤＮＡ断片Ｄは２５１ｂｐとなる。

詳しくは後述するように、下流側プライマーの選択範囲によって制限酵素切断により生成されるＤＮＡ断片長が異なるが、図３及び図５に示すように下流側プライマーを選択する場合においては、ＤＮＡ断片Ｄ、更にＤＮＡ断片Ａは、他のＤＮＡ断片の長さと重なることがなく、該上流側プライマーはＡｐｏＥ遺伝子多型の判定に適切である。即ち、この場合ＤＮＡ断片ＤをＡｐｏＥ遺伝子多型の判別の根拠として利用し得るのみならず、ＤＮＡ断片ＡをもＡｐｏＥ遺伝子多型の判別の根拠の一つとして利用することができる。この点については、下流側プライマーとの関連で更に詳しく後述する。

一方、図７に示すように下流側プライマーを選択する場合においては、他のＤＮＡ断片（図７中Ｂ３）の鎖長がＤＮＡ断片Ａの鎖長とほぼ同等となり重複する可能性があり、この場合は、ＤＮＡ断片ＡはＡｐｏＥ遺伝子多型の判別には利用することができない。しかし、（Ａ＋１４５）ｂｐのＤＮＡ断片ＤがＥ４に特異的であるため、下流側プライマーの設計に拘わらず、Ｅ４の検出は可能、且つ、容易である。

（下流側プライマー）
下流側プライマーは、図２中領域ｂで示す如く、第２の切断位置より、３０ｂｐ以上、２０２ｂｐ以下の下流の位置（即ち、第２の切断位置より３０〜２０２ｂｐ下流の位置）に５’末端を設定する。このような下流側プライマーは、ＡｐｏＥ遺伝子に特異的であり、Ｔｍが上流側のプライマーと同程度ものであればよい。これに限定されるものではないが、プライマーの長さに関しては、プライマーのＰＣＲの特性、他のゲノムの領域における特異性を考慮して、２０〜２５ｍｅｒが好適である。

下流側プライマーの５’末端を第２の切断位置より３０ｂｐ以上下流の位置に設定することで、ＤＮＡ断片Ｃと、ＤＮＡ断片Ｅとを良好に分離することができる。又、下流側プライマーの５’末端を第２の切断位置の下流２０２ｂｐ以下の下流の位置（下流２０２ｂｐより上流側）とすることにより、以下更に詳しく説明するように下流側プライマーの選択範囲によっては生成される最下流側のＤＮＡ断片Ｂ３（図７）と、ＤＮＡ断片Ｃとを分離することができる。これにより、ＤＮＡ断片Ｃ、ＤＮＡ断片Ｅは、それぞれＥ３、Ｅ２に特異的なものとなる。但し、極めて良好にＤＮＡ断片Ｂ３をＤＮＡ断片Ｃと分離するには、第２の切断位置より１８５ｂｐ以下の下流の位置（即ち、第２の切断位置より３０〜１８５ｂｐ下流の位置）に下流側プライマーの５’末端を設定するのが好ましい。この位置については更に詳しく後述する。

増幅されたＤＮＡ断片の切断後に生成される断片長のパターンを、下流側プライマーの選択範囲ｂを更に図２に示す如くｂ１、ｂ２、ｂ３の３つの領域に分けて考えることとする。ここで、ｂ１とｂ２との境界は第２の切断位置から下流側３５ｂｐの位置、ｂ２とｂ３との境界は第２の切断位置から下流側６６ｂｐの位置とする。

（１）領域ｂ１から選択する場合（図３、図４）：
Ｅ２（第１の切断位置が切断され、第２の切断位置が切断されない）に特異的なＤＮＡ断片Ｅの長さは（Ｂ１＋１４５）ｂｐ＝１７５〜１８０ｂｐのいずれかとなる。最下流側のＤＮＡ断片Ｂ１は、Ｅ３及びＥ４（第２の切断位置が切断される）の場合に生成され、その長さは３０ｂｐ〜３５ｂｐのいずれかとなる。これらの断片は、長さが５０ｂｐ以下となり短いため、ＤＮＡ分離法によっては同定不可能となる。Ｅ３（第１の切断位置及び第２の切断位置でともに切断される）に特異的なＤＮＡ断片Ｃの長さは１４５ｂｐとなる。又、Ｅ４（第１の切断位置で切断されず、第２の切断位置で切断される）に特異的なＤＮＡ断片Ｄの長さは（Ａ＋１４５）ｂｐとなる。このように、各ＡｐｏＥ遺伝子多型に特異的なＤＮＡ断片Ｃ、Ｄ、Ｅの長さは互いに重なることはなく、又ＤＮＡ断片Ｂ１の長さも、各ＡｐｏＥ遺伝子多型に特異的なＤＮＡ断片のいずれにも重ならないので、ＡｐｏＥ遺伝子多型の判別は容易である。

（２）領域ｂ２から選択する場合（図５、図６）：
この場合、Ｅ２に特異的なＤＮＡ断片Ｅの長さは１８０ｂｐとなる。Ｅ３及びＥ４の場合に３５ｂｐのＤＮＡ断片が生成される。Ｅ３に特異的なＤＮＡ断片Ｃの長さは１４５ｂｐとなり、Ｅ４に特異的なＤＮＡ断片Ｄの長さは（Ａ＋１４５）ｂｐとなる。又、いずれのＡｐｏＥ遺伝子多型においても、ＤＮＡ断片Ｂ２が生成されるが、その長さは最長でも２０ｂｐ以下である（長さが１８ｂｐ以下の長さのＤＮＡ断片、或いは長さが１８ｂｐの断片及び長さが１３ｂｐ以下の断片）。このように、各ＡｐｏＥ遺伝子多型に特異的なＤＮＡ断片Ｃ、Ｄ、Ｅの長さは互いに重なることはなく、又３５ｂｐのＤＮＡ断片及びＤＮＡ断片Ｂ２の長さも、各ＡｐｏＥ遺伝子多型に特異的なＤＮＡ断片のいずれにも重ならないので、ＡｐｏＥ遺伝子多型の判別は可能である。尚、上述のように、３５ｂｐのＤＮＡ断片及びＤＮＡ断片Ｂ２は、長さが短いため分離法によっては同定不可能となる。

（３）領域ｂ３から選択する場合（図７、図８）：
この場合、Ｅ２に特異的なＤＮＡ断片Ｅの長さは１８０ｂｐとなる。Ｅ３及びＥ４の場合に３５ｂｐのＤＮＡ断片が生成される。Ｅ３に特異的なＤＮＡ断片Ｃの長さは１４５ｂｐとなり、Ｅ４に特異的なＤＮＡ断片Ｄの長さは（Ａ＋１４５）ｂｐとなる。又、いずれのＡｐｏＥ遺伝子多型においても、１８ｂｐ、１３ｂｐのＤＮＡ断片が生成される。３５ｂｐのＤＮＡ断片及び１８ｂｐ、１３ｂｐのＤＮＡ断片は、長さが短いためＤＮＡ分離法によっては同定不可能となる。更に、いずれのＡｐｏＥ遺伝子多型においても最下流側ＤＮＡ断片Ｂ３が生成され、その長さは最長でも１３６ｂｐ以下（好ましくは１２０ｂｐ以下）となる。ここで、（ａ）ＤＮＡ断片Ｂ３がＤＮＡ断片Ａと分離可能な場合は、ＤＮＡ断片ＡがＥ２及びＥ３で生成され、Ｅ４では生成されないので、ＤＮＡ断片Ａは、ＡｐｏＥ遺伝子多型の判別の根拠の一つとして利用可能となる。一方、（ｂ）ＤＮＡ断片Ｂ３とＤＮＡ断片Ａとが分離可能でない場合、ＤＮＡ断片Ａの有無の情報はＡｐｏＥ遺伝子多型の判定に利用できないが、１８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｅ）、１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｃ）、（Ａ＋１４５）ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｄ）のＤＮＡ断片が、それぞれＥ２、Ｅ３、Ｅ４に特異的であるので、これらの有無のみでもＡｐｏＥ遺伝子多型の判別は可能、且つ、容易である。

本実施例における配列番号２の下流側プライマーでは、第２の切断位置から１０１ｂｐ下流にプライマーの５’末端が設定されており、図７に示すように、最下流側のＤＮＡ断片Ｂ３の長さは３５ｂｐになる。この断片は、ＡｐｏＥ遺伝子多型の判定に必要なＤＮＡ断片の長さ（１８０ｂｐ、１４５ｂｐ、（Ａ＋１４５）ｂｐ）と重なることがなく、該下流側プライマーは、ＡｐｏＥ遺伝子多型の判定に適切である。

本発明によれば、ＤＮＡ断片ＡをもＡｐｏＥ遺伝子多型の判別の根拠の一つとして利用し、更には、ＤＮＡ断片Ｂ、より詳細にはＥ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｂの存否及び／又はその量を利用することによって、更にＡｐｏＥ遺伝子多型の検出、ゲノタイピングの正確性、信頼性を高めることができる。以下、この点について説明する。

先ず、本発明によれば、ＤＮＡ断片ＡをもＡｐｏＥ遺伝子多型の判別の根拠の一つとして利用することができる。つまり、ＤＮＡ断片ＡはＥ２及びＥ３において生成されるが、Ｅ４では生成されない。このため、ＤＮＡ断片Ａの存在は、それぞれＤＮＡ断片Ｅ、ＤＮＡ断片Ｃの存在と共にＡｐｏＥ遺伝子多型の判別の根拠として利用して、Ｅ２又はＥ３の存在を示す。一方、ＤＮＡ断片Ａの非存在は、Ｅ４を示す。このように、ＡｐｏＥ遺伝子多型の判定の根拠を増すことにより、判定の正確性、信頼性を向上させることができる。

上述のように、本発明では、上流側プライマーは、第１の切断位置より６０ｂｐ以上の上流の位置に５’末端を設定する。即ち、６０ｂｐ以上の上流の位置に設定することで、ＤＮＡ断片Ｄが、ＤＮＡ断片Ｃ、ＤＮＡ断片Ｅと極めて良好に分離可能であると共に、ＤＮＡ断片Ａを、前述のＡｇｉｌｅｎｔ２１００、日立ＳＶ１２１０、ＡＢＩ３１００（或いはＡＢＩ３７００）等の高解像度のＤＮＡ分離方法で良好に分離、検出することができる。

この観点からは、上流側プライマーの５’末端の位置は、第１の切断位置に対し７０ｂｐ以上、８０ｂｐ以上と、より上流に設定するのがよく、より好ましくは９０ｂｐ以上上流の位置に設定する。更に好ましくは、１００ｂｐ以上上流の位置に５’末端の位置を設定することで、例えば従来一般に用いられているアガロースゲル電気泳動によっても断片Ａを良好に分離し、検出することができ、更に広範囲のＤＮＡ分離方法においてＤＮＡ断片ＡをもＡｐｏＥ遺伝子多型の判別の根拠の一つとして利用することができる。更に、後述するように、ＤＮＡ断片Ｂの存否及び／又は量をＡｐｏＥ遺伝子多型の検出、ゲノタイピングに利用する場合、ＤＮＡ断片ＡとＤＮＡ断片Ｂとの分離性を良好にする観点からも、上流側プライマーの５’末端は、第１の切断位置に対しより上流に設定することが好ましい。

