JP7280312B2 - 新規crispr酵素及び系 - Google Patents
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Description
本願は、2015年6月18日に出願された米国仮特許出願第62/181,739号明細書;2015年7月16日に出願された米国仮特許出願第62/193,507号明細書、2015年8月5日に出願された米国仮特許出願第62/201,542号明細書、2015年8月16日に出願された米国仮特許出願第62/205,733号明細書、2015年9月24日に出願された米国仮特許出願第62/232,067号明細書、2015年12月18日に出願された米国特許出願第14/975,085号明細書、及び欧州特許出願第16150428.7号明細書の利益及びそれらに対する優先権を主張する。
本発明は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)から付与された助成金第MH100706号に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
本願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、この配列表は本明細書によって全体として参照により援用される。2015年12月17日に作成された前記ASCII複製物は、名称47627.05.2123_SL.txt、サイズが2,467,205バイトである。
Cpf1ヌクレアーゼの一次構造のコンピュータ分析から、3つの個別的な領域が明らかになる(図1)。第一にC末端RuvC様ドメインであり、これは唯一機能的に特徴付けられたドメインである。第二にN末端α-ヘリックス領域であり、及び第三に、RuvC様ドメインとα-ヘリックス領域との間に位置する混合α及びβ領域である。
Cpf1タンパク質がヌクレアーゼ活性を有する場合、Cpf1タンパク質は、低下したヌクレアーゼ活性、例えば、野生型酵素と比較したとき少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は100%のヌクレアーゼ不活性化を有するように改変することができ;又は別の言い方をすれば、Cpf1酵素は有利には、非突然変異型又は野生型Cpf1酵素又はCRISPR酵素のヌクレアーゼ活性の約0%、又は非突然変異型又は野生型Cpf1酵素、例えば非突然変異型又は野生型フランシセラ・ノビシダ(Francisella novicida)U112(FnCpf1)、アシダミノコッカス属種(Acidaminococcus sp.)BV3L6(AsCpf1)、ラクノスピラ科細菌(Lachnospiraceae bacterium)ND2006(LbCpf1)又はモラクセラ・ボボクリ(Moraxella bovoculi)237(MbCpf1 Cpf1酵素又はCRISPR酵素のヌクレアーゼ活性の約3%又は約5%又は約10%以下を有する。これは、Cpf1及びそのオルソログのヌクレアーゼドメインに突然変異を導入することによって可能である。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの本発明に係るエフェクタータンパク質(CRISPR酵素;Cpf1)は不安定化ドメイン(DD)と会合又は融合される。一部の実施形態において、DDはER50である。このDDの対応する安定化リガンドは、一部の実施形態において4HTである。そのため、一部の実施形態では、少なくとも1つのDDのうち1つがER50であり、従って安定化リガンドが4HT又はCMP8である。一部の実施形態において、DDはDHFR50である。このDDの対応する安定化リガンドは、一部の実施形態においてTMPである。そのため、一部の実施形態では、少なくとも1つのDDのうち1つがDHFR50であり、従って安定化リガンドがTMPである。一部の実施形態において、DDはER50である。このDDの対応する安定化リガンドは、一部の実施形態においてCMP8である。従ってCMP8は、ER50系における4HTの代替的な安定化リガンドであり得る。CMP8及び4HTを競合的に使用し得る/使用すべきである可能性があり得るが、一部の細胞型はこれらの2つのリガンドのうちのいずれか一方の影響を受け易いこともあり、及び本開示及び当該技術分野における知識から、当業者はCMP8及び/又は4HTを使用することができる。
一態様において、本発明は、オフターゲット効果の低下をもたらす1つ以上の突然変異を有する本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされたCRISPR酵素、好ましくはクラス2 CRISPR酵素、好ましくはV型又はVI型CRISPR酵素、例えば好ましくは、限定はされないが、本明細書の他の部分に記載されるとおりのCpf1、即ち、標的遺伝子座に改変を生じさせるのに用いられるが、しかしガイドRNAと複合体化したときなどの、オフターゲットに向けた活性は低下又は消失させる改良されたCRISPR酵素、並びにガイドRNAと複合体を形成したときなどの、CRISPR酵素の活性を増加させるための改良されたCRISPR酵素を提供する。本明細書において以下に記載するとおりの突然変異酵素は、本明細書の他の部分に記載されるとおりの本発明に係る方法のいずれにおいても用いられ得ることが理解されるべきである。本明細書の他の部分に記載されるとおりの方法、産物、組成物及び使用のいずれも、同様に以下に更に詳述するとおりの突然変異CRISPR酵素に適用可能である。本明細書に記載されるとおりの態様及び実施形態において、Cpf1をCRISPR酵素として参照するとき又は読めるとき、機能性CRISPR-Cas系の再構成は、好ましくはtracr配列を必要とせず又はそれに依存せず、及び/又はダイレクトリピートはガイド(標的又はスペーサー)配列の5’(上流)側にあることが理解されるべきである。
Cpf1などの、本明細書で定義される天然に存在しないCRISPR酵素
を提供し、ここで:
この酵素はガイドRNAと複合体化してCRISPR複合体を形成し、
CRISPR複合体内にあるとき、ガイドRNAが1つ以上の標的ポリヌクレオチド遺伝子座を標的化して、酵素がポリヌクレオチド遺伝子座を変化させ、及び
この酵素は少なくとも1つの改変を含み、
それによってCRISPR複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき1つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力が低下し、及び/又はそれによってCRISPR複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき1つ以上の標的遺伝子座を改変する能力が増加する。
標的と1つ以上のオフターゲット遺伝子座の対応する配列との間には単一のミスマッチが存在してもよく;及び/又は
標的と1つ以上のオフターゲット遺伝子座の対応する配列との間には2、3又は4つ又はそれより多いミスマッチが存在してもよく、及び/又は
ここで(ii)において、前記2、3又は4つ又はそれより多いミスマッチは連続している。
a)本明細書に定義するとおりのエンジニアリングされたCRISPRタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第1の調節エレメント;及び任意選択で、
b)ガイド配列、ダイレクトリピート配列を含むガイドRNAを含む1つ以上の核酸分子をコードする1つ以上のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第2の調節エレメントを含み、任意選択で構成成分(a)及び(b)は同じ又は異なるベクターに位置する。
CRISPR-Cas複合体構成成分又は前記構成成分を含むか若しくはそれをコードする1つ以上のポリヌクレオチド配列を細胞に送達するように作動可能に構成された送達系であって、前記CRISPR-Cas複合体は細胞において作動可能である、送達系
を含む天然に存在しないエンジニアリングされた組成物も提供し、
CRISPR-Cas複合体構成成分又は細胞における転写及び/又は翻訳のためCRISPR-Cas複合体構成成分をコードする1つ以上のポリヌクレオチド配列は、
(I)本明細書に記載の天然に存在しないCRISPR酵素(例えば、エンジニアリングされたCpf1);
(II)以下を含むCRISPR-CasガイドRNA:
ガイド配列、
ダイレクトリピート配列、
を含み、ここで:
CRISPR複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき1つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力が低下し、及び/又はそれによってCRISPR複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき1つ以上の標的遺伝子座を改変する能力が増加する。
a)本明細書における本発明の構築物のいずれか1つの天然に存在しないCRISPR酵素をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第1の調節エレメント;及び
b)ガイドRNAの1つ以上をコードする1つ以上のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第2の調節エレメントであって、ガイドRNAがガイド配列とダイレクトリピート配列とを含む、第2の調節エレメント、
を含む1つ以上のベクターを含む、エンジニアリングされた天然に存在しないクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復(CRISPR)-CRISPR関連(Cas)(CRISPR-Cas)ベクター系も提供し、ここで:
構成成分(a)及び(b)は同じ又は異なるベクター上に位置し、
CRISPR複合体が形成され;
ガイドRNAが標的ポリヌクレオチド遺伝子座を標的化し、酵素がポリヌクレオチド遺伝子座を変化させ、及び
CRISPR複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき1つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力が低下し、及び/又はそれによってCRISPR複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき1つ以上の標的遺伝子座を改変する能力が増加する。
I.CRISPR-Cas系ガイドRNA(gRNA)ポリヌクレオチド配列であって、
(a)HSC内の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
(b)ダイレクトリピート配列、
を含むポリヌクレオチド配列、及び
II.任意選択で少なくとも1つ以上の核局在化配列を含む、CRISPR酵素、
を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を、例えばそれを含有する粒子にHSCを接触させることによって、HSCに送達するステップを含み、
ここで、ガイド配列は標的配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を導き、及び
ここでCRISPR複合体は、(1)標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成したCRISPR酵素を含み;及び
この方法はまた、任意選択で、例えば、HDR鋳型を含有するHSCと接触する粒子を介するか、又はHDR鋳型を含有する別の粒子にHSCを接触させることにより、HDR鋳型を送達するステップも含むことができ、ここでHDR鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし;「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってもよく;及び
任意選択で本方法は、生物又は非ヒト生物からHSCを単離又は入手するステップ、任意選択でHSC集団を拡大するステップ、1つ又は複数の粒子とHSCとの接触を実施して改変されたHSC集団を入手するステップ、任意選択で改変されたHSCの集団を拡大するステップ、及び任意選択で改変されたHSCを生物又は非ヒト生物に投与するステップを含み得る。
この方法はまた、任意選択で、例えば、HDR鋳型を含有するHSCと接触する粒子を介するか、又はHDR鋳型を含有する別の粒子にHSCを接触させることにより、HDR鋳型を送達するステップも含むことができ、ここでHDR鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし;「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってもよく;及び
任意選択で本方法は、生物又は非ヒト生物からHSCを単離又は入手するステップ、任意選択でHSC集団を拡大するステップ、1つ又は複数の粒子とHSCとの接触を実施して改変されたHSC集団を入手するステップ、任意選択で改変されたHSCの集団を拡大するステップ、及び任意選択で改変されたHSCを生物又は非ヒト生物に投与するステップを含み得る。
I.第1のCRISPR-Cas(例えば、Cpf1)系RNA(RNA)ポリヌクレオチド配列であって、
(a)第1の標的配列にハイブリダイズ可能な第1のガイド配列、
(b)第1のダイレクトリピート配列、及び
を含む第1のポリヌクレオチド配列、
II.第2のCRISPR-Cas(例えば、Cpf1)系ガイドRNAポリヌクレオチド配列であって、
(a)第2の標的配列にハイブリダイズ可能な第2のガイド配列、
(b)第2のダイレクトリピート配列、及び
を含む第2のポリヌクレオチド配列、及び
III.少なくとも1つ以上の核局在化配列を含み、且つ1つ以上の突然変異を含むCRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列[(a)、(b)及び(c)は5’から3’への方向に並ぶ];又は
IV.I.~III.の1つ以上の1つ又は複数の発現産物、例えば第1及び第2のダイレクトリピート配列、CRISPR酵素;
[転写されると、第1及び第2のガイド配列がそれぞれ第1及び第2のCRISPR複合体と第1及び第2の標的配列との配列特異的結合を誘導し、第1のCRISPR複合体が、(1)第1の標的配列にハイブリダイズする第1のガイド配列と複合体を形成したCRISPR酵素を含み、第2のCRISPR複合体が、(1)第2の標的配列にハイブリダイズする第2のガイド配列と複合体を形成したCRISPR酵素を含み、CRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列がDNA又はRNAであり、及び第1のガイド配列が第1の標的配列の近傍でDNA二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、且つ第2のガイド配列が第2の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導して二本鎖切断を生じさせ、それにより生物又は非ヒト生物を改変する]を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を含む粒子をHSCに接触させることによる送達するステップを含む、HSCの目的のゲノム遺伝子座であって、例えば異常タンパク質発現又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異に関連する目的のゲノム遺伝子座におけるDNA二重鎖の逆鎖上にある第1及び第2の標的配列の操作によって生物又は非ヒト生物を改変する方法を包含し、;及びこの方法は、任意選択で、例えば、HDR鋳型を含有するHSCと接触する粒子を介するか、又はHDR鋳型を含有する別の粒子にHSCを接触させることにより、HDR鋳型を送達するステップもまた含むことができ、ここでHDR鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし;「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってよく;及び任意選択でこの方法は、生物又は非ヒト生物からHSCを単離又は入手するステップ、任意選択でこのHSC集団を拡大するステップ、1つ以上の粒子とHSCとの接触を実施して改変されたHSC集団を入手するステップ、任意選択で改変HSCの集団を拡大するステップを含み、及び任意選択で改変HSCを生物又は非ヒト生物に投与するステップとを含む、前記ゲノム遺伝子座のコードエレメント、非コードエレメント又は調節エレメント内の標的配列の操作を含む方法。本発明の一部の方法において、CRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列、第1及び第2のガイド配列、第1及び第2のダイレクトリピート配列の一部又は全部がRNAである。本発明のさらなる実施形態において、CRISPR酵素をコードする配列、第1及び第2のガイド配列、第1及び第2のダイレクトリピート配列をコードするポリヌクレオチドはRNAであり、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃によって送達される;しかし、送達は粒子によることが有利である。本発明の特定の実施形態において、第1及び第2のダイレクトリピートは100%の同一性を共有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、1つ以上のベクターを含むベクター系内に含まれ得る。好ましい実施形態において、第1のCRISPR酵素は、その酵素が相補鎖ニッキング酵素となるような1つ以上の突然変異を有し、第2のCRISPR酵素は、その酵素が非相補鎖ニッキング酵素となるような1つ以上の突然変異を有する。或いは、第1の酵素が非相補鎖ニッキング酵素であってもよく、及び第2の酵素が相補鎖ニッキング酵素であってもよい。本発明の好ましい方法において、第1のガイド配列が第1の標的配列の近傍でDNA二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、且つ第2のガイド配列が第2の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導することにより、5’オーバーハングが生じる。本発明の実施形態において、5’オーバーハングは高々200塩基対、好ましくは高々100塩基対、又はより好ましくは高々50塩基対である。本発明の実施形態において、5’オーバーハングは少なくとも26塩基対、好ましくは少なくとも30塩基対、又はより好ましくは34~50塩基対である。
I.第1の調節エレメントであって、
(a)第1の標的配列にハイブリダイズ可能な第1のガイド配列、及び
(b)少なくとも1つ以上のダイレクトリピート配列
に機能的に連結している第1の調節エレメント、
II.第2の調節エレメントであって、
(a)第2の標的配列にハイブリダイズ可能な第2のガイド配列、及び
(b)少なくとも1つ以上のダイレクトリピート配列
に機能的に連結している第2の調節エレメント、
III.CRISPR酵素(例えば、Cpf1)をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第3の調節エレメント、及び
V.I.~IV.の1つ以上の1つ又は複数の発現産物、例えば第1及び第2のダイレクトリピート配列、CRISPR酵素;
[転写されると、構成成分I、II、III及びIVが系の同じ又は異なるベクターに位置し、且つ第1及び第2のガイド配列がそれぞれ第1及び第2の標的配列に対する第1及び第2のCRISPR複合体の配列特異的結合を誘導し、第1のCRISPR複合体が、(1)第1の標的配列にハイブリダイズする第1のガイド配列と複合体を形成したCRISPR酵素を含み、第2のCRISPR複合体が、(1)第2の標的配列にハイブリダイズする第2のガイド配列と複合体を形成したCRISPR酵素を含み、CRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列がDNA又はRNAであり、及び第1のガイド配列が第1の標的配列の近傍でDNA二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、且つ第2のガイド配列が第2の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導して二本鎖切断を生じさせ、それにより生物又は非ヒト生物を改変する]を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を含む1つ以上の粒子をHSCに接触させることにより送達するステップを含む、例えばHSCの目的のゲノム遺伝子座であって、異常タンパク質発現又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異に関連する目的のゲノム遺伝子座におけるDNA二重鎖の逆鎖上にある第1及び第2の標的配列の操作によって生物又は非ヒト生物を改変する方法を包含し;及びこの方法は、任意選択で、例えば、HDR鋳型を含有するHSCと接触する粒子を介するか、又はHDR鋳型を含有する別の粒子にHSCを接触させることにより、HDR鋳型を送達するステップもまた含むことができ、ここでHDR鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし;「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってよく;及び任意選択でこの方法は、生物又は非ヒト生物からHSCを単離又は入手するステップ、任意選択でこのHSC集団を拡大するステップ、1つ以上の粒子とHSCとの接触を実施して改変されたHSC集団を入手するステップ、任意選択で改変HSCの集団を拡大するステップ、及び任意選択で改変HSCを生物又は非ヒト生物に投与するステップを含み得る。
a)HSCの二本鎖DNA分子のそれぞれ第1の鎖及び第2の鎖を標的化する2つのCRISPR-Cas系ガイドRNAの各々に機能的に連結している第1の調節エレメント、及び
b)Cas(例えば、Cpf1)タンパク質に機能的に連結している第2の調節エレメント、又は
c)a)又はb)の1つ以上の発現産物、
[構成成分(a)及び(b)は系の同じ又は異なるベクターに位置する]を含む1つ以上の粒子をHSCに接触させることにより、HSCに導入し、それによりガイドRNAがHSCのDNA分子を標的化し、且つCasタンパク質がそのHSCのDNA分子の第1の鎖及び第2の鎖の各々をニッキングすることにより(及び、Casタンパク質と2つのガイドRNAとは天然では一緒に存在しない)、HSCにおける目的のゲノム遺伝子座、例えば異常タンパク質発現又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異に関連する目的のゲノム遺伝子座を改変する方法を包含し;及びこの方法は、任意選択で、例えばHDR鋳型を含有するHSCと接触する粒子を介するか、又はHDR鋳型を含有する別の粒子にHSCを接触させることにより、HDR鋳型を送達するステップもまた含むことができ、ここでHDR鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし;「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってよく;及び任意選択でこの方法は、生物又は非ヒト生物からHSCを単離又は入手するステップ、任意選択でHSC集団を拡大するステップ、1つ以上の粒子とHSCとの接触を実施して改変されたHSC集団を入手するステップ、任意選択で改変HSCの集団を拡大するステップ、及び任意選択で改変HSCを生物又は非ヒト生物に投与するステップを含み得る。本発明の態様において、ガイドRNAは、ダイレクトリピート配列に融合したガイド配列及びtracr配列を含み得る。本発明の態様は、遺伝子産物の発現を低下させること、又は遺伝子産物をコードするDNA分子に鋳型ポリヌクレオチドが更に導入されること、又は2つの5’オーバーハングのリアニーリング及びライゲーションを可能にすることにより介在配列が正確に切り出されること、又は遺伝子産物の活性又は機能を変化させること、又は遺伝子産物の発現を増加させることに関する。本発明のある実施形態において、遺伝子産物はタンパク質である。本発明の好ましい実施形態において、系のベクターはウイルスベクターである。さらなる実施形態において、系のベクターは、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃によって送達され;及び粒子が好ましい。一態様において、本発明は、HSC中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、CRISPR複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させるステップであって、前記標的ポリヌクレオチドの切断を生じさせ、それにより標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、ここでCRISPR複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成したCRISPR酵素を含み、前記ガイド配列はダイレクトリピート配列に連結する。一部の実施形態において、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子から発現するタンパク質に1つ以上のアミノ酸変化をもたらす。一部の実施形態において、本方法は、1つ以上のベクター又はその1つ又は複数の発現産物を例えば1つ又は複数の粒子によって例えば前記HSCに送達するステップを更に含み、ここで1つ以上のベクターは、CRISPR酵素、ダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列のうちの1つ以上の発現をドライブする。一部の実施形態において、前記ベクターは例えば対象のHSCに送達される。一部の実施形態において、前記改変は細胞培養物内の前記HSCにおいて起こる。一部の実施形態において、本方法は、前記改変前に対象から前記HSCを単離するステップを更に含む。一部の実施形態において、本方法は、前記HSC及び/又はそこから得られた細胞を前記対象に戻すステップを更に含む。
ある態様において、本発明は、
誘導性二量体の第1の半体に結合した第1のCpf1融合構築物、及び
誘導性二量体の第2の半体に結合した第2のCpf1融合構築物
を含む、天然に存在しない又はエンジニアリングされた誘導性Cpf1 CRISPR-Cas系を提供し、ここで
第1のCpf1融合構築物は1つ以上の核局在化シグナルに作動可能に連結され、
第2のCpf1融合構築物は1つ以上の核外移行シグナルに作動可能に連結され、
誘導物質エネルギー源に接触すると誘導性二量体の第1及び第2の半体が一体になり、
誘導性二量体の第1及び第2の半体が一体になると、第1及び第2のCpf1融合構築物が機能性Cpf1 CRISPR-Cas系を構成することが可能になり、
Cpf1 CRISPR-Cas系が、細胞の目的のゲノム遺伝子座にある標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドRNA(gRNA)を含み、及び
機能性Cpf1 CRISPR-Cas系が標的配列に結合し、及び任意選択で、ゲノム遺伝子座を編集して遺伝子発現を変化させる。
誘導性ヘテロ二量体の第1の半体に結合した第1のCpf1融合構築物、及び
誘導性ヘテロ二量体の第2の半体に結合した第2のCpf1融合構築物
を含む、天然に存在しない又はエンジニアリングされた誘導性Cpf1 CRISPR-Cas系を提供し、ここで
第1のCpf1融合構築物は1つ以上の核局在化シグナルに作動可能に連結され、
第2のCpf1融合構築物は核外移行シグナルに作動可能に連結され、
誘導物質エネルギー源に接触すると誘導性ヘテロ二量体の第1及び第2の半体が一体になり、
誘導性ヘテロ二量体の第1及び第2の半体が一体になると、第1及び第2のCpf1融合構築物が機能性Cpf1 CRISPR-Cas系を構成することが可能となり、
Cpf1 CRISPR-Cas系は、細胞の目的のゲノム遺伝子座にある標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドRNA(gRNA)を含み、及び
機能性Cpf1 CRISPR-Cas系がゲノム遺伝子座を編集して遺伝子発現を変化させる。
誘導性ホモ二量体の第1の半体に結合した第1のCpf1融合構築物、及び
誘導性ホモ二量体の第2の半体に結合した第2のCpf1融合構築物、
を含む、天然に存在しない又はエンジニアリングされた誘導性Cpf1 CRISPR-Cas系もまた提供され、
第1のCpf1融合構築物は1つ以上の核局在化シグナルに作動可能に連結され、
第2のCpf1融合構築物は(任意選択で1つ以上の)核外移行シグナルに作動可能に連結され、
誘導物質エネルギー源に接触すると誘導性ホモ二量体の第1及び第2の半体が一体になり、
誘導性ホモ二量体の第1及び第2の半体が一体になると、第1及び第2のCpf1融合構築物が機能性Cpf1 CRISPR-Cas系を構成することが可能となり、
Cpf1 CRISPR-Cas系が、細胞の目的のゲノム遺伝子座にある標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドRNA(gRNA)を含み、及び
機能性Cpf1 CRISPR-Cas系が標的配列に結合し、及び任意選択で、ゲノム遺伝子座を編集して遺伝子発現を変化させる。
誘導性二量体の第1の半体に結合した第1のCpf1融合構築物、及び
誘導性二量体の第2の半体に結合した第2のCpf1融合構築物、
を含み、
第1のCpf1融合構築物が1つ以上の核局在化シグナルに作動可能に連結され、
第2のCPf1融合構築物が1つ以上の核外移行シグナルに作動可能に連結され、
誘導物質エネルギー源に接触すると誘導性ヘテロ二量体の第1及び第2の半体が一体になり、
誘導性ヘテロ二量体の第1及び第2の半体が一体になると、第1及び第2のCpf1融合構築物が機能性Cpf1 CRISPR-Cas系を構成することが可能となり、
Cpf1 CRISPR-Cas系が、細胞の目的のゲノム遺伝子座にある標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドRNA(gRNA)を含み、及び
機能性Cpf1 CRISPR-Cas系が標的配列に結合し、及び任意選択で、ゲノム遺伝子座を編集して遺伝子発現を変化させる。これらのエレメントは、好ましくは単一の構築物、例えば発現カセットに提供される。
細胞内のゲノムにおける遺伝子の全てのコピーが編集された後は、それ以上当該細胞においてCRISRP/Cpf1発現が続行する必要はない。実際、発現が持続すれば、意図しないゲノム部位でオフターゲット効果が起こる場合等、望ましくないこともある。従って時限的発現が有用となり得る。誘導性発現は一つの手法を提供するが、更に本出願人らは、CRISPRベクターそれ自体の中の非コードガイド標的配列の使用に頼る自己不活性化CRISPR-Cpf1系を想定する。従って、発現開始後、CRISPR系はそれ自体の破壊をもたらし得るが、しかし破壊が完了する前に、標的遺伝子のゲノムコピーを編集する時間があり得る(二倍体細胞における通常の点突然変異では、これに必要となるのは高々2つの編集である)。単純に、自己不活性化CRISPR-Cas系は、CRISPR酵素それ自体のコード配列を標的化するか、又は以下の1つ以上に存在するユニーク配列に相補的な1つ以上の非コードガイド標的配列を標的化する追加的なRNA(即ち、ガイドRNA)を含む:
(a)非コードRNAエレメントの発現を駆動するプロモーター内、
(b)Cpf1遺伝子の発現を駆動するプロモーター内、
(c)Cpf1コード配列におけるATG翻訳開始コドンから100bp以内、
(d)例えばAAVゲノムにおける、ウイルス送達ベクターの逆方向末端反復配列(iTR)内。
二本鎖切断点又は鎖のうちの一方における一本鎖切断点は、有利には、修正が起こるように標的位置に十分に近くなければならない。ある実施形態において、その距離は50、100、200、300、350又は400ヌクレオチド以下である。理論によって拘束されることを望むものではないが、切断点が標的位置に十分に近く、末端リセクションの間にエキソヌクレアーゼの媒介による除去を受ける領域内に切断点がなければならないと考えられる。鋳型核酸配列は末端リセクション領域内の配列の修正にのみ用いられ得るため、標的位置と切断点との間の距離が大き過ぎる場合、末端リセクションに突然変異が含まれないことになり得るとともに、ひいては修正されないことになり得る。
特定の実施形態では、ヌクレアーゼ誘導性非相同末端結合(NHEJ)を用いて遺伝子特異的ノックアウトを標的化することができる。ヌクレアーゼ誘導性NHEJはまた、目的の遺伝子内の配列の除去(例えば欠失)にも用いることができる。概して、NHEJは、DNA内の二本鎖切断をその両端を一体につなぎ合わせることによって修復する;しかしながら、概して、元の配列が復元されるのは、それらが二本鎖切断によって形成された当初と厳密に同じとおりの2つの適合末端が完全にライゲートされた場合に限られる。二本鎖切断点のDNA末端は多くの場合に酵素的プロセシングを受けるため、それらの末端がつなぎ直される前に、一方又は両方の鎖にヌクレオチドの付加又は除去が生じる。これにより、NHEJ修復部位のDNA配列に挿入及び/又は欠失(インデル)突然変異が存在することになる。これらの突然変異の3分の2が、典型的にはリーディングフレームを変化させ、ひいては非機能性タンパク質を作り出す。加えて、リーディングフレームを維持しているものの、多くの配列を挿入し又は欠失させる突然変異は、タンパク質の機能性を破壊し得る。重要な機能ドメインにおける突然変異は、タンパク質の重要でない領域における突然変異よりも許容性が低いと見込まれるため、これは遺伝子座依存的である。NHEJによって生成されるインデル突然変異は本質的に予測不可能である;しかしながら、恐らくは小さいマイクロホモロジー領域に起因して、所与の切断部位で特定のインデル配列が選好され、集団内で大きな比率を占める。欠失の長さは大きく異なり得る;最も一般的には1~50bpの範囲内であるが、優に50bpを超えることもあり、例えば、優に約100~200bpを超えるまでに至ることもある。挿入はより短い傾向があり、切断部位を直接取り囲む配列の短い重複を含むことが多い。しかしながら、大きい挿入を得ることが可能であり、その場合、挿入された配列は、ゲノムの他の領域又は細胞内に存在するプラスミドDNAにまで到達していることが多い。
遺伝子をDNAレベルで突然変異させることにより発現を永久的に消失させるCRISPR-Cas媒介性遺伝子ノックアウトと異なり、CRISPR-Casノックダウンは人工転写因子を用いて遺伝子発現を一時的に低下させることが可能である。FnCpf1タンパク質など、Cpf1タンパク質の両方のDNA切断ドメインにある鍵となる残基を突然変異させると(例えばFnCpf1タンパク質のD917A及びH1006A突然変異又はAsCpf1タンパク質によるD908A、E993A、D1263A又はLbCpf1タンパク質によるD832A、E925A、D947A又はD1180A)、触媒的に不活性なCpf1が生成される。触媒的に不活性なCpf1はガイドRNAと複合体を形成し、当該のガイドRNAのターゲティングドメインによって特定されるDNA配列に局在化するが、しかしながら、これは標的DNAを切断しない。FnCpf1タンパク質(例えばD917A及びH1006A突然変異)など、不活性Cpf1タンパク質をエフェクタードメイン、例えば転写抑制ドメインと融合させると、ガイドRNAによって特定される任意のDNA部位へとそのエフェクターをリクルートすることが可能になる。特定の実施形態において、Cpf1を転写抑制ドメインに融合させて遺伝子のプロモーター領域にリクルートしてもよい。特に遺伝子抑制について、本明細書では、内因性転写因子の結合部位を遮断すれば、遺伝子発現を下方制御する助けとなり得ることが企図される。別の実施形態において、不活性Cpf1をクロマチン修飾タンパク質と融合させてもよい。クロマチン状態が変化すると、標的遺伝子の発現の低下が起こり得る。
本開示及び当該技術分野における知識から、CRISPR-Cas系、特に本明細書に記載される新規CRISPR系、又はその構成成分又はその核酸分子(例えばHDR鋳型を含む)又はその構成成分をコードし又は提供する核酸分子は、本明細書に概略的にも詳細にも記載される送達系によって送達し得る。
インビボでのゲノム改変を媒介するため、本発明のCpf1をコードする核酸分子、例えばDNAをベクター、例えばウイルスベクターにパッケージングする方法としては、以下が挙げられる:
・NHEJ媒介遺伝子ノックアウトを達成するため:
・シングルウイルスベクター:
・2つ以上の発現カセットを含むベクター:
・プロモーター-Cpf1コード核酸分子-ターミネーター
・プロモーター-gRNA1-ターミネーター
・プロモーター-gRNA2-ターミネーター
・プロモーター-gRNA(N)-ターミネーター(ベクターのサイズ限界まで)
・ダブルウイルスベクター:
・Cpf1の発現をドライブするための1つの発現カセットを含むベクター1
・プロモーター-Cpf1コード核酸分子-ターミネーター
・1つ以上のガイドRNAの発現をドライブするためのもう1つの発現カセットを含むベクター2
・プロモーター-gRNA1-ターミネーター
・プロモーター-gRNA(N)-ターミネーター(ベクターのサイズ限界まで)
・相同依存性修復を媒介するため。
・上記に記載されるシングル及びダブルウイルスベクター手法に加えて、相同依存性修復鋳型の送達のため更なるベクターを使用することができる。
-AAV ITRはプロモーターとして役立ち得る:これは、追加のプロモーターエレメント(ベクター内で場所をとり得る)の必要性がなくなる点で有利である。空いた追加の空間を使用して、追加のエレメント(gRNAなど)の発現をドライブすることができる。また、ITR活性は比較的弱いため、Cpf1の過剰発現による潜在的な毒性を軽減するために使用することができる。
-偏在発現には、使用し得るプロモーターとしては、CMV、CAG、CBh、PGK、SV40、フェリチン重鎖又は軽鎖等が挙げられる。
-U6又はH1などのPol IIIプロモーター
-gRNAを発現させるためのPol IIプロモーター及びイントロンカセットの使用。
Cpf1及び1つ以上のガイドRNAは、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レンチウイルス、アデノウイルス又は他のプラスミド又はウイルスベクタータイプを使用して、詳細には、例えば、米国特許第8,454,972号明細書(アデノウイルス用の製剤、用量)、同第8,404,658号明細書(AAV用の製剤、用量)及び同第5,846,946号明細書(DNAプラスミド用の製剤、用量)並びにレンチウイルス、AAV及びアデノウイルスが関わる臨床試験及びそのような臨床試験に関する刊行物からの製剤及び用量を用いて送達することができる。例えば、AAVについて、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第8,454,972号明細書及びAAVが関わる臨床試験にあるとおりであってもよい。アデノウイルスについては、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第8,404,658号明細書及びアデノウイルスが関わる臨床試験にあるとおりであってもよい。プラスミド送達については、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第5,846,946号明細書及びプラスミドが関わる臨床試験にあるとおりであってもよい。用量は、平均70kgの個体(例えば男性成人ヒト)に基づくか、又はそれに当てはめてもよく、異なる体重及び種の患者、対象、哺乳動物用に調整することができる。投与頻度は、患者又は対象の年齢、性別、全般的な健康、他の条件並びに対処される特定の状態又は症状を含めた通常の要因に応じて、医学又は獣医学実務者(例えば、医師、獣医師)の範囲内である。ウイルスベクターは、目的の組織に注射することができる。細胞型特異的ゲノム改変について、Cpf1の発現は細胞型特異的プロモーターによってドライブすることができる。例えば、肝臓特異的発現にはアルブミンプロモーターが用いられてもよく、及びニューロン特異的発現には(例えばCNS障害を標的化するため)シナプシンIプロモーターが用いられてもよい。
低毒性(これは、免疫応答を活性化させ得る細胞粒子の超遠心が不要な精製方法に起因し得る)及び
宿主ゲノムに組み込まれないため、挿入突然変異誘発を引き起こす確率の低さ。
レンチウイルスは、有糸分裂細胞及び分裂終了細胞の両方でその遺伝子の感染能及び発現能を有する複合的レトロウイルスである。最も一般的には、公知のレンチウイルスはヒト免疫不全ウイルス(HIV)であり、これは他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を用いて広範囲の細胞型を標的化する。
RNA送達:CRISPR酵素、例えばCpf1、及び/又は本RNAのいずれか、例えばガイドRNAはまた、RNAの形態で送達することもできる。Cpf1 mRNAはインビトロ転写を用いて作成することができる。例えば、Cpf1 mRNAは、以下のエレメント:βグロビン-ポリAテール(120以上の一連のアデニン)由来のT7_プロモーター-コザック配列(GCCACC)-Cpf1-3’UTRを含有するPCRカセットを用いて合成することができる。このカセットは、T7ポリメラーゼによる転写に使用することができる。ガイドRNAはまた、T7_プロモーター-GG-ガイドRNA配列を含有するカセットからのインビトロ転写を用いて転写することもできる。
幾つかのタイプの粒子送達系及び/又は製剤が、多様な生物医学的適用において有用であることが知られている。一般に、粒子は、その輸送及び特性の点で一単位として挙動する小さい物体として定義される。粒子は、更に直径に基づき分類される。粗粒子は2,500~10,000ナノメートルの範囲を包含する。微粒子は100~2,500ナノメートルのサイズを有する。超微粒子、又はナノ粒子は、概して1~100ナノメートルのサイズである。100nm限度の基準は、粒子をバルク材料と区別する新規特性が典型的には100nm未満の臨界長さスケールで生じるという事実である。
適切な場合、本明細書における粒子又はナノ粒子への言及は同義的であり得ることが理解されるであろう。CRISPR酵素mRNA及びガイドRNAは、粒子又は脂質エンベロープを使用して同時に送達し得る;例えば、本発明のCRISPR酵素及びRNA(例えば複合体としての)は、7C1など、Dahlman et al.,国際公開第2015089419 A2号パンフレット及びその引用文献にあるとおりの粒子によって送達することができ(例えば、James E.Dahlman and Carmen Barnes et al.Nature Nanotechnology(2014)published online 11 May 2014,doi:10.1038/nnano.2014.84を参照)、例えば、送達粒子は脂質又はリピドイド及び親水性ポリマー、例えばカチオン性脂質及び親水性ポリマーを含み、例えばカチオン性脂質には、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)又は1,2-ジテトラデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)が含まれ、及び/又は親水性ポリマーには、エチレングリコール又はポリエチレングリコール(PEG)が含まれ;及び/又は粒子は、コレステロール(例えば、製剤1=DOTAP 100、DMPC 0、PEG 0、コレステロール 0;製剤番号2=DOTAP 90、DMPC 0、PEG 10、コレステロール 0;製剤番号3=DOTAP 90、DMPC 0、PEG 5、コレステロール 5からの粒子)を更に含み、粒子は効率的な多段階プロセスを用いて形成され、ここでは初めに、エフェクタータンパク質及びRNAを、例えば1:1モル比で、例えば室温で、例えば30分間、例えば無菌ヌクレアーゼフリー1×PBS中において共に混合し;及びそれとは別に、製剤に適用し得るとおりDOTAP、DMPC、PEG、及びコレステロールをアルコール、例えば100%エタノール中に溶解し;及び、これらの2つの溶液を共に混合して、複合体を含有する粒子を形成する)。
エキソソームは、RNA及びタンパク質を輸送する内因性のナノ小胞であり、これはRNAを脳及び他の標的器官に送達することができる。免疫原性を低下させるため、Alvarez-Erviti et al.(2011,Nat Biotechnol 29:341)はエキソソーム産生に自己由来の樹状細胞を使用した。ニューロン特異的RVGペプチドに融合したエキソソーム膜タンパク質Lamp2bを発現するように樹状細胞をエンジニアリングすることにより、脳への標的化が達成された。精製エキソソームに電気穿孔によって外因性RNAが負荷された。静脈内注射されるRVG標的化エキソソームが、GAPDH siRNAを脳内のニューロン、ミクログリア、オリゴデンドロサイトに特異的に送達し、特異的遺伝子ノックダウンが得られた。RVGエキソソームに予め曝露してもノックダウンは減弱しなかったとともに、他の組織における非特異的取込みは観察されなかった。アルツハイマー病の治療標的であるBACE1の強力なmRNA(60%)及びタンパク質(62%)ノックダウンによって、エキソソーム媒介siRNA送達の治療可能性が実証された。
本発明に係る送達又は投与は、リポソームで実施することができる。リポソームは、内部の水性区画を取り囲む単層又は多重膜脂質二重層及び比較的不透過性の外側の親油性リン脂質二重層からなる球形の小胞構造である。リポソームは、生体適合性であり、非毒性であり、親水性及び親油性の両方の薬物分子を送達することができ、そのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、且つ生体膜及び血液脳関門(BBB)を越えてそのロードを輸送するため、薬物送達担体として大いに注目を集めてきた(例えば、レビューについては、Spuch and Navarro,Journal of Drug Delivery,vol.2011,Article ID 469679,12 pages,2011.doi:10.1155/2011/469679を参照のこと)。
アミノ脂質2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)などの他のカチオン性脂質を利用して、例えばSiRNAと同様に、CRISPR Cas又はその構成成分又はそれをコードする1つ又は複数の核酸分子を封入してもよく(例えば、Jayaraman,Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,8529-8533を参照)、従って本発明の実施に用い得る。以下の脂質組成を有する予め形成された小胞が企図され得る:アミノ脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、コレステロール及び(R)-2,3-ビス(オクタデシルオキシ)プロピル-1-(メトキシポリ(エチレングリコール)2000)プロピルカルバメート(PEG-脂質)、それぞれモル比40/10/40/10、及び約0.05(w/w)のFVII siRNA/総脂質比。70~90nmの範囲の狭い粒径分布及び0.11±0.04の低い多分散性指数(n=56)が確実となるように、粒子を最大3回まで80nm膜で押し出し、その後ガイドRNAに加えた。極めて強力なアミノ脂質16を含有する粒子を使用してもよく、ここで4つの脂質構成成分16、DSPC、コレステロール及びPEG-脂質のモル比(50/10/38.5/1.5)はインビボ活性を増強させるため更に最適化され得る。
