JP4677646B2 - アポリポタンパクｅ遺伝子多型検出方法、アポリポタンパクｅ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法及び試薬 - Google Patents

Description

本発明は、アポリポタンパクＥの遺伝子多型検出方法及びそれに用いる試薬に関するものであり、より詳細には、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）法を利用したヒト・アポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプを判定（ゲノタイピング）するのに有用なアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法、アポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法及びそれに用いる試薬に関するものである。

アポリポタンパク（以下「Ａｐｏ」という。）Ｅは、血中コレステロールの運搬に重要な役割を果たす血漿タンパクであり、主要なアイソフォームとして、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４がある。ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４のそれぞれをコードする遺伝子ε２、ε３、ε４は第１９染色体上に存在する。これらＡｐｏＥ遺伝子多型（以下、単にそれぞれ「Ｅ２」、「Ｅ３」、「Ｅ４」という。）の一つであるＥ４は、アルツハイマー病及び心血管疾患の非常に強い危険因子であることが知られており、現在までに多くの報告がなされ、ほぼ確立した知見になっている（例えば、非特許文献１〜５参照。）。

例えば、ＡｐｏＥ遺伝子のＥ４型を持つ人では、アルツハイマー病の発症率が持たない人に比較して１０倍以上になることが知られており、一見メンデルの法則のような遺伝的家族内集積を示す場合があるほどである。又、高齢者のアルツハイマー型痴呆非罹患群では、ＡｐｏＥ遺伝子のＥ４型を持つ固体の頻度は非常に低いところからも、この多型がこの疾患の大きな危険因子であることが考えられる。

現在では、ＡｐｏＥ遺伝子多型は臨床検査にも応用されており、アルツハイマー型痴呆或いは心血管疾患の危険因子として、個々の患者の診断、治療を行う上で重要な臨床的情報となっている。

従来、ＡｐｏＥ遺伝子多型を判別する実験的手法がいくつか報告されている。例えば、下記のものが挙げられる。非特許文献５には、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism：ＲＦＬＰ）によるタイピング法が記載されている。この方法の基本的な手法は、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction：ＰＣＲ）によって、ゲノタイピングを行なう目的の遺伝子領域であるＡｐｏＥ特定の領域を増幅し、そのＲＦＬＰをポリアクリルアミドゲル電気泳動（Polyacrylamide Electrophoresis）による泳動パターンでゲノタイピングするというものである。この方法は、現在でも多くの研究室等で用いられている方法である。

この方法では、先ず、ヒト・染色体ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）を血液より抽出した後、ＡｐｏＥ遺伝子に特異的な次のプライマー対、
Ｆ４（５’−ＡＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＡＣ−３’）
Ｆ６（５’−ＴＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＧＧＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＡ−３’）
を用いてＰＣＲで増幅し、増幅したＤＮＡを制限酵素ＨｈａＩによって断片化する。

図１２は、この方法によるゲノタイピングの概念図である。ＡｐｏＥ遺伝子多型は、それぞれ１つのアミノ酸の置換により生じる。即ち、１１２番目、１５８番目のアミノ酸が、それぞれＥ２ではシステイン、システイン、Ｅ３ではシステイン、アルギニン、Ｅ４ではアルギニン、アルギニンである。制限酵素ＨｈａＩは、塩基配列ＧＣＧＣを認識するため、同図に示すように、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の多型により、制限酵素ＨｈａＩが認識してＤＮＡを切断する部位の組み合わせが異なる。つまり、制限酵素ＨｈａＩは、１１２番目アルギニン（Ｅ４）及び１５８番目のアルギニン（Ｅ３、Ｅ４）をコードするコドンの領域にわたるＧＣＧＣを認識して切断するが、１１２番目のシステイン（Ｅ２、Ｅ３）及び１５８番目のシステイン（Ｅ２）をコードするコドンの領域にわたるＧＴＧＣは切断しない（図中、四角で囲んだＴ又はＣはそれぞれのコドンのはじめの塩基を示す。）。従って、それぞれのＡｐｏＥ遺伝子多型に特異的な長さのＤＮＡ制限酵素切断断片（以下「ＤＮＡ制限断片」という。）が得られるので、各ＡｐｏＥ遺伝子多型の判別が可能となる。

ヒトはアリルを２つ持つため、いずれかのＡｐｏＥ遺伝子多型の２つの組合せを持つことになる。即ち、ＡｐｏＥ遺伝子多型のアリルの組合せのパターン（遺伝子型：ゲノタイプ）には、図１２に示すように、Ｅ２／Ｅ２、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ４／Ｅ４、Ｅ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ４がある。

ホモ接合体について、Ｅ２／Ｅ２では、制限酵素ＨｈａＩでの切断によって８３ｂｐ（塩基対）及び９１ｂｐの２種類の長さのＤＮＡ制限断片が得られるが、Ｅ３／Ｅ３では、３５ｂｐ、４８ｂｐ及び９１ｂｐ、Ｅ４／Ｅ４では１９ｂｐ、３５ｂｐ、４８ｂｐ及び７２ｂｐのＤＮＡ制限断片が得られる。同様に、ヘテロ接合体であるＥ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ４についても、図１２に示すようにそれぞれ異なったＤＮＡ制限断片の組合せが得られる。従って、制限酵素ＨｈａＩによる切断によって得られたそれぞれの長さのＤＮＡ制限断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分離することで、ＡｐｏＥ遺伝子多型のタイピングが可能になる。尚、１９ｂｐ以下の長さのＤＮＡ制限断片はポリアクリルアミドゲル電気泳動では検出されない。

非特許文献５に記載される上述の方法がＡｐｏＥ遺伝子多型をタイピングした最初の報告である。その後、現在までに、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピング方法については多数の報告がある。しかし、それらの多くは、基本的に最初の方法の変法である。

しかしながら、非特許文献５に記載の方法において、制限酵素ＨｈａＩで得られるＤＮＡ制限断片の長さは１００ｂｐ未満と極めて短いため、実験室において通常用いられ、且つ、安価なＤＮＡ分離方法であるアガロースゲル電気泳動法（Agarose Gel Electrophoresis）では、解像度の低さのため分離が不可能であった。つまり、より短いＤＮＡ断片を分離するためには、ゲルをより高濃度にする必要があるが、アガロースゲルでは４％程度が限界であり、この濃度では上記１００ｂｐより短い短鎖ＤＮＡを高解像度にて分離することはできない。そのため、従来、より操作が煩雑で、時間を要するポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いる必要があった。

又、近年、日立マイクロチップ電気泳動解析システムＳＶ１２１０ コスモアイ（以下「日立ＳＶ１２１０」という。）（日立ハイテクノロジーズ社製）等のＤＮＡ分離装置が開発されている。斯かるＤＮＡ分離装置は、基本的には電気泳動法を利用しているが、迅速に大量のサンプルを（順次に若しくは同時に）処理することができ、又、分析の自動化に対応可能である。この他、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００ バイオアナライザ（Agilent 2100 BioAnalyzer：以下「Ａｇｉｌｅｎｔ２１００」という。）（Agilent Technologies社製）の電気泳動用セット、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００（或いは３７００） ジェネティック アナライザ（以下「ＡＢＩ３１００」、或いは「ＡＢＩ３７００」という。）（Applied Biosystems社製）等のＤＮＡ分離装置がある。

しかし、本発明者らの検討によれば、これら近年開発された高解像度の種々のＤＮＡ分離方法を用いる場合にも、非特許文献５に記載されるように制限酵素ＨｈａＩで切断したＤＮＡ制限断片では、正確なゲノタイピングを行うには、満足のゆく解像度を得ることができなかった。

非特許文献６は、ゲノムＤＮＡから下記のプライマー対、
Ｆ５’−ＴＣＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＧＣＡ
Ｒ５’−ＧＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＡＣＴＧＣＣＡ
を用いてＰＣＲにて２１８ｂｐのＡｐｏＥ遺伝子特異的な領域を増幅し、２種類の制限酵素ＡｆｌＩＩＩ、ＨａｅＩＩを用いて断片化する方法を開示する。この方法によれば、それぞれＥ３、Ｅ２、Ｅ４に特異的な１４５ｂｐ、１６８ｂｐ、１９５ｂｐといった長鎖のＤＮＡ制限断片が得られる。そして、非特許文献６では、このＤＮＡ断片を４％アガロースゲル電気泳動で分離して、ＤＮＡ制限断片の長さからＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピングを行っている。

しかしながら、本発明者の検討によれば、詳しくは後述するように、斯かる方法は、機械化、製品化を考慮すると、正確性、信頼性の点で満足のゆくものではなかった。

その他に、抗体を用いて変異したタンパク質を同定する方法により間接的にゲノタイピングを行う方法が開発されている。この方法は、現在臨床検査業務で一般的に使用されている。しかしながら、斯かる抗体法を用いた生化学的な解析手法は、遺伝子を直接タイピングする方法ではなく、タンパク質の種類を判別する手法を用いているため、擬陽性（false-positive）が多く正確さに欠けるものである。更に、この方法は、実験に用いる試料の作成に時間がかかり、簡便さや、経済性の面で問題がある。

このように、より長鎖のＤＮＡ制限断片を得て、より高解像度で正確にＡｐｏＥ遺伝子多型をゲノタイピングをし得るＡｐｏＥ遺伝子多型の検出方法、それに用いる試薬に対する要求がある。又、自動化が可能で迅速、且つ、簡便に大量のサンプルについてＡｐｏＥ遺伝子多型をゲノタイピングし得ることも求められている。更に、機械化、製品化に際しての正確性、信頼性を更に高めることが求められている。
Corder E.H., Saunders A.M., Strittmatter W.J., Schmechel D.E., Gaskell P.C., Small G.W., Roses A.D., Haines J.L., Pericak-Vance M.A. Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer's disease in late onset families. Science 1993 Aug 13;261(5123):921-3 Ueki A., Kawano M., Namba Y., Kawakami M., Ikeda K. A high frequency of apolipoprotein E4 isoprotein in Japanese patients with late-onset nonfamilial Alzheimer's disease. Neurosci Lett 1993 Dec 12;163(2):166-8 Saunders A. M., Strittmatter W. J., Schmechel D., St. George-Hyslop P. H., Pericak-Vance M. A., Joo S. H., Rosi B. L., Gusella J. F., Crapper-MacLachlan D. R., Alberts M. J., Hulette C., Crain B., Goldgaber D., Roses A. D. Association of apolipoprotein E allele E4 with late-onset familial and sporadic Alzheimer's disease. Neurology 1993;43:1467-1472. Eichner J.E., Dunn S.T., Perveen G., Thompson D.M., Stewart K.E., Stroehla B.C. Apolipoprotein E polymorphism and cardiovascular disease: a HuGE review. Am J Epidemiol 2002 Mar 15;155(6):487-95 James E. H. and Daniel T. V. Restriction of human apolipoprotein E by gene amplification and cleavage with HhaＩ. J. Lipid. Res .1990; 31: 545-548. Zivelin, A., Rosenberg, N., Peretz, H., Amit, Y., Kornbrot, N., and Seligsohn, U., Improved Method for Genotyping Apolipoprotein E Polymorphisms by a PCR-Based Assay Simultaneously Utilizing Two Distinct Restriction Enzymes. Clinical Chemistry, 43, No9, 1657-1659, 1997

従って、本発明の目的は、正確、迅速、且つ、簡便にＡｐｏＥ遺伝子多型を検出し、ゲノタイプを判定することを可能とするＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法及び試薬を提供することである。

本発明の他の目的は、安価、簡便なＤＮＡ分離方法を用いてＡｐｏＥ遺伝子多型を検出し、ゲノタイプを判定することを可能とするＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法及び試薬を提供することである。

本発明の他の目的は、様々なＤＮＡ分離方法の利用を可能とし、高速、且つ、大量処理化を可能とするＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法及び試薬を提供することである。

本発明の他の目的は、正確性、信頼性の向上したＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法及び試薬を提供することである。

本発明の他の目的は、機械化、製品化に際しての正確性、信頼性を更に向上させることができるＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法及び試薬を提供することである。

本発明の更に他の目的は、アルツハイマー病、心血管疾患など、ＡｐｏＥ遺伝子多型が関連する疾患の診断、治療にとって有用な情報となるＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプの判別を正確、且つ、迅速に行うことのできるＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法及び試薬を提供することである。

上記目的は本発明に係るアポリポタンパク遺伝子多型検出方法、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法及び試薬にて達成される。要約すれば、本発明は、アポリポタンパクＥ遺伝子に特異的なプライマー対を用いてＤＮＡを増幅する段階；増幅されたＤＮＡを、アポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１１２の一塩基多型部位を認識配列に含む第１の制限酵素と、アポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１５８の一塩基多型部位を認識配列に含む第２の制限酵素と、を用いて切断する段階；切断されたＤＮＡ断片を分離する段階；分離されたＤＮＡ断片を検出する段階；を有し、前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記コドン１１２の一塩基多型部位を含む前記第１の制限酵素の認識配列より上流側に前記第１の制限酵素の認識配列を導入する、少なくとも１塩基の変異を導入された配列であって、前記コドン１１２の一塩基多型部位を含む前記第１の制限酵素の認識配列での切断位置より４５ｂｐ以上、１３６ｂｐ以下の上流の位置に前記第１の制限酵素による切断位置が配置されるように設定される配列を有し、且つ、該上流側プライマーは、前記導入される前記第１の制限酵素の認識配列での切断位置よりも４５ｂｐ以上の上流の位置に５’末端が設定され、前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記コドン１５８の一塩基多型部位を含む前記第２の制限酵素の認識配列での切断位置より７０ｂｐ以上の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とするアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法である。

本発明の他の態様によると、第１の本発明のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法により検出されたＤＮＡ断片の存否の組み合わせからアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプを判定するアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法が提供される。

本発明の他の態様によると、アポリポタンパクＥ遺伝子に特異的なプライマー対を用いてＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡを、アポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１１２の一塩基多型部位を認識配列に含む第１の制限酵素と、アポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１５８の一塩基多型部位を認識配列に含む第２の制限酵素と、を用いて切断することを含むアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法に使用するための、前記プライマー対を備えるアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出用試薬であって、前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記コドン１１２の一塩基多型部位を含む前記第１の制限酵素の認識配列より上流側に前記第１の制限酵素の認識配列を導入する、少なくとも１塩基の変異を導入された配列であって、前記コドン１１２の一塩基多型部位を含む前記第１の制限酵素の認識配列での切断位置より４５ｂｐ以上、１３６ｂｐ以下の上流の位置に前記第１の制限酵素による切断位置が配置されるように設定される配列を有し、且つ、該上流側プライマーは、前記導入される前記第１の制限酵素の認識配列での切断位置よりも４５ｂｐ以上の上流の位置に５’末端が設定され、前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記コドン１５８の一塩基多型部位を含む前記第２の制限酵素の認識配列での切断位置より７０ｂｐ以上の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とするアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出用試薬が提供される。

尚、本明細書において、遺伝子配列における位置は、５’末端から３’末端方向に一本鎖でみていうものであり、その上流とは該一本鎖でみたときの５’末端側、下流とは３’末端側をいう。

又、ＡｐｏＥ遺伝子について、いずれかの遺伝子多型において制限酵素による切断位置（或いは認識配列）がある場合、その位置に相当する他の遺伝子多型における配列上の位置については、切断されない（或いは認識されない）場合についても切断位置（或いは認識配列）の語を用いて説明する。

本発明によれば、正確、迅速、且つ、簡便にＡｐｏＥ遺伝子多型を検出することができる。又、本発明によれば、安価、簡便なＤＮＡ分離方法を用いてＡｐｏＥ遺伝子多型を検出することが可能となる。又、本発明によれば、様々なＤＮＡ分離方法の利用を可能とし、高速、且つ、大量化が可能となる。又、本発明によれば、ＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法及び試薬の正確性、信頼性を向上させることができる。機械化、製品化に際しての正確性、信頼性を更に向上させることができる。更に、本発明によれば、アルツハイマー病、血管疾患等、ＡｐｏＥ遺伝子多型が関連する疾患の診断、治療にとって有用な情報となるＡｐｏＥ遺伝子のタイピングを正確、且つ、迅速に行うことができる。

