CN114164214B

CN114164214B - 一种基于crispr技术检测病原微生物的方法

Info

Publication number: CN114164214B
Application number: CN202111554420.0A
Authority: CN
Inventors: 王丽梅; 梁亚峰
Original assignee: Shandong Shunfeng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shandong Shunfeng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2021-06-11
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2022-11-22
Anticipated expiration: 2041-12-17
Also published as: CN114164214A; CN115851719A; CN116334081A

Abstract

本发明提供了一种基于CRISPR技术检测I型牛疱疹病毒或牛病毒性腹泻病毒或布鲁氏杆菌或传染性鼻气管炎或病毒性腹泻/粘膜病或布鲁氏菌病的方法，所述方法包括利用gRNA、Cas蛋白和单链核酸检测器进行检测的步骤；本发明通过对gRNA的筛选和优化，提高了检测效率，具有广阔的应用前景。

Description

一种基于CRISPR技术检测病原微生物的方法

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，尤其涉及基于CRISPR技术检测I型牛疱疹病毒或牛病毒性腹泻病毒或布鲁氏杆菌的方法、系统和试剂盒。

背景技术

传染性鼻气管炎(Bovine infectious rhinotracheitis)，又称坏死性鼻炎、红鼻病，是由I型牛疱疹病毒(Bovine herpesvirus type 1)引起牛的一种接触性传染病，表现上呼吸道及气管黏膜发炎、呼吸困难、流鼻汁等症状，BHV-1还可引起生殖道感染、结膜炎、脑膜脑炎、流产、乳房炎等多种病症。该病被OIE列为B类传染病，也被我国列为二类动物传染病。目前国内外用于诊断I型牛疱疹病毒的检验方法包括：病毒分离、包涵体检查、免疫荧光试验、血清中和试验、间接血凝试验或酶联免疫吸附试验等。近年来，检测病毒DNA的核酸探针技术、聚合酶链反应(PCR)技术也已建立。在国际贸易中，指定诊断方法为病毒中和试验、酶联免疫吸附试验和病原分离鉴定(仅限于精液)。

病毒性腹泻/粘膜病(Viral Diarrhea/Mucosal Disease)，是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea/Mucosal Disease Virus)引起的传染病，以粘膜发炎、糜烂、坏死和腹泻为特征。家养和野生的反刍兽及猪是本病的自然宿主，自然发病病例仅见于牛，黄牛、水羊、牦牛，没有明显的种间差异。各种年龄的牛都有易感性，但6-18月龄的幼牛易感性较高，感染后更易发病。绵羊、山羊也可发生亚临诊感染，感染后产生抗体。牛病毒性腹泻病毒的检测方法有很多，包括血清中和试验、免疫组化方法、ELISA和荧光PCR技术。也有利用CRISPR-Cas13a检测牛病毒性腹泻病毒的报道(例如，中国专利申请CN111979357A)，但是检测耗时较长，并且，其检测的是RNA，应用场景有限。

布鲁氏菌病(Brucellosis)，又称布病、地中海弛张热、马耳他热、波浪热，是一种人畜共患性全身传染病。布病主要损害人、畜的生殖系统和关节，对畜牧业的发展以及人类健康产生了较大的危害。布鲁氏菌病的病原菌为布鲁氏杆菌(Brucella)。布鲁氏菌病病畜诊断标准如下：①分离出布鲁氏杆菌。②血清学正式试验中试管凝集试验阳性或补体结合试验阳性。③初筛试验中，一项或多项出现阳性，并有流行病学史和临床症状者。一般牲畜具备上述一项者即判定为病畜。目前已经有采用Cas12a检测布鲁氏杆菌的方法，如中国专利申请CN112322764A，但是检测耗时较长，检测灵敏度低。

本发明提供了一种新型的检测I型牛疱疹病毒、或牛病毒性腹泻病毒、或布鲁氏杆菌的方法，该方法是基于CRISPR技术，尤其是基于V型Cas酶的trans活性，提供的一种快速简便、特异性高、检测灵敏度高的检测方法。

发明内容

本发明提供了一种基于CRISPR技术进行I型牛疱疹病毒、或牛病毒性腹泻病毒、或布鲁氏杆菌检测的方法、系统和试剂盒。

一方面，本发明提供了一种用于检测I型牛疱疹病毒的gRNA，所述gRNA包括与Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述靶核酸为来源于I型牛疱疹病毒的核酸。

本发明中，所述与CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域又称为同向重复序列、骨架区或spacer序列，该区域与Cas蛋白相互作用，从而结合Cas蛋白。

在一个实施方式中，所述gRNA自5’端至3’端依次包括与Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列。

在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有20-30个碱基，并且与SEQID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交，并且所述导向序列包含SEQ ID No.5-8任一所示的序列；优选的，所述导向序列包含SEQ ID No.5、6、7、8任一所示的序列。

在优选的实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有20-30个碱基，例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基。

在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列包含SEQ ID No.5-8任一所示的序列，并且在SEQ ID No.5-8任一所示的序列的3’端还包括1-10个碱基(优选，1、2、3、4、5、6、7、8、9个碱基)，并且，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交；优选的，所述导向序列包含SEQ ID No.5、6、7、8任一所示的序列。

在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.5-8任一所示的序列相比，在SEQ ID No.5-8任一所示的序列的3’端连续缺失1-5个碱基(例如，1、2、3、4、5个碱基)。

所述与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交，是指上述导向序列与SEQID No.1或SEQ ID No.1的反向互补序列的连续的一段可以连续的互补配对。比如，所述与靶核酸杂交的导向序列含有30个碱基，则，导向序列的30个碱基需要与SEQ ID No.1或其互补序列的连续30个碱基互补配对。

在更优选的实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列如SEQ ID No.5-8任一所示。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白选自V型Cas蛋白，例如，Cas12、Cas14家族蛋白或其突变体。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白优选为Cas12家族，包括但不限于Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12j中的一种或任意几种。

优选的，所述与Cas蛋白结合的区域的序列如SEQ ID No.21所示。

另一方面，本发明提供了一种检测/诊断I型牛疱疹病毒的组合物，所述组合物包括上述gRNA，还包括Cas蛋白以及单链核酸检测器。

另一方面，本发明提供了一种检测/诊断I型牛疱疹病毒或传染性鼻气管炎的方法，所述方法包括将待测核酸与V型Cas蛋白、上述gRNA和单链核酸检测器接触；检测由Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测I型牛疱疹病毒或传染性鼻气管炎。

进一步的，所述方法还包括从待测样品中获得待测核酸的步骤；优选的，采用扩增的方法从待测样品中获得待测核酸。

本发明中，所述待测核酸可以是双链核酸，也可以是单链核酸。

本发明所述扩增选自PCR、基于核酸测序的扩增(NASBA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、或切口酶扩增反应(NEAR)、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增(RCA)、连接酶链反应(LCR)、或衍生物扩增方法(RAM)中的一种或任意几种。