超荷電タンパク質は、異常に高い理論上の正味正電荷又は負電荷を有するエンジニアリングされた又は天然に存在するタンパク質の一クラスであり、1つ又は複数のCRISPR Cas系又はその1つ又は複数の構成成分又はそれをコードする1つ又は複数の核酸分子の送達に用いられ得る。超負電荷及び超正電荷の両方のタンパク質とも、熱的又は化学的に誘導される凝集に耐える著しい能力を呈する。超正電荷タンパク質はまた、哺乳類細胞に侵入することも可能である。プラスミドDNA、RNA、又は他のタンパク質など、これらのタンパク質と関連付けるカーゴが、インビトロ及びインビボの両方でこれらの巨大分子を哺乳類細胞に機能的に送達することを可能にし得る。David Liuの研究室は、2007年に超荷電タンパク質の作成及び特徴付けを報告した(Lawrence et al.,2007,Journal of the American Chemical Society 129,10110-10112)。
更に別の実施形態において、CRISPR Cas系の送達に細胞透過性ペプチド(CPP)が企図される。CPPは、(ナノサイズ粒子から化学的小分子及び大型DNA断片に至るまでの)様々な分子カーゴの細胞取込みを促進する短鎖ペプチドである。用語「カーゴ」は、本明細書で使用されるとき、限定はされないが、治療剤、診断プローブ、ペプチド、核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミド、タンパク質、ナノ粒子を含めた粒子、リポソーム、発色団、小分子及び放射性物質からなる群を含む。本発明の態様では、カーゴにはまた、CRISPR Cas系の任意の構成成分又は機能性CRISPR Cas系全体も含まれ得る。本発明の態様は、所望のカーゴを対象に送達する方法を更に提供し、この方法は、(a)本発明の細胞透過性ペプチドと所望のカーゴとを含む複合体を調製するステップ、及び(b)複合体を対象に経口的に、関節内に、腹腔内に、くも膜下腔内に、動脈内に(intrarterially)、鼻腔内に、実質内に、皮下に、筋肉内に、静脈内に、経皮的に、直腸内に、又は局所的に投与するステップを含む。カーゴは、共有結合を介した化学的連結によるか、又は非共有結合性の相互作用によるかのいずれかでペプチドと会合している。
別の実施形態において、植込み型デバイスもまた、CRISPR Cas系又はその1つ又は複数の構成成分又はそれをコードする1つ又は複数の核酸分子の送達に企図される。例えば、米国特許出願公開第20110195123号明細書は、薬物を局所的に長時間溶出する植込み型医療器具を、幾つかのタイプのかかるデバイス、治療の実施態様及び植え込み方法を含めて開示しており、それが提供される。デバイスは、例えばデバイス本体として用いられるマトリックスなどのポリマー基質、及び薬物、及び場合によっては金属又は更なるポリマーなどの追加的な足場材料、及び可視性及びイメージングを増強する材料を含む。植込み型送達デバイスは局所的な長期間にわたる放出を提供するのに有利であってよく、ここで薬物は、腫瘍、炎症、変性などの罹患範囲の細胞外マトリックス(ECM)に直接又は症候性の対象のため、又は損傷した平滑筋細胞に、又は予防のため放出される。薬物の一種は上記に開示されるとおりRNAであり、このシステムは本発明のCRISPR Cas系に使用及び/又は応用することができる。一部の実施形態において植え込み方法は、小線源照射療法及び針生検を含め、現在他の治療向けに開発及び使用されている既存の植え込み手技である。そのような場合、この発明に記載される新規インプラントの寸法は、元のインプラントと同様である。典型的には、同じ治療手技中に数個のデバイスが植え込まれる。
DNA、例えばトリヌクレオチドリピートを標的とする核酸ターゲティング系を使用して、かかるリピートの存在に関して患者又は患者の試料をスクリーニングすることができる。このリピートは核酸ターゲティング系のRNAの標的であることができ、その核酸ターゲティング系によるこのリピートへの結合がある場合、当該の結合を検出して、それによりかかるリピートの存在を示すことができる。従って、核酸ターゲティング系を使用して、リピートの存在に関して患者又は患者試料をスクリーニングすることができる。次に、患者に好適な1つ又は複数の化合物を投与して状態に対応し得る;又は、核酸ターゲティング系を投与して結合させ、挿入、欠失、又は突然変異を生じさせて、状態を緩和し得る。
CRISPR酵素mRNA及びガイドRNAはまた、別々に送達されてもよい。CRISPR酵素に発現する時間を与えるため、CRISPR酵素mRNAをガイドRNAより先に送達してもよい。CRISPR酵素mRNAはガイドRNA投与の1~12時間前(好ましくは約2~6時間前)に投与されてもよい。
一部の実施形態では、CRISPR酵素は誘導性系の一成分を形成し得る。この系の誘導可能な性質により、エネルギーの形態を用いた遺伝子編集又は遺伝子発現の時空間的制御が可能となり得る。エネルギーの形態としては、限定はされないが、電磁放射線、音響エネルギー、化学エネルギー及び熱エネルギーを挙げることができる。誘導性系の例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター(Tet-On又はTet-Off)、小分子2ハイブリッド転写活性化システム(FKBP、ABA等)、又は光誘導性系(フィトクロム、LOVドメイン、又はクリプトクロム)が含まれる。一実施形態において、CRISPR酵素は、配列特異的に転写活性の変化を導く光誘導性転写エフェクター(LITE)の一部であり得る。光の構成成分には、CRISPR酵素、光応答性シトクロムヘテロ二量体(例えばシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来)、及び転写活性化/抑制ドメインが含まれ得る。誘導性DNA結合タンパク質及びその使用方法の更なる例は、米国仮特許出願第61/736,465号明細書及び米国仮特許出願第61/721,283号明細書、及び国際公開第2014/018423 A2号パンフレット(本明細書によって全体として参照により援用される)に提供される。
細胞内のゲノムにおける遺伝子の全てのコピーが編集された後は、それ以上当該細胞においてCRISRP/Cpf1p発現が続行する必要はない。実際、発現が持続すれば、意図しないゲノム部位でオフターゲット効果が起こる場合等、望ましくないこともある。従って時限的発現が有用となり得る。誘導性発現は一つの手法を提供するが、更に本出願人らは、CRISPRベクターそれ自体の中の非コードガイド標的配列の使用に頼る自己不活性化CRISPR系をエンジニアリングしている。従って、発現開始後、CRISPR-Cas系はそれ自体の破壊をもたらし得るが、しかし破壊が完了する前に、標的遺伝子のゲノムコピーを編集する時間があり得る(二倍体細胞における通常の点突然変異では、これに必要となるのは高々2つの編集である)。単純に、自己不活性化CRISPR-Cas系は、CRISPR酵素それ自体のコード配列を標的化するか、又は以下の1つ以上に存在するユニーク配列に相補的な1つ以上の非コードガイド標的配列を標的化する追加的なRNA(即ち、ガイドRNA)を含む:
(a)非コードRNAエレメントの発現を駆動するプロモーター内、
(b)Cpf1エフェクタータンパク質遺伝子の発現を駆動するプロモーター内、
(c)Cpf1エフェクタータンパク質コード配列におけるATG翻訳開始コドンから100bp以内、
(d)例えばAAVゲノムにおける、ウイルス送達ベクターの逆方向末端反復配列(iTR)内。
本発明者らは、本明細書に定義するとおりのCRISPR酵素が活性を失うことなく2つ以上のRNAガイドを用い得ることを示している。これにより、本明細書に定義するとおりの単一の酵素、系又は複合体で、複数のDNA標的、遺伝子又は遺伝子座のターゲティングに本明細書に定義するとおりのCRISPR酵素、系又は複合体を使用することが可能となる。ガイドRNAはタンデムに配置されてもよく、任意選択で本明細書に定義するとおりのダイレクトリピートなどのヌクレオチド配列によって分離されていてもよい。これらの異なるガイドRNAの位置はタンデムであり、活性に影響を及ぼさない。用語「CRISPR-Cas系」、「CRISP-Cas複合体」「CRISPR複合体」及び「CRISPR系」は同義的に使用されることが注記される。また、用語「CRISPR酵素」、「Cas酵素」、又は「CRISPR-Cas酵素」も同義的に使用することができる。好ましい実施形態において、前記CRISPR酵素、CRISP-Cas酵素又はCas酵素はCpf1であり、又は本明細書の他の部分に記載される改変した又は突然変異させたその変異体のいずれか一つである。
I.2つ以上のCRISPR-Cas系ポリヌクレオチド配列であって、
(a)ポリヌクレオチド遺伝子座の第1の標的配列にハイブリダイズ可能な第1のガイド配列、
(b)ポリヌクレオチド遺伝子座の第2の標的配列にハイブリダイズ可能な第2のガイド配列、
(c)ダイレクトリピート配列、
を含むポリヌクレオチド配列、及び
II.Cpf1酵素又はそれをコードする第2のポリヌクレオチド配列
を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物が提供され、
第1及び第2のガイド配列は、転写されると、それぞれ第1及び第2の標的配列への第1及び第2のCpf1 CRISPR複合体の配列特異的結合を導き、
第1のCRISPR複合体は、第1の標的配列にハイブリダイズ可能な第1のガイド配列と複合体を形成したCpf1酵素を含み、
第2のCRISPR複合体は、第2の標的配列にハイブリダイズ可能な第2のガイド配列と複合体を形成したCpf1酵素を含み、
第1のガイド配列が第1の標的配列近傍におけるDNA二重鎖の一方の鎖の切断を導き、且つ第2のガイド配列が第2の標的配列近傍における他方の鎖の切断を導いて二本鎖切断が誘導され、それにより生物又は非ヒト若しくは非動物生物が改変される。同様に、例えば各々が1つの標的に特異的な、且つ本明細書に記載されるとおりの組成物又はCRISPR系又は複合体においてタンデムに配置された2つより多いガイドRNAを含む組成物を想定することができる。
一態様において、本発明は、上記の方法及び組成物に開示されるエレメントの任意の1つ以上を含むキットを提供する。一部の実施形態において、本キットは、本明細書に教示されるとおりのベクター系とキットの使用説明書とを含む。要素は個々に又は組み合わせで提供されてもよく、及び任意の好適な容器、例えば、バイアル、ボトル、又はチューブに提供されてもよい。本キットは、本明細書に記載されるとおりのgRNA及び未結合の保護鎖を含み得る。本キットは、保護鎖がガイド配列に少なくとも部分的に結合したgRNA(即ちpgRNA)を含み得る。従って本キットは、本明細書に記載されるとおりの部分的に二本鎖ヌクレオチド配列の形態のpgRNAを含み得る。一部の実施形態において、本キットは1つ以上の言語、例えば2つ以上の言語による説明書を含む。取扱説明書は本明細書に記載される適用及び方法に特異的であってもよい。
本発明は、標的細胞をインビボ、エキソビボ又はインビトロで改変するのに用いられる、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、又は前記組成物の構成成分をコードする1つ以上のポリヌクレオチド、又は前記組成物の構成成分をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター又は送達系を提供し、及び、改変後はCRISPRにより改変された細胞の子孫又は細胞株が変化した表現型を保持するように細胞を変化させる方法で行われ得る。改変された細胞及び子孫は、CRISPR系が所望の細胞型にエキソビボ又はインビボ適用された植物又は動物などの多細胞生物の一部であり得る。本CRISPR発明は、療法的治療方法であり得る。療法的治療方法には、遺伝子又はゲノム編集、又は遺伝子療法が含まれ得る。
一態様において、本発明は、本明細書に記載される触媒的に不活性なCasタンパク質、好ましくは不活性Cpf1(dCpf1)を含むエンジニアリングされた天然に存在しないCRISPR-Cas系、及び蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)などの検出方法におけるこの系の使用を提供する。DNA二本鎖切断を生じさせる能力を欠くdCpf1を高感度緑色蛍光タンパク質(eEGFP)などの蛍光タンパク質などのマーカーと融合させて、小さいガイドRNAと共発現させることにより、インビボで挟動原体、動原体及びテロメアリピートを標的化し得る。dCpf1系を使用してヒトゲノムの反復配列及び個々の遺伝子の両方を可視化することができる。標識されたdCpf1 CRISPR-cas系のかかる新規適用は、細胞のイメージング及び機能的核構造の研究において、特に核内低分子容積又は複合体三次元構造を含む場合に重要であり得る(Chen B,Gilbert LA,Cimini BA,Schnitzbauer J,Zhang W,Li GW,Park J,Blackburn EH,Weissman JS,Qi LS,Huang B.2013.「最適化CRISPR/Cas系によるヒト生細胞のゲノム遺伝子座の動的イメージング(Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system)」.Cell 155(7):1479-91.doi:10.1016/j.cell.2013.12.001)。
一態様において、本発明は、真核細胞内の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供し、これはインビボ、エキソビボ又はインビトロであってもよい。一部の実施形態において、本方法は、ヒト又は非ヒト動物から細胞又は細胞集団を試料採取するステップ、及び1つ又は複数の細胞を改変するステップを含む。培養は任意の段階でエキソビボで行われ得る。この1つ又は複数の細胞が、更には非ヒト動物又は植物に再導入されてもよい。再導入される細胞について、細胞は幹細胞であることが特に好ましい。
本発明は核酸を使用して標的DNA配列を結合する。核酸はタンパク質と比べて作製するのがはるかに容易で安価であり、且つ相同性が求められるストレッチの長さに応じて特異性を変化させることができるため、これは有利である。例えば、複数のフィンガーを複雑に三次元配置させる必要はない。用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、及び「オリゴヌクレオチド」は同義的に使用される。これらの用語は、デオキシリボヌクレオチドであれ又はリボヌクレオチドであれ、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド、又はその類似体を指す。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有することができ、既知又は未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である:遺伝子又は遺伝子断片のコード領域又は非コード領域、連鎖解析によって定義される複数の遺伝子座(1つの遺伝子座)、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、低分子干渉RNA(siRNA)、低分子ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ、及びプライマー。この用語はまた、合成骨格を有する核酸様構造も包含し、例えば、Eckstein,1991;Baserga et al.,1992;Milligan,1993;国際公開第97/03211号パンフレット;国際公開第96/39154号パンフレット;Mata,1997;Strauss-Soukup,1997;及びSamstag,1996を参照のこと。ポリヌクレオチドは、1つ以上の改変ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の改変はポリマーをアセンブルする前又はその後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド構成成分で中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、重合後に、標識構成成分とのコンジュゲーションによるなどして更に改変されてもよい。本明細書で使用されるとき、用語「野生型」は、当業者によって理解される当該技術分野の用語であり、突然変異体又は変異体形態とは区別されるものとして天然に存在するとおりの、典型的な形態の生物、菌株、遺伝子、又は特徴を意味する。「野生型」はベースラインであり得る。本明細書で使用されるとき、用語「変異体」は、天然に存在するものから逸脱したパターンを有する質の呈示を意味するものと解釈されなければならない。用語「天然に存在しない」又は「エンジニアリングされた」は同義的に使用され、人間の手が加えられていることを示す。この用語は、核酸分子又はポリペプチドに言及するとき、核酸分子又はポリペプチドが、自然中ではそれと天然に結び付いている、且つ自然中に見られるとおりの少なくとも1つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する「相補性」は、従来のワトソン・クリック塩基対合又は他の非従来型の対合のいずれかによって核酸が別の核酸配列と1つ又は複数の水素結合を形成する能力を指す。「相補性」は、従来のワトソン・クリック塩基対合又は他の非従来型のいずれかによって核酸が別の核酸配列と1つ又は複数の水素結合を形成する能力を指す。パーセント相補性は、核酸分子中で第2の核酸配列と水素結合を形成(例えばワトソン・クリック塩基対合)することのできる残基のパーセンテージを示す(例えば、10個のうち5、6、7、8、9、10個は、それぞれ、50%、60%、70%、80%、90%、100%の相補性である)。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が第2の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補的」は、本明細書で使用されるとき、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50ヌクレオチド、又はそれ以上の領域にわたって少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%である相補性の程度を指し、又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする2つの核酸を指す。本明細書で使用されるとき、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件」とは、標的配列と相補性を有する核酸が標的配列に優先的にハイブリダイズし、且つ非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は概して配列依存性であり、幾つもの要因に応じて異なる。一般に、配列が長いほど、配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度が高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例が、Tijssen(1993),Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I,Second Chapter “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay”,Elsevier,N.Y.に詳述されている。ポリヌクレオチド配列に言及する場合、相補配列又は部分的相補配列も想定される。これらは、好ましくは、高度にストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズ可能なものである。概して、ハイブリダイゼーション速度を最大にするには、比較的低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件(熱融点(Tm)より約20~25℃低い)が選択される。Tmは、特定の標的配列の50%が規定のイオン強度及びpHの溶液中で完全に相補的なプローブにハイブリダイズする温度である。概して、ハイブリダイズした配列の少なくとも約85%のヌクレオチド相補性を要求する場合、Tmより約5~15℃低くなるよう高度にストリンジェントな洗浄条件が選択される。ハイブリダイズした配列の少なくとも約70%のヌクレオチド相補性を要求する場合、Tmより約15~30℃低くなるよう中程度にストリンジェントな洗浄条件が選択される。高度に許容的な(極めて低いストリンジェンシーの)洗浄条件はTmより50℃も低いものであってよく、ハイブリダイズした配列間に高レベルのミスマッチが許容される。当業者は、ハイブリダイゼーション段階及び洗浄段階における他の物理的及び化学的パラメーターもまた、標的配列とプローブ配列との間の特定の相同性レベルからの検出可能なハイブリダイゼーションシグナルの結果に影響を与えるよう変更し得ることを認識するであろう。好ましい高度にストリンジェントな条件は、50%ホルムアミド、5×SSC、及び1% SDS中42℃でのインキュベーション、又は5×SSC及び1% SDS中65℃でのインキュベーションと、0.2×SSC及び0.1% SDS中65℃での洗浄を含む。「ハイブリダイゼーション」とは、1つ以上のポリヌクレオチドが反応することによりヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定した複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対合、フーグステイン(Hoogstein)結合によるか、又は任意の他の配列特異的様式で起こり得る。複合体には、二重鎖構造を形成する2本の鎖、多重鎖複合体を形成する3本以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、又はこれらの任意の組み合わせが含まれ得る。ハイブリダイゼーション反応は、PCRの開始、又は酵素によるポリヌクレオチドの切断など、より大規模なプロセスで一ステップを構成し得る。所与の配列とハイブリダイズ可能な配列は、その所与の配列の「相補体」と称される。本明細書で使用されるとき、用語「ゲノム遺伝子座(genomic locus)」又は「遺伝子座(locus)」(複数形loci)は、染色体上の遺伝子又はDNA配列の特定の位置である。「遺伝子」は、ポリペプチドをコードする一続きのDNA若しくはRNA、又は生物において機能的役割を果たし、従って生体における分子的遺伝単位であるRNA鎖を指す。本発明の目的上、遺伝子は、遺伝子産物の産生を調節する領域を含むと(かかる調節配列がコード配列及び/又は転写配列に隣接しているか否かに関わらず)見なし得る。従って、遺伝子には、必ずしも限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位及び配列内リボソーム進入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位及び遺伝子座制御領域が含まれる。本明細書で使用されるとき、「ゲノム遺伝子座の発現」又は「遺伝子発現」は、機能的遺伝子産物の合成に遺伝子からの情報が用いられる過程である。遺伝子発現の産物は、多くの場合にタンパク質であるが、rRNA遺伝子又はtRNA遺伝子などの非タンパク質コード遺伝子では、産物は機能性RNAである。遺伝子発現の過程は、あらゆる既知の生命-真核生物(多細胞生物を含む)、原核生物(細菌及び古細菌)、及びウイルスによって生存のための機能性産物の産生に用いられている。本明細書で使用されるとき、遺伝子又は核酸の「発現」には、細胞遺伝子発現のみならず、クローニング系及び任意の他のコンテクストにおける1つ又は複数の核酸の転写及び翻訳もまた包含される。本明細書で使用されるとき、「発現」はまた、ポリヌクレオチドがDNA鋳型から(mRNA又は他のRNA転写物などに)転写される過程及び/又は転写されたmRNAが続いてペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳される過程も指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、まとめて「遺伝子産物」と称される。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合、発現には真核細胞におけるmRNAのスプライシングが含まれ得る。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指して同義的に使用される。ポリマーは線状又は分枝状であってよく、それは修飾アミノ酸を含んでもよく、及びそれは非アミノ酸が割り込んでいてもよい。これらの用語はまた、改変されているアミノ酸ポリマー(例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又はその他任意の、標識成分とのコンジュゲーションなどの操作)も包含する。本明細書で使用されるとき、用語「アミノ酸」には、グリシン及びD又はLの両方の光学異性体、及びアミノ酸類似体及びペプチド模倣体を含め、天然及び/又は非天然又は合成のアミノ酸が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「ドメイン」又は「タンパク質ドメイン」は、タンパク質配列のうち残りのタンパク質鎖と独立に存在し及び機能し得る一部分を指す。本発明の態様に記載されるとおり、配列同一性は配列相同性と関係する。相同性比較は目測で行われてもよく、又はより通例では、容易に利用可能な配列比較プログラムの助けを借りて行われてもよい。これらの市販のコンピュータプログラムは、2つ以上の配列間のパーセント(%)相同性を計算することができ、また2つ以上のアミノ酸配列又は核酸配列が共有する配列同一性も計算することができる。
一部の態様において、本発明は、1つ以上のポリヌクレオチド、例えば、又は本明細書に記載されるとおりの1つ以上のベクター、その1つ以上の転写物、及び/又はそれから転写されるもの又はタンパク質を、宿主細胞に送達するステップを含む方法を提供する。一部の態様において、本発明は、かかる方法によって作製される細胞、及びかかる細胞を含むか、又はそれから作製される生物(動物、植物、又は真菌類など)を更に提供する。一部の実施形態では、ガイドRNAと組み合わせた(及び任意選択でそれと複合体を形成した)核酸ターゲティングエフェクタータンパク質が細胞に送達される。哺乳類細胞又は標的組織における核酸の導入には、従来のウイルスベース及び非ウイルスベースの遺伝子導入方法を用いることができる。かかる方法を用いて、核酸ターゲティング系の構成成分をコードする核酸を培養下の細胞に、又は宿主生物中の細胞に投与することができる。非ウイルスベクター送達系には、DNAプラスミド、RNA(例えば本明細書に記載されるベクターの転写物)、ネイキッド核酸、及び送達ビヒクルと複合体を形成した核酸、例えばリポソームが含まれる。ウイルスベクター送達系にはDNA及びRNAウイルスが含まれ、これは細胞への送達後にエピソームゲノム又は組込みゲノムのいずれかを有する。遺伝子療法手順のレビューに関しては、Anderson,Science 256:808-813(1992);Nabel & Felgner,TIBTECH 11:211-217(1993);Mitani & Caskey,TIBTECH 11:162-166(1993);Dillon,TIBTECH 11:167-175(1993);Miller,Nature 357:455-460(1992);Van Brunt,Biotechnology 6(10):1149-1154(1988);Vigne,Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36(1995);Kremer & Perricaudet,British Medical Bulletin 51(1):31-44(1995);Haddada et al.,in Current Topics in Microbiology and Immunology,Doerfler and Boehm(eds)(1995);及びYu et al.,Gene Therapy 1:13-26(1994)を参照のこと。
一部の実施形態において、CRISPR系の構成成分は、DNA/RNA又はRNA/RNAの組み合わせ又はタンパク質RNAなど、様々な形態で送達し得る。例えば、Cpf1は、DNAコードポリヌクレオチド又はRNAコードポリヌクレオチドとして、又はタンパク質として送達してもよい。ガイドはDNAコードポリヌクレオチド又はRNAとして送達してもよい。混合型の送達を含め、可能なあらゆる組み合わせが想定される。
更に、CRISPR系は、例えば、Sun W et al,「抗癌薬送達用の繭様自己分解性DNAナノクリュー(Cocoon-like self-degradable DNA nanoclew for anticancer drug delivery)」.,J Am Chem Soc.2014 Oct 22;136(42):14722-5.doi:10.1021/ja5088024.Epub 2014 Oct 13.;又はSun W et al,「ゲノム編集用CRISPR-Cas9を効率的に送達するための自己集合DNAナノクリュー(Self-Assembled DNA Nanoclews for the Efficient Delivery of CRISPR-Cas9 for Genome Editing)」.,Angew Chem Int Ed Engl.2015 Oct 5;54(41):12029-33.doi:10.1002/anie.201506030.Epub 2015 Aug 27に記載されるとおりのナノクリューを用いて送達し得る。
本発明の方法を用いることにより、目的の突然変異のモデル又は疾患モデルによるなどの、目的の遺伝的又は後成的条件のモデル化及び/又は研究に使用し得る植物、動物又は細胞を作り出すことができる。本明細書で使用されるとき、「疾患」は、対象における疾患、障害、又は徴候を指す。例えば、本発明の方法を用いて、疾患に関連する1つ以上の核酸配列に改変を含む動物若しくは細胞、又は疾患に関連する1つ以上の核酸配列の発現が変化している植物、動物若しくは細胞を作り出すことができる。かかる核酸配列は疾患関連タンパク質配列をコードしてもよく、又は疾患関連制御配列であってもよい。従って、本発明の実施形態において植物、対象、患者、生物又は細胞は、非ヒトの対象、患者、生物又は細胞であり得ることが理解される。従って、本発明は、本方法により作製された植物、動物若しくは細胞、又はその子孫を提供する。子孫は、作製された植物又は動物のクローンであってもよく、又は更に望ましい形質をその子孫に遺伝子移入させるため同じ種の他の個体と交配させることによる有性生殖から生じてもよい。細胞は、多細胞生物、特に動物又は植物の場合にインビボ又はエキソビボであってよい。細胞が培養下にある例では、適切な培養条件が満たされる場合、且つ好ましくは細胞がこの目的に好適に適合する場合(例えば幹細胞)、細胞系が樹立され得る。本発明によって作製される細菌細胞系もまた想定される。ひいては細胞系もまた想定される。
本明細書に記載されるCRISPRタンパク質及び系は、効率的で対費用効果の高い機能性ゲノムスクリーニングの実施に用いることができる。かかるスクリーニングは、ゲノムワイドライブラリベースのCRISPRエフェクタータンパク質を用いることができる。かかるスクリーニング及びライブラリにより、遺伝子の機能、遺伝子が関与する細胞経路、及び遺伝子発現の任意の変化が如何に特定の生物学的過程をもたらし得るかを決定することが可能となり得る。本発明の利点は、CRISPR系がオフターゲット結合及びその結果として生じる副作用を回避することである。これは、標的DNAに対して高度な配列特異性を有するように構成された系を用いて達成される。本発明の好ましい実施形態において、CRISPRエフェクタータンパク質複合体はCpf1エフェクタータンパク質複合体である。
別の態様において、本発明は、遺伝子の機能的評価及びスクリーニング方法を提供する。機能ドメインを正確に送達するため、遺伝子を活性化若しくは抑制するため又は目的の特定の遺伝子座上のメチル化部位を正確に変化させることによりエピジェネティック状態を変化させるための本発明のCRISPR系の使用は、単細胞又は細胞集団に適用される1つ以上のガイドRNAを伴うか、又は複数のガイドRNA(gRNA)を含むライブラリの投与又は発現を含む、エキソビボ又はインビボで細胞のプール内のゲノムに適用されるライブラリを伴うことができ、及びここでスクリーニングはCpf1エフェクタータンパク質の使用を更に含み、ここでCpf1エフェクタータンパク質を含むCRISPR複合体は、異種機能ドメインを含むように改変される。ある態様において、本発明は、ライブラリの宿主への投与又は宿主におけるインビボ発現を含む、ゲノムのスクリーニング方法を提供する。ある態様において、本発明は、宿主に投与される又は宿主で発現するアクチベーターを更に含む、本明細書に考察されるとおりの方法を提供する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでアクチベーターはCpf1エフェクタータンパク質に付加される。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでアクチベーターはCpf1エフェクタータンパク質のN末端又はC末端に付加される。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでアクチベーターはgRNAループに付加される。ある態様において、本発明は、宿主に投与される又は宿主で発現するリプレッサーを更に含む、本明細書に考察されるとおりの方法を提供する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでスクリーニングは、遺伝子活性化、遺伝子阻害、又は遺伝子座における切断に影響を及ぼし、及びそれを検出することを含む。
本明細書に記載される1つ又は複数のCpf1エフェクタータンパク質系は、例えば、遺伝子発現、薬剤耐性、及び疾患の好転に必要な機能性エレメントの重要な最小限の特徴及び個別的な脆弱性を決定するための、細胞表現型と併せたゲノム遺伝子座における飽和又はディープスキャニング突然変異誘発の実施に用いることができる。飽和又はディープスキャニング突然変異誘発とは、ゲノム遺伝子座内であらゆる又は本質的にあらゆるDNA塩基が切断されることを意味する。Cpf1エフェクタータンパク質ガイドRNAのライブラリが細胞集団に導入される。このライブラリは、各細胞がシングルガイドRNA(gRNA)を受け取るように導入され得る。本明細書に記載されるとおり、ライブラリがウイルスベクターの形質導入によって導入される場合、低い感染多重度(MOI)が用いられる。ライブラリは、ゲノム遺伝子座において(プロトスペーサー隣接モチーフ)(PAM)配列の上流にある全ての配列を標的化するgRNAを含み得る。ライブラリは、ゲノム遺伝子座内の1000塩基対毎にPAM配列の上流に少なくとも100個の非重複ゲノム配列を含み得る。ライブラリは、少なくとも1つの異なるPAM配列の上流の配列を標的化するgRNAを含み得る。1つ又は複数のCpf1エフェクタータンパク質系は2つ以上のCpf1タンパク質を含み得る。異なるPAM配列を認識するオルソログ又はエンジニアリングされたCpf1エフェクタータンパク質を含め、本明細書に記載されるとおりの任意のCpf1エフェクタータンパク質を用いることができる。gRNAに関するオフターゲット部位の頻度は500未満であり得る。オフターゲットスコアを作成して、最も低いオフターゲット部位のgRNAを選択し得る。単一の実験で同じ部位を標的化するgRNAを用いることにより、gRNA標的部位における切断に関連すると決定された任意の表現型を確認し得る。標的部位の検証はまた、本明細書に記載されるとおりの改変Cpf1エフェクタータンパク質、及び目的のゲノム部位を標的化する2つのgRNAを用いることにより行ってもよい。理論によって拘束されないが、標的部位は、検証実験で表現型の変化が観察された場合に真のヒットである。
一部の実施形態における本発明は、細胞又は生物を改変する方法を包含する。細胞は原核細胞又は真核細胞であってもよい。細胞は哺乳類細胞であってもよい。哺乳類細胞は、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、げっ歯類又はマウス細胞であってもよい。細胞は、家禽、魚類又はエビなどの非哺乳類真核細胞であってもよい。細胞はまた、植物細胞であってもよい。植物細胞は、キャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、又はコメなどの作物植物であってもよい。植物細胞はまた、藻類、樹木又は野菜であってもよい。本発明によって細胞に導入される改変は、抗体、デンプン、アルコール又は他の所望の細胞産出物などの生物学的産物の産生向上のため細胞及び細胞の子孫を変化させるようなものであり得る。本発明によって細胞に導入される改変は、産生される生物学的産物を変える変化が細胞及び細胞の子孫に含まれるようなものであり得る。
本発明は、少なくとも1つのナノ粒子複合体によって送達されるCRISPR複合体の少なくとも1つの構成成分、例えばRNAに関する。一部の態様において、本発明は、1つ以上のポリヌクレオチド、例えば、又は本明細書に記載されるとおりの1つ以上のベクター、その1つ以上の転写物、及び/又はそれから転写されるもの又はタンパク質を、宿主細胞に送達するステップを含む方法を提供する。一部の態様において、本発明は、かかる方法によって作製される細胞、及びかかる細胞を含むか、又はそれから作製される動物を更に提供する。一部の実施形態では、ガイド配列と組み合わせた(及び任意選択でそれと複合体を形成した)CRISPR酵素が細胞に送達される。哺乳類細胞又は標的組織における核酸の導入には、従来のウイルスベース及び非ウイルスベースの遺伝子導入方法を用いることができる。かかる方法を用いて、CRISPR系の構成成分をコードする核酸を培養下の細胞に、又は宿主生物中の細胞に投与することができる。非ウイルスベクター送達系には、DNAプラスミド、RNA(例えば本明細書に記載されるベクターの転写物)、ネイキッド核酸、及び送達ビヒクルと複合体を形成した核酸、例えばリポソームが含まれる。ウイルスベクター送達系にはDNA及びRNAウイルスが含まれ、これは細胞への送達後にエピソームゲノム又は組込みゲノムのいずれかを有する。遺伝子療法手順のレビューに関しては、Anderson,Science 256:808-813(1992);Nabel & Felgner,TIBTECH 11:211-217(1993);Mitani & Caskey,TIBTECH 11:162-166(1993);Dillon,TIBTECH 11:167-175(1993);Miller,Nature 357:455-460(1992);Van Brunt,Biotechnology 6(10):1149-1154(1988);Vigne,Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36(1995);Kremer & Perricaudet,British Medical Bulletin 51(1):31-44(1995);Haddada et al.,in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Boehm(eds)(1995);及びYu et al.,Gene Therapy 1:13-26(1994)を参照のこと。
Cpf1エフェクタータンパク質系(例えば単一の又は多重化した)は、作物ゲノミクスにおける近年の進歩と併せて用いることができる。本明細書に記載される系を使用して、効率的で且つ対費用効果の高い植物遺伝子又はゲノムの探索又は編集又は操作を-例えば、植物遺伝子又はゲノムの迅速な調査及び/又は選択及び/又は探索及び/又は比較及び/又は操作及び/又は形質転換のため、実施することができ;例えば、1つ又は複数の形質又は1つ又は複数の特徴を作出し、同定し、開発し、最適化し、又は1つ又は複数の植物に付与し、又は植物ゲノムを形質転換することができる。従って、植物の生産の向上、新規組み合わせの形質又は特徴を有する新規植物、又は形質が増強された新規植物があり得る。Cpf1エフェクタータンパク質系は、植物に関して、部位特異的組込み(SDI)又は遺伝子編集(GE)又は任意の準逆育種(NRB)又は逆育種(RB)技術において使用することができる。本明細書に記載されるCpf1エフェクタータンパク質系を利用する態様は、植物におけるCRISPR-Cas(例えばCRISPR-Cas9)系の使用と同様であってもよく、アリゾナ大学(University of Arizona)ウェブサイト「CRISPR-PLANT」(http://www.genome.arizona.edu/crispr/)(後援Penn State及びAGI)が挙げられる。本発明の実施形態(emodiments)は、植物におけるゲノム編集で、又はRNAi若しくは同様のゲノム編集技法が既に用いられているところで用いることができる;例えば、Nekrasov,「容易になった植物ゲノム編集:CRISPR/Cas系を使用したモデル及び作物植物における標的突然変異誘発(Plant genome editing made easy:targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system)」,Plant Methods 2013,9:39(doi:10.1186/1746-4811-9-39);Brooks,「CRISPR/Cas9系を使用した第一世代のトマトにおける効率的遺伝子編集(Efficient gene editing in tomato in the first generation using the CRISPR/Cas9 system)」,Plant Physiology September 2014 pp 114.247577;Shan,「CRISPR-Cas系を使用した作物植物の標的ゲノム改変(Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system)」,Nature Biotechnology 31,686-688(2013);Feng,「CRISPR/Cas系を使用した植物における効率的なゲノム編集(Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system)」,Cell Research(2013)23:1229-1232.doi:10.1038/cr.2013.114;オンライン発行 20 August 2013;Xie,「CRISPR-Cas系を使用した植物におけるRNAガイド下ゲノム編集(RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system)」,Mol Plant.2013 Nov;6(6):1975-83.doi:10.1093/mp/sst119.Epub 2013 Aug 17;Xu,「コメにおけるアグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介CRISPR-Cas系を使用した遺伝子ターゲティング(Gene targeting using the Agrobacterium tumefaciens-mediated CRISPR-Cas system in rice)」,Rice 2014,7:5(2014)、Zhou et al.,「木本多年生植物ポプラ属(Populus)の外交配における両アレルCRISPR突然変異へのSNPの利用により、4-クマル酸:CoAリガーゼ特異性及び冗長性が明らかになる(Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate:CoA ligase specificity and Redundancy)」,New Phytologist(2015)(Forum)1-4(www.newphytologist.comにおいてオンラインでのみ入手可能);Caliando et al,「宿主ゲノムを安定に担持するCRISPRデバイスを使用した標的DNA分解(Targeted DNA degradation using a CRISPR device stably carried in the host genome)」,NATURE COMMUNICATIONS 6:6989,DOI:10.1038/ncomms7989,www.nature.com/naturecommunications DOI:10.1038/ncomms7989;米国特許第6,603,061号明細書-アグロバクテリウム属媒介性植物形質転換方法(Agrobacterium-Mediated Plant Transformation Method);米国特許第7,868,149号明細書-植物ゲノム配列及びその使用(Plant Genome Sequences and Uses Thereof)及び米国特許出願公開第2009/0100536号明細書-農業形質が増強されたトランスジェニック植物(Transgenic Plants with Enhanced Agronomic Traits)(これらの各々の内容及び開示は全て、本明細書において全体として参照により援用される)を参照のこと。本発明の実施では、Morrell et al「作物ゲノミクス:進展と応用(Crop genomics:advances and applications)」,Nat Rev Genet.2011 Dec 29;13(2):85-96の内容及び開示;その各々が、本明細書における実施形態が植物に関してどのように用いられ得るかに関してを含め、参照により本明細書に援用される。従って、本明細書において動物細胞への言及はまた、特に明らかでない限り、適宜修正して植物細胞にも適用し得る;及び、オフターゲット効果が低下した本明細書における酵素及びかかる酵素を利用する系は、本明細書に記載するものを含め、植物適用(applciations)に用いることができる。
植物及び酵母へのCpf1-CRISPR系の適用
定義:
