TW201812007A - 來自個別細胞之用於捕獲經配對ｍＲＮＡ及定序的回轉條碼之高通量油乳化液合成 - Google Patents

來自個別細胞之用於捕獲經配對ｍＲＮＡ及定序的回轉條碼之高通量油乳化液合成 Download PDF

Info

Publication number
TW201812007A
TW201812007A TW106127772A TW106127772A TW201812007A TW 201812007 A TW201812007 A TW 201812007A TW 106127772 A TW106127772 A TW 106127772A TW 106127772 A TW106127772 A TW 106127772A TW 201812007 A TW201812007 A TW 201812007A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
nucleic acid
barcode
sequence
mrna
dna
Prior art date
Application number
TW106127772A
Other languages
English (en)
Inventor
約瑟 貝特曼
路易斯 舒泰爾
Original Assignee
亞利桑那州大學之亞利桑那董事會
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 亞利桑那州大學之亞利桑那董事會 filed Critical 亞利桑那州大學之亞利桑那董事會
Publication of TW201812007A publication Critical patent/TW201812007A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/159—Microreactors, e.g. emulsion PCR or sequencing, droplet PCR, microcapsules, i.e. non-liquid containers with a range of different permeability's for different reaction components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/179—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being a nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
    • C12Q2565/133—Detection mode being characterised by the assay principle conformational analysis