以下、本発明に係るアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法及び試薬を図面に則して更に詳しく説明する。

本発明に係るアポリポタンパクＥ（ＡｐｏＥ）遺伝子多型検出方法は、ＡｐｏＥ遺伝子に特異的なプライマー対を用いてＰＣＲにより目的のＤＮＡ領域を増幅し、増幅されたＤＮＡを所定の制限酵素を用いて切断し、切断したＤＮＡ制限断片を分離し、分離されたＤＮＡ断片を検出する各段階を含む。

ＡｐｏＥ遺伝子に特異的なプライマー対は、ゲノムＤＮＡをテンプレート（鋳型）として、ＡｐｏＥ遺伝子の２箇所の一塩基多型部位、即ち、ＡｐｏＥの１１２番目のアミノ酸をコードするＡｐｏＥ遺伝子領域（以下「コドン１１２」という。）、ＡｐｏＥの１５８番目のアミノ酸をコードするＡｐｏＥ遺伝子領域（以下「コドン１５８」という。）を挟んだ所定領域（以下「多型領域」という。）のＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅するように設計されたオリゴヌクレオチド対（プライマー対）である。プライマー対の一方は、５’末端から３’末端方向に一本鎖でみて、上記ＡｐｏＥ遺伝子の多型領域の上流側にハイブリダイズ可能な適当な長さのオリゴヌクレオチドで、他方は同多型領域の下流側の相補鎖にハイブリダイズ可能な適当な長さのオリゴヌクレオチドである。これらプライマーは、通常通り、当業者には周知のプライマーとしての好適条件、例えば、標的遺伝子に対する特異性が良好であること、２つのプライマーのＴｍが同程度となること、又増幅効率が良好であることなどを考慮して設計される。

増幅したＤＮＡ産物を切断する所定の制限酵素は、ＡｐｏＥ遺伝子多型間の遺伝子変異で認識部位が出現又は消失するもの、即ち、いずれかのＡｐｏＥ遺伝子多型の一塩基多型部位が認識配列内に存在するものである。特に、この制限酵素は、切断後のＤＮＡ制限断片が典型的にはアガロースゲル電気泳動法によって十分な解像度にて分離可能な長さを有し得るものである。本発明では、ＡｐｏＥ遺伝子のコドン１１２の一塩基多型部位を認識配列に含む第１の酵素と、ＡｐｏＥ遺伝子のコドン１５８の一塩基多型部位を認識配列に含む第２の制限酵素とを用いる。以下、制限酵素、プライマー対についてより詳しく説明する。

（制限酵素）
本発明にて用いることが可能である制限酵素は下記の条件を満たす。

（１）第１の制限酵素は、ＡｐｏＥ遺伝子のコドン１１２の一塩基配列多型部位を含む認識配列をもち、切断されるか切断されないかが該一塩基多型によって決定するもの。認識配列について上記の条件を満たせば、切断される部位はコドン１１２から離れていても良い。

（２）第２の制限酵素は、ＡｐｏＥ遺伝子のコドン１５８の一塩基配列多型部位を含む認識配列をもち、切断されるか切断されないかが、該一塩基多型によって決定するもの。認識配列について上記の条件を満たせば、切断される部位はコドン１５８から離れていても良い。

（３）ＡｐｏＥ遺伝子の多型領域（ＡｐｏＥ遺伝子の２つの一塩基多型部位を含む領域）を含む増幅された所定のＤＮＡ制限断片を上記第１、第２の制限酵素を用いて切断することにより得られるＤＮＡ断片が、ＡｐｏＥ遺伝子多型の判定に利用可能となるもの、即ち、それぞれのＡｐｏＥ遺伝子多型を特定可能な、特異的な少なくとも１つのＤＮＡ制限断片若しくは少なくとも１つのＤＮＡ制限断片の組合せ（或いは電気泳動によって分離することによって得られる流出パターン）が得られるもの。

（４）それぞれのＡｐｏＥ遺伝子多型が特定可能な、少なくとも１つの特異的なＤＮＡ制限断片若しくは少なくとも１つの特異的なＤＮＡ断片の組合せを構成するＤＮＡ制限断片の分離性が良好であること、好ましくは、該ＤＮＡ制限断片が実質的に１００ｂｐ以上になるもの。尚、ＤＮＡ制限断片長は、ＡｐｏＥ遺伝子の多型領域（ＡｐｏＥ遺伝子の２つの一塩基多型部位を含む領域）に用いられる所定のプライマーとの関係で許容される最長長さ以下となる。

（５）更に、第１、第２の制限酵素は、認識配列或いは切断部位が、ＡｐｏＥ遺伝子のコドン１１２の一塩基多型部位を含む認識配列とコドン１５８の一塩基多型部位を含む認識配列との間には存在しないものであることが望ましい。

本発明の好ましい一実施態様では、増幅したＤＮＡ産物を切断する第１、第２の制限酵素としての２種類の制限酵素として、ＡｆｌＩＩＩとＨａｅＩＩとの組み合わせを用いる。これら制限酵素の組み合わせを用いることにより、増幅されたＤＮＡに関し、２種類の制限酵素のいずれか一方の制限酵素のみによる切断、及び両方の制限酵素による切断によって、いずれかのアポリポタンパクＥ遺伝子多型に帰属させ得る１００ｂｐ以上のＤＮＡ断片が生成する。

図３に示すように、制限酵素ＡｆｌＩＩＩは、塩基配列ＡＣＲＹＧＴ（ＲはＡ又はＧ，ＹはＣ又はＴ）を認識する。又、制限酵素ＨａｅＩＩは、塩基配列ＲＧＣＧＣＹ（ＲはＡ又はＧ，ＹはＣ又はＴ）を認識する。即ち、制限酵素ＡｆｌＩＩＩは、１１２番目のシステイン（Ｅ２、Ｅ３）をコードするコドンの領域にわたるＡＣＧＴＧＴを認識して切断するが、１１２番目のアルギニン（Ｅ４）をコードするコドンの領域にわたるＡＣＧＴＧＣは切断しない。又、制限酵素ＨａｅＩＩは、１５８番目のアルギニン（Ｅ３、Ｅ４）をコードするコドンの領域にわたるＡＧＣＧＣＣを認識して切断するが、１５８番目のシステイン（Ｅ２）をコードするコドンの領域にわたるＡＧＴＧＣＣは認識せず、切断しない（図中、四角で囲んだＴ又はＣはそれぞれのコドンのはじめの塩基を示す。）。つまり、Ｅ２では、コドン１５８の一塩基多型部位を含むＨａｅＩＩの認識配列が消失し、Ｅ４では、コドン１１２の一塩基多型部位を含むＡｆｌＩＩＩの認識配列が消失する。

これにより、これらの制限酵素ＡｆｌＩＩＩ、ＨａｅＩＩを用いて増幅されたＤＮＡを断片化すると、Ｅ３では、コドン１１２の一塩基多型部位を含む切断位置（以下「第１切断位置」という。）とコドン１５８の一塩基多型部位を含む切断位置（以下「第２切断位置」という。）との間の配列（図中Ｂ）のみを含む特異的なＤＮＡ断片Ｂ（＝１４５ｂｐ）が生成する。Ｅ２では、第１切断位置から第２切断位置より下流に位置する端部までの配列（図中Ｄ）を含む特異的なＤＮＡ断片Ｄが生成する。又、Ｅ４では、第２の切断位置から第１の切断位置より上流に位置する端部までの配列（図中Ｃ）を含む特異的なＤＮＡ断片Ｃを生成する。従って、詳しくは後述するように、適切なプライマーを設計することにより、図３中に示すように、Ｅ２／Ｅ２、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ４／Ｅ４、Ｅ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ４の６種類のゲノタイプを明瞭に判定することができる。

図１２に示すように、非特許文献５に開示される従来の方法においては、制限酵素ＨｈａＩは、コドン１１２、１５８の一塩基多型部位を含む切断位置以外（それぞれの上流側）に他の多くの切断位置を持つ。これに対して、ＡｆｌＩＩＩは、コドン１１２の一塩基多型部位を含む切断位置より上流及び下流に他の切断位置を持たず、又ＨａｅＩＩは、コドン１５８の一塩基多型部位を含む切断位置より上流に他の切断位置を持たない。

従って、これらの制限酵素ＡｆｌＩＩＩ、ＨａｅＩＩの組み合わせを用いることで、制限酵素ＨｈａＩによる切断で得られたものよりも長い、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４にそれぞれ特異的なＤＮＡ制限断片を生成することができる。又、適切なプライマーを設計することにより、ＤＮＡ制限断片間の鎖長差は、非特許文献５に開示される従来方法よりも大きくなり、ＤＮＡ制限断片の分離を容易ならしめる。

上述の２種類の制限酵素、ＡｆｌＩＩＩ及びＨａｅＩＩは、上記条件（１）〜（４）、更には（５）の条件を満たす制限酵素の組み合わせである。これに対して、従来の方法における制限酵素ＨｈａＩは、上記条件（４）を満たさず、更に上記条件（５）をも満たさない。

尚、第１、第２の制限酵素は、上記条件（１）〜（４）、更に望ましくは（５）を満たせば同一のものであっても２種類以上であってもよい。

（プライマー対）
そして、本発明では、以下に説明する新規プライマー対を用いる。このプライマー対は、ＡｐｏＥ遺伝子多型Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片の存否によって、制限酵素による切断反応が適正に行われた否かを判定し得るように設計される。又、ＡｐｏＥ遺伝子多型Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片を定量した結果に基づいて、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４に特異的なＤＮＡ断片の存否を判定できる。これにより、ＡｐｏＥ遺伝子多型の検出、ゲノタイピングの正確性、信頼性を著しく高めることができる。以下、第１の制限酵素としてＡｆｌＩＩＩ、第２の制限酵素としてＨａｅＩＩを用いる場合に即して更に説明する。

１．上流側プライマー
本発明では、ＡｐｏＥ遺伝子に特異的なプライマー対のうち上流側プライマーには、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について第１の制限酵素（ＡｆｌＩＩＩ）によって切断されて生成するＤＮＡ断片を得るために、コドン１１２の一塩基多型部位を含む認識配列より上流側に第１の制限酵素（ＡｆｌＩＩＩ）の認識配列を導入するように変異（ミューテーション）を加える。即ち、上流側プライマーは、天然のＡｐｏＥ遺伝子に対し、コドン１１２の一塩基多型部位を含む第１の制限酵素（ＡｆｌＩＩＩ）の認識配列より上流側に第１の制限酵素（ＡｆｌＩＩＩ）の認識配列を導入するための少なくとも１塩基の変異を導入された配列（以下、導入される各変異配列を「ミスマッチ配列」という。）を有するミスマッチプライマーである。

ところで、図３に示すように、ＡｐｏＥ遺伝子には、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について、第１切断位置よりも１４２ｂｐ上流の位置に第２の制限酵素（ＨａｅＩＩ）の切断位置がある。即ち、コドン９５〜コドン９６の領域にわたるＨａｅＩＩの認識配列がある。

上流側プライマーの５’末端を第１の切断位置よりも１４２ｂｐ以上の上流の位置に設定すると、第１切断位置より上流、且つ、上流側プライマーによって導入される第１の制限酵素（ＡｆｌＩＩＩ）の認識配列での切断位置（以下「導入切断位置」という。）より下流の配列（図中Ａ）のみを含むＤＮＡ断片Ａ（＝１４２ｂｐ）と、第１切断位置と第２切断位置との間の配列（図中Ｂ）のみを含むＤＮＡ断片Ｂ（＝１４５ｂｐ）との良好な分離が難しくなり、ＤＮＡ断片ＢはＥ３に特異的なものではなくなることがある。

そのため、導入切断位置は、ＤＮＡ断片ＡとＤＮＡ断片Ｂ（＝１４５ｂｐ）との良好な分離が可能なように設定する（９ｂｐ以上、好ましくは２０ｂｐ以上、更に好ましくは３０ｂｐ以上の鎖長差を有する）必要がある。このことから、導入切断位置が第１切断位置より１３６ｂｐ以下の上流の位置となるように、上流側プライマーによって第１の制限酵素（ＡｆｌＩＩＩ）の認識配列を導入するのが好ましい。この観点からは、例えば、典型的にはアガロース電気泳動によっても十分な解像度にて分離可能となるように、導入切断位置は第１切断位置よりも、より好ましくは１３０ｂｐ以下、更に好ましくは１２５ｂｐ以下の上流の位置とすることがより好ましい。

又、導入切断位置は、上記の第２の切断位置から第１の切断位置より上流に位置する端部までの配列（図中Ｃ）を含むＤＮＡ断片Ｃ（即ち、配列Ａ及び配列Ｂを含むＤＮＡ断片Ｃ）が、ＤＮＡ断片Ｂ（＝１４５ｂｐ）と良好に分離可能であると共に、上記の第１切断位置から第２切断位置より下流に位置する端部までの配列（図中Ｄ）を含むＤＮＡ断片Ｄとも良好に分離可能であるように設定する（９ｂｐ以上、好ましくは２０ｂｐ以上、更に好ましくは３０ｂｐ以上の鎖長差を有する）必要がある。このことから、導入切断位置が第１の切断位置より４５ｂｐ以上、より好ましくは６０ｂｐ以上の上流の位置となるように、上流側プライマーによって第１の制限酵素（ＡｆｌＩＩＩ）の認識配列を導入するのが好ましい。この観点からは、例えば、典型的にはアガロース電気泳動によっても十分な解像度にて分離可能となるように、導入切断位置は、第１切断位置よりも７０ｂｐ以上、８０ｂｐ以上、９０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上の上流の位置と、より上流とされるのが好ましい。

尚、詳しくは後述するが、下流側プライマーの選択範囲によって生成されるＤＮＡ制限断片長が異なるが、第２切断位置より下流の配列（図中Ｒ）のみを含むＤＮＡ断片Ｒと、上記ＤＮＡ断片Ａとが良好に分離可能である場合、ＤＮＡ断片Ａの長さは他のＤＮＡ断片の長さと重なることがなく、このＤＮＡ断片ＡはＡｐｏＥ遺伝子多型判別の根拠の一つとして利用することができる。

又、導入切断位置より上流の配列（図中Ｆ）のみを含むＤＮＡ断片Ｆは、典型的にはアガロース電気泳動によって十分な解像度にて分離可能な十分な長さであることが好ましい。好ましくは、ＤＮＡ断片Ｆは４５ｂｐ以上、より好ましくは５０ｂｐ以上とされる。このことから、上流側プライマーの５’末端の位置は、導入切断位置よりも４５ｂｐ以上の上流の位置に設定するのが好ましい。より好ましくは、上流側プライマーの５’末端の位置は、導入切断位置よりも５０ｂｐ以上の上流の位置とする。

一方、ＤＮＡ断片Ｆと、他のＤＮＡ断片、特に、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４のそれぞれに特異的なＤＮＡ断片Ｂ、ＤＮＡ断片Ｃ、ＤＮＡ断片Ｄと良好に分離可能である（９ｂｐ以上、好ましくは２０ｂｐ以上、更に好ましくは３０ｂｐ以上の鎖長差を有する）ことが必要である。又、プライマーの性能等の点から、ＤＮＡ断片Ｆは、１１０ｂｐ以下、より好ましくは７０ｂｐ以下、更に好ましくは５０ｂｐ以下とされる。このことから、上流側プライマーの５’末端の位置は、導入切断位置よりも１１０ｂｐ以下の上流の位置に設定するのが好ましい。より好ましくは、上流側プライマーの５’末端の位置は、導入切断位置よりも７０ｂｐ以下の上流の位置とする。更に好ましくは５０ｂｐ以下の上流の位置とする。

更に、ＤＮＡ断片Ｆは、詳しくは後述するＤＮＡ断片Ｒとも良好に分離可能である（９ｂｐ以上、好ましくは２０ｂｐ以上、更に好ましくは３０ｂｐ以上の鎖長差を有する）必要がある。