一方、上述の如く、極めて良好にＤＮＡ断片ＡとＤＮＡ断片Ｃとを分離するには、第１の切断位置より１２０ｂｐ以下の上流の位置に上流側プライマーの５’末端を設定するのが好ましい。ＤＮＡ断片Ｃとの分離性を更に高めるように、上流側プライマーの５’末端は、第１の切断位置より１１０ｂｐ以下の上流の位置とすることも有効である。

次に、本発明によれば、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｂの存否によって、制限酵素（ＨａｅＩＩ）が効果的に反応しているか否かを判断し、ＰＣＲ産物の消化が適正に行われたか否かの判断をすることができる。消化反応が適正に行われたか否かを判断することは、正確で、信頼性のあるＡｐｏＥ遺伝子多型の検出、ゲノタイピングにとって重要である。Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｂが存在するときに、有効な切断反応の存在を判断する。そして、有効な切断反応の存在を判断した場合に、各ＤＮＡ断片の存否の組み合わせから、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプを判定するようにすることができる。このＤＮＡ断片Ｂが存在しない場合は、その検出結果を採用しない、或いはゲノタイピング不能であること、若しくは精度が低下していることを判断することができる。

上述のように、本発明によれば、下流側プライマーは、第２の切断位置より３０ｂｐ以上の下流の位置に５’末端を設定することで、ＤＮＡ断片ＣとＤＮＡ断片Ｅとを良好に分離できる。ここで、ＤＮＡ断片Ｂを上記のように消化反応の良否判断の目的で利用することを考えると、下流側プライマーは、好ましくは、第２の切断位置より７０ｂｐ以上の下流の位置に５’末端を設定する。これにより、前述のＡｇｉｌｅｎｔ２１００、日立ＳＶ１２１０、ＡＢＩ３１００（或いはＡＢＩ３７００）等の高解像度のＤＮＡ分離方法を用いるとき、ＤＮＡ断片Ｂ２（本実施例では１８ｂｐ、１３ｂｐのＤＮＡ断片）をこの目的のために好適に利用することができる。又、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成する最下流のＤＮＡ断片の長さがＤＮＡ断片Ｂ１（本実施例では３５ｂｐ）と同じである場合にはＤＮＡ断片Ｂ１をＤＮＡ断片Ｂ３と共にこの目的のために利用することができる。

又、この目的のためには、ＤＮＡ断片の分離、検出を良好に行うことができるように、下流側プライマーの５’末端の位置を８０ｂｐ以上、９０ｂｐ以上と、第２の切断位置より更に下流側に設定することが好ましく、より好ましくは１００ｂｐ以上の下流の位置に設定する。これにより、ＤＮＡ断片Ｂ３（本実施例では３５ｂｐのＤＮＡ断片）をこの目的のために好適に使用することができる。第２の切断位置より１２６ｂｐ以上の下流の位置、１３６ｂｐ以上の下流の位置と、より下流に下流側プライマーの５’末端を設定することも有効である。

但し、上述の如く、極めて良好にＤＮＡ断片Ｂ３をＤＮＡ断片Ｃと分離するには、第２の切断位置より１８５ｂｐ以下の下流の位置に下流側プライマーの５’末端を設定するのが好ましい。又、ＤＮＡ断片Ａ、ＤＮＡ断片Ｂを上述の如く利用する場合には、これらＤＮＡ断片ＡとＤＮＡ断片Ｂとを分離可能とする（９ｂｐ、好ましくは２０ｂｐ、より好ましくは３０ｂｐ以上の鎖長差を設ける）必要がある。このようにＤＮＡ断片ＡとＤＮＡ断片Ｃとの分離性が良好であるように、下流側プライマーは、好ましくは、第２の切断位置より１６６ｂｐ以下の下流の位置、より好ましくは、第２の切断位置より１５６ｂｐ以下の下流の位置に５’末端の位置を設定する。

好ましくは、ＤＮＡ断片Ａ、ＤＡＮ断片Ｂとをそれぞれ上記の目的で使用する場合、上流側プライマーの５’末端は、第１の切断位置より１００ｂｐ以上の上流の位置に設定し、下流側プライマーの５’末端位置は、第２の切断位置より１５６ｂｐ以下の下流の位置とする。

つまり、本発明の一態様によれば、検出したＤＮＡ断片長の存否の組み合わせからＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプを判定するＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法が提供される。その一実施態様では、ＤＮＡ断片Ｃ（本実施例では１４５ｂｐ）、ＤＮＡ断片Ｄ（本実施例では２５１ｂｐ）及びＤＮＡ断片Ｅ（本実施例では１８０ｂｐ）の存否をＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプの判定に用い、（ａ）断片Ｅのみの存在によりＥ２／Ｅ２を判定し；（ｂ）断片Ｃのみの存在によりＥ３／Ｅ３を判定し；（ｃ）断片Ｄのみの存在によりＥ４／Ｅ４を判定し；（ｄ）断片Ｅ及び断片Ｃのみの存在によりＥ２／Ｅ３を判定し；（ｅ）断片Ｄ及び断片Ｅのみの存在によりＥ２／Ｅ４を判定し；（ｆ）断片Ｄ及び断片Ｃのみの存在によりＥ３／Ｅ４を判定することができる。

又、断片Ａ、断片Ｃ、断片Ｄ及び断片Ｅの存否をＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプの判定に用い、（ａ）断片Ｅ及び断片Ａのみの存在によりＥ２／Ｅ２を判定し；（ｂ）断片Ｃ及び断片Ａのみの存在によりＥ３／Ｅ３を判定し；（ｃ）断片Ｄの存在及び断片Ａの非存在によりＥ４／Ｅ４を判定し；（ｄ）断片Ｅ、断片Ｃ及び断片Ａのみの存在によりＥ２／Ｅ３を判定し；（ｅ）断片Ｄ、断片Ｅ及び断片Ａのみの存在によりＥ２／Ｅ４を判定し；（ｆ）断片Ｄ、断片Ｃ及び断片Ａのみの存在によりゲノタイプＥ３／Ｅ４を判定することができる。

そして、更に、断片Ｂの存在により、制限酵素による切断段階における有効な切断反応の存在を判断し、該有効な切断の存在を判断した場合に、ＤＮＡ断片長の存否の組み合わせからＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプを判定することができる。断片Ａの存否をＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプの判定に用い、断片Ａの非存在によりゲノタイプＥ４／Ｅ４を判定することもできる。

ところで、目的の遺伝子領域を複製する過程において、ヘテロ二本鎖（ヘテロデュプレックス）が生じることがある。ヘテロ二本鎖は、特に、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプがヘテロの場合（Ｅ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ４）の場合に問題となる。以下この点について説明する。

図１６（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、Ｅ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ４の各ゲノタイプについてヘテロデュプレックスが生じた場合のＤＮＡ制限断片のパターンを本実施例に則して模式的に示したものである（ここでは、説明の容易化のために最下流の３５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｂ３）は無視する。）。

ＰＣＲの過程で仮に５０％がヘテロ二本鎖を形成したとすると、Ｅ２／Ｅ３ゲノタイプでは、図１６（ａ）に示すように、５０％がＥ２／Ｅ３二本鎖（ヘテロ二本鎖）が５０％、Ｅ３／Ｅ３二本鎖が２５％、Ｅ２／Ｅ２二本鎖が２５％生成する。そして、ヘテロ二本鎖では第２の制限酵素（ＨａｅＩＩ）の認識配列が消失し、第２の切断位置が切断されなくなる。その結果、見かけ上では、Ｅ２（１０６ｂｐ、１８０ｂｐのＤＮＡ断片）が７５％、Ｅ３（３５ｂｐ、１０６ｂｐ、１４５ｂｐのＤＮＡ断片）が２５％となる。

又、Ｅ３／Ｅ４ゲノタイプでは、同様に考えると、図１６（ｃ）に示すようになる。そして、ヘテロ二本鎖では第１の制限酵素（ＡｆｌＩＩＩ）の認識配列が消失し、第１の切断位置が切断されなくなる。その結果、見かけ上では、Ｅ４（３５ｂｐ、２５１ｂｐのＤＮＡ断片）が７５％、Ｅ３（３５ｂｐ、１０６ｂｐ、１４５ｂｐのＤＮＡ断片）が２５％となる。

一方、Ｅ２／Ｅ４ゲノタイプでは、同様に考えると、図１６（ｂ）に示すようになる。そして、ヘテロ二本鎖では第１及び第２の酵素（ＡｆｌＩＩＩ及びＨａｅＩＩ）の認識配列が消失し、第１及び第２の位置が切断されなくなる。第２の切断位置より下流の切断位置ではヘテロ二本鎖であっても切断されるので、Ｅ２／Ｅ４二本鎖（ヘテロ二本鎖）に特異的な、本実施例では２８６ｂｐのＤＮＡ断片（以下「ヘテロ二本鎖断片という。）が生成する。即ち、ヘテロ二本鎖断片は、配列Ａ、配列Ｂ及び配列Ｃを含む。その結果、見かけ上では、Ｅ４（３５ｂｐ、２５１ｂｐのＤＮＡ断片）が２５％、Ｅ２（１０６ｂｐ、１８０ｂｐの断片）が２５％、ヘテロ二本鎖断片（２８６ｂｐのＤＮＡ断片）が５０％となる。

図１７は、ヘテロ二本鎖の生成をも考慮した場合における本実施例に即した各ゲノタイプでのＤＮＡ断片の分離パターンを模式的に示す。図示の通り、Ｅ２／Ｅ３では、１８０ｂｐにヘテロ二本鎖の生成による太いバンドが出現し、Ｅ２／Ｅ４では２８６ｂｐにヘテロ二本鎖の生成による新たなバンドが出現し、Ｅ３／Ｅ４では２５１ｂｐにヘテロ二本鎖の生成による太いバンドが出現する。このことから、ヘテロ二本鎖断片（２８６ｂｐのＤＮＡ断片）の出現は、Ｅ４／Ｅ４ゲノタイプを示し、アポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定の根拠の一つとして利用することができる。

図１７から理解されるように、本発明によれば、ヘテロ二本鎖が生成しても、各ＡｐｏＥ遺伝子多型の検出、ゲノタイピングが可能であるが、本発明によれば、ヘテロ二本鎖の生成をも考慮することで、更にＡｐｏＥ遺伝子多型の検出、ゲノタイピングの正確さ、信頼性を高めることができる。以下、この点について説明する。

つまり、本発明によれば、上述のように、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｂの出現によって、制限酵素が効果的に反応しているかを判断し、ＰＣＲ産物の消化が適正に行われたか否かを判断することができる。更に、このＤＮＡ断片Ｂの量を定量することによって、消化反応全体に寄与し、ゲノタイピングの用に供することのできるＤＮＡ全量の予測が可能となる。