一般に、用語「植物」は、細胞分裂によって特徴的に成長し、葉緑体を含有し、及びセルロースで構成される細胞壁を有する植物界(Plantae)の任意の様々な光合成生物、真核生物、単細胞生物又は多細胞生物に関する。用語の植物には単子葉及び双子葉植物が包含される。具体的には、植物には、限定なしに、アカシア、アルファルファ、アマランス、リンゴ、アンズ、チョウセンアザミ、トネリコの木、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ類、テンサイ、カバノキ、ブナノキ、クロイチゴ、ブルーベリー、ブロッコリー、メキャベツ、キャベツ、キャノーラ、カンタループ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、ヒマラヤスギ、穀物、セロリ、クリ、サクランボ、ハクサイ、柑橘類、クレメンタイン、クローバ、コーヒー、トウモロコシ、ワタ、ササゲ、キュウリ、イトスギ、ナス、ニレ、エンダイブ、ユーカリ、ウイキョウ、イチジク、モミ、ゼラニウム、ブドウ、グレープフルーツ、ラッカセイ類、ホオズキ、ガムヘムロック(gum hemlock)、ヒッコリー、ケール、キーウィフルーツ、コールラビ、カラマツ、レタス、ニラ、レモン、ライム、ニセアカシア、マツ、メイデンヘア、トウモロコシ、マンゴー、カエデ、メロン、キビ、キノコ、カラシ、堅果類、オーク、オートムギ、油ヤシ、オクラ、タマネギ、オレンジ、観賞植物又は装飾花又は観賞樹、パパイヤ、ヤシ、パセリ、パースニップ、エンドウマメ、モモ、ピーナッツ、セイヨウナシ、ピート、コショウ、カキ、キマメ、マツ、パイナップル、オオバコ、セイヨウスモモ、ザクロ、ジャガイモ、カボチャ、赤チコリ、ダイコン、ナタネ、キイチゴ、コメ、ライムギ、モロコシ、ベニバナ、サルヤナギ、ダイズ、ホウレンソウ、エゾマツ、カボチャ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、スイートコーン、タンジェリン、茶、タバコ、トマト、樹木、ライ小麦、芝草、カブ、つる植物、クルミ、オランダガラシ、スイカ、コムギ、ヤムイモ、イチイ、及びズッキーニなどの被子植物及び裸子植物が含まれることが意図される。用語の植物にはまた、それらに根、葉及び高等植物を特徴付ける他の器官がないことによって主に統一された、大部分が光独立栄養生物である藻類も包含される。
詳細な実施形態では、植物細胞のゲノムに安定に組み込むためCpf1 CRISPR系の構成成分をコードするポリヌクレオチドを導入することが想定される。これらの実施形態において、形質転換ベクター又は発現系の設計は、いつ、どこで、及びどのような条件下でガイドRNA及び/又はCpf1遺伝子を発現させるかに応じて調整し得る。
(a)植物の標的配列とハイブリダイズするガイドRNA(gRNA)をコードするヌクレオチド配列であって、ガイドRNAがガイド配列とダイレクトリピート配列とを含む、ヌクレオチド配列、及び
(b)Cpf1タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
を含み、
ここで構成成分(a)又は(b)は同じ又は異なる構築物上に位置し、及びそれによって異なるヌクレオチド配列が、植物細胞において作動可能な同じ又は異なる調節エレメントの制御下にあることができる。
植物細胞における適切な発現を確実にするため、本明細書に記載されるCpf1 CRISPR系の構成成分は、典型的には植物プロモーター、即ち植物細胞において作動可能なプロモーターの制御下に置かれる。異なる種類のプロモーターの使用が想定される。
発現系は、特定の植物細胞小器官に転位し及び/又はそこで発現するためのエレメントを含み得る。
詳細な実施形態では、Cpf1 CRISPR系を用いて葉緑体遺伝子を特異的に改変し、又は葉緑体における発現を確実にすることが想定される。この目的で、葉緑体形質転換方法又はCpf1 CRISPR構成成分の葉緑体への区画化が用いられる。例えば、プラスチドゲノムに遺伝子改変を導入すると、花粉を通じた遺伝子流動などのバイオセーフティ問題を軽減することができる。
トランスジェニック藻類(又は他の植物、例えばセイヨウアブラナ)が、植物油又はバイオ燃料、例えばアルコール(特にメタノール及びエタノール)又は他の生産物の生産において特に有用であり得る。これらは、油又はバイオ燃料産業で使用される油又はアルコールを高度に発現又は過剰発現するようにエンジニアリングされ得る。
詳細な実施形態では、本発明は、酵母細胞のゲノム編集のためのCpf1 CRISPR系の使用に関する。Cpf1 CRISPR系構成成分をコードするポリヌクレオチドの導入に用いることのできる酵母細胞の形質転換方法は当該技術分野において周知であり、Kawai et al.,2010,Bioeng Bugs.2010 Nov-Dec;1(6):395-403)によってレビューされている。非限定的な例としては、酢酸リチウム処理による酵母細胞の形質転換(これはキャリアDNA及びPEG処理を更に含み得る)、ボンバードメント又は電気穿孔によるものが挙げられる。
詳細な実施形態では、植物細胞においてガイドRNA及び/又はCpf1遺伝子を一過性に発現させることが想定される。これらの実施形態では、CRISPR/Cpf1系により、細胞内にガイドRNA及びCpf1タンパク質の両方が存在するときに限った標的遺伝子の改変が確実となり、従ってゲノム改変を更に制御することができる。Cpf1酵素の発現は一過性であるため、かかる植物細胞から再生した植物は典型的には外来DNAを含有しない。詳細な実施形態では、Cpf1酵素は植物細胞によって安定に発現し、及びガイド配列は一過性に発現する。
詳細な実施形態では、Cpf1 CRISPR系の1つ以上の構成成分を植物細胞に直接送達することが有益である。これは特に、非トランスジェニック植物の作成に有益である(下記参照)。詳細な実施形態では、Cpf1構成成分の1つ以上が植物又は植物細胞の外部で調製され、細胞に送達される。例えば詳細な実施形態では、Cpf1タンパク質がインビトロで調製された後、植物細胞に導入される。Cpf1タンパク質は当業者に公知の、組換え産生を含めた様々な方法によって調製することができる。発現後、Cpf1タンパク質が単離され、必要に応じて再び折り畳まれ、精製され、及び任意選択でHisタグなどの任意の精製タグを除去するため処理される。粗製の、部分的に精製された、又はより完全に精製されたCpf1タンパク質が得られたところで、タンパク質が植物細胞に導入され得る。
詳細な実施形態では、本明細書に記載される方法は、CRISPR構成成分をコードするものを含めた任意の外因性遺伝子を植物のゲノムに永久的に導入することなく、そのようにして植物のゲノムに外来DNAが存在することを回避しつつ内因性遺伝子を改変し、又はそれらの発現を改変するために用いられる。非トランスジェニック植物に求められる規制上の要件は厳しさが緩和されるため、これは有益であり得る。
詳細な実施形態において、方法が植物ゲノムの内因性標的遺伝子改変を伴う場合、植物、植物部位又は植物細胞にCpf1 CRISPR系を感染させ又はトランスフェクトした後、任意の好適な方法を用いることにより、標的部位で遺伝子ターゲティング又は標的突然変異誘発が起こるかどうかを決定することができる。方法がトランス遺伝子の導入を伴う場合、エンジニアリングされた植物材料をトランス遺伝子の存在又はトランス遺伝子によってコードされる形質に関して選択又はスクリーニングすることにより、形質転換された植物細胞、カルス、組織又は植物を同定し、単離し得る。挿入された遺伝子構築物又は内因性DNA改変を含有する植物又は植物細胞形質転換体の同定には、物理的及び生化学的方法を用い得る。これらの方法としては、限定はされないが:1)組換えDNAインサート又は改変された内因性遺伝子の構造を検出及び決定するサザン解析又はPCR増幅;2)遺伝子構築物のRNA転写物を検出して調べるノーザンブロット、S1 RNアーゼ保護、プライマー伸長又は逆転写酵素PCR増幅;3)酵素又はリボザイム活性を検出する酵素アッセイ(かかる遺伝子産物が遺伝子構築物によってコードされるか、又は発現が遺伝子改変によって影響を受ける場合);4)タンパク質ゲル電気泳動、ウエスタンブロット法、免疫沈降、又は酵素結合免疫測定法(遺伝子構築物又は内因性遺伝子産物がタンパク質である場合)が挙げられる。インサイチュハイブリダイゼーション、酵素染色、及び免疫染色などの更なる技法もまた、組換え構築物の存在若しくは発現の検出、又は特定の植物器官及び組織における内因性遺伝子の改変の検出に用いることができる。これらの全てのアッセイを行う方法は当業者に周知である。
詳細な実施形態では、改変ゲノムを有し、且つ本明細書に記載される方法のいずれかによって作製又は入手される植物細胞は、培養することにより、形質転換され又は改変された遺伝子型を備えた、ひいては所望の表現型を備えた全植物を再生することができる。従来の再生技法は当業者に周知である。かかる再生技法の詳細な例は、組織培養成長培地中でのある種の植物ホルモンの操作に頼るものであり、及び典型的には所望のヌクレオチド配列と共に導入された殺生物剤及び/又は除草剤マーカーに頼るものである。更なる詳細な実施形態では、植物再生は、培養したプロトプラスト、植物カルス、外植片、器官、花粉、胚又はそれらの一部から得られる(例えば、Evans et al.(1983),Handbook of Plant Cell Culture,Klee et al(1987)Ann.Rev.of Plant Physを参照)。
本明細書に提供されるCpf1ベースのCRISPR系は標的二本鎖又は一本鎖切断の導入に用いることができ、及び/又は遺伝子アクチベーター及び/又はリプレッサー系を導入することができ、及び限定なしに、遺伝子ターゲティング、遺伝子置換、標的突然変異誘発、標的欠失又は挿入、標的逆位及び/又は標的転座に用いることができる。単一細胞において複数の改変を実現するために行われるマルチターゲティングRNAの共発現により、多重化ゲノム改変を確実に行うことができる。この技術は、栄養価、病害抵抗性並びに生物的及び非生物的ストレスに対する抵抗性の増加、及び商業的に有用な植物製品又は異種化合物の生産増加を含め、改良された特徴を備える植物の高精度エンジニアリングに用いることができる。
本発明は、目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列のゲノム編集又は改変方法を提供し、この方法は、Cpf1エフェクタータンパク質複合体を植物細胞に導入するステップであって、それによりCpf1エフェクタータンパク質複合体が植物細胞のゲノムへのDNAインサート(例えば目的の外因性遺伝子をコードする)の組込みに有効に機能するステップを含む。好ましい実施形態において、DNAインサートの組込みは、外因的に導入されたDNA鋳型又は修復鋳型とのHRによって促進される。典型的には、外因的に導入されたDNA鋳型又は修復鋳型は、Cpf1エフェクタータンパク質複合体若しくは1つの構成成分又は複合体の構成成分を発現するポリヌクレオチドベクターと共に送達される。本明細書に提供されるCpf1 CRISPR系は標的遺伝子送達を可能にする。目的の遺伝子の発現効率はゲノムへの組込み位置によって決まるところが大きいことが次第に明らかになりつつある。本方法は、外因性遺伝子をゲノムの所望の位置に標的化して組み込むことが可能である。位置は、これまでに生じたイベントの情報に基づき選択することができ、又は本明細書の他の部分に開示される方法によって選択することができる。
本発明は、目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列のゲノム編集又は改変方法を提供し、この方法は、Cpf1エフェクタータンパク質複合体を植物細胞に導入するステップであって、それによりCpf1複合体が植物の内因性遺伝子の発現を改変するステップを含む。これは様々な方法で実現することができ、詳細な実施形態では、内因性遺伝子の発現の除去が望ましく、Cpf1 CRISPR複合体を用いて内因性遺伝子を標的化し、切断することにより、遺伝子発現が改変される。これらの実施形態において、本明細書に提供される方法は、(a)ガイドRNA(ダイレクトリピートとガイド配列とを含む)を含むCpf1 CRISPR複合体を植物細胞に導入するステップ[ガイド配列は植物細胞のゲノムにおける目的の遺伝子内の標的配列にハイブリダイズする];及び(b)ガイドRNAとの結合時に、標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含み、ガイド配列が標的とする配列又はその近傍で二本鎖切断を確実に行うCas9エフェクタータンパク質を細胞に導入するステップを含み;詳細な実施形態では、導入するステップは、Cpf1エフェクタータンパク質及びガイドRNAをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを植物細胞に送達することを含み得る。
また、本明細書には、本明細書に提供されるCpf1タンパク質を用いて内因性遺伝子発現を調節(即ち活性化又は抑制)する方法も提供される。かかる方法では、Cpf1複合体によって植物ゲノムに標的化される1つ又は複数の個別のRNA配列を利用する。より詳細には、1つ又は複数の個別のRNA配列は2つ以上のアダプタータンパク質(例えばアプタマー)に結合し、それにより各アダプタータンパク質は1つ以上の機能ドメインと会合し、及びここでアダプタータンパク質と会合した1つ以上の機能ドメインの少なくとも1つは、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写解除因子活性、ヒストン修飾活性、DNA組込み活性、RNA切断活性、DNA切断活性又は核酸結合活性を含む1つ以上の活性を有する;機能ドメインを使用して、所望の形質が得られるように内因性植物遺伝子の発現が調節される。典型的には、これらの実施形態において、Cpf1エフェクタータンパク質は1つ以上の突然変異を有し、そのため少なくとも1つの突然変異を有しないCpf1エフェクタータンパク質の5%以下のヌクレアーゼ活性を有する。
多くの植物は倍数体であり、つまり、それらはそのゲノムの二重のコピー(時にコムギの場合のように6個にも上る)を有するということである。Cpf1 CRISPRエフェクタータンパク質を利用する本発明に係る方法は「多重化」されるため、遺伝子の全てのコピーに影響を及ぼすことができ、又は何十個もの遺伝子を一度に標的化することができる。例えば、詳細な実施形態では、本発明の方法を用いて、病害に対する防御の抑制に関与する種々の遺伝子で機能喪失突然変異が同時に起こることが確実にされる。詳細な実施形態では、本発明の方法を用いてコムギ植物細胞におけるTaMLO-Al、TaMLO-Bl及びTaMLO-Dl核酸配列の発現が同時に抑制され、及びそれからコムギ植物が再生されて、コムギ植物がうどんこ病に抵抗性となるよう確実にされる(国際公開第2015109752号パンフレットもまた参照)。
本明細書において上記に記載されるとおり、詳細な実施形態では、本発明は、1つ以上の植物発現性遺伝子を含めた目的のDNAの挿入ための、本明細書に記載されるとおりのCpf1 CRISPR系の使用を包含する。更なる詳細な実施形態では、本発明は、1つ以上の植物発現遺伝子を部分的又は完全に欠失させるための、本明細書に記載されるとおりのCpf1系を用いた方法及びツールを包含する。他の更なる詳細な実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるとおりのCpf1系を用いて1つ以上のヌクレオチドの突然変異、置換、挿入による1つ以上の植物発現遺伝子の改変を確実に行う方法及びツールを包含する。他の詳細な実施形態では、本発明は、前記遺伝子の発現を導く調節エレメントの1つ以上を特異的に改変することによる1つ以上の植物発現遺伝子の発現の改変を確実に行うための本明細書に記載されるとおりのCpf1 CRISPR系の使用を包含する。
・植物病害抵抗性遺伝子。植物をクローン抵抗性遺伝子で形質転換することにより、特定の病原菌株に対して抵抗性の植物をエンジニアリングすることができる。例えば、Jones et al.,Science 266:789(1994)(トマト葉かび病菌(Cladosporium fulvum)に対する抵抗性のためのトマトCf-9遺伝子のクローニング);Martin et al.,Science 262:1432(1993)(トマト斑葉細菌病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)に対する抵抗性のためのトマトPto遺伝子はプロテインキナーゼをコードする);Mindrinos et al.,Cell 78:1089(1994)(アラビドプス(Arabidops)はトマト斑葉細菌病菌(Pseudomonas syringae)に対する抵抗性のためのRSP2遺伝子であり得る))を参照のこと。
・ダイズシスト線虫などの害虫に対する抵抗性を付与する遺伝子。例えば、PCT出願国際公開第96/30517号パンフレット;PCT出願国際公開第93/19181号パンフレットを参照のこと。
・バチルス・チューリンジエンシス(Bacillus thuringiensis)タンパク質、例えば、Geiser et al.,Gene 48:109(1986)を参照のこと。
・レクチン、例えば、Van Damme et al.,Plant Molec.Biol.24:25(1994を参照のこと。
・アビジンなどのビタミン結合タンパク質、PCT出願US93/06487号明細書を参照のこと、害虫に対する幼虫撲滅剤としてのアビジン及びアビジンホモログの使用を教示している。
・プロテアーゼ又はプロテイナーゼ阻害薬又はアミラーゼ阻害薬などの酵素阻害薬。例えば、Abe et al.,J.Biol.Chem.262:16793(1987)、Huub et al.,Plant Molec.Biol.21:985(1993))、Sumitani et al.,Biosci.Biotech.Biochem.57:1243(1993)及び米国特許第5,494,813号明細書を参照のこと。
・エクジステロイド又は幼若ホルモン、それらの変異体、それらをベースとする模倣体、又はそれらの拮抗薬若しくは作動薬など、昆虫特異的ホルモン又はフェロモン。例えば、Hammock et al.,Nature 344:458(1990)を参照のこと。
・発現時に、罹病源の害虫の生理機能を破壊する昆虫特異的ペプチド又は神経ペプチド。例えば、Regan,J.Biol.Chem.269:9(1994)及びPratt et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.163:1243(1989)。また米国特許第5,266,317号明細書も参照のこと。
・ヘビ、スズメバチ、又は任意の他の生物によって天然で産生される昆虫特有の毒液。例えば、Pang et al.,Gene 116:165(1992)を参照のこと。
・モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体又は殺虫活性を有する別の非タンパク質分子の過剰な蓄積に関与する酵素。
・翻訳後修飾を含め、生物学的に活性な分子の改変に関わる酵素;例えば、解糖酵素、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼ、エステラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼ及びグルカナーゼ(天然か又は合成かに関わらない)。PCT出願国際公開第93/02197号パンフレット、Kramer et al.,Insect Biochem.Molec.Biol.23:691(1993)及びKawalleck et al.,Plant Molec.Biol.21:673(1993)を参照のこと。
・シグナル伝達を刺激する分子。例えば、Botella et al.,Plant Molec.Biol.24:757(1994)、及びGriess et al.,Plant Physiol.104:1467(1994)を参照のこと。
・ウイルス侵入性タンパク質又はそれに由来する複合体毒素。Beachy et al.,Ann.rev.Phytopathol.28:451(1990)を参照のこと。
・病原体又は寄生虫によって天然で産生される発生抑止性タンパク質。Lamb et al.,Bio/Technology 10:1436(1992)及びToubart et al.,Plant J.2:367(1992)を参照のこと。
・植物によって天然で産生される発生抑止性タンパク質。例えば、Logemann et al.,Bio/Technology 10:305(1992)。
・植物では、病原体は多くの場合に宿主特異的である。例えば、あるフザリウム属(Fusarium)種はトマト萎凋病を引き起こし得るが、攻撃するのはトマトのみであり、他のフザリウム属(Fusarium)種はコムギのみを攻撃する。植物は既存の誘導防御を有して多くの病原体に抵抗する。特に病原体が植物よりも高い頻度で複製することに伴い、植物世代間での突然変異及び組換えイベントが、感受性を生じさせる遺伝的変異性をもたらす。植物には非宿主抵抗性が存在することもあり、例えばその宿主と病原体とが適合しないか、又は典型的には多くの遺伝子によって制御される、あらゆる病原体系統に対する部分抵抗性、及び/又は、また、他の系統に対しては存在しない、一部の病原体系統に対する完全抵抗性も存在し得る。かかる抵抗性は、典型的には数個の遺伝子によって制御される。CRISP-cpf1系の方法及び構成成分を用いることにより、ここで特異的突然変異をそれを見越して誘導する新規ツールが存在する。従って、抵抗性遺伝子の供給源のゲノムを分析し、且つ所望の特性又は形質を有する植物において、Cpf1 CRISPR系の方法及び構成成分を用いることにより、抵抗性遺伝子の産生を誘発することができる。本系は、これまでの突然変異誘発物質より高い精度でそれを行うことができ、ひいては植物育種プログラムを加速させ、及び改善することができる。
・イネの病害:イネいもち病菌(Magnaporthe grisea)、イネごま葉枯病菌(Cochliobolus miyabeanus)、イネ紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、イネばか苗病菌(Gibberella fujikuroi);コムギの病害:コムギうどんこ病菌(Erysiphe graminis)、コムギ赤かび病菌(Fusarium graminearum)、コムギ赤かび病菌(F.avenaceum)、コムギ赤かび病菌(F.culmorum)、コムギ赤かび病菌(Microdochium nivale)、コムギ黄さび病菌(Puccinia striiformis)、コムギ黒さび病菌(P.graminis)、コムギ赤さび病菌(P.recondita)、コムギ紅色雪腐病菌(Micronectriella nivale)、コムギ雪腐小粒菌核病菌(Typhula sp.)、コムギ裸黒穂病菌(Ustilago tritici)、コムギなまぐさ黒穂病菌(Tilletia caries)、コムギ眼紋病菌(Pseudocercosporella herpotrichoides)、コムギ葉枯病菌(Mycosphaerella graminicola)、コムギふ枯病菌(Stagonospora nodorum)、コムギ黄斑病菌(Pyrenophora tritici-repentis);オオムギの病害:オオムギうどんこ病菌(Erysiphe graminis)、オオムギ赤かび病菌(Fusarium graminearum)、オオムギ赤かび病菌(F.avenaceum)、オオムギ赤かび病菌(F.culmorum)、オオムギ赤かび病菌(Microdochium nivale)、オオムギ黄さび病菌(Puccinia striiformis)、オオムギ黒さび病菌(P.graminis)、オオムギ小さび病菌(P.hordei)、オオムギ裸黒穂病菌(Ustilago nuda)、オオムギ雲形病菌(Rhynchosporium secalis)、オオムギ網斑病菌(Pyrenophora teres)、オオムギ斑点病菌(Cochliobolus sativus)、オオムギ斑葉病菌(Pyrenophora graminea)、オオムギ紋枯病菌(Rhizoctonia solani);トウモロコシの病害:トウモロコシ黒穂病菌(Ustilago maydis)、トウモロコシごま葉枯病菌(Cochliobolus heterostrophus)、トウモロコシひょう紋病菌(Gloeocercospora sorghi)、トウモロコシ南方さび病菌(Puccinia polysora)、トウモロコシ灰斑病菌(Cercospora zeae-maydis)、トウモロコシ根朽病菌(Rhizoctonia solani);
・柑橘類の病害:カンキツ黒点病菌(Diaporthe citri)、カンキツそうか病菌(Elsinoe fawcetti)、カンキツ緑かび病菌(Penicillium digitatum)、カンキツ青かび病菌(P.italicum)、カンキツ疫病菌(Phytophthora parasitica)、カンキツ褐色腐敗病菌(Phytophthora citrophthora);リンゴの病害:リンゴモニリア病菌(Monilinia mali)、リンゴ腐らん病菌(Valsa ceratosperma)、リンゴうどんこ病菌(Podosphaera leucotricha)、リンゴ斑点落葉病菌(Alternaria alternata apple pathotype)、リンゴ黒星病菌(Venturia inaequalis)、リンゴ炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)、リンゴ疫病菌(Phytophtora cactorum);
・セイヨウナシの病害:ナシ黒星病菌(Venturia nashicola)、セイヨウナシ黒星病(V.pirina)、ナシ黒斑病菌(Alternaria alternata Japanese pear pathotype)、ナシ赤星病菌(Gymnosporangium haraeanum)、ナシ疫病菌(Phytophtora cactorum);
・モモの病害:モモ灰星病菌(Monilinia fructicola)、モモ黒星病菌(Cladosporium carpophilum)、モモホモプシス腐敗病菌(Phomopsis sp.);
・ブドウの病害:ブドウ黒とう病菌(Elsinoe ampelina)、ブドウ晩腐病菌(Glomerella cingulata)、ブドウうどんこ病菌(Uninula necator)、ブドウさび病菌(Phakopsora ampelopsidis)、ブドウ黒腐病菌(Guignardia bidwellii)、ブドウべと病菌(Plasmopara viticola);
・カキの病害:カキ炭疽病菌(Gloesporium kaki)、カキ角斑落葉病菌(Cercospora kaki)、カキ円星落葉病菌(Mycosphaerela nawae);
・ウリ類の病害:ウリ類炭疽病菌(Colletotrichum lagenarium)、ウリ類うどんこ病菌(Sphaerotheca fuliginea)、ウリ類つる枯病菌(Mycosphaerella melonis)、ウリ類つる割病菌(Fusarium oxysporum)、ウリ類べと病菌(Pseudoperonospora cubensis)、ウリ類疫病菌(Phytophthora sp.)、ウリ類苗立枯病菌(Pythium sp.);
・トマトの病害:トマト輪紋病菌(Alternaria solani)、トマト葉かび病菌(Cladosporium fulvum)、トマト疫病菌(Phytophthora infestans);
・ナスの病害:ナス褐紋病菌(Phomopsis vexans)、ナスうどんこ病菌(Erysiphe cichoracearum);
アブラナ科野菜の病害:アブラナ科植物黒斑病菌(Alternaria japonica)、アブラナ科植物白斑病菌(Cercosporella brassicae)、アブラナ科植物根こぶ病菌(Plasmodiophora brassicae)、アブラナ科植物べと病菌(Peronospora parasitica);
・ネギの病害:ネギさび病菌(Puccinia allii)、ネギべと病菌(Peronospora destructor);
・ダイズの病害:ダイズ斑病菌(Cercospora kikuchii)、ダイズ黒とう病菌(Elsinoe glycines)、ダイズ黒点病菌(Diaporthe phaseolorum var.sojae)、ダイズ褐紋病菌(Septoria glycines)、ダイズ斑点病菌(Cercospora sojina)、ダイズさび病菌(Phakopsora pachyrhizi)、ダイズ茎疫病菌(Phytophthora sojae)、ダイズリゾクトニア根腐病菌(Rhizoctonia solani)、ダイズ褐色輪紋病菌(Corynespora casiicola)、ダイズ菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum);
・インゲンマメの病害:インゲンマメ炭疽病菌(Colletrichum lindemthianum);
・ピーナッツの病害:ラッカセイ黒渋病菌(Cercospora personata)、ラッカセイ褐斑病菌(Cercospora arachidicola)、ラッカセイ白絹病菌(Sclerotium rolfsii);
・エンドウマメの病害エンドウマメ:エンドウうどんこ病菌(Erysiphe pisi);
・ジャガイモの病害:ジャガイモ夏疫病菌(Alternaria solani)、ジャガイモ疫病菌(Phytophthora infestans)、ジャガイモ緋色腐敗病菌(Phytophthora erythroseptica)、ジャガイモ粉状そうか病菌(Spongospora subterranean,f.sp.Subterranean);
・イチゴの病害:イチゴうどんこ病菌(Sphaerotheca humuli)、イチゴ炭疽病菌(Glomerella cingulata);
・チャノキの病害:チャ網もち病菌(Exobasidium reticulatum)、チャ白星病菌(Elsinoe leucospila)、チャ輪斑病菌(Pestalotiopsis sp.)、チャ炭疽病菌(Colletotrichum theae-sinensis);
・タバコの病害:タバコ赤星病菌(Alternaria longipes)、タバコうどんこ病菌(Erysiphe cichoracearum)、タバコ炭疽病菌(Colletotrichum tabacum)、タバコべと病菌(Peronospora tabacina)、タバコ疫病菌(Phytophthora nicotianae);
・ナタネの病害:ナタネ菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、ナタネ立枯病菌(Rhizoctonia solani);
・綿の病害:ワタ腰折病菌(Rhizoctonia solani);
・テンサイの病害:テンサイ褐斑病菌(Cercospora beticola)、テンサイ根腐病菌(Thanatephorus cucumeris)、テンサイ葉腐病菌(Thanatephorus cucumeris)、テンサイ苗立枯病菌(Aphanomyces cochlioides);
・バラの病害:バラ黒星病菌(Diplocarpon rosae)、バラうどんこ病菌(Sphaerotheca pannosa)、バラべと病菌(Peronospora sparsa);
・キク及びキク科植物の病害:キク類べと病菌(Bremia lactuca)、キク類褐斑病菌(Septoria chrysanthemi-indici)、キク類白さび病菌(Puccinia horiana);
・様々な植物の病害:フィチウム・アファニデルマツム(Pythium aphanidermatum)、苗立枯病菌(Pythium debarianum)、フィチウム・グラミニコラ(Pythium graminicola)、フィチウム・イレギュラレ(Pythium irregulare)、フィチウム・ウルチマム(Pythium ultimum)、灰色かび病菌(Botrytis cinerea)、菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum);
・ダイコンの病害:ダイコン黒斑病菌(Alternaria brassicicola);
・シバの病害:シバダラースポット病菌(Sclerotinia homeocarpa)、シバ葉腐病菌(Rhizoctonia solani);
・バナナの病害:バナナブラックシガトカ病菌(Mycosphaerella fijiensis)、バナナ斑葉病菌(Mycosphaerella musicola);
・ヒマワリの病害:ヒマワリべと病菌(Plasmopara halstedii);
・アスペルギルス属種(Aspergillus spp.)、ペニシリウム属種(Penicillium spp.)、フザリウム属種(Fusarium spp.)、ジベレラ属種(Gibberella spp.)、トリコデルマ属種(Tricoderma spp.)、チエラビオプシス属種(Thielaviopsis spp.)、リゾプス属種(Rhizopus spp.)、ムコール属種(Mucor spp.)、コルチシウム属種(Corticium spp.)、ロマ属種(Rhoma spp.)、リゾクトニア属種(Rhizoctonia spp.)、ジプロジア属種(Diplodia spp.)などによって引き起こされる様々な植物の種子の病害又は生育初期段階における病害;
・ポリミキサ属種(Polymixa spp.)、フクロカビ属種(Olpidium spp.)などによって媒介される様々な植物のウイルス性病害。
・成長点又は分裂組織を阻害する除草剤に対する抵抗性、例えば、それぞれ、Lee et al.,EMBO J.7:1241(1988)、及びMiki et al.,Theor.Appl.Genet.80:449(1990)によるイミダゾリノン又はスルホニル尿素など。
・グリホセート耐性(例えば、それぞれ、突然変異5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸シンターゼ(EPSP)遺伝子、aroA遺伝子及びグリホセートアセチルトランスフェラーゼ(GAT)遺伝子によって付与される抵抗性)、又はグルホシネートによるなどの他のホスホノ化合物に対する抵抗性(ストレプトミセス・ヒグロスコピカス(Streptomyces hygroscopicus)及びストレプトミセス・ビリドクロメオゲネス(Streptomyces viridichromogenes)を含めたストレプトミセス属(Streptomyces)種由来のホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT)遺伝子)、及びACCアーゼ阻害薬コード遺伝子によるピリジノキシ又はフェノキシプロピオン酸(proprionic acid)及びシクロヘキソンに対する抵抗性。例えば、米国特許第4,940,835号明細書及び米国特許第6,248,876号明細書、米国特許第4,769,061号明細書、EP0 333 033号明細書及び米国特許第4,975,374号明細書を参照のこと。また、EP0242246号明細書、DeGreef et al.,Bio/Technology 7:61(1989)、Marshall et al.,Theor.Appl.Genet.83:435(1992)、Castle et.al.に対する国際公開第2005012515号パンフレット、及び国際公開第2005107437号パンフレットも参照のこと。
・Przibila et al.,Plant Cell 3:169(1991)、米国特許第4,810,648号明細書、及びHayes et al.,Biochem.J.285:173(1992)におけるトリアジン(psbA及びgs+遺伝子)又はベンゾニトリル(ニトリラーゼ遺伝子)、及びグルタチオンS-トランスフェラーゼなど、光合成を阻害する除草剤抵抗性。
・除草剤を解毒する酵素又は阻害に対して抵抗性の突然変異グルタミンシンターゼ酵素をコードする遺伝子、例えば米国特許出願第11/760,602号明細書。又は解毒酵素は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(ストレプトミセス属(Streptomyces)種由来のbar又はpatタンパク質など)をコードする酵素である。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼについては、例えば、米国特許第5,561,236号明細書;同第5,648,477号明細書;同第5,646,024号明細書;同第5,273,894号明細書;同第5,637,489号明細書;同第5,276,268号明細書;同第5,739,082号明細書;同第5,908,810号明細書及び同第7,112,665号明細書に記載されている。
・ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(HPPD)阻害薬、即ち、天然に存在するHPPD抵抗性酵素、又は国際公開第96/38567号パンフレット、国際公開第99/24585号パンフレット、及び国際公開第99/24586号パンフレット、国際公開第2009/144079号パンフレット、国際公開第2002/046387号パンフレット、又は米国特許第6,768,044号明細書に記載されるとおりの突然変異又はキメラHPPD酵素をコードする遺伝子。
・国際公開第00/04173号パンフレット、又は国際公開第2006/045633号パンフレットに記載されるとおりの、植物細胞又は植物におけるポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)遺伝子の発現及び/又は活性を低下させることが可能なトランス遺伝子。
・例えば国際公開第2004/090140号パンフレットに記載されるとおりの、植物又は植物細胞のPARGコード遺伝子の発現及び/又は活性を低下させることが可能なトランス遺伝子。
・例えば、EP04077624.7号明細書、国際公開第2006/133827号パンフレット、PCT/EP07/002,433号明細書、EP1999263号明細書、又は国際公開第2007/107326号パンフレットに記載されるとおりの、ニコチンアミダーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドシンテターゼ又はニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼを含めた、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(nicotineamide adenine dinucleotide)サルベージ合成経路の植物機能性酵素をコードするトランス遺伝子。
・炭水化物生合成に関わる酵素としては、例えば、EP0571427号明細書、国際公開第95/04826号パンフレット、EP0719338号明細書、国際公開第96/15248号パンフレット、国際公開第96/19581号パンフレット、国際公開第96/27674号パンフレット、国際公開第97/11188号パンフレット、国際公開第97/26362号パンフレット、国際公開第97/32985号パンフレット、国際公開第97/42328号パンフレット、国際公開第97/44472号パンフレット、国際公開第97/45545号パンフレット、国際公開第98/27212号パンフレット、国際公開第98/40503号パンフレット、国際公開第99/58688号パンフレット、国際公開第99/58690号パンフレット、国際公開第99/58654号パンフレット、国際公開第00/08184号パンフレット、国際公開第00/08185号パンフレット、国際公開第00/08175号パンフレット、国際公開第00/28052号パンフレット、国際公開第00/77229号パンフレット、国際公開第01/12782号パンフレット、国際公開第01/12826号パンフレット、国際公開第02/101059号パンフレット、国際公開第03/071860号パンフレット、国際公開第2004/056999号パンフレット、国際公開第2005/030942号パンフレット、国際公開第2005/030941号パンフレット、国際公開第2005/095632号パンフレット、国際公開第2005/095617号パンフレット、国際公開第2005/095619号パンフレット、国際公開第2005/095618号パンフレット、国際公開第2005/123927号パンフレット、国際公開第2006/018319号パンフレット、国際公開第2006/103107号パンフレット、国際公開第2006/108702号パンフレット、国際公開第2007/009823号パンフレット、国際公開第00/22140号パンフレット、国際公開第2006/063862号パンフレット、国際公開第2006/072603号パンフレット、国際公開第02/034923号パンフレット、EP06090134.5号明細書、EP06090228.5号明細書、EP06090227.7号明細書、EP07090007.1号明細書、EP07090009.7号明細書、国際公開第01/14569号パンフレット、国際公開第02/79410号パンフレット、国際公開第03/33540号パンフレット、国際公開第2004/078983号パンフレット、国際公開第01/19975号パンフレット、国際公開第95/26407号パンフレット、国際公開第96/34968号パンフレット、国際公開第98/20145号パンフレット、国際公開第99/12950号パンフレット、国際公開第99/66050号パンフレット、国際公開第99/53072号パンフレット、米国特許第6,734,341号明細書、国際公開第00/11192号パンフレット、国際公開第98/22604号パンフレット、国際公開第98/32326号パンフレット、国際公開第01/98509号パンフレット、国際公開第01/98509号パンフレット、国際公開第2005/002359号パンフレット、米国特許第5,824,790号明細書、米国特許第6,013,861号明細書、国際公開第94/04693号パンフレット、国際公開第94/09144号パンフレット、国際公開第94/11520号パンフレット、国際公開第95/35026号パンフレット又は国際公開第97/20936号パンフレットに記載されるもの、又はEP0663956号明細書、国際公開第96/01904号パンフレット、国際公開第96/21023号パンフレット、国際公開第98/39460号パンフレット、及び国際公開第99/24593号パンフレットに開示されるとおりの、ポリフルクトース、特にイヌリン及びレバン型のポリフルクトースの産生、国際公開第95/31553号パンフレット、米国特許出願公開第2002031826号明細書、米国特許第6,284,479号明細書、米国特許第5,712,107号明細書、国際公開第97/47806号パンフレット、国際公開第97/47807号パンフレット、国際公開第97/47808号パンフレット及び国際公開第00/14249号パンフレットに開示されるとおりのα-1,4-グルカン類の産生、国際公開第00/73422号パンフレットに開示されるとおりのα-1,6分枝α-1,4-グルカンの産生、例えば、国際公開第00/47727号パンフレット、国際公開第00/73422号パンフレット、EP06077301.7号明細書、米国特許第5,908,975号明細書及びEP0728213号明細書に開示されるとおりのアルテルナンの産生、例えば、国際公開第2006/032538号パンフレット、国際公開第2007/039314号パンフレット、国際公開第2007/039315号パンフレット、国際公開第2007/039316号パンフレット、特開2006-304779号公報、及び国際公開第2005/012529号パンフレットに開示されるとおりのヒアルロナンの産生に関わる酵素が挙げられる。
・耐乾性を改善する遺伝子。例えば、国際公開第2013122472号パンフレットは、機能性ユビキチンタンパク質リガーゼタンパク質(UPL)タンパク質、より具体的にはUPL3が存在しないか又はそのレベルが低下すると、前記植物の水要求の減少又は耐乾性の向上につながることを開示している。耐乾性が増加したトランスジェニック植物の他の例が、例えば、米国特許出願公開第2009/0144850号明細書、米国特許出願公開第2007/0266453号明細書、及び国際公開第2002/083911号パンフレットに開示されている。米国特許出願公開第2009/0144850号明細書は、DR02核酸の発現の変化に起因して耐乾性表現型を呈する植物について記載している。米国特許出願公開第2007/0266453号明細書は、DR03核酸の発現の変化に起因して耐乾性表現型を呈する植物について記載し、及び国際公開第2002/083911号パンフレットは、孔辺細胞で発現するABCトランスポーターの活性の低下に起因して干ばつストレスに対する抵抗性が増加した植物について記載している。別の例はKasuga及び共著者ら(1999)による研究であり、彼らは、トランスジェニック植物におけるDREB1 AをコードするcDNAの過剰発現が、正常な生育条件下で多くのストレス耐性遺伝子の発現を活性化し、耐乾性、食塩負荷耐性、及び耐凍性の改善をもたらしたことを記載している。しかしながら、DREB1Aの発現はまた、正常な生育条件下で重大な成長遅延ももたらした(Kasuga(1999)Nat Biotechnol 17(3)287-291)。
雑種植物は、典型的には純系植物と比較して有利な農業形質を有する。しかしながら、自家受粉植物については、雑種の生成には難題が伴い得る。種々の植物タイプにおいて、植物の稔性、より詳細には雄性稔性に重要な遺伝子が同定されている。例えば、トウモロコシでは、稔性において重大な少なくとも2つの遺伝子が同定されている(Amitabh Mohanty International Conference on New Plant Breeding Molecular Technologies Technology Development And Regulation,Oct 9-10,2014,Jaipur,India;Svitashev et al.Plant Physiol.2015 Oct;169(2):931-45;Djukanovic et al.Plant J.2013 Dec;76(5):888-99)。本明細書に提供される方法は、容易に交雑させて雑種を生成し得る雄性不稔植物を生成するため雄性稔性に必要な遺伝子を標的化するのに用いることができる。詳細な実施形態では、本明細書に提供されるCpf1 CRISPR系がシトクロムP450様遺伝子(MS26)又はメガヌクレアーゼ遺伝子(MS45)の標的突然変異誘発に用いられ、それによりトウモロコシ植物に雄性不稔が付与される。このように遺伝的に変化したトウモロコシ植物は、雑種育種計画に使用することができる。
詳細な実施形態では、本明細書に提供される方法を用いてコメ植物などの植物の稔性期が延長される。例えば、Ehd3などのコメ稔性期遺伝子を標的化することによりその遺伝子に突然変異を生成することができ、延長された再生植物稔性期に関して小植物を選択することができる(CN 104004782号明細書に記載されるとおり)