本发明中，所述样品可以为来自反刍动物的样品，例如，牛、羊；其他的实施方式中，所述样品还可以来自其他动物，例如，猪、马、驴。

在一个实施方式中，所述样品可以为鼻腔拭子、脓性鼻液、生殖道拭子、精液、呼吸道黏膜、部分扁桃体、肺、支气管淋巴结、动物胎儿、肝、肺、肾和胎盘子叶。

在其他的实施方式中，所述样品还可以来源于养殖场的环境样品，例如，空气、水体、土壤、养殖场的设备等。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测或诊断待测动物是否感染传染性鼻气管炎的系统、组合物或试剂盒，所述系统、组合物或试剂盒包括V型Cas蛋白、上述gRNA和单链核酸检测器。进一步的，所述系统、组合物或试剂盒还包括扩增引物。

另一方面，本发明还提供了上述用于检测或诊断待测动物是否感染传染性鼻气管炎的组合物在诊断或检测传染性鼻气管炎中的用途，或者在用于制备诊断或检测传染性鼻气管炎的试剂或试剂盒中的用途。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测/诊断I型牛疱疹病毒的系统、组合物或试剂盒，所述系统、组合物或试剂盒包括V型Cas蛋白、上述gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器。

另一方面，本发明还提供了上述系统、组合物或试剂盒在检测/诊断I型牛疱疹病毒中的应用。

另一方面，本发明还提供了上述组合物在制备检测/诊断I型牛疱疹病毒的试剂或试剂盒中的用途。

进一步的，所述V型Cas蛋白选自Cas12、Cas14家族蛋白或其突变体。

在一个实施方式中，所述Cas12a选自FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a中一种或任意几种。

在优选的实施方式中，所述Cas12i蛋白的氨基酸序列选自下组：

(1)SEQ ID NO：4所示的蛋白；

(2)将SEQ ID NO：4所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白；

(3)与SEQ ID NO：4具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或至少99％的序列同一性的，且具有trans活性的蛋白。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白突变体包括氨基酸取代、缺失或替换，且所述突变体至少保留其trans切割活性。优选地，所述突变体具有Cis和trans切割活性。

另一方面，本发明提供了一种用于检测牛病毒性腹泻病毒的gRNA，所述gRNA包括与Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述靶核酸为来源于牛病毒性腹泻病毒的核酸。

在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有20-30个碱基，并且与SEQID No.2所示的序列或其反向互补序列杂交，并且所述导向序列包含SEQ ID No.9-10任一所示的序列；优选的，所述导向序列包含SEQ ID No.9、10任一所示的序列。

在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列包含SEQ ID No.9-10任一所示的序列，并且在SEQ ID No.9-10任一所示的序列的3’端还包括1-10个碱基(优选，1、2、3、4、5、6、7、8、9个碱基)，并且，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.2所示的序列或其反向互补序列杂交；优选的，所述导向序列包含SEQ ID No.9、10任一所示的序列。

在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.9-10任一所示的序列相比，在SEQ ID No.9-10任一所示的序列的3’端连续缺失1-5个碱基(例如，1、2、3、4、5个碱基)。

所述与SEQ ID No.2所示的序列或其反向互补序列杂交，是指上述导向序列与SEQID No.2或SEQ ID No.2的反向互补序列的连续的一段可以连续的互补配对。比如，所述与靶核酸杂交的导向序列含有30个碱基，则，导向序列的30个碱基需要与SEQ ID No.2或其互补序列的连续30个碱基互补配对。

在更优选的实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列如SEQ ID No.9-10任一所示。

优选的，所述与Cas蛋白结合的区域的序列如SEQ ID No.21所示。

另一方面，本发明提供了一种检测/诊断牛病毒性腹泻病毒的组合物，所述组合物包括上述gRNA，还包括Cas蛋白以及单链核酸检测器。

另一方面，本发明提供了一种检测/诊断牛病毒性腹泻病毒或病毒性腹泻/粘膜病的方法，所述方法包括将待测核酸与V型Cas蛋白、上述gRNA和单链核酸检测器接触；检测由Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测牛病毒性腹泻病毒或病毒性腹泻/粘膜病。

在一个实施方式中，所述样品可以为分泌物、排泄物、血液或脾脏样品。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测或诊断待测动物是否感染病毒性腹泻/粘膜病的系统、组合物或试剂盒，所述系统、组合物或试剂盒包括V型Cas蛋白、上述gRNA和单链核酸检测器。进一步的，所述系统、组合物或试剂盒还包括扩增引物。

另一方面，本发明还提供了上述用于检测或诊断待测动物是否感染病毒性腹泻/粘膜病的组合物在诊断或检测病毒性腹泻/粘膜病中的用途，或者在用于制备诊断或检测病毒性腹泻/粘膜病的试剂或试剂盒中的用途。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测/诊断牛病毒性腹泻病毒的系统、组合物或试剂盒，所述系统、组合物或试剂盒包括V型Cas蛋白、上述aRNA(指导RNA)和单链核酸检测器。

另一方面，本发明还提供了上述系统、组合物或试剂盒在检测/诊断牛病毒性腹泻病毒中的应用。

另一方面，本发明还提供了上述组合物在制备检测/诊断牛病毒性腹泻病毒的试剂或试剂盒中的用途。

(1)SEQ ID NO：4所示的蛋白；

另一方面，本发明提供了一种用于检测布鲁氏杆菌的gRNA，所述gRNA包括与Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述靶核酸为来源于布鲁氏杆菌的核酸。

在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有20-30个碱基，并且与SEQID No.3所示的序列或其反向互补序列杂交，并且所述导向序列包含SEQ ID No.11-20任一所示的序列；优选的，所述导向序列包含SEQ ID No.11、12、13、14、15、16、17、18、19、20任一所示的序列。

在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列包含SEQ ID No.11-20任一所示的序列，并且在SEQ ID No.11-20任一所示的序列的3’端还包括1-10个碱基(优选，1、2、3、4、5、6、7、8、9个碱基)，并且，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.3所示的序列或其反向互补序列杂交；优选的，所述导向序列包含SEQ ID No.11、12、13、14、15、16、17、18、19、20任一所示的序列。

在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.11-20任一所示的序列相比，在SEQ ID No.11-20任一所示的序列的3’端连续缺失1-5个碱基(例如，1、2、3、4、5个碱基)。

所述与SEQ ID No.3所示的序列或其反向互补序列杂交，是指上述导向序列与SEQID No.3或SEQ ID No.3的反向互补序列的连续的一段可以连续的互补配对。比如，所述与靶核酸杂交的导向序列含有30个碱基，则，导向序列的30个碱基需要与SEQ ID No.3或其互补序列的连续30个碱基互补配对。

在更优选的实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列如SEQ ID No.11-20任一所示。

优选的，所述与Cas蛋白结合的区域的序列如SEQ ID No.21所示。

另一方面，本发明提供了一种检测/诊断布鲁氏杆菌的组合物，所述组合物包括上述gRNA，还包括Cas蛋白以及单链核酸检测器。

另一方面，本发明提供了一种检测/诊断布鲁氏杆菌或布鲁氏菌病的方法，所述方法包括将待测核酸与V型Cas蛋白、上述gRNA和单链核酸检测器接触；检测由Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测布鲁氏杆菌或布鲁氏菌病。