そして、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｂを定量した結果に基づいて、それぞれのゲノタイプに関係付けることのできる断片（各ゲノタイプで出現する特異的なＤＮＡ制限断片パターンを構成するそれぞれのＤＮＡ断片）、特に、ＤＮＡ断片Ａ、ＤＮＡ断片Ｃ、ＤＮＡ断片Ｄ及び／又はＤＮＡ断片Ｅをより正確に評価することが可能となる。つまり、それらのＤＮＡ断片の存在をより正確に判断することができる。即ち、ＤＮＡ断片Ａ、ＤＮＡ断片Ｃ、ＤＮＡ断片Ｄ及び／又はＤＮＡ断片Ｅを定量し、その量と、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｂの量から推定されるそれらの量とを比較する。これにより、ＤＮＡ断片Ａ、ＤＮＡ断片Ｃ、ＤＮＡ断片Ｄ及び／又はＤＮＡ断片Ｅがその推定量に相当する量存在するときに、該ＤＮＡ断片が出現したものと判断することができる。

特に、ヘテロ接合体（Ｅ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ４）については、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｂを定量した結果に基づいて、ヘテロ二本鎖の生成割合を求めることができる。そして、このＤＮＡ断片Ｂの量と、ヘテロ二本鎖の生成割合とに基づいて、それぞれのゲノタイプに関係付けることのできるＤＮＡ断片（各ゲノタイプで出現する特異的なＤＮＡ制限断片パターンを構成するそれぞれのＤＮＡ断片）、特に、ＤＮＡ断片Ａ、ＤＮＡ断片Ｃ、ＤＮＡ断片Ｄ及び／又はＤＮＡ断片Ｅをより正確に評価することが可能となる。つまり、それらのＤＮＡ断片の存在をより正確に判断することができる。即ち、ＤＮＡ断片Ａ、ＤＮＡ断片Ｃ、ＤＮＡ断片Ｄ及び／又はＤＮＡ断片Ｅを定量し、その量と、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｂの量及びヘテロ二本鎖の生成割合から推定されるそれらの量とを比較する。これにより、ＤＮＡ断片Ａ、ＤＮＡ断片Ｃ、ＤＮＡ断片Ｄ及び／又はＤＮＡ断片Ｅがその推定量に相当する量存在するときに、該ＤＮＡ断片が出現したものと判断することができる。

特に、各ＤＮＡ断片の定量は、例えば、前述の日立ＳＶ１２１０、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００などの近年開発されたＤＮＡ分離方法を用いれば、ピークを定量することで極めて簡単に行うことができる。自動処理化することも比較的容易である。

以下、この方法の一例を説明する。説明の容易化のために、はじめに、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｂとして最下流のＤＮＡ断片Ｂ３を用いるものとし、且つ、このＤＮＡ断片Ｂ３が８０ｂｐである場合について説明する。図２０は、この場合の各ゲノタイプでのＤＮＡ断片の分離パターンを模式的に示す。

先ず、ヘテロ二本鎖が生成することのあるヘテロ接合体（Ｅ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ４）について説明する。

Ｅ２／Ｅ３の場合、テンプレートＤＮＡをＥ２ａ／Ｅ２ｂ二本鎖、Ｅ３ａ／Ｅ３ｂ二本鎖であるとすると、ＰＣＲによる増幅の過程でヘテロ二本鎖が生成すると、ＰＣＲ産物、生成するＤＮＡ制限断片長の組み合わせ、それぞれの産物（ＤＮＡ制限断片）の量の関係は下記表１に示すようになる。尚、表には、増幅された後切断されたＰＣＲ産物の全量が１００ｐｍｏｌで、ヘテロ二本鎖の生成割合が５０％であるとした例を示す。又、図２１（ａ）に表１の場合における各ＤＮＡ断片の出現量を示す。

図２０に示すように、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全て、即ち、全てのゲノタイプで８０ｂｐのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｂ３）、１８ｂｐ、１３ｂｐのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｂ２）が出現し、その数は、増幅された後に切断されたＤＮＡの数（以下「反応ＤＮＡ全量」という。）と同じとなる。

この場合、８０ｂｐのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｂ３）の量（測定値）をα（ｐｍｏｌ）、１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｃ）又は３５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｂ１）のＤＮＡ断片の量（測定値）をβ（ｐｍｏｌ）とすると、ヘテロ二本鎖の生成割合Ｘ（％）は、
Ｘ（％）＝［（α−２β）／α］×１００
となる。即ち、ヘテロ二本鎖に特異的なＤＮＡ断片の生成しないＥ２／Ｅ３の場合は、ヘテロ二本鎖以外の二本鎖のみに由来する各ＤＮＡ断片の量（測定値）（ヘテロ二本鎖以外の二本鎖全体の量はその２倍と推定できる。）と、８０ｂｐのＤＮＡ断片の量（測定値）（即ち、反応ＤＮＡ全量）とから、ヘテロ二本鎖の生成割合を求める。

そして、求めたヘテロ二本鎖の生成割合Ｘ（％）と、８０ｂｐのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｂ３）の量から、各ＤＮＡ断片の量を予測（推定）することができる。つまり、下記、
１８０ｂｐの（ＤＮＡ断片Ｅ）の推定量：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×α＋（α×Ｘ×０．０１）
１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｃ）の推定量：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×α
１０６ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）の推定量：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×２×α＋（α×Ｘ×０．０１）
３５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｂ１）の推定量：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×α
により各ＤＮＡ断片の量を推定することができる。

次に、Ｅ３／Ｅ４の場合、テンプレートＤＮＡをＥ３ａ／Ｅ３ｂ二本鎖、Ｅ４ａ／Ｅ４ｂ二本鎖であるとすると、上記Ｅ２／Ｅ３の場合と同様に考えた場合、下記表２、図２１（ｃ）に示すようになる。

この場合、上記Ｅ３／Ｅ４の場合と同様に考えて、８０ｂｐのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｂ３）の量（測定値）をα（ｐｍｏｌ）、１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｃ）又は１０６ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）の量（測定値）をβ（ｐｍｏｌ）とすると、ヘテロ二本鎖の生成割合Ｘ（％）は、
Ｘ（％）＝［（α−２β）／α］×１００
となる。そして、上記Ｅ２／Ｅ３の場合と同様に考えて、各ＤＮＡ断片の推定量は、下記、
２５１ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｄ）の推定量：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×α＋（α×Ｘ×０．０１）
１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｃ）の推定量：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×α
１０６ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）の推定量：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×α
３５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｂ１）の推定量：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×２×α＋（α×Ｘ×０．０１）
となる。

一方、Ｅ２／Ｅ４の場合、テンプレートＤＮＡをＥ２ａ／Ｅ２ｂ二本鎖、Ｅ４ａ／Ｅ４ｂ二本鎖であるとすると、上記Ｅ２／Ｅ３、Ｅ３／Ｅ４の場合と同様に考えた場合、下記表３、図２１（ｂ）に示すようになる。

図２０に示すように、上記Ｅ２／Ｅ３、Ｅ３／Ｅ４の場合と同様、全てのゲノタイプで８０ｂｐのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｂ３）、１８ｂｐ、１３ｂｐのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｂ２）が出現し、その数は、反応ＤＮＡ全量と同じとなる。

そして、この場合、８０ｂｐのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｂ３）の量（測定値）をα（ｐｍｏｌ）、２８６ｂｐ（ヘテロデュプレクス断片）の量（測定値）をγ（ｐｍｏｌ）とすると、ヘテロ二本鎖の生成割合Ｘ（％）は、
Ｘ（％）＝γ／α×１００
となる。即ち、ヘテロ二本鎖に特異的な断片の生成するＥ２／Ｅ４の場合は、ヘテロ二本鎖のみに由来するＤＮＡ断片の量（測定値）と、８０ｂｐのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｂ３）の量（測定値）（即ち、反応ＤＮＡ全量）とから、ヘテロ二本鎖の生成割合を求めることができる。

或いは、上記Ｅ２／Ｅ３の場合と同様に考えて、８０ｂｐのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｂ３）の量（測定値）をα、２５１ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｄ）、１８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｅ）又は１０６ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）の量（測定値）をβとすると、ヘテロ二本鎖の生成割合Ｘ（％）は、
Ｘ（％）＝［（α−２β）／α］×１００
となる。

そして、各ＤＮＡ断片の推定量は、下記、
２５１ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｄ）の推定量：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×α
１８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｅ）の推定量：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×α
１０６ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）の推定量：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×α
３５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｂ１）の推定量：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×α
となる。

以上のようにして、ヘテロ接合体についての各ＤＮＡ断片の量を推定することができる。そして、各ＤＮＡ断片の定量値（測定値）が、その推定量に整合する場合、即ち、推定量に相当する量だけ存在するときに、該ＤＮＡ断片が出現したものと判断することができる。尚、推定量との誤差がどの程度の場合に該ＤＮＡ断片が出現したものと判断するかは、適宜、選定することができる。

尚、上述では、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｂとして、８０ｂｐのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｂ３）を用いた場合を例に説明したが、同様にして、１８ｂｐ、１３ｂｐのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｂ２）を用いることもできる。

又、ヘテロ二本鎖が問題になるのはヘテロ接合体の場合であるが、ホモ接合体の場合においても、上述したように、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｂを定量した結果に基づいて、それぞれのゲノタイプに関係付けることのできるＤＮＡ断片、特に、ＤＮＡ断片Ａ、ＤＮＡ断片Ｃ、ＤＮＡ断片Ｄ及び／又はＤＮＡ断片Ｅの存在をより正確に判断することができる。

つまり、上記ヘテロ接合体の場合と同様に、増幅された後切断されたＰＣＲ産物の全量が１００ｐｍｏｌであると仮定した場合の、各ゲノタイプで生成する各ＤＮＡ断片の量（推定量）を図２２に示す。酵素処理後には、ＰＣＲで増幅された後切断されたＤＮＡの数（反応ＤＮＡ全量）と同じだけ、１３ｂｐ、１８ｂｐ、８０ｂｐのＤＮＡ断片が生成される。そして、Ｅ２／Ｅ２、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ４／Ｅ４のサンプルではへテロ二本鎖が生成されないため、Ｅ２／Ｅ２では１０６ｂｐ、１８０ｂｐの断片、Ｅ３／Ｅ３では３５ｂｐ、１０６ｂｐ、１４５ｂｐの断片、Ｅ４／Ｅ４では３５ｂｐ、２５１ｂｐの断片が、このＤＮＡ断片の数と同じだけ生成される。このように、ホモ接合体についても、各ＤＮＡ断片の量を推定することができる。そして、各ＤＮＡ断片の定量値（測定値）が、その推定量に整合する場合、即ち、推定量に相当する量だけ存在するときに、該ＤＮＡ断片が出現したものと判断することができる。

次に、最下流のＤＮＡ断片Ｂ３の長さがＤＮＡ断片Ｂ１（本実施例では３５ｂｐ）と同じである場合について説明する。この場合、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するこの鎖長のＤＮＡ断片Ｂ（ＤＮＡ断片Ｂ１及びＢ３）を定量した結果に基づいてヘテロ二本鎖の生成割合、各ＤＮＡ断片の推定量を求めることができる。以下この場合について本実施例に則して説明する。この場合の各ゲノタイプでのＤＮＡ断片の分離パターンは、前述のように、図１７に示すようになる。