作物植物における野生生殖質の利用可能性及び遺伝的変異は作物改良計画の鍵であるが、作物植物からの利用可能な生殖質の多様性は限られている。本発明は、目的の生殖質に遺伝的変異の多様性を生じさせる方法を想定する。Cpf1 CRISPR系のこの適用では、植物ゲノム内の種々の位置を標的化するガイドRNAのライブラリが提供され、Cpf1エフェクタータンパク質と共に植物細胞に導入される。このようにして、ゲノム規模の点突然変異及び遺伝子ノックアウトのコレクションを生成することができる。詳細な実施形態では、本方法は、そのように得られた細胞から植物部位又は植物を生成するステップ、及び目的の形質に関して細胞をスクリーニングするステップを含む。標的遺伝子はコード領域及び非コード領域の両方を含み得る。詳細な実施形態では、形質はストレス耐性であり、本方法は、ストレス耐性作物品種の生成方法である。
熟成は、果実及び野菜の成熟過程における通常の段階である。熟成が始まると、それにより僅か数日で果実又は野菜は食べるのに適さないものとなる。この過程は農業従事者及び消費者の双方に著しい損失をもたらす。詳細な実施形態では、本発明の方法を用いてエチレン産生を低下させる。これは、以下の1つ以上を確実にすることにより確実にされる:a.ACCシンターゼ遺伝子発現の抑制。ACC(1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸)シンターゼは、S-アデノシルメチオニン(SAM)からACCへの変換;エチレン生合成における2番目から最後への段階に関与する酵素である。植物のゲノムにシンターゼ遺伝子のアンチセンス(「鏡像」)又はトランケート型コピーが挿入されると、酵素発現が妨げられる;b.ACCデアミナーゼ遺伝子の挿入。この酵素をコードする遺伝子は、一般的な非病原性土壌細菌であるシュードモナス・クロロラフィス(Pseudomonas chlororaphis)から得られる。これはACCを別の化合物に変換し、それによりエチレン産生に利用可能なACC量を低下させる;c.SAMヒドロラーゼ遺伝子の挿入。この手法はACCデアミナーゼと同様であり、ここではその代謝産物前駆体の量を低下させるとエチレン産生が妨げられる;この場合SAMはホモセリンに変換される。この酵素をコードする遺伝子は、大腸菌(E.coli)T3バクテリオファージから得られる、及びd.ACCオキシダーゼ遺伝子発現の抑制。ACCオキシダーゼは、エチレン生合成経路の最後の段階であるACCからエチレンへの酸化を触媒する酵素である。本明細書に記載される方法を用いてACCオキシダーゼ遺伝子を下方制御すると、エチレン産生が抑制されることになり、それにより果実の熟成が遅延する。詳細な実施形態では、上記に記載される改変に加えて又は代えて、本明細書に記載される方法はエチレン受容体の改変に用いられ、それにより果実が得るエチレンシグナルを妨害する。詳細な実施形態では、エチレン結合タンパク質をコードするETR1遺伝子の発現が改変され、より詳細には抑制される。詳細な実施形態では、上記に記載される改変に加えて又は代えて、本明細書に記載される方法は、植物細胞壁の完全性を維持する物質ペクチンの分解に関与する酵素であるポリガラクツロナーゼ(PG)をコードする遺伝子の発現の改変に用いられる。ペクチン分解は熟成過程の始めに起こり、果実の軟化をもたらす。従って、詳細な実施形態では、本明細書に記載される方法を用いてPG遺伝子に突然変異を導入するか、又はPG遺伝子の活性化を抑制することによりPG酵素の産生量を低下させて、それによりペクチン分解を遅延させる。
詳細な実施形態では、本発明の方法を用いて、植物又は植物部位の貯蔵寿命に影響を及ぼす化合物の産生に関わる遺伝子が改変される。より詳細には、改変は、ジャガイモ塊茎における還元糖の蓄積を防止する遺伝子における改変である。高温処理を行うと、これらの還元糖が遊離アミノ酸と反応し、褐色の苦味がある生産品となり、且つ潜在的発癌物質であるアクリルアミドレベルが上昇する。詳細な実施形態では、本明細書に提供される方法を用いて液胞型インベルターゼ遺伝子(VInv)(スクロースをグルコースとフルクトースとに分解するタンパク質をコードする)の発現を低下させ、又は阻害する(Clasen et al.DOI:10.1111/pbi.12370)。
詳細な実施形態では、Cpf1 CRISPR系を用いて、栄養的に改良された農業作物が作製される。詳細な実施形態では、本明細書に提供される方法は、「機能性食品」、即ちそれが含有する従来の栄養素を超えた健康上の利益を提供し得る改変された食品又は食品成分、及び/又は「ニュートラシューティカルズ」、即ち食品又は食品の一部と見なすことができ、且つ疾患の予防及び治療を含めた健康上の利益を提供する物質を生成するように適合される。詳細な実施形態では、ニュートラシューティカルズは、癌、糖尿病、心血管疾患、及び高血圧症のうちの1つ以上の予防及び/又は治療に有用である。
・バヒアグラス(Luciani et al.2005,Florida Genetics Conference Poster)、キャノーラ(Roesler et al.,1997,Plant Physiol 113 75-81)、トウモロコシ(Cromwell et al,1967,1969 J Anim Sci 26 1325-1331、O’Quin et al.2000 J Anim Sci 78 2144-2149、Yang et al.2002,Transgenic Res 11 11-20、Young et al.2004,Plant J 38 910-922)、ジャガイモ(Yu J and Ao,1997 Acta Bot Sin 39 329-334;Chakraborty et al.2000,Proc Natl Acad Sci USA 97 3724-3729;Li et al.2001)Chin Sci Bull 46 482-484、コメ(Katsube et al.1999,Plant Physiol 120 1063-1074)、ダイズ(Dinkins et al.2001,Rapp 2002,In Vitro Cell Dev Biol Plant 37 742-747)、サツマイモ(Egnin and Prakash 1997,In Vitro Cell Dev Biol 33 52A)に関して記載されているものなど、改変されたタンパク質品質、含有量及び/又はアミノ酸組成。
・キャノーラ(Falco et al.1995,Bio/Technology 13 577-582)、ルピナス(White et al.2001,J Sci Food Agric 81 147-154)、トウモロコシ(Lai and Messing,2002,Agbios 2008 GM crop database(March 11,2008))、ジャガイモ(Zeh et al.2001,Plant Physiol 127 792-802)、モロコシ(Zhao et al.2003,Kluwer Academic Publishers,Dordrecht,The Netherlands,pp 413-416)、ダイズ(Falco et al.1995 Bio/Technology 13 577-582;Galili et al.2002 Crit Rev Plant Sci 21 167-204)に関して記載されているものなど、必須アミノ含有量。
・キャノーラ(Dehesh et al.(1996)Plant J 9 167-172 [PubMed];Del Vecchio(1996)INFORM International News on Fats,Oils and Related Materials 7 230-243;Roesler et al.(1997)Plant Physiol 113 75-81 [PMC free article][PubMed];Froman and Ursin(2002,2003)Abstracts of Papers of the American Chemical Society 223 U35;James et al.(2003)Am J Clin Nutr 77 1140-1145[PubMed];Agbios(2008,上記);ワタ(Chapman et al.(2001).J Am Oil Chem Soc 78 941-947;Liu et al.(2002)J Am Coll Nutr 21 205S-211S [PubMed];O’Neill(2007)Australian Life Scientist.http://www.biotechnews.com.au/index.php/id;866694817;fp;4;fpid;2(June 17,2008))、リンシード(Abbadi et al.,2004,Plant Cell 16:2734-2748)、トウモロコシ(Young et al.,2004,Plant J 38 910-922)、油ヤシ(Jalani et al.1997,J Am Oil Chem Soc 74 1451-1455;Parveez,2003,AgBiotechNet 113 1-8)、コメ(Anai et al.,2003,Plant Cell Rep 21 988-992)、ダイズ(Reddy and Thomas,1996,Nat Biotechnol 14 639-642;Kinney and Kwolton,1998,Blackie Academic and Professional,London,pp 193-213)、ヒマワリ(Arcadia,Biosciences 2008)に関するなどの、油及び脂肪酸
・チコリ(Smeekens(1997)Trends Plant Sci 2 286-287、Sprenger et al.(1997)FEBS Lett 400 355-358、Sevenier et al.(1998)Nat Biotechnol 16 843-846)、トウモロコシ(Caimi et al.(1996)Plant Physiol 110 355-363)、ジャガイモ(Hellwege et al.,1997 Plant J 12 1057-1065)、サトウダイコン(Smeekens et al.1997,上記)に関して記載されるフルクタン、ジャガイモに関して記載されるなどのイヌリン(Hellewege et al.2000,Proc Natl Acad Sci USA 97 8699-8704)、コメに関して記載されるなどのデンプン(Schwall et al.(2000)Nat Biotechnol 18 551-554、Chiang et al.(2005)Mol Breed 15 125-143)など、炭水化物、
・キャノーラ(Shintani and DellaPenna(1998)Science 282 2098-2100)、トウモロコシ(Rocheford et al.(2002).J Am Coll Nutr 21 191S-198S,Cahoon et al.(2003)Nat Biotechnol 21 1082-1087、Chen et al.(2003)Proc Natl Acad Sci USA 100 3525-3530)、カラシ種子(Shewmaker et al.(1999)Plant J 20 401-412、ジャガイモ(Ducreux et al.,2005,J Exp Bot 56 81-89)、コメ(Ye et al.(2000)Science 287 303-305、イチゴ(Agius et al.(2003),Nat Biotechnol 21 177-181)、トマト(Rosati et al.(2000)Plant J 24 413-419、Fraser et al.(2001)J Sci Food Agric 81 822-827、Mehta et al.(2002)Nat Biotechnol 20 613-618、Diaz de la Garza et al.(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101 13720-13725、Enfissi et al.(2005)Plant Biotechnol J 3 17-27、DellaPenna(2007)Proc Natl Acad Sci USA 104 3675-3676に関して記載されるなどのビタミン類及びカロテノイド類。
・リンゴ(スチルベン類、Szankowski et al.(2003)Plant Cell Rep 22:141-149)、アルファルファ(レスベラトロール、Hipskind and Paiva(2000)Mol Plant Microbe Interact 13 551-562)、キーウィ(レスベラトロール、Kobayashi et al.(2000)Plant Cell Rep 19 904-910)、トウモロコシ及びダイズ(フラボノイド類、Yu et al.(2000)Plant Physiol 124 781-794)、ジャガイモ(アントシアニン及びアルカロイドグリコシド、Lukaszewicz et al.(2004)J Agric Food Chem 52 1526-1533)、コメ(フラボノイド類及びレスベラトロール、Stark-Lorenzen et al.(1997)Plant Cell Rep 16 668-673、Shin et al.(2006)Plant Biotechnol J 4 303-315)、トマト(+レスベラトロール、クロロゲン酸、フラボノイド類、スチルベン;Rosati et al.(2000)上記、Muir et al.(2001)Nature 19 470-474、Niggeweg et al.(2004)Nat Biotechnol 22 746-754、Giovinazzo et al.(2005)Plant Biotechnol J 3 57-69)、コムギ(コーヒー酸及びフェルラ酸、レスベラトロール;United Press International(2002))に関して記載されるなどの機能性二次代謝産物;及び
・アルファルファ(フィターゼ、Austin-Phillips et al.(1999)http://www.molecularfarming.com/nonmedical.html)、レタス(lettuse)(鉄、Goto et al.(2000)Theor Appl Genet 100 658-664)、コメ(鉄、Lucca et al.(2002)J Am Coll Nutr 21 184S-190S)、トウモロコシ、ダイズ及びコムギ(wheate)(フィターゼ、Drakakaki et al.(2005)Plant Mol Biol 59 869-880、Denbow et al.(1998)Poult Sci 77 878-881、Brinch-Pedersen et al.(2000)Mol Breed 6 195-206)に関して記載されるなどのミネラル利用可能性。
・ニンジンに存在するα-カロチン(細胞に損傷を引き起こし得るフリーラジカルを中和する)又は様々な果実及び野菜に存在するβ-カロチン(フリーラジカルを中和する)など、カロテノイド類
・緑色野菜に存在するルテイン(健康な視力の維持に寄与する)、
・トマト及びトマト製品に存在するリコペン(前立腺癌のリスクを低減すると考えられている)
・柑橘類及びトウモロコシに存在するゼアキサンチン(健康な視力の維持に寄与する)、
・小麦ふすまに存在する不溶性繊維などの食物繊維(乳癌及び/又は結腸癌のリスクを低減し得る)及びオートムギに存在するβ-グルカン、サイリウム及び全粒穀物に存在する可溶性繊維(心血管疾患(CVD)のリスクを低減し得る)
・ω-3脂肪酸などの脂肪酸(CVDのリスクを低減し、且つ精神機能及び視覚機能を改善し得る)、共役リノール酸(体組成を改善し得る、ある種の癌のリスクを減少させ得る)、及びGLA(癌及びCVDの炎症リスクを低減し得る、体組成を改善し得る)
・抗酸化剤様活性を有するコムギに存在するヒドロキシ桂皮酸などのフラボノイド類は、変性疾患のリスクを低減し得る、果実及び野菜に存在するフラボノール類、カテキン類及びタンニン類(フリーラジカルを中和し、且つ癌のリスクを低減し得る)
・アブラナ科の野菜(ブロッコリー、ケール)、セイヨウワサビに存在する、スルホラファンなど、グルコシノレート類、インドール類、イソチオシアネート類(フリーラジカルを中和し、癌のリスクを低減し得る)
・ブドウに存在するスチルベン類などのフェノール類(変性疾患、心疾患、及び癌のリスクを低減し得る、長寿効果を有し得る)並びに野菜及び柑橘類に存在するコーヒー酸及びフェルラ酸(抗酸化剤様活性を有する)、変性疾患、心疾患、及び眼疾患のリスクを低減し得る、及びカカオに存在するエピカテキン(抗酸化剤様活性を有する、変性疾患及び心疾患のリスクを低減し得る)
・トウモロコシ、ダイズ、コムギ及び木由来のオイル(wooden oil)に存在する植物スタノール/ステロール(血中コレステロール値を下げることにより冠動脈心疾患のリスクを低減し得る)
・キクイモ、エシャロット、オニオンパウダーに存在するフルクタン類、イヌリン類、フラクトオリゴ糖類(胃腸の健康を改善し得る)
・ダイズに存在するサポニン類(LDLコレステロールを下げ得る)
・ダイズに存在するダイズタンパク質(心疾患のリスクを低減し得る)
・ダイズに存在するイソフラボン類などのフィトエストロゲン類(のぼせなどの閉経症状を低減し得る、骨粗鬆症及びCVDを低減し得る)及び亜麻、ライムギ及び野菜に存在するリグナン類(心疾患及び幾つかの癌から保護し得る、LDLコレステロール、総コレステロールを下げ得る)。
・タマネギ、ニンニク、オリーブ、ニラ及びワケギ(scallon)に存在する硫化ジアリルなどの硫化物及びチオール類、並びにアブラナ科の野菜に存在するアリルメチルトリスルフィド、ジチオールチオン類(LDLコレステロールを下げ得る、健康な免疫系を維持する助けとなる)
・クランベリー、ココアに存在するプロアントシアニジン類などのタンニン類(尿路の健康を改善し得る、CVD及び高血圧のリスクを低減し得る)
・等。
詳細な実施形態では、本明細書に提供される方法を用いて、植物が消費者にとってより安全なものとなるよう、アレルゲンレベルが低下した植物が作成される。詳細な実施形態では、本方法は、植物アレルゲンの生成に関与する1つ以上の遺伝子の発現を改変するステップを含む。例えば、詳細な実施形態では、本方法は、ライグラス植物細胞などの植物細胞のLol p5遺伝子の発現を下方制御するステップ、及び前記植物の花粉のアレルゲン性を低下させるためそれらの植物細胞から植物を再生するステップを含む(Bhalla et al.1999,Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.96:11676-11680)。
本明細書に提供される方法は、更に、栄養的付加価値のある構成成分の産生に関与する価値コード酵素の遺伝子、又は一般に種、門、及び植物界にわたって目的の農業形質に影響を及ぼす遺伝子の同定を可能にする。例えば植物における代謝経路の酵素をコードする遺伝子を本明細書に記載されるとおりのCpf1 CRISPR系を用いて選択的に標的化することにより、植物のある種の栄養的側面に関与する遺伝子を同定することができる。同様に、望ましい農業形質に影響を及ぼし得る遺伝子を選択的に標的化することにより、関連性のある遺伝子を同定することができる。従って、本発明は、特定の栄養価及び/又は農業形質を有する化合物の生成に関与する酵素をコードする遺伝子のスクリーニング方法を包含する。
バイオ燃料生成におけるCpf1 CRISPR系の使用
用語「バイオ燃料」は、本明細書で使用されるとき、植物及び植物由来の資源から作られる代替燃料である。再生可能バイオ燃料は、エネルギーが炭素固定の過程を通じて得られてきた有機物から抽出することができ、又はバイオマスの使用若しくは変換によって作られる。このバイオマスはバイオ燃料に直接使用してもよく、又は熱変換、化学変換、及び生化学変換によって好都合なエネルギー含有物質に変換されてもよい。このバイオマス変換により、固体、液体、又は気体の形態の燃料が得られ得る。バイオ燃料には、バイオエタノールとバイオディーゼルとの2種類がある。バイオエタノールは、主として、大部分がトウモロコシ及びサトウキビに由来するセルロース(デンプン)の糖発酵プロセスによって生産される。他方でバイオディーゼルは、主として、ナタネ、ヤシ、及びダイズなどの油料作物から生産される。バイオ燃料は主として輸送機関に用いられる。
詳細な実施形態では、発酵に際して糖類がより効率的に放出されるよう主要な加水分解剤によるアクセスを容易にするため、本明細書に記載されるとおりのCpf1 CRISPR系を使用する本方法を用いて細胞壁の特性を変化させる。詳細な実施形態では、セルロース及び/又はリグニンの生合成が改変される。セルロースは細胞壁の主要な構成成分である。セルロース及びリグニンの生合成は共調節される。植物中のリグニンの割合を低下させることにより、セルロースの割合を増加させることができる。詳細な実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて植物におけるリグニン生合成が下方制御され、それにより発酵性糖質を増加させる。より詳細には、国際公開第2008064289 A2号パンフレットに開示されるとおり、本明細書に記載される方法を用いて、4-クマル酸3-ヒドロキシラーゼ(C3H)、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)、桂皮酸-4-ヒドロキシラーゼ(C4H)、ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ(HCT)、コーヒー酸O-メチルトランスフェラーゼ(COMT)、カフェオイルCoA3-O-メチルトランスフェラーゼ(CCoAOMT)、フェルラ酸5-ヒドロキシラーゼ(F5H)、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ(CAD)、シンナモイルCoA-レダクターゼ(CCR)、4-クマル酸-CoAリガーゼ(4CL)、モノリグノール-リグニン特異的グリコシルトランスフェラーゼ、及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)からなる群から選択される少なくとも第1のリグニン生合成遺伝子が下方制御される。
詳細な実施形態において、本明細書に提供されるCpf1酵素は組換え微生物によるバイオエタノールの生産に用いられる。例えば、Cpf1を用いて酵母などの微生物をエンジニアリングすることにより、発酵性糖類からバイオ燃料又は生体高分子を作成することができ、及び任意選択で発酵性糖類の供給源としての農業廃棄物から得られた植物由来のリグノセルロースを分解することが可能である。より詳細には、本発明は、Cpf1 CRISPR複合体を用いてバイオ燃料生成に必要な外因性遺伝子を微生物に導入し、及び/又はバイオ燃料合成を妨げ得る内因性遺伝子を改変する方法を提供する。より詳細には、本方法は、ピルビン酸からエタノール又は別の目的の産物への変換に関与する酵素をコードする1つ以上のヌクレオチド配列を酵母などの微生物に導入するステップを含む。詳細な実施形態では、本方法は、セルラーゼなど、微生物によるセルロースの分解を実現する1つ以上の酵素の導入を確実にする。更に別の実施形態では、Cpf1 CRISPR複合体を用いて、バイオ燃料生成経路と競合する内因性代謝経路が改変される。
-植物細胞壁分解酵素をコードする少なくとも1つの異種核酸が導入され、又は少なくとも1つの内因性核酸の発現が増加し、従って前記微生物は前記核酸の発現、並びに前記植物細胞壁分解酵素の産生及び分泌が可能となる;
-任意選択で、アセトアルデヒドをエタノールに変換する酵素をコードする少なくとも1つの異種核酸との組み合わせで、ピルビン酸をアセトアルデヒドに変換する酵素をコードする少なくとも1つの異種核酸が導入され、又は少なくとも1つの内因性核酸の発現が増加し、そのため前記宿主細胞は前記核酸の発現が可能となり;及び/又は
-前記宿主細胞における代謝経路の酵素をコードする少なくとも1つの核酸が改変され(ここで前記経路はピルビン酸からアセトアルデヒド又はアセトアルデヒドからエタノール以外の代謝産物を産生し、及び前記改変は前記代謝産物の産生の低下をもたらす)、又は前記酵素の阻害因子をコードする少なくとも1つの核酸が導入される。
トランスジェニックの藻類又はセイヨウアブラナなどの他の植物は、例えばアルコール類(特にメタノール及びエタノール)など、植物油又はバイオ燃料の生成に特に有用であり得る。これらは、油又はバイオ燃料産業で使用される高レベルの油又はアルコールを発現又は過剰発現するようにエンジニアリングされ得る。
詳細な実施形態では、本発明の方法を用いて、脂肪酸メチルエステル類(「FAME」)及び脂肪酸エチルエステル類(「FAEE」)など、脂肪酸エステル類の産生能を有する遺伝子操作微生物が作成される。詳細な実施形態では、藻類細胞によって産生される脂質の量及び/又は脂質の質の改変に関与する遺伝子を特異的に改変することが想定される。脂肪酸合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子は、例えば、アセチル-CoAカルボキシラーゼ、脂肪酸シンターゼ、3-ケトアシルアシルキャリアータンパク質シンターゼIII、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(phospate deshydrogenase)(G3PDH)、エノイルアシルキャリアータンパク質レダクターゼ(エノイル-ACP-レダクターゼ)、グリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ又はジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、リン脂質:ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ(phoshatidate phosphatase)、パルミトイル(palmitoyi)タンパク質チオエステラーゼなどの脂肪酸チオエステラーゼ、又はリンゴ酸酵素活性を有するタンパク質をコードすることができる。更なる実施形態では、脂質蓄積が増加した珪藻類を作成することが想定される。これは、脂質異化を減少させる遺伝子を標的化することによって実現し得る。トリアシルグリセロール及び遊離脂肪酸の両方の活性化に関わる遺伝子、並びにアシル-CoAシンテターゼ、3-ケトアシル-CoAチオラーゼ、アシル-CoAオキシダーゼ活性及びホスホグルコムターゼなどの脂肪酸のβ酸化に直接関わる遺伝子が、本発明の方法で用いるのに特に有益である。本明細書に記載されるCpf1 CRISPR系及び方法を用いると、その脂質含有量が増加するように珪藻類のかかる遺伝子を特異的に活性化させることができる。
詳細な実施形態では、本発明の方法は、脂肪酸メチルエステル類(「FAME」)及び脂肪酸エチルエステル類(「FAEE」)など、脂肪酸エステル類の産生能を有する遺伝子操作された微生物の作成に用いられる。
本明細書に提供される方法は、有機酸産生能、より詳細にはペントース又はヘキソース糖類からの有機酸産生能を有する微生物のエンジニアリングに更に用いられる。詳細な実施形態では、本方法は、外因性LDH遺伝子を微生物に導入するステップを含む。詳細な実施形態では、それに加えて又は代えて、目的の有機酸以外の代謝産物を産生する内因性代謝経路であって、有機酸を消費する内因性代謝経路に関わるタンパク質をコードする内因性遺伝子を不活性化することにより、前記微生物における有機酸産生を増加させる。詳細な実施形態では、この改変により、目的の有機酸以外の代謝産物の産生が低下することが確実となる。詳細な実施形態によれば、本方法は、有機酸が消費される内因性経路の少なくとも1つのエンジニアリングされた遺伝子欠失及び/又は不活性化、又は目的の有機酸以外の代謝産物を作り出す内因性経路に関わる産物をコードする遺伝子の導入に用いられる。詳細な実施形態では、少なくとも1つのエンジニアリングされた遺伝子欠失又は不活性化は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ(pdc)、フマル酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ(adh)、acetアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、D-乳酸デヒドロゲナーゼ(d-ldh)、L-乳酸デヒドロゲナーゼ(l-ldh)、乳酸2-モノオキシゲナーゼからなる群から選択される酵素をコードする1つ以上の遺伝子にある。更なる実施形態において、少なくとも1つのエンジニアリングされた遺伝子欠失及び/又は不活性化は、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする内因性遺伝子(pdc)にある。
詳細な実施形態では、Cpf1 CRISPR系は、酵母株を利用した改良キシロース又はセロビオースの選択に適用し得る。エラープローンPCRを用いて、キシロース利用又はセロビオース利用経路に関わる1つ(又は複数)の遺伝子を増幅することができる。キシロース利用経路及びセロビオース利用経路に関わる遺伝子の例としては、限定なしに、Ha,S.J.,et al.(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108(2):504-9及びGalazka,J.M.,et al.(2010)Science 330(6000):84-6に記載されるものを挙げることができる。各々がかかる選択の遺伝子にランダム突然変異を含む得られた二本鎖DNA分子ライブラリは、Cpf1 CRISPR系の構成成分と共に酵母株(例えばS288C)に共形質転換してもよく、国際公開第2015138855号パンフレットに記載されるとおり、キシロース又はセロビオース利用能が増強された株を選択することができる。
Tadas Jakociunas et al.は、パン酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)において1回の形質転換ステップで最大5つの異なるゲノム遺伝子座をゲノムエンジニアリングすることへの多重Cpf1 CRISPR系の適用に成功したことについて記載しており(Metabolic Engineering Volume 28,March 2015,Pages 213-222)、工業的に重要なイソプレノイド生合成経路にとって鍵となる中間体であるメバロン酸高産生株が得られている。詳細な実施形態では、イソプレノイド合成に用いられる更なる高産生酵母株を同定するため、本明細書に記載されるとおりの多重ゲノムエンジニアリング方法においてCpf1 CRISPR系が適用されてもよい。
別の実施形態において、多重Cpf1 CRISPR系の適用の成功が企図される。Vratislav Stovicek et al.(Metabolic Engineering Communications,Volume 2,December 2015,Pages 13-22)と同様に、改良乳酸産生株を設計し、単一の形質転換イベントで得ることができる。詳細な実施形態では、Cpf1 CRISPR系を用いて異種乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の挿入と2つの内因性遺伝子PDC1及びPDC5遺伝子の破壊とが同時に行われる。
詳細な実施形態では、本明細書に記載されるCRISPR系、及び好ましくはCpf1 CRISPR系を用いて遺伝因子ダイナミクスを視覚化することができる。例えば、CRISPRイメージングは、反復ゲノム配列又は非反復ゲノム配列のいずれかを視覚化し、テロメア長の変化及びテロメアの動きを報告し、及び全細胞周期を通じた遺伝子座のダイナミクスをモニタすることができる(Chen et al.,Cell,2013)。これらの方法はまた、植物にも適用し得る。
本発明はまた、本明細書に提供される方法によって得ることのできる及びそれによって得られた植物及び酵母細胞も提供する。本明細書に記載される方法によって得られた改良植物は、例えば、植物害虫、除草剤、乾燥、低温又は高温、過剰な水等に対する耐性を確実にする遺伝子の発現により、食品又は飼料製造において有用となり得る。
ある態様において、本発明は、記載される実施形態のいずれかに係る真核生物宿主細胞を含む非ヒト真核生物;好ましくは多細胞真核生物を提供する。他の態様において、本発明は、記載される実施形態のいずれかに係る真核生物宿主細胞を含む真核生物;好ましくは多細胞真核生物を提供する。これらの態様の一部の実施形態における生物は、動物;例えば哺乳類であってもよい。また、生物は、昆虫などの節足動物であってもよい。生物はまた、植物であってもよい。更に、生物は真菌であってもよい。
家畜におけるウイルス標的には、一部の実施形態において、例えばブタマクロファージ上のブタCD163が含まれ得る。CD163は、PRRSv(アルテリウイルスであるブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス)による感染に関連する(ウイルスの細胞への侵入を介すると考えられている)。PRRSvが特にブタ肺胞マクロファージ(肺に見られる)に感染すると、飼育ブタの生殖障害、体重減少及び高死亡率を含めた被害をもたらす、以前は不治であったブタ症候群(「ミステリーブタ病」又は「青耳病」)が引き起こされる。マクロファージ活性が失われることによる免疫不全に起因して、流行性肺炎、髄膜炎及び耳浮腫などの日和見感染症が見られることが多い。また、抗生物質の使用増加及び金銭的損失に起因して、経済的及び環境的影響も大きい(毎年推定6億6千万ドル)。
明らかなとおり、本系を用いていかなる目的のポリヌクレオチド配列も標的化し得ることが想定される。本発明は、標的細胞をインビボ、エキソビボ又はインビトロで改変するために用いられる、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、又は前記組成物の構成成分をコードする1つ以上のポリヌクレオチド、又は前記組成物の構成成分をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター若しくは送達系を提供し、及び改変後はCRISPRにより改変された細胞の子孫又は細胞株が変化した表現型を保持するように細胞を変化させる形で行われ得る。改変された細胞及び子孫は、CRISPR系が所望の細胞型にエキソビボ又はインビボ適用された植物又は動物などの多細胞生物の一部であり得る。本CRISPR発明は、療法的治療方法であり得る。療法的治療方法には、遺伝子又はゲノム編集、又は遺伝子療法が含まれ得る。
本発明はまた、細菌、真菌及び寄生虫病原体の治療にも適用され得る。大部分の研究が新規抗生物質の開発に注力しているが、それにも関わらず、新規抗生物質は、開発後は同じ薬剤耐性問題に曝される。本発明は、それらの難題を解消する新規CRISPRベースの代替案を提供する。更に、既存の抗生物質と異なり、CRISPRベースの治療は病原体特異的なものとすることができ、有益な細菌を回避しながらも標的病原体の細菌細胞死を誘導し得る。
Cas媒介性ゲノム編集を用いれば、体細胞組織に保護突然変異を導入して非遺伝的疾患又は複合疾患と闘うことができる。例えば、リンパ球におけるCCR5受容体のNHEJ媒介性不活性化(Lombardo et al.,Nat Biotechnol.2007 Nov;25(11):1298-306)は、HIV感染を回避するのに実行可能な戦略であり得る一方、PCSK9(Cohen et al.,Nat Genet.2005 Feb;37(2):161-5)又はアンジオポエチン(Musunuru et al.,N Engl J Med.2010 Dec 2;363(23):2220-7)を欠失させると、スタチン抵抗性高コレステロール血症又は高脂血症に対する治療効果がもたらされ得る。これらの標的はまた、siRNA媒介性タンパク質ノックダウンを用いても対処し得るが、NHEJ媒介性遺伝子不活性化のユニークな利点は、治療を継続する必要なしに永久的な治療利益を実現する能力である。全ての遺伝子療法と同様に、当然ながら、各提案される治療使用が有利なリスク・ベネフィット比を有するよう確立することが重要となり得る。
本発明はまた、B型肝炎ウイルス(HBV)の治療にも適用することができる。しかしながら、CRISPR Cas系は、内因性低分子RNA経路が過飽和(oversatring)になるリスクなどのRNAiの欠点を回避するように、例えば用量及び配列を最適化するなどして適合させなければならない(例えば、Grimm et al.,Nature vol.441,26 May 2006を参照)。例えば、ヒト当たり約1~10×1014粒子などの低用量が企図される。別の実施形態において、HBVを標的とするCRISPR Cas系が、安定核酸脂質粒子(SNALP)などのリポソームで投与され得る(例えば、Morrissey et al.,Nature Biotechnology,Vol.23,No.8,August 2005を参照)。SNALP中約1、3又は5mg/kg/日の、HBV RNAに標的化されたCRISPR Casを毎日静脈内注射することが企図される。毎日の治療は約3日間にわたり、次に毎週、約5週間にわたり得る。別の実施形態において、Chen et al.のシステム(Gene Therapy(2007)14,11-19)を本発明のCRISPR Cas系に使用し及び/又は適合させることができる。Chen et al.は二本鎖アデノ随伴ウイルス8型偽型ベクター(dsAAV2/8)を使用してshRNAを送達する。HBV特異的shRNAを担持するdsAAV2/8ベクターの単回投与(マウス当たり1×1012ベクターゲノム)が、HBVトランスジェニックマウスの肝臓における安定したレベルのHBVタンパク質、mRNA及び複製DNAを有効に抑制し、循環中HBV負荷の最大2~3log10の低下がもたらされた。有意なHBV抑制はベクター投与後少なくとも120日間持続した。shRNAの治療効果は配列依存的で、インターフェロンの活性化は伴わなかった。本発明には、HBVを指向するCRISPR Cas 系をAAV2/8ベクターなどのAAVベクターにクローニングし、例えばヒト当たり約1×1015ベクターゲノム~約1×1016ベクターゲノムの投薬量でヒトに投与し得る。別の実施形態において、Wooddell et al.の方法(Molecular Therapy vol.21 no.5,973-985 May 2013)を、本発明のCRISPR Cas系に使用し及び/又は適合させることができる。Woodell et al.は、肝細胞標的化N-アセチルガラクトサミンコンジュゲートメリチン様ペプチド(NAG-MLP)と、凝固第VII因子(F7)を標的化する肝臓向性コレステロールコンジュゲートsiRNA(chol-siRNA)との単純な共注入が、マウス及び非ヒト霊長類において臨床化学の変化又はサイトカインの誘導なしに効率的なF7ノックダウンをもたらすことを示す。Wooddell et al.は、HBV感染症の一過性のトランスジェニックマウスモデルを使用して、NAG-MLPと、保存されたHBV配列を標的化する強力なchol-siRNAとの単回共注入が、ウイルスRNA、タンパク質、及びウイルスDNAのマルチログ(multilog)抑制をもたらし、効果が長時間にわたったことを示す。本発明には、例えば約6mg/kgのNAG-MLPと6mg/kgのHBV特異的CRISPR Casとの静脈内(intraveinous)共注入が想定され得る。代替例では、1日目に約3mg/kgのNAG-MLP及び3mg/kgのHBV特異的CRISPR Casが送達され、続いて2週間後に約2~3mg/kgのNAG~MLP及び約2~3mg/kgのHBV特異的CRISPR Casが投与されてもよい。
Gluckmann et al.の国際公開第2015/048577号パンフレット「CRISPR関連方法及び組成物(CRISPR-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS)」;Glucksmann et alの国際公開第2015/070083号パンフレット「統率gRNAを伴うCRISPR関連方法及び組成物(CRISPR-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS WITH GOVERNING gRNAS)」を含めた、標的遺伝子座にCas9系を使用して遺伝子療法で疾患に治療的に対処する方法について記載しているEditas Medicineの公開出願にあるものを含め、これまでTALEN及びZFNを使用して試みられたが成功は限られていた、且つCas9系の潜在的な標的と同定されている遺伝子突然変異を、本発明のCRISPR-Cas系を用いて補修することができる;一部の実施形態において、原発性開放隅角緑内障(POAG)の治療、予防又は診断が提供される。標的は、好ましくはMYOC遺伝子である。これは、国際公開第2015153780号パンフレット(その開示は本明細書によって参照により援用される)に記載される。
る。本系を用いて有用に治療し得るであろう病態又は疾患の一部の例は、本明細書に含まれる遺伝子の例及び参考文献に含まれ、及びそれらの病態に現在関連付けられ、同様にそこに提供される。例示される遺伝子及び病態は網羅的ではない。
本発明はまた、CRISPR-Cas系、具体的には本明細書に記載される新規CRISPRエフェクタータンパク質系を血液又は造血幹細胞(hematopoetic stem cell)に送達することも企図する。Wahlgren et al.の血漿エキソソーム(Nucleic Acids Research,2012,Vol.40,No.17 e130)が以前記載されており、これを利用してCRISPR Cas系を血液に送達し得る。本発明の核酸ターゲティング系は、異常ヘモグロビン症、例えばサラセミア及び鎌状赤血球症を治療することも企図される。例えば、本発明のCRISPR Cas系により標的化し得る潜在的標的については、国際公開第2013/126794号パンフレットを参照のこと。
用語「造血幹細胞」又は「HSC」は、HSCと見なされる細胞、例えば、他の全ての血球細胞を生じる、且つ中胚葉に由来し;ほとんどの骨の中心部に含まれる赤色髄に位置する血球細胞を広義に含むことが意図される。本発明のHSCには、小さいサイズ、系統(lin)マーカーの欠如、及び一連の分化クラスターに属するマーカー、例えば:CD34、CD38、CD90、CD133、CD105、CD45、及びまたc-kit(幹細胞因子の受容体)によって同定される、造血幹細胞の表現型を有する細胞が含まれる。造血幹細胞は、分化系列決定の検出に用いられるマーカーが陰性で、従ってLin-と呼ばれ;及び、FACSによるその精製中、幾つもの最大14個の異なる成熟血液系列マーカー、例えば、ヒトについて骨髄細胞のCD13及びCD33、赤血球細胞のCD71、B細胞のCD19、巨核球のCD61等;及び、B細胞のB220(マウスCD45)、単球のMac-1(CD11b/CD18)、顆粒球のGr-1、赤血球系細胞のTer119、T細胞のIl7Ra、CD3、CD4、CD5、CD8等。マウスHSCマーカー:CD34lo/-、SCA-1+、Thy1.1+/lo、CD38+、C-kit+、lin-、及びヒトHSCマーカー:CD34+、CD59+、Thy1/CD90+、CD38lo/-、C-kit/CD117+、及びlin-。HSCはマーカーによって同定される。従って本明細書で考察される実施形態において、HSCはCD34+細胞であり得る。HSCはまた、CD34-/CD38-である造血幹細胞であってもよい。当該技術分野でHSCと見なされる細胞表面上にc-kitを欠き得る幹細胞は本発明の範囲内にあり、並びにCD133+細胞も同様に当該技術分野ではHSCと見なされる。
本発明はまた、CRISPR-Cas系を脳又はニューロンに送達することも企図する。例えば、RNA干渉(RNAi)は、ハンチントン病の疾患原因遺伝子であるHTTの発現を低下させることによってこの障害に対する治療可能性を提供し(例えば、McBride et al.,Molecular Therapy vol.19 no.12 Dec.2011,pp.2152-2162を参照)、従って出願人は、それをCRISPR-Cas系に使用し及び/又は適合させることができると仮定する。CRISPR-Cas系は、アンチセンス配列のオフターゲットの可能性を低下させるアルゴリズムを使用して生成され得る。CRISPR-Cas配列は、マウス、アカゲザル又はヒトハンチンチンのいずれのエクソン52にある配列も標的とし、且つAAVなどのウイルスベクターで発現し得る。ヒトを含めた動物に、半球当たり約3回のマイクロインジェクション(合計6回の注入):最初は前交連から1mm吻側に(12μl)及び残りの2回の注入(それぞれ12μl及び10μl)は最初の注入から3及び6mm尾側に離して、1e12vg/mlのAAVによって約1μl/分の速度で注入されてもよく、注入液を針先端から拡散させるため、針はその場に更に5分間残された。
米国特許出願公開第20110023153号明細書は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用したアルツハイマー病に関連する細胞、動物及びタンパク質の遺伝子改変を記載している。一たび改変された細胞及び動物は、ADの試験で一般的に用いられる尺度-例えば、限定なしに、学習及び記憶、不安、抑欝、嗜癖、及び感覚運動機能を使用して、標的突然変異がADの発症及び/又は進行に及ぼす効果を研究するための公知の方法、並びに行動的、機能的、病理学的、代謝的(metaboloic)及び生化学的機能を計測するアッセイを用いて更に試験され得る。
米国特許出願公開第20110023146号明細書は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用したセクレターゼ関連障害に関連する細胞、動物及びタンパク質の遺伝子改変を記載している。セクレターゼは、プレタンパク質をその生物学的に活性な形態にプロセシングするために必須である。セクレターゼ経路の種々の構成成分の欠損は、多くの障害、特に、アルツハイマー病(AD)など、顕著な特徴であるアミロイド形成又はアミロイド斑を伴う障害に寄与する。
米国特許出願公開第20110023144号明細書は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用した筋萎縮性側索硬化症(amyotrophyic lateral sclerosis)(ALS)疾患に関連する細胞、動物及びタンパク質の遺伝子改変を記載している。ALSは、随意運動に関わる皮質、脳幹、及び脊髄における特定の神経細胞の漸進的で確実な変性によって特徴付けられる。
米国特許出願公開第20110023145号明細書は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用した自閉症スペクトラム障害(ASD)に関連する細胞、動物及びタンパク質の遺伝的改変を記載している。自閉症スペクトラム障害(ASD)は、社会的相互作用及びコミュニケーションの質的障害、並びに限定された反復的且つ常同的様式の行動、興味、及び活動によって特徴付けられる一群の障害である。3つの障害、自閉症、アスペルガー症候群(AS)及び特定不能の広汎性発達障害(PDD-NOS)は、種々の重症度、関連する知的機能及び医学的状態を伴う一連の同じ障害である。ASDは主に遺伝的に決定される障害であり、遺伝率は約90%である。
米国特許出願公開第20110016540号明細書は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用したトリヌクレオチドリピート伸長障害に関連する細胞、動物及びタンパク質の遺伝子改変を記載する。トリヌクレオチドリピート伸長障害は、発生神経生物学が関与し且つ多くの場合に認知並びに感覚運動機能に影響を及ぼす複合的な進行性障害である。