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

用於將獨特回轉條碼併入核酸摺疊奈米結構中之方法(圖1)。特定言之，本文提供使用例如高通量次世代定序來促使來自個別細胞之核酸之配對及分析的方法。

Description

來自個別細胞之用於捕獲經配對mRNA及定序的回轉條碼之高通量油乳化液合成 【相關申請案之交叉引用】
本申請案主張於2016年8月19日申請之美國臨時申請案第62/377,123號之優先權及權益，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
關於聯邦政府贊助的研究的聲明
本發明係在政府支持下進行，隸屬於美國國家衛生研究院(National Institutes of Health)授予之R21 CA196460及R21 AI12587。政府擁有在本發明中之某些權利。
需要多重基因序列之單細胞分析之生物學問題有很多，包括在淋巴細胞上無性系分佈之二聚免疫受體及在多株腫瘤中之驅動基因/副突變之累積之分析。主體細胞群之溶解引起基因序列之混合，致使無法知曉哪對基因序列來源於任何特定細胞且混淆較大細胞群內之稀有序列之分 析。儘管當前單細胞分選技術可用於解決一些此等問題，此類方法係昂貴的，需要專用設備，且缺乏大型樣品之全面分析所必需的高通量能力。因此，在此項技術中仍需要用於個別細胞之基因分析之改良方法。
在第一態樣中，本發明提供一種用於將單股DNA(ssDNA)帶條碼的多核苷酸併入至核酸摺疊奈米結構中之方法。該方法可包含以下或主要由以下組成：(a)進行條碼核酸之第一股合成以產生雙股條碼核酸，其中該條碼核酸包含至少一個與單股5'-5'回轉連接子核酸之一側互補的引子配對位點，該單股5'-5'回轉連接子核酸包含藉由互補條碼核酸及與核酸摺疊奈米結構互補的序列而側接於任一側上之中央5'-5'磷酸二酯連接子，該合成可能在後續油乳化液擴增步驟之前或期間進行；(b)在包含用於擴增目標核酸之試劑的油乳化液液滴中組合雙股條碼核酸(或單股條碼及互補引子對)與5'-5'回轉連接子核酸；(c)使包含雙股(或單股)條碼核酸引子及5'-5'回轉連接子核酸的的油乳化液液滴熱循環，其足以引起來自雙股條碼核酸之各股黏著至5'-5'回轉連接子核酸上之互補序列且延長ssDNA帶條碼的5'-5'回轉多核苷酸，從而生成包括5'5'磷酸二酯連接回轉股之任一側上之帶條碼的mRNA捕獲序列之產物；(d)萃取來自經熱循環的液滴的延長產物；(e)純化來自經萃取的延長產物的ssDNA帶條碼的5'-5'回轉多核苷酸；及(f)將經純化的ssDNA帶條碼的5'-5'回轉多核苷酸併入至核酸摺疊奈米結構中。併入可包含將該經純化的ssDNA帶條碼的5'-5'回轉多核苷酸黏著至核酸摺疊奈米結構。核酸摺疊奈米結構可為DNA奈米結構。
在另一態樣中，本發明提供一種用於在單細胞層次上偵測目 標核酸序列之方法。該方法可包含以下或主要由以下組成：(a)將根據技術方案1之方法獲得之核酸摺疊奈米結構與自單細胞分離之核酸接觸，其中該奈米結構包含具有與目標核酸序列互補之帶條碼的序列的ssDNA帶條碼的多核苷酸；且其中，接觸發生在適合於帶條碼的序列與目標核酸序列(若存在於單細胞中)結合的條件下；(b)回收結合於帶條碼的序列的目標核酸序列；及(c)使用ssDNA帶條碼的多核苷酸作為用於逆轉錄的基因特異性引子來逆轉錄經回收的目標核酸序列，由此得以偵測到目標核酸(若存在於細胞中)而無需單細胞分選步驟。核酸摺疊奈米結構可為DNA奈米結構。
在另一態樣中，本發明提供一種用於在單細胞層次上偵測B細胞受體序列之方法。該方法可包含以下或主要由以下組成(a)轉染成表現獨特重(IgH)及輕(IgL)鏈BCR mRNA之抗原特異性B細胞；(b)接觸包含多個帶條碼的mRNA捕獲序列的DNA摺疊奈米結構，以捕獲且保護經轉染抗原特異性B細胞中之免疫球蛋白重(IgH)及輕(IgL)鏈BCR mRNA兩者；(c)分離接觸的DNA摺疊奈米結構以回收結合於帶條碼的mRNA捕獲序列的IgH及IgL mRNA；及(d)使用帶條碼的mRNA捕獲探針作為用於逆轉錄的基因特異性引子來逆轉錄回收的IgH及IgL mRNA，由此得以偵測目標BCR序列而無需單細胞分選步驟。DNA摺疊奈米結構可包含整合的生物素標記，且其中分離接觸的奈米結構包含抗生物素蛋白管柱純化。
本發明之前述及其他優點將根據以下實施方式體現。在實施方式中，參考隨附圖式，該等圖式形成此處之部分，且其中藉助於說明展示本發明之較佳具體實例。然而，此類具體實例未必代表本發明之完整範 圍，且因而引用申請專利範圍且在此用於解釋本發明的範圍。
【詳細描述】
在本說明書中所引用之所有公開案，包括但不限於專利及專利申請案，皆以引用之方式併入本文中，如同在本申請案中闡述其全部內容。
本發明人先前研發出具有捕獲且保護來自經轉染的細胞之mRNA序列之能力之新穎DNA摺疊奈米結構。DNA摺疊上之整合的螢光標 記輔助經轉染的細胞之鑑別，且結合有mRNA之奈米結構之再分離使用整合的生物素標記及抗生物素蛋白管柱純化來達成。本文所提供之方法至少部分地基於本發明人對用於配對所關注的來自個別細胞之多個基因而無需單細胞分選或專用設備之一種穩固方法之發現(圖1)。本發明提供用於將「回轉條碼(bowtie-barcode)」技術併入至DNA摺疊奈米結構及其他基於核酸的奈米結構中以允許同時配對且捕獲來自數百萬細胞之mRNA之新穎方法。對微穿孔(使用微升體積用於細胞電穿孔)技術之另外改進已提高轉染效率且提高細胞存活率。最終，回轉條碼捕獲方法與基於油水乳化液液滴的系統及重疊延伸PCR之組合使得能夠創建數百萬經配對無規則序列，該等序列可用作條碼以在定序期間連接個別基因序列返回彼此。藉由經由帶獨特匹配條碼的序列分析連接mRNA，本發明人研發出一種適用於分析大型細胞群及針對探測來自幾乎任何異質細胞群之經配對基因之序列多樣性可輕易調式之具成本效益的方法。
關於其他可轉染核酸雜交平台，不存在用於需要連接多mRNA物種之分析之其他有成效的分子方法。然而已嘗試轉染單股寡核苷酸，單股寡核苷酸活化RISC複合物且被降解，妨礙下游分析。不受任何特定機制或理論之束縛，咸信摺疊分子之半超旋扭性質藉由RISC複合物抑制降解，正如由再捕獲且分離經轉染摺疊分子與結合的mRNA之能力所證明。另外，參看標準的基於單細胞乳化液的系統，其不適合於需要連接多mRNA物種之分析。而相比於單細胞分選，基於乳化液的系統允許輸入較高細胞數目，先前技術基於單細胞乳化液的系統僅捕獲7對經配對序列(>0.000001%)且不能偵測出濃度小於1000/1000000的其對照組之存在。咸 信大多數純系以每人單殖株之形式存在，此水準之敏感性對於發現稀有細胞而言將係不可接受的。
相應地，在第一態樣中，本發明提供一種將單股DNA(ssDNA)帶條碼的多核苷酸併入至核酸摺疊奈米結構中之方法。該方法包含以下步驟或基本上由以下步驟組成：(a)進行條碼核酸之第一股合成(在後續油乳化液步驟之前或期間)以產生互補雙股條碼核酸，其中該條碼核酸包含至少一個與單股回轉連接子DNA股之一部分互補之引子配對位點，該回轉連接子DNA股包含藉由與條碼核酸互補之序列及與核酸摺疊奈米結構互補之序列而側接的中央5'-5'磷酸二酯連接子；(b)在包含用於延長目標核酸之試劑的油乳化液液滴中組合雙股條碼核酸(或單股條碼核酸及互補引子組)與5'-5'回轉連接子核酸；(c)使包含雙股條碼核酸(或單股條碼核酸及互補引子)與5'-5'回轉連接子核酸的油-乳化液液滴熱循環，其足以引起來自雙股條碼核酸之各股黏著至5'-5'回轉連接子核酸上之互補序列且延長單股DNA(ssDNA)帶條碼的5'-5'回轉多核苷酸，從而產生延長產物液滴；(d)自液滴提取延長產物；(e)純化來自經萃取的延長產物之ssDNA帶條碼的5'-5'回轉多核苷酸；及(f)將經純化的ssDNA帶條碼的5'-5'回轉多核苷酸併入至核酸摺疊奈米結構中。
如本文所用，術語「條碼(barcode)」指可用以區分、配對及獨特地鑑定來自同一細胞之核酸的核苷酸之獨特序列。在一些情況下，條碼可用於區分幾十、數百或甚至數千之例如產生自不同細胞或其他來源之核酸。如本文所用，術語「回轉條碼」指經由獨特5'-5'非標準磷酸二酯DNA「回轉(bowtie)」結構連接在一起之一組互補條碼序列，意指中央磷 酸二酯連接子藉由互補條碼核酸序列而側接在任一側上。
如本文所用，出於方便而使用術語「核酸奈米結構(nucleic acid nanostructure)」且應理解本發明通常涵蓋核酸奈米結構。本發明之奈米結構可為線性(例如奈米棒)或非線性(例如星形、三角形等)。使用各種技術，諸如DNA或RNA摺疊，諸如DNA或RNA的核酸可摺疊成預定一、二或三維奈米結構。
術語「寡核苷酸(oligonucleotide)」、「核苷酸(nucleotide)」及「核酸(nucleic acid)」可互換地使用，意指包含連接至磷酸基及可交換有機鹼的糖(例如核糖或去氧核糖)的分子，其係經取代嘧啶(例如胞嘧啶(C)、胸苷(T)或尿嘧啶(U))或經取代嘌呤(例如腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G))。因此，術語涵蓋DNA及RNA寡核苷酸兩者。術語應亦包括多核苷酸(亦即減去磷酸之多核苷酸)及任何其他含有機鹼之聚合物。寡核苷酸可自現存核酸源(例如基因體或cDNA)獲得，但較佳為合成的(例如藉由核酸合成產生)。
帶條碼的5'-5'回轉連接子捕獲探針之結構：帶條碼的多核苷酸係長ssDNA股，其構建含有中央5'-5'「回轉」連接子，允許兩端執行5'→3'。回轉連接子可包含預合成DNA序列(例如自商業供應商訂購)。較佳地，帶條碼的多核苷酸之任一端另外可包含與M13mp18噬菌體DNA摺疊主幹互補之特異性序列。此序列可經變化且經調適用於將條碼併入至任何目標奈米結構中。參見圖2A，任一端可另外包含用於下游擴增之保守的PCR引子位點，與股之相反端上之條碼互補的獨特條碼、第二保守的引子配對位點及與所關注的基因的保守區互補的mRNA捕獲位點。捕獲序列之重要設 計特徵係mRNA藉由包含在5'-5'回轉之任一端上之一組獨特互補核苷酸條碼而彼此配對。