本发明中，所述样品可以为来自动物的样品，例如，牛、羊；其他的实施方式中，所述样品还可以来自其他动物，例如，猪、马、驴。

在一个实施方式中，所述样品可以为流产物、分泌物、排泄物(粪、尿)、乳、肉、内脏、皮毛、血液或骨髓样品。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测或诊断待测动物是否感染布鲁氏菌病的系统、组合物或试剂盒，所述系统、组合物或试剂盒包括V型Cas蛋白、上述gRNA和单链核酸检测器。进一步的，所述系统、组合物或试剂盒还包括扩增引物。

另一方面，本发明还提供了上述用于检测或诊断待测动物是否感染布鲁氏菌病的组合物在诊断或检测布鲁氏菌病中的用途，或者在用于制备诊断或检测布鲁氏菌病的试剂或试剂盒中的用途。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测/诊断布鲁氏杆菌的系统、组合物或试剂盒，所述系统、组合物或试剂盒包括V型Cas蛋白、上述gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器。

另一方面，本发明还提供了上述系统、组合物或试剂盒在检测/诊断布鲁氏杆菌或布鲁氏菌病中的应用。

另一方面，本发明还提供了上述组合物在制备检测/诊断布鲁氏杆菌或布鲁氏菌病的试剂或试剂盒中的用途。

优选的，所述布鲁氏杆菌为牛种布鲁氏杆菌。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白优选为Cas12家族，包括但不限于Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12i中的一种或任意几种。

(1)SEQ ID NO：4所示的蛋白；

本发明中，所述单链核酸检测器包括单链DNA、单链RNA或者单链DNA-RNA杂交体。在其他的实施方式中，所述单链核酸检测器包括单链DNA、单链RNA或者单链DNA-RNA杂交体的任意两种或三种的混合物，例如，单链DNA和单链RNA的组合物、单链DNA和单链DNA-RNA杂交体的组合物、单链RNA和单链DNA-RNA的组合物。在其他的实施方式中，所述单链核酸检测器还包括对碱基的修饰。

在优选的实施方式中，所述单链核酸检测器为单链寡核酸检测器。

所述单链核酸检测器不与所述gRNA杂交。

本发明中，所述可检测信号通过以下方式实现：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，荧光信号，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。

在一些实施方式中，本发明的方法还包括测量CRISPR/CAS效应蛋白(Cas蛋白)产生的可检测信号的步骤。所述Cas蛋白识别所述靶核酸或与所述靶核酸杂交之后可以激发任意单链核酸的切割活性，从而切割所述单链核酸检测器进而产生可检测信号。

本发明中，所述可检测信号可以是当切割单链核酸检测器时产生的任何信号。例如，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，荧光信号，胶体相变/分散，电化学检测，基于半导体的传感。所述可检测信号可通过任何合适的方式读出，包括但不限于：可检测的荧光信号的测量，凝胶电泳检测(通过检测凝胶上的条带的变化)，基于视觉或传感器的颜色的存在或不存在的检测、或者颜色存在的差异(例如，基于金纳米颗粒)以及电信号的差异。

在优选的实施方式中，所述可检测信号通过以下方式实现：所述单链核酸检测器的5’端和3’端分别设置不同的报告基团，当所述单链核酸检测器被切割后，可以表现出可检测的报告信号；例如，单链核酸检测器的两端分别设置荧光基团和淬灭基团，当所述单链核酸检测器被切割后，可以表现出可检测的荧光信号。

在一个实施方式中，所述荧光基团选自FAM、FITC、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种或任意几种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种或任意几种。

在其他的实施方式中，所述可检测信号还可以通过以下方式实现：所述单链核酸检测器的5’端和3’端分别设置不同的标记分子，通过胶体金检测的方式检测反应信号。

在一些实施方式中，所述可检测信号的测量可以是定量的，在其他的实施方式中，所述可检测信号的测量可以是定性的。

优选的，所述单链核酸检测器在被所述Cas蛋白切割之前产生第一可检测信号，并且在被切割之后产生不同于第一可检测信号的第二可检测信号。

在其他的实施方式中，单链核酸检测器包括一个或多个的修饰，例如碱基修饰，骨架修饰，糖修饰等，以向核酸提供新的或增强的特征(例如改进的稳定性)。合适修饰的例子包括修饰的核酸骨架和非天然核苷间连接，具有修饰主链的核酸包括那些在主链中保留磷原子的核酸和那些在主链中不具有磷原子的核酸。合适的其中含有磷原子的修饰的寡核苷酸骨架包括硫代磷酸酯，手性硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨基烷基磷酸三酯，甲基和其它烷基膦酸酯。在一些实施方式中，单链核酸检测器包含一个或多个硫代磷酸酯和/或杂原子核苷键。在其他的实施方式中，所述单链核酸检测器可以是核酸模拟物；在某些实施方式中，所述核酸模拟物为肽核酸(PNA)，另一类核酸模拟物是基于具有连接到吗啉环上的杂环碱基的连接吗啉基单元(吗啉基核酸)，其他的核酸模拟物还包括环己烯基核酸(CENA)，还包括核糖或者脱氧核糖链。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白与gRNA的用量摩尔比为(0.8-1.2)∶1。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白的用量终浓度为20-200nM，优选，30-100nM，更优选，40-80nM，更优选，50nM。

在一个实施方式中，所述gRNA的用量终浓度为20-200nM，优选，30-100nM，更优选，40-80nM，更优选，50nM。

在一个实施方式中，所述待测核酸的用量终浓度为5-100nM，优选，10-50nM。

在一个实施方式中，所述单链核酸检测器的用量终浓度为100-1000nM，优选，150-800nM，优选，200-800nM，优选，200-500nM，优选，200-300nM。

在一个实施方式中，所述单链核酸检测器具有2-300个核苷酸，优选，3-200个核苷酸，优选，3-100个核苷酸，优选，具有3-30个核苷酸，优选，4-20个核苷酸，更优选，5-15个核苷酸。

术语“杂交”或“互补的”或“基本上互补的”是指核酸(例如RNA、DNA)包含使其能够非共价结合的核苷酸序列，即以序列特异性，反平行的方式(即核酸特异性结合互补核酸)与另一核酸形成碱基对和/或G/U碱基对，“退火”或“杂交”。杂交需要两个核酸含有互补序列，尽管碱基之间可能存在错配。两个核酸之间杂交的合适条件取决于核酸的长度和互补程度，这是本领域公知的变量。典型地，可杂交核酸的长度为8个核苷酸或更多(例如，10个核苷酸或更多，12个核苷酸或更多，15个核苷酸或更多，20个核苷酸或更多，22个核苷酸或更多，25个核苷酸或更多，或30个核苷酸或更多)。

应当理解，多核苷酸的序列不需要与其靶核酸的序列100％互补以特异性杂交。多核苷酸可包含60％或更高，65％或更高，70％或更高，75％或更高，80％或更高，85％或更高，90％或更高，95％或更高，98％或更高，99％或更高，99.5％或更高，或与其杂交的靶核酸序列中的靶区域的序列互补性为100％。