Ｅ２／Ｅ３の場合、テンプレートＤＮＡをＥ２ａ／Ｅ２ｂ二本鎖、Ｅ３ａ／Ｅ３ｂ二本鎖であるとすると、ＰＣＲによる増幅の過程でヘテロ二本鎖が生成すると、ＰＣＲ産物、生成するＤＮＡ制限断片長の組み合わせ、それぞれの産物（ＤＮＡ制限断片）の量の関係は下記表４に示すようになる。尚、表には、増幅された後切断されたＰＣＲ産物の全量が１００ｐｍｏｌで、ヘテロ二本鎖の生成割合が５０％であるとした例を示す。又、表中、便宜的に、３５ｂｐのＤＮＡ断片の鎖長は、ＤＮＡ断片Ｂ１（Ｅ３、Ｅ４において生成）を３５（ａ）ｂｐ、ＤＮＡ断片Ｂ３（Ｅ２、Ｅ３又はＥ４の全てで生成）を３５（ｂ）ｂｐとして区別している。そして、図１８（ａ）に、表１の場合における各ＤＮＡ断片の出現量を示す。

図１７から分かるように、３５ｂｐのＤＮＡ断片は、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全て、即ち、全てのゲノタイプで出現する。但し、その量には、上述のＤＮＡ断片Ｂ１由来のものと、ＤＮＡ断片Ｂ３由来のものとが含まれている。

この場合、３５ｂｐのＤＮＡ断片の量（測定値）をα’（ｐｍｏｌ）、１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｃ）のＤＮＡ断片の量（測定値）をβ（ｐｍｏｌ）とすると、ヘテロ二本鎖の生成割合Ｘ（％）は、
Ｘ（％）＝［（α’−３β）／（α’−β）］×１００
となる。即ち、Ｅ２／Ｅ２二本鎖及びヘテロ二本鎖からはＤＮＡ断片Ｂ３（表中３５（ｂ））のみが生成するが、Ｅ３／Ｅ３二本鎖からはＤＮＡ断片Ｂ１（表中３５（ａ））及びＤＮＡ断片Ｂ３（表中３５（ｂ））が生成する。このＥ３／Ｅ３二本鎖から生成するＤＮＡ断片Ｂ１（表中３５（ａ）））の量は、Ｅ３／Ｅ３二本鎖のみから生成する１４５ｂｐのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｃ）の量と同じである（表中３５（ｂ）も同じ量である）ので、３５ｂｐのＤＮＡ断片の量（α’）からβを差し引いたものが、反応ＤＮＡ全量となる。つまり、３５ｂｐのＤＮＡ断片の量α’は、表１を参照して説明した例における（α＋β）に相当する。

そして、求めたヘテロ二本鎖の生成割合Ｘ（％）と、３５ｂｐのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｂ３）の量から、各ＤＮＡ断片の量を予測（推定）することができる。つまり、下記、
１８０ｂｐの（ＤＮＡ断片Ｅ）の推定量：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×（α’−β）＋［（α’−β）×Ｘ×０．０１］
１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｃ）の推定量：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×（α’−β）
１０６ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）の推定量：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×２×（α’−β）
＋［（α’−β）×Ｘ×０．０１］
により各ＤＮＡ断片の量を推定することができる。

次に、Ｅ３／Ｅ４の場合、テンプレートＤＮＡをＥ３ａ／Ｅ３ｂ二本鎖、Ｅ４ａ／Ｅ４ｂ二本鎖であるとすると、上記Ｅ２／Ｅ３と同様に考えた場合、下記表５、図１８（ｃ）に示すようになる。

この場合、３５ｂｐのＤＮＡ断片の量（測定値）をα’’（ｐｍｏｌ）、１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｃ）のＤＮＡ断片の量（測定値）をβ（ｐｍｏｌ）とすると、ヘテロ二本鎖の生成割合Ｘ（％）は、
Ｘ（％）＝［（α’’／２）−２β］／（α’’／２）］×１００
となる。即ち、Ｅ３／Ｅ３二本鎖、Ｅ４／Ｅ４二本鎖及びヘテロ二本鎖の全てから、ＤＮＡ断片Ｂ１（表中３５（ａ））及びＤＮＡ断片Ｂ３（表中３５（ｂ））が生成する。従って、３５ｂｐのＤＮＡ断片の量（α’’）の１／２が反応ＤＮＡ全量となる。つまり、３５ｂｐのＤＮＡ断片の量α’’は、表２を参照して説明した例における２αに相当する。

そして、上記Ｅ２／Ｅ３の場合と同様に考えて、各ＤＮＡ断片の量の推定量は、下記、
２５１ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｄ）の推定量：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×（α’’／２）＋［（α’’／２）×Ｘ×０．０１］
１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｃ）の推定量：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×（α’’／２）
１０６ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）の推定量：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×（α’’／２）
となる。

一方、Ｅ２／Ｅ４の場合、テンプレートＤＮＡをＥ２ａ／Ｅ２ｂ二本鎖、Ｅ４ａ／Ｅ４ｂ二本鎖であるとすると、上記Ｅ２／Ｅ３、Ｅ３／Ｅ４の場合と同様に考えた場合、下記表６、図１８（ｂ）に示すようになる。

この場合、３５ｂｐのＤＮＡ断片の量をα’（ｐｍｏｌ）、２５１ｂｐのＤＮＡ断片（或いは１０６ｂｐ、１８０ｂｐのそれぞれのＤＮＡ断片）の量をβ、２８６ｂｐ（ヘテロデュプレクス断片）の量をγ（ｐｍｏｌ）とすると、ヘテロ二本鎖の生成割合Ｘ（％）は、
Ｘ（％）＝γ／（α’−β）×１００
となる。即ち、Ｅ２／Ｅ２二本鎖及びヘテロ二本鎖からはＤＮＡ断片Ｂ３（表中３５（ｂ））のみが生成するが、Ｅ４／Ｅ４二本鎖からは、ＤＮＡ断片Ｂ１（表中３５（ａ））及びＤＮＡ断片Ｂ３（表中３５（ｂ））が生成する。このＥ４／Ｅ４二本鎖から生成するＤＮＡ断片Ｂ１（表中３５（ａ）））の量は、Ｅ４／Ｅ４二本鎖のみから生成する２５１ｂｐのＤＮＡ断片（或いは、Ｅ２／Ｅ２二本鎖からのみ生成する１０６ｂｐ、１８０ｂｐのそれのＤＮＡ断片）の量と同じであるので、３５ｂｐのＤＮＡ断片の量（α’）からβを差し引いたものが、反応ＤＮＡ全量となる。つまり、３５ｂｐのＤＮＡ断片の量α’は、表３の場合の（α＋β）に相当する。

或いは、上記Ｅ２／Ｅ３の場合と同様に考えて、３５ｂｐのＤＮＡ断片の量をα’、２５１ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｄ）、１８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｅ）又は１０６ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）の量をβとすると、ヘテロ二本鎖の生成割合Ｘ（％）は、
Ｘ（％）＝［（α’−３β）／（α’−β）］×１００
となる。

そして、求めたヘテロ二本鎖の生成割合Ｘ（％）と、３５ｂｐのＤＮＡ断片の量から、各ＤＮＡ断片の量を予測（推定）することができる。つまり、下記、
２５１ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｄ）の推定量：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×（α’−β）
１８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｅ）の推定量：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×（α’−β）
１０６ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）の推定量：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×（α’−β）
により各ＤＮＡ断片の量を推定することができる。

以上のようにして、ヘテロ接合体についての各ＤＮＡ断片の量を推定することができる。そして、各ＤＮＡ断片がその推定量に相当する量だけ存在するときに、該ＤＮＡ断片が出現したものと判断することができる。

又、ホモ接合体の場合は、次のようになる。増幅された後切断されたＰＣＲ産物の全量が１００ｐｍｏｌであると仮定した場合の、各ゲノタイプで生成する各ＤＮＡ断片の量（推定量）を図１９に示す。Ｅ２／Ｅ２については、酵素処理後には、ＰＣＲで増幅された後切断されたＤＮＡの数（反応ＤＮＡ全量）と同じだけ、３５ｂｐのＤＮＡ断片が生成される。一方、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ４／Ｅ４については、ＰＣＲで増幅された後切断されたＤＮＡの数（反応ＤＮＡ全量）の２倍、３５ｂｐのＤＮＡ断片が生成される。

そして、Ｅ２／Ｅ２、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ４／Ｅ４のサンプルではへテロ二本鎖が生成されないため、Ｅ２／Ｅ２では１０６ｂｐ、１８０ｂｐの断片が、このＤＮＡ断片の数と同じだけ生成される。一方、Ｅ３／Ｅ３では１０６ｂｐ、１４５ｂｐの断片が３５ｂｐのＤＮＡ断片の１／２だけ生成し、Ｅ４／Ｅ４では２５１ｂｐの断片が３５ｂｐのＤＮＡ断片の１／２だけ生成される。このように、ホモ接合体についても、各ＤＮＡ断片の量を推定することができる。そして、各ＤＮＡ断片がその推定量に相当する量だけ存在するときに、該ＤＮＡ断片が出現したものと判断することができる。

ところで、図２７は、上記非特許文献１０に開示される方法によるＡｐｏＥ遺伝子多型の各ゲノタイプでのＤＮＡ断片の分離パターンを模式的に示す。上述のように、この方法では、ゲノムＤＮＡから下記のプライマー対、
Ｆ５’−ＴＣＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＧＣＡ
Ｒ５’−ＧＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＡＣＴＧＣＣＡ
を用いてＡｐｏＥ遺伝子特異的な領域を増幅し、２種類の制限酵素ＡｆｌＩＩＩ、ＨａｅＩＩを用いて断片化する。そして、図２７に示すように、それぞれＥ３、Ｅ２、Ｅ４に特異的な１４５ｂｐ、１６８ｂｐ、１９５ｂｐのＤＮＡ制限断片が得られる。

しかしながら、上記非特許文献１０は、Ｅ２及びＥ３で出現し、Ｅ４で出現しない最上流のＤＮＡ断片をＡｐｏＥ遺伝子多型の判別の根拠として用いることについては何ら言及していない。

又、この方法では、全てのゲノタイプで生成するＤＮＡ断片はなく、いずれかのＤＮＡ断片の存否によってＰＣＲ産物の消化が適正に行われたか否かの判断をすることは不可能である。又、同様に、全てのゲノタイプで生成するＤＮＡ断片はないので、いずれかのＤＮＡ断片の量を定量することによって、複製された後制限酵素で切断され、ゲノタイピングの用に供することのできるＤＮＡの全量を予測することができない。従って、ヘテロ二本鎖の発生割合を求めることも不可能である。

又、上記非特許文献１０の方法では、未消化フラグメント（２１８ｂｐ）が、Ｅ２／Ｅ４の場合に生成し得るヘテロ二本鎖（２１８ｂｐ）と同じであるため、ヘテロ二本鎖が生成したのか、酵素反応が起こっているのかどうかの確認することはできない。そのため、タイピングを誤る可能性がある。これに対して、本発明によれば、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｂの存否によりＰＣＲ産物の適正な消化が行われたか否かを判断できるのに加え、Ｅ２／Ｅ４の場合には、酵素が反応した場合、ＰＣＲ産物の断片（図１７に示す例では３５２ｂｐ、図２０の例では３９７ｂｐ）は必然的に切断され、短い断片（２８６ｂｐ）の出現によって反応が進んでいることを容易に確認できる。