長的帶條碼的回轉多核苷酸可隨後併入至DNA摺疊主混合物(或其他所需奈米結構)中，且條碼回轉中之M13mp18互補序列與摺疊奈米結構自組裝。參見圖2B，回轉之mRNA捕獲序列區自摺疊奈米結構之表面延伸。在一些情況下將ssDNA帶條碼的5'-5'回轉多核苷酸併入至核酸奈米結構中可包含黏著。
如本文所描述，油乳化液液滴可用於將一組獨特互補條碼併入至數百萬(或更多)回轉股中。包含中央5'-5'非傳統磷酸二酯連接子之基底回轉股可包括與核酸摺疊奈米結構之序列互補的序列以及兩個不同的經保守的引子配對位點，基底回轉股自商業供應商(例如Integrated DNA Technologies公司)獲得。
在一些情況下，5'-5'回轉股具有，例如，以下序列：3'-CGAGTCCCTTTATCGGGAAC-5'-5'-GAACGTGGCGAGAA AGGAAGGGAACAAACTATGGACAGCAAAGACAGCACCT-3'(SEQ ID NO：1)。
在一些情況下，條碼股具有以下序列：5'CACCGACTTTGACTCCCAAATCAATGTGCGGACAGCAA AGACAGCACCTNNNNNNNNNNNNGCTCAGGGAAATAGCCCTTGGGGTAG CCTTTTGTTTGTTTGCAAT CTCTG3'(SEQ ID NO：2)，其中「N」可為在DNA中發現之四個氮鹼(腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤或胸腺嘧啶)之任一者。
在其他情況下，條碼標記的股包含一個引子配對位點，其與 5'-5'回轉股之一側互補；無規則10單元核苷酸條碼(410=1048576個獨特條碼，若分析>106個序列則可採用11單元或12單元條碼)；及第二引子配對位點，其與5'-5'回轉股之另一側互補，其中特異性mRNA(互補)捕獲序列側接在條碼股之兩端上。短條碼股可用於第一股合成反應中以建立具有互補條碼的dsDNA產物，或在下游在油乳化液延長步驟期間用於標準聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction；PCR)反應以直接在乳化液液滴中合成dsDNA條碼股。參見圖3A，>1010個相同ssDNA 5'-5'回轉股及獨特dsDNA條碼股(或具有互補引子之ssDNA條碼股)隨後在油水乳化液液滴重疊延伸延長系統中以1：1：1分子比分子比液滴比率併入。標準PCR循環可用於變性dsDNA條碼股(或在變性之後擴增ssDNA條碼股)，以黏著來自dsDNA條碼股之兩個ssDNA股與5'-5'回轉之任一端，且伸長使用ssDNA條碼股作為模板之回轉。
在變性之後，在各液滴中進行重疊延伸，因為來自dsDNA條碼之各股將與其在5'-5'回轉連接子上之互補引子配對位點黏著，充當用於重疊延伸之引子及模板，且由此併入5'-5'回轉股之任一端上之互補10單元條碼以及回轉股3'端上之mRNA特異性捕獲序列(圖3B)。然而此系統不為指數PCR擴增，採用多分解/黏著/延長循環以確保各5'-5'連接子之兩端得以延長。隨後使用標準醚/乙酸乙酯萃取方案自油水乳化液系統中萃取PCR產物，且藉由標準變性PAGE純化自殘餘核酸純化ssDNA帶條碼的5'-5'回轉股。此時產物將含有(按自5'-5'中央回轉連接子朝向兩個3'端延伸之順序)以下：摺疊互補序列(可能僅一側)、保守的PCR引子配對位點、與5'-5'連接子之相反臂上之條碼互補的無規則10單元條碼、及第二保守的引子配 對位點及基因特異性mRNA捕獲序列(圖3B)。在最終變性PAGE純化之後，最終產物將含有針對以下所必需的區：1)併入至DNA摺疊結構中；2)用於下游PCR擴增之保守的引子配對位點；3)用於配對捕獲的mRNA兩者的互補條碼；及4)與所關注的基因的保守區互補的mRNA捕獲序列，其亦可用作基因特異性逆轉錄引子(圖3C)。
此等獨特回轉條碼可隨後藉由僅僅改變股之「摺疊黏著序列(origami annealing sequence)」部分之身分標識來併入至個別摺疊分子或所關注的任何核酸結構中。由於連接於各回轉股之獨特地帶條碼的mRNA捕獲序列，此方法允許極高水準之mRNA配對特異性。
使用捕獲股上之保守的序列作為基因特異性RT引子將經回收mRNA逆轉錄(reverse transcribed；RT)成cDNA，從而自回轉條碼之3'端延伸基因特異性cDNA。由於回轉條碼上之保守的基因特異性序列為引發RT反應所需，任何非結合mRNA將不被擴增，由此提高選擇性且避免偽配對。
逆轉錄及條碼連接的mRNA擴增子產生(圖1)：在mRNA結合摺疊已自細胞溶解物中純化時，將進行逆轉錄(RT)。使用回轉條碼之mRNA互補區作為RT引子，可藉由僅僅添加任何可商購的RT主混合物且根據製造商之建議培育來達成延長。隨後可藉由添加商購核糖核酸酶H(RNaseH)混合物移除mRNA，且將獲得作為自條碼回轉之3'端延伸之產物的帶條碼的cDNA。吾人先前已使用活體外轉譯目標mRNA結合摺疊證實此方法且證實藉由PCR分離基因特異性cDNA之能力。最終，對於回轉條碼之任一端上之保守的引子配對序列兩者之使用單引子的多重 分析PCR，且視技術之應用而定，1)可進行用於TCRa/TCRp V基因或IgH/IgL V家族之良好確立多重分析引子組以產生具有免疫受體之相應CDR3區的擴增子之集區或2)用於只在已知癌症驅動基因/共同驅動基因中之所關注的突變之外的保守區的單引子將產生條碼配對的PCR產物。藉由在引子組中包含依魯米那特異性接附子序列，可獲得具有CDR3序列、癌症突變序列或來自異源細胞群之所關注的任何配對基因序列的帶條碼的擴增子，其直接適合用於標準依魯米那配對端定序。
在另一態樣中，本文提供例如出於分析細胞群之目的或其他目的，用於，來自大量單細胞的一組幾十至數百或更多之特異性DNA及/或RNA序列之平行捕獲、加條碼及定量之方法。在較佳具體實例中，一種用於在單細胞層次上偵測目標核酸序列之方法包含以下步驟或基本上由以下步驟組成：(a)將根據技術方案1之方法獲得之核酸摺疊奈米結構與自單細胞分離之核酸接觸，其中該奈米結構包含具有與目標核酸序列互補之帶條碼的序列的ssDNA帶條碼的多核苷酸；且其中，接觸發生在適合於帶條碼的序列與目標核酸序列(若存在於單細胞中)結合之條件下；(b)回收結合於帶條碼的序列的目標核酸序列；及(c)使用ssDNA帶條碼的多核苷酸作為用於逆轉錄之基因特異性引子來逆轉錄經回收的目標核酸序列，由此得以偵測到目標核酸(若存在於細胞中)而無需單細胞分選步驟。
在另一態樣中，本發明提供一種用於在單細胞層次上偵測B細胞受體序列之方法。該方法可包含以下步驟或主要由以下步驟組成：(a)轉染成抗原特異性B細胞；(b)接觸包含一或多組mRNA捕獲序列之DNA摺疊奈米結構，以捕獲且保護經轉染抗原特異性B細胞中之免疫球蛋白重 (IgH)及輕(IgL)鏈BCR mRNA兩者；(c)分離接觸的DNA摺疊奈米結構以回收結合於一或多個mRNA捕獲序列之IgH及IgL mRNA；及(d)使用一或多組mRNA捕獲探針作為用於逆轉錄之基因特異性引子來逆轉錄回收的IgH及IgL mRNA，由此得以偵測目標BCR序列而無需單細胞分選步驟。
在一些情況下，DNA摺疊奈米結構包含整合的生物素標記，且分離接觸的奈米結構的步驟可包含抗生物素蛋白管柱純化。
核酸或核酸分子，如本文所用，可包括所關注的任何核酸。在一些具體實例中，核酸包括但不限於，DNA、RNA、肽核酸、N-嗎啉基核酸、鎖核酸、乙二醇核酸、蘇糖核酸、其混合物及其雜交物、或具有內部碳主幹間隔物之核酸。在一些態樣中，核酸係當條件適於合成引子延伸產物時能夠充當沿著核酸之互補股之合成之起始點的「引子(primer)」。核酸可為單股、雙股亦及三股。在一些態樣中，核酸充當用於合成互補核酸之模板，例如藉由核苷酸單元之鹼基互補併入。舉例而言，在一些態樣中，核酸包含天然產生DNA(包括基因體DNA)、RNA(包括mRNA)及/或包含合成分子，合成分子包括但不限於互補DNA(cDNA)及以任何方式生成之重組分子。在一些態樣中，核酸產生於化學合成、逆轉錄、DNA複製或此等生成方法之組合。
可使用任何適合方法獲得核酸，包括由Maniatis等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.，第280-281頁(1982)所描述之方法。在一些態樣中，如美國專利申請公開案第US2002/0190663號中所描述獲得核酸。自生物樣本獲得之核酸典型地經片段 化以產生用於分析之適合片段。
本發明之核酸及/或其他部分可經分離。如本文所用，「經分離(isolated)」意謂自至少一些組分中分離，其通常與係衍生自天然產生來源抑或合成製備(整體或部分地)有關。本發明之核酸及/或其他部分可經純化。如本文所用，「經純化(purified)」意謂自其他化合物或實體之大部分分離。化合物或部分可經部分純化或實質上純化。純度可由藉由重量量測之重量表示且可使用各種分析技術來測定，諸如但不限於質譜、HPLC等。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域的一般技術者通常所理解的相同的含義。如本文所定義及使用之所有定義應理解為控制在辭典定義、以引用之方式併入之文獻中的定義及/或所定義術語之普通含義內。
除非有明確相反指示，否則如在本說明書及申請專利範圍中所使用之冠詞「一(a)」及「一(an)」應理解為意謂「至少一個(at least one)」。
如在本文說明書及申請專利範圍中使用之片語「及/或(and/or)」應理解為意指如此結合之要素的「任一者或兩者(either or both)」，亦即，在一些情況下結合地存在且在其他情況下未結合地存在之要素。使用「及/或」列出之多個要素應以相同方式解釋，亦即，如此結合之要素之「一或多個(one or more)」。可視情況存在除了藉由「及/或」短語所確切地鑑別的要素以外的其他要素，無論與確切地鑑別的彼等要素相關抑或不相關。因此，作為非限制性實例，指代「A及/或B(A and/or B)」在結合諸如「包含」等開放式措辭使用時，在一個具體實例中，可僅指A(視情況包括除了B以外之要素)；在另一具體實例中，可僅指B(視情況包括 除了A以外之要素)；在另一具體實例中，可指A及B兩者(視情況包括其他要素)；等。