一般定义：

除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。

术语“氨基酸”是指含有氨基的羧酸。生物体内的各种蛋白质是由20种基本氨基酸构成的。

术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。

术语“寡核苷酸”是指含有3-100个核苷酸的序列，优选，具有3-30个核苷酸，优选，4-20个核苷酸，更优选，5-15个核苷酸。

术语“同源性”或“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体

亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，

或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上

是同一的。两个序列之间。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行

比较。这样的比对可通过使用，例如，氨基酸序列的同一性可以通过常规方法，参考例如Smithand Waterman，1981，Adv.Appl.Math.2：482Pearson&Lipman，1988，Proc.NatlAcad.Sci.USA85：2444，Thompson etal.，1994，Nucleic Acids Res 22：467380等的教导，通过计算机化运行运算法则(Wisconsin Genetics软件包中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，Cenetics ComputerGroup)来确定。也可使用可从美国国立生物技术信息中心(NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的BLAST运算法则，使用默认参数确定。

如本文所用，所述“CRISPR”是指成簇、规律间隔的短回文重复序列(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats)，其来自微生物的免疫系统。

如本文所用，“生物素(biotin)”也称维生素H，是一种分子量为244Da的小分子维生素。“亲和素(avidin)”，又称抗生物素，是一种碱性糖蛋白，具有4个同生物素亲和力极高的结合位点，常用亲和素有链霉亲合素。生物素与亲和素的极强亲和力可用于在检测体系中放大或增强检测信号。如生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合，而结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。

Cas蛋白

本文所述“Cas蛋白”是指CRISPR-associated蛋白，优选来自V型或VI型CRISPR/CAS蛋白，其一旦与待检测特征序列(靶序列)结合(即形成Cas蛋白-gRNA-靶序列的三元复合物)，就可以诱发其trans活性，即随机切割非靶向单链核苷酸(即本文所述单链核酸检测器，优选单链DNA(ssDNA)、单链DNA-RNA杂交体、单链RNA)。当Cas蛋白与特征序列结合后，其切割或不切割特征序列，均可以诱发其trans活性；优选地，其通过切割特征序列诱发其trans活性；更优选地，其通过切割单链特征序列诱发其trans活性。

本发明所述的Cas蛋白为至少具有trans切割活性的蛋白，优选地，所述的Cas蛋白为具有Cis和trans切割活性的蛋白。所述的Cis活性是指Cas蛋白可在gRNA的作用下识别PAM位点并特异性切割靶序列的活性。

本发明所述的Cas蛋白包括V型和VI型CRISPR/CAS效应蛋白，包括Cas12、Cas13、Cas14等蛋白家族。优选地，例如Cas12蛋白，例如Cas12a、Cas1 2b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12j；优选地，所述Cas蛋白为Cas12a、Cas12b、Cas12i、Cas12j。Cas13蛋白家族包括Cas13a、Cas13b等。

在实施方式中，本文所称的Cas蛋白，如Cas12，也涵盖Cas的功能变体或其同源物或直系同源物。如本文所用的蛋白的“功能变体”是指至少部分保留该蛋白的活性的这样的蛋白的变体。功能变体可以包括突变体(其可以是插入、缺失或替换突变体)，包括多晶型物等。功能变体中还包括这样的蛋白与另一种通常不相关的核酸、蛋白质、多肽或肽的融合产物。功能变体可以是天然存在的或可以是人造的。有利的实施方式可以涉及工程化或非天然存在的V型DNA靶向效应蛋白。

在一个实施方式中，编码Cas蛋白，如Cas12，的一种或多种核酸分子或其直系同源物或同源物可以被密码子优化用于在真核细胞中表达。真核生物可如本文所述。一种或多种核酸分子可以是工程化的或非天然存在的。

在一个实施方式中，Cas12蛋白或其直系同源物或同源物可以包含一个或多个突变(并且因此编码其的核酸分子可以具有一个或多个突变。突变可以是人工引入的突变并且可以包括但不限于催化结构域中的一个或多个突变。

在一个实施方式中，Cas蛋白可以来自：纤毛菌属、李斯特菌属、棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真细菌属、链球菌属、乳酸菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、黄杆菌属、固氮螺菌属、Sphaerochaeta、葡糖醋杆菌属、奈瑟氏菌属、罗氏菌属、Parvibaculum、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属、弯曲杆菌属和毛螺菌属。

所述的Cas蛋白可以通过重组表达载体技术获得，即将编码该蛋白的核酸分子构建到合适的载体上，再转化到宿主细胞中，使得所述的编码核酸分子在细胞中表达，从而获得相应的蛋白。所述的蛋白可以被细胞分泌出来，或者破解细胞通过常规的提取技术获得该蛋白。所述的编码核酸分子可以整合至宿主细胞的基因组中进行表达，也可以不整合到宿主细胞中进行表达。所述的载体还进一步包括有利于序列整合，或进行自我复制的调节元件。所述的载体可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的，优选地，本发明中的表达载体是质粒。所述的载体进一步包括一种或多种调控元件，选自启动子、增强子、翻译起始的核糖体结合位点、终止子、多聚腺苷酸序列、筛选标记基因。

宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。

gRNA

如本文所用，所述的“gRNA”又称为guide RNA或导向RNA，并且具有本领域技术人员通常理解的含义。一般而言，导向RNA可以包含同向(direct)重复序列和导向序列(guidesequence)，或者基本上由或由同向重复序列和导向序列(在内源性CRISPR系统背景下也称为间隔序列(spacer))组成。gRNA在不同的CRISPR系统中，依据其所依赖的Cas蛋白的不同，可以包括crRNA和tracrRNA，也可以只含有crRNA。crRNA和tracrRNA可以经过人工改造融合形成single guide RNA(sgRNA)。在某些情况下，导向序列是与靶序列(本发明中所述特征序列)具有足够互补性从而与所述靶序列杂交并引导CRISPR/Cas复合物与所述靶序列的特异性结合的任何多核苷酸序列，通常具有12-25nt的序列长度。所述的同向重复序列可折叠形成特定结构(如茎环结构)供Cas蛋白识别，以形成复合物。所述的导向序列不需要与特征序列(靶序列)100％互补。所述的导向序列不与单链核酸检测器互补。

在某些实施方案中，当最佳比对时，导向序列与其相应靶序列之间的互补程度(匹配度)为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如，存在公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于ClustalW、matlab中的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman)、Bowtie、Geneious、Biopython以及SeqMan。

本发明所述的gRNA可以是天然的，也可以是经过人工改造或设计合成的。

单链核酸检测器

本发明所述的单链核酸检测器是指含有2-200个核苷酸的序列，优选，具有2-150个核苷酸，优选，3-100个核苷酸，优选，3-30个核苷酸，优选，4-20个核苷酸，更优选，5-15个核苷酸。优选为单链DNA分子、单链RNA分子或单链DNA-RNA杂交体。

所述的单链核酸检测器在检测方法或系统中用以报告样品中是否存在靶核酸。所述的单链核酸检测器两端包括不同的报告基团或标记分子，当其处于初始状态(即未被切割状态时)不呈现报告信号，当该单链核酸检测器被切割后，呈现出可检测的信号，即切割后与切割前表现出可检测的区别。在本发明中，如果能够检测出可检测的区别，则反映能够检测出靶核酸；或者，如果无法检检测出所述的可检测的区别，则反映无法检测出靶核酸。