本発明はまた、CRISPR-Cas系を一方又は両方の耳に送達することも企図する。
例えば相同組換え(HR)は概して細胞周期G1期中に抑制されるため、非分裂(特に非分裂の、完全に分化した)細胞型は、遺伝子ターゲティング又はゲノムエンジニアリングで問題となる。しかしながら、細胞が正常なDNA修復システムを制御する機構を研究する間に、Durocherは、非分裂細胞でHRを「オフ」に保つこれまで知られていなかったスイッチを発見し、このスイッチを切り替えてオンに戻す戦略を考案した。Orthwein et al.(カナダ国OttawaのMount Sinai HospitalのDaniel Durocher研究室)は、最近、HRの抑制を解除することができ、腎臓(293T)及び骨肉腫(U2OS)の両方の細胞で遺伝子ターゲティングが成功裏に終わったことを示していることを報告した(Nature 16142,published online 9 Dec 2015)。腫瘍抑制因子BRCA1、PALB2及びBRAC2が、HRによるDNA DSB修復を促進することが知られている。彼らは、BRCA1とPALB2-BRAC2の複合体の形成が、その部位へのE3ユビキチンリガーゼによる作用など、PALB2上のユビキチン部位によって左右されることを見出した。このE3ユビキチンリガーゼは、カリン-3(CUL3)-RBX1と複合体になったKEAP1(PALB2相互作用タンパク質)で構成される。PALB2のユビキチン化がBRCA1とのその相互作用を抑制し、及びそれ自体が細胞周期調節下にある脱ユビキチン化酵素USP11によって無効にされる。G1中の相同組換えを誘導するには、USP11又はKEAP1に向けられるCRISPR-Cas9ベースの遺伝子ターゲティングアッセイを含め(pX459ベクターから発現する)、幾つもの方法によって計測されるとおり、BRCA1-PALB2相互作用がDNA-末端リセクションの活性化と相まって回復すれば十分である。しかしながら、KEAP1枯渇又はPALB2-KR突然変異体の発現のいずれかを用いてリセクションコンピテントなG1細胞でBRCA1-PALB2相互作用を回復させたとき、遺伝子ターゲティングイベントのロバストな増加が認められた。
本発明はまた、CRISPR-Cas系を一方又は両方の眼に送達することも企図する。
本発明はまた、本明細書に記載されるCRISPR-Cas系、例えばCpf1エフェクタータンパク質系を心臓に送達することも企図する。心臓に関しては、心筋向性アデノ随伴(adena-associated)ウイルス(AAVM)、詳細には心臓で優先的遺伝子導入を示したAAVM41が好ましい(例えば、Lin-Yanga et al.,PNAS,March 10,2009,vol.106,no.10を参照のこと)。投与は全身投与又は局所投与であってよい。全身投与には約1~10×1014ベクターゲノムの投薬量が企図される。例えば、Eulalio et al.(2012)Nature 492:376及びSomasuntharam et al.(2013)Biomaterials 34:7790も参照のこと。
D49B、VLA-2受容体のα2サブユニット))、CABIN1(カルシニューリン結合タンパク質1)、SHBG(性ホルモン結合グロブリン)、HMGB1(高移動度群ボックス1)、HSP90B2P(熱ショックタンパク質90kDa β(Grp94)、メンバー2(偽遺伝子))、CYP3A4(シトクロムP450、ファミリー3、サブファミリーA、ポリペプチド4)、GJA1(ギャップ結合タンパク質、α1、43kDa)、CAV1(カベオリン1、カベオラタンパク質、22kDa)、ESR2(エストロゲン受容体2(ER β))、LTA(リンホトキシンα(TNFスーパーファミリー、メンバー1))、GDF15(成長分化因子15)、BDNF(脳由来神経栄養因子)、CYP2D6(シトクロムP450、ファミリー2、サブファミリーD、ポリペプチド6)、NGF(神経成長因子(βポリペプチド))、SP1(Sp1転写因子)、TGIF1(TGFB誘導性因子ホメオボックス1)、SRC(v-src肉腫(シュミット-ルピンA-2(Schmidt-Ruppin A-2))ウイルス癌遺伝子ホモログ(トリ))、EGF(上皮成長因子(β-ウロガストロン))、PIK3CG(ホスホイノシチド-3-キナーゼ、触媒、γポリペプチド)、HLA-A(主要組織適合遺伝子複合体、クラスI、A)、KCNQ1(カリウム電位開口型チャネル、KQT様サブファミリー、メンバー1)、CNR1(カンナビノイド受容体1(脳))、FBN1(フィブリリン1)、CHKA(コリンキナーゼα)、BEST1(ベストロフィン1)、APP(アミロイドβ(A4)前駆体タンパク質)、CTNNB1(カテニン(カドヘリン関連タンパク質)、β1、88kDa)、IL2(インターロイキン2)、CD36(CD36分子(トロンボスポンジン受容体))、PRKAB1(プロテインキナーゼ、AMP活性化、β1非触媒サブユニット)、TPO(甲状腺ペルオキシダーゼ)、ALDH7A1(アルデヒドデヒドロゲナーゼ7ファミリー、メンバーA1)、CX3CR1(ケモカイン(C-X3-Cモチーフ)受容体1)、TH(チロシンヒドロキシラーゼ)、F9(凝固第IX因子)、GH1(成長ホルモン1)、TF(トランスフェリン)、HFE(ヘモクロマトーシス)、IL17A(インターロイキン17A)、PTEN(ホスファターゼ・テンシンホモログ)、GSTM1(グルタチオンS-トランスフェラーゼμ1)、DMD(ジストロフィン)、GATA4(GATA結合タンパク質4)、F13A1(凝固第XIII因子、A1ポリペプチド)、TTR(トランスサイレチン)、FABP4(脂肪酸結合タンパク質4、脂肪細胞)、PON3(パラオキソナーゼ3)、APOC1(アポリポタンパク質C-I)、INSR(インスリン受容体)、TNFRSF1B(腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー1B)、HTR2A(5-ヒドロキシトリプタミン(セロトニン)受容体2A)、CSF3(コロニー刺激因子3(顆粒球))、CYP2C9(シトクロムP450、ファミリー2、サブファミリーC、ポリペプチド9)、TXN(チオレドキシン)、CYP11B2(シトクロムP450、ファミリー11、サブファミリーB、ポリペプチド2)、PTH(副甲状腺ホルモン)、CSF2(コロニー刺激因子2(顆粒球マクロファージ))、KDR(キナーゼ挿入ドメイン受容体(III型受容体チロシンキナーゼ))、PLA2G2A(ホスホリパーゼA2、グループIIA(血小板、滑液))、B2M(β-2-ミクログロブリン)、THBS1(トロンボスポンジン1)、GCG(グルカゴン)、RHOA(rasホモログ遺伝子ファミリー、メンバーA)、ALDH2(アルデヒドデヒドロゲナーゼ2ファミリー(ミトコンドリア))、TCF7L2(転写因子7様2(T細胞特異的、HMGボックス))、BDKRB2(ブラジキニン受容体B2)、NFE2L2(核内因子(赤血球由来2)様2)、NOTCH1(Notchホモログ1、転座関連(ショウジョウバエ属(Drosophila)))、UGT1A1(UDPグルクロノシルトランスフェラーゼ1ファミリー、ポリペプチドA1)、IFNA1(インターフェロン、α1)、PPARD(ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体δ)、SIRT1(サーチュイン(サイレント交配型情報調節2ホモログ)1(S.セレビシエ(S.cerevisiae)))、GNRH1(ゴナドトロピン放出ホルモン1(黄体形成放出ホルモン))、PAPPA(妊娠関連血漿タンパク質A、パパリシン1)、ARR3(アレスチン3、レチナール(X-アレスチン))、NPPC(ナトリウム利尿ペプチド前駆体C)、AHSP(αヘモグロビン安定化タンパク質)、PTK2(PTK2プロテインチロシンキナーゼ2)、IL13(インターロイキン13)、MTOR(ラパマイシンの機構的標的(セリン/スレオニンキナーゼ))、ITGB2(インテグリン、β2(補体成分3受容体3及び4サブユニット))、GSTT1(グルタチオンS-トランスフェラーゼθ1)、IL6ST(インターロイキン6シグナル伝達因子(gp130、オンコスタチンM受容体))、CPB2(カルボキシペプチダーゼB2(血漿))、CYP1A2(シトクロムP450、ファミリー1、サブファミリーA、ポリペプチド2)、HNF4A(肝細胞核内因子4、α)、SLC6A4(溶質輸送担体ファミリー6(神経伝達物質輸送体、セロトニン)、メンバー4)、PLA2G6(ホスホリパーゼA2、VI群(細胞質型、カルシウム非依存性))、TNFSF11(腫瘍壊死因子(リガンド)スーパーファミリー、メンバー11)、SLC8A1(溶質輸送担体ファミリー8(ナトリウム/カルシウム交換体)、メンバー1)、F2RL1(凝固第II因子(トロンビン)受容体様1)、AKR1A1(アルド-ケトレダクターゼファミリー1、メンバーA1(アルデヒドレダクターゼ))、ALDH9A1(アルデヒドデヒドロゲナーゼ9ファミリー、メンバーA1)、BGLAP(骨γ-カルボキシグルタミン酸(gla)含有タンパク質)、MTTP(ミクロゾームトリグリセリド転移タンパク質)、MTRR(5-メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステインメチルトランスフェラーゼレダクターゼ)、SULT1A3(スルホトランスフェラーゼファミリー、細胞質型、1A、フェノール選択、メンバー3)、RAGE(腎腫瘍抗原)、C4B(補体成分4B(チド(Chido)血液型)、P2RY12(プリン受容体P2Y、Gタンパク質共役、12)、RNLS(リナラーゼ、FAD依存性アミンオキシダーゼ)、CREB1(cAMP応答エレメント結合タンパク質1)、POMC(プロオピオメラノコルチン)、RAC1(ras関連C3ボツリヌス毒素基質1(rhoファミリー、低分子GTP結合タンパク質Rac1))、LMNA(ラミンNC)、CD59(CD59分子、補体調節タンパク質)、SCN5A(ナトリウムチャネル、電位開口型、V型、αサブユニット)、CYP1B1(シトクロムP450、ファミリー1、サブファミリーB、ポリペプチド1)、MIF(マクロファージ遊走阻害因子(グリコシル化阻害因子))、MMP13(マトリックスメタロペプチダーゼ13(コラゲナーゼ3))、TIMP2(TIMPメタロペプチダーゼ阻害因子2)、CYP19A1(シトクロムP450、ファミリー19、サブファミリーA、ポリペプチド1)、CYP21A2(シトクロムP450、ファミリー21、サブファミリーA、ポリペプチド2)、PTPN22(タンパク質チロシンホスファターゼ、非受容体型22(リンパ球))、MYH14(ミオシン、重鎖14、非筋肉性)、MBL2(マンノース結合レクチン(プロテインC)2、可溶性(オプソニン欠損))、SELPLG(セレクチンPリガンド)、AOC3(アミンオキシダーゼ、銅含有3(血管接着タンパク質1))、CTSL1(カテプシンL1)、PCNA(増殖細胞核抗原)、IGF2(インスリン様成長因子2(ソマトメジンA))、ITGB1(インテグリン、β1(フィブロネクチン受容体、βポリペプチド、抗原CD29はMDF2、MSK12を含む))、CAST(カルパスタチン)、CXCL12(ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド12(ストロマ細胞由来因子1))、IGHE(免疫グロブリン重鎖定常ε)、KCNE1(カリウム電位開口型チャネル、Isk関連ファミリー、メンバー1)、TFRC(トランスフェリン受容体(p90、CD71))、COL1A1(コラーゲン、I型、α1)、COL1A2(コラーゲン、I型、α2)、IL2RB(インターロイキン2受容体、β)、PLA2G10(ホスホリパーゼA2、X群)、ANGPT2(アンギオポエチン2)、PROCR(プロテインC受容体、内皮(EPCR))、NOX4(NADPHオキシダーゼ4)、HAMP(ヘプシジン抗菌ペプチド)、PTPN11(タンパク質チロシンホスファターゼ、非受容体型11)、SLC2A1(溶質輸送担体ファミリー2(促進性グルコーストランスポーター)、メンバー1)、IL2RA(インターロイキン2受容体、α)、CCL5(ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド5)、IRF1(インターフェロン調節因子1)、CFLAR(CASP8及びFADD様アポトーシス調節因子)、CALCA(カルシトニン関連ポリペプチドα)、EIF4E(真核生物翻訳開始因子4E)、GSTP1(グルタチオンS-トランスフェラーゼπ1)、JAK2(ヤヌスキナーゼ2)、CYP3A5(シトクロムP450、ファミリー3、サブファミリーA、ポリペプチド5)、HSPG2(ヘパラン硫酸プロテオグリカン2)、CCL3(ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド3)、MYD88(ミエロイド分化一次応答遺伝子(88))、VIP(血管作動性腸管ペプチド)、SOAT1(ステロールO-アシルトランスフェラーゼ1)、ADRBK1(アドレナリン作動性、β、受容体キナーゼ1)、NR4A2(核内受容体サブファミリー4、グループA、メンバー2)、MMP8(マトリックスメタロペプチダーゼ8(好中球コラゲナーゼ))、NPR2(ナトリウム利尿ペプチド受容体B/グアニル酸シクラーゼB(心房性ナトリウム利尿ペプチド受容体B))、GCH1(GTPシクロヒドロラーゼ1)、EPRS(グルタミル-プロリル-tRNAシンテターゼ)、PPARGC1A(ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ、コアクチベーター1α)、F12(凝固第XII因子(ハーゲマン因子))、PECAM1(血小板/内皮細胞接着分子)、CCL4(ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド4)、SERPINA3(セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードA(α-1アンチプロテイナーゼ、アンチトリプシン)、メンバー3)、CASR(カルシウム感知受容体)、GJA5(ギャップ結合タンパク質、α5、40kDa)、FABP2(脂肪酸結合タンパク質2、腸)、TTF2(転写終結因子、RNAポリメラーゼII)、PROS1(プロテインS(α))、CTF1(カルジオトロフィン1)、SGCB(サルコグリカン、β(43kDaジストロフィン関連糖タンパク質))、YME1L1(YME1様1(S.セレビシエ(S.cerevisiae)))、CAMP(カテリシジン抗菌ペプチド)、ZC3H12A(ジンクフィンガーCCCH型含有12A)、AKR1B1(アルド-ケトレダクターゼファミリー1、メンバーB1(アルドースレダクターゼ))、DES(デスミン)、MMP7(マトリックスメタロペプチダーゼ7(マトリライシン、子宮))、AHR(アリール炭化水素受容体)、CSF1(コロニー刺激因子1(マクロファージ))、HDAC9(ヒストン脱アセチル化酵素9)、CTGF(結合組織成長因子)、KCNMA1(大コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル、サブファミリーM、αメンバー1)、UGT1A(UDPグルクロノシルトランスフェラーゼ1ファミリー、ポリペプチドA複合遺伝子座)、PRKCA(プロテインキナーゼC、α)、COMT(カテコール-β-メチルトランスフェラーゼ)、S100B(S100カルシウ
ム結合タンパク質B)、EGR1(初期増殖応答1)、PRL(プロラクチン)、IL15(インターロイキン15)、DRD4(ドーパミン受容体D4)、CAMK2G(カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIIγ)、SLC22A2(溶質輸送担体ファミリー22(有機カチオントランスポーター)、メンバー2)、CCL11(ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド11)、PGF(B321胎盤成長因子)、THPO(トロンボポエチン)、GP6(糖タンパク質VI(血小板))、TACR1(タキキニン受容体1)、NTS(ニューロテンシン)、HNF1A(HNF1ホメオボックスA)、SST(ソマトスタチン)、KCND1(カリウム電位開口型チャネル、Shal関連サブファミリー、メンバー1)、LOC646627(ホスホリパーゼ阻害因子)、TBXAS1(トロンボキサンAシンターゼ1(血小板))、CYP2J2(シトクロムP450、ファミリー2、サブファミリーJ、ポリペプチド2)、TBXA2R(トロンボキサンA2受容体)、ADH1C(アルコールデヒドロゲナーゼ1C(クラスI)、γポリペプチド)、ALOX12(アラキドン酸12-リポキシゲナーゼ)、AHSG(α-2-HS-糖タンパク質)、BHMT(ベタイン-ホモシステインメチルトランスフェラーゼ)、GJA4(ギャップ結合タンパク質、α4、37kDa)、SLC25A4(溶質輸送担体ファミリー25(ミトコンドリア輸送担体;アデニンヌクレオチドトランスロケーター)、メンバー4)、ACLY(ATPクエン酸リアーゼ)、ALOX5AP(アラキドン酸5-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質)、NUMA1(核有糸分裂装置タンパク質1)、CYP27B1(シトクロムP450、ファミリー27、サブファミリーB、ポリペプチド1)、CYSLTR2(システイニルロイコトリエン受容体2)、SOD3(スーパーオキシドジスムターゼ3、細胞外)、LTC4S(ロイコトリエンC4シンターゼ)、UCN(ウロコルチン)、GHRL(グレリン/オベスタチンプレプロペプチド)、APOC2(アポリポタンパク質C-II)、CLEC4A(C型レクチンドメインファミリー4、メンバーA)、KBTBD10(ケルヒリピート及びBTB(POZ)ドメイン含有10)、TNC(テネイシンC)、TYMS(チミジル酸シンテターゼ)、SHCl(SHC(Src相同性2ドメイン含有)形質転換タンパク質1)、LRP1(低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1)、SOCS3(サイトカインシグナル伝達のサプレッサー3)、ADH1B(アルコールデヒドロゲナーゼ1B(クラスI)、βポリペプチド)、KLK3(カリクレイン関連ペプチダーゼ3)、HSD11B1(ヒドロキシステロイド(11-β)デヒドロゲナーゼ1)、VKORC1(ビタミンKエポキシドレダクターゼ複合体、サブユニット1)、SERPINB2(セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードB(オボアルブミン)、メンバー2)、TNS1(テンシン1)、RNF19A(リングフィンガータンパク質19A)、EPOR(エリスロポエチン受容体)、ITGAM(インテグリン、αM(補体成分3受容体3サブユニット))、PITX2(ペアード様ホメオドメイン2)、MAPK7(マイトジェン活性化プロテインキナーゼ7)、FCGR3A(IgGのFc断片、低親和性111a、受容体(CD16a))、LEPR(レプチン受容体)、ENG(エンドグリン)、GPX1(グルタチオンペルオキシダーゼ1)、GOT2(グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ2、ミトコンドリア(アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ2))、HRH1(ヒスタミン受容体H1)、NR112(核内受容体サブファミリー1、グループI、メンバー2)、CRH(コルチコトロピン放出ホルモン)、HTR1A(5-ヒドロキシトリプタミン(セロトニン)受容体1A)、VDAC1(電位依存性アニオンチャネル1)、HPSE(ヘパラナーゼ)、SFTPD(サーファクタントタンパク質D)、TAP2(トランスポーター2、ATP結合カセット、サブファミリーB(MDR/TAP))、RNF123(リングフィンガータンパク質123)、PTK2B(PTK2Bプロテインチロシンキナーゼ2β)、NTRK2(神経栄養チロシンキナーゼ、受容体、2型)、IL6R(インターロイキン6受容体)、ACHE(アセチルコリンエステラーゼ(Yt血液型))、GLP1R(グルカゴン様ペプチド1受容体)、GHR(成長ホルモン受容体)、GSR(グルタチオンレダクターゼ)、NQO1(NAD(P)Hデヒドロゲナーゼ、キノン1)、NR5A1(核内受容体サブファミリー5、グループA、メンバー1)、GJB2(ギャップ結合タンパク質、β2、26kDa)、SLC9A1(溶質輸送担体ファミリー9(ナトリウム/水素交換体)、メンバー1)、MAOA(モノアミンオキシダーゼA)、PCSK9(プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型)、FCGR2A(IgGのFc断片、低親和性IIa、受容体(CD32))、SERPINF1(セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードF(α-2抗プラスミン、色素上皮由来因子)、メンバー1)、EDN3(エンドセリン3)、DHFR(ジヒドロ葉酸レダクターゼ)、GAS6(成長停止特異的6)、SMPD1(スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ1、酸性リソソーム)、UCP2(脱共役タンパク質2(ミトコンドリア、プロトン担体))、TFAP2A(転写因子AP-2α(活性化エンハンサー結合タンパク質2α))、C4BPA(補体成分4結合タンパク質、α)、SERPINF2(セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードF(α-2抗プラスミン、色素上皮由来因子)、メンバー2)、TYMP(チミジンホスホリラーゼ)、ALPP(アルカリホスファターゼ、胎盤(リーガン(Regan)アイソザイム))、CXCR2(ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体2)、SLC39A3(溶質輸送担体ファミリー39(亜鉛トランスポーター)、メンバー3)、ABCG2(ATP結合カセット、サブファミリーG(WHITE)、メンバー2)、ADA(アデノシンデアミナーゼ)、JAK3(ヤヌスキナーゼ3)、HSPA1A(熱ショック70kDaタンパク質1A)、FASN(脂肪酸シンターゼ)、FGF1(線維芽細胞成長因子1(酸性))、F11(凝固第XI因子)、ATP7A(ATPアーゼ、Cu++輸送、αポリペプチド)、CR1(補体成分(3b/4b)受容体1(Knops血液型))、GFAP(グリア線維性酸性タンパク質)、ROCK1(Rho関連、コイルドコイル含有プロテインキナーゼ1)、MECP2(メチルCpG結合タンパク質2(レット症候群))、MYLK(ミオシン軽鎖キナーゼ)、BCHE(ブチリルコリンエステラーゼ)、LIPE(リパーゼ、ホルモン感受性)、PRDX5(ペルオキシレドキシン5)、ADORA1(アデノシンA1受容体)、WRN(ウェルナー症候群、RecQヘリカーゼ様)、CXCR3(ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体3)、CD81(CD81分子)、SMAD7(SMADファミリーメンバー7)、LAMC2(ラミニン、γ2)、MAP3K5(マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ5)、CHGA(クロモグラニンA(副甲状腺分泌タンパク質1))、IAPP(膵島アミロイドポリペプチド)、RHO(ロドプシン)、ENPP1(エクトヌクレオチドピロホスファターゼ/ホスホジエステラーゼ1)、PTHLH(副甲状腺ホルモン様ホルモン)、NRG1(ニューレグリン1)、VEGFC(血管内皮増殖因子C)、ENPEP(グルタミルアミノペプチダーゼ(アミノペプチダーゼA))、CEBPB(CCAAT/エンハンサー結合タンパク質(C/EBP)、β)、NAGLU(N-アセチルグルコサミニダーゼ、α-)、F2RL3(凝固第II因子(トロンビン)受容体様3)、CX3CL1(ケモカイン(C-X3-Cモチーフ)リガンド1)、BDKRB1(ブラジキニン受容体B1)、ADAMTS13(トロンボスポンジン1型モチーフを有するADAMメタロペプチダーゼ、13)、ELANE(エラスターゼ、好中球発現)、ENPP2(エクトヌクレオチドピロホスファターゼ/ホスホジエステラーゼ2)、CISH(サイトカイン誘導性SH2含有タンパク質)、GAST(ガストリン)、MYOC(ミオシリン、小柱網誘導性グルココルチコイド応答)、ATP1A2(ATPアーゼ、Na+/K+輸送、α2ポリペプチド)、NF1(ニューロフィブロミン1)、GJB1(ギャップ結合タンパク質、β1、32kDa)、MEF2A(筋細胞エンハンサー因子2A)、VCL(ビンキュリン)、BMPR2(骨形成タンパク質受容体、II型(セリン/スレオニンキナーゼ))、TUBB(チューブリン、β)、CDC42(細胞分裂周期42(GTP結合タンパク質、25kDa))、KRT18(ケラチン18)、HSF1(熱ショック転写因子1)、MYB(v-myb骨髄芽球症ウイルス癌遺伝子ホモログ(トリ))、PRKAA2(プロテインキナーゼ、AMP活性化、α2触媒サブユニット)、ROCK2(Rho関連、コイルドコイル含有プロテインキナーゼ2)、TFPI(組織因子経路阻害因子(リポタンパク質関連凝固阻害因子))、PRKG1(プロテインキナーゼ、cGMP依存性、I型)、BMP2(骨形成タンパク質2)、CTNND1(カテニン(カドヘリン関連タンパク質)、δ1)、CTH(シスタチオナーゼ(シスタチオニンγ-リアーゼ))、CTSS(カテプシンS)、VAV2(vav 2グアニンヌクレオチド交換因子)、NPY2R(ニューロペプチドY受容体Y2)、IGFBP2(インスリン様成長因子結合タンパク質2、36kDa)、CD28(CD28分子)、GSTA1(グルタチオンS-トランスフェラーゼα1)、PPIA(ペプチジルプロリルイソメラーゼA(シクロフィリンA))、APOH(アポリポタンパク質H(β-2-糖タンパク質I))、S100A8(S100カルシウム結合タンパク質A8)、IL11(インターロイキン11)、ALOX15(アラキドン酸15-リポキシゲナーゼ)、FBLN1(フィビュリン1)、NR1H3(核内受容体サブファミリー1、グループH、メンバー3)、SCD(ステアロイル-CoAデサチュラーゼ(Δ-9-デサチュラーゼ))、GIP(胃抑制ポリペプチド)、CHGB(クロモグラニンB(セクレトグラニン1))、PRKCB(プロテインキナーゼC、β)、SRD5A1(ステロイド-5-アルファ-レダクターゼ、αポリペプチド1(3-オキソ-5α-ステロイドΔ4-デヒドロゲナーゼα1))、HSD11B2(ヒドロキシステロイド(11-β)デヒドロゲナーゼ2)、CALCRL(カルシトニン受容体様)、GALNT2(UDP-N-アセチル-α-D-ガラクトサミン:ポリペプチドN-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ2(GalNAc-T2))、ANGPTL4(アンギオポエチン様4)、KCNN4(カリウム中間体/小コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、サブファミリーN、メンバー4)、PIK3C2A(ホスホイノシチド-3-キナーゼ、クラス2、αポリペプチド)、HBEGF(ヘパリン結合EGF様成長因子)、CYP7A1(シトクロムP450、ファミリー7、サブファミリーA、ポリペプチド1)、HLA-DRB5(主要組織適合遺伝子複合体、クラスII、DR β 5)、BNIP3(BCL2/アデノウイルスE1B 19kDa相互作用タンパク質3)、GCKR(グルコキナーゼ(ヘキソキナーゼ4)調節因子)、S100A12(S100カルシウム結合タンパク質A12)、PADI4(ペプチジルアルギニンデイミナーゼ、IV型)、HSPA14(熱ショック70kDaタンパク質14)、CXCR1(ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体1)、H19(H19、刷り込み母性発現転写物(非タンパク質コード))、KRTAP19-3(ケラチン関連タンパク質19-3)、IDDM2(インスリン依存性真性糖尿病2)、
RAC2(ras関連C3ボツリヌス毒素基質2(rhoファミリー、低分子GTP結合タンパク質Rac2))、RYR1(リアノジン受容体1(骨格))、CLOCK(時計ホモログ(マウス))、NGFR(神経成長因子受容体(TNFRスーパーファミリー、メンバー16))、DBH(ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ(ドーパミンβ-モノオキシゲナーゼ))、CHRNA4(コリン作動性受容体、ニコチン性、α4)、CACNA1C(カルシウムチャネル、電位依存性、L型、α1Cサブユニット)、PRKAG2(プロテインキナーゼ、AMP活性化、γ2非触媒サブユニット)、CHAT(コリンアセチルトランスフェラーゼ)、PTGDS(プロスタグランジンD2シンターゼ21kDa(脳))、NR1H2(核内受容体サブファミリー1、グループH、メンバー2)、TEK(TEKチロシンキナーゼ、内皮)、VEGFB(血管内皮増殖因子B)、MEF2C(筋細胞エンハンサー因子2C)、MAPKAPK2(マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ2)、TNFRSF11A(腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー11a、NFKBアクチベータ)、HSPA9(熱ショック70kDaタンパク質9(モルタリン))、CYSLTR1(システイニルロイコトリエン受容体1)、MAT1A(メチオニンアデノシルトランスフェラーゼI、α)、OPRL1(オピエート受容体様1)、IMPA1(イノシトール(myo)-1(又は4)-モノホスファターゼ1)、CLCN2(クロライドチャネル2)、DLD(ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ)、PSMA6(プロテアソーム(プロソーム、マクロパイン(macropain))サブユニット、α型、6)、PSMB8(プロテアソーム(プロソーム、マクロパイン)サブユニット、β型、8(大型多機能ペプチダーゼ7))、CHI3L1(キチナーゼ3様1(軟骨糖タンパク質-39))、ALDH1B1(アルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリー、メンバーB1)、PARP2(ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ2)、STAR(ステロイド産生急性調節タンパク質)、LBP(リポ多糖結合タンパク質)、ABCC6(ATP結合カセット、サブファミリーC(CFTR/MRP)、メンバー6)、RGS2(Gタンパク質シグナル伝達の調節因子2、24kDa)、EFNB2(エフリン-B2)、GJB6(ギャップ結合タンパク質、β6、30kDa)、APOA2(アポリポタンパク質A-II)、AMPD1(アデノシン一リン酸デアミナーゼ1)、DYSF(ジスフェリン、肢帯型筋ジストロフィー2B(常染色体劣性遺伝))、FDFT1(ファルネシル二リン酸ファルネシルトランスフェラーゼ1)、EDN2(エンドセリン2)、CCR6(ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体6)、GJB3(ギャップ結合タンパク質、β3、31kDa)、IL1RL1(インターロイキン1受容体様1)、ENTPD1(エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ1)、BBS4(バルデー-ビードル症候群4)、CELSR2(カドヘリン、EGF LAG7回膜貫通型G型受容体2(フラミンゴホモログ、ショウジョウバエ属(Drosophila)))、F11R(F11受容体)、RAPGEF3(Rapグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)3)、HYAL1(ヒアルロノグルコサミニダーゼ1)、ZNF259(ジンクフィンガータンパク質259)、ATOX1(ATX1抗酸化タンパク質1ホモログ(酵母))、ATF6(活性化転写因子6)、KHK(ケトヘキソキナーゼ(フルクトキナーゼ))、SAT1(スペルミジン/スペルミンN1-アセチルトランスフェラーゼ1)、GGH(γ-グルタミルヒドロラーゼ(コンジュガーゼ、ホリルポリγグルタミルヒドロラーゼ))、TIMP4(TIMPメタロペプチダーゼ阻害因子4)、SLC4A4(溶質輸送担体ファミリー4、ナトリウム・炭酸水素イオン共輸送体、メンバー4)、PDE2A(ホスホジエステラーゼ2A、cGMP刺激性)、PDE3B(ホスホジエステラーゼ3B、cGMP阻害性)、FADS1(脂肪酸デサチュラーゼ1)、FADS2(脂肪酸デサチュラーゼ2)、TMSB4X(チモシンβ4、X連鎖)、TXNIP(チオレドキシン相互作用タンパク質)、LIMS1(LIM及び老化細胞抗原様ドメイン1)、RHOB(rasホモログ遺伝子ファミリー、メンバーB)、LY96(リンパ球抗原96)、FOXO1(フォークヘッドボックスO1)、PNPLA2(パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有2)、TRH(サイロトロピン放出ホルモン)、GJC1(ギャップ結合タンパク質、γ1、45kDa)、SLC17A5(溶質輸送担体ファミリー17(アニオン/糖輸送体)、メンバー5)、FTO(体脂肪量及び肥満関連)、GJD2(ギャップ結合タンパク質、δ2、36kDa)、PSRC1(プロリン/セリンリッチコイルドコイル1)、CASP12(カスパーゼ12(遺伝子/偽遺伝子))、GPBAR1(Gタンパク質共役型胆汁酸受容体1)、PXK(PXドメイン含有セリン/スレオニンキナーゼ)、IL33(インターロイキン33)、TRIB1(トリブルズ(tribbles)ホモログ1(ショウジョウバエ属(Drosophila)))、PBX4(プレB細胞白血病ホメオボックス4)、NUPR1(核タンパク質、転写調節因子、1)、15-Sep(15kDa セレノプロテイン)、CILP2(軟骨中間層タンパク質2)、TERC(テロメラーゼRNA構成成分)、GGT2(γ-グルタミルトランスフェラーゼ2)、MT-CO1(ミトコンドリアにコードされたシトクロムcオキシダーゼI)、及びUOX(尿酸オキシダーゼ、偽遺伝子)を含み得る。これらの配列のいずれも、例えば突然変異に対処するためのCRISPR-Cas系の標的となり得る。
本発明はまた、本明細書に記載されるCRISPR-Cas系、例えばCpf1エフェクタータンパク質系を腎臓に送達することも企図する。治療用核酸の細胞取込みを誘導するための送達戦略には、物理的力又はベクター系、例えばウイルスベース、脂質ベース又は複合体ベースの送達、又はナノ担体が含まれる。核酸が流体力学的高圧注入で全身的に腎細胞に送られたとき見込まれる臨床的意義が低い初期の適用以降、種々の動物腎疾患モデルにおいてインビボで転写後イベントを標的化するため幅広い遺伝子治療ウイルス及び非ウイルス担体が既に適用されている(Csaba Revesz and Peter Hamar(2011)、「腎臓においてRNAを標的化する送達方法(Delivery Methods to Target RNAs in the Kidney)」、Gene Therapy Applications,Prof.Chunsheng Kang(Ed.),ISBN:978-953-307-541-9、InTech、以下から入手可能:http://www.intechopen.com/books/gene-therapy-applications/delivery-methods-to-target-rnas-inthe-kidney)。腎臓に対する送達方法としては、アラキドン酸代謝の12/15-リポキシゲナーゼ(12/15-LO)経路を標的にする低分子干渉RNA(siRNA)のインビボ送達が、ストレプトゾトシンを注射した1型糖尿病マウスモデルにおいて腎損傷及び糖尿病性腎症(DN)を改善し得るかどうかを調べたYuan et al.(Am J Physiol Renal Physiol 295:F605-F617,2008)にあるものを挙げることができる。腎臓においてより多くのインビボ到達及びsiRNA発現を達成するため、Yuan et al.は、コレステロールとコンジュゲートした二本鎖12/15-LO siRNAオリゴヌクレオチドを使用した。約400μgのsiRNAがマウスに皮下注入された。Yuang et al.の方法は、ヒトに対する腎臓への送達にコレステロールとコンジュゲートしたCRISPR Casの1~2gの皮下注射を企図して本発明のCRISPR Cas系に適用し得る。
肝細胞のターゲティングが提供される。これはインビトロ又はインビボであってもよい。ヘパトサイトが好ましい。本明細書におけるCpf1などのCRISPRタンパク質の送達は、ウイルスベクター、特にAAV(及び詳細にはAAV2/6)ベクターによることができる。これらは静脈内注射によって投与し得る。
アルブミンなどの高発現遺伝子(高活性エンハンサー/プロモーターを有する遺伝子)内にある標的を使用すると、Wechsler et al.によって報告されるとおり、プロモーターレスドナー鋳型を使用することも可能となり、これはまた、肝臓ターゲティング以外にも幅広く適用可能である。高発現遺伝子の他の例は公知である。
詳細な実施形態では、本発明のCRISPRタンパク質は、トランスサイレチンアミロイドーシス(ATTR)、α1-アンチトリプシン欠乏症及び他の肝性先天性代謝異常など、肝障害の治療において用いられる。FAPは、トランスサイレチン(TTR)をコードする遺伝子の突然変異によって引き起こされる。これは常染色体優性疾患であるが、全ての保因者がこの疾患を発症するわけではない。この疾患に関連することが分かっているTTR遺伝子の突然変異は100を超える。共通の突然変異の例としては、V30Mが挙げられる。遺伝子サイレンシングに基づくTTR治療の原理が、iRNAを用いた研究によって実証されている(Ueda et al.2014 Transl Neurogener.3:19)。ウィルソン病(WD)は、専ら肝細胞に見られるATP7Bをコードする遺伝子の突然変異によって引き起こされる。WDに関連する突然変異は500を超え、東アジアなどの特定の地域で有病率が上昇する。他の例は、A1ATD(SERPINA1遺伝子の突然変異によって引き起こされる常染色体劣性遺伝疾患)及びPKU(フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)遺伝子の突然変異によって引き起こされる常染色体劣性遺伝疾患)である。
ヘパトサイトの遺伝子編集の成功がマウス(インビトロ及びインビボの両方)及び非ヒト霊長類(インビボ)で実現しており、ヘパトサイトにおける遺伝子編集/ゲノムエンジニアリングによる血液障害の治療が実現可能であることを示している。詳細には、ヘパトサイトにおけるヒトF9(hF9)遺伝子の発現が非ヒト霊長類において示されており、ヒトの血友病B(hemophillia B)の治療が示唆される。
・AAV(特にAAV2/6)ベクター、好ましくは静脈内注射によって投与される;
・トランス遺伝子/鋳型の遺伝子編集/挿入の標的としてのアルブミン-特にアルブミンのイントロン1における;
・ヒトF9ドナー鋳型;及び/又は
・プロモーターレスドナー鋳型。
従って、一部の実施形態において、本発明は血友病Bの治療に用いられることが好ましい。そのため、鋳型が提供されること、及びそれがヒトF9遺伝子であることが好ましい。hF9鋳型がwt又は治療が有効となるように「正しい」バージョンのhF9を含むことが理解されるであろう。
一部の実施形態において、F9(第IX因子)遺伝子が上記に記載されるF8(第VIII因子)遺伝子に置き換えられてもよく、血友病Aの治療(正しいF8遺伝子の提供による)及び/又は血友病Aモデル生物、細胞又は細胞株の作出(正しくない血友病AバージョンのF8遺伝子の提供による)につながる。
一部の実施形態において、F9(第IX因子)遺伝子が上記に記載されるF11(第X因子I)遺伝子に置き換えられてもよく、血友病Cの治療(正しいF11遺伝子の提供による)及び/又は血友病Cモデル生物、細胞又は細胞株の作出(正しくない血友病CバージョンのF11遺伝子の提供による)につながる。
本発明はまた、本明細書に記載されるCRISPR-Cas系、例えばCpf1エフェクタータンパク質系を一方又は両方の肺に送達することも企図する。
本発明はまた、例えばCpf1エフェクタータンパク質系などの、本明細書に記載されるCRISPR-Cas系を筋肉に送達することも企図する。
本発明はまた、例えばCpf1エフェクタータンパク質系などの、本明細書に記載されるCRISPR-Cas系を皮膚に送達することも企図する。
一部の実施形態において、癌の治療、予防又は診断が提供される。標的は好ましくはFAS、BID、CTLA4、PDCD1、CBLB、PTPN6、TRAC又はTRBC遺伝子のうちの1つ以上である。癌は、リンパ腫、慢性リンパ性白血病(CLL)、B細胞急性リンパ性白血病(B-ALL)、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫(NHL)、びまん性大細胞型リンパ腫(DLCL)、多発性骨髄腫、腎細胞癌(RCC)、神経芽細胞腫、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、メラノーマ、肉腫、前立腺癌、肺癌、食道癌、肝細胞癌、膵癌、星状細胞腫、中皮腫、頭頸部癌、及び髄芽腫のうちの1つ以上であってもよい。これは、エンジニアリングされたキメラ抗原受容体(CAR)T細胞で実現し得る。これは、国際公開第2015161276号パンフレット(その開示は本明細書によって参照により援用される)に記載されており、及び本明細書において以下に記載される。
一部の実施形態において、アッシャー症候群又は網膜色素変性症39型の治療、予防又は診断が提供される。標的は好ましくはUSH2A遺伝子である。一部の実施形態において、2299位のG欠失(2299delG)の修正が提供される。これは、国際公開第2015134812A1号パンフレット(その開示は本明細書によって参照により援用される)に記載されている。
一部の実施形態において、嚢胞性線維症の治療、予防又は診断が提供される。標的は好ましくはSCNN1A又はCFTR遺伝子である。これは、国際公開第2015157070号パンフレット(その開示は本明細書によって参照により援用される)に記載されている。
一部の実施形態において、HIV及びAIDSの治療、予防又は診断が提供される。標的は好ましくはHIVのCCR5遺伝子である。これは、国際公開第2015148670A1号パンフレット(その開示は本明細書によって参照により援用される)に記載されている。
一部の実施形態において、βサラセミアの治療、予防又は診断が提供される。標的は好ましくはBCL11A遺伝子である。これは、国際公開第2015148860号パンフレット(その開示は本明細書によって参照により援用される)に記載されている。
一部の実施形態において、鎌状赤血球症(SCD)の治療、予防又は診断が提供される。標的は好ましくはHBB又はBCL11A遺伝子である。これは、国際公開第2015148863号パンフレット(その開示は本明細書によって参照により援用される)に記載されている。
一部の実施形態において、HSV-1(単純ヘルペスウイルス1型)の治療、予防又は診断が提供される。標的は好ましくはHSV-1のUL19、UL30、UL48又はUL50遺伝子である。これは、国際公開第2015153789号パンフレット(その開示は本明細書によって参照により援用される)に記載されている。
本発明はまた、養子療法向けに細胞を改変するための、本明細書に記載されるCRISPR-Cas系、例えばCpf1エフェクタータンパク質系の使用も企図する。本発明の態様は、従って、特定の抗原、例えば腫瘍関連抗原に特異的なT細胞などの免疫系細胞の養子移入を含む(Maus et al.,2014,「癌又はウイルスの養子免疫療法(Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses)」,Annual Review of Immunology,Vol.32:189-225;Rosenberg and Restifo,2015,「ヒト癌の個別化免疫療法としての養子細胞移入(Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer)」,Science Vol.348 no.6230 pp.62-68;Restifo et al.,2015,「癌の養子免疫療法:T細胞応答の利用(Adoptive immunotherapy for cancer:harnessing the T cell response)」.Nat.Rev.Immunol.12(4):269-281;及びJenson and Riddell,2014,「キメラ抗原受容体改変T細胞による養子療法の設計及び実施(Design and implementation of adoptive therapy with chimeric antigen receptor-modified T cells)」.Immunol Rev.257(1):127-144を参照)。様々なストラテジーを例えば用いて、例えば選択されたペプチド特異性を有する新規TCR α及びβ鎖の導入によってT細胞受容体(TCR)の特異性を変化させることにより、T細胞を遺伝的に改変し得る(米国特許第8,697,854号明細書;PCT特許公開:国際公開第2003020763号パンフレット、国際公開第2004033685号パンフレット、国際公開第2004044004号パンフレット、国際公開第2005114215号パンフレット、国際公開第2006000830号パンフレット、国際公開第2008038002号パンフレット、国際公開第2008039818号パンフレット、国際公開第2004074322号パンフレット、国際公開第2005113595号パンフレット、国際公開第2006125962号パンフレット、国際公開第2013166321号パンフレット、国際公開第2013039889号パンフレット、国際公開第2014018863号パンフレット、国際公開第2014083173号パンフレット;米国特許第8,088,379号明細書を参照)。