如在本說明書及申請專利範圍中所用，「或(or)」應理解為具有與上文所定義之「及/或」相同的含義。舉例而言，當分隔清單中之項目時，「或」或「及/或」應被解釋為包括性的，亦即，包括一些或一列要素中之至少一個而且包括多於一個，及(視情況)其他未列出的項目。只有指示截然相反的術語，諸如「中之僅一者(only one of)」或「中之恰好一者(exactly one of)」或當用於申請專利範圍中時「由……組成(consisting of)」將指包括一些或一列要素中之恰好一個要素。一般而言，當置於排他性術語，諸如「任一(either)」、「中之一者(one of)」、「中之僅一者(only one of)」或「中之恰好一者(exactly one of)」之前時，如本文所用之術語「或」應僅解釋為表明排他性替代方式(亦即「一者或另一者但非兩者皆(one or the other but not both)」)。當用於申請專利範圍中時，「主要由……組成(Consisting essentially of)」應具有如其在專利法律領域中所使用之普通含義。
如本文所用，除非另行說明或以其他方式根據上下文顯而易見，否則指代數目之術語「約(approximately)」或「約(about)」通常視為包括在任一方向上於處於數目之5%範圍內(大於或小於)的數目(除了此類數目將超出可能值之100%之情況)。在陳述範圍之情況下，除非另行說明或以其他方式根據上下文顯而易見，否則端點包括在範圍內。
本發明已關於一或多個較佳具體實例而進行了描述，且應了解除明確地陳述之彼等以外，多個等效物、替代方案、變化形式及修改均為可能的且屬於本發明的範圍內。考慮以下非限制性實施例將能更充分理 解本發明。
實施例
實施例1-逆轉錄及條碼連接的mRNA擴增子生成
一旦mRNA結合摺疊已自細胞溶解物中純化，便進行逆轉錄(RT)。使用回轉條碼之mRNA互補區作為RT引子，藉由添加任何可商購的RT主混合物且根據製造商的建議培育來達成延長。藉由添加商購核糖核酸酶H混合物移除mRNA，且獲得作為自條碼回轉之3'端延伸之產物的帶條碼的cDNA。吾人先前使用活體外轉譯目標mRNA結合摺疊證實了此方法且證實了藉由PCR分離基因特異性cDNA之能力。最終，對回轉條碼上之任一端之各保守的引發序列使用單引子進行多重分析PCR。視技術之應用而定，(1)用於TCR α/TCR β基因或BCR IgH/IgL V家族之良好確立多重分析引子組將產生具有免疫受體之相應CDR3區的擴增子的集區；或2)使用用於只在已知癌症驅動基因/共同驅動基因中之所關注的突變之外的保守區的單引子獲得條碼配對的PCR產物；或(3)用於與多種生物體物種或細胞群內之異源基因相鄰之保守區的單引子。藉由在引子組中包含依魯米那特異性接附子序列，獲得具有CDR3序列之帶條碼的擴增子，其直接適合用於標準依魯米那配對端定序。
實施例2-結合於免疫受體mRNA之DNA摺疊
吾人先前研發出以下用於異二聚體T細胞受體(T cell receptors；TCR)之分析方法，其就多樣性及異質細胞群而言存在相似問題。圖4A至圖4C展示分析已知轉殖基因TCR之上下文中之初步資料(P14轉殖基因T細胞)。摺疊奈米結構經設計以包含每個別摺疊分子多個mRNA捕 獲探針。吾人已修改吾人之奈米結構設計以併入每摺疊分子單個5'-5'帶條碼的mRNA捕獲股。雖然設想mRNA結合動力學相似，但是將進行最佳化實驗以評估mRNA結合效率。先前，當含有TCR α特異性探針及TCR β特異性探針的摺疊僅與TCR β mRNA一起培育時，mRNA僅由摺疊分子之一側(可能具有TCR β特異性探針)捕獲(圖4B)。當含有TCR α特異性探針及TCR β特異性探針兩者的摺疊與TCR α及TCR β mRNA兩者一起培育時，摺疊之兩側捕獲mRNA，表明TCR mRNA之兩種類型在個別摺疊分子之任一側上結合於相應探針(圖4C)，證實恰當的mRNA結合的能力及特異性。此外，關於吾人之分析TCR mRNA結合之先前實驗，吾人在摺疊分子之任一側上採用個別探針股，分別與TCR α序列或TCR β序列互補。儘管mRNA之捕獲將以輕微不同取向出現，預期在摺疊mRNA捕獲中無顯著變化。
實施例3-DNA摺疊奈米結構之轉染
先前研究已採用DNA奈米結構之受體介導的胞吞作用經由小窩蛋白依賴型路徑導致微管傳遞至溶酶體且因此導致奈米結構分解。此策略之明顯問題係，為了mRNA捕獲及後續再分離，吾人之奈米結構必須繞過胞吞作用路徑且替代地直接穿過膜到達細胞質。電穿孔係用於進入細胞質之最簡單方法，且由此避免胞內體降解(endosomal degration)之有害影響。然而較高細胞死亡率通常與此方法相關。微穿孔技術(使用微升體積電穿孔)之近期進展已顯示較高轉染效率(>93%)以及較高細胞生存力(>86%)。針對吾人之B細胞轉染實驗，吾人將使用表現同一KL25序列BCR的KL25 IgL/IgH轉殖基因小鼠作為先前生成之融合瘤[34]。來自4至6 週齡的KL25 IgL/IgH轉殖基因小鼠的脾細胞將藉由機械干擾來製備且在0.83% NH4Cl中溶解紅血球。IgM+ B細胞將藉由磁性細胞分選純化且將藉由流式細胞測量術證實分選的群的>95%純度。細胞將藉由離心(1200rpm，5分鐘，4℃)粒化，用OPTI-MEMTM培養基(Gibco)洗滌，且以1×107個細胞/毫升再懸浮於OPTI-MEMTM培養基中。對於電穿孔，將使用氖注射器轉染系統(Thermo Scientific)在以下設置下使用100微升注射器頂端：2000V，10ms，1脈衝。樣品將由100μL細胞懸浮液及25μL(20nM)DNA摺疊懸浮液(以1×TAE-Mg2+)或25μL 1×TAE-Mg2+緩衝液之模擬轉染對照組構成。緊隨電穿孔，細胞將傳遞至具有10%胎牛血清之新鮮RPMI-1640培養物培養基且在37℃下在96孔盤之個別孔中培育12至24小時。為分析轉染效率，細胞將在LSR Fortessa流式細胞儀中可視化；併入至各奈米結構中之螢光異硫氰酸鹽(FITC；488nm激發，518nm發射)標記允許經成功轉染的細胞藉由流式細胞測量術鑑別出。
吾人先前研發出此轉染方案用於小鼠原代T淋巴細胞(圖5A)，且預測針對B細胞轉染相似設置將提供初始起點。在吾人之先前實驗中，藉由使用濃縮脫氧核糖核酸酶(Turbo脫氧核糖核酸酶，Ambion,Life Technologies)處理經轉染細胞，且隨後藉由FACS分析分析細胞之成功轉染(圖5A)，吾人驗證，DNA摺疊奈米結構進入經轉染淋巴細胞而非非特異性地結合至細胞表面(其將給出偽陽性讀數)。吾人亦證實濃縮脫氧核糖核酸酶處理導致DNA奈米結構之成功破壞(圖5B)。由此，針對原代淋巴細胞，DNA摺疊具有極佳轉染效率。應注意，Turbo脫氧核糖核酸酶係脫氧核糖核酸酶I之經適當改造版本且具有比野生型脫氧核糖核酸酶I顯著較高 之DNA親和力，吾人認為其在摺疊奈米結構之降解方面效率低得多。另外，吾人之研究組先前已展示DNA摺疊在細胞溶解物中12小時高度穩定[33]，證實此等結構耐胞溶質核酸酶降解。
實施例4-序列資料管理、處理及分析(預示)
此項目之成功依賴於經驗證資料處理管線及有經驗的資訊小組，其負責管理、處理及共享大量資料。相應地，使用用於分析經配對整個基因體及轉錄組次世代定序資料之經驗證管線，諸如次世代資料處理及分析管線，其利用經驗證軟體工具且產生標準平台無關格式(第6圖)。在管線內之各步驟，建立統計檔案以確保所有過程均已完成且檔案無損壞。統計檔案含有「經比對鹼基(aligned bases)」、「不匹配率(mismatch rate)」及「md5總和(md5 sums)」。之前在管線內，調用若干額外檢查，包括總庫覆蓋度評估、庫連貫性評估、鹼基品質評估及污染檢查。此管線係關於以下建構：(1)標準化檔案格式；(2)多品質控制檢查；(3)自動處理；(4)序列資料、定序比對及變體識別之計劃釋放及(5)集中式初步資料處理。
讀段經歷一系列品質控制步驟用於在任何給定基礎下量化偏差，且隨後解析成獨立FASTQ檔案用於使用BWA-MEM比對用於獨特CDR3結構之精確拆分讀段比對。各序列具有與Vκ或VH基因片段中之一者匹配之12核苷酸，該等Vκ或VH基因片段對應於來自V片段之3'端上之第二保守半胱胺酸的CASS共同胺基酸序列，以及與對應於保守苯丙胺酸的J片段匹配的6核苷酸。此等密碼子之間的核苷酸總數目決定長度且因此決定CDR3區之閱讀框架。經處理序列資料將儲存在ASU安全關係資料庫管理系統中，其允許經由JasperSoft伺服器之網路應用(WebApp)前端以及 允許特用(Ad Hoc)查詢之安全MongoDB執行個體。配對IgH序列與IgL序列形式個別細胞將藉由基本「若-則(if-then)」算法進行，以各讀段之10單元條碼序列延伸來搜索互補鹼基配對。
參考文獻
1. Arstila, T.P.，等人，A direct estimate of the human alphabeta T cell receptor diversity. Science, 1999. 286(5441)：第958-61頁。
2. Bartok, I.，等人，T cell receptor CDR3 loops influence alphabeta pairing. Mol Immunol, 2010. 47(7-8)：第1613-8頁。
3. Corthay, A., K.S. Nandakumar，及R. Holmdahl, Evaluation of the percentage of peripheral T cells with two different T cell receptor alpha-chains and of their potential role in autoimmunity. J. Autoimmun, 2001. 16(4)：第423-9頁。