在一个实施方式中，所述的报告基团或标记分子包括荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团选自FAM、FITC、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种或任意几种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种或任意几种。

在其他的实施方式中，所述的单链核酸检测器具有连接至一端第一分子(如FAM或FITC)和连接至另一端的第二分子(如生物素)。所述的含有单链核酸检测器的反应体系与流动条配合用以检测靶核酸(优选，胶体金检测方式)。所述的流动条被设计为具有两条捕获线，在样品接触端(胶体金)设有结合第一分子的抗体(即第一分子抗体)，在第一线(control line)处含有结合第一分子抗体的抗体，在第二线(test line)处含有与第二分子结合的第二分子的抗体(即第二分子抗体，如亲和素)。当反应沿着条带流动时，第一分子抗体与第一分子结合携带切割或未切割的寡核苷酸至捕获线，切割的报告子将在第一个捕获线处结合第一分子抗体的抗体，而未切割的报告子将在第二捕获线处结合第二分子抗体。报告基团在各条线的结合将导致强读出/信号(例如颜色)。随着更多的报告子被切割，更多的信号将在第一捕获线处累积，并且在第二线处将出现更少的信号。在某些方面，本发明涉及如本文所述的流动条用于检测核酸的用途。在某些方面，本发明涉及用本文定义的流动条检测核酸的方法，例如(侧)流测试或(侧)流免疫色谱测定。在某些方面，所述单链核酸检测器中的分子可相互替换，或改变分子的位置，只要其报告原理与本发明相同或相近，所改进的方式也均包含在本发明中。

本发明所述的检测方法，可用于靶核酸的定量检测。所述的定量检测指标可以根据报告基团的信号强弱进行定量，如根据荧光基团的发光强度，或根据显色条带的宽度等。

序列信息

本发明涉及的部分序列信息提供如下：

附图说明

图1.不同gRNA(gRNA-1、gRNA-2、gRNA-3、gRNA-4)检测ssDNA(SEQ ID No.1)时的检测结果图；其中，线条1为实验组；gRNA-1、gRNA-2、gRNA-3、gRNA-4与ssDNA(SEQ ID No.1)靶核酸进行反应时荧光信号达到峰值(达到平台期)的时间分别在8min、15min、35min和10min左右。

图2.不同gRNA(gRNA-1、gRNA-4)检测dsDNA(SEQ ID No.1)靶核酸时的检测结果图。其中，线条1为实验组，线条2为不添加靶核酸的对照组；gRNA-1、gRNA-4与dsDNA(SEQ IDNo.1)靶核酸进行反应时荧光信号达到峰值(达到平台期)的时间分别在15min和23min左右。

图3.不同gRNA(gRNA-5、gRNA-6)检测ssDNA(SEQ ID No.2)时的检测结果图；其中，线条1为实验组；gRNA-5、gRNA-6与ssDNA(SEQ ID No.2)靶核酸进行反应时荧光信号达到峰值(达到平台期)的时间分别在6min和5min左右。

图4.不同gRNA(gRNA-5、gRNA-6)检测dsDNA(SEQ ID No.2)靶核酸时的检测结果图。

其中，线条1为实验组，线条2为不添加靶核酸的对照组；gRNA-5、gRNA-6与dsDNA(SEQ ID No.2)靶核酸进行反应时荧光信号达到峰值(达到平台期)的时间分别在20min和10min左右。

图5.不同gRNA(gRNA-7、gRNA-8、gRNA-9、gRNA-10、gRNA-11、gRNA-12、gRNA-13、gRNA-14、gRNA-15、gRNA-16)检测ssDNA(SEQ ID No.3)时的检测结果图；其中，线条1为实验组；gRNA-7、gRNA-8、gRNA-9、gRNA-11、gRNA-12、gRNA-13、gRNA-14、gRNA-15、gRNA-16与ssDNA(SEQ ID No.3)靶核酸进行反应时荧光信号达到峰值(达到平台期)的时间分别在20min、30min、12min、15min、24min、20min、20min、20min和18min左右。

图6.不同gRNA(gRNA-9、gRNA-11)检测dsDNA(SEQ ID No.3)靶核酸时的检测结果图。其中，线条1为实验组，线条2为不添加靶核酸的对照组；gRNA-9、gRNA-11与dsDNA(SEQID No.3)靶核酸进行反应时荧光信号达到峰值(达到平台期)的时间均在6min左右。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

本发明技术方案基于如下原理，将PCR扩增与CRISPR技术相结合，具有快速、灵敏、特异、高效的特点。在样本中存在目标病原菌的特异核酸的前提下，特异性引物与靶标序列结合，通过PCR扩增富集目标序列，Cas酶(Cas蛋白)在gRNA引导下与扩增产物结合，激活Cas蛋白反式剪切(trans)活性，剪切体系中的Reporter(Reporter一端连接荧光基团，一端连接淬灭基团)，Reporter被Cas蛋白剪切后会释放荧光，以呈现检测结果。在其他的实施方式中，单链核酸检测器(Reporter)的两端还可以设置成能够被胶体金检测的标记。

实施例1、I型牛疱疹病毒特异核酸的扩增和gRNA的设计

本实施方式中，针对I型牛疱疹病毒(BHV1)Bovine herpesvirus type 1的特异性核酸进行引物的设计和靶核酸的扩增。

根据BHV1的基因组序列，设计扩增引物如下：

BHV1-gB-F1：cacctttgtggacctaaacct；

BHV1-gB-R1：gtagtcgagcagacccgtgtc；

扩增得到的靶序列如下：

cacctttgtggacctaaacctcacggttctggaggaccgcgagttcttgccgctagaagtgtacacgcgcgccgagctcgccgacacgggtctgctcgactac(SEQ ID No.1)。

针对上述靶序列，在区段内部或其互补序列内部设计了4条gRNA，本实施方式是基于Cas12i(SEQ ID No.4)设计的能够结合Cas12i的gRNA，每条gRNA 5’端的前3个碱基均为TTN(PAM序列)。

所设计的gRNA的序列如下：

实施例2、gRNA在进行核酸检测I型牛疱疹病毒时的应用

为了验证实施例1设计的不同的gRNA与Cas12i蛋白应用时的检测效率，本实施方式对不同gRNA的活性进行了验证。

首先采用单链的靶序列(ssDNA，SEQ ID No.1)或者其反向互补序列作为靶核酸，ssDNA为对应的gRNA所靶向的ssDNA。

单链核酸检测器序列为FAM-TTATT-BHQ1；

采用如下反应体系：Cas12i终浓度为25nM，gRNA终浓度为25nM，靶核酸终浓度为25nM，单链核酸检测器终浓度200nM。37℃孵育，读取FAM荧光/1min。对照组不添加靶核酸。

图1示出了利用gRNA-1、gRNA-2、gRNA-3、gRNA-4在与ssDNA(SEQ ID No.1)的靶核酸进行反应时的结果。其中，与对照组相比，gRNA-1、gRNA-2、gRNA-3和gRNA-4均能快速的报告出荧光，并且，荧光信号的峰值会在35min之内出，反映出其在进行I型牛疱疹病毒特异核酸检测时的较好的灵敏度；尤其是gRNA-1和gRNA-4，在10min之内都可以达到荧光信号的峰值。图1中，1为实验组。