つまり、本発明に従うＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法では、更に、ＡｐｏＥ遺伝子多型Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成する断片Ｂ（図１７の例では３５ｂｐ、１８ｂｐ若しくは１３ｂｐ、図２０の例では８０ｂｐ）を定量した結果に基づいて、断片Ａ、断片Ｃ、断片Ｄ及び／又は断片Ｅの存否を判断することができる。更に、該断片Ｂを定量した結果に基づいて求めたヘテロ二本鎖の生成割合に基づいて、断片Ａ、断片Ｃ、断片Ｄ及び／又は断片Ｅの存否を判断することができる。尚、ヘテロ二本鎖（図１７、２０の例では２８６ｂｐ）の存否をＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプの判定に用いることができ、該ヘテロ二本鎖の存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ４を判定することができる。

以上、本発明によれば、ＡｐｏＥ遺伝子多型の検出、ゲノタイピングの正確性、信頼性を更に向上させることについて説明した。

尚、蛍光物質などの標識物質によってプライマーを修飾することにより、その標識物質を利用したＤＮＡ断片の分離、同定方法も可能である。

本発明に係るＡｐｏＥ遺伝子多型の検出試薬は、一実施態様では、上記ＡｐｏＥ遺伝子に特異的なプライマー対を含む増幅試薬である。増幅試薬は更に、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ）、緩衝液のいずれか若しくは全てを含んでいるか、又は組み合わされた試薬セットとされていてよい。詳しくは後述するように、所望に応じてｄＮＴＰは、標識物質（例えば蛍光物質）で標識されていてもよい。使用し得る耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼなどの耐熱性ポリメラーゼが挙げられるが、上記プライマー対（配列番号１、２）を用いる場合には、Ｔａｑポリメラーゼが好適である。緩衝液は、使用される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに応じて選択すればよい。増幅試薬は更に、塩、保存料（例えば、防腐剤（アジ化ナトリウム等）、酸化防止剤）、ＤＭＳＯ、ホルムアミド、ベタイン、ゼラチンなどの適当な添加成分のいずれか若しくは全てを含んでいるか、又は組み合わされた試薬セットとされていてよい。増幅試薬に含まれる若しくは組み合わされる諸成分の選択、濃度等の条件については、当業者は通常行う実験などを通して適宜選択することができる。

本発明に係るＡｐｏＥ遺伝子多型の検出試薬は、他の実施態様では、上記所定の制限酵素を含む消化試薬である。この消化試薬は更に、緩衝液を含んでいるか、若しくは組み合わされた試薬セットとされていてよい。緩衝液は、使用する制限酵素に応じて選択されるが、制限酵素がＡｆｌＩＩＩ、ＨａｅＩＩの組合せであるとき、中または高塩濃度緩衝液を好適に使用することができる。消化試薬は更に、塩、保存料（例えば、防腐剤（アジ化ナトリウム等）、酸化防止剤）、ＢＳＡ、グリセロール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの適当な添加成分のいずれか若しくは全てを含んでいるか、又は組み合わされた試薬セットとされていてよい。消化試薬に含まれる若しくは組み合わされる諸成分の選択、濃度等の条件については、当業者は通常行う実験などを通して適宜選択することができる。

更に、他の実施態様では、ＡｐｏＥ遺伝子多型の検出試薬は、上記増幅試薬と、消化試薬とが組み合わされた試薬セットとされていてもよい。

本発明に係るＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法は、（１）試料から抽出されたゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＡｐｏＥ遺伝子に特異的なプライマー対を用いてＰＣＲ法によってＡｐｏＥ遺伝子の多型領域を増幅し、（２）増幅されたＤＮＡを所定の制限酵素を用いて切断し、（３）切断したＤＮＡ制限断片を分離し、分離されたＤＮＡ制限断片を検出する各段階を含む。更に、本発明に係るＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法は、（４）検出したＤＮＡ断片長の組合せからＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピングを行う段階を含んでいてよい。

試料は、ゲノムＤＮＡを抽出することが可能であれば何を用いても構わない。例えば、末梢血液、毛根、爪、口腔粘膜などが例示される。好ましくは末梢血液である。

試料からのゲノムＤＮＡの抽出方法としては、如何なる手法をも用い得るが、例えば、市販のＤＮＡ精製キットを用いて、試料としての末梢血液から白血球を分離し、該白血球から市販のＤＮＡ精製キットを用いてゲノムＤＮＡを抽出することができる。この目的に好適に使用し得るＤＮＡ精製キットが、Wizard Plus Midipreps DNA Purification Systemとしてプロメガ社から市販されている。このキットを用いたＤＮＡ抽出の操作には３〜４時間ほど要する。一方、ボイリング法と呼ばれるＤＮＡ抽出方法（例えば、Applied Biosystems社のPrepMan Ultra Reagent）を用いれば２０分ほどでＰＣＲ法においてテンプレートとするのに十分な量のゲノムＤＮＡが得られる。

ＡｐｏＥ遺伝子の多型領域は、一般的にサーマルサイクラーと呼ばれるＤＮＡ増幅装置を用いてＰＣＲ法によって増幅することができる。ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いる場合、ゲノムＤＮＡ２本鎖を加熱して変性し、１本鎖にする（変性）。次に、増幅したい特定部位のＤＮＡ鎖の両端に相補的な２種類のオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー対）を反応系に過剰に加えた状態で温度を下げると、プライマーがＤＮＡ鎖の相補的な部位と２本鎖を形成する（アニーリング）。この状態でＤＮＡ合成基質のデオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）とＤＮＡポリメラーゼを作用させると、ポリメラーゼはプライマー部位からＤＮＡ相補鎖を合成していく（伸長反応）。引き続き、得られた２本鎖を加熱して１本鎖として、プライマーのアニーリング、伸長反応を行い、再度得られた２本鎖を１本鎖とする反応を繰り返す。

ＰＣＲ反応条件、即ち、ＰＣＲ反応混合物に含まれるテンプレートＤＮＡ、プライマー対、ｄＮＴＰ、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ等の種類・量（濃度）、或いは変性、アニーリング、伸長反応を行う温度・時間、サイクル数は、適宜選択事項である。本発明に従い、上記新規なプライマー対（配列番号１、配列番号２）及びＴａｑポリメラーゼを用いて、ＰＣＲ法でゲノタイピングに必要十分量のＤＮＡを好適に得ることのできる一実施例を後述する。

本発明の好ましい一実施態様では、配列番号１、２のプライマーを用いて増幅されたＡｐｏＥ遺伝子の多型領域は、２種類の制限酵素、より具体的には、上記制限酵素ＡｆｌＩＩＩ、ＨａｅＩＩの組合せを用いて切断する。斯かる切断は、当該制限酵素の組合せにおいて最適な条件、即ち、２種類の制限酵素が好適に作用し、ＲＦＬＰによるゲノタイピングを行うのに十分にＡｐｏＥ遺伝子の多型領域が切断される反応条件（反応混合物に含まれる成分の種類・量（濃度）、反応温度、反応時間など）にて行う。本発明者らの検討により最適と思われる一実施例を後述する。

得られたＤＮＡ制限断片は、好ましい一実施態様では、電気泳動で分離する。そして、分離されたＤＮＡ制限断片は、使用する電気泳動法に応じた方法により検出する。

上述のように、本発明によれば、上記新規なプライマー対、及び上記本発明に従う制限酵素、特に２種類の制限酵素の組合せ（ＡｆｌＩＩＩ、ＨａｅＩＩ）を用いることにより、非特許文献５に記載の制限酵素ＨｈａＩを用いた場合よりも長いＤＮＡ制限断片が得られる。より詳細には、本発明によれば、それぞれのアポリポタンパクＥ遺伝子多型に特異的な略１００ｂｐ以上のＤＮＡ制限断片が生成し、更に詳しくは、好ましい一実施態様では、上記第１の切断位置と第２の切断位置との間の長さ以上、即ち、１４４ｂｐ以上のＤＮＡ制限断片が生成する。これによって、ＤＮＡ分離方法として、典型的には、斯界にて通常用いられ、且つ、安価なＤＮＡ分離方法であるアガロースゲル電気泳動を用いても、高解像度にてＤＮＡ制限断片を分離することができる。アガロースゲル電気泳動では、種々の染色法のうち例えば、染色剤としてのエチジウムブロマイドで染色し、紫外線を照射することにより、分離されたＤＮＡ制限断片を検出することができる。

又、上記新規なプライマー対、及び上記本発明に従う制限酵素、特に２種類の制限酵素の組合せ（ＡｆｌＩＩＩ、ＨａｅＩＩ）を用いることにより、上記同様の理由から、前述のＡｇｉｌｅｎｔ２１００、日立ＳＶ１２１０、ＡＢＩ３１００（或いはＡＢＩ３７００）等の多様なＤＮＡ分離方法を用い、高解像度にてＤＮＡ制限断片を分離、検出することができる。

Ａｇｉｌｅｎｔ２１００の電気泳動用セットは、ガラスチップ上にサンプル等の装填用穴と微細な溝とが設けられたマイクロチップ［ＤＮＡＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）］及び所定の試薬キットと共に用い、又日立ＳＶ１２１０は、樹脂チップ上にサンプル等の装填用穴と微細な溝とが設けられたマイクロチップ［ｉ−チップ］及び所定の試薬キット（ゲル、染色試薬、内部標準等）と共に用い、所定の手順に従って所定の試薬及びサンプルをマイクロチップに装填して装置本体にセットすることで、マイクロチップ上の分離部へのゲルの充填、複数のサンプルの電気泳動、バンドの検出、データ出力を自動で行うことができる。分離されたＤＮＡ制限断片は、染色剤の蛍光により検出される。Ａｇｉｌｅｎｔ２１００は１２サンプルを約３０分で、又日立ＳＶ１２１０は１２サンプルを約５分で分析する。

又、ＡＢＩ３１００（或いはＡＢＩ３７００）は、キャピラリーと呼ばれる微小径ガラス管に充填したポリマー中で電気泳動を行うキャピラリー電気泳動法を利用し、サンプルの蛍光によりバンドを検出するシステムであり、所定のキャピラリーアレイ、セパレーションポリマー及び試薬キットと共に用いることで、キャピラリーへのポリマー充填、複数のサンプルの電気泳動、バンドの検出、データ出力を自動で行うことができる。ＡＢＩ３１００は、使用するキャピラリーアレイに応じて、約１時間〜数時間で複数サンプルを分析する。

本発明によれば、非特許文献５に記載の制限酵素ＨｈａＩを用いた方法では極めて困難であった、これら近年開発された種々のＤＮＡ分離方法の利点を活用することが可能になり、ＤＮＡ制限断片の分離、検出の迅速化、大量処理化、又自動化が可能になった。更に、これら近年開発されたＤＮＡ分離方法においては、サンプル、試薬等の微量化が図れる。