4. Rani, L.，等人，Immunoglobulin heavy chain variable region gene repertoire and B-cell receptor stereotypes in Indian patients with chronic lymphocytic leukemia. Leuk Lymphoma, 2016：第1-12頁。
5. Li, X., Dynamic changes of driver genes' mutations across clinical stages in nine cancer types. Cancer Med, 2016。
6. New Driver Mutations Detected in NSCLC. Cancer Discov, 2016。
7. Anoosha, P.，等人，Discrimination of driver and passenger mutations in epidermal growth factor receptor in cancer. Mutat Res, 2015. 780：第24-34頁。
8. Bozic, I.，等人，Accumulation of driver and passenger mutations during tumor progression. Proc Natl Acad Sci U SA, 2010. 107(43)：第18545-50頁。
9. Busse, C.E.，等人，Single-cell based high-throughput sequencing of full-length immunoglobulin heavy and light chain genes. Eur J Immunol, 2014. 44(2)：第597-603。
10. Dash, P.，等人，Paired analysis of TCRalpha and TCRbeta chains at the single-cell level in mice. J Clin Invest, 2011. 121(1)：第288-95頁。
11. DeKosky, B.J.，等人，High-throughput sequencing of the paired human immunoglobulin heavy and light chain repertoire. Nat Biotechnol, 2013. 31(2)：第166-9頁。
12. Chen, A.K.，等人，Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells. Nucleic Acids Res, 2010. 38(14)：第e148頁。
13. Tyagi, S.及F.R. Kramer, Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat Biotechnol, 1996. 14(3)：第303-8頁。
14. Mhlanga, M.M.，等人，tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Res, 2005. 33(6)：第1902-12頁。
15. Dittmer, W.U., A. Reuter，及F.C. Simmel, A DNA-based machine that can cyclically bind and release thrombin. Angew Chem Int Ed Engl, 2004. 43(27)：第3550-3頁。
16. Benenson, Y.，等人，An autonomous molecular computer for logical control of gene expression. Nature, 2004. 429(6990)：第423-9頁。
17. Ko, S.，等人，DNA nanotubes as combinatorial vehicles for cellular delivery. Biomacromolecules, 2008. 9(11)：第3039-43頁。
18. Chen, Y.J.，等人，DNA nanotechnology from the test tube to the cell. Nat Nanotechnol, 2015. 10(9)：第748-60頁。
19. Zhang, X.，等人，Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res, 2013. 41(15)：第e152頁。
20. Kelso, G.F.，等人，Impact on monoclonal antibody production in murine hybridoma cell cultures of adenosine receptor antagonists and phosphodiesterase inhibitors. Bioorg Med Chem Lett, 2016. 26(2)：第540-4頁。
21. Frame, K.K.及W.S. Hu, The loss of antibody productivity in continuous culture of hybridoma cells. Biotechnol Bioeng, 1990. 35(5)：第469-76頁。
22. Franek, F.及J. Dolnikova, Hybridoma growth and monoclonal antibody production in iron-rich protein-free medium: effect of nutrient concentration. Cytotechnology, 1991. 7(1)：第33-8頁。
23. Han, D.，等人，DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space. Science, 2011. 332(6027)：第342-6頁。
24. Ke, Y.，等人，Scaffolded DNA origami of a DNA tetrahedron molecular container. Nano Lett, 2009. 9(6)：第2445-7頁。
25. Han, D.，等人，DNA gridiron nanostructures based on four-arm junctions. Science, 2013. 339(6126)：第1412-5頁。
26. Rinker, S.，等人，Self-assembled DNA nanostructures for distance-dependent multivalent ligand-protein binding. Nat Nanotechnol, 2008. 3(7)：第418-22頁。
27. Sharma, J.，等人，Control of self-assembly of DNA tubules through integration of gold nanoparticles. Science, 2009. 323(5910)：第112-6頁。
28. Ke, Y.，等人，Self-assembled water-soluble nucleic acid probe tiles for label-free RNA hybridization assays. Science, 2008. 319(5860)：第180-3頁。
29. Blattman, J.N.，等人，Evolution of the T cell repertoire during primary, memory, and recall responses to viral infection. J Immunol, 2000. 165(11)：第6081-90頁。
30. Blattman, J.N.，等人，Therapeutic use of IL-2 to enhance antiviral T-cell responses in vivo. Nat Med, 2003. 9(5)：第540-7頁。
31. Schietinger, A.，等人，Rescued tolerant CD8 T cells are preprogrammed to reestablish the tolerant state. Science, 2012. 335(6069)：第723-7頁。
32. Rothemund, P.W., Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature, 2006. 440(7082)：第297-302頁。
33. Mei, Q.，等人，Stability of DNA origami nanoarrays in cell lysate. Nano Lett, 2011. 11(4)：第1477-82頁。
34. Seiler, P.，等人，Enhanced virus clearance by early inducible lymphocytic choriomeningitis virus-neutralizing antibodies in immunoglobulin-transgenic mice. J Virol, 1998. 72(3)：第2253-8頁。
35. Miconnet, I., Probing the T-cell receptor repertoire with deep sequencing. Curr Opin HIV AIDS, 2012. 7(1)：第64-70頁。
36. Venturi, V.，等人，Method for assessing the similarity between subsets of the T cell receptor repertoire. J Immunol Methods, 2008. 329(1-2)：第67-80頁。