针对检测单链靶序列效果较好的gRNA-1和gRNA-4，进一步验证了其在检测双链靶序列(dsDNA)时的效率。

采用双链的靶序列(dsDNA，SEQ ID No.1)作为双链靶核酸。

双链靶核酸采用PCR反应获得，其中，PCR扩增体系如下：

其中，模板采用含目标核酸片段的质粒，PCR反应模板添加量为50个拷贝，PCR扩增45个循环，最后取2μl的PCR扩增产物作为双链靶核酸进行检测。

单链核酸检测器序列为FAM-TTATT-BHQ 1；

采用如下检测体系：Cas12i终浓度为50nM，gRNA终浓度为50nM，靶核酸(上述PCR扩增得到的双链DNA)2μl，单链核酸检测器终浓度200nM。37℃孵育，读取FAM荧光/20s。对照组不添加靶核酸。

图2示出了gRNA-1和gRNA-4在与dsDNA(SEQ ID No.1)的靶核酸进行反应时的结果；与对照组相比，gRNA-1和gRNA-4均能在较短的时间内表现出显著的荧光信号，反映出其具有较好的检测dsDNA(SEQ ID No.1)的灵敏度；尤其是gRNA-1，在15min左右就可以达到荧光信号的峰值。图2中，1为实验组，2为对照组。

实施例3、牛病毒性腹泻病毒特异核酸的扩增和gRNA的设计

本实施方式中，针对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Bovine Viral Diarrhea/MucosalDisease Virus的特异性核酸进行引物的设计和靶核酸的扩增。

根据BVDV的基因组序列，设计扩增引物如下：

BVDV-5UTR-F1：ccgcgaMggccgaaaaga；

BVDV-5UTR-R1：tgacgactNccctgtactcag；

扩增得到的靶序列如下：

ccgcgaaggccgaaaagaggctagccatgcccttagtaggactagcatagcgaggggggtagcaacagtggtgagttcgttggatggcttaagccctgagtacagggtagtcgtca(SEQ ID No.2)。

针对上述靶序列，在区段内部或其互补序列内部设计了2条gRNA，本实施方式是基于Cas12i(SEQ ID No.4)设计的能够结合Cas12i的gRNA，每条gRNA 5’端的前3个碱基均为TTN(PAM序列)。

所设计的gRNA的序列如下：

实施例4、gRNA在进行核酸检测牛病毒性腹泻病毒时的应用

为了验证实施例3设计的不同的gRNA与Cas12i蛋白应用时的检测效率，本实施方式对不同gRNA的活性进行了验证。

首先采用单链的靶序列(ssDNA，SEQ ID No.2)或者其反向互补序列作为靶核酸，ssDNA为对应的gRNA所靶向的ssDNA。

单链核酸检测器序列为FAM-TTATT-BHQ1；

图3示出了利用gRNA-5、gRNA-6在与ssDNA(SEQ ID No.2)的靶核酸进行反应时的结果。其中，与对照组相比，gRNA-5和gRNA-6均能快速的报告出荧光，并且，荧光信号的峰值会在6min之内出，反映出其在进行牛病毒性腹泻病毒特异核酸检测时的较好的灵敏度。图3中，1为实验组。

针对gRNA-5和gRNA-6，进一步验证了其在检测双链靶序列(dsDNA)时的效率。

采用双链的靶序列(dsDNA，SEQ ID No.2)作为双链靶核酸。

双链靶核酸采用PCR反应获得，其中，PCR扩增体系如下：

其中，模板采用含目标核酸片段的质粒，PCR反应质板添加重为20个拷贝，PCR扩增45个循环，最后取2μl的PCR扩增产物作为双链靶核酸进行检测。

单链核酸检测器序列为FAM-TTATT-BHQ1；

图4示出了gRNA-5和gRNA-6在与dsDNA(SEQ ID No.2)的靶核酸进行反应时的结果；与对照组相比，gRNA-5和gRNA-6均能在较短的时间内表现出显著的荧光信号，反映出其具有较好的检测dsDNA(SEQ ID No.2)的灵敏度；尤其是gRNA-6，在10min左右就可以达到荧光信号的峰值。图4中，1为实验组，2为对照组。

实施例5、布鲁氏杆菌特异核酸的扩增和gRNA的设计

本实施方式中，针对布鲁氏杆菌Brucella的特异性核酸进行引物的设计和靶核酸的扩增。

根据Brucella的基因组序列，设计扩增引物如下：

Brucella-IS711-F1：accattgaagtctggcgagca；

Brucella-IS711-R1：gaccgcattcatgggtttcg；

扩增得到的靶序列如下：

accattgaagtctggcgagcatgagcggctggggccgtttcggcttaatctgaccttccgaaaggcgttctagggcgtgtctgcatttaacgtaaccagatcatagcgcatgcgagatggacgaaacccatgaatgcggtc(SEQID No.3)。

针对上述靶序列，在区段内部或其互补序列内部设计了10条gRNA，本实施方式是基于Cas12i(SEQ ID No.4)设计的能够结合Cas12i的gRNA，每条gRNA5’端的前3个碱基均为TTN(PAM序列)。

所设计的gRNA的序列如下：

实施例6、gRNA在进行核酸检测布鲁氏杆菌时的应用

为了验证实施例5设计的不同的gRNA与Cas12i蛋白应用时的检测效率，本实施方式对不同gRNA的活性进行了验证。

首先采用单链的靶序列(ssDNA，SEQ ID No.3)或者其反向互补序列作为靶核酸，ssDNA为对应的gRNA所靶向的ssDNA。

单链核酸检测器序列为FAM-TTATT-BHQ1；

采用如下反应体系：Casl2i终浓度为25nM，gRNA终浓度为25nM，靶核酸终浓度为25nM，单链核酸检测器终浓度200nM。37℃孵育，读取FAM荧光/1min。对照组不添加靶核酸。

图5示出了利用gRNA-7、gRNA-8、gRNA-9、gRNA-10、gRNA-11、gRNA-12、gRNA-13、gRNA-14、gRNA-15、gRNA-16在与ssDNA(SEQ ID No.3)的靶核酸进行反应时的结果。其中，与对照组相比，gRNA-7、gRNA-8、gRNA-9、gRNA-11、gRNA-12、gRNA-13、gRNA-14、gRNA-15和gRNA-16均能快速的报告出荧光，并且，荧光信号的峰值会在30min之内出，反映出其在进行牛种布鲁氏杆菌特异核酸检测时的较好的灵敏度；尤其是gRNA-9和gRNA-11，在15min之内都可以达到荧光信号的峰值；相对而言，gRNA-10的荧光信号较弱，检测灵敏度较低。图5中，1为实验组。