本発明はまた、例えば国際公開第2015/105928号パンフレットに記載される遺伝子ドライブと同様の系におけるRNAガイド下遺伝子ドライブを提供するための、本明細書に記載されるCRISPR-Cas系、例えばCpf1エフェクタータンパク質系の使用も企図する。この種の系は、例えば、RNAガイド下DNAヌクレアーゼ及び1つ以上のガイドRNAをコードする核酸配列を生殖系列細胞に導入することによる、真核生物生殖系列細胞を変化させる方法を提供し得る。ガイドRNAは、生殖系列細胞のゲノムDNA上の1つ以上の標的位置に相補的であるように設計され得る。RNAガイド下DNAヌクレアーゼをコードする核酸配列及びガイドRNAをコードする核酸配列は、構築物上でフランキング配列間に、生殖系列細胞がRNAガイド下DNAヌクレアーゼ及びガイドRNAを発現し得るように配置されたプロモーターを伴い、同様にフランキング配列間に位置する任意の所望のカーゴコード配列と共に提供されてもよい。フランキング配列は、典型的には選択の標的染色体上の対応する配列と同一の配列を含むことができ、そのためフランキング配列が構築物によってコードされる構成成分と共に働き、相同組換えなどの機構による標的切断部位におけるゲノムDNAへの外来性核酸構築物配列の挿入が促進されて、生殖系列細胞がその外来性核酸配列に関してホモ接合になる。このようにして、遺伝子ドライブ系は、育種集団全体にわたって所望のカーゴ遺伝子を移入させる能力を有する(Gantz et al.,2015,「マラリアベクター蚊ステフェンスハマダラカの集団改変のための極めて効率的なCas9媒介遺伝子ドライブ(Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi)」,PNAS 2015,published ahead of print November 23,2015,doi:10.1073/pnas.1521077112;Esvelt et al.,2014,「野生集団を変化させるためのRNAガイド下遺伝子ドライブに関して(Concerning RNA-guided gene drives for the alteration of wild populations)」eLife 2014;3:e03401)。選択の実施形態においては、ゲノムに潜在的なオフターゲット部位をほとんど有しない標的配列が選択され得る。標的遺伝子座内の複数の部位を複数のガイドRNAを用いて標的化することにより、切断頻度が増加し、且つドライブ抵抗性対立遺伝子の進化が妨げられ得る。トランケート型ガイドRNAではオフターゲット切断が低下し得る。特異性を更に増加させるため、単一のヌクレアーゼの代わりに対のニッカーゼが用いられてもよい。遺伝子ドライブ構築物は、例えば相同組換え遺伝子を活性化させ、及び/又は非相同末端結合を抑制するため、転写調節因子をコードするカーゴ配列を含み得る。標的部位は必須遺伝子内で選択され得るため、非相同末端結合イベントはドライブ抵抗性対立遺伝子を作り出すよりむしろ致死を引き起こし得る。遺伝子ドライブ構築物は、ある温度範囲においてある宿主範囲で機能するようにエンジニアリングすることができる(Cho et al.2013,「小分子を用いた線虫におけるタンパク質安定性の迅速且つ調整可能な制御(Rapid and Tunable Control of Protein Stability in Caenorhabditis elegans Using a Small Molecule)」,PLoS ONE 8(8):e72393.doi:10.1371/journal.pone.0072393)。
本発明はまた、改変された移植用組織の提供に用いられるように適合されたRNAガイド下DNAヌクレアーゼを提供するための、本明細書に記載されるCRISPR-Cas系、例えばCpf1エフェクタータンパク質系の使用も企図する。例えば、RNAガイド下DNAヌクレアーゼを用いて、例えば、ヒト免疫系によって認識されるエピトープをコードする遺伝子、即ち異種抗原遺伝子の発現を破壊することにより、トランスジェニックブタなど(ヒトヘムオキシゲナーゼ-1トランスジェニックブタ系統など)、動物の選択の遺伝子をノックアウト、ノックダウン又は破壊し得る。破壊の候補ブタ遺伝子としては、例えば、α(1,3)-ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシチジン一リン酸-N-アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ遺伝子(国際公開第2014/066505号パンフレットを参照)を挙げることができる。加えて、内在性レトロウイルスをコードする遺伝子、例えば全てのブタ内在性レトロウイルスをコードする遺伝子を破壊してもよい(Yang et al.,2015,「ブタ内在性レトロウイルス(PERV)のゲノムワイドな不活性化(Genome-wide inactivation of porcine endogenous retroviruses(PERVs))」,Science 27 November 2015:Vol.350 no.6264 pp.1101-1104を参照)。加えて、RNAガイド下DNAヌクレアーゼを用いて、ヒトCD55遺伝子など、異種移植ドナー動物における更なる遺伝子の組込み部位を標的化することにより、超急性拒絶反応からの保護を向上させ得る。
本発明の実施において標的化することのできる疾患関連遺伝子及びポリヌクレオチドの例及び疾患の具体的情報は、ワールドワイドウェブで利用可能なジョンズ・ホプキンス大学マキュージック・ネイサンズ遺伝医学研究所(McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine,Johns Hopkins University)(Baltimore,Md.)及び米国国立医学図書館国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information,National Library of Medicine)(Bethesda,Md.)から入手することができる。
本発明は、以下の論文に示されるとおりの、及び特に、細胞及び生物におけるCRISPRタンパク質複合体の送達及びRNAガイド下エンドヌクレアーゼの使用に関するとおりのCFISPR-Cas9の開発及び使用の態様に基づき更に例示し、及び拡張することができ:
・「CRISPR/Cas系を用いた多重ゲノムエンジニアリング(Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems)」.Cong,L.,Ran,F.A.,Cox,D.,Lin,S.,Barretto,R.,Habib,N.,Hsu,P.D.,Wu,X.,Jiang,W.,Marraffini,L.A.,& Zhang,F.Science Feb 15;339(6121):819-23(2013);
・「CRISPR-Cas系を用いた細菌ゲノムのRNAガイド下編集(RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems)」.Jiang W.,Bikard D.,Cox D.,Zhang F,Marraffini LA.Nat Biotechnol Mar;31(3):233-9(2013);
・「複数の遺伝子に突然変異を有するマウスのCRISPR/Cas媒介性ゲノムエンジニアリングによるワンステップ生成(One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering)」.Wang H.,Yang H.,Shivalila CS.,Dawlaty MM.,Cheng AW.,Zhang F.,Jaenisch R.Cell May 9;153(4):910-8(2013);
・「哺乳類内因性転写及び後成状態の光学制御(Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states)」.Konermann S,Brigham MD,Trevino AE,Hsu PD,Heidenreich M,Cong L,Platt RJ,Scott DA,Church GM,Zhang F.Nature.Aug 22;500(7463):472-6.doi:10.1038/Nature12466.Epub 2013 Aug 23(2013);
・「ゲノム編集特異性を増強するためのRNAガイド下CRISPR Cas9による二重ニッキング(Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity)」.Ran,FA.,Hsu,PD.,Lin,CY.,Gootenberg,JS.,Konermann,S.,Trevino,AE.,Scott,DA.,Inoue,A.,Matoba,S.,Zhang,Y.,& Zhang,F.Cell Aug 28.pii:S0092-8674(13)01015-5(2013-A);
・「RNAガイド下Cas9ヌクレアーゼのDNAターゲティング特異性(DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases)」.Hsu,P.,Scott,D.,Weinstein,J.,Ran,FA.,Konermann,S.,Agarwala,V.,Li,Y.,Fine,E.,Wu,X.,Shalem,O.,Cradick,TJ.,Marraffini,LA.,Bao,G.,& Zhang,F.Nat Biotechnol doi:10.1038/nbt.2647(2013);
・「CRISPR-Cas9系を用いたゲノムエンジニアリング(Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system)」.Ran,FA.,Hsu,PD.,Wright,J.,Agarwala,V.,Scott,DA.,Zhang,F.Nature Protocols Nov;8(11):2281-308(2013-B);
・「ヒト細胞におけるゲノム規模のCRISPR-Cas9ノックアウトスクリーニング(Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells)」.Shalem,O.,Sanjana,NE.,Hartenian,E.,Shi,X.,Scott,DA.,Mikkelson,T.,Heckl,D.,Ebert,BL.,Root,DE.,Doench,JG.,Zhang,F.Science Dec 12.(2013).[Epub ahead of print];
・「ガイドRNAと標的DNAとを有する複合体におけるcas9の結晶構造(Crystal structure of cas9 in complex with guide RNA and target DNA)」.Nishimasu,H.,Ran,FA.,Hsu,PD.,Konermann,S.,Shehata,SI.,Dohmae,N.,Ishitani,R.,Zhang,F.,Nureki,O.Cell Feb 27,156(5):935-49(2014);
・「哺乳類細胞におけるCRISPRエンドヌクレアーゼCas9のゲノムワイドな結合(Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells)」.Wu X.,Scott DA.,Kriz AJ.,Chiu AC.,Hsu PD.,Dadon DB.,Cheng AW.,Trevino AE.,Konermann S.,Chen S.,Jaenisch R.,Zhang F.,Sharp PA.Nat Biotechnol.Apr 20.doi:10.1038/nbt.2889(2014);
・「ゲノム編集及び癌モデリングのためのCRISPR-Cas9ノックインマウス(CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling)」.Platt RJ,Chen S,Zhou Y,Yim MJ,Swiech L,Kempton HR,Dahlman JE,Parnas O,Eisenhaure TM,Jovanovic M,Graham DB,Jhunjhunwala S,Heidenreich M,Xavier RJ,Langer R,Anderson DG,Hacohen N,Regev A,Feng G,Sharp PA,Zhang F.Cell 159(2):440-455 DOI:10.1016/j.cell.2014.09.014(2014);
・「ゲノムエンジニアリングに向けたCRISPR-Cas9の開発及び適用(Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering)」,Hsu PD,Lander ES,Zhang F.,Cell.Jun 5;157(6):1262-78(2014)
・「CRISPR/Cas9系を用いたヒト細胞における遺伝子スクリーニング(Genetic screens in human cells using the CRISPR/Cas9 system)」,Wang T,Wei JJ,Sabatini DM,Lander ES.,Science.January 3;343(6166):80-84.doi:10.1126/science.1246981(2014);
・「CRISPR-Cas9媒介性遺伝子不活性化のための高活性sgRNAの合理的設計(Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation)」,Doench JG,Hartenian E,Graham DB,Tothova Z,Hegde M,Smith I,Sullender M,Ebert BL,Xavier RJ,Root DE.,(オンライン発行 3 September 2014)Nat Biotechnol.Dec;32(12):1262-7(2014);
・「CRISPR-Cas9を用いた哺乳類脳における遺伝子機能のインビボ探索(In vivo interrogation of gene function in the mammalian brain using CRISPR-Cas9)」,Swiech L,Heidenreich M,Banerjee A,Habib N,Li Y,Trombetta J,Sur M,Zhang F.,(オンライン発行 19 October 2014)Nat Biotechnol.Jan;33(1):102-6(2015);
・「エンジニアリングされたCRISPR-Cas9複合体によるゲノム規模の転写活性化(Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex)」,Konermann S,Brigham MD,Trevino AE,Joung J,Abudayyeh OO,Barcena C,Hsu PD,Habib N,Gootenberg JS,Nishimasu H,Nureki O,Zhang F.,Nature.Jan 29;517(7536):583-8(2015)
・「誘導性ゲノム編集及び転写調節のためのスプリットCas9アーキテクチャ(A split-Cas9 architecture for inducible genome editing and transcription modulation)」,Zetsche B,Volz SE,Zhang F.,(オンライン発行 02 February 2015)Nat Biotechnol.Feb;33(2):139-42(2015);
・「腫瘍成長及び転移マウスモデルにおけるゲノムワイドなCRISPRスクリーニング(Genome-wide CRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth and Metastasis)」,Chen S,Sanjana NE,Zheng K,Shalem O,Lee K,Shi X,Scott DA,Song J,Pan JQ,Weissleder R,Lee H,Zhang F,Sharp PA.Cell 160,1246-1260,March 12,2015(マウスにおける多重スクリーニング)、及び
・「黄色ブドウ球菌Cas9を用いたインビボゲノム編集(In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9)」,Ran FA,Cong L,Yan WX,Scott DA,Gootenberg JS,Kriz AJ,Zetsche B,Shalem O,Wu X,Makarova KS,Koonin EV,Sharp PA,Zhang F.,(オンライン発行 01 April 2015),Nature.Apr 9;520(7546):186-91(2015)
・Shalem et al.,「CRISPR-Cas9を用いたハイスループット機能ゲノミクス(High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9)」,Nature Reviews Genetics 16,299-311(May 2015)
・Xu et al.,「改良CRISPR sgRNA設計の配列決定因子(Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design)」,Genome Research 25,1147-1157(August 2015)
・Parnas et al.,「初代免疫細胞におけるゲノムワイドなCRISPRスクリーニングによる調節ネットワークの分析(A Genome-wide CRISPR Screen in Primary Immune Cells to Dissect Regulatory Networks)」,Cell 162,675-686(July 30,2015)
・Ramanan et al.,「ウイルスDNAのCRISPR/Cas9切断はB型肝炎ウイルスを効率的に抑制する(CRISPR/Cas9 cleavage of viral DNA efficiently suppresses hepatitis B virus)」,Scientific Reports 5:10833.doi:10.1038/srep10833(June 2,2015)
・Nishimasu et al.,「黄色ブドウ球菌Cas9の結晶構造(Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9)」,Cell 162,1113-1126(Aug.27,2015)
・「Cas9媒介性インサイチュ飽和突然変異誘発によるBCL11Aエンハンサー分析(BCL11A enhancer dissection by Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis)」,Canver et al.,Nature 527(7577):192-7(Nov.12,2015)doi:10.1038/nature15521.Epub 2015 Sep 16
・「Cpf1はクラス2CRISPR-Cas系の単一のRNA誘導型エンドヌクレアーゼである(Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System)」,Zetsche et al.,Cell 163,759-71(Sep 25,2015)
・「多様なクラス2CRISPR-Cas系の発見及び機能の特徴付け(Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems)」,Shmakov et al.,Molecular Cell,60(3),385-397 doi:10.1016/j.molcel.2015.10.008 Epub October 22,2015
・「特異性が向上した合理的にエンジニアリングされたCas9ヌクレアーゼ(Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity)」,Slaymaker et al.,Science 2016 Jan 1 351(6268):84-88 doi:10.1126/science.aad5227.Epub 2015 Dec 1.[Epub ahead of print]
この各々が参照により本明細書に援用され、本発明の実施において考慮されてもよく、及び以下に簡単に考察する:
・Cong et al.は、サーモフィラス菌(Streptococcus thermophilus)Cas9及びまた化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9の両方に基づき、真核細胞で使用されるII型CRISPR/Cas系をエンジニアリングし、Cas9ヌクレアーゼが低分子RNAの指図を受けてヒト及びマウス細胞で正確なDNA切断を誘導し得ることを実証した。この著者らの研究は更に、ニッキング酵素に変換されるCas9を使用して、最小限の変異原活性を有する真核細胞での相同性組換え修復を促進し得ることを示した。加えて、この著者らの研究は、複数のガイド配列を単一のCRISPR配列にコードすることによって哺乳類ゲノム内の内在性ゲノム遺伝子座部位でいくつかを同時に編集することが可能となり得ることを実証し、RNAガイドヌクレアーゼ技術の容易なプログラム可能性及び広範な適用性を実証した。このようにRNAを使用して細胞における配列特異的DNA切断をプログラムすることが可能となり、ゲノムエンジニアリングツールの新しいクラスが定義された。これらの研究は更に、他のCRISPR遺伝子座が哺乳類細胞に移植可能である可能性があり、哺乳類ゲノム切断も媒介し得ることを示した。重要なことに、CRISPR/Cas系のいくつかの側面を更に改良してその効率及び多用途性を高め得ることが想定され得る。
・Jiang et al.は、デュアルRNAと複合体を形成したクラスター化等間隔短鎖回分リピート(CRISPR)関連Cas9エンドヌクレアーゼを使用して、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)及び大腸菌(Escherichia coli)のゲノムに正確な突然変異を導入した。この手法は、標的ゲノム部位におけるデュアルRNA:Cas9誘導切断によって非突然変異細胞を死滅させることに頼ったもので、選択可能マーカー又は対抗選択系の必要性が回避される。この研究は、単一及び複数のヌクレオチド変化が生じるように短鎖CRISPR RNA(crRNA)の配列を変えることによってデュアルRNA:Cas9特異性を再プログラム化すると、鋳型の編集が行われることを報告した。この研究は、2つのcrRNAを同時に使用すると突然変異誘発の多重化が可能であることを示した。更に、この手法を組換えと組み合わせて用いたとき、肺炎連鎖球菌(S.pneumoniae)では、記載される手法を用いて回収された細胞のほぼ100%が所望の突然変異を含み、大腸菌(E.coli)では回収された細胞の65%が突然変異を含んだ。
・Wang et al.(2013)はCRISPR/Cas系を用いることにより、胚性幹細胞における逐次的組換え及び/又は及び/又は時間のかかる単一突然変異を有するマウスの交雑による複数の段階で従来作成された複数の遺伝子に突然変異を保有するマウスを一段階で作成した。CRISPR-Cas系は機能的に重複する遺伝子及び上位遺伝子相互作用のインビボ研究を大幅に加速させ得る。
・Konermann et al.(2013)は、CRISPR Cas9酵素及びまた転写活性化因子様エフェクターに基づくDNA結合ドメインの光学的及び化学的調節を可能にする多用途の且つロバストな技術が当該技術分野で必要とされていることに対処した。
・Ran et al.(2013-A)は、Cas9ニッカーゼ突然変異体を対のガイドRNAと組み合わせて標的二本鎖切断を導入するという手法を記載した。これは、微生物CRISPR-Cas系のCas9ヌクレアーゼがガイド配列によって特異的なゲノム遺伝子座に標的化されるが、ガイド配列はDNA標的との幾らかのミスマッチに耐えることができるため、従って望ましくないオフターゲット突然変異誘発を促進し得るという問題に対処する。ゲノム中の個々のニックは高いフィデリティーで修復されるため、二本鎖切断には適切にオフセットしたガイドRNAによる同時のニッキングが必要であり、標的切断のために特異的に認識される塩基の数が大きくなる。この著者らは、対のニッキングを使用して細胞系におけるオフターゲット活性を50~1,500分の1に減らし、オンターゲット切断効率を犠牲にすることなしにマウス接合体における遺伝子ノックアウトを促進し得ることを実証した。この多用途戦略により、高い特異性が要求される多種多様なゲノム編集適用が可能となる。
・Hsu et al.(2013)は、標的部位の選択を知らせ、且つオフターゲット効果を回避するためのヒト細胞におけるSpCas9ターゲティングの特異性を特徴付けた。この研究は、700個を超えるガイドRNA変異体並びに293T及び293FT細胞の100個を超える予測ゲノムオフターゲット遺伝子座におけるSpCas9誘導インデル突然変異レベルを評価した。この著者ら、SpCas9が、ミスマッチの数、位置及び分布に感受性を示して配列依存的に種々の位置におけるガイドRNAと標的DNAとの間のミスマッチに耐えること。この著者らは更に、SpCas9媒介性切断がDNAメチル化の影響を受けないこと、SpCas9及びgRNAの投与量を滴定してオフターゲット改変を最小限に抑え得ることを示した。加えて、哺乳類ゲノムエンジニアリング適用を促進するため、この著者らは、標的配列の選択及び検証並びにオフターゲット解析をガイドするウェブベースのソフトウェアツールの提供を報告した。
・Ran et al.(2013-B)は、哺乳類細胞における非相同末端結合(NHEJ)又は相同性組換え修復(HDR)を用いたCas9媒介性ゲノム編集用並びに下流機能研究のための改変細胞系作成用の一組のツールを記載した。オフターゲット切断を最小限に抑えるため、この著者らは更に、対のガイドRNAを含むCas9ニッカーゼ突然変異体を使用した二重ニッキング戦略を記載した。この著者らによって提供されるプロトコルから、標的部位の選択、切断効率の評価及びオフターゲット活性の分析に関する指針が実験的に導かれた。この研究は、標的設計から始めて、僅か1~2週間以内に遺伝子改変を達成し得るとともに、2~3週間以内に改変クローン細胞系を誘導し得ることを示した。
・Shalem et al.は、ゲノムワイドな規模で遺伝子機能を調べる新しい方法を記載した。この著者らの研究は、64,751個のユニークなガイド配列で18,080個の遺伝子を標的化するゲノム規模のCRISPR-Cas9ノックアウト(GeCKO)ライブラリの送達が、ヒト細胞におけるネガティブ選択及びポジティブ選択の両方のスクリーニングを可能にしたことを示した。第一に、この著者らは、GeCKOライブラリを使用した、癌及び多能性幹細胞における細胞生存にとって不可欠な遺伝子の同定を示した。次に、この著者らは黒色腫モデルにおいて、その欠損が突然変異体プロテインキナーゼBRAFを阻害する治療薬ベムラフェニブに対する耐性に関わる遺伝子をスクリーニングした。この著者らの研究は、最も上位にランク付けされた候補に、以前検証された遺伝子NF1及びMED12並びに新規ヒットNF2、CUL3、TADA2B、及びTADA1が含まれたことを示した。この著者らは、同じ遺伝子を標的化する独立したガイドRNA間における高度な一致及び高率のヒット確認を観察し、従ってCas9によるゲノム規模スクリーニングの有望さを実証した。
・Nishimasu et al.は、2.5Åの分解能でsgRNA及びその標的DNAと複合体形成する化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9の結晶構造を報告した。この構造から、標的認識ローブとヌクレアーゼローブとで構成された、それらの界面にある正電荷の溝にsgRNA:DNAヘテロ二本鎖を受け入れる2ローブ構成が明らかになった。認識ローブはsgRNA及びDNAの結合に決定的に重要であるのに対し、ヌクレアーゼローブはHNH及びRuvCヌクレアーゼドメインを含み、これらのドメインは標的DNAのそれぞれ相補鎖及び非相補鎖の切断に適切な位置にある。ヌクレアーゼローブはまた、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)との相互作用に関与するカルボキシル末端ドメインも含む。この高分解能構造解析及び付随する機能解析により、Cas9によるRNAガイド下DNAターゲティングの分子機構が明らかになることで、ひいては新規の多用途ゲノム編集技術の合理的な設計への道が開かれつつある。
・Wu et al.は、マウス胚性幹細胞(mESC)においてシングルガイドRNA(sgRNA)を負荷した化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)由来の触媒不活性Cas9(dCas9)のゲノムワイドな結合部位をマッピングした。この著者らは、試験した4つのsgRNAの各々が、多くの場合にsgRNAにおける5ヌクレオチドシード領域及びNGGプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)によって特徴付けられる数十個ないし数千個のゲノム部位にdCas9を標的化することを示した。クロマチンが接触不可能であることにより、一致するシード配列を含む他の部位に対するdCas9結合が減少し;従ってオフターゲット部位の70%が遺伝子と会合する。この著者らは、触媒活性Cas9を形質移入したmESCにおける295個のdCas9結合部位の標的シーケンシングから、バックグラウンドレベルを上回って突然変異した部位は1つのみ同定されたことを示した。この著者らは、Cas9結合及び切断の2状態モデルを提案しており、このモデルではシードの一致が結合を引き起こすが、切断には標的DNAとの広範な対合が必要である。
・Platt et al.はCre依存性Cas9ノックインマウスを樹立した。この著者らは、ニューロン、免疫細胞、及び内皮細胞においてガイドRNAのアデノ随伴ウイルス(AAV)媒介性、レンチウイルス媒介性、又は粒子媒介性送達を用いたインビボ並びにエキソビボゲノム編集を実証した。
・Hsu et al.(2014)は、細胞の遺伝子スクリーニングを含めたヨーグルトからゲノム編集に至るまでのCRISPR-Cas9の歴史を広く考察するレビュー論文である。
・Wang et al.(2014)は、ゲノム規模のレンチウイルスシングルガイドRNA(sgRNA)ライブラリを使用するポジティブ選択及びネガティブ選択の両方に好適なプールされた機能喪失型遺伝子スクリーニング手法に関する。
・Doench et al.は、6個の内因性マウス遺伝子及び3個の内因性ヒト遺伝子のパネルの可能な全ての標的部位にわたってタイリングするsgRNAのプールを作成し、その標的遺伝子のヌル対立遺伝子を産生するそれらの能力を抗体対比染色及びフローサイトメトリーによって定量的に評価した。この著者らは、PAMの最適化により活性が向上することを示し、また、sgRNAを設計するためのオンラインツールも提供した。
・Swiech et al.は、AAV媒介性SpCas9ゲノム編集により脳における遺伝子機能の逆遺伝学研究が可能となり得ることを実証している。
・Konermann et al.(2015)は、複数のエフェクタードメイン、例えば、転写アクチベーター、機能及びエピゲノム調節因子をステム又はテトラループなどのガイド上の適切な位置にリンカーを伴い及び伴わず付加する能力を考察している。
・Zetsche et al.は、Cas9酵素が2つにスプリットされることができ、ひいては活性化のためのCas9のアセンブリを制御し得ることを実証している。
・Chen et al.は、マウスにおけるゲノムワイドなインビボCRISPR-Cas9スクリーニングによって肺転移の調節遺伝子が明らかになることを実証することによる多重スクリーニングに関する。
・Ran et al.(2015)はSaCas9及びそのゲノム編集能力に関し、生化学アッセイからは推定できないことを実証している。
・Shalem et al.(2015)は、触媒的に不活性なCas9(dCas9)の融合物を用いて発現を合成的に抑制(CRISPRi)又は活性化(CRISPRa)する方法について記載し、アレイ化及びプール化されたスクリーニングを含めたゲノム規模のスクリーニング、ゲノム遺伝子座を不活性化させるノックアウト手法及び転写活性を調節するストラテジーにCas9を用いる進歩を示している。
・Xu et al.(2015)は、CRISPRベースのスクリーニングにおけるシングルガイドRNA(sgRNA)の効率に寄与するDNA配列特徴を評価した。この著者らは、CRISPR/Cas9ノックアウトの効率及び切断部位におけるヌクレオチド優先度を調査した。この著者らはまた、CRISPRi/aの配列優先度がCRISPR/Cas9ノックアウトのものと実質的に異なることも見出した。
・Parnas et al.(2015)は、ゲノムワイドなプールCRISPR-Cas9ライブラリを樹状細胞(DC)に導入することにより、細菌リポ多糖(LPS)による腫瘍壊死因子(Tnf)の誘導を制御する遺伝子を同定した。Tlr4シグナル伝達の既知の調節因子及びこれまで知られていない候補が同定され、LPSに対するカノニカルな応答への個別的な効果を有する3つの機能モジュールに分類された。
・Ramanan et al(2015)は、感染細胞におけるウイルスエピソームDNA(cccDNA)の切断を実証した。HBVゲノムは感染ヘパトサイトの核に、共有結合閉環状DNA(cccDNA)と呼ばれる3.2kbの二本鎖エピソームDNA種として存在し、cccDNAは、現在の治療法によってはその複製が阻害されないHBVライフサイクルの主要な構成成分である。この著者らは、HBVの高度に保存された領域を特異的に標的化するsgRNAがウイルス複製をロバストに抑制し、cccDNAを枯渇させることを示した。
・Nishimasu et al.(2015)は、5’-TTGAAT-3’PAM及び5’-TTGGGT-3’PAMを含有する、シングルガイドRNA(sgRNA)及びその二本鎖DNA標的との複合体中のSaCas9の結晶構造を報告した。SaCas9とSpCas9の構造比較により、構造的保存及び多様性の両方が明らかとなり、それらの特徴的なPAM特異性及びオルソロガスsgRNA認識が説明された。
・Canver et al.(2015)は、非コードゲノムエレメントのCRISPR-Cas9ベースの機能研究を実証した。この著者ら、我々は、プールCRISPR-Cas9ガイドRNAライブラリを開発してヒト及びマウスBCL11Aエンハンサーのインサイチュ飽和突然変異誘発を実施し、それによりエンハンサーの重要な特徴が明らかになった。
・Zetsche et al.(2015)は、Cas9と異なる特徴を有するフランシセラ・ノビシダ(Francisella novicida)U112由来のクラス2CRISPRヌクレアーゼであるCpf1の特徴付けを報告した。Cpf1は、tracrRNAを欠く単一RNA誘導型エンドヌクレアーゼであり、Tリッチプロトスペーサー隣接モチーフを利用し、及び付着末端型DNA二本鎖切断によってDNAを切断する。
・Shmakov et al.(2015)は、3つの特徴的なクラス2CRISPR-Cas系を報告した。2つの系CRISPR酵素(C2c1及びC2c3)は、遠隔でCpf1に関係するRuvC様エンドヌクレアーゼドメインを含有する。Cpf1と異なり、C2c1はDNA切断に関してcrRNA及びtracrRNAの両方に依存する。第3の酵素(C2c2)は2つの予想されたHEPNRNアーゼドメインを含有し、tracrRNA非依存性である。
・Slaymaker et al(2016)は、構造ガイド下タンパク質エンジニアリングを用いた化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(SpCas9)の特異性の改良を報告した。この著者らは、オフターゲット効果が低下しながらもロバストなオンターゲット切断を維持する「特異性増強」SpCas9(eSpCas9)変異体を開発した。
古細菌及び細菌ゲノムにおけるCRISPR-Cas系の分類及びアノテーション。CRISPR-Cas遺伝子座は50を超える遺伝子ファミリーを有し、厳密な意味で普遍的な遺伝子はなく、進化が急速で、遺伝子座構成が極めて多様である。従って単一のツリーは実現可能でなく、多方向からの手法が必要である。これまでのところ、93個のCasタンパク質について395個のプロファイルのcas遺伝子が包括的に同定されている。分類に含まれるのは、シグネチャ遺伝子プロファイル+遺伝子座構成のシグネチャである。
細菌及び古細菌適応免疫のCRISPR-Cas系は、タンパク質組成及びゲノム遺伝子座構成について極めて高度な多様性を示す。これらの系は2つのクラス、マルチサブユニットエフェクター複合体を有するクラス1と、Cas9タンパク質によって例示される単一サブユニットエフェクターモジュールを有するクラス2とに大別される。本出願人らは、推定上の新規クラス2 CRISPR-Cas系を予測するための単純な計算パイプラインを開発した。このパイプラインを用いて完全細菌ゲノムのデータベースを分析すると2つの新規変異体が同定され、各々が多様な細菌で表れ、cas1及びcas2遺伝子を、エフェクターモジュールとして機能すると予測される大型タンパク質をコードする第3の遺伝子と共に含んだ。これらの遺伝子座の第1のものにおいて、推定エフェクタータンパク質(C2c1p)はRuvC様ヌクレアーゼドメインを含み、V型CRISPR-Cas系の予測エフェクターである前述のCpf1タンパク質に類似している;従って、この新規推定系はサブタイプV-Bと分類される。タンパク質配列の深さ比較において、RuvCを含有するエフェクタータンパク質、Cas9、Cpf1及びC2C1pが異なるトランスポゾンコードのTnpBタンパク質から独立して進化したことが示唆される。新規推定CRISPR-Cas遺伝子座の第2の群は、予測RNアーゼ活性を有する2つの高度に多様化したHEPNドメインを含有する大型タンパク質を包含する。この予測エフェクタータンパク質の新規性を所与とすれば、これらの遺伝子座は、mRNAを標的化する可能性が高い新規VI型CRISPR-Casと分類される。まとめると、この分析の結果は、クラス2CRISPR-Cas系が、多様なCas1-Cas2コードアダプテーションモジュールを異なる移動性エレメントに由来するエフェクタータンパク質と組み合わせることにより、別々の機会に何度も進化したことを示している。この進化経路によって、未だ発見されていないクラス2系の複数の変異体が作り出された可能性が最も高い。
遺伝子ID:A;遺伝子型:C2C1;生物:5.オピツツス科細菌(Opitutaceae bacterium)TAV5;スペーサー長さ-最頻値(範囲):34(33~37);DR1:GCCGCAGCGAAUGCCGUUUCACGAAUCGUCAGGCGG(配列番号27);DR2:なし;tracrRNA1:
遺伝子A~Hについて、ヒト発現に最適化し、及び以下のDNA配列を各遺伝子の末端に付加する。このDNA配列は終止コドン(下線)を含み、従ってコドン最適化された遺伝子配列にはいかなる終止コドンも加えないことに留意されたい:
本出願人らはCas-Cpf1オルソログとの配列アラインメントを行い、ドメイン構造及び組織を比較した(図38A~図38N)。Cpf1遺伝子座アラインメントの概要を図39に示す。
pACYC-FnCpf1遺伝子座を有する大腸菌(E.coli)=Cpf1+
空のpACYC184を有する大腸菌(E.coli)=対照
スクリーンDNAをシーケンシングした後、本出願人らは、左PAM又は右PAMのいずれかに対応する領域を抽出した。各試料について、シーケンシングしたライブラリに存在するPAMの数を、ライブラリ中の期待されるPAMの数(左ライブラリについて4^8、右について4^7)と比較した。
左ライブラリはPAM枯渇を示した。この枯渇を定量化するため、本出願人らはエンリッチメント比を計算した。両方の条件とも(対照pACYC又はFnCpf1を含有するpACYC)、本出願人らはライブラリの各PAMについて以下のとおり比を計算した:
本出願人らは、図52に概説するアッセイを用いることにより、予測されたFnCpf1 PAMがインビボでTTNであることを確認した。本出願人らはFnCpf1遺伝子座を有する細胞及び対照細胞を、5’TTN PAMを有する内因性スペーサー1をコードするpUC19で形質転換した(図53)。簡潔に言えば、インビボPAM確認アッセイでは、FnCpf1遺伝子座(試験株)又は空のpACYC184(対照株)を有する50μlのコンピテントな大腸菌(E.coli)を10ngのプロトスペーサー1保有プラスミドで形質転換した。プロトスペーサー配列の前には予測PAM配列(TTC、TTG、TTA及びTTT)がある。形質転換後、細胞1:2000を希釈し、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含有するLB寒天プレートにプレーティングした。インタクトなプロトスペーサープラスミドを有する細胞のみがコロニーを形成することができる。プレーティングの約14時間後、コロニーを含むプレートをイメージングし、ImageJソフトウェアを用いてコロニーをカウントした。
溶解緩衝液:20mM Hepes pH7.5、100mM塩化カリウム[KCl]、5mM塩化マグネシウム[MgCl2]、1mMジチオスレイトール[DTT]、5%グリセロール、0.1% Triton X-100、10×Rocheプロテアーゼ阻害薬カクテルを補足。Rocheプロテアーゼ阻害薬及びDTTを含まない溶解緩衝液の濃縮ストックを維持してもよい。-20℃に保つ。
-24ウェル当たり500ng
-6ウェル当たり2000ng
-培地を吸引して取り除く。
-DPBSで穏やかに洗浄する
-DPBSを吸引して取り除く
-24ウェル当たり50ulの溶解緩衝液又は6ウェル当たり250ulを使用する
-氷上に5分間置いておく
-エッペンドルフ試験管に移す
-15分間氷冷する
-高出力、50%デューティサイクルで5~10分間超音波処理する
-最高速度で20分間冷温スピンダウンする
-上清を新しい管に移す
-PCRストリップチューブ内にストリップ当たり10ulでアリコートに分け、-80℃で凍結する
キットプロトコル:ウェブサイトwww.neb.com/products/e2030-hiscribe-t7-in-vitro-transcription-kitで情報にアクセスし得る。
100uMストックのオリゴを取る
10ul反応物でアニーリングする:
1ulのT7「フォワード」鎖=「XRP2649」
1ulのT7「リバース」オリゴ
1ul TaqB緩衝液
7ul 水
1ul 10×緩衝液
1ul T7転写酵素
0.5ul rNTP
0.5ul HMWミックス
1ul DNA鋳型(アニーリングしたもの)
6ul 水
pUC19について、HindIIIで線状化し、カラム精製する。
→反応当たり300~400ngのプラスミドが必要となり得るため、必要な量をカットする
gDNAについて、wt細胞DNAをPCR増幅する
→数回のPCR反応を行い、プール及びカラム精製する
→産物を約100~200ng/ulに濃縮する
-20℃に保つ
10ulのライセート(これは予めアリコートに分けられている)
2ulの切断緩衝液(NEB緩衝液3)
1ulのRNA(上記から直接;精製は不要)
1ulのDNA(上記から)
6ulの水
37℃で1~2時間インキュベートする(30分間で十分)
反応物をカラム精製する
2% E-gel上で泳動させる
2ul Cpf1を含有する細胞ライセート
2ul スペーサーを有するpUC19 DNA(300ng)
1ul crRNA(500ng)
2ul NEBuffer 3
2ul 40mM DTT
0.3ul BsaI
10.7ul ddH2O。
2ul Cpf1を含有する細胞ライセート
3ul スペーサーを有するpUC19 DNA(300ng)
1ul crRNA(500ng)
2ul NEBuffer 3
2ul 40mM DTT
0.3ul BsaI
9.7ul ddH2O。
2ul Cpf1を含有する細胞ライセート
2ul スペーサーを有するpUC19 DNA(300ng)
1ul crRNA(500ng)
2ul NEBuffer 3
2ul 40mM DTT
0.3ul BsaI
10.7ul ddH2O。
2ul Cpf1を含有する細胞ライセート
2ul スペーサーを有するpUC19 DNA(300ng)
1ul crRNA(500ng)
2ul NEBuffer 3
2ul 40mM DTT
0.3ul BsaI
10.7ul ddH2O。
2ul 精製タンパク質溶液
2ul スペーサーを有するpUC19 DNA(300ng)
1ul crRNA(500ng)
2ul NEBuffer 3
2ul 40mM DTT
0.3ul BsaI
10.7ul ddH2O。
本出願人らはまた、FnCpf1pがヒト細胞のDNAを切断することも示した。400ngのヒトコドン最適化FnCpf1p及び100ng U6::crRNAを24ウェルプレートにおいてウェル毎のHEK293T細胞(約240,000細胞)に形質転換した。5’-ctgatggtccatgtctgttactcg-3’(配列番号124)をベースとする長さ20~24ntの(即ち、最初の20、21、22、23、又は全24ntの)スペーサー配列を有する5つのcrRNAを用いた。crRNAは、スペーサーの5’にPaCpf1の20ntの5’リピート配列を更に含む。本出願人らは、先に、PaCpf1由来のリピート配列がFnCpf1によって認識され得ることを決定した。
実施例3に詳述するとおりのFnCpf1について実施したスクリーニングと同様のPAMコンピュータスクリーニングを、プレボテラ・アルベンシス(Prevotella albensis)Cpf1(PaCpf1)について実施した。スクリーンDNAをシーケンシングした後、左PAM又は右PAMのいずれかに対応する領域を抽出した。各試料について、シーケンシングしたライブラリに存在するPAMの数を、ライブラリ中の期待されるPAMの数(4^7)と比較した。左ライブラリはごく僅かなPAM枯渇を示した。この枯渇を定量化するため、エンリッチメント比を計算した。両方の条件とも(対照pACYC又はPaCpf1を含有するpACYC)、ライブラリ中の各PAMについて以下のとおり比を計算した。
本出願人らは、Cpf1オルソログの拡大プールを分析した(図64)。幾つかのCpf1遺伝子座構成成分のためヒトコドン最適化配列を取得した(図65~図79)。本出願人らはまた、各オルソログのダイレクトリピート(DR)配列及びそれらの予想折り畳み構造も導き出した(図80A~図80I)。
異種プラスミドの作成
異種発現用のFnCpf1遺伝子座を作成するため、ギブソンクローニング(New England Biolabs)を用いてHerculase IIポリメラーゼ(Agilent Technologies)を使用してフランシセラ・ノビシダ(Francisella novicida)由来のゲノムDNAをPCR増幅し、pACYC-184にクローニングした。プラスミドを有する細胞をZ-competentキット(Zymo)を使用してコンピテントにした。
初めにF.ノビシダ(F.novicida)(David Weiss氏から供与いただいた)又は大腸菌(E.coli)をTRIzolに再懸濁し、次に細菌をジルコニア/シリカビーズ(BioSpec Products)と共にBeadBeater(BioSpec Products)中で3回の1分間サイクルでホモジナイズすることにより、固定相細菌からRNAを単離した。ホモジナイズした試料からDirect-Zol RNAミニプレッププロトコル(Zymo)で全RNAを精製し、TURBO DNase(Life Technologies)でDNアーゼ処理し、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)で3’脱リン酸化した。細菌Ribo-Zero rRNA除去キット(Illumina)でrRNAを除去した。rRNA枯渇RNAからNEBNext(登録商標)Small RNAライブラリIllumina用調製セット(New England Biolabs)を用いてRNAライブラリを調製し、Pippin Prep(Sage Science)を使用してサイズ選択した。