又、本発明によれば、上述したように、ＤＮＡ断片ＡをもＡｐｏＥ遺伝子多型の判別の根拠の一つとして利用し、更には、ＤＮＡ断片Ｂの存否及び／又はその量を利用することによって、更にＡｐｏＥ遺伝子多型の検出、ゲノタイピングの正確性、信頼性を高めることができる。これらは、前述のＡｇｉｌｅｎｔ２１００、日立ＳＶ１２１０、ＡＢＩ３１００（或いはＡＢＩ３７００）等の近年開発されＤＮＡ分離方法では、極めて良好且つ簡便に行うことができ、自動化を図ることもできる。

勿論、所望によりポリアクリルアミドゲル電気泳動によってＤＮＡ制限断片を分離、検出することもできる。

検出されたＤＮＡ制限断片の分離パターン（検出されたＤＮＡ断片長の存否の組み合わせ）から、ＡｐｏＥ遺伝子多型のタイピングを行う。ＤＮＡ制限断片の分離パターンからＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピングを行う段階をコンピュータ処理により自動化してもよい。更に、ロボット化等により自動化を進めてもよい。この場合、ＡｐｏＥ遺伝子多型の各ゲノタイプについて既知のＤＮＡ制限断片の分離パターンと、サンプルについて得られたＤＮＡ制限断片の分離パターンとを比較し、サンプルをいずれかのＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプに関係付ける出力を行うようにすればよいことは当業者にとって自明である。

即ち、上述の本発明のＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法は、記憶部、演算処理部、出力部を備える一般的なコンピュータで実行可能なプログラムとして提供することができる。即ち、該プログラムにより、演算処理部は、本発明の本発明のＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法に従って検出した各ＤＮＡ断片長の存否の組み合わせと、記憶部に記憶された既知のＡｐｏＥ遺伝子多型の各ゲノタイプの同組み合わせとを比較し、上記本発明の判定方法に従って、サンプルのＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプを、いずれかのゲノタイプに関係付ける。そして、こうして関係付けた結果を、コンピュータの画面、記録紙等に出力させる。

又、演算処理部は、上述のように、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｂの存否によって制限酵素が効果的に反応しているかを判断し、その結果に応じてサンプルのＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプを判定するか、若しくは検出結果を採用しない等の判断を行うことができる。又は、演算処理部は、上述したように、このＤＮＡ断片Ｂを定量した結果（或いは、このＤＮＡ断片Ｂを定量した結果に基づくヘテロ二本鎖の生成割合）から、各ＤＮＡ断片の推定量を算出し、該推定量とそれぞれのＤＮＡ断片の測定値とを比較することで、測定値が推定量と適宜選定可能な所定の精度範囲で整合するか否かを判断することができる。そして、推定量と測定値とが整合したＤＮＡ断片についてそのＤＮＡ断片の存在を判断して、各ＤＮＡ断片の存否の組み合わせから、サンプルのＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプを判定することができる。

本発明に従ってヒト検体からの試料についてＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピングを行うことにより、ＡｐｏＥ遺伝子多型と関連する疾患の診断、治療のために、迅速、且つ、正確な情報を提供することができる。例えば、上述のように、ＡｐｏＥ遺伝子多型の１つであるＥ４は、アルツハイマー病、高脂血症、高リポタンパク血症、高コレステロール血症、心血管疾患（アテローム性動脈硬化、虚血性心疾患、脳血管障害など）、睡眠時無呼吸症候群の非常に強い危険因子であることが知られている。従って、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピングを行うことにより、より詳細には、例えば対象検体がＡｐｏＥ遺伝子多型のＥ４アリルを１つ有するのか、２つ有するのか、或いは有していないのかを迅速、且つ、正確に検出することによって、これらアルツハイマー病、心血管疾患などの予診が可能である。

特に、上述のような近年開発された種々のＤＮＡ分離方法によれば、分析作業の自動化、大量処理化が可能となるので、個々のサンプルのゲノタイピングに要する時間を短縮すると共に、多くの検体からのサンプルを一度に大量に処理することができ、診断、治療に極めて有用な情報を、正確、且つ、迅速に提供することができる。

以下、本発明に係るＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法を実施例を通して更に詳しく説明する。以下の説明において、特に言及しない限り、用いられる器具、試薬は斯界にて一般的なものである。又、特に言及しない限り、以下で行われる実験操作も標準的なものと特に変わるところはない。

実施例１
［ＤＮＡ抽出］
先ず、ヒト検体の血液を試料として、白血球由来のゲノムＤＮＡを抽出する。ここでは、プロメガ社のＤＮＡ精製キットであるWizard Plus Midipreps DNA Purification Systemを用いて、末梢血液から白血球を分離し、その白血球からゲノムＤＮＡを抽出した。各検体毎に、ＰＣＲ法によるＡｐｏＥ遺伝子の多型領域の増幅に十分量のゲノムＤＮＡを抽出した。抽出の操作は付属のプロトコールに従って行った。

［ＡｐｏＥ領域のＤＮＡ増幅］
上記方法により抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、下記の条件にてＰＣＲ法によりＡｐｏＥ遺伝子の多型領域を増幅した。尚、プライマー対は、ＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）合成装置により合成して得た。又、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑポリメラーゼ（Parkin Elmer Cetus社）を用いた。
ａ）プライマー対
ＡＥ−Ｆ１（５’−ＡＡＴＣＧＧＡＡＣＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡＡＣＴＧ−３’）
・・・・・（配列番号１）
ＡＥ−Ｒ１（５’−ＧＣＣＣＧＣＡＣＧＣＧＧＣＣＣＴＧＴＴＣ−３’）
・・・・・（配列番号２）
ｂ）ＰＣＲ反応混合物
白血球より抽出したゲノムＤＮＡ：５０ｎｇ
プライマー対：１μＭ
ｄＮＴＰ２００μＭ
緩衝液（１０倍濃縮標準ＰＣＲ緩衝液）１μｌ
ＤＭＳＯ(dimethyl sulfoxide)：１０％
Ｔａｑポリメラーゼ：０．０２５ｕｎｉｔｓ／μｌ
総反応量：１０μｌ
ｃ）ＰＣＲサイクルの条件
９４℃，１分間（変性）
次いで、下記のサイクルを３５回繰り返す。
９４℃，３０秒間（変性）
６０℃，３０秒間（プライマーアニーリング)
７２℃，１分間(伸長反応)
次いで、次の条件で最終的に２本鎖を形成する。
７２℃，５分間（最終伸長反応）
上記ＰＣＲ条件にて増幅されたＤＮＡフラグメントの量は約１００ｎｇであった。

［ＲＦＬＰ及び制限酵素切断断片の分離とゲノタイピング］
本発明のＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法に、代表的ないくつかの電気泳動法を適用可能であるか確認した。それぞれの電気泳動法に関する詳細な実験方法を以下に述べる。

ａ）アガロースゲル電気泳動
約５０〜１００ｎｇのＰＣＲ産物、制限酵素ＡｆｌＩＩＩ（New England biolabs社：以下同様。）（３ｕｎｉｔ）及びＨａｅＩＩ（New England biolabs社：以下同様。）（６ｕｎｉｔ）、１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ３、１×ＢＳＡを含む反応溶液を、全量が１０μｌになるように調製し、３７℃で２時間以上反応させた。反応液全量を４％アガロースゲル（厚さ７ｍｍ×長さ６ｃｍ）のウェルに充填し、１００Ｖで３０分間電気泳動した。泳動終了後ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、ＵＶ照射によりバンドを記録した。代表的なＤＮＡ制限断片の分離結果を図９に示す。図中左端のレーンはマーカー、次いで左から順にＥ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ３、Ｅ３／Ｅ４、Ｅ４／Ｅ４の各ゲノタイプのＤＮＡ制限断片の分離パターンを示す。

ｂ）Ａｇｉｌｅｎｔ２１００
約１０〜２０ｎｇのＰＣＲ産物、制限酵素ＡｆｌＩＩＩ（３ｕｎｉｔ）及びＨａｅＩＩ（６ｕｎｉｔ）、１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ３、１×ＢＳＡを含む反応溶液を、全量が１０μｌになるように調製し、３７℃で３０分以上反応させた。その後５０ｍＭＥＤＴＡを２．５μｌ加え、制限酵素を失活させた。各サンプルについて、上記反応液の１μｌを、測定用のマイクロチップとしてＤＮＡ５００ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）及びＤＮＡ１０００ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）（マイクロチップ及び付属試薬キット）を用いたＡｇｉｌｅｎｔ２１００によるＤＮＡ制限断片の分離、検出に供した。測定手順は、装置供給元の指示に従った。ＤＮＡ制限断片の分離結果は、当該装置に接続されたコンピュータのディスプレイ上に表示される。代表的なＤＮＡ制限断片の分離結果を図１０に示す。図中上から順に、Ｅ２／Ｅ３、Ｅ３／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ４／Ｅ４の各ゲノタイプのＤＮＡ制限断片の分離パターンを示す。

ｃ）日立ＳＶ１２１０
各サンプルについて、上記ｂ）と同様にして制限酵素を作用させた後該制限酵素を失活させた反応溶液の１μｌを、下記の条件での日立ＳＶ１２１０によるＤＮＡ制限断片の分離、検出に供した。
測定用マイクロチップ：ｉ−チップＩＣ−１１００
試薬キット：ＩＣ−９１０１
測定手順は、装置供給元の指示に従った。ＤＮＡ制限断片の分離結果は、当該装置に接続されたコンピュータのディスプレイ上に表示される。代表的なＤＮＡ制限断片の分離結果を図１１、図２３〜図２５に示す。図１１中上から順に、図中に付記したように、Ｅ２／Ｅ３、Ｅ３／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ４／Ｅ４の各ゲノタイプのＤＮＡ制限断片の分離パターンを示す。同様に図２３〜２５についても、それぞれの結果がいずれのゲノタイプのＤＮＡ制限断片パターンを示すかは図中に付記したとおりである。図１１、図２３は、５０ｂｐの内部標準を用いた例を示し、図２４及び図２５は、１０ｂｐの内部標準を用いた場合を示す。

ｄ）ＡＢＩ３１００
キャピラリー電気泳動に供するサンプルの調製のために、上記ＰＣＲを行うに際し、ＰＣＲ反応混合物中のｄＮＴＰとして、Ｒ６Ｇ，Ｒ１１０で蛍光ラベルされたもの（Applied Biosystems社製）を用いた。その後、上記ａ）のアガロースゲル電気泳動の場合と同様にしてＰＣＲ産物を制限酵素で処理した。各サンプルについて、得られた反応溶液の５μｌを、下記の条件でのＡＢＩ３１００によるＤＮＡ制限断片の分離、検出に供した。
キャピラリー：３１００ＣａｐｉｌｌａｒｙＡｒｒａｙ３６ｃｍ
セパレーションポリマー：３１００ＰＯＰ−６
試薬キット： DNA Sequencing Kit(BigDye Terminator
Ver. 3 Cycle Suquencing Ready Reaction)
測定手順は、装置供給元の指示に従った。ＤＮＡ制限断片の分離結果は、当該装置に接続されたコンピュータのディスプレイ上に表示される。代表的なＤＮＡ制限断片の分離結果を図１２に示す。図中上から順にＥ２／Ｅ３、Ｅ３／Ｅ４、Ｅ４／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ３の各ゲノタイプのＤＮＡ制限断片の分離パターンを示す。