针对检测单链靶序列效果较好的gRNA-9和gRNA-11，进一步验证了其在检测双链靶序列(dsDNA)时的效率。

采用双链的靶序列(dsDNA，SEQ ID No.3)作为双链靶核酸。

双链靶核酸采用PCR反应获得，其中，PCR扩增体系如下：

其中，模板采用含目标核酸片段的质粒，PCR反应模板添加量为40个拷贝，PCR扩增45个循环，最后取2μl的PCR扩增产物作为双链靶核酸进行检测。

单链核酸检测器序列为FAM-TTATT-BHQ1；

图6示出了gRNA-9和gRNA-11在与dsDNA(SEQ ID No.3)的靶核酸进行反应时的结果；与对照组相比，gRNA-9和gRNA-11均能在6min左右就可以达到荧光信号的峰值，反映出其具有较好的检测dsDNA(SEQ ID No.3)的灵敏度。图6中，1为实验组，2为对照组。

本申请中的gRNA(gRNA-1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16)的引导序列的长度为20-21bp，即，其与靶核酸杂交的区域为20-21bp；实际在使用时，本领域技术人员也可以在引导序列的3’端增加或减少任意的碱基(当然还要保证其与靶核酸杂交)；引导序列的5’端毗邻PAM序列，不适合再调整；但是，针对其3’端，只要保证其能够与靶序列具有15bp-30bp的杂交区域，即能够实现将Cas酶结合在靶序列上的功能，这些长度的改变不会实质性的影响gRNA的活性。例如，针对gRNA-1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16的引导序列，在保证其与靶序列配对的情况下，可以在3’端减少1-5个碱基(例如，1、2、3、4或5个碱基)，或者增加1-10个碱基(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基)，其不会实质性的影响gRNA与Cas蛋白在检测靶核酸时的效率。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东舜丰生物科技有限公司