ここで、上流側プライマーの５’末端の位置の設定によって、上述の第１切断位置より１４２ｂｐ上流側の第２の制限酵素（ＨａｅＩＩ）の切断位置がプライマー配列中に入ることがある。この場合には、この切断位置に対応する第２の制限酵素（ＨａｅＩＩ）の認識配列をミューテーションにより消失させることができる。即ち、この場合、上流側プライマーは、天然のＡｐｏＥ遺伝子に対し、コドン１１２の一塩基多型部位より上流側における第２の制限酵素（ＨａｅＩＩ）の認識配列を消失させるための少なくとも１塩基のミスマッチ配列を有するミスマッチプライマーである。

２．下流側プライマー
一方、ＡｐｏＥ遺伝子に特異的なプライマー対のうち下流側プライマーは、５’末端の位置を第２切断位置より下流の適切な位置に設定することにより、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について生成する、第２切断位置より下流の配列（図中Ｒ）のみを含むＤＮＡ断片Ｒを得ることができる。

図３に示すように、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について、第２切断位置よりも３５ｂｐ、５３ｂｐ（３５ｂｐ＋１８ｂｐ）、６６ｂｐ（３５ｂｐ＋１８ｂｐ＋１３ｂｐ）下流に、それぞれ第２の制限酵素（ＨａｅＩＩ）の切断位置がある。従って、下流側プライマーの５’末端の位置の設定により、第２の制限酵素（ＨａｅＩＩ）による切断で生成されるＤＮＡ断片Ｒが異なってくる。

下流側プライマーの５’末端を第２切断位置より３５ｂｐ以上、５３ｂｐ以下の下流の位置に設定（即ち、図中配列Ｒ３内に設定）することで、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について、ＤＮＡ断片Ｒ３（最長でも１８ｂｐ）が生成する。Ｅ３、Ｅ４では、ＤＮＡ断片Ｒ４（＝３５ｂｐ）も生成する。

又、下流側プライマーの５’末端位置を第２切断位置より５３ｂｐ以上、６６ｂｐ以下の下流の位置に設定（即ち、図中配列Ｒ２内に設定）することで、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について、ＤＮＡ断片Ｒ３（＝１８ｂｐ）、ＤＮＡ断片Ｒ２（最長でも１３ｂｐ）が生成する。Ｅ３、Ｅ４ではＤＮＡ断片Ｒ４（＝３５ｂｐ）も生成する。

更に、下流側プライマーの５’末端の位置を少なくとも第２切断位置より６６ｂｐ以上の下流の位置、好ましくは７０ｂｐ以上、８０ｂｐ以上、９０ｂｐ以上と、より第２切断位置より下流の位置に設定（即ち、図中配列Ｒ１内に設定）することにより、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について、所望の鎖長のＤＮＡ断片Ｒ１が生成する。このとき、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について、ＤＮＡ断片Ｒ３（＝１８ｂｐ）、ＤＮＡ断片Ｒ２（＝１３ｂｐ）が生成する。Ｅ３、Ｅ４ではＤＮＡ断片Ｒ４（＝３５ｂｐ）も生成する。これにより、好ましくは下流側プライマーの５’末端位置を第２切断位置より７０ｂｐ以上の下流の位置とすることにより、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について生成するＤＮＡ断片Ｒ１、或いは１８ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ３）、１３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ２）のＤＮＡ断片を上記の如く消化反応の良否判断等の目的で利用することができる。

ここで、ＤＡＮ断片Ｒは、上記ＤＮＡ断片Ｆと同様に、典型的にはアガロース電気泳動によって十分な解像度にて分離可能な十分な長さであることが好ましい。好ましくは、ＤＮＡ断片Ｒ１は４５ｂｐ以上、より好ましくは５０ｂｐ以上とされる。この観点からは、下流側プライマーの５’末端の位置は、第２切断位置より１００ｂｐ以上の下流の位置、１２０ｂｐ以上の下流の位置、１２６ｂｐ以上の下流の位置と、より下流の位置とするのが好ましく、更に好ましくは１３６ｂｐ以上の下流の位置に設定する。

一方、ＤＮＡ断片Ｒ１と、特にＤＮＡ断片Ｂ（更にはＤＮＡ断片Ｃ、Ｄ）とを良好に分離するためには、下流側プライマーの５’末端の位置は、第２切断位置より２０２ｂｐ以下の下流の位置（下流２０２ｂｐよりも上流側）に設定するのが好ましい。この観点からは、下流側プライマーの５’末端の位置は、第２切断位置より１８５ｂｐ以下の下流の位置に設定するのが好ましい。更に、ＡｐｏＥ遺伝子多型の判定の根拠の一つとして利用可能なＤＮＡ断片ＡとＤＮＡ断片Ｒ１との分離を良好とすることをも考慮すると、下流側プライマーの５’末端の位置は、好ましくは第２切断位置より１６６ｂｐ以下の下流の位置、より好ましくは１５６ｂｐ以下の下流の位置に５’末端を設定する。

更に、ＤＮＡ断片Ｒは、ＤＮＡ断片Ｆとも、典型的にはアガロース電気泳動によって十分な解像度にて分離可能である（９ｂｐ以上、好ましくは２０ｂｐ以上、更に好ましくは３０ｂｐ以上の鎖長差を有する）ことが必要である。

尚、これらの条件を満たすことにより、下流側プライマーの５’末端の位置は第２切断位置より３０ｂｐ以上の下流の位置となり、ＤＮＡ断片ＢとＤＮＡ断片Ｄとを良好に分離することができる。

好ましい一実施態様では、下記の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから成るプライマーの対を用いる。

上流側プライマー（ＡＥ−Ｆａｆｌ５）：配列番号１
５’−ＡＣＡＣＣＣＴＣＣＣＧＣＣＣＴＣＴＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＧＣＧＣＧＧＡＴＧＧＡＣＧＡＧＡＣＣＡＴＧＡＡＣＧＣＧＴＴＧＡＡＧ−３’
下流側プライマー（ＡＥ−Ｒｈａｅ）：配列番号２
５’−ＧＣＣＣＧＣＴＣＣＴＧＴＡＧＣＧＧＣ−３’
配列番号１の上流側プライマーは、第１切断位置より１１４〜１７３ｂｐ上流に位置する（５’末端は第１切断位置より１７３ｂｐ上流に位置する。）６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。配列番号２の下流側プライマーは、第２切断位置より１２９〜１４６ｂｐ下流に位置する（５’末端は第２切断位置より１４６ｂｐ下流に位置する。）１８ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。上記オリゴヌクレオチド配列のプライマー対によれば、ＡｐｏＥ遺伝子多型の２箇所の一塩基多型部位、即ち、コドン１１２、コドン１５８の一塩基多型部位を含み、５３番目〜２０８番目のアミノ酸をコードするコドン領域にわたる４６４ｂｐのＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅することができる。斯かるオリゴヌクレオチド配列の各プライマーは、市販のＤＮＡ合成装置を用いて斯界にて周知のＤＮＡ合成方法により得ることができる。

図２に示すように、配列番号１の上流側プライマーは、コドン４１〜コドン４２にわたる領域の配列ＡＧＧＡＧＴ（ＡｐｏＥ遺伝子２６５８番目〜２６６３番目の塩基）中の上流側から２番目のＧと４番目のＡを、それぞれＣ、Ｃに変異させた、配列ＡＣＧＣＧＴを有する。これにより、ＡｆｌＩＩＩの認識配列ＡＣＲＹＧＴ（ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ）が導入される。

上記の如く制限酵素の認識配列を導入するためにプライマー配列中にミスマッチ配列を入れる場合、テンプレートＤＮＡとの結合性等からミスマッチ数はできる限り少ない方がよい。又、ミスマッチ配列は、プライマー配列の末端（特に３’末端）からできるだけ離れていた方がよく、好ましくは３ｂｐ、より好ましくは５ｂｐ以上離れていた方がよい。配列番号１の上流側プライマーにおけるミスマッチ配列の位置、３’末端の位置は、これらの観点から好適である。

更に、配列番号１の上流側プライマーで導入される第１の制限酵素（ＡｆｌＩＩＩ）による切断位置（導入切断位置）は、第１切断位置よりも１２３ｂｐ上流に位置する。従って、図３に示した第１切断位置より上流且つ導入切断位置より下流の配列（図中Ａ）のみを含むＤＮＡ断片Ａは１２３ｂｐとなる。このＤＮＡ断片Ａは、典型的にはアガロース電気泳動によって十分な解像度にて分離可能であると共に、ＤＮＡ断片Ｂの１４５ｂｐと良好に分離可能である。これにより、ＤＮＡ断片Ｂ（＝１４５ｂｐ）は、Ｅ３に特異的なものとなる。更に、配列番号１で導入される導入切断位置によれば、ＤＮＡ断片Ｃは、ＤＮＡ断片Ｂと良好に分離可能であると共に、ＤＮＡ断片Ｄとも良好に分離可能である。

一方、図２に示すように、配列番号１の上流側プライマーは、コドン９５〜コドン９６にわたる領域の配列ＧＧＣＧＣＴ（ＡｐｏＥ遺伝子２６３５番目〜２６４０番目の塩基）中の上流側から６番目のＴを、Ｇに変異させた、配列ＧＧＣＧＣＧを有する。これにより、ＨａｅＩＩの認識配列ＲＧＣＧＣＹ（ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ）が消失する。この認識配列が消失すれば、認識領域内のミスマッチ配列の位置、ミスマッチ配列の数、ミスマッチ配列の塩基は適宜選択できる。

上記の如く制限酵素の認識配列を消失させるためにプライマー配列中にミスマッチ配列を入れる場合も、テンプレートＤＮＡとの結合性等からミスマッチ数はできる限り少ない方がよい。又、ミスマッチ配列は、プライマー配列の末端（特に３’末端）からできるだけ離れていた方がよく、好ましくは３ｂｐ、より好ましくは５ｂｐ以上離れていた方がよい。配列番号１の上流側プライマーにおけるミスマッチ配列の位置、５’末端の位置は、これらの観点から好適である。

更に、配列番号１の上流側プライマーにより、第１の切断位置より１４２ｂｐ上流（導入切断位置より１９ｂｐ上流）の第２の制限酵素（ＨａｅＩＩ）による切断位置を消失させ、又、上流側プライマーの５’末端を導入切断位置より５０ｂｐ上流の位置（第１の切断位置より１７３ｂｐ上流の位置）に設定することで、図３に示した導入切断位置より上流の配列（図中Ｆ）のみを含む、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について生成するＤＮＡ断片Ｆは、典型的にはアガロース電気泳動によって十分な解像度にて分離可能な十分な長さとなる。従って、このＤＮＡ断片Ｆの存否により、制限酵素による切断段階で適切な切断反応が起きたか否かを判定することができる。又、詳しくは後述するように、ＤＮＡ断片Ｆを定量した結果に基づいて、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４のそれぞれに特異的なＤＮＡ断片の存否の判定することにより、より精度の高いＡｐｏＥ遺伝子多型の検出、ゲノタイピングを実現できる。

配列番号２の下流側プライマーは、５’末端が第２切断位置より１４６ｂｐ下流に設定されている。これにより、図３に示した、第２切断位置よりも下流の配列（図中Ｒ）のみを含むＤＮＡ断片Ｒとして、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について、８０ｂｐのＤＮＡ断片Ｒ１、１３ｂｐのＤＮＡ断片Ｒ２、１８ｂｐのＤＮＡ断片Ｒ３が生成する。又、Ｅ３、Ｅ４については３５ｂｐのＤＮＡ断片Ｒ４が生成する。これにより、上記ＤＮＡ断片Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、特に、８０ｂｐのＤＮＡ断片Ｒ３は、典型的にはアガロース電気泳動によって十分な解像度にて分離可能な十分な長さとなる。従って、このＥ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について生成するＤＮＡ断片Ｒ、特に、ＤＮＡ断片Ｒ３の存否により、制限酵素による切断段階で適切な切断反応が起きたか否かを判定することができる。又、詳しくは後述するように、このＥ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について生成するＤＮＡ断片Ｒ、特に、ＤＮＡ断片Ｒ３を定量した結果に基づいて、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４のそれぞれに特異的なＤＮＡ断片の存否の判定することにより、より精度の高いＡｐｏＥ遺伝子多型の検出、ゲノタイピングを実現できる。

更に、配列番号１の上流側プライマー、配列番号２の下流側プライマーを用いることで、上記Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ配列Ｆと、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ配列Ｒとは、典型的にはアガロース電気泳動によって十分な解像度にて分離可能である（鎖長差３０ｂｐ）。

配列番号１の上流側プライマーは、上記の箇所以外にミスマッチ配列はない。又、配列番号２の下流側プライマーにはミスマッチ配列はない。

上記配列番号１、２のプライマー対を用いて増幅したＤＮＡをＡｆｌＩＩＩ、ＨａｅＩＩを用いれば、上流側プライマーにより導入されるＡｆｌＩＩＩ（第１の制限酵素）の認識配列より上流側、導入されるＡｆｌＩＩＩ（第１の制限酵素）の認識配列とコドン１１２の一塩基多型部位を含むＡｆｌＩＩＩ（第１の制限酵素）の認識配列との間、コドン１１２の一塩基多型部位を含むＡｆｌＩＩＩ（第１の制限酵素）の認識配列とコドン１５８の一塩基多型部位を含むＨａｅＩＩ（第２の制限酵素）の認識配列との間に、ＡｆｌＩＩＩ（第１の制限酵素）及びＨａｅＩＩ（第２の制限酵素）のいずれの認識配列も持たない。

図１は、配列番号１、２のプライマー対を用いて増幅したＤＮＡをＡｆｌＩＩＩ、ＨａｅＩＩを用いて消化した際の、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の各多型におけるＤＮＡ制限断片長、及び各ゲノタイプにおけるＤＮＡ制限断片長の組み合わせを示す。図１に示すように、ホモ接合体については、下記の通りのＤＮＡ断片が得られる。

Ｅ２／Ｅ２：１８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｄ）、１２３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）、
８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ１）、５０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｆ）、
１８ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ３）、１３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ２）
Ｅ３／Ｅ３：１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｂ）、１２３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）、
８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ１）、５０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｆ）、
３５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ４）、１８ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ３）、
１３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ２）
Ｅ４／Ｅ４：２６８ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｃ）、
８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ１）、５０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｆ）、
３５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ４）、１８ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ３）、
１３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ２）
又、ヘテロ接合体については、下記の通りのＤＮＡ断片が得られる。

Ｅ２／Ｅ３：１８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｄ）、１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｂ）、
１２３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）、
８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ１）、５０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｆ）、
３５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ４）、１８ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ３）、
１３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ２）
Ｅ２／Ｅ４：２６８ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｃ）、１８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｄ）、
１２３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）、
８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ１）、５０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｆ）、
３５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ４）、１８ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ３）、
１３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ２）
Ｅ３／Ｅ４：２６８ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｃ）、１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｂ）、
１２３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）、
８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ１）、５０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｆ）、
３５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ４）、１８ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ３）、
１３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ２）
本発明によれば、ＤＮＡ断片ＡをもＡｐｏＥ遺伝子多型の判別の根拠の一つとして利用することができる（下流側プライマーの５’末端の位置の設定によってＤＮＡ断片Ｒ１と良好に分離可能である場合。）。更に、ＤＮＡ断片Ｆ、及び、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について生成するＤＮＡ断片Ｒ（特にＤＮＡ断片Ｒ１）の存否及び／又はその量を利用することによって、ＡｐｏＥ遺伝子多型の検出、ゲノタイピングの正確性、信頼性を更に高めることができる。

つまり、先ず、ＤＮＡ断片ＡはＥ２及びＥ３において生成されるが、Ｅ４では生成されない。このため、ＤＮＡ断片Ａの存在は、それぞれＤＮＡ断片Ｄ、ＤＮＡ断片Ｂの存在と共にＡｐｏＥ遺伝子多型の判別の根拠として利用して、Ｅ２、Ｅ３の存在を示す。一方、ＤＮＡ断片Ａの非存在は、Ｅ４の存在、より詳細には、ゲノタイプＥ４／Ｅ４を示す。