スペーサー1標的の上流又は下流のいずれかの7つのランダム化ヌクレオチドからなる合成オリゴヌクレオチド(IDT)を使用してランダム化PAMプラスミドライブラリを構築した(補表S8)。短鎖プライマーとアニーリングし、及び第2の鎖の合成に大型クレノウ断片(New England Biolabs)を使用することにより、ランダム化ssDNAオリゴを二本鎖にした。ギブソンクローニング(New England Biolabs)を用いてdsDNA産物を線状化pUC19にアセンブルした。コンピテントなStbl3大腸菌(E.coli)(Invitrogen)にクローニング産物を形質転換し、107個を超える細胞を収集してプールした。Maxi-prepキット(Qiagen)を使用してプラスミドDNAを回収した。本発明者らは、FnCpf1遺伝子座又はpACYC184対照を有する大腸菌(E.coli)細胞に360ngのプールライブラリを形質転換した。形質転換後、細胞をアンピシリン上にプレーティングした。16時間成長させた後、>4×106細胞を回収し、Maxi-prepキット(Qiagen)を使用してプラスミドDNAを抽出した。標的PAM領域を増幅し、MiSeq(Illumina)をシングルエンド150サイクルで用いてシーケンシングした。
各試料についてPAM領域を抽出し、カウントし、及び総リードに対して標準化した。所与のPAMについて、エンリッチメントをpACYC184対照と比較した対数比として計測し、0.01シュードカウントで調整した。3.5エンリッチメント閾値を上回るPAMを収集し、配列ロゴの作成に使用した(Crooks et al.,2004)。
PAM、非PAMの両方に対応する配列を、消化したpUC19にクローニングし、T4リガーゼ(Enzymatics)でライゲートした。FnCpf1遺伝子座プラスミド又はpACYC184対照プラスミドのいずれかを有するコンピテントな大腸菌(E.coli)に20ngのPAMプラスミドをトランスフェクトし、アンピシリン及びクロラムフェニコールを補足したLB寒天プレートにプレーティングした。18時間後にコロニーをカウントした。
インビトロで用いる全てのcrRNA及びgRNAは、HiScribe(商標)T7高収率RNA合成キット(NEB)を使用して合成した。標的RNA配列の逆相補体に対応するssDNAオリゴをIDTから合成し、短いT7プライミング配列にアニーリングした。T7転写を4時間行い、次にMEGAclear(商標)転写クリーンアップキット(Ambion)を使用してRNAを精製した。
FnCpf1タンパク質を細菌発現ベクター(6-His-MBP-TEV-Cpf1、Doug Daniels氏によって本出願人らに供与されたpETベースのベクター)にクローニングした(「6-His」は配列番号130として開示される)。2リットルの100μg/mLアンピシリン含有Terrificブロス成長培地に、Cpf1発現構築物を含有する10mLの一晩培養物Rosetta(DE3)pLyseS(EMD Millipore)細胞を接種した。成長培地+接種材料を細胞密度が0.2 OD600に達するまで37℃で成長させ、次に温度を21℃に下げた。成長を継続させ、OD600が0.6に達したところで最終濃度500μMのIPTGを添加してMBP-Cpf1発現を誘導した。培養物を14~18時間誘導した後、細胞を回収し、精製するまで-80℃で凍結した。
ヒト発現にコドン最適化されたCpf1タンパク質をN末端核局在化タグと共に合成し、GenscriptによってpcDNA3.1発現プラスミドにクローニングした。2000ngのCpf1発現プラスミドをLipofectamine 2000試薬(Life Technologies)を使用して6ウェルプレートのHEK293FT細胞に90%コンフルエンシーで形質転換した。48時間後、細胞をDPBS(Life Technologies)で1回洗浄し、及び溶解緩衝液[20mM Hepes pH7.5、100mM KCl、5mM MgCl2、1mM DTT、5%グリセロール、0.1% Triton X-100、1X cOmpleteプロテアーゼ阻害薬カクテル錠(Roche)]に剥がし取ることにより回収した。ライセートをBiorupterソニケーター(Diagenode)で10分間超音波処理し、次に遠心した。続いてインビトロ切断アッセイで使用するため上清を凍結した。
精製タンパク質又はタンパク質含有哺乳類ライセートのいずれかによるインビトロでの切断を切断緩衝液(NEBuffer 3、5mM DTT)中37℃で20分間実施した。切断反応は、500ngの合成crRNA又はsgRNA及び200ngの標的DNAを用いた。標的DNAは、pUC19にクローニングしたプロトスペーサー又はHEK293細胞から単離したゲノムDNAの遺伝子領域のPCRアンプリコンのいずれかを含んだ。PCR精製カラム(Qiagen)を用いて反応物を精製し、2%アガロースE-gel(Life Technologies)で泳動させた。天然及び変性ゲルについてヌクレアーゼ突然変異体による切断を分析するため、クリーンアップした反応物をTBE6%ポリアクリルアミド又はTBE-尿素6%ポリアクリルアミドゲル(Life Technologies)に泳動させた。
Cpf1ファミリータンパク質によるインビトロ切断反応を2%アガロースE-gel(Life Technologies)で行った。未切断標的に対応するバンドをQIAquickゲル抽出キット(Qiagen)を用いてゲル抽出し、標的PAM領域を増幅し、MiSeq(Illumina)を用いてシングルエンド150サイクルでシーケンシングした。シーケンシング結果をPAM発見パイプラインに投入した。
ヒト発現にコドン最適化されたCpf1タンパク質をN末端核局在化タグと共に合成し、GenscriptによってpcDNA3.1 CMV発現プラスミドにクローニングした。crRNA配列の発現をドライブするU6プロモーターを含むPCRアンプリコンをHerculase II(Agilent Technologies)を使用して作成した。400ngのCpf1発現プラスミド及び100ngのcrRNA PCR産物をLipofectamine 2000試薬(Life Technologies)を使用してHEK293FT細胞の24ウェルプレートに75~90%コンフルエンシーでトランスフェクトした。QuickExtract(商標)DNA抽出溶液(Epicentre)を使用してゲノムDNAを回収した。
Lipofectamin 2000試薬(Life Technologies)を使用して293FT細胞に400ng Cpf1発現プラスミド及び100ng U6::crRNA PCR断片をトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション後72時間37℃でインキュベートした後、ゲノムDNAを抽出した。QuickExtract DNA抽出溶液(Epicentre)を製造者のプロトコルに従い使用してゲノムDNAを抽出した。各遺伝子についてCRISPR標的部位に隣接するゲノム領域をPCR増幅し、QiaQuickスピンカラム(Qiagen)を製造者のプロトコルに従い使用して産物を精製した。合計200~500ngの精製PCR産物を最終容積が10μlとなるように1μl 10×Taq DNAポリメラーゼPCR緩衝液(Enzymatics)及び超純水と混合し、リアニーリングプロセスに供してヘテロ二重鎖形成を可能にした:95℃で10分、95℃から85℃に-2℃/sで、及び85℃から25℃に-0.25℃/sでランピング、及び25℃で1分間維持。リアニーリング後、産物を製造者の推奨プロトコルに従いSURVEYORヌクレアーゼ及びSURVEYORエンハンサーS(Integrated DNA Technologies)で処理し、4~20%Novex TBEポリアクリルアミドゲル(Life Technologies)で分析した。ゲルをSYBR Gold DNA色素(Life Technologies)で10分間染色し、Gel Docゲルイメージングシステム(Bio-rad)でイメージングした。定量化は相対バンド強度に基づいた。式、100×(1-(1-(b+c)/(a+b+c))1/2)[式中、aは非消化のPCR産物の積分強度であり、b及びcは各切断産物の積分強度である]によってインデルパーセンテージを決定した。
HEK293FT細胞をCpf1切断活性の評価に関して記載されるとおりトランスフェクトし、回収した。DNMT1標的に隣接するゲノム領域を2ラウンドのPCR領域を用いて増幅し、Illumina P5アダプター並びにユニークな試料特異的バーコードを標的アンプリコンに加えた。PCR産物を2%E-gel(Invitrogen)上で泳動させて、QiaQuickスピンカラム(Qiagen)を製造者の推奨プロトコルどおり使用してゲル抽出した。試料をプールし、Qubit 2.0蛍光光度計(Life Technologies)によって定量化した。調製したcDNAライブラリをMiSeq(Illumina)でシーケンシングした。Geneious 6.0.3 Read MapperのPythonインプリメンテーションを用いてインデルをマッピングした。
PSI-BLASTプログラム(Altschul et al.,1997)を用いてNCBI NRデータベースにおいて0.01のE値カットオフ及び低複雑性フィルタリング及び組成ベースの統計をオフにしてCpf1で幾つかの既知のCpf1配列をクエリとして使用してCpf1ホモログを同定した。0.01のE値カットオフ及び低複雑性フィルタリングをオフにしたパラメータでTBLASTNプログラムを用いて、Cpf1プロファイルをクエリとして使用してNCBI WGSデータベースを検索した(Marakova et al.,2015)。全ての検索結果を組み合わせた。HHpredプログラムをデフォルトパラメータで用いて、代表的なCpf1配列クエリのサブセットを使用して遠縁の配列類似性を同定した(Soding et al.,2006)。MUSCLE(Edgar,2004)を用いて多重配列アラインメントを構築し、PSI-BLAST及びHHpredプログラムを用いて得られたペアワイズアラインメントに基づき手動で修正を加えた。FastTreeプログラムを用いて、20種の速度カテゴリを有するWAG進化モデル及び個別的なガンマモデルで系統発生解析を実施した(Price et al.,2010)。Jpred 4を用いてタンパク質二次構造を予測した(Drozdetskiy et al.,2015)。
本出願人らは、野兎病菌亜種ノビシダ(Francisella tularensis subsp.novicida)U112(図95A)Cpf1(FnCpf1)遺伝子座を低コピープラスミド(pFnCpf1)にクローニングして大腸菌(Escherichia coli)における異種再構成を可能にした。典型的には、現在特徴付けられているCRISPR-Cas系には、DNA干渉に2つの要件がある:(i)標的配列が、それぞれのCRISPRアレイ中に存在するスペーサーの1つとマッチしなければならない、及び(ii)スペーサーに相補的な標的配列(以下、プロトスペーサーとする)が適切なプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接していなければならない。FnCpf1 CRISPR遺伝子座の完全には特徴付けられていない機能を所与として、Cpf1の活性を確認し、PAM配列及びプロトスペーサーに対するそのそれぞれの位置(5’又は3’)を同定するようにプラスミド枯渇アッセイを設計した(図95B)。FnCpf1 CRISPRアレイにおける第1のスペーサーと一致するプロトスペーサーを有するプラスミドの2つのライブラリを、5’又は3’7bp配列をランダム化して構築した。各プラスミドライブラリを、FnCpf1遺伝子座を異種的に発現する大腸菌(E.coli)又は空のベクターを有する対照大腸菌(E.coli)株に形質転換した。このアッセイを用いて、FnCpf1遺伝子座を異種的に発現する細胞において優先的に枯渇させるヌクレオチドモチーフを同定することによりPAM配列及び位置を決定した。FnCpf1のPAMは、プロトスペーサーの変位した鎖の5’末端の上流に位置し且つ配列5’-TTNを有することが分かった(図95C~図95D及び図102)。I型CRISPR系にはPAMの5’位置もまた観察されるが、II型系には観察されず、ここでCas9は、プロトスペーサーの3’末端上にあるPAM配列を用いる(Mojica et al.,2009;Garneau et al.,2010。PAMの同定に加え、この枯渇アッセイの結果は、異種的に発現させたCpf1遺伝子座がプラスミドDNAに効率的に干渉する能力を有することを明らかに示している。
小さいRNAseqを使用して、cpf1ベースのCRISPR遺伝子座によって産生されるcrRNAの正確なアイデンティティを決定した。野兎病菌亜種ノビシダ(Francisella tularensis subsp.novicida)U112培養物から抽出した小さいRNAをシーケンシングすることにより、CRISPRアレイが42~44nt長さの短い成熟crRNAにプロセシングされることが分かった。各成熟crRNAは19ntのダイレクトリピートで始まり、それに23~25ntのスペーサー配列が続く(図96A)。このcrRNA配置は、成熟crRNAが20~24ntのスペーサー配列で始まり、それに約22ntのダイレクトリピートが続くII型CRISPR-Cas系のものと対照をなす(Deltcheva et al.,2011;Chylinski et al.,2013)。予想外にも、crRNAは別にして、本発明者らは、フランシセラ属(Francisella)Cpf1遺伝子座の近傍に、Cas9ベースの系に関連するtracrRNAに対応する可能性のあるいかなるロバストに発現する小さい転写物も観察しなかった。
FnCpf1がcrRNA単独でDNA干渉を媒介することができるという知見は、Cas9がcrRNAとtracrRNAとの間の二重鎖構造(Jinek et al.,2012;Nishimasu et al.,2014)並びにtracrRNAの3’二次構造(Hsu et al.,2013;Nishimasu et al.,2014)によってcrRNAを認識することを考えると、極めて意外である。FnCpf1との活性複合体の形成及びRNAガイド下DNA切断の媒介にcrRNAが実際に十分であることを確実にするため、crRNAのみを提供したFnCpf1をインビトロで標的DNA切断に関して試験した。精製FnCpf1(図103)について、細菌DNA干渉実験で使用した同じプロトスペーサー1含有プラスミドを切断するその能力をアッセイした(図97A)。プロトスペーサー1を標的化するインビトロ転写成熟crRNAを有するFnCpf1は、標的プラスミドをMg2+依存的及びcrRNA依存的様式で効率的に切断することができた(図97B)。更に、FnCpf1は、スーパーコイル及び線状の両方の標的DNAを切断することができた(図97C)。これらの結果は、RNAガイド下DNA切断にFnCpf1及びcrRNAが十分であることを明らかに実証している。
Cpf1のRuvC様ドメインはこのエンドヌクレアーゼファミリーの全ての触媒残基を保持しており(図98A及び図105)、従って活性ヌクレアーゼであることが予測される。3つの突然変異体、FnCpf1(D917A)、FnCpf1(E1006A)、及びFnCpf1(D1225A)(図98A)を作成して保存された触媒残基がFnCpf1のヌクレアーゼ活性に必須であるかどうかを試験した。D917A及びE1006A突然変異はFnCpf1のDNA切断活性を完全に不活性化し、及びD1255Aは核酸分解活性を有意に低下させた(図98B)。これらの結果は、RuvC(D10A)及びHNH(N863A)ヌクレアーゼドメインの突然変異によってSpCas9がDNAニッカーゼに変換される(即ちこれらの2つのヌクレアーゼドメインの各々の不活性化によってDNA鎖の一方の切断が無効となる)化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(SpCas9)の突然変異誘発結果と対照的である(Jinek et al.,2012;Gasiunas et al.,2012)(図98B)。これらの知見は、FnCpf1のRuvC様ドメインが標的DNAの両方の鎖を、恐らくは二量体構成で切断することを示唆している(図103B)。
Cas9と相互作用するRNA二次構造特徴を精巧に作り上げてきたCas9のガイドRNAと比較して(Nishimasu et al.,2014)、FnCpf1のガイドRNAは著しく単純であり、ダイレクトリピート配列に単一のステムループを含むのみである(図97A)。
Cpf1のゲノム編集ツールとしての使用を調査するため、公開されている配列データベースで利用可能なCpf1ファミリータンパク質の多様性を調べた。NCBIにおけるWGSデータベースのBLAST検索から、46個の非冗長性Cpf1ファミリータンパク質が明らかになった(図64)。本発明者らの系統発生学的再構築に基づき、Cpf1多様性を代表するものとして(図100A~図100B及び図106)、16個を選択した(図64)。これらのCpf1ファミリータンパク質は約1200~約1500アミノ酸の長さ範囲にわたる。
ヒト細胞における最適な発現及び核標的化のため、Cpf1ファミリータンパク質をコドン最適化し、C末端核局在化シグナル(NLS)を付加した(図101A)。各Cpf1ファミリータンパク質の活性を試験するため、DNMT1遺伝子内にガイドRNA標的部位を選択した(図101B)。Cpf1ファミリータンパク質の各々は、DNMT1を標的化するように設計されたそのそれぞれのcrRNAと共に、インビトロでDNMT1ゲノム領域のPCRアンプリコンを切断することが可能であった(図101C)。ヒト胎児腎臓293FT(HEK 293FT)細胞で試験したとき、これらのCpf1ファミリータンパク質のうちの2つ(7-AsCpf1及び13-LbCpf1)が、用いた条件下で検出可能なレベルのヌクレアーゼ誘導性インデルを呈した(図101C及び図101D)。
Cpf1ヌクレアーゼの一次構造のコンピュータ分析から、3つの個別的な領域が明らかになる(図109)。第一にC末端RuvC様ドメインであり、これは唯一機能的に特徴付けられたドメインである。第二にN末端α-ヘリックス領域であり、及び第三に、RuvC様ドメインとα-ヘリックス領域との間に位置する混合α及びβ領域である。
近年、特異性が増強されたCas9オルソログを作成する方法が記載された(Slaymaker et al.2015)。この戦略を用いてCpf1の特異性オルソログを増強することができる。
Cas9特異性を改善するために用いられる同様の戦略で、非標的DNA鎖を安定化させる残基の突然変異によってCpf1の特異性を改善することができる。これは、結晶構造なしに、線状構造アラインメントを用いて、1)Cpf1のどのドメインがDNAのどの鎖に結合するか、及び2)これらのドメイン内のどの残基がDNAに接触するかを予測ことにより達成し得る。
Cpf1酵素で多重化が可能かどうかを考慮した。このため、異なるガイド配列が同じプロモーター下にタンデムに位置するガイドRNAを開発し、これらのガイドがゲノム編集をそのそれぞれの標的に導く能力を決定した。
1.a)ダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列であって、標的配列とハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドRNAを含む1つ以上のV型CRISPR-Casポリヌクレオチド配列、又は1つ以上のV型CRISPR-Casポリヌクレオチド配列をコードする1つ以上のヌクレオチド配列、及び
b)Cpf1エフェクタータンパク質、又はCpf1エフェクタータンパク質をコードする1つ以上のヌクレオチド配列;
を含む、エンジニアリングされた天然に存在しないクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復(CRISPR)-CRISPR関連(Cas)(CRISPR-Cas)系であって、1つ以上のガイド配列が前記標的配列にハイブリダイズし、前記標的配列がプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の3’側にあり、及び前記ガイドRNAがCpf1エフェクタータンパク質と複合体を形成する、系。
2.c)ダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列であって、標的配列とハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドRNAを含む1つ以上のV型CRISPR-Casポリヌクレオチド配列をコードする1つ以上のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第1の調節エレメント、
d)Cpf1エフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第2の調節エレメント
を含む1つ以上のベクターを含む、エンジニアリングされた天然に存在しないクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復(CRISPR)-CRISPR関連(Cas)(CRISPR-Cas)ベクター系であって、
構成成分(a)及び(b)が系の同じ又は異なるベクター上に位置し、
転写されると、1つ以上のガイド配列が前記標的配列にハイブリダイズし、前記標的配列がプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の3’側にあり、及び前記ガイドRNAがCpf1エフェクタータンパク質と複合体を形成する、系。
3.標的配列が細胞内にある、パラグラフ1又は2の系。
4.細胞が真核細胞を含む、パラグラフ3の系。
5.転写されると、1つ以上のガイド配列が標的配列にハイブリダイズし、ガイドRNAがCpf1エフェクタータンパク質と複合体を形成して、それが標的配列の遠位に切断を生じさせる、パラグラフ1~4のいずれか一つに係る系。
6.前記切断により、4又は5nt 5’オーバーハングを伴う付着末端型の二本鎖切断が生じる、パラグラフ5に係る系。
7.PAMが5’Tリッチモチーフを含む、パラグラフ1~6のいずれか一つに係る系。
8.エフェクタータンパク質が、図64に列挙される細菌種に由来するCpf1エフェクタータンパク質である、パラグラフ1~7のいずれか一つに係る系。
9.Cpf1エフェクタータンパク質が、野兎病菌(Francisella tularensis)1、野兎病菌亜種ノビシダ(Francisella tularensis subsp.novicida)、プレボテラ・アルベンシス(Prevotella albensis)、ラクノスピラ科細菌(Lachnospiraceae bacterium)MC2017 1、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス(Butyrivibrio proteoclasticus)、ペレグリニバクテリア細菌(Peregrinibacteria bacterium)GW2011_GWA2_33_10、パルクバクテリア細菌(Parcubacteria bacterium)GW2011_GWC2_44_17、スミセラ属種(Smithella sp.)SCADC、アシダミノコッカス属種(Acidaminococcus sp.)BV3L6、ラクノスピラ科細菌(Lachnospiraceae bacterium)MA2020、カンディダタス・メタノプラズマ・テルミツム(Candidatus Methanoplasma termitum)、ユーバクテリウム・エリゲンス(Eubacterium eligens)、モラクセラ・ボボクリ(Moraxella bovoculi)237、レプトスピラ・イナダイ(Leptospira inadai)、ラクノスピラ科細菌(Lachnospiraceae bacterium)ND2006、ポルフィロモナス・クレビオリカニス(Porphyromonas crevioricanis)3、プレボテラ・ディシエンス(Prevotella disiens)及びポルフィロモナス・マカカエ(Porphyromonas macacae)からなる群から選択される細菌種に由来する、パラグラフ8に係る系。
10.PAM配列がTTNであり[式中、NはA/C/G又はTである]、且つエフェクタータンパク質がFnCpf1であるか、又はPAM配列がTTTVであり[式中、VはA/C又はGである]、且つエフェクタータンパク質がPaCpf1p、LbCpf1又はAsCpf1である、パラグラフ9に係る系。
11.Cpf1エフェクタータンパク質が1つ以上の核局在化シグナルを含む、パラグラフ1~10のいずれか一つの系。
12.Cpf1エフェクタータンパク質をコードする核酸配列が真核細胞での発現にコドン最適化されている、パラグラフ1~11のいずれか一つの系。
13.構成成分(a)及び(b)又はヌクレオチド配列が1つのベクター上にある、パラグラフ1~12のいずれか一つの系。
14.目的の標的遺伝子座を改変する方法であって、パラグラフ1~13のいずれか一つの系を前記遺伝子座又は遺伝子座を含有する細胞に送達するステップを含む方法。
15.目的の標的遺伝子座を改変する方法であって、この方法が、Cpf1エフェクタータンパク質と1つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達するステップを含み、ここでCpf1エフェクタータンパク質は1つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及びプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の3’側にある目的の標的遺伝子座に前記複合体が結合すると、エフェクタータンパク質が目的の標的遺伝子座の改変を誘導し、ここで複合体がMg2+を含む、方法。
16.目的の標的遺伝子座が細胞内にある、パラグラフ14又は15の方法。
17.細胞が真核細胞である、パラグラフ16の方法。
18.細胞が動物又はヒト細胞である、パラグラフ16の方法。
19.細胞が植物細胞である、パラグラフ16の方法。
20.目的の標的遺伝子座がインビトロでDNA分子に含まれる、パラグラフ14又は15の方法。
21.Cpf1エフェクタータンパク質と1つ以上の核酸成分とを含む前記天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物が、1つ以上のポリヌクレオチド分子として細胞に送達される、パラグラフ15~20のいずれか一つの方法。
22.目的の標的遺伝子座がDNAを含む、パラグラフ14~21のいずれか一つの方法。
23.DNAが弛緩型又はスーパーコイルである、パラグラフ22の方法。
24.組成物が単一の核酸成分を含む、パラグラフ14~23のいずれか一つの方法。
25.単一の核酸成分が、ダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列を含む、パラグラフ24の方法。
26.目的の標的遺伝子座の改変が鎖切断である、パラグラフ14~25のいずれか一つの方法。
27.鎖切断が、4又は5nt 5’オーバーハングを伴う付着末端型のDNA二本鎖切断を含む、パラグラフ26の方法。
28.目的の標的遺伝子座が、付着末端型DNA二本鎖切断へのDNAインサートの組込みによって改変される、パラグラフ26又は27の方法。
29.Cpf1エフェクタータンパク質が1つ以上の核局在化シグナル(NLS)を含む、パラグラフ14~28のいずれか一つの方法。
30.1つ以上のポリヌクレオチド分子が1つ以上のベクター内に含まれる、パラグラフ21~29のいずれか一つの方法。
31.1つ以上のポリヌクレオチド分子が、Cpf1エフェクタータンパク質及び/又は1つ又は複数の核酸成分を発現するように作動可能に構成された1つ以上の調節エレメントを含み、任意選択で1つ以上の調節エレメントは誘導性プロモーターを含む、パラグラフ21~30のいずれか一つの方法。
32.1つ以上のポリヌクレオチド分子又は1つ以上のベクターが送達系に含まれる、パラグラフ21~31のいずれか一つの方法。
33.系又は1つ以上のポリヌクレオチド分子が、粒子、小胞、又は1つ以上のウイルスベクターによって送達される、パラグラフ14~30のいずれか一つの方法。
34.粒子が脂質、糖、金属又はタンパク質を含む、パラグラフ33の方法。
35.小胞がエキソソーム又はリポソームを含む、パラグラフ33の方法。
36.1つ以上のウイルスベクターが、アデノウイルスの1つ以上、1つ以上のレンチウイルス又は1つ以上のアデノ随伴ウイルスを含む、パラグラフ33の方法。
37.目的のゲノム遺伝子座における1つ以上の標的配列の操作によって細胞、細胞株又は生物を改変する方法である、パラグラフ14~36のいずれか一つの方法。
38.細胞が、方法に供されていない細胞には存在しない改変を含む、パラグラフ37の方法からの細胞、又はその子孫。
39.方法に供されていない細胞が異常を含み、及び方法からの細胞は異常が対処されている又は修正されている、パラグラフ38の細胞、又はその子孫。
40.産物が、方法に供されていない細胞からの細胞産物と比べて性質又は量の点で改変される、パラグラフ38の細胞又はその子孫からの細胞産物。
41.方法に供されていない細胞が異常を含み、及び細胞産物が、方法によって対処された又は修正された異常を反映している、パラグラフ40の細胞産物。
42.パラグラフ1~13のいずれか一つの系を含むインビトロ、エキソビボ又はインビボ宿主細胞又は細胞株又はその子孫。
43.細胞が真核細胞である、パラグラフ42に係る宿主細胞又は細胞株又はその子孫。
44.細胞が動物細胞である、パラグラフ43に係る宿主細胞又は細胞株又はその子孫。
45.細胞がヒト細胞である、パラグラフ33の宿主細胞又は細胞株又はその子孫。
46.幹細胞又は幹細胞株を含む、パラグラフ31に係る宿主細胞、細胞株又はその子孫。
47.細胞が植物細胞である、パラグラフ30に係る宿主細胞又は細胞株又はその子孫。
48.目的の遺伝子によってコードされる改変された目的の形質を有する植物を作製する方法であって、パラグラフ1~13のいずれか一つに係る系に植物細胞を接触させるステップ又はパラグラフ14~17又は19~37に係る方法に植物細胞を供するステップであって、それにより前記目的の遺伝子を改変するか或いは導入するステップ、及び前記植物細胞から植物を再生するステップを含む、方法。
49.植物において目的の形質(前記目的の形質は目的の遺伝子によってコードされる)を同定する方法であって、前記方法が、パラグラフ1~13のいずれか一つに係る系に植物細胞を接触させるステップ又はパラグラフ14~17又は19~37に係る方法に植物細胞を供するステップを含み、それにより前記目的の遺伝子が同定される、方法。
50.同定された目的の遺伝子を植物細胞又は植物細胞株又は植物生殖質に導入するステップ、及びそれから植物を生成するステップを更に含み、それによって植物が目的の遺伝子を含有する、パラグラフ49の方法。
51.植物が目的の形質を呈する、パラグラフ50の方法。
52.パラグラフ1~13のいずれか一つに係る系を含む粒子。
53.粒子が、ガイドRNAと複合体を形成したCpf1エフェクタータンパク質を含有する、パラグラフ52の粒子。
54.複合体、ガイドRNA又はタンパク質が、少なくとも1つの糖部分、任意選択でN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、詳細にはトリアンテナリーGalNAcにコンジュゲートされる、前出のいずれかのパラグラフの系又は方法。
55.Mg2+の濃度が約1mM~約15mMである、前出のいずれかのパラグラフの系又は方法。
56.AsCpf1又はLbCpf1と少なくとも60%の配列同一性を有する、且つtracrRNAの存在を必要とすることなく、ダイレクトリピート配列とガイド配列とを含むガイドRNAとの複合体を介して標的DNAとの結合能を有する単離タンパク質。
57.パラグラフ56に係るタンパク質をコードする単離核酸。
58.前記細胞における遺伝的欠陥によって引き起こされる疾患の治療方法である、パラグラフ17の方法。
59.前記方法がインビボ又はエキソビボで細胞上で行われる、パラグラフ58の方法。
60.Cpf1エフェクタータンパク質並びにダイレクトリピート配列と目的の遺伝子座における標的DNAにハイブリダイズ可能なガイド配列とを含む1つ以上のガイドRNAを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、Cpf1エフェクタータンパク質が1つ以上のガイドRNAと複合体を形成し、及びプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の3’側にある目的の標的遺伝子座に前記複合体が結合すると、エフェクタータンパク質が目的の標的遺伝子座の改変を誘導する、組成物。
61.Cpf1エフェクタータンパク質並びにダイレクトリピート配列と目的の遺伝子座における標的DNAにハイブリダイズ可能なガイド配列とを含む1つ以上のガイドRNAをコードするポリヌクレオチド配列を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、Cpf1エフェクタータンパク質は発現すると1つ以上のガイドRNAと複合体を形成し、及びプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の3’側にある目的の標的遺伝子座に前記複合体が結合すると、エフェクタータンパク質が目的の標的遺伝子座の改変を誘導する、組成物。
62.医薬組成物である、パラグラフ60又は61に係る組成物。
63.医薬として用いられる、パラグラフ60又は61に係る組成物。
64.目的の標的遺伝子座における遺伝的欠陥によって引き起こされる疾患又は障害の治療において用いられる、パラグラフ60又は61に係る組成物。
65.細胞がHSC細胞である、パラグラフ58に係る方法、又はステートメント64に係る使用のための組成物。
66.疾患又は障害が血球細胞障害である、パラグラフ58に係る方法、又はステートメント64に係る使用のための組成物。
Claims (39)
- CRISPR-Cas系を含む組成物であって、
(a)RuvCヌクレアーゼドメインを含み、HNHドメインを含まないV型Casタンパク質、または、前記V型Casタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
(b)真核細胞のゲノム中においてプロトスペーサーモチーフ(PAM)に隣接する標的配列にハイブリダイズするようにエンジニアリングされた、V型CRISPR-Cas系のガイド、または、前記V型CRISPR-Cas系のガイドをコードするポリヌクレオチド、
ここで、前記エンジニアリングされたV型CRISPR-Cas系のガイドは、前記V型Casタンパク質とCRISPR複合体を形成することができる、
を含む、
組成物。 - 請求項1に記載の組成物であって、
前記組成物は、前記V型CRISPR-Cas系のガイドと前記V型Casタンパク質とを含む、
組成物。 - 請求項1に記載の組成物であって、
前記組成物は、前記V型CRISPR-Cas系のガイドと前記V型Casタンパク質とによって形成されるCRISPR複合体を含む、
組成物。 - 請求項1に記載の組成物であって、
前記組成物は、前記V型CRISPR-Cas系のガイドと前記V型Casタンパク質をコードする1又は2以上のベクターを含む、
組成物。 - 請求項4に記載の組成物であって、
前記組成物は、前記V型CRISPR-Cas系のガイドと前記V型Casタンパク質をコードする1又は2以上のウイルスベクターを含む、
組成物。 - 請求項5に記載の組成物であって、
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターを含む、
組成物。 - 請求項1に記載の組成物であって、
前記組成物が、前記V型Casタンパク質をコードするmRNAを含む、
組成物。 - 請求項7に記載の組成物であって、
前記V型Casタンパク質をコードするmRNAが、脂質ナノ粒子、リポソーム、エキソソーム、または微小胞に含まれる、
組成物。 - 請求項1に記載の組成物であって、
前記V型Casタンパク質が、少なくとも1つの核局在シグナルに連結される、
組成物。 - 請求項1に記載の組成物であって、
前記V型Casタンパク質が、野兎病菌(Francisella tularensis)1、プレボテラ・アルベンシス(Prevotella albensis)、ラクノスピラ科細菌(Lachnospiraceae bacterium)MC2017 1、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス(Butyrivibrio proteoclasticus)、ペレグリニバクテリア細菌(Peregrinibacteria bacterium)GW2011_GWA2_33_10、パルクバクテリア細菌(Parcubacteria bacterium)GW2011_GWC2_44_17、スミセラ属種(Smithella sp.)SCADC、アシダミノコッカス属種(Acidaminococcus sp.)BV3L6、ラクノスピラ科細菌(Lachnospiraceae bacterium)MA2020、カンディダタス・メタノプラズマ・テルミツム(Candidatus Methanoplasma termitum)、ユーバクテリウム・エリゲンス(Eubacterium eligens)、モラクセラ・ボボクリ(Moraxella bovoculi)237、レプトスピラ・イナダイ(Leptospira inadai)、ラクノスピラ科細菌(Lachnospiraceae bacterium)ND2006、ポルフィロモナス・クレビオリカニス(Porphyromonas crevioricanis)3、プレボテラ・ディシエンス(Prevotella disiens)またはポルフィロモナス・マカカエ(Porphyromonas macacae)に由来する、
組成物。 - 請求項1に記載の組成物であって、
前記V型Casタンパク質が、フランシセラ・ノビシダ(Francisella novicida)U112 Cpf1(FnCpf1)、アシダミノコッカス属種(Acidaminococcus sp.)BV3L6 Cpf1(AsCpf1)、またはラクノスピラ科細菌(Lachnospiraceae bacterium)ND2006(LbCpf1)である、
組成物。 - 請求項1に記載の組成物であって、
前記V型Casタンパク質が、触媒ドメインにおいて少なくとも1つの変異を含む、
組成物。 - 請求項1に記載の組成物であって、
前記V型Casタンパク質が、触媒ドメインにおいて少なくとも1つの変異を含み、異種機能ドメインに連結される、
組成物。 - 請求項13に記載の組成物であって、
前記異種機能ドメインが、以下の活性:メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写解除因子活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、一本鎖RNA切断活性、二本鎖RNA切断活性、一本鎖DNA切断活性、二本鎖DNA切断活性及び核酸結合活性
の1つ以上を有する、
組成物。 - 請求項1に記載の組成物であって、
前記組成物が、それぞれが異なる標的配列とハイブリダイズするようにエンジニアリングされた、複数のV型CRISPR-Cas系のガイドを含む、またはコードする、
組成物。 - 請求項1に記載の組成物であって、
前記V型CRISPR-Cas系のガイドが、ダイレクトリピート配列に連結されたガイドを含み、ここで、前記ダイレクトリピート配列が配列番号195-210のいずれかにコードされる、または、配列番号1434-1449のいずれかを含む、
組成物。 - 請求項1に記載の組成物であって、
前記V型CRISPR-Cas系のガイドが、1つ以上の改変されたヌクレオチド、または1つ以上の非ヌクレオチド部分を含む、
組成物。 - 請求項1に記載の組成物であって、
前記V型CRISPR-Cas系のガイドが、少なくとも1つの化学的改変を含み、
前記化学的改変が、リボース環の炭素原子間のメチレン架橋、ホスホロチオエート結合、又は、1つ以上の末端ヌクレオチドにおける2’-O-メチル、2’-O-メチル3’ホスホロチオエート、又は2’-O-メチル3’チオPACEの取込みである、
組成物。 - 請求項1に記載の組成物であって、
前記標的配列がTリッチPAMに隣接する、
組成物。 - 請求項19に記載の組成物であって、
前記V型Casタンパク質がFnCpf1であり、前記PAMがTTNであり、NがA、C、G又はTである、または、
前記V型Casタンパク質がAsCpf1又はLbCpf1であり、前記PAMがTTTVであり、VがA、C、又はGである、
組成物。 - 請求項1に記載の組成物であって、
前記CRISPR複合体が、前記標的配列において鎖切断を生じさせる、
組成物。 - 請求項21に記載の組成物であって、
前記鎖切断が、5’オーバーハングを伴う付着末端型二本鎖切断である、
組成物。 - 請求項21に記載の組成物であって、
前記鎖切断が、4-nt又は5-ntのオーバーハングを伴う付着末端型二本鎖切断である、
組成物。 - 請求項21に記載の組成物であって、
前記組成物が、前記二本鎖切断の相同依存性修復のための鋳型としての一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドをさらに含む、
組成物。 - 請求項21に記載の組成物であって、
前記組成物が、前記二本鎖切断に挿入するための二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドをさらに含む、
組成物。 - 真核細胞を改変するためのインビトロ又はエキソビボの方法であって、
請求項1~25のいずれかの組成物を前記真核細胞に送達するステップを含み、
ここで、前記真核細胞のゲノム中において前記PAMに隣接する前記標的配列が、前記V型Casタンパク質と前記V型CRISPR-Cas系のガイドとによって形成される前記CRISPR複合体によって改変され、
前記真核細胞はヒトの生殖系列細胞ではない、
方法。 - 請求項26に記載の方法であって、
前記真核細胞が哺乳類細胞又は植物細胞である、
方法。 - 請求項27に記載の方法であって、
前記真核細胞がヒト細胞である、
方法。 - 請求項28に記載の方法であって、
前記真核細胞が造血細胞又はリンパ球である、
方法。 - 請求項29に記載の方法であって、
前記真核細胞がCD34+造血幹/前駆細胞、ナチュラルキラー細胞、細胞傷害性Tリンパ球、調節性Tリンパ球、又は、腫瘍浸潤リンパ球である、
方法。 - 遺伝子疾患又は障害の治療のための医薬の製造における、請求項1~25のいずれかの組成物の使用。
- 請求項31の使用であって、
前記遺伝子疾患又は障害が血液の疾患又は障害である、
使用。 - 請求項32の使用であって、
前記血液の疾患又は障害が、鎌状赤血球貧血、βサラセミア、又は血友病である、
使用。 - 請求項31の使用であって、
前記遺伝子疾患又は障害が、眼科的又は眼の疾患又は障害である、
使用。 - 請求項34の使用であって、
前記眼科的又は眼の疾患又は障害が、レーベル先天黒内障、アッシャー症候群、網膜色素変性症、又は原発性開放隅角緑内障である、
使用。 - 請求項31の使用であって、
前記遺伝子疾患又は障害が筋肉の疾患又は障害である、
使用。 - 請求項36の使用であって、
前記筋肉の疾患又は障害が、嚢胞性線維症、又はデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、
使用。 - 請求項31の使用であって、
前記遺伝子疾患又は障害が癌である、
使用。 - 請求項38の使用であって、
前記V型CRISPR-Cas系のガイドが、PD1、CTLA4、TRAC、TRBC、B2M、又は、MHC2TAに関連する標的配列にハイブリダイズする、
使用。
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US11390884B2 (en) | 2015-05-11 | 2022-07-19 | Editas Medicine, Inc. | Optimized CRISPR/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells |
CN107614680A (zh) * | 2015-05-14 | 2018-01-19 | 南加利福尼亚大学 | 利用重组核酸内切酶系统的最佳化基因编辑 |
US11911415B2 (en) | 2015-06-09 | 2024-02-27 | Editas Medicine, Inc. | CRISPR/Cas-related methods and compositions for improving transplantation |
US9790490B2 (en) * | 2015-06-18 | 2017-10-17 | The Broad Institute Inc. | CRISPR enzymes and systems |
EP3430134B1 (en) | 2015-06-18 | 2022-09-21 | The Broad Institute, Inc. | Novel crispr enzymes and systems |
AU2016279062A1 (en) | 2015-06-18 | 2019-03-28 | Omar O. Abudayyeh | Novel CRISPR enzymes and systems |
US10648020B2 (en) * | 2015-06-18 | 2020-05-12 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR enzymes and systems |
WO2017004261A1 (en) | 2015-06-29 | 2017-01-05 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modified crispr rna and modified single crispr rna and uses thereof |
WO2017015015A1 (en) * | 2015-07-17 | 2017-01-26 | Emory University | Crispr-associated protein from francisella and uses related thereto |
US11459540B2 (en) | 2015-07-28 | 2022-10-04 | Flodesign Sonics, Inc. | Expanded bed affinity selection |
US11474085B2 (en) | 2015-07-28 | 2022-10-18 | Flodesign Sonics, Inc. | Expanded bed affinity selection |
GB2557123B (en) | 2015-07-31 | 2021-11-03 | Univ Minnesota | Modified cells and methods of therapy |
WO2017031370A1 (en) | 2015-08-18 | 2017-02-23 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for altering function and structure of chromatin loops and/or domains |