ｅ）比較例
比較例として、非特許文献５に記載される方法に従って、同一検体由来のゲノムＤＮＡからＡｐｏＥ遺伝子の多型領域を増幅し、制限酵素ＨｈａＩを用いてＤＮＡ制限断片を得、上記ａ）〜ｄ）における各ＤＮＡ分離方法（アガロースゲル電気泳動、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００、日立ＳＶ１２１０、ＡＢＩ３１００）によりＤＮＡ制限断片を分離した。アガロースゲル電気泳動法、ＡＢＩ３１００（キャピラリー電気泳動）によっては、有意なＤＮＡ制限断片の分離パターンを得ることはできなかった。Ａｇｉｌｅｎｔ２１００、日立ＳＶ１２１０による代表的なＤＮＡ制限断片の分離結果を、それぞれ図１４、図１５に示す。図１４中上から順に、Ｅ２／Ｅ３、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ３／Ｅ４、Ｅ４／Ｅ４の各ゲノタイプであることが既知のＤＮＡ制限断片の分離パターンを示す。又、図１５中上から順に、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ３／Ｅ４、Ｅ２／Ｅ３、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ３／Ｅ３の各ゲノタイプであることが既知のＤＮＡ制限断片についての結果を示す。

［本実施例と比較例との対比］
ａ）汎用性
本実施例では、本発明に従ってゲノムＤＮＡからＡｐｏＥ遺伝子に特異的なプライマー対、より具体的には、配列番号１及び２の新規プライマー対を用いてＰＣＲ法によりＡｐｏＥ遺伝子の多型領域を増幅する。そして、増幅したＤＮＡ産物を、本発明にて特徴的な２種類の制限酵素の組み合わせ、より具体的にはＡｆｌＩＩＩとＨａｅＩＩとで切断する。これらのプライマー対及び制限酵素を用いることによって、上述のように、従来の制限酵素ＨｈａＩを用いる方法よりも長いＤＮＡ制限断片が出現する。

これによって、本発明によれば、図９から明らかなように、安価で広く用いられているＤＮＡ制限断片の分離方法であるアガロースゲル電気泳動によっても、高解像度にてＡｐｏＥ遺伝子多型をゲノタイピングすることができた。

一方、従来の制限酵素ＨｈａＩを用いる方法によって得たＤＮＡ制限断片は、１００ｂｐ以下と極めて短いため、アガロースゲル電気泳動では、ＤＮＡ制限断片を有意に分離することができなかった（データ示さず。）。

又、図１０、図１１及び図１２から明らかなように、本発明によれば、近年開発されたＤＮＡ分離方法であるＡｇｉｌｅｎｔ２１００、日立ＳＶ１２１０、ＡＢＩ３１００をも好適に用いることができ、良好に分離した各断片長毎のピークが得られ、高解像度にてＡｐｏＥ遺伝子多型をゲノタイピングすることができた。

一方、従来の制限酵素ＨｈａＩを用いる方法によって得たＤＮＡ制限断片は、それぞれ図１４、図１５に示すように、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００、日立ＳＶ１２１０では各断片長毎のピークを十分に分離することができず、ＡｐｏＥ遺伝子多型の各ゲノタイプを判別することはできなかった。又、ＡＢＩ３１００については、有意なＤＮＡ制限断片の分離結果を得ることはできなかった（データ示さず。）。

このように、本発明に係るＡｐｏＥ遺伝子多型の検出方法は、現在使用されている多くの電気泳動法に適用可能であり、極めて汎用性が高い。

更に、本発明は、ＤＮＡ分離方法を電気泳動法に限定するものではない。上述のように、例えば、アガロースゲル電気泳動法は、安価且つ簡便であることから広く用いられており、又他の近年開発された上述のような電気泳動法を利用した種々のＤＮＡ分離方法は極めて迅速、且つ、簡便である等、従来ＤＮＡ分離法として広く用いられている電気泳動法は、本発明を実施するに当たり最も好ましいと思われるが、本発明は他のＤＮＡ分離法、例えば質量分析機（MASS-Spectrometry）等を利用することでも実施可能である。

ｂ）簡便性、迅速性
本発明に従えば、典型的には、アガロースゲル電気泳動を用いる場合で、染色体ＤＮＡをテンプレートにしたＰＣＲから、ＡｐｏＥ遺伝子多型のタイピングの結果が判別するまで約３時間と、非特許文献５に記載される従来の方法に比較して、ゲノタイピングにかかる時間を大幅に短縮することができる。上述の近年開発された種々のＤＮＡ分離方法を用いれば、更に時間を短縮することができる。又、斯かる従来の方法において用いられるポリアクリルアミドゲル電気泳動法に比較して、アガロースゲル電気泳動、その他上記各種のＤＮＡ分離方法は操作が極めて簡便である。

ｃ）正確性
本発明に従って得たＡｐｏＥ遺伝子多型のタイピング結果の正確性を確認するために、本発明に従って上述のようにアガロースゲル電気泳動、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００、日立ＳＶ１２１０、ＡＢＩ３１００によるＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピングに供したものと同一検体からのサンプルについて、従来汎用されてきた非特許文献５に記載の方法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法）に従ってゲノムＤＮＡからＡｐｏＥ遺伝子の多型領域を増幅し、増幅したＤＮＡを制限酵素ＨｈａＩを用いて切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によりＡｐｏＥ遺伝子多型をゲノタイピングした結果との比較を行った。その結果、９６例のサンプルを用いた一致率は１００％であった。

加えて、同一検体からのサンプルについて、ＡＢＩ３１００（Applied Biosystems社製）においてDNA Sequencing Kit (BigDye Terminator Ver. 3 Cycle Suquencing Ready Reaction)を用いたＤＮＡ直接塩基配列決定法によって多型部分の塩基配列の確認を行ったが、塩基配列から決定されたＡｐｏＥ遺伝子多型と、本発明に従って得たタイピング結果とは全例で一致した。

又、日立ＳＶ１２１０によるデータを示す図２４及び図２５において、重複するゲノタイプに関するデータは、別人から得られたサンプルについてのデータを示している。図２４及び図２５から分かるように、本発明によれば、再現性の良好な、正確性、信頼性に富むＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプの判定が可能である。尚、図２６は、図２５中の１：（Ｅ２／２）、４：（Ｅ２／４）、６：（Ｅ３／３）、７：（Ｅ３／４）、１０：（Ｅ２／３）、１１：（Ｅ４／４）と付記されたデータをそれぞれ拡大して示したものである。図２６から分かるように、本発明によれば、ＤＮＡ断片の分離性は良好であり、又、上述のようにしてＤＮＡ断片Ｂ（本実施例では３５ｂｐのＤＮＡ断片）を定量することにより、更に正確性、信頼性の向上したＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプの判定が可能である。

ｄ）大量処理
上述のように、本発明は、近年開発された種々のＤＮＡ分離装置にも適用可能である。例えば、ＰＣＲにおいて蛍光ラベルされたｄＮＴＰを使用することによりＡＢＩ等のキャピラリー電気泳動によってＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピングが可能であり、従って、大量のサンプルを迅速、且つ、自動でタイピングすることができる。又、例えば、日立ＳＶ１２１０のシステムでは、マイクロチップへの泳動ゲルの分注と充填、内部標準マーカー及びサンプルの分注を短時間で行う分注ロボットの使用が可能であり、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピングの高速大量化が可能である。

以上説明したように、本発明によれば、
（Ａ）ＲＦＬＰのＤＮＡ制限断片を検出し易くなる。
（Ｂ）加えて、上記（Ａ）によって検出方法の汎用性が広がり、自動処理化にあいまって高速大量処理化が可能になる。又、機械化、製品化に際しての正確性、信頼性を更に向上させることができる。
（Ｃ）ＤＮＡを直接タイピングすることによって、抗体法（非特許文献９）を用いるようなタンパク質のタイピング法に比較して擬陽性（false-positive）が大幅に減少し、それによってタイピングの正確性を増すことができる。
（Ｄ）例えば、アルツハイマー型痴呆、その他の心血管疾患など、ＡｐｏＥ遺伝子多型が関連する疾患の診断、治療にとって有用な情報となるゲノタイピングという臨床検査を行う上で、上記各点は極めて重要な要素であり、本発明によれば、斯かる有用な情報を正確、且つ、迅速に提供することができる。

図１は、本発明に従うＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピングの概念図である。図２は、本発明に従うプライマー対の設定位置を説明するための模式図である。図３は、本発明に従うプライマー対の一例を用いた場合のＤＮＡ制限断片の長さを説明するための模式図である。図４は、本発明に従うプライマー対の一例を用いた場合の各ＡｐｏＥ遺伝子多型に対する電気泳動パターンの模式図である。図５は、本発明に従うプライマー対の他の例を用いた場合のＤＮＡ制限断片の長さを説明するための模式図である。図６は、本発明に従うプライマー対の他の例を用いた場合の各ＡｐｏＥ遺伝子多型に対する電気泳動パターンの模式図である。図７は、本発明に従うプライマー対の更に他の例を用いた場合のＤＮＡ制限断片の長さを説明するための模式図である。図８は、本発明に従うプライマー対の更に他の例を用いた場合の各ＡｐｏＥ遺伝子多型に対する電気泳動パターンの模式図である。図９は、本発明に従ってＡｐｏＥ遺伝子の制限断片をアガロースゲル電気泳動により分離した結果を示す図である。図１０は、本発明に従ってＡｐｏＥ遺伝子の制限断片をＡｇｉｌｅｎｔ２１００により分離した結果を示す図である。図１１は、本発明に従ってＡｐｏＥ遺伝子の制限断片を日立ＳＶ１２１０により分離した結果を示す図である。図１２は、本発明に従ってＡｐｏＥ遺伝子の制限断片をＡＢＩ３１００により分離した結果を示す図である。図１３は、制限酵素ＨｈａＩを用いた従来のＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピングの概念図である。図１４は、従来の方法に従って制限酵素ＨｈａＩを用いて得たＡｐｏＥ遺伝子の制限断片をＡｇｉｌｅｎｔ２１００により分離した結果を示す図である。図１５は、従来の方法に従って制限酵素ＨｈａＩを用いて得たＡｐｏＥ遺伝子の制限断片を日立ＳＶ１２１０により分離した結果を示す図である。図１６は、ヘテロ二本鎖の生成を説明するための模式図である。図１７は、ヘテロ二本鎖の生成を考慮した、本発明に従うゲノタイピングの概念図である。図１８は、ヘテロ接合体についてヘテロ接合体が生成した場合の各ＤＮＡ断片の生成量の推定方法の他の例（３５ｂｐのＤＮＡ断片の定量に用いる例）を説明するための模式図である。図１９は、ホモ接合体についてヘテロ接合体が生成した場合の各ＤＮＡ断片の生成量の推定方法の他の例（３５ｂｐのＤＮＡ断片の定量に用いる例）を説明するための模式図である。図２０は、ヘテロ二本鎖の定量について説明するための各ゲノタイプでのＤＮＡ制限断片の分離パターンを示す模式図である。図２１は、ヘテロ接合体についてヘテロ接合体が生成した場合の各ＤＮＡ断片の生成量の推定方法の一例（８０ｂｐのＤＮＡ断片の定量に用いる例）を説明するための模式図である。図２２は、ホモ接合体についてヘテロ接合体が生成した場合の各ＤＮＡ断片の生成量の推定方法の一例（８０ｂｐのＤＮＡ断片の定量に用いる例）を説明するための模式図である。図２３は、本発明に従ってＡｐｏＥ遺伝子の制限断片を日立ＳＶ１２１０により分離した結果を示す図である。図２４は、本発明に従ってＡｐｏＥ遺伝子の制限断片を日立ＳＶ１２１０により分離した結果を示す図である。図２５は、本発明に従ってＡｐｏＥ遺伝子の制限断片を日立ＳＶ１２１０により分離した結果を示す図である。図２６は、図５に示す一部のデータを拡大して示した図である。図２７は、制限酵素ＡｆｌＩＩＩ及びＨａｅＩＩを用いた従来のＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピングの概念図である。