尚、１００ｂｐ以上のＤＮＡ制限断片の存否の組み合わせによりＡｐｏＥ遺伝子多型の検出、ゲノタイプの判定を行うことが精度、信頼性の点で好ましいが、高解像度のＤＮＡ分離方法（装置）を利用する場合などには、ＤＮＡ断片Ｒ４をＡｐｏＥ遺伝子多型の判別の根拠の一つとして利用することもできる。上述のように、第２切断位置より下流の配列Ｒのみを含むＤＮＡ断片として、ＤＮＡ断片Ｒ４は、Ｅ３、Ｅ４では生成されるが、Ｅ２では生成されない。下流側プライマーの５’末端の位置の設定によって、ＤＮＡ断片Ｒ１とＤＮＡ断片Ｒ４とが良好に分離可能である場合には、ＤＮＡ断片Ｒ４の存在は、それぞれＤＮＡ断片Ｂ（更にはＤＮＡ断片Ａ）、ＤＮＡ断片Ｃの存在と共にＡｐｏＥ遺伝子多型の判別の根拠として利用して、Ｅ３、Ｅ４の存在を示す。一方、ＤＮＡ断片Ｒ４の非存在は、Ｅ２の存在、より詳細にはゲノタイプＥ２／Ｅ２を示す。

このように、ＡｐｏＥ遺伝子多型の判定の根拠を増すことにより、判定の正確性、信頼性を向上させることができる。

次に、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｆの存否により、第１の制限酵素（ＡｆｌＩＩＩ）が効果的に反応しているか否かを判断することができる。又、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｒの存否によって、第２の制限酵素（ＨａｅＩＩ）が効果的に反応しているか否かを判断することができる。これにより、ＰＣＲ産物の消化が適正に行われたか否かの判断をすることができる。

消化反応が適正に行われたか否かを判断することは、正確で、信頼性のあるＡｐｏＥ遺伝子多型の検出、ゲノタイピングにとって重要である。ＤＮＡ断片Ｆ及び／又はＥ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｒが存在するときに、有効な切断反応の存在を判断する。より詳細には、ＤＮＡ断片Ｆの存在により、第１の制限酵素（ＡｆｌＩＩＩ）による有効な切断反応の存在を判断する。又、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｒの存在により、第２の制限酵素（ＨａｅＩＩ）による有効な切断反応の存在を判断する。そして、有効な切断反応の存在を判断した場合に、各ＤＮＡ断片の存否の組み合わせから、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプを判定するようにすることができる。このＤＮＡ断片Ｆ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｒが存在しない場合は、その検出結果を採用しない、或いはゲノタイピング不能であること、若しくは精度が低下していることを判断することができる。

上述のように、本発明の一態様によれば、上流側プライマーにより導入される認識配列での切断位置（導入切断位置）より上流の配列Ｆのみを含むＤＮＡ断片をＤＮＡ断片Ｆ、コドン１５８の一塩基多型部位を含む認識配列での切断位置（第２切断位置）より下流の配列Ｒのみを含むＤＮＡ断片をＤＮＡ断片Ｒ、コドン１１２の一塩基多型部位を含む認識配列での切断位置（第１切断位置）より上流且つ前記導入切断位置より下流の配列Ａのみを含むＤＮＡ断片をＤＮＡ断片Ａ、第１切断位置と第２切断位置との間の配列Ｂのみを含むＤＮＡ断片をＤＮＡ断片Ｂ、配列Ａ及びＢを含むＤＮＡ断片をＤＮＡ断片Ｃ、配列Ｂ及びＲを含むＤＮＡ断片をＤＮＡ断片Ｄとしたとき、検出したＤＮＡ断片の存否の組み合わせからＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプを判定するＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法が提供される。その一実施態様では、ＤＮＡ断片Ｂ（配列番号１、２のプライマー対、制限酵素ＡｆｌＩＩＩ、ＨａｅＩＩを用いた場合の鎖長。以下括弧内の鎖長は同様：１４５ｂｐ）、ＤＮＡ断片Ｃ（２６８ｂｐ）及びＤＮＡ断片Ｄ（１８０ｂｐ）の存否をＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプの判定に用い、（ａ）ＤＮＡ断片Ｄ（１８０ｂｐ）のみの存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ２を判定し；（ｂ）ＤＮＡ断片Ｂ（１４５ｂｐ）のみの存在によりゲノタイプＥ３／Ｅ３を判定し；（ｃ）ＤＮＡ断片Ｃ（２６８ｂｐ）のみの存在によりゲノタイプＥ４／Ｅ４を判定し；（ｄ）ＤＮＡ断片Ｂ（１４５ｂｐ）及びＤＮＡ断片Ｄ（１８０ｂｐ）のみの存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ３を判定し；（ｅ）ＤＮＡ断片Ｃ（２６８ｂｐ）及びＤＮＡ断片Ｄ（１８０ｂｐ）のみの存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ４を判定し；（ｆ）ＤＮＡ断片Ｂ（１４５ｂｐ）及びＤＮＡ断片Ｃ（２６８ｂｐ）のみの存在によりゲノタイプＥ３／Ｅ４を判定することができる。

又、他の実施態様では、ＤＮＡ断片Ａ（１２３ｂｐ）、ＤＮＡ断片Ｂ（１４５ｂｐ）、ＤＮＡ断片Ｃ（２６８ｂｐ）及びＤＮＡ断片Ｄ（１８０ｂｐ）の存否をＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプの判定に用い、（ａ）ＤＮＡ断片Ａ（１２３ｂｐ）及びＤＮＡ断片Ｄ（１８０ｂｐ）のみの存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ２を判定し；（ｂ）ＤＮＡ断片Ａ（１２３ｂｐ）及びＤＮＡ断片Ｂ（１４５ｂｐ）のみの存在によりゲノタイプＥ３／Ｅ３を判定し；（ｃ）ＤＮＡ断片Ｃ（２６８ｂｐ）のみの存在によりゲノタイプＥ４／Ｅ４を判定し；（ｄ）ＤＮＡ断片Ａ（１２３ｂｐ）、ＤＮＡ断片Ｂ（１４５ｂｐ）及びＤＮＡ断片Ｄ（１８０ｂｐ）のみの存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ３を判定し；（ｅ）ＤＮＡ断片Ａ（１２３ｂｐ）、ＤＮＡ断片Ｃ（２６８ｂｐ）及びＤＮＡ断片Ｄ（１８０ｂｐ）のみの存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ４を判定し；（ｆ）ＤＮＡ断片Ａ（１２３ｂｐ）、ＤＮＡ断片Ｂ（１４５ｂｐ）及びＤＮＡ断片Ｃ（２６８ｂｐ）のみの存在によりゲノタイプＥ３／Ｅ４を判定することができる。

又、他の実施態様では、ＤＮＡ断片Ａ（１２３ｂｐ）の存否をＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプの判定に用い、ＤＮＡ断片Ａ（１２３ｂｐ）の非存在によりゲノタイプＥ４／Ｅ４を判定することができる。

更に、本発明によれば、ＤＮＡ断片Ｆ又はＥ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について生成するＤＮＡ断片Ｒの存在により、制限酵素による切断段階における有効な切断反応の存在を判定することができる。より詳細には、ＤＮＡ断片Ｆの存在及びＥ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について生成するＤＮＡ断片Ｒの存在により、第１の制限酵素（ＡｆｌＩＩＩ）及び第２の制限酵素（ＨａｅＩＩ）による切断段階における有効な切断反応の存在を判定することができる。そして、この有効な切断の存在を判定した場合に、ＤＮＡ断片の存否の組み合わせからＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプを判定することができる。

（ヘテロ二本鎖）
ところで、目的の遺伝子領域を複製する過程において、ヘテロ二本鎖（ヘテロデュプレックス）が生じることがある。ヘテロ二本鎖は、特に、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプがヘテロの場合（Ｅ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ４）の場合に問題となる。以下この点について説明する。ここでは、配列番号１、２のプライマー、制限酵素ＡｆｌＩＩＩ、ＨａｅＩＩを用いる場合に即して説明する。

図４（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、Ｅ２／Ｅ３、Ｅ３／Ｅ４、Ｅ２／Ｅ４の各ゲノタイプについてヘテロ二本鎖が生じた場合のＤＮＡ制限断片のパターンを模式的に示したものである。

ＰＣＲの過程で仮に５０％がヘテロ二本鎖を形成したとすると、Ｅ２／Ｅ３ゲノタイプでは、図４（ａ）に示すように、Ｅ２／Ｅ３二本鎖（ヘテロ二本鎖）が５０％、Ｅ３／Ｅ３二本鎖が２５％、Ｅ２／Ｅ２二本鎖が２５％生成する。そして、ヘテロ二本鎖ではコドン１５８の一塩基多型部位を含む第２の制限酵素（ＨａｅＩＩ）の認識配列が消失し、第２切断位置が切断されなくなる。その結果、見かけ上では、Ｅ２（１２３ｂｐ、１８０ｂｐのＤＮＡ制限断片）が７５％、Ｅ３（３５ｂｐ、１２３ｂｐ、１４５ｂｐのＤＮＡ制限断片）が２５％となる。

又、Ｅ３／Ｅ４ゲノタイプについて同様に考えると、図４（ｂ）に示すように、Ｅ３／Ｅ４二本鎖（ヘテロ二本鎖）ではコドン１１２の一塩基多型部位を含む第１の制限酵素（ＡｆｌＩＩＩ）の認識配列が消失し、第１切断位置が切断されなくなる。その結果、見かけ上では、Ｅ４（３５ｂｐ、２６８ｂｐのＤＮＡ制限断片）が７５％、Ｅ３（３５ｂｐ、１２３ｂｐ、１４５ｂｐのＤＮＡ制限断片）が２５％となる。

一方、Ｅ２／Ｅ４ゲノタイプについて同様に考えると、図４（ｃ）に示すように、Ｅ２／Ｅ４二本鎖（ヘテロ二本鎖）ではコドン１１２の一塩基多型部位を含む第１の制限酵素（ＡｆｌＩＩＩ）の認識配列、及びコドン１５８の一塩基多型部位を含む第２の制限酵素（ＨａｅＩＩ）の認識配列が消失し、第１切断位置及び第２切断位置の両方が切断されなくなる。第２切断位置より下流の切断位置ではヘテロ二本鎖であっても切断されるので、Ｅ２／Ｅ４二本鎖（ヘテロ二本鎖）に特異的なＤＮＡ断片（以下「ヘテロ二本鎖特異的断片という。）（３０３ｂｐ）が生成する。即ち、ヘテロ二本鎖特異的断片は、図３に示した配列Ａ、配列Ｂ及び配列Ｒを含む。その結果、見かけ上では、Ｅ４（３５ｂｐ、２６８ｂｐのＤＮＡ制限断片）が２５％、Ｅ２（１２３ｂｐ、１８０ｂｐのＤＮＡ制限断片）が２５％、ヘテロ二本鎖特異的断片（３０３ｂｐのＤＮＡ制限断片）が５０％となる。

図５は、ヘテロ二本鎖の生成をも考慮した場合における各ゲノタイプでのＤＮＡ制限断片の分離パターンを模式的に示す。図示の通り、ゲノタイプＥ２／Ｅ３では、１８０ｂｐにヘテロ二本鎖の生成による太いバンドが出現し、ゲノタイプＥ２／Ｅ４では３０３ｂｐにヘテロ二本鎖の生成による新たなバンドが出現し、Ｅ３／Ｅ４では２６８ｂｐにヘテロ二本鎖の生成による太いバンドが出現する。

尚、ヘテロ二本鎖特異的断片は、アポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定の根拠の一つとして利用することができ、ヘテロ二本鎖特異的断片の存在はゲノタイプＥ２／Ｅ４を示す。

（定量法）
図５から理解されるように、本発明によれば、ヘテロ二本鎖が生成しても、各ＡｐｏＥ遺伝子多型の検出、ゲノタイピングが可能であるが、本発明によれば、ヘテロ二本鎖の生成をも考慮することで、更にＡｐｏＥ遺伝子多型の検出、ゲノタイピングの正確さ、信頼性を高めることができる。以下、この点について説明する。

つまり、本発明によれば、上述のように、制限酵素が効果的に反応しているかを判断し、ＰＣＲ産物の消化が適正に行われたか否かを判断することができると共に、ＤＮＡ断片Ｆ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について生成するＤＮＡ断片Ｒの一方若しくは両方を定量することによって、消化反応全体に寄与し、ゲノタイピングの用に供することのできるＤＮＡ全量の予測が可能となる。そして、その定量結果に基づいて、それぞれのゲノタイプに関係付けることのできる断片（各ゲノタイプに特異的なＤＮＡ制限断片パターンを構成するそれぞれのＤＮＡ制限断片）、特に、ＤＮＡ断片Ａ、ＤＮＡ断片Ｂ、ＤＮＡ断片Ｃ及び／又はＤＮＡ断片Ｄをより正確に評価することが可能となる。つまり、それらのＤＮＡ断片の存否をより正確に判断することができる。

より詳細には、ＤＮＡ断片Ａ、ＤＮＡ断片Ｂ、ＤＮＡ断片Ｃ及び／又はＤＮＡ断片Ｄを定量し、その量（測定値）と、ＤＮＡ断片Ｆ及び／又はＥ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｒの量から推定されるそれらの量（推定値）とを比較する。これにより、ＤＮＡ断片Ａ、ＤＮＡ断片Ｂ、ＤＮＡ断片Ｃ及び／又はＤＮＡ断片Ｄがその推定量に相当する量存在するときに、そのＤＮＡ断片が出現したものと判断することができる。

特に、ヘテロ接合体（ゲノタイプＥ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ４）については、ＤＮＡ断片Ｆ及び／又はＥ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｒを定量した結果に基づいて、ヘテロ二本鎖の生成割合を求めることができる。そして、このＤＮＡ断片Ｂの量と、ヘテロ二本鎖の生成割合とに基づいて、それぞれのゲノタイプに関係付けることのできるＤＮＡ断片、特に、ＤＮＡ断片Ａ、ＤＮＡ断片Ｂ、ＤＮＡ断片Ｃ及び／又はＤＮＡ断片Ｄをより正確に評価することが可能となる。つまり、それらのＤＮＡ断片の存否をより正確に判断することができる。

より詳細には、ＤＮＡ断片Ａ、ＤＮＡ断片Ｂ、ＤＮＡ断片Ｃ及び／又はＤＮＡ断片Ｄを定量し、その量（測定値）と、ＤＮＡ断片Ｆ及び／又はＥ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｒの量並びにヘテロ二本鎖の生成割合から推定されるそれらの量（推定値）とを比較する。これにより、ＤＮＡ断片Ａ、ＤＮＡ断片Ｂ、ＤＮＡ断片Ｃ及び／又はＤＮＡ断片Ｄがその推定量に相当する量存在するときに、そのＤＮＡ断片が出現したものと判断することができる。

特に、各ＤＮＡ制限断片の定量は、例えば、前述の日立ＳＶ１２１０、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００などの近年開発されたＤＮＡ分離方法を用いれば、ピークを定量することで極めて簡単に行うことができる。自動処理化することも比較的容易である。

以下、この方法の一例を説明する。ここでは、配列番号１、２のプライマー対、制限酵素ＡｆｌＩＩＩ、ＨａｅＩＩを用いた場合に即して説明する。

先ず、ヘテロ二本鎖が生成することのあるヘテロ接合体（ゲノタイプＥ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ４）について説明する。

ゲノタイプＥ２／Ｅ３の場合、テンプレートＤＮＡをＥ２ａ／Ｅ２ｂ二本鎖、Ｅ３ａ／Ｅ３ｂ二本鎖であるとすると、ＰＣＲによる増幅の過程でヘテロ二本鎖が生成すると、ＰＣＲ産物、生成するＤＮＡ制限断片長の組み合わせ、それぞれの産物（ＤＮＡ制限断片）の量の関係は下記表１、及び図６（ａ）に示すようになる。尚、ここでは、増幅された後切断されたＰＣＲ産物の全量が１００ｐｍｏｌで、ヘテロ二本鎖の生成割合が５０％であるとした例を示す。

Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型、即ち、全てのゲノタイプで８０ｂｐのＤＮＡ制限断片（ＤＮＡ断片Ｒ１）、５０ｂｐのＤＮＡ制限断片（ＤＮＡ断片Ｆ）、更には１８ｂｐのＤＮＡ制限断片（ＤＮＡ断片Ｒ３）、１３ｂｐのＤＮＡ制限断片（ＤＮＡ断片Ｒ２）が出現し、その数は、増幅された後に切断されたＤＮＡの数（以下「反応ＤＮＡ全量」という。）と同じとなる。

この場合、８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ１）又は５０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｆ）のＤＮＡ制限断片の量（測定値）をα（ｐｍｏｌ）、１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｂ）又は３５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ４）のＤＮＡ制限断片の量（測定値）をβ（ｐｍｏｌ）とすると、ヘテロ二本鎖の生成割合Ｘ（％）は、
Ｘ（％）＝［（α−２β）／α］×１００
となる。即ち、ヘテロ二本鎖に特異的なＤＮＡ制限断片の生成しないゲノタイプＥ２／Ｅ３の場合は、ヘテロ二本鎖以外の二本鎖のみに由来する１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｂ）又は３５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ４）のＤＮＡ制限断片の量（測定値）（ヘテロ二本鎖以外の二本鎖全体の量はその２倍と推定できる。）と、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について生成する８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ１）又は５０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｆ）のＤＮＡ制限断片の量（測定値）（即ち、反応ＤＮＡ全量）とから、ヘテロ二本鎖の生成割合を求める。

そして、求めたヘテロ二本鎖の生成割合Ｘ（％）と、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について生成する８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ１）又は５０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｆ）のＤＮＡ制限断片の量（測定値）α（ｐｍｏｌ）から、各ＤＮＡ制限断片の理論上の出現数に基づいて各ＤＮＡ断片の量を予測（推定）することができる。つまり、下記、
１８０ｂｐの（ＤＮＡ断片Ｄ）の推定量（ｐｍｏｌ）：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×α＋（α×Ｘ×０．０１）
１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｂ）の推定量（ｐｍｏｌ）：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×α
１２３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）の推定量（ｐｍｏｌ）：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×２×α＋（α×Ｘ×０．０１）
３５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ４）の推定量（ｐｍｏｌ）：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×α
により各ＤＮＡ断片の量を推定することができる。

次に、ゲノタイプＥ３／Ｅ４の場合、テンプレートＤＮＡをＥ３ａ／Ｅ３ｂ二本鎖、Ｅ４ａ／Ｅ４ｂ二本鎖であるとすると、上記ゲノタイプＥ２／Ｅ３の場合と同様に考えた場合、生成するＤＮＡ制限断片長の組み合わせ、それぞれの量の関係は、下記表２、及び図６（ｂ）に示すようになる。

この場合、上記ゲノタイプＥ３／Ｅ４の場合と同様に考えて、８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ１）又は５０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｆ）のＤＮＡ制限断片の量（測定値）をα（ｐｍｏｌ）、１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｂ）又は１２３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）の量（測定値）をβ（ｐｍｏｌ）とすると、ヘテロ二本鎖の生成割合Ｘ（％）は、
Ｘ（％）＝［（α−２β）／α］×１００
となる。そして、上記ゲノタイプＥ２／Ｅ３の場合と同様に考えて、各ＤＮＡ制限断片の推定量は、下記、
２６８ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｃ）の推定量（ｐｍｏｌ）：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×α＋（α×Ｘ×０．０１）
１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｂ）の推定量（ｐｍｏｌ）：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×α
１２３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）の推定量（ｐｍｏｌ）：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×α
３５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ４）の推定量（ｐｍｏｌ）：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×２×α＋（α×Ｘ×０．０１）
となる。

一方、ゲノタイプＥ２／Ｅ４の場合、テンプレートＤＮＡをＥ２ａ／Ｅ２ｂ二本鎖、Ｅ４ａ／Ｅ４ｂ二本鎖であるとすると、上記ゲノタイプＥ２／Ｅ３、Ｅ３／Ｅ４の場合と同様に考えた場合、生成するＤＮＡ制限断片長の組み合わせ、それぞれの量の関係は、下記表３、及び図６（ｃ）に示すようになる。

上記Ｅ２／Ｅ３、Ｅ３／Ｅ４の場合と同様、全てのゲノタイプで８０ｂｐのＤＮＡ制限断片（ＤＮＡ断片Ｒ１）、５０ｂｐのＤＮＡ制限断片（ＤＮＡ断片Ｆ）、更には１８ｂｐのＤＮＡ制限断片（ＤＮＡ断片Ｒ３）、１３ｂｐのＤＮＡ制限断片（ＤＮＡ断片Ｒ２）が出現し、その数は、反応ＤＮＡ全量と同じとなる。

そして、この場合、８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ１）又は５０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｆ）のＤＮＡ制限断片の量（測定値）をα（ｐｍｏｌ）、３０３ｂｐ（ヘテロ二本鎖特異的断片）のＤＮＡ制限断片の量（測定値）をγ（ｐｍｏｌ）とすると、ヘテロ二本鎖の生成割合Ｘ（％）は、
Ｘ（％）＝γ／α×１００
となる。即ち、ヘテロ二本鎖に特異的なＤＮＡ制限断片の生成するゲノタイプＥ２／Ｅ４の場合は、ヘテロ二本鎖のみに由来する３０３ｂｐ（ヘテロ二本鎖特異的断片）のＤＮＡ断片の量（測定値）と、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について生成する８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ１）又は５０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｆ）のＤＮＡ制限断片の量（測定値）（即ち、反応ＤＮＡ全量）とから、ヘテロ二本鎖の生成割合を求めることができる。

或いは、上記ゲノタイプＥ２／Ｅ３の場合と同様に考えて、８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ１）又は５０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｆ）の量（測定値）をα（ｐｍｏｌ）、２６８ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｃ）、１８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｄ）、１２３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）又は３５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ４）の量（測定値）をβとすると、ヘテロ二本鎖の生成割合Ｘ（％）は、
Ｘ（％）＝［（α−２β）／α］×１００
となる。

そして、各ＤＮＡ断片の推定量は、下記、
２６８ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｃ）の推定量（ｐｍｏｌ）：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×α
１８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｄ）の推定量（ｐｍｏｌ）：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×α
１２３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）の推定量（ｐｍｏｌ）：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×α
３５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ４）の推定量（ｐｍｏｌ）：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×α
となる。

以上のようにして、ヘテロ接合体についての各ＤＮＡ制限断片の量を推定することができる。そして、各ＤＮＡ制限断片の定量値（測定値）が、その推定量に整合する場合、即ち、推定量に相当する量だけ存在するときに、該ＤＮＡ制限断片が出現したものと判断することができる。尚、推定量との誤差がどの程度の場合に該ＤＮＡ制限断片が出現したものと判断するかは、適宜、選定することができる。

尚、上述では、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｒとして、８０ｂｐのＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｒ１）を用いた場合を例に説明したが、高解像度のＤＮＡ分離方法（装置）を用いる場合などにおいて、１８ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ３）、１３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ２）のＤＮＡ断片を、適切な切断反応の存在の判定、ＤＮＡ制限断片の定量に用いることもできる。

又、ヘテロ二本鎖が問題になるのはヘテロ接合体の場合であるが、ホモ接合体の場合においても、上述したように、ＤＮＡ断片Ｆ及び／又はＥ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｒを定量した結果に基づいて、それぞれのゲノタイプに関係付けることのできるＤＮＡ断片、特に、ＤＮＡ断片Ａ、ＤＮＡ断片Ｂ、ＤＮＡ断片Ｃ及び／又はＤＮＡ断片Ｄの存在をより正確に判断することができる。

つまり、上記ヘテロ接合体の場合と同様に、増幅された後切断されたＰＣＲ産物の全量が１００ｐｍｏｌであると仮定した場合の、各ゲノタイプで生成する各ＤＮＡ制限断片の量（推定量）を図７に示す。酵素処理後には、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について生成する１３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ２）、１８ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ３）、５０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｆ）、８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ１）のＤＮＡ制限断片が、ＰＣＲで増幅された後切断されたＤＮＡの数（反応ＤＮＡ全量）と同じだけ生成される。

そして、ゲノタイプＥ２／Ｅ２、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ４／Ｅ４のサンプルではヘテロ二本鎖が生成されないため、ゲノタイプＥ２／Ｅ２では１２３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）、１８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｄ）のＤＮＡ制限断片、ゲノタイプＥ３／Ｅ３では３５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ４）、１２３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）、ゲノタイプ１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｂ）のＤＮＡ制限断片、ゲノタイプＥ４／Ｅ４では３５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ４）、２６８ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｃ）のＤＮＡ制限断片が、上記のＥ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について生成するＤＮＡ制限断片の数（反応ＤＮＡ全量）と同じだけ生成される。このように、ホモ接合体についても、各ＤＮＡ断片の量を推定することができる。そして、各ＤＮＡ断片の定量値（測定値）が、その推定量に整合する場合、即ち、推定量に相当する量だけ存在するときに、該ＤＮＡ断片が出現したものと判断することができる。

上述のように、適正な消化反応の判定、ＤＮＡ制限断片の定量に使用するためには、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について生成するＤＮＡ断片Ｒ１とＤＮＡ断片Ｒ４とが良好に分離可能であることが好ましい。但し、ＤＮＡ断片Ｒ１とＤＮＡ断片Ｒ４とが重なる場合であっても、同じ目的のためにこのＤＮＡ断片Ｒ（ＤＮＡ断片Ｒ１及びＲ４）を用いることができる。この場合の各ゲノタイプでのＤＮＡ制限断片の分離パターンを図８に示す。

次に、ＤＮＡ断片Ｒ１の長さがＤＮＡ断片Ｒ４と同じであるとき（即ち、ＤＮＡ断片Ｒ１、Ｒ４が共に３５ｂｐであるとき）に、ＤＮＡ断片Ｒ１をＤＮＡ制限断片の定量のために用いる場合について説明する。尚、当然、以下の説明によらず、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について生成するＤＮＡ断片Ｒは制限酵素（より詳細には第２の制限酵素（ＨａｅＩＩ））による適正な切断反応の存在の判定のために用い、ＤＮＡ断片Ｆを制限酵素（より詳細には第１の制限酵素ＡｆｌＩＩＩ）による適正な切断反応の判定とＤＮＡ制限断片の定量とのために用いてもよい。勿論、高解像度のＤＮＡ分離方法（装置）を用いる場合などにおいて、上記同様、１８ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ３）、１３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ２）のＤＮＡ制限断片を、適切な切断反応の存在の判定、ＤＮＡ制限断片の定量に用いることもできる。

この場合、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成する３５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ１及びＲ４）のＤＮＡ制限断片を定量した結果に基づいてヘテロ二本鎖の生成割合、各ＤＮＡ断片の推定量を求めることができる。

先ず、ヘテロ二本鎖が生成することのあるヘテロ接合体（ゲノタイプＥ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ４）について説明する。

ゲノタイプＥ２／Ｅ３の場合、テンプレートＤＮＡをＥ２ａ／Ｅ２ｂ二本鎖、Ｅ３ａ／Ｅ３ｂ二本鎖であるとすると、ＰＣＲによる増幅の過程でヘテロ二本鎖が生成すると、ＰＣＲ産物、生成するＤＮＡ制限断片長の組み合わせ、それぞれの産物（ＤＮＡ制限断片）の量の関係は下記表４、及び図９（ａ）に示すようになる。尚、ここでは、増幅された後切断されたＰＣＲ産物の全量が１００ｐｍｏｌで、ヘテロ二本鎖の生成割合が５０％であるとした例を示す。又、表中、便宜的に、３５ｂｐのＤＮＡ断片の鎖長は、ＤＮＡ断片４（Ｅ３、Ｅ４において生成）を３５（ａ）ｂｐ、ＤＮＡ断片Ｒ１（Ｅ２、Ｅ３又はＥ４の全てで生成）を３５（ｂ）ｂｐとして区別している。

３５ｂｐのＤＮＡ断片は、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型、即ち、全てのゲノタイプで出現する。但し、その量には、ＤＮＡ断片Ｒ４由来のものと、ＤＮＡ断片Ｒ１由来のものとが含まれている。

この場合、３５ｂｐのＤＮＡ制限断片の量（測定値）をα’（ｐｍｏｌ）、１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｂ）のＤＮＡ制限断片の量（測定値）をβ（ｐｍｏｌ）とすると、ヘテロ二本鎖の生成割合Ｘ（％）は、
Ｘ（％）＝［（α’−３β）／（α’−β）］×１００
となる。即ち、Ｅ２／Ｅ２二本鎖及びヘテロ二本鎖からはＤＮＡ断片Ｒ１（表中３５（ｂ））のみが生成するが、Ｅ３／Ｅ３二本鎖からはＤＮＡ断片Ｒ４（表中３５（ａ））及びＤＮＡ断片Ｒ１（表中３５（ｂ））が生成する。このＥ３／Ｅ３二本鎖から生成するＤＮＡ断片Ｒ４（表中３５（ａ）））の量は、Ｅ３／Ｅ３二本鎖のみから生成する１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｂ）のＤＮＡ制限断片の量と同じである（表中３５（ｂ）も同じ量である）ので、３５ｂｐのＤＮＡ制限断片の量α’（ｐｍｏｌ）からβ（ｐｍｏｌ）を差し引いたものが、反応ＤＮＡ全量となる。つまり、３５ｂｐのＤＮＡ断片の量α’は、表１を参照して説明した例における（α＋β）に相当する。

そして、求めたヘテロ二本鎖の生成割合Ｘ（％）と、３５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｒ１及びＲ４）のＤＮＡ制限断片の量α’（ｐｍｏｌ）、１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｂ）のＤＮＡ制限断片の量β（ｐｍｏｌ）から、各ＤＮＡ制限断片の理論上の出現数に基づいて各ＤＮＡ断片の量を予測（推定）することができる。つまり、下記、
１８０ｂｐの（ＤＮＡ断片Ｄ）の推定量（ｐｍｏｌ）：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×（α’−β）＋［（α’−β）×Ｘ×０．０１］
１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｂ）の推定量（ｐｍｏｌ）：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×（α’−β）
１２３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）の推定量（ｐｍｏｌ）：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×２×（α’−β）
＋［（α’−β）×Ｘ×０．０１］
により各ＤＮＡ制限断片の量を推定することができる。

次に、ゲノタイプＥ３／Ｅ４の場合、テンプレートＤＮＡをＥ３ａ／Ｅ３ｂ二本鎖、Ｅ４ａ／Ｅ４ｂ二本鎖であるとすると、上記ゲノタイプＥ２／Ｅ３と同様に考えた場合、生成するＤＮＡ制限断片長の組み合わせ、それぞれの量の関係は、下記表５、及び図９（ｂ）に示すようになる。

この場合、３５ｂｐのＤＮＡ制限断片の量（測定値）をα’’（ｐｍｏｌ）、１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｂ）又は１２３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）のＤＮＡ断片の量（測定値）をβ（ｐｍｏｌ）とすると、ヘテロ二本鎖の生成割合Ｘ（％）は、
Ｘ（％）＝［（α’’／２）−２β］／（α’’／２）］×１００
となる。即ち、Ｅ３／Ｅ３二本鎖、Ｅ４／Ｅ４二本鎖及びヘテロ二本鎖の全てから、ＤＮＡ断片Ｒ４（表中３５（ａ））及びＤＮＡ断片Ｒ１（表中３５（ｂ））が生成する。従って、３５ｂｐのＤＮＡ断片の量α’’（ｐｍｏｌ）の１／２が反応ＤＮＡ全量となる。つまり、３５ｂｐのＤＮＡ断片の量α’’は、表２を参照して説明した例における２αに相当する。