<120> 一种基于CRISPR技术检测病原微生物的方法

<130> SF074-正

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 103

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BHV1扩增产物

<400> 1

cacctttgtg gacctaaacc tcacggttct ggaggaccgc gagttcttgc cgctagaagt 60

gtacacgcgc gccgagctcg ccgacacggg tctgctcgac tac 103

<210> 2

<211> 116

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BVDV扩增产物

<400> 2

ccgcgaaggc cgaaaagagg ctagccatgc ccttagtagg actagcatag cgaggggggt 60

agcaacagtg gtgagttcgt tggatggctt aagccctgag tacagggtag tcgtca 116

<210> 3

<211> 141

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Brucella扩增产物

<400> 3

accattgaag tctggcgagc atgagcggct ggggccgttt cggcttaatc tgaccttccg 60

aaaggcgttc tagggcgtgt ctgcatttaa cgtaaccaga tcatagcgca tgcgagatgg 120

acgaaaccca tgaatgcggt c 141

<210> 4

<211> 1045

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cas12i

<400> 4

Met Lys Lys Val Glu Val Ser Arg Pro Tyr Gln Ser Leu Leu Leu Pro

1 5 10 15

Asn His Arg Lys Phe Lys Tyr Leu Asp Glu Thr Trp Asn Ala Tyr Lys

20 25 30

Ser Val Lys Ser Leu Leu His Arg Phe Leu Val Cys Ala Tyr Gly Ala

35 40 45

Val Pro Phe Asn Lys Phe Val Glu Val Val Glu Lys Val Asp Asn Asp

50 55 60

Gln Leu Val Leu Ala Phe Ala Val Arg Leu Phe Arg Leu Val Pro Val

65 70 75 80

Glu Ser Thr Ser Phe Ala Lys Val Asp Lys Ala Asn Leu Ala Lys Ser

85 90 95

Leu Ala Asn His Leu Pro Val Gly Thr Ala Ile Pro Ala Asn Val Gln

100 105 110

Ser Tyr Phe Asp Ser Asn Phe Asp Pro Lys Lys Tyr Met Trp Ile Asp

115 120 125

Cys Ala Trp Glu Ala Asp Arg Leu Ala Arg Glu Met Gly Leu Ser Ala

130 135 140

Ser Gln Phe Ser Glu Tyr Ala Thr Thr Met Leu Trp Glu Asp Trp Leu

145 150 155 160

Pro Leu Asn Lys Asp Asp Val Asn Gly Trp Gly Ser Val Ser Gly Leu

165 170 175

Phe Gly Glu Gly Lys Lys Glu Asp Arg Gln Gln Lys Val Lys Met Leu

180 185 190

Asn Asn Leu Leu Asn Gly Ile Lys Lys Asn Pro Pro Lys Asp Tyr Thr

195 200 205

Gln Tyr Leu Lys Ile Leu Leu Asn Ala Phe Asp Ala Lys Ser His Lys

210 215 220

Glu Ala Val Lys Asn Tyr Lys Gly Asp Ser Thr Gly Arg Thr Ala Ser

225 230 235 240

Tyr Leu Ser Glu Lys Ser Gly Glu Ile Thr Glu Leu Met Leu Glu Gln

245 250 255

Leu Met Ser Asn Ile Gln Arg Asp Ile Gly Asp Lys Gln Lys Glu Ile

260 265 270

Ser Leu Pro Lys Lys Asp Val Val Lys Lys Tyr Leu Glu Ser Glu Ser

275 280 285

Gly Val Pro Tyr Asp Gln Asn Leu Trp Ser Gln Ala Tyr Arg Asn Ala

290 295 300

Ala Ser Ser Ile Lys Lys Thr Asp Thr Arg Asn Phe Asn Ser Thr Leu

305 310 315 320

Glu Lys Phe Lys Asn Glu Val Glu Leu Arg Gly Leu Leu Ser Glu Gly

325 330 335

Asp Asp Val Glu Ile Leu Arg Ser Lys Phe Phe Ser Ser Glu Phe His

340 345 350

Lys Thr Pro Asp Lys Phe Val Ile Lys Pro Glu His Ile Gly Phe Asn

355 360 365

Asn Lys Tyr Asn Val Val Ala Glu Leu Tyr Lys Leu Lys Ala Glu Ala

370 375 380

Thr Asp Phe Glu Ser Ala Phe Ala Thr Val Lys Asp Glu Phe Glu Glu

385 390 395 400

Lys Gly Ile Lys His Pro Ile Lys Asn Ile Leu Glu Tyr Ile Trp Asn

405 410 415

Asn Glu Val Pro Val Glu Lys Trp Gly Arg Val Ala Arg Phe Asn Gln

420 425 430

Ser Glu Glu Lys Leu Leu Arg Ile Lys Ala Asn Pro Thr Val Glu Cys

435 440 445

Asn Gln Gly Met Thr Phe Gly Asn Ser Ala Met Val Gly Glu Val Leu

450 455 460

Arg Ser Asn Tyr Val Ser Lys Lys Gly Ala Leu Val Ser Gly Glu His

465 470 475 480

Gly Gly Arg Leu Ile Gly Gln Asn Asn Met Ile Trp Leu Glu Met Arg

485 490 495

Leu Leu Asn Lys Gly Lys Trp Glu Thr His His Val Pro Thr His Asn

500 505 510

Met Lys Phe Phe Glu Glu Val His Ala Tyr Asn Pro Ser Leu Ala Asp

515 520 525

Ser Val Asn Val Arg Asn Arg Leu Tyr Arg Ser Glu Asp Tyr Thr Gln

530 535 540

Leu Pro Ser Ser Ile Thr Asp Gly Leu Lys Gly Asn Pro Lys Ala Lys

545 550 555 560

Leu Leu Lys Arg Gln His Cys Ala Leu Asn Asn Met Thr Ala Asn Val

565 570 575

Leu Asn Pro Lys Leu Ser Phe Thr Ile Asn Lys Lys Asn Asp Asp Tyr

580 585 590

Thr Val Ile Ile Val His Ser Val Glu Val Ser Lys Pro Arg Arg Glu

595 600 605

Val Leu Val Gly Asp Tyr Leu Val Gly Met Asp Gln Asn Gln Thr Ala

610 615 620

Ser Asn Thr Tyr Ala Val Met Gln Val Val Lys Pro Lys Ser Thr Asp

625 630 635 640

Ala Ile Pro Phe Arg Asn Met Trp Val Arg Phe Val Glu Ser Gly Ser

645 650 655

Ile Glu Ser Arg Thr Leu Asn Ser Arg Gly Glu Tyr Val Asp Gln Leu

660 665 670

Asn His Asp Gly Val Asp Leu Phe Glu Ile Gly Asp Thr Glu Trp Val

675 680 685

Asp Ser Ala Arg Lys Phe Phe Asn Lys Leu Gly Val Lys His Lys Asp

690 695 700

Gly Thr Leu Val Asp Leu Ser Thr Ala Pro Arg Lys Ala Tyr Ala Phe

705 710 715 720

Asn Asn Phe Tyr Phe Lys Thr Met Leu Asn His Leu Arg Ser Asn Glu

725 730 735

Val Asp Leu Thr Leu Leu Arg Asn Glu Ile Leu Arg Val Ala Asn Gly

740 745 750

Arg Phe Ser Pro Met Arg Leu Gly Ser Leu Ser Trp Thr Thr Leu Lys

755 760 765

Ala Leu Gly Ser Phe Lys Ser Leu Val Leu Ser Tyr Phe Asp Arg Leu

770 775 780

Gly Ala Lys Glu Met Val Asp Lys Glu Ala Lys Asp Lys Ser Leu Phe

785 790 795 800

Asp Leu Leu Val Ala Ile Asn Asn Lys Arg Ser Asn Lys Arg Glu Glu

805 810 815

Arg Thr Ser Arg Ile Ala Ser Ser Leu Met Thr Val Ala Gln Lys Tyr

820 825 830

Lys Val Asp Asn Ala Val Val His Val Val Val Glu Gly Asn Leu Ser

835 840 845

Ser Thr Asp Arg Ser Ala Ser Lys Ala His Asn Arg Asn Thr Met Asp

850 855 860

Trp Cys Ser Arg Ala Val Val Lys Lys Leu Glu Asp Met Cys Asn Leu

865 870 875 880

Tyr Gly Phe Asn Ile Lys Gly Val Pro Ala Phe Tyr Thr Ser His Gln

885 890 895

Asp Pro Leu Val His Arg Ala Asp Tyr Asp Asp Pro Lys Pro Ala Leu

900 905 910

Arg Cys Arg Tyr Ser Ser Tyr Ser Arg Ala Asp Phe Ser Lys Trp Gly

915 920 925

Gln Asn Ala Leu Ala Ala Val Val Arg Trp Ala Ser Asn Lys Lys Ser

930 935 940

Asn Thr Cys Tyr Lys Val Gly Ala Val Glu Phe Leu Lys Gln His Gly

945 950 955 960

Leu Phe Ala Asp Lys Lys Leu Thr Val Glu Gln Phe Leu Ser Lys Val

965 970 975

Lys Asp Glu Glu Ile Leu Ile Pro Arg Arg Gly Gly Arg Val Phe Leu

980 985 990

Thr Thr His Arg Leu Leu Ala Glu Ser Thr Phe Val Tyr Leu Asn Gly

995 1000 1005

Val Lys Tyr His Ser Cys Asn Ala Asp Glu Val Ala Ala Val Asn

1010 1015 1020

Ile Cys Leu Asn Asp Trp Val Ile Pro Cys Lys Lys Lys Met Lys

1025 1030 1035

Glu Glu Ser Ser Ala Ser Gly

1040 1045

<210> 5

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gRNA-1

<400> 5

uggaggaccg cgaguucuug 20

<210> 6

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gRNA-2

<400> 6

uugccgcuag aaguguacac 20

<210> 7

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gRNA-3

<400> 7

ccgcuagaag uguacacgcg 20

<210> 8

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gRNA-4

<400> 8

uagcggcaag aacucgcggu 20

<210> 9

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gRNA-5

<400> 9

ugcccuuagu aggacuagca 20

<210> 10

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gRNA-6

<400> 10

agccaugccc uuaguaggac 20

<210> 11

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gRNA-7

<400> 11

ggcuuaaucu gaccuuccga 20

<210> 12

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gRNA-8

<400> 12

aucugaccuu ccgaaaggcg 20

<210> 13

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gRNA-9

<400> 13

cgaaaggcgu ucuagggcgu 20

<210> 14

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gRNA-10

<400> 14

uagggcgugu cugcauuuaa 20

<210> 15

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gRNA-11

<400> 15

acguaaccag aucauagcgc 20

<210> 16

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gRNA-12

<400> 16

guccaucucg caugcgcuau 20

<210> 17

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gRNA-13

<400> 17

cguuaaaugc agacacgccc 20

<210> 18

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gRNA-14

<400> 18

aauugcagac acgcccuaga a 21

<210> 19

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gRNA-15

<400> 19

ggaaggucag auuaagccga 20

<210> 20

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gRNA-16

<400> 20

agccgaaacg gccccagccg 20

<210> 21

<211> 23

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gRNA的DR区

<400> 21

agagaaugug ugcauaguca cac 23

Claims

1.一种检测/诊断I型牛疱疹病毒的系统、组合物或试剂盒，所述系统、组合物或试剂盒包括Cas12i蛋白、gRNA和单链核酸检测器；所述gRNA包括与Cas12i蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述靶核酸来源于I型牛疱疹病毒，所述与靶核酸杂交的导向序列如SEQ ID No.5所示，所述Cas12i蛋白序列如SEQ ID No.4所示。

2.权利要求1所述的组合物在制备诊断或检测传染性鼻气管炎的试剂或试剂盒中的用途。

3.权利要求1所述的组合物在制备检测或诊断I型牛疱疹病毒的试剂或试剂盒中的用途。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述检测或诊断的待测样品来源于动物。

5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述检测或诊断的待测样品来源于动物。

6.一种非疾病诊断目的的检测I型牛疱疹病毒的方法，所述方法包括将待测核酸与权利要求1中的Cas12i蛋白、gRNA和单链核酸检测器接触；检测由Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测I型牛疱疹病毒。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从待测样品中获

得待测核酸的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述样品为来自动物的样品。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述可检测信号通过以下任一方式实现：基于传感器的检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，荧光信号，胶体相变，电化学检测或基于半导体的检测。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述可检测信号通过基于视觉的检测实现。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述基于视觉的检测包括颜色检测。