Claims

アポリポタンパクＥ遺伝子に特異的なプライマー対を用いてＤＮＡを増幅する段階、
増幅したＤＮＡを、アポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１１２の一塩基多型部位を認識配列に含む第１の制限酵素と、アポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１５８の一塩基多型部位を認識配列に含む第２の制限酵素と、を用いて、前記コドン１１２の一塩基多型部位を含む認識配列での第１の切断位置及び前記コドン１５８の一塩基多型部位を含む認識配列での第２の切断位置で切断する段階、
切断したＤＮＡ断片を分離する段階、
分離されたＤＮＡ断片を検出する段階、
を含み、
前記プライマー対及び前記第１、第２の制限酵素は、それぞれのアポリポタンパクＥ遺伝子多型に特異的なそれぞれ１００ｂｐ以上のＤＮＡ断片を生成し得るように選択され、前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記第１の切断位置より、６０ｂｐ以上、１３６ｂｐ以下の上流の位置に５’末端が設定され、前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第２の切断位置より７０ｂｐ以上の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とするアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
前記第１、第２の制限酵素はいずれも、前記コドン１１２の一塩基多型部位を含む認識配列と、前記コドン１５８の一塩基多型部位を含む認識配列との間に切断位置を持たないことを特徴とする請求項１のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
前記第１の制限酵素は前記増幅したＤＮＡにおいてアポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１１２の一塩基多型部位を含む認識配列より上流に切断位置を持たず、前記第２の制限酵素は前記増幅したＤＮＡにおいてアポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１５８の一塩基多型部位を含む認識配列より上流に切断位置を持たないことを特徴とする請求項２のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
前記第１の制限酵素は塩基配列ＡＣＲＹＧＴ（ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ）を認識して切断し、前記第２の制限酵素は塩基配列ＲＧＣＧＣＹ（ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ）を認識して切断することを特徴とする請求項１、２又は３のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
前記第１の制限酵素はＡｆｌＩＩＩ、前記第２の制限酵素はＨａｅＩＩであることを特徴とする請求項４のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
アポリポタンパクＥ遺伝子に特異的なプライマー対を用いてＤＮＡを増幅する段階、
増幅したＤＮＡを２種類の制限酵素を用いてアポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１１２の一塩基多型部位を含む認識配列での第１の切断位置及びアポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１５８の一塩基多型部位を含む認識配列での第２の切断位置で切断する段階、
切断したＤＮＡ断片を分離する段階、
分離されたＤＮＡ断片を検出する段階、
を含み、
前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記第１の切断位置より、６０ｂｐ以上、１３６ｂｐ以下の上流の位置に５’末端が設定され、前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第２の切断位置より７０ｂｐ以上の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とするアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
前記２種類の制限酵素のうち一方は塩基配列ＡＣＲＹＧＴ（ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ）を認識して切断し、他方は塩基配列ＲＧＣＧＣＹ（ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ）を認識して切断することを特徴とする請求項６のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
前記２種類の制限酵素は、ＡｆｌＩＩＩ及びＨａｅＩＩであることを特徴とする請求項７のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
それぞれのアポリポタンパクＥ遺伝子多型に特異的なそれぞれ１００ｂｐ以上のＤＮＡ断片が生成されることを特徴とする請求項６、７又は８のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記第１の切断位置より９０ｂｐ以上の上流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項１〜９のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記第１の切断位置より１００ｂｐ以上の上流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記第１の切断位置より１２０ｂｐ以下の上流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第２の切断位置より２０２ｂｐ以下の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第２の切断位置より１００ｂｐ以上の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項１〜１３のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第２の切断位置より１８５ｂｐ以下の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第２の切断位置より１５６ｂｐ以下の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
前記プライマー対の各プライマーは、それぞれ下記の塩基配列、
ＡＡＴＣＧＧＡＡＣＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡＡＣＴＧ（配列番号１）
ＧＣＣＣＧＣＡＣＧＣＧＧＣＣＣＴＧＴＴＣ（配列番号２）
を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜１６のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
切断したＤＮＡ断片を電気泳動で分離することを特徴とする請求項１〜１７のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
請求項１〜１８のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法により検出したＤＮＡ断片長の存否の組み合わせからアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプを判定することを特徴とするアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法。
前記第１の切断位置より上流の配列Ａのみを含むＤＮＡ断片を断片Ａ、前記第２の切断位置より下流の配列Ｂのみを含むＤＮＡ断片を断片Ｂ、前記第１の切断位置と前記第２の切断位置との間の配列Ｃのみを含むＤＮＡ断片を断片Ｃ、前記配列Ａ及びＣを含むＤＮＡ断片を断片Ｄ、前記配列Ｂ及びＣを含むＤＮＡ断片を断片Ｅとしたとき、断片Ｃ、断片Ｄ及び断片Ｅの存否をアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプの判定に用い、
（ａ）断片Ｅのみの存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ２を判定し、
（ｂ）断片Ｃのみの存在によりゲノタイプＥ３／Ｅ３を判定し、
（ｃ）断片Ｄのみの存在によりゲノタイプＥ４／Ｅ４を判定し、
（ｄ）断片Ｅ及び断片Ｃのみの存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ３を判定し、
（ｅ）断片Ｄ及び断片Ｅのみの存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ４を判定し、
（ｆ）断片Ｄ及び断片Ｃのみの存在によりゲノタイプＥ３／Ｅ４を判定する、
ことを特徴とする請求項１９のアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法。
前記第１の切断位置より上流の配列Ａのみを含むＤＮＡ断片を断片Ａ、前記第２の切断位置より下流の配列Ｂのみを含むＤＮＡ断片を断片Ｂ、前記第１の切断位置と前記第２の切断位置との間の配列Ｃのみを含むＤＮＡ断片を断片Ｃ、前記配列Ａ及びＣを含むＤＮＡ断片を断片Ｄ、前記配列Ｂ及びＣを含むＤＮＡ断片を断片Ｅとしたとき、断片Ａ、断片Ｃ、断片Ｄ及び断片Ｅの存否をアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプの判定に用い、
（ａ）断片Ｅ及び断片Ａのみの存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ２を判定し、
（ｂ）断片Ｃ及び断片Ａのみの存在によりゲノタイプＥ３／Ｅ３を判定し、
（ｃ）断片Ｄの存在及び断片Ａの非存在によりゲノタイプＥ４／Ｅ４を判定し、
（ｄ）断片Ｅ、断片Ｃ及び断片Ａのみの存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ３を判定し、
（ｅ）断片Ｄ、断片Ｅ及び断片Ａのみの存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ４を判定し、
（ｆ）断片Ｄ、断片Ｃ及び断片Ａのみの存在によりゲノタイプＥ３／Ｅ４を判定する、
ことを特徴とする請求項１９のアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法。
更に、前記配列Ａ、配列Ｂ及び配列Ｃを含むヘテロ二本鎖の存否をアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプの判定に用い、該ヘテロ二本鎖の存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ４を判定することを特徴とする請求項２０又は２１のアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法。
更に、アポリポタンパクＥ遺伝子多型Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成する断片Ｂの存在により、前記切断段階における有効な切断反応の存在を判断し、該有効な切断の存在を判断した場合に、ＤＮＡ断片長の存否の組み合わせからアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプを判定することを特徴とする請求項２０、２１又は２２のアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法。
更に、アポリポタンパクＥ遺伝子多型Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成する断片Ｂを定量した結果に基づいて、断片Ａ、断片Ｃ、断片Ｄ及び／又は断片Ｅの存否を判断することを特徴とする請求項２０〜２３のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法。
更に、前記（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）の各場合の判定に際し、アポリポタンパクＥ遺伝子多型Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成する断片Ｂを定量した結果に基づいて求めたヘテロ二本鎖の生成割合に基づいて、断片Ａ、断片Ｃ、断片Ｄ及び／又は断片Ｅの存否を判断することを特徴とする請求項２０又は２１のアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法。
前記第１の切断位置より上流の配列Ａのみを含むＤＮＡ断片を断片Ａとしたとき、断片Ａの存否をアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプの判定に用い、断片Ａの非存在によりゲノタイプＥ４／Ｅ４を判定することを特徴とする請求項１９のアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法。
アポリポタンパクＥ遺伝子の制限酵素切断断片を検出することでアポリポタンパクＥ遺伝子多型を検出するために用い得る、アポリポタンパクＥ遺伝子増幅用のプライマー対を備えるアポリポタンパクＥ遺伝子多型の検出試薬であって、前記プライマー対のうち上流側プライマーは、アポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１１２の一塩基多型部位を含む認識配列での第１の切断位置より、６０ｂｐ以上、１３６ｂｐ以下の上流の位置に５’末端が設定され、前記プライマー対のうち下流側プライマーは、アポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１５８の一塩基多型部位を含む認識配列での第２の切断位置より７０ｂｐ以上の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とするアポリポタンパクＥ遺伝子多型の検出試薬。
前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記第１の切断位置より９０ｂｐ以上の上流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項２７のアポリポタンパクＥ遺伝子多型の検出試薬。
前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記第１の切断位置より１００ｂｐ以上の上流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項２７又は２８のアポリポタンパクＥ遺伝子多型の検出試薬。
前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記第１の切断位置より１２０ｂｐ以下の上流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項２７、２８又は２９のアポリポタンパクＥ遺伝子多型の検出試薬。
前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第２の切断位置より２０２ｂｐ以下の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項２７〜３０のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型の検出試薬。
前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第２の切断位置より１００ｂｐ以上の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項２７〜３１のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型の検出試薬。
前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第２の切断位置より１８５ｂｐ以下の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項２７〜３２のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型の検出試薬。
前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第２の切断位置より１５６ｂｐ以下の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項２７〜３３のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型の検出試薬。
前記プライマー対の各プライマーは、それぞれ下記の塩基配列、
ＡＡＴＣＧＧＡＡＣＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡＡＣＴＧ（配列番号１）
ＧＣＣＣＧＣＡＣＧＣＧＧＣＣＣＴＧＴＴＣ（配列番号２）
を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２７〜３４のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型の検出試薬。
更に、塩基配列ＡＣＲＹＧＴ（ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ）を認識して切断する制限酵素及び塩基配列ＲＧＣＧＣＹ（ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ）を認識して切断する制限酵素と組み合わせて成ることを特徴とする請求項２７〜３５のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型の検出試薬。
更に、制限酵素ＡｆｌＩＩＩ及びＨａｅＩＩと組み合わされて成ることを特徴とする請求項２７〜３５のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型の検出試薬。