そして、上記Ｅ２／Ｅ３の場合と同様に考えて、各ＤＮＡ断片の量の推定量は、下記、
２６８ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｃ）の推定量（ｐｍｏｌ）：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×（α’’／２）＋［（α’’／２）×Ｘ×０．０１］
１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｂ）の推定量（ｐｍｏｌ）：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×（α’’／２）
１２３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）の推定量（ｐｍｏｌ）：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×（α’’／２）
となる。

一方、ゲノタイプＥ２／Ｅ４の場合、テンプレートＤＮＡをＥ２ａ／Ｅ２ｂ二本鎖、Ｅ４ａ／Ｅ４ｂ二本鎖であるとすると、上記ゲノタイプＥ２／Ｅ３、Ｅ３／Ｅ４の場合と同様に考えた場合、生成するＤＮＡ制限断片長の組み合わせ、それぞれの量の関係は、下記表６、及び図９（ｃ）に示すようになる。

この場合、３５ｂｐのＤＮＡ断片の量をα’（ｐｍｏｌ）、２６８ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｃ）（或いは、１２３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）又は１８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｄ））のＤＮＡ制限断片の量をβ（ｐｍｏｌ）、２８６ｂｐ（ヘテロ二本鎖特異的断片）のＤＮＡ制限断片の量をγ（ｐｍｏｌ）とすると、ヘテロ二本鎖の生成割合Ｘ（％）は、
Ｘ（％）＝γ／（α’−β）×１００
となる。即ち、Ｅ２／Ｅ２二本鎖及びヘテロ二本鎖からはＤＮＡ断片Ｒ１（表中３５（ｂ））のみが生成するが、Ｅ４／Ｅ４二本鎖からはＤＮＡ断片Ｒ４（表中３５（ａ））及びＤＮＡ断片Ｒ１（表中３５（ｂ））が生成する。このＥ４／Ｅ４二本鎖から生成するＤＮＡ断片Ｒ４（表中３５（ａ）））の量は、Ｅ４／Ｅ４二本鎖のみから生成する２６８ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｃ）のＤＮＡ制限断片（或いは、Ｅ２／Ｅ２二本鎖からのみ生成する１２３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）又は１８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｄ）のＤＮＡ制限断片）の量と同じであるので、３５ｂｐのＤＮＡ断片の量α’（ｐｍｏｌ）からβ（ｐｍｏｌ）を差し引いたものが、反応ＤＮＡ全量となる。つまり、３５ｂｐのＤＮＡ断片の量α’は、表３の場合の（α＋β）に相当する。

或いは、上記ゲノタイプＥ２／Ｅ３の場合と同様に考えて、３５ｂｐのＤＮＡ制限断片の量をα’（ｐｍｏｌ）、２６８ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｃ）、１８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｄ）又は１２３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）のＤＮＡ制限断片の量をβ（ｐｍｏｌ）とすると、ヘテロ二本鎖の生成割合Ｘ（％）は、
Ｘ（％）＝［（α’−３β）／（α’−β）］×１００
となる。

そして、求めたヘテロ二本鎖の生成割合Ｘ（％）と、３５ｂｐのＤＮＡ断片の量から、各ＤＮＡ断片の量を予測（推定）することができる。つまり、下記、
２６８ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｃ）の推定量（ｐｍｏｌ）：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×（α’−β）
１８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｄ）の推定量（ｐｍｏｌ）：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×（α’−β）
１２３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）の推定量（ｐｍｏｌ）：
｛［（１００−Ｘ）×０．０１］／２｝×（α’−β）
により各ＤＮＡ制限断片の量を推定することができる。

以上のようにして、ヘテロ接合体についての各ＤＮＡ制限断片の量を推定することができる。そして、各ＤＮＡ制限断片がその推定量に相当する量だけ存在するときに、該ＤＮＡ断片が出現したものと判断することができる。

又、ホモ接合体の場合は、次のようになる。増幅された後切断されたＰＣＲ産物の全量が１００ｐｍｏｌであると仮定した場合の、各ゲノタイプで生成する各ＤＮＡ制限断片の量（推定量）を図１０に示す。ゲノタイプＥ２／Ｅ２については、酵素処理後には、ＰＣＲで増幅された後切断されたＤＮＡの数（反応ＤＮＡ全量）と同じだけ、３５ｂｐのＤＮＡ制限断片（ＤＮＡ断片Ｒ１）が生成される。一方、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ４／Ｅ４については、ＰＣＲで増幅された後切断されたＤＮＡの数（反応ＤＮＡ全量）の２倍、３５ｂｐのＤＮＡ制限断片（ＤＮＡ断片Ｒ１及びＲ４）が生成される。

そして、ゲノタイプＥ２／Ｅ２、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ４／Ｅ４のサンプルではヘテロ二本鎖が生成されないため、ゲノタイプＥ２／Ｅ２では１２３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）、１８０ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｄ）のＤＮＡ制限断片が、このＤＮＡ断片の数と同じだけ生成される。一方、ゲノタイプＥ３／Ｅ３では１２３ｂｐ（ＤＮＡ断片Ａ）、１４５ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｂ）のＤＮＡ制限断片が３５ｂｐのＤＮＡ制限断片（ＤＮＡ断片Ｒ１及びＲ４）の１／２だけ生成し、Ｅ４／Ｅ４では２６８ｂｐ（ＤＮＡ断片Ｃ）のＤＮＡ制限断片が３５ｂｐのＤＮＡ制限断片（ＤＮＡ断片Ｒ１及びＲ４）の１／２だけ生成される。このように、ホモ接合体についても、各ＤＮＡ制限断片の量を推定することができる。そして、各ＤＮＡ制限断片がその推定量に相当する量だけ存在するときに、該ＤＮＡ制限断片が出現したものと判断することができる。

ところで、図１３は、上記非特許文献６に開示される方法によるＡｐｏＥ遺伝子多型の各ゲノタイプでのＤＮＡ断片の分離パターンを模式的に示す。非特許文献６の方法では、前述のプライマー対を用いてＡｐｏＥ遺伝子特異的な領域を増幅し、２種類の制限酵素ＡｆｌＩＩＩ、ＨａｅＩＩを用いて断片化する。そして、図１３に示すように、それぞれＥ３、Ｅ２、Ｅ４に特異的な１４５ｂｐ、１６８ｂｐ、１９５ｂｐのＤＮＡ制限断片が得られる。

しかしながら、非特許文献６は、Ｅ２及びＥ３で出現し、Ｅ４で出現しない最上流のＤＮＡ断片をＡｐｏＥ遺伝子多型の判別の根拠として用いることについては何ら言及していない。

又、この方法では、全てのゲノタイプで生成するＤＮＡ断片はなく、いずれかのＤＮＡ断片の存否によってＰＣＲ産物の消化が適正に行われたか否かの判断をすることは不可能である。又、同様に、全てのゲノタイプで生成するＤＮＡ断片はないので、いずれかのＤＮＡ断片の量を定量することによって、複製された後制限酵素で切断され、ゲノタイピングの用に供することのできるＤＮＡの全量を予測することができない。従って、ヘテロ二本鎖の発生割合を求めることも不可能である。

又、非特許文献６の方法では、未消化フラグメント（２１８ｂｐ）が、Ｅ２／Ｅ４の場合に生成し得るヘテロ二本鎖（２１８ｂｐ）と同じであるため、ヘテロ二本鎖が生成したのか、酵素反応が起こっているのかどうかの確認することはできない。そのため、タイピングを誤る可能性がある。

これに対して、本発明によれば、ＤＮＡ断片Ｆ及び／又はＥ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｒの存否によりＰＣＲ産物の適正な消化が行われたか否かを判断できる。これに加え、Ｅ２／Ｅ４の場合にヘテロ二本鎖が生成されると、酵素が反応したときにはＰＣＲ産物（図５に示す例では４６４ｂｐ、図８の例では４１９ｂｐ）は必然的に切断され、短いヘテロ二本鎖特異的断片（３０３ｂｐ）が出現する。によって反応が進んでいることを容易に確認できる。

上述のように、本発明に係るＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法は、一実施態様では、（１）ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＡｐｏＥ遺伝子に特異的なプライマー対を用いてＰＣＲ法によってＡｐｏＥ遺伝子の多型領域を増幅し、（２）増幅されたＤＮＡを所定の制限酵素を用いて切断し、（３）切断したＤＮＡ制限断片を分離し、分離されたＤＮＡ制限断片を検出する各段階を含む。又、本発明に係るＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法は、（４）検出したＤＮＡ断片長の組合せからＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピングを行う段階を更に含んでいてよい。更に、試料からゲノムＤＮＡを抽出する段階を含んでいてよい。

試料は、ゲノムＤＮＡを抽出することが可能であれば何を用いても構わない。例えば、末梢血液、毛根、爪、口腔粘膜などが例示される。好ましくは末梢血液である。

試料からのゲノムＤＮＡの抽出方法としては、如何なる手法をも用い得るが、例えば、市販のＤＮＡ精製キットを用いて、試料としての末梢血液から白血球を分離し、該白血球から市販のＤＮＡ精製キットを用いてゲノムＤＮＡを抽出することができる。この目的に好適に使用し得るＤＮＡ精製キットが、Wizard Plus Midipreps DNA Purification Systemとしてプロメガ社から市販されている。このキットを用いたＤＮＡ抽出の操作には３〜４時間ほど要する。一方、ボイリング法と呼ばれるＤＮＡ抽出方法（例えば、Applied Biosystems社のPrepMan Ultra Reagent）を用いれば２０分ほどでＰＣＲ法においてテンプレートとするのに十分な量のゲノムＤＮＡが得られる。

ＡｐｏＥ遺伝子の多型領域は、一般的にサーマルサイクラーと呼ばれるＤＮＡ増幅装置を用いてＰＣＲ法によって増幅することができる。ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いる場合、ゲノムＤＮＡ２本鎖を加熱して変性し、１本鎖にする（変性）。次に、増幅したい特定部位のＤＮＡ鎖の両端に相補的な２種類のオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー対）を反応系に過剰に加えた状態で温度を下げると、プライマーがＤＮＡ鎖の相補的な部位と２本鎖を形成する（アニーリング）。この状態でＤＮＡ合成基質のデオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）とＤＮＡポリメラーゼを作用させると、ポリメラーゼはプライマー部位からＤＮＡ相補鎖を合成していく（伸長反応）。引き続き、得られた２本鎖を加熱して１本鎖として、プライマーのアニーリング、伸長反応を行い、再度得られた２本鎖を１本鎖とする反応を繰り返す。

ＰＣＲ反応条件、即ち、ＰＣＲ反応混合物に含まれるテンプレートＤＮＡ、プライマー対、ｄＮＴＰ、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ等の種類・量（濃度）、或いは変性、アニーリング、伸長反応を行う温度・時間、サイクル数は、適宜選択事項である。本発明に従い、上記新規なプライマー対（配列番号１、配列番号２）及びＴａｑポリメラーゼを用いて、ＰＣＲ法でゲノタイピングに必要十分量のＤＮＡを好適に得ることのできる一実施例を後述する。

本発明の好ましい一実施態様では、配列番号１、２のプライマーを用いて増幅されたＡｐｏＥ遺伝子の多型領域は、２種類の制限酵素、より具体的には、上記制限酵素ＡｆｌＩＩＩ、ＨａｅＩＩの組合せを用いて切断する。斯かる切断は、当該制限酵素の組合せにおいて最適な条件、即ち、２種類の制限酵素が好適に作用し、ＲＦＬＰによるゲノタイピングを行うのに十分にＡｐｏＥ遺伝子の多型領域が切断される反応条件（反応混合物に含まれる成分の種類・量（濃度）、反応温度、反応時間など）にて行う。本発明者らの検討により最適と思われる一実施例を後述する。

得られたＤＮＡ制限断片は、好ましい一実施態様では、電気泳動で分離する。そして、分離されたＤＮＡ制限断片は、使用する電気泳動法に応じた方法により検出する。

上述のように、本発明によれば、上記新規なプライマー対、及び上記本発明に従う制限酵素、特に２種類の制限酵素の組合せ（ＡｆｌＩＩＩ、ＨａｅＩＩ）を用いることにより、非特許文献５に記載の制限酵素ＨｈａＩを用いた場合よりも長いＤＮＡ制限断片が得られる。より詳細には、本発明によれば、それぞれのアポリポタンパクＥ遺伝子多型に特異的な略１００ｂｐ以上のＤＮＡ制限断片が生成し、更に詳しくは、好ましい一実施態様では、上記第１の切断位置と第２の切断位置との間の長さ以上、即ち、１４４ｂｐ以上のＤＮＡ制限断片が生成する。これによって、ＤＮＡ分離方法として、典型的には、斯界にて通常用いられ、且つ、安価なＤＮＡ分離方法であるアガロースゲル電気泳動を用いても、高解像度にてＤＮＡ制限断片を分離することができる。アガロースゲル電気泳動では、種々の染色法のうち例えば、染色剤としてのエチジウムブロマイドで染色し、紫外線を照射することにより、分離されたＤＮＡ制限断片を検出することができる。

又、上記新規なプライマー対、及び上記本発明に従う制限酵素、特に２種類の制限酵素の組合せ（ＡｆｌＩＩＩ、ＨａｅＩＩ）を用いることにより、上記同様の理由から、前述の日立ＳＶ１２１０、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００、ＡＢＩ３１００（或いはＡＢＩ３７００）等の多様なＤＮＡ分離方法を用い、高解像度にてＤＮＡ制限断片を分離、検出することができる。

日立ＳＶ１２１０は、樹脂チップ上にサンプル等の装填用穴と微細な溝とが設けられたマイクロチップ［ｉ−チップ］及び所定の試薬キット（ゲル、染色試薬、内部標準等）と共に用い、又、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００の電気泳動用セットは、ガラスチップ上にサンプル等の装填用穴と微細な溝とが設けられたマイクロチップ［ＤＮＡ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）］及び所定の試薬キットと共に用い、所定の手順に従って所定の試薬及びサンプルをマイクロチップに装填して装置本体にセットすることで、マイクロチップ上の分離部へのゲルの充填、複数のサンプルの電気泳動、バンドの検出、データ出力を自動で行うことができる。分離されたＤＮＡ制限断片は、染色剤の蛍光により検出される。日立ＳＶ１２１０は１２サンプルを約５分で、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００は１２サンプルを約３０分で分析する。

又、ＡＢＩ３１００（或いはＡＢＩ３７００）は、キャピラリーと呼ばれる微小径ガラス管に充填したポリマー中で電気泳動を行うキャピラリー電気泳動法を利用し、サンプルの蛍光によりバンドを検出するシステムであり、所定のキャピラリーアレイ、セパレーションポリマー及び試薬キットと共に用いることで、キャピラリーへのポリマー充填、複数のサンプルの電気泳動、バンドの検出、データ出力を自動で行うことができる。ＡＢＩ３１００は、使用するキャピラリーアレイに応じて、約１時間〜数時間で複数サンプルを分析する。

非特許文献５に記載の制限酵素ＨｈａＩを用いた方法では、これら近年開発された種々のＤＮＡ分離方法を用いた場合にも、正確なゲノタイピングを行うには満足のゆく解像度を得ることができなかった。これに対し、本発明によれば、これらのＤＮＡ分離方法の利点を活用することが可能になり、ＤＮＡ制限断片の分離、検出の迅速化、大量処理化、又自動化が可能になった。更に、これら近年開発されたＤＮＡ分離方法においては、サンプル、試薬等の微量化が図れる。

又、本発明によれば、ＤＮＡ断片Ｆ及び／又はＥ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について生成するＤＮＡ断片Ｒの量を利用することによって、更にＡｐｏＥ遺伝子多型の検出、ゲノタイピングの正確性、信頼性を高めることができる。日立ＳＶ１２１０、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００、ＡＢＩ３１００（或いはＡＢＩ３７００）等の近年開発されＤＮＡ分離方法では、ＤＮＡ制限断片の同定、定量等の処理を極めて良好に高速且つ簡便に行うことができ、自動化を図ることもできる。