37. Brandle, D.，等人，T cell development and repertoire of mice expressing a single T cell receptor alpha chain. Eur J Immunol, 1995. 25(9)：第2650-5頁。
38. Burns, R.P., Jr.，等人，Molecular analysis of skewed Tcra-V gene use in T-cell receptor beta-chain transgenic mice. Immunogenetics, 1998. 47(2)：第107-14頁。
39. Cabaniols, J.P.，等人，Most alpha/beta T cell receptor diversity is due to terminal deoxynucleotidyl transferase. J Exp Med, 2001. 194(9)：第1385-90頁。
40. Ewing, C.，等人，Virus-specific CD8+ T-cell responses in mice transgenic for a T-cell receptor beta chain selected at random. J Virol, 1994. 68(5)：第3065-70頁。
41. Turner, S.J., S.C. Cose，及F.R. Carbone, TCR alpha-chain usage can determine antigen-selected TCR beta-chain repertoire diversity. J Immunol, 1996. 157(11)：第4979-85頁。
42. Hayakawa, K.，等人，Isolation of high-affinity memory B cells: phycoerythrin as a probe for antigen-binding cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 1987. 84(5)：第1379-83頁。
43. Venturi, V.，等人，Methods for comparing the diversity of samples of the T cell receptor repertoire. J Immunol Methods, 2007. 321(1-2)：第182-95頁。
44. Hurlbert, S.H., The Nonconcept of Species Diversity: A Critique and Alternative Parameters. Ecology, 1971. 52(4)：第577頁。
45. Preston, F.W., The Commonness, and Rarity, of Species. Ecology, 1948. 29(3)：第254-283頁。
46. Futschik, A.及C. Schlotterer, The next generation of molecular markers from massively parallel sequencing of pooled DNA samples. Genetics, 2010. 186(1)：第207-18頁。
47. Johnson, P.L.及M. Slatkin, Inference of population genetic parameters in metagenomics: a clean look at messy data. Genome Res, 2006. 16(10)：第1320-7頁。
48. Casrouge, A.，等人，Size estimate of the alpha beta TCR repertoire of naive mouse splenocytes. J Immunol, 2000. 164(11)：第5782-7頁。
49. Lynch, M., Estimation of nucleotide diversity, disequilibrium coefficients, and mutation rates from high-coverage genome-sequencing projects. Mol Biol Evol, 2008. 25(11)：第2409-19頁。
50. Robins, H.S.，等人，Comprehensive assessment of T-cell receptor beta-chain diversity in alphabeta T cells. Blood, 2009. 114(19)：第4099-107頁。
在考慮本發明之以下實施方式，將更好地理解本發明，且除上述彼得以外之特性、態樣及優點將變得顯而易見。該實施方式參考以下圖式，其中：圖1係使用DNA摺疊奈米結構以自來自單細胞之BCR/抗體mRNA獲得連接的序列資訊而無需單細胞分選之例示性方法之示意圖。使用經螢光標記之抗原藉由流式細胞測量術細胞分選來獲得抗原反應性B細胞，且藉由電穿孔含有與IgH及IgL兩者(亦即κ或λ)恆定區mRNA互補之延伸序列之DNA摺疊奈米結構來轉染。DNA摺疊分子結合且保護隨後將溶解之個別細胞內之胞內IgH及IgL mRNA，且結合有mRNA的摺疊隨後經再分離及純化。使用mRNA捕獲探針作為逆轉錄引子，IgH及IgL基因序列在該等摺疊捕獲探針上延伸。cDNA隨後藉由標準IgH/IgL V-基因多重分析PCR進一步擴增以獲得適合於依魯米那(Illumina)配對端定序之擴增產物之集區。各擴增子含有可與其互補序列配對之12單元條碼，由此提供來自個別細胞之IgH及IgL兩者的mRNA之序列資訊而無需單細胞分選。
圖2A至圖2C展示DNA摺疊設計及合成。(A)5'-5'回轉mRNA捕獲探針之組織。各種區允許併入至DNA摺疊奈米結構、下游PCR擴增、條碼配對及IgH/IgL mRNA捕獲中。(B)5'-5'回轉mRNA捕獲探針在黏著BCR IgH及IgL mRNA之同時自摺疊奈米結構之表面延伸之示意性可視化(注意：5'-5'回轉捕獲探針之長度已擴增至允許結構之可視化)。(C)如藉由AFM顯現之恰當地摺疊的DNA摺疊分子顯示預期的「晶圓(wafer)」 形狀之驗證(探針可撓性太大而不能由AFM顯現)。各摺疊分子大致呈60×90nM規模。
圖3A至圖3C展示含有互補條碼序列之5'-5'回轉mRNA捕獲探針之結構。(A)在10單元條碼股之第一股合成之後，建立1：1：1條碼：5'-5'股：油水乳化液液滴反應。(B)使用條碼股作為模板之5'-5'股之重疊延伸允許互補條碼在5'-5'股之任一端上併入。(C)在變性PAGE純化之後，利用接附子股進行模組T4 DNA接合反應，以將基因特異性互補mRNA捕獲序列連接至5'-5'股之任一端。在最終變性PAGE純化及定量之後，可將帶條碼的5'-5'mRNA捕獲探針併入至個別DNA摺疊奈米結構中。
圖4A至圖4C展示DNA摺疊奈米結構與目標mRNA之結合。(A)目標mRNA特異性地結合至DNA摺疊結構：使用報導螢光素分子顯現由於目標mRNA之特異性結合而導致之DNA摺疊之偏移。色帶1至色帶3：不具有目標特異性延伸釘序列之與活體外轉錄的目標mRNA一起培育(1)、單獨培育(2)、或與無意義(亂序)mRNA一起培育(3)之DNA摺疊。色帶4：僅活體外轉錄目標mRNA(不可見)，色帶5：MW標記(不可見)，色帶6至色帶7：具有延伸目標特異性釘序列之單獨培育(6)或與活體外轉錄目標mRNA一起培育(7)之DNA摺疊。特異性FRET信號鑑別DNA摺疊結構。(B)選擇的AFM影像顯示與具有目標特異性延伸釘的摺疊結合但不與非目標釘結合之活體外轉錄目標mRNA之特異性(mRNA僅在摺疊分子之一側上可見)。(C)選擇的AFM影像顯示兩個活體外轉錄目標mRNA之結合，由含有α釘及β釘兩者之個別摺疊捕獲(mRNA結合於摺疊分子之兩側上)。
圖5A至圖5B展示具有DNA摺疊奈米結構之原代淋巴細胞之轉染。(A)來自小鼠之淋巴細胞經模擬轉染(左)或經FITC標記的DNA摺疊奈米結構轉染(中間)。經轉染的細胞基於藉由流式細胞測量術偵測FITC標記來顯現。為確保摺疊結構由細胞佔據且不結合於細胞表面，在轉染之後用去氧核糖核酸酶(DNase)處理細胞。在去氧核糖核酸酶處理之後，自DNA摺疊偵測到相似FITC信號(右)。(B)在培育之後去氧核糖核酸酶分解破壞細胞表面上之DNA摺疊，如藉由凝膠電泳所證實。
圖6係展示例示性次世代定序(Next Generation Sequencing；NGS)分析方案之流程圖。個別運行之序列解析成FASTQ檔案用於使用BWA-MEM軟體比對。生成分析檔案用於製圖、讀段計數及連接點偵測，且針對序列之品質控制及擴增偏差而進一步處理。
雖然本發明易有各種修改及替代形式，但在附圖中藉助於實例展示了其例示性具體實例，且在本文中對其進行詳細描述。然而應理解，例示性具體實例之描述不意欲將本發明限制於所揭示的特定形式，相反，目的係涵蓋屬於由所附申請專利範圍定義之本發明之精神及範圍內之所有修改、等效物及替代方式。
<110> 亞利桑那州大學之亞利桑那董事會
<120> 來自個別細胞之用於捕獲經配對mRNA及定序的回轉條碼之高通量油乳化液合成
<130> M17-010L/112624.00928
<150> 62/377,123
<151> 2016-08-19
<160> 2
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
<210> 2
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(61)
<223> n係a、c、g或t
<400> 2