US11530424B1 (en) * | 2015-09-18 | 2022-12-20 | University Of South Florida | Efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in system and method of use |
US20190048340A1 (en) * | 2015-09-24 | 2019-02-14 | Crispr Therapeutics Ag | Novel family of rna-programmable endonucleases and their uses in genome editing and other applications |
AU2016326711B2 (en) | 2015-09-24 | 2022-11-03 | Editas Medicine, Inc. | Use of exonucleases to improve CRISPR/Cas-mediated genome editing |
JP6929837B2 (ja) | 2015-10-05 | 2021-09-15 | プレシジョン バイオサイエンシズ,インク. | ヒトt細胞受容体アルファ定常領域遺伝子中に見出される認識配列に対して操作されたメガヌクレアーゼ |
DK3756682T3 (da) | 2015-10-05 | 2022-07-11 | Prec Biosciences Inc | Genetisk modificerede celler, der omfatter et modificeret gen fra det konstante område af den humane t-cellereceptor alpha |
JP7059468B2 (ja) | 2015-10-08 | 2022-04-26 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 多重ゲノム編集 |
CA3000917A1 (en) * | 2015-10-09 | 2017-04-13 | Monsanto Technology Llc | Rna-guided nucleases and uses thereof |
EP4089175A1 (en) | 2015-10-13 | 2022-11-16 | Duke University | Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells |
JP2018531261A (ja) * | 2015-10-16 | 2018-10-25 | テンプル ユニバーシティー オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケーション | Cpf1を用いた、rnaガイド遺伝子編集方法および組成物 |
EP3350327B1 (en) | 2015-10-23 | 2018-09-26 | Caribou Biosciences, Inc. | Engineered crispr class 2 cross-type nucleic-acid targeting nucleic acids |
US12043852B2 (en) | 2015-10-23 | 2024-07-23 | President And Fellows Of Harvard College | Evolved Cas9 proteins for gene editing |
WO2017075335A1 (en) | 2015-10-28 | 2017-05-04 | Voyager Therapeutics, Inc. | Regulatable expression using adeno-associated virus (aav) |
CN108471731A (zh) * | 2015-11-06 | 2018-08-31 | 杰克逊实验室 | 大型基因组dna敲入及其用途 |
US11905521B2 (en) * | 2015-11-17 | 2024-02-20 | The Chinese University Of Hong Kong | Methods and systems for targeted gene manipulation |
EP3397260A4 (en) | 2015-11-30 | 2019-10-16 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS RELATING TO CHOOSERISMS FROM BLOOD PRODUCTS |
US9988624B2 (en) | 2015-12-07 | 2018-06-05 | Zymergen Inc. | Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform |
US11208649B2 (en) | 2015-12-07 | 2021-12-28 | Zymergen Inc. | HTP genomic engineering platform |
US11293029B2 (en) | 2015-12-07 | 2022-04-05 | Zymergen Inc. | Promoters from Corynebacterium glutamicum |
WO2017099494A1 (ko) * | 2015-12-08 | 2017-06-15 | 기초과학연구원 | Cpf1을 포함하는 유전체 교정용 조성물 및 그 용도 |
US20190233814A1 (en) * | 2015-12-18 | 2019-08-01 | The Broad Institute, Inc. | Novel crispr enzymes and systems |
EP4159847A1 (en) | 2015-12-29 | 2023-04-05 | Monsanto Technology LLC | Novel crispr-associated transposases and uses thereof |
US11427837B2 (en) * | 2016-01-12 | 2022-08-30 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for enhanced genome editing |
US20190264186A1 (en) * | 2016-01-22 | 2019-08-29 | The Broad Institute Inc. | Crystal structure of crispr cpf1 |
US9896696B2 (en) * | 2016-02-15 | 2018-02-20 | Benson Hill Biosystems, Inc. | Compositions and methods for modifying genomes |
WO2017151719A1 (en) * | 2016-03-01 | 2017-09-08 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Molecular cell diary system |
IL291971A (en) * | 2016-03-04 | 2022-06-01 | Editas Medicine Inc | Methods related to crispr-cpf1, compositions and components for cancer immunotherapy |
WO2017165826A1 (en) | 2016-03-25 | 2017-09-28 | Editas Medicine, Inc. | Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use |
EP4047092A1 (en) | 2016-04-13 | 2022-08-24 | Editas Medicine, Inc. | Cas9 fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof |
CA3026112A1 (en) * | 2016-04-19 | 2017-10-26 | The Broad Institute, Inc. | Cpf1 complexes with reduced indel activity |
EP3445848A1 (en) * | 2016-04-19 | 2019-02-27 | The Broad Institute, Inc. | Novel crispr enzymes and systems |
US20200263190A1 (en) | 2016-04-19 | 2020-08-20 | The Broad Institute, Inc. | Novel crispr enzymes and systems |
JP2019514379A (ja) * | 2016-04-28 | 2019-06-06 | インダストリ−アカデミック コオペレーション ファウンデイション, ヨンセイ ユニヴァーシティIndustry−Academic Cooperation Foundation, Yonsei University | Rna誘導型ヌクレアーゼ活性のインビボ高スループット評価のための方法 |
US11214789B2 (en) | 2016-05-03 | 2022-01-04 | Flodesign Sonics, Inc. | Concentration and washing of particles with acoustics |
US11085035B2 (en) | 2016-05-03 | 2021-08-10 | Flodesign Sonics, Inc. | Therapeutic cell washing, concentration, and separation utilizing acoustophoresis |
US11499158B2 (en) | 2016-05-13 | 2022-11-15 | Kaneka Corporation | Method for modifying plant |
EP3456825A4 (en) * | 2016-05-13 | 2020-03-18 | Kaneka Corporation | METHOD FOR PLANT GENE EDITING |
EP3456181A4 (en) | 2016-05-13 | 2019-12-25 | Kaneka Corporation | METHOD FOR PRODUCING A TRANSFORMED PLANT |
AU2017268458B2 (en) | 2016-05-20 | 2022-07-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for breaking immunological tolerance using multiple guide RNAS |
CN109069560A (zh) * | 2016-06-01 | 2018-12-21 | 切除生物治疗公司 | 用于裂解性病毒和溶原性病毒的组合物和治疗方法 |
CN109983124B (zh) * | 2016-06-02 | 2022-09-16 | 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 | 使用可编程dna结合蛋白增强靶向基因组修饰 |
WO2017218185A1 (en) | 2016-06-14 | 2017-12-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Use of cpf1 endonuclease for plant genome modifications |
US10337051B2 (en) | 2016-06-16 | 2019-07-02 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for detecting a target RNA |
AU2017283713B2 (en) * | 2016-06-17 | 2021-04-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Type VI CRISPR orthologs and systems |
US11293021B1 (en) | 2016-06-23 | 2022-04-05 | Inscripta, Inc. | Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems |
JP2019518478A (ja) * | 2016-06-24 | 2019-07-04 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド,ア ボディー コーポレイトTHE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF COLORADO,a body corporate | バーコードを付けたコンビナトリアルライブラリーを生成する方法 |
EP3478845A4 (en) | 2016-06-30 | 2019-07-31 | Zymergen, Inc. | METHODS OF PRODUCING A GLUCOSE PERMEASE BANK AND USES THEREOF |
WO2018005655A2 (en) | 2016-06-30 | 2018-01-04 | Zymergen Inc. | Methods for generating a bacterial hemoglobin library and uses thereof |
CN106191057B (zh) * | 2016-07-06 | 2018-12-25 | 中山大学 | 一种用于敲除人CYP2E1基因的sgRNA序列、CYP2E1基因缺失细胞株的构建方法及其应用 |
US11603533B2 (en) | 2016-07-12 | 2023-03-14 | Washington University | Incorporation of internal polya-encoded poly-lysine sequence tags and their variations for the tunable control of protein synthesis in bacterial and eukaryotic cells |
EP3485023B1 (en) * | 2016-07-15 | 2023-11-15 | Salk Institute for Biological Studies | Methods and compositions for genome editing in non-dividing cells |
EP4275747A3 (en) * | 2016-07-19 | 2024-01-24 | Duke University | Therapeutic applications of cpf1-based genome editing |
SG11201900447SA (en) | 2016-07-21 | 2019-02-27 | Maxcyte Inc | Methods and compositions for modifying genomic dna |
CN109790527A (zh) * | 2016-07-26 | 2019-05-21 | 通用医疗公司 | 普氏菌属和弗朗西斯氏菌属的CRISPR1(Cpf1)的变体 |
US11078481B1 (en) | 2016-08-03 | 2021-08-03 | KSQ Therapeutics, Inc. | Methods for screening for cancer targets |
IL264565B2 (en) | 2016-08-03 | 2024-07-01 | Harvard College | Adenosine nuclear base editors and their uses |
US11661590B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-05-30 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
US11905549B2 (en) * | 2016-08-10 | 2024-02-20 | Genahead Bio, Inc. | Method for modifying target site in genome of eukaryotic cell, and method for detecting presence or absence of nucleic acid sequence to be detected at target site |
EP3500670B1 (en) * | 2016-08-17 | 2024-07-10 | The Broad Institute, Inc. | Method for selecting target sequences for guide rna of crispr systems |
WO2018035388A1 (en) | 2016-08-17 | 2018-02-22 | The Broad Institute, Inc. | Novel crispr enzymes and systems |
US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
US11078483B1 (en) | 2016-09-02 | 2021-08-03 | KSQ Therapeutics, Inc. | Methods for measuring and improving CRISPR reagent function |
IL247752A0 (en) * | 2016-09-11 | 2016-11-30 | Yeda Res & Dev | Compositions and methods for modulating gene expression for site-directed mutagenesis |
US10650621B1 (en) | 2016-09-13 | 2020-05-12 | Iocurrents, Inc. | Interfacing with a vehicular controller area network |
US20190225974A1 (en) | 2016-09-23 | 2019-07-25 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Targeted genome optimization in plants |
JP2019532644A (ja) * | 2016-09-30 | 2019-11-14 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | Rna誘導型核酸修飾酵素及びその使用方法 |
JP7306696B2 (ja) * | 2016-09-30 | 2023-07-11 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | Rna誘導型核酸修飾酵素及びその使用方法 |
KR20190062505A (ko) | 2016-10-03 | 2019-06-05 | 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 | Hpv-특이적 결합 분자 |
DK3757120T3 (da) | 2016-10-04 | 2022-07-25 | Prec Biosciences Inc | Co-stimulerende domæner til anvendelse i genetisk modificerede celler |
US11242542B2 (en) | 2016-10-07 | 2022-02-08 | Integrated Dna Technologies, Inc. | S. pyogenes Cas9 mutant genes and polypeptides encoded by same |
AU2017339542A1 (en) | 2016-10-07 | 2019-04-11 | Integrated Dna Technologies, Inc. | S. pyogenes Cas9 mutant genes and polypeptides encoded by same |
EP3526326A4 (en) * | 2016-10-12 | 2020-07-29 | The Regents of The University of Colorado, A Body Corporate | NEW MODIFIED AND CHEMERICAL NUCLEASES |
US20200172899A1 (en) * | 2016-10-14 | 2020-06-04 | The General Hospital Corporation | Epigenetically Regulated Site-Specific Nucleases |
US11306324B2 (en) | 2016-10-14 | 2022-04-19 | President And Fellows Of Harvard College | AAV delivery of nucleobase editors |
EP3529359B1 (en) | 2016-10-18 | 2023-12-13 | Regents of the University of Minnesota | Tumor infiltrating lymphocytes for use in therapy |
CA3042259A1 (en) | 2016-11-04 | 2018-05-11 | Flagship Pioneering Innovations V. Inc. | Novel plant cells, plants, and seeds |
CN106591335A (zh) * | 2016-11-08 | 2017-04-26 | 安徽省农业科学院水稻研究所 | 一种密码子植物化改造的LbCpf1基因及其应用 |
JP2019535287A (ja) | 2016-11-22 | 2019-12-12 | インテグレイテツド・デイー・エヌ・エイ・テクノロジーズ・インコーポレイテツド | Crispr/cpf1システム及び方法 |
CN110382695A (zh) * | 2016-11-28 | 2019-10-25 | 得克萨斯州大学系统董事会 | 通过crispr/cpf1介导的基因编辑来预防肌营养不良 |
CN108130342B (zh) * | 2016-12-01 | 2022-01-11 | 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 | 基于Cpf1的植物基因组定点编辑方法 |
WO2018107103A1 (en) * | 2016-12-09 | 2018-06-14 | The Broad Institute, Inc. | Crispr-systems for modifying a trait of interest in a plant |
WO2018111947A1 (en) | 2016-12-12 | 2018-06-21 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Genome editing enhancement |
RU2019121801A (ru) | 2016-12-14 | 2021-01-15 | Лигандал, Инк. | Композиции и способы для доставки полезной нагрузки в виде нуклеиновой кислоты и/или белка |
CA3047542A1 (en) * | 2016-12-19 | 2018-06-28 | The Uab Research Foundation | Mass spectrometric standards for hemoglobin beta and hemoglobin beta sickle and uses thereof |
JP7127942B2 (ja) * | 2016-12-22 | 2022-08-30 | キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ | 二重鎖dnaの標的化改変の方法 |
US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
CA3047330A1 (en) * | 2016-12-28 | 2018-07-05 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modified crispr rna and uses thereof |
US11859219B1 (en) | 2016-12-30 | 2024-01-02 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Methods of altering a target nucleotide sequence with an RNA-guided nuclease and a single guide RNA |
CN108265068B (zh) * | 2016-12-31 | 2021-06-15 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 重组精氨酸脱亚胺酶及其产业化制备方法和应用 |
WO2018129544A1 (en) | 2017-01-09 | 2018-07-12 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods of altering gene expression by perturbing transcription factor multimers that structure regulatory loops |
GB201700380D0 (en) * | 2017-01-10 | 2017-02-22 | Plant Bioscience Ltd | Methods of increasing seed yield |
US20180201921A1 (en) * | 2017-01-18 | 2018-07-19 | Excision Biotherapeutics, Inc. | CRISPRs |
US11624071B2 (en) | 2017-01-28 | 2023-04-11 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Method of creating a plurality of targeted insertions in a plant cell |
BR112019015578A2 (pt) | 2017-01-30 | 2020-03-10 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Ligação de modelo de reparo a endonucleases para engenharia de genoma |
WO2018147401A1 (ja) * | 2017-02-10 | 2018-08-16 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 2-オキソグルタル酸依存的に4-hppd阻害剤を酸化する触媒活性が高められたhslタンパク質の製造方法 |
CA3049989A1 (en) * | 2017-02-10 | 2018-08-16 | Zymergen Inc. | A modular universal plasmid design strategy for the assembly and editing of multiple dna constructs for multiple hosts |
US20200190527A1 (en) * | 2017-02-15 | 2020-06-18 | Keygene N.V. | Methods of targeted genetic alteration in plant cells |
CN106868031A (zh) * | 2017-02-24 | 2017-06-20 | 北京大学 | 一种基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达的克隆方法及应用 |
CN106947779B (zh) * | 2017-02-28 | 2021-02-26 | 中国农业大学 | 利用乳腺生物反应器提高乳汁中褪黑素含量的方法 |
US10687520B2 (en) | 2017-03-07 | 2020-06-23 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Generation and correction of a humanized mouse model with a deletion of dystrophin exon 44 |
WO2018165504A1 (en) | 2017-03-09 | 2018-09-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
WO2018165631A1 (en) * | 2017-03-09 | 2018-09-13 | President And Fellows Of Harvard College | Cancer vaccine |
KR20190127797A (ko) | 2017-03-10 | 2019-11-13 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 시토신에서 구아닌으로의 염기 편집제 |
EP3596207B1 (en) * | 2017-03-15 | 2023-12-20 | The Broad Institute, Inc. | Novel cas13b orthologues crispr enzymes and systems |
CN106978428A (zh) * | 2017-03-15 | 2017-07-25 | 上海吐露港生物科技有限公司 | 一种Cas蛋白特异结合靶标DNA、调控靶标基因转录的方法及试剂盒 |
SG11201908658TA (en) | 2017-03-23 | 2019-10-30 | Harvard College | Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins |
WO2018175712A1 (en) * | 2017-03-23 | 2018-09-27 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Recombinant adeno-associated virus-paraoxonase 1-ifii particles and the methods of making and using thereof |
WO2018183908A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for treating ovarian tumors |
CN108690845B (zh) * | 2017-04-10 | 2021-04-27 | 中国科学院动物研究所 | 基因组编辑系统和方法 |
WO2018191663A1 (en) * | 2017-04-14 | 2018-10-18 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for herbicide tolerance in plants |
US20180362590A1 (en) * | 2017-04-14 | 2018-12-20 | Synthetic Genomics, Inc. | Polypeptides with type v crispr activity and uses thereof |
WO2018195545A2 (en) | 2017-04-21 | 2018-10-25 | The General Hospital Corporation | Variants of cpf1 (cas12a) with altered pam specificity |
WO2018195540A1 (en) * | 2017-04-21 | 2018-10-25 | The General Hospital Corporation | Inducible, tunable, and multiplex human gene regulation using crispr-cpf1 |
EP3615672A1 (en) | 2017-04-28 | 2020-03-04 | Editas Medicine, Inc. | Methods and systems for analyzing guide rna molecules |
US12029760B2 (en) * | 2017-05-04 | 2024-07-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for gene editing in T cells using CRISPR/Cpf1 |
EP3634493A1 (en) | 2017-05-08 | 2020-04-15 | Precision BioSciences, Inc. | Nucleic acid molecules encoding an engineered antigen receptor and an inhibitory nucleic acid molecule and methods of use thereof |
WO2018209320A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation |
KR102678809B1 (ko) * | 2017-05-18 | 2024-06-26 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 표적화된 핵산 편집을 위한 시스템, 방법 및 조성물 |
US11046969B2 (en) | 2017-05-24 | 2021-06-29 | Epiplanta Biotech Ltd. | Transgenic plant and the method for producing the same |
EP3630962A4 (en) * | 2017-05-25 | 2021-01-20 | Bluebird Bio, Inc. | CBLB ENDONUCLEASE VARIANTS, COMPOSITIONS AND METHODS OF USE |
CA3102054A1 (en) | 2017-06-05 | 2018-12-13 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Genomic safe harbors for genetic therapies in human stem cells and engineered nanoparticles to provide targeted genetic therapies |
CA3061984A1 (en) | 2017-06-06 | 2018-12-13 | Zymergen Inc. | A htp genomic engineering platform for improving fungal strains |
ES2875579T3 (es) | 2017-06-06 | 2021-11-10 | Zymergen Inc | Plataforma de ingeniería genómica de HTP para mejorar Escherichia coli |
WO2018227114A1 (en) | 2017-06-09 | 2018-12-13 | Editas Medicine, Inc. | Engineered cas9 nucleases |
WO2018232017A1 (en) | 2017-06-13 | 2018-12-20 | Flagship Pioneering, Inc. | Compositions comprising curons and uses thereof |
US11897953B2 (en) | 2017-06-14 | 2024-02-13 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods targeting complement component 3 for inhibiting tumor growth |
US9982279B1 (en) | 2017-06-23 | 2018-05-29 | Inscripta, Inc. | Nucleic acid-guided nucleases |
EP3642334B1 (en) * | 2017-06-23 | 2023-12-27 | Inscripta, Inc. | Nucleic acid-guided nucleases |
US10011849B1 (en) * | 2017-06-23 | 2018-07-03 | Inscripta, Inc. | Nucleic acid-guided nucleases |
CN107312790A (zh) * | 2017-06-26 | 2017-11-03 | 中国科学技术大学 | 一种可编程的多位点特异性的转录抑制系统及其应用 |
WO2019005884A1 (en) | 2017-06-26 | 2019-01-03 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR / CAS-ADENINE DEAMINASE COMPOSITIONS, SYSTEMS AND METHODS FOR TARGETED NUCLEIC ACID EDITION |
EP3645021A4 (en) | 2017-06-30 | 2021-04-21 | Intima Bioscience, Inc. | ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTORS FOR GENE THERAPY |
CA3068465A1 (en) | 2017-06-30 | 2019-01-03 | Precision Biosciences, Inc. | Genetically-modified t cells comprising a modified intron in the t cell receptor alpha gene |
HUE058668T2 (hu) | 2017-06-30 | 2022-09-28 | Inscripta Inc | Automatizált sejtkezelési eljárások, modulok, berendezések és rendszerek |
US10392616B2 (en) | 2017-06-30 | 2019-08-27 | Arbor Biotechnologies, Inc. | CRISPR RNA targeting enzymes and systems and uses thereof |
KR102007457B1 (ko) * | 2017-06-30 | 2019-08-05 | 동국대학교 산학협력단 | Cas9 단백질, 가이드 RNA 및 양친매성 펩타이드를 포함하는 나노복합체 및 이의 용도 |
EP3648781A4 (en) * | 2017-07-07 | 2021-05-19 | The Broad Institute, Inc. | ANTIVIRAL THERAPY BASED ON THE CRISPR SYSTEM |
US12049643B2 (en) | 2017-07-14 | 2024-07-30 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for modulating cytotoxic lymphocyte activity |
CN107488710B (zh) * | 2017-07-14 | 2020-09-22 | 上海吐露港生物科技有限公司 | 一种Cas蛋白的用途及靶标核酸分子的检测方法和试剂盒 |
WO2019014564A1 (en) | 2017-07-14 | 2019-01-17 | Editas Medicine, Inc. | SYSTEMS AND METHODS OF TARGETED INTEGRATION AND GENOME EDITING AND DETECTION THEREOF WITH INTEGRATED PRIMING SITES |
US20200231975A1 (en) * | 2017-07-17 | 2020-07-23 | The Broad Institute, Inc. | Novel type vi crispr orthologs and systems |
US11041154B2 (en) | 2017-07-21 | 2021-06-22 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | CRISPR fluorescent guide RNA (fgRNA) to understanding gRNAs expressed from pol II promotors |
US11732274B2 (en) | 2017-07-28 | 2023-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE) |
CA3071247A1 (en) * | 2017-07-28 | 2019-01-31 | Locus Ip Company, Llc | Yeast-based masks for improved skin, hair and scalp health |
EP3585160A2 (en) | 2017-07-31 | 2020-01-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr reporter non-human animals and uses thereof |
CA3065579A1 (en) | 2017-07-31 | 2019-02-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Assessment of crispr/cas-induced recombination with an exogenous donor nucleic acid in vivo |
CN115074343A (zh) | 2017-07-31 | 2022-09-20 | 瑞泽恩制药公司 | Cas转基因小鼠胚胎干细胞和小鼠及其应用 |
IL271283B2 (en) * | 2017-08-04 | 2024-04-01 | Syngenta Participations Ag | Methods and compositions for targeted genomic insertion |
EP3665279B1 (en) | 2017-08-09 | 2023-07-19 | Benson Hill, Inc. | Compositions and methods for modifying genomes |
US10476825B2 (en) | 2017-08-22 | 2019-11-12 | Salk Institue for Biological Studies | RNA targeting methods and compositions |
US11970720B2 (en) | 2017-08-22 | 2024-04-30 | Salk Institute For Biological Studies | RNA targeting methods and compositions |
CN111278450B (zh) | 2017-08-23 | 2024-04-09 | 通用医疗公司 | 具有改变的PAM特异性的工程化的CRISPR-Cas9核酸酶 |
US10738327B2 (en) | 2017-08-28 | 2020-08-11 | Inscripta, Inc. | Electroporation cuvettes for automation |
US11319532B2 (en) | 2017-08-30 | 2022-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
EP3676378A4 (en) * | 2017-08-31 | 2021-06-09 | The New York Genome Center | PROCEDURES AND COMPOSITIONS USING CRIMP-CPF1 AND PAIRED GUIDE-CRISPR-RNA FOR PROGRAMMABLE GENOMIC DELETIONS |
CN111511388A (zh) | 2017-09-21 | 2020-08-07 | 博德研究所 | 用于靶向核酸编辑的系统、方法和组合物 |
CA3071712C (en) | 2017-09-29 | 2023-02-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized ttr locus and methods of use |
WO2019066549A2 (ko) * | 2017-09-29 | 2019-04-04 | 주식회사 툴젠 | 망막 기능장애 질환 치료를 위한 유전자 조작 |
US10435713B2 (en) | 2017-09-30 | 2019-10-08 | Inscripta, Inc. | Flow through electroporation instrumentation |
EP3692057B9 (en) | 2017-10-03 | 2023-10-04 | Precision BioSciences, Inc. | Modified epidermal growth factor receptor peptides for use in genetically-modified cells |
MA50613A (fr) | 2017-10-03 | 2020-08-12 | Editas Medicine Inc | Molécules de liaison spécifique à l'hpv |