勿論、所望によりポリアクリルアミドゲル電気泳動によってＤＮＡ制限断片を分離、検出することもできる。

検出されたＤＮＡ制限断片の分離パターン（検出されたＤＮＡ断片長の存否の組み合わせ）から、ＡｐｏＥ遺伝子多型のタイピングを行う段階は、コンピュータ処理により自動化してもよい。更に、ロボット化等により自動化を進めてもよい。この場合、ＡｐｏＥ遺伝子多型の各ゲノタイプについて既知のＤＮＡ制限断片の分離パターンと、サンプルについて得られたＤＮＡ制限断片の分離パターンとを比較し、サンプルをいずれかのＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプに関係付ける出力を行うようにすればよいことは当業者にとって自明である。

即ち、本発明のＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法は、記憶部、演算処理部、出力部を備える一般的なコンピュータで実行可能なプログラムとして提供することができる。即ち、該プログラムにより、演算処理部は、本発明の本発明のＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法に従って検出した各ＤＮＡ断片長の存否の組み合わせと、記憶部に記憶された既知のＡｐｏＥ遺伝子多型の各ゲノタイプの同組み合わせとを比較し、上記本発明の判定方法に従って、サンプルのＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプを、いずれかのゲノタイプに関係付ける。そして、こうして関係付けた結果を、コンピュータの画面、記録紙等に出力させる。

又、演算処理部は、上述のように、ＤＮＡ断片Ｆ及び／又はＥ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｒの存否によって制限酵素が効果的に反応しているかを判断し、その結果に応じてサンプルのＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプを判定するか、若しくは検出結果を採用しない等の判断を行うことができる。又は、演算処理部は、上述したように、ＤＮＡ断片Ｆ及び／又はＥ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成するＤＮＡ断片Ｒを定量した結果（或いは、このＤＮＡ断片Ｂを定量した結果に基づくヘテロ二本鎖の生成割合）から、各ＤＮＡ断片の推定量を算出し、該推定量とそれぞれのＤＮＡ断片の測定値とを比較することで、測定値が推定量と適宜選定可能な所定の精度範囲で整合するか否かを判断することができる。そして、推定量と測定値とが整合したＤＮＡ断片についてそのＤＮＡ断片の存在を判断して、各ＤＮＡ断片の存否の組み合わせから、サンプルのＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプを判定することができる。

本発明に従ってヒト検体からの試料についてＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピングを行うことにより、ＡｐｏＥ遺伝子多型と関連する疾患の診断、治療のために、迅速、且つ、正確な情報を提供することができる。例えば、上述のように、ＡｐｏＥ遺伝子多型の１つであるＥ４は、アルツハイマー病、高脂血症、高リポタンパク血症、高コレステロール血症、心血管疾患（アテローム性動脈硬化、虚血性心疾患、脳血管障害など）、睡眠時無呼吸症候群の非常に強い危険因子であることが知られている。従って、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピングを行うことにより、より詳細には、例えば対象検体がＡｐｏＥ遺伝子多型のＥ４アリルを１つ有するのか、２つ有するのか、或いは有していないのかを迅速、且つ、正確に検出することによって、これらアルツハイマー病、心血管疾患などの予診が可能である。

特に、上述のような近年開発された種々のＤＮＡ分離方法によれば、分析作業の自動化、大量処理化が可能となるので、個々のサンプルのゲノタイピングに要する時間を短縮すると共に、多くの検体からのサンプルを一度に大量に処理することができ、診断、治療に極めて有用な情報を、正確、且つ、迅速に提供することができる。

尚、蛍光物質などの標識物質によってプライマーを修飾することにより、その標識物質を利用したＤＮＡ断片の分離、同定方法も可能である。

本発明に係るＡｐｏＥ遺伝子多型の検出試薬は、一実施態様では、上記ＡｐｏＥ遺伝子に特異的なプライマー対を含む増幅試薬である。増幅試薬は更に、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ）、緩衝液のいずれか若しくは全てを含んでいるか、又は組み合わされた試薬セットとされていてよい。詳しくは後述するように、所望に応じてｄＮＴＰは、標識物質（例えば蛍光物質）で標識されていてもよい。使用し得る耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼなどの耐熱性ポリメラーゼが挙げられるが、上記プライマー対（配列番号１、２）を用いる場合には、Ｔａｑポリメラーゼが好適である。緩衝液は、使用される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに応じて選択すればよい。増幅試薬は更に、塩、保存料（例えば、防腐剤（アジ化ナトリウム等）、酸化防止剤）、ＤＭＳＯ、ホルムアミド、ベタイン、ゼラチンなどの適当な添加成分のいずれか若しくは全てを含んでいるか、又は組み合わされた試薬セットとされていてよい。増幅試薬に含まれる若しくは組み合わされる諸成分の選択、濃度等の条件については、当業者は通常行う実験などを通して適宜選択することができる。

本発明に係るＡｐｏＥ遺伝子多型の検出試薬は、他の実施態様では、上記所定の制限酵素を含む消化試薬である。この消化試薬は更に、緩衝液を含んでいるか、若しくは組み合わされた試薬セットとされていてよい。緩衝液は、使用する制限酵素に応じて選択されるが、制限酵素がＡｆｌＩＩＩ、ＨａｅＩＩの組合せであるとき、中または高塩濃度緩衝液を好適に使用することができる。消化試薬は更に、塩、保存料（例えば、防腐剤（アジ化ナトリウム等）、酸化防止剤）、ＢＳＡ、グリセロール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの適当な添加成分のいずれか若しくは全てを含んでいるか、又は組み合わされた試薬セットとされていてよい。消化試薬に含まれる若しくは組み合わされる諸成分の選択、濃度等の条件については、当業者は通常行う実験などを通して適宜選択することができる。

更に、他の実施態様では、ＡｐｏＥ遺伝子多型の検出試薬は、上記増幅試薬、消化試薬が組み合わされた試薬セットとされていてもよい。

以下、本発明に係るＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法を実施例を通して更に詳しく説明する。以下の説明において、特に言及しない限り、用いられる器具、試薬は斯界にて一般的なものである。又、特に言及しない限り、以下で行われる実験操作も標準的なものと特に変わるところはない。

実施例１
［ＤＮＡ抽出］
先ず、ヒト検体の血液を試料として、白血球由来のゲノムＤＮＡを抽出する。ここでは、プロメガ社のＤＮＡ精製キットであるWizard Plus Midipreps DNA Purification Systemを用いて、末梢血液から白血球を分離し、その白血球からゲノムＤＮＡを抽出した。各検体毎に、ＰＣＲ法によるＡｐｏＥ遺伝子の多型領域の増幅に十分量のゲノムＤＮＡを抽出した。抽出の操作は付属のプロトコールに従って行った。

［ＡｐｏＥ領域のＤＮＡ増幅］
上記方法により抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、下記の条件にてＰＣＲ法によりＡｐｏＥ遺伝子の多型領域を増幅した。尚、プライマー対は、ＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）合成装置により合成して得た。又、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑポリメラーゼ（Parkin Elmer Cetus社）を用いた。

ａ）プライマー対
上流側プライマー（ＡＥ−Ｆａｆｌ５）：配列番号１
５’−ＡＣＡＣＣＣＴＣＣＣＧＣＣＣＴＣＴＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＧＣＧＣＧＧＡＴＧＧＡＣＧＡＧＡＣＣＡＴＧＡＡＣＧＣＧＴＴＧＡＡＧ−３’
下流側プライマー（ＡＥ−Ｒｈａｅ）：配列番号２
５’−ＧＣＣＣＧＣＴＣＣＴＧＴＡＧＣＧＧＣ−３’。

ｂ）ＰＣＲ反応混合物
白血球より抽出したゲノムＤＮＡ： ５０ｎｇ
プライマー対： １μＭ
ｄＮＴＰ ２００μＭ
緩衝液（１０倍濃縮標準ＰＣＲ緩衝液） １μｌ
ＤＭＳＯ(dimethyl sulfoxide)： ５％
Ｂｅｔａｉｎｅ（ベタイン）：１Ｍ
Ｔａｑポリメラーゼ： ０．０２５ｕｎｉｔｓ／μｌ
総反応量： １０μｌ。

ｃ）ＰＣＲサイクルの条件
９４℃，１分間（変性）
次いで、下記のサイクルを３５回繰り返す。
９４℃，３０秒間（変性）
６０℃，３０秒間（プライマーアニーリング）
７２℃，１分間（伸長反応）
次いで、次の条件で最終的に２本鎖を形成する。
７２℃，５分間（最終伸長反応）。

上記ＰＣＲ条件にて増幅されたＤＮＡフラグメントの量は約１００ｎｇであった。

［ＲＦＬＰ及び制限酵素切断断片の分離とゲノタイピング］
約１０〜２０ｎｇのＰＣＲ産物、制限酵素ＡｆｌＩＩＩ（New England biolabs社）（３ｕｎｉｔ）及びＨａｅＩＩ（New England biolabs社）（６ｕｎｉｔ）、１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ ３、１×ＢＳＡを含む反応溶液を、全量が１０μｌになるように調製し、３７℃で３０分以上反応させた。その後５０ｍＭ ＥＤＴＡを２．５μｌ加え、制限酵素を失活させた。その後、反応溶液の１μｌを、下記の条件での日立ＳＶ１２１０によるＤＮＡ制限断片の分離、検出に供した。

測定用マイクロチップ： ｉ−チップ ＩＣ−１１００
試薬キット： ＩＣ−９１０１。

測定手順は、装置供給元の指示に従った。ＤＮＡ制限断片の分離結果は、当該装置に接続されたコンピュータのディスプレイ上に表示される。代表的なＤＮＡ制限断片の分離結果を図１１に示す。図中に付記したように、上から順にＥ２／Ｅ３、Ｅ３／Ｅ４、Ｅ４／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ３の各ゲノタイプのＤＮＡ制限断片の分離パターンを示す。図１１は、１０ｂｐの内部標準を用いた例を示す。

［結果］
ａ）汎用性
図１１に示すように、本発明によれば、近年開発されたＤＮＡ分離方法である日立ＳＶ１２１０を好適に用いて良好に分離した各断片長毎のピークが得られた。そして、高解像度にてＡｐｏＥ遺伝子多型をゲノタイピングすることができた。ＤＮＡ制限断片の分離性、ゲノタイピングの容易性は、制限酵素ＨｈａＩを用いる非特許文献５の方法と比較して著しく向上した。

又、安価で広く用いられているＤＮＡ制限断片の分離方法であるアガロースゲル電気泳動によっても、高解像度にてＡｐｏＥ遺伝子多型をゲノタイピングすることができる。

このように、本発明に係るＡｐｏＥ遺伝子多型の検出方法は、現在使用されている多くの電気泳動法に適用可能であり、極めて汎用性が高い。

更に、本発明は、ＤＮＡ分離方法を電気泳動法に限定するものではない。上述のように、例えば、アガロースゲル電気泳動法は、安価且つ簡便であることから広く用いられている。又、日立ＳＶ１２１０等の他の近年開発された電気泳動法を利用した種々のＤＮＡ分離方法は極めて迅速、且つ、簡便である。これらの理由から、従来ＤＮＡ分離法として広く用いられている電気泳動法は、本発明を実施するに当たり最も好ましいと思われるが、本発明は他のＤＮＡ分離法、例えば質量分析機（MASS-Spectrometry）等を利用することでも実施可能である。

ｂ）簡便性、迅速性
本発明によれば、日立ＳＶ１２１０等の高速、自動処理が可能なＤＮＡ分離方法を好適に活用できるので、ＡｐｏＥ遺伝子多型の検出、ゲノタイピングにかかる時間を大幅に短縮することができる。又、アガロースゲル電気泳動を用いる場合でも、染色体ＤＮＡをテンプレートにしたＰＣＲから、ＡｐｏＥ遺伝子多型のタイピングの結果が判別するまで約３時間と、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いる非特許文献５の方法に比較して、ゲノタイピングにかかる時間を大幅に短縮することができる。更に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に比較して、アガロースゲル電気泳動は操作が極めて簡便であり、日立ＳＶ１２１０等のＤＮＡ分離方法は更に操作は簡便である。

ｃ）正確性
ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピングを本発明に従い日立ＳＶ１２１０を用いて行った結果と、同一検体からのサンプルについて従来汎用されてきた非特許文献５に記載の方法によりＡｐｏＥ遺伝子多型をゲノタイピングした結果は、全サンプルで一致した。

加えて、同一検体からのサンプルについて、ＡＢＩ３１００（Applied Biosystems社製）においてDNA Sequencing Kit (BigDye Terminator Ver. 3 Cycle Suquencing Ready Reaction)を用いたＤＮＡ直接塩基配列決定法によって多型部分の塩基配列の確認を行ったが、塩基配列から決定されたＡｐｏＥ遺伝子多型と、本発明に従って得たタイピング結果とは全例で一致した。

又、ＤＮＡ断片Ｆ（図１１中５０ｂｐ近傍のピーク）、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について生成するＤＮＡ断片Ｒ（図１１中８０ｂｐ近傍のピーク）の存在により、それぞれＡｆｌＩＩＩ、ＨａｅＩＩによる切断反応が適切に進行したことを判定することができる。更に、これらＤＮＡ断片Ｆ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について生成するＤＮＡ断片Ｒを定量することにより、更に正確性、信頼性の向上したＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプの判定が可能である。

ＤＮＡ断片Ｆ（５０ｂｐのＤＮＡ制限断片）、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型から生成するＤＮＡ断片Ｒ（ここでは８０ｂｐのＤＮＡ制限断片）からヘテロ二本鎖の生成割合Ｘを求め、このヘテロ二本鎖の生成割合Ｘから求まる代表的なＤＮＡ制限断片の生成量の計算値と実測値とを比較したいくつかの例を下記表７〜９に示す。表中α１は５０ｂｐのＤＮＡ制限断片を定量した値、α２は８０ｂｐのＤＮＡ制限断片を定量した値（単位ｎｇ／μＬ・ｂｐ［濃度／ｓｉｚｅ］：ｍｏｌに相当する）を示す。Ｘ１、Ｘ２は、上記α１、α２をそれぞれ用いて算出されたヘテロ二本鎖の生成割合である。又、βはゲノタイプＥ３／Ｅ４については１４５ｂｐのＤＮＡ制限断片の生成量（実測値）を、ゲノタイプＥ２／Ｅ３についても１４５ｂｐのＤＮＡ制限断片の生成量（実測値）を用いた。そして、Ｅ３／Ｅ４については、１４５ｂｐのＤＮＡ断片以外の１２３ｂｐ、２６８ｂｐのＤＮＡ断片に関し上記実測値を用いて前述の式により計算した計算値（推測値）と実測値を比較した。又、Ｅ２／Ｅ３についても、１４５ｂｐのＤＮＡ断片以外の１２３ｂｐ、１８０ｂｐのＤＮＡ断片に関し上記実測値を用いて前述の式により計算した計測値（推測値）と実測値とを比較した。下記表７、８、９より、略１０％以内の誤差で実測値と計測値が一致していることが分かる。

ｄ）大量処理
例えば、日立ＳＶ１２１０のシステムでは、マイクロチップへの泳動ゲルの分注と充填、内部標準マーカー及びサンプルの分注を短時間で行う分注ロボットの使用が可能であり、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピングの高速大量化が可能である。

以上説明したように、本発明によれば、
（Ａ）ＲＦＬＰのＤＮＡ制限断片を検出し易くなる。
（Ｂ）加えて、上記（Ａ）によって検出方法の汎用性が広がり、自動処理化にあいまって高速大量処理化が可能になる。又、機械化、製品化に際しての正確性、信頼性を更に向上させることができる。
（Ｃ）ＤＮＡを直接タイピングすることによって、抗体法を用いるようなタンパク質のタイピング法に比較して擬陽性（false-positive）が大幅に減少し、それによってタイピングの正確性を増すことができる。
（Ｄ）制限酵素による消化反応が適正に行われたか否かを判断することができ、又定量的にＤＮＡ制限断片の存否を判定することができるので、ＡｐｏＥ遺伝子多型の検出、ゲノタイプの判定の正確性、信頼性を格段に向上させることができる。
（Ｅ）例えば、アルツハイマー型痴呆、その他の心血管疾患など、ＡｐｏＥ遺伝子多型が関連する疾患の診断、治療にとって有用な情報となるゲノタイピングという臨床検査を行う上で、上記各点は極めて重要な要素であり、本発明によれば、斯かる有用な情報を正確、且つ、迅速に提供することができる。