Claims (7)

  1. 一種用於將單股DNA(ssDNA)帶條碼的多核苷酸併入至核酸摺(origami)疊奈米結構中的方法，該方法包含：(a)進行條碼核酸之第一股合成或乳化液液滴內擴增以產生雙股條碼核酸，其中該條碼核酸包含與所關注之基因序列之保守區互補的區以及至少一個與單股5'-5'回轉連接子核酸的一側互補的引子配對位點，該回轉連接子核酸包含藉由與核酸摺疊奈米結構互補之序列而側接在一側上的中央5'-5'磷酸二酯連接子；(b)在包含用於延長目標核酸之試劑之油乳化液液滴中組合該等雙股條碼核酸與該5'-5'回轉連接子核酸；(c)使包含該等雙股條碼核酸及該5'-5'回轉連接子核酸之油乳化液液滴熱循環，其足夠引起該等雙股條碼核酸黏著至該5'-5'回轉連接子核酸上之互補序列及延長ssDNA帶條碼的5'-5'回轉多核苷酸，從而產生延長液滴；(d)自該延長液滴中萃取延長產物；(e)自該等經萃取延長產物中純化ssDNA帶條碼的5'-5'回轉多核苷酸；及(f)將該等經純化的ssDNA帶條碼的5'-5'回轉多核苷酸併入至核酸摺疊奈米結構中。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中併入包含將該等經純化ssDNA帶條碼的5'-5'回轉多核苷酸黏著至核酸摺疊奈米結構。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該核酸摺疊奈米結構係DNA奈米 結構。
  4. 一種用於在單細胞層次上偵測目標核酸序列方法，該方法包含(a)將根據申請專利範圍第1項之方法獲得之核酸摺疊奈米結構與自單細胞分離之核酸接觸，其中該奈米結構包含ssDNA帶條碼的多核苷酸，其具有與目標核酸序列互補之條碼序列；且其中接觸發生在適合於該等條碼序列與該目標核酸序列(若存在於該單細胞中)結合的條件下；(b)回收結合於該等條碼序列之目標核酸序列；及(c)使用該等ssDNA帶條碼的多核苷酸作為用於逆轉錄的基因特異性引子來逆轉錄該等經回收的目標核酸序列，由此偵測出目標核酸(若存在於該細胞中)而無需單細胞分選步驟。
  5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該核酸摺疊奈米結構係DNA奈米結構。
  6. 一種用於在單細胞層次上偵測B細胞受體序列之方法，該方法包含(a)將免疫球蛋白重(IgH)及輕(IgL)鏈BCR mRNA轉染至抗原特異性B細胞；(b)接觸包含一或多個mRNA捕獲序列之DNA摺疊奈米結構以捕獲且保護經轉染的抗原特異性B細胞中的免疫球蛋白重(IgH)及輕(IgL)鏈BCR mRNA兩者(c)分離該等經接觸的DNA摺疊奈米結構以回收結合於該一或多個mRNA捕獲序列之IgH及IgL mRNA；及(d)使用該一或多個mRNA捕獲探針作為用於逆轉錄之基因特異 性引子來逆轉錄該經回收的IgH及IgL mRNA，由此偵測出目標BCR序列而無需單細胞分選步驟。
  7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該等DNA摺疊奈米結構包含整合的生物素標記，且其中分離該等經接觸的奈米結構包含抗生物素蛋白管柱純化。
TW106127772A 2016-08-19 2017-08-16 來自個別細胞之用於捕獲經配對ｍＲＮＡ及定序的回轉條碼之高通量油乳化液合成 TW201812007A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662377123P 2016-08-19 2016-08-19
US62/377,123 2016-08-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201812007A true TW201812007A (zh) 2018-04-01

Family

ID=61196998

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW106127772A TW201812007A (zh) 2016-08-19 2017-08-16 來自個別細胞之用於捕獲經配對ｍＲＮＡ及定序的回轉條碼之高通量油乳化液合成

Country Status (9)

Country Link
US (2) US11208681B2 (zh)
EP (1) EP3500685B1 (zh)
JP (1) JP6811843B2 (zh)
KR (1) KR20190039294A (zh)
CN (1) CN109642254A (zh)
AU (1) AU2017312947A1 (zh)
CA (1) CA3072318A1 (zh)
TW (1) TW201812007A (zh)
WO (1) WO2018035055A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109652480A (zh) * 2018-12-28 2019-04-19 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种构筑集束状dna纳米结构的方法
KR102424143B1 (ko) * 2020-09-01 2022-07-25 프로지니어 주식회사 표적핵산 자체로 만들어지는 입체적 핵산나노구조체를 이용한 표적핵산 검출 방법
GB202015058D0 (en) * 2020-09-23 2020-11-04 Univ London Nanostructured necleic acids vaccines

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6448717B1 (en) 2000-07-17 2002-09-10 Micron Technology, Inc. Method and apparatuses for providing uniform electron beams from field emission displays
CN102656449B (zh) * 2009-09-01 2015-07-08 俄勒冈健康科学大学 用于分离生物大分子的可逆电流凝胶电泳装置
WO2012102616A1 (en) * 2011-01-28 2012-08-02 Flexgen B.V. Heterodirectional polynucleotides
CA2826131C (en) * 2011-02-02 2019-11-05 Jay Ashok Shendure Massively parallel continguity mapping
WO2013184754A2 (en) 2012-06-05 2013-12-12 President And Fellows Of Harvard College Spatial sequencing of nucleic acids using dna origami probes
WO2014200933A1 (en) 2013-06-12 2014-12-18 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Obtaining information from single cells within populations using dna origami nanostructures
US20150315637A1 (en) * 2014-04-30 2015-11-05 International Business Machines Corporation Bow tie dna compositions and methods
CN104962615B (zh) * 2015-06-04 2018-05-11 西南大学 基于适配体修饰的dna折纸纳米结构-纳米金的生物传感器及其制备方法和应用
WO2018053119A2 (en) * 2016-09-15 2018-03-22 Augmenta Bioworks, Inc. Immune repertoire sequence amplification methods and applications
WO2018200884A1 (en) * 2017-04-26 2018-11-01 The Broad Institute, Inc. Methods for linking polynucleotides

Also Published As

Publication number Publication date
US11208681B2 (en) 2021-12-28
CA3072318A1 (en) 2018-02-22
KR20190039294A (ko) 2019-04-10
EP3500685B1 (en) 2023-07-12
US20220162674A1 (en) 2022-05-26
JP6811843B2 (ja) 2021-01-13
EP3500685A4 (en) 2020-02-26
US12018317B2 (en) 2024-06-25
AU2017312947A1 (en) 2019-02-14
EP3500685A1 (en) 2019-06-26
CN109642254A (zh) 2019-04-16
JP2019526250A (ja) 2019-09-19
US20190194724A1 (en) 2019-06-27
WO2018035055A1 (en) 2018-02-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11708607B2 (en) Compositions containing identifier sequences on solid supports for nucleic acid sequence analysis
US10273473B2 (en) Method of normalizing biological samples
AU2017381296B2 (en) Reagents and methods for the analysis of linked nucleic acids
EP3172321B1 (en) Polynucleotide enrichment using crispr-cas systems
US12018317B2 (en) High throughput oil-emulsion synthesis of bowtie barcodes for paired mRNA capture and sequencing from individual cells
WO2016074338A1 (en) Detection methods based on sequencing
JP6789935B2 (ja) データの速度および密度を増大させるための多数のプライマーからのシーケンシング
CN113528628A (zh) 用于基因组应用和治疗应用的核酸分子的克隆复制和扩增的系统和方法
US20210017580A1 (en) Small rna detection method based on small rna primed xenosensor module amplification
CN114787385A (zh) 用于检测核酸修饰的方法和系统
US20190292591A1 (en) Systems and methods for determining genetic data
WO2016098595A1 (ja) 一塩基多型検出用オリゴヌクレオチドプローブ及び一塩基多型検出方法
EP4146818A1 (en) Removal of excess oligonucleotides from a reaction mixture