本発明に従うＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピングの概念図である。 上流側プライマーの一実施例を示す模式図である。 本発明に従うプライマー対の設定位置を説明するための模式図である。 ヘテロ二本鎖の生成を説明するための模式図である。 ヘテロ二本鎖の生成を考慮した場合の本発明に従うゲノタイピングの概念図である。 ヘテロ接合体についてヘテロ接合体が生成した場合の各ＤＮＡ断片の生成量の推定方法の一例を説明するための模式図である。 ホモ接合体についてヘテロ接合体が生成した場合の各ＤＮＡ断片の生成量の推定方法の一例を説明するための模式図である。 ヘテロ二本鎖の生成を考慮した場合の本発明に従うゲノタイピングの他の例の概念図である。 ヘテロ接合体についてヘテロ接合体が生成した場合の各ＤＮＡ断片の生成量の推定方法の他の例を説明するための模式図である。 ホモ接合体についてヘテロ接合体が生成した場合の各ＤＮＡ断片の生成量の推定方法の他の例を説明するための模式図である。 本発明に従ってＡｐｏＥ遺伝子の制限断片を日立ＳＶ１２１０により分離した結果を示す図である。 制限酵素ＨｈａＩを用いた従来のＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピングの概念図である。 制限酵素ＡｆｌＩＩＩ及びＨａｅＩＩを用いた従来のＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピングの概念図である。

Claims (33)

1. アポリポタンパクＥ遺伝子に特異的なプライマー対を用いてＤＮＡを増幅する段階、
   増幅されたＤＮＡを、アポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１１２の一塩基多型部位を認識配列に含む第１の制限酵素と、アポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１５８の一塩基多型部位を認識配列に含む第２の制限酵素と、を用いて切断する段階、
   切断されたＤＮＡ断片を分離する段階、
   分離されたＤＮＡ断片を検出する段階、
   を有し、
   前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記コドン１１２の一塩基多型部位を含む前記第１の制限酵素の認識配列より上流側に前記第１の制限酵素の認識配列を導入する、少なくとも１塩基の変異を導入された配列であって、前記コドン１１２の一塩基多型部位を含む前記第１の制限酵素の認識配列での切断位置より４５ｂｐ以上、１３６ｂｐ以下の上流の位置に前記第１の制限酵素による切断位置が配置されるように設定される配列を有し、且つ、該上流側プライマーは、前記導入される前記第１の制限酵素の認識配列での切断位置よりも４５ｂｐ以上の上流の位置に５’末端が設定され、
   前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記コドン１５８の一塩基多型部位を含む前記第２の制限酵素の認識配列での切断位置より７０ｂｐ以上の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とするアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
2. 前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記切断段階にて、前記導入される前記第１の制限酵素の認識配列での切断位置よりも上流の配列のみを含む４５ｂｐ以上のＤＮＡ断片が生成するように設定されることを特徴とする請求項１のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
3. 前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記導入される前記第１の制限酵素の認識配列での切断位置より１１０ｂｐ以下の上流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項１又は２のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
4. 前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記コドン１１２の一塩基多型部位より上流側における第２の制限酵素の認識配列を消失させる、少なくとも１塩基の変異を導入された配列を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
5. 前記切断段階で生成される、前記導入される前記第１の制限酵素の認識配列での切断位置より上流の配列のみを含むＤＮＡ断片と、アポリポタンパクＥ遺伝子のＥ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成する前記コドン１５８の一塩基多型部位を含む前記第２の制限酵素の認識配列での切断位置よりも下流側の配列のみを含むＤＮＡ断片と、が分離可能であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
6. 前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記コドン１５８の一塩基多型部位を含む前記第２の制限酵素の認識配列での切断位置よりも１００ｂｐ以上の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項１〜５のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
7. 前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記コドン１５８の一塩基多型部位を含む前記第２の制限酵素の認識配列での切断位置より２０２ｂｐ以下の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項１〜６のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
8. 前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記切断段階にて、アポリポタンパクＥ遺伝子のＥ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて、前記コドン１５８の一塩基多型部位を含む前記第２の制限酵素の認識配列での切断位置よりも下流の配列のみを含む４５ｂｐ以上のＤＮＡ断片が生成するように設定されることを特徴とする請求項１〜７のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
9. 前記導入される前記第１の制限酵素の認識配列より上流側、前記導入される前記第１の制限酵素の認識配列と前記コドン１１２の一塩基多型部位を含む前記第１の制限酵素の認識配列との間、前記コドン１１２の一塩基多型部位を含む前記第１の制限酵素の認識配列と前記コドン１５８の一塩基多型部位を含む前記第２の制限酵素の認識配列との間に、前記第１及び第２の制限酵素のいずれの認識配列も持たないことを特徴とする請求項１〜８のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
10. 前記第１の制限酵素は塩基配列ＡＣＲＹＧＴ（ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ）を認識して切断し、前記第２の制限酵素は塩基配列ＲＧＣＧＣＹ（ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ）を認識して切断することを特徴とする請求項１〜９のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
11. 前記第１の制限酵素はＡｆｌＩＩＩ、前記第２の制限酵素はＨａｅＩＩであることを特徴とする請求項１０のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
12. 前記プライマー対のうち上流側プライマーは、配列番号１の配列から成るオリゴヌクレオチドであり、前記プライマー対のうち下流側プライマーは、配列番号２の配列から成るオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
13. 切断されたＤＮＡ断片を電気泳動で分離することを特徴とする請求項１〜１２のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
14. 請求項１〜１３のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法により検出されたＤＮＡ断片の存否の組み合わせからアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプを判定するアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法であって、
    前記上流側プライマーにより導入される認識配列での切断位置（導入切断位置）より上流の配列Ｆのみを含むＤＮＡ断片を断片Ｆ、前記コドン１５８の一塩基多型部位を含む認識配列での切断位置（第２切断位置）より下流の配列Ｒのみを含むＤＮＡ断片を断片Ｒ、前記コドン１１２の一塩基多型部位を含む認識配列での切断位置（第１切断位置）より上流且つ前記導入切断位置より下流の配列Ａのみを含むＤＮＡ断片を断片Ａ、前記第１切断位置と前記第２切断位置との間の配列Ｂのみを含むＤＮＡ断片を断片Ｂ、前記配列Ａ及びＢを含むＤＮＡ断片を断片Ｃ、前記配列Ｂ及びＲを含むＤＮＡ断片を断片Ｄとしたとき、断片Ｂ、断片Ｃ及び断片Ｄの存否をアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプの判定に用い、
    （ａ）断片Ｄのみの存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ２を判定し、
    （ｂ）断片Ｂのみの存在によりゲノタイプＥ３／Ｅ３を判定し、
    （ｃ）断片Ｃのみの存在によりゲノタイプＥ４／Ｅ４を判定し、
    （ｄ）断片Ｂ及び断片Ｄのみの存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ３を判定し、
    （ｅ）断片Ｃ及び断片Ｄのみの存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ４を判定し、
    （ｆ）断片Ｂ及び断片Ｃのみの存在によりゲノタイプＥ３／Ｅ４を判定する、
    ことを特徴とするアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法。
15. 請求項１〜１３のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法により検出されたＤＮＡ断片の存否の組み合わせからアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプを判定するアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法であって、
    前記上流側プライマーにより導入される認識配列での切断位置（導入切断位置）より上流の配列Ｆのみを含むＤＮＡ断片を断片Ｆ、前記コドン１５８の一塩基多型部位を含む認識配列での切断位置（第２切断位置）より下流の配列Ｒのみを含むＤＮＡ断片を断片Ｒ、前記コドン１１２の一塩基多型部位を含む認識配列での切断位置（第１切断位置）より上流且つ前記導入切断位置より下流の配列Ａのみを含むＤＮＡ断片を断片Ａ、前記第１切断位置と前記第２切断位置との間の配列Ｂのみを含むＤＮＡ断片を断片Ｂ、前記配列Ａ及びＢを含むＤＮＡ断片を断片Ｃ、前記配列Ｂ及びＲを含むＤＮＡ断片を断片Ｄとしたとき、断片Ａ、断片Ｂ、断片Ｃ及び断片Ｄの存否をアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプの判定に用い、
    （ａ）断片Ａ及び断片Ｄのみの存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ２を判定し、
    （ｂ）断片Ａ及び断片Ｂのみの存在によりゲノタイプＥ３／Ｅ３を判定し、
    （ｃ）断片Ｃのみの存在によりゲノタイプＥ４／Ｅ４を判定し、
    （ｄ）断片Ａ、断片Ｂ及び断片Ｄのみの存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ３を判定し、
    （ｅ）断片Ａ、断片Ｃ及び断片Ｄのみの存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ４を判定し、
    （ｆ）断片Ａ、断片Ｂ及び断片Ｃのみの存在によりゲノタイプＥ３／Ｅ４を判定する、
    ことを特徴とするアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法。
16. 請求項１〜１３のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法により検出されたＤＮＡ断片の存否の組み合わせからアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプを判定するアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法であって、
    前記上流側プライマーにより導入される認識配列での切断位置（導入切断位置）より上流の配列Ｆのみを含むＤＮＡ断片を断片Ｆ、前記コドン１５８の一塩基多型部位を含む認識配列での切断位置（第２切断位置）より下流の配列Ｒのみを含むＤＮＡ断片を断片Ｒ、前記コドン１１２の一塩基多型部位を含む認識配列での切断位置（第１切断位置）より上流且つ前記導入切断位置より下流の配列Ａのみを含むＤＮＡ断片を断片Ａ、前記第１切断位置と前記第２切断位置との間の配列Ｂのみを含むＤＮＡ断片を断片Ｂとしたとき、前記配列Ａ、配列Ｂ及び配列Ｒを含むヘテロ二本鎖特異的断片の存否をアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプの判定に用い、該ヘテロ二本鎖特異的断片の存在によりゲノタイプＥ２／Ｅ４を判定することを特徴とするアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法。
17. 請求項１〜１３のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法により検出されたＤＮＡ断片の存否の組み合わせからアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプを判定するアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法であって、
    前記上流側プライマーにより導入される認識配列での切断位置（導入切断位置）より上流の配列Ｆのみを含むＤＮＡ断片を断片Ｆ、前記コドン１５８の一塩基多型部位を含む認識配列での切断位置（第２切断位置）より下流の配列Ｒのみを含むＤＮＡ断片を断片Ｒ、前記コドン１１２の一塩基多型部位を含む認識配列での切断位置（第１切断位置）より上流且つ前記導入切断位置より下流の配列Ａのみを含むＤＮＡ断片を断片Ａとしたとき、断片Ａの存否をアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプの判定に用い、断片Ａの非存在によりゲノタイプＥ４／Ｅ４を判定することを特徴とするアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法。
18. 更に、断片Ｆの存在により、前記切断段階における有効な切断反応の存在を判定することを特徴とする請求項１４〜１７のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法。
19. 更に、アポリポタンパクＥ遺伝子多型Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成される断片Ｒの存在により、前記切断段階における有効な切断反応の存在を判定することを特徴とする請求項１４〜１７のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法。
20. 更に、断片Ｆの存在及びアポリポタンパクＥ遺伝子多型Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成する断片Ｒの存在により、前記切断段階における前記第１の制限酵素による有効な切断反応及び前記第２の制限酵素による有効な切断反応の存在を判定することを特徴とする請求項１４〜１７のアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法。
21. 前記有効な切断反応の存在を判定した場合に、検出されたＤＮＡ断片の存否の組み合わせからアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプを判定することを特徴とする請求項１８、１９又は２０のアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法。
22. 更に、断片Ｆ及び／又はアポリポタンパクＥ遺伝子多型Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成される断片Ｒを定量した結果に基づいて、断片Ａ、断片Ｂ、断片Ｃ及び／又は断片Ｄの存否を判断することを特徴とする請求項１４又は１５のアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法。
23. 前記断片Ｆ及び／又はアポリポタンパクＥ遺伝子多型Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成される断片Ｒを定量した結果に基づいて、断片Ａ、断片Ｂ、断片Ｃ及び／又は断片Ｄの推定量を求め、該推定量を、それぞれ断片Ａ、断片Ｂ、断片Ｃ及び／又は断片Ｄを定量した実測値と比較することで、それぞれの断片の存否を判断することを特徴とする請求項２２のアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法。
24. 更に、前記（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）の各場合の判定に際し、断片Ｆ及び／又はアポリポタンパクＥ遺伝子多型Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成する断片Ｒを定量した結果から求めたヘテロ二本鎖の生成割合に基づいて、断片Ａ、断片Ｂ、断片Ｃ及び／又は断片Ｄの存否を判断することを特徴とする請求項１４又は１５のアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法。
25. 前記ヘテロ二本鎖の生成割合に基づいて、断片Ａ、断片Ｂ、断片Ｃ及び／又は断片Ｄの推定量を求め、該推定量を、それぞれ断片Ａ、断片Ｂ、断片Ｃ及び／又は断片Ｄを定量した実測値と比較することで、それぞれの断片の存否を判断することを特徴とする請求項２４のアポリポタンパクＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定方法。
26. アポリポタンパクＥ遺伝子に特異的なプライマー対を用いてＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡを、アポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１１２の一塩基多型部位を認識配列に含む第１の制限酵素と、アポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１５８の一塩基多型部位を認識配列に含む第２の制限酵素と、を用いて切断することを含むアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法に使用するための、前記プライマー対を備えるアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出用試薬であって、
    前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記コドン１１２の一塩基多型部位を含む前記第１の制限酵素の認識配列より上流側に前記第１の制限酵素の認識配列を導入する、少なくとも１塩基の変異を導入された配列であって、前記コドン１１２の一塩基多型部位を含む前記第１の制限酵素の認識配列での切断位置より４５ｂｐ以上、１３６ｂｐ以下の上流の位置に前記第１の制限酵素による切断位置が配置されるように設定される配列を有し、且つ、該上流側プライマーは、前記導入される前記第１の制限酵素の認識配列での切断位置よりも４５ｂｐ以上の上流の位置に５’末端が設定され、
    前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記コドン１５８の一塩基多型部位を含む前記第２の制限酵素の認識配列での切断位置より７０ｂｐ以上の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とするアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出用試薬。
27. 前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記コドン１１２の一塩基多型部位より上流側における第２の制限酵素の認識配列を消失させる、少なくとも１塩基の変異を導入された配列を有することを特徴とする請求項２６のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出用試薬。
28. 前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記導入される前記第１の制限酵素の認識配列での切断位置より１１０ｂｐ以下の上流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項２６又は２７のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出用試薬。
29. 前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記コドン１５８の一塩基多型部位を含む前記第２の制限酵素の認識配列での切断位置より２０２ｂｐ以下の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項２６〜２８のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出用試薬。
30. 前記プライマー対のうち上流側プライマーは、配列番号１の配列から成るオリゴヌクレオチドであり、前記プライマー対のうち下流側プライマーは、配列番号２の配列から成るオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２６〜２９のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出用試薬。
31. 前記第１の制限酵素及び前記第２の制限酵素での切断により生成される、前記導入される前記第１の制限酵素の認識配列での切断位置より上流の配列のみを含むＤＮＡ断片と、アポリポタンパクＥ遺伝子のＥ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成する前記コドン１５８の一塩基多型部位を含む前記第２の制限酵素の認識配列での切断位置よりも下流側の配列のみを含むＤＮＡ断片と、が分離可能であることを特徴とする請求項２６〜３０のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出用試薬。
32. 更に、塩基配列ＡＣＲＹＧＴ（ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ）を認識して切断する前記第１の制限酵素、塩基配列ＲＧＣＧＣＹ（ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ）を認識して切断する前記第２の制限酵素と組み合わされて成ることを特徴とする請求項２６〜３１のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出用試薬。
33. 前記第１の制限酵素はＡｆｌＩＩＩ、前記第２の制限酵素はＨａｅＩＩであることを特徴とする請求項３２のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出用試薬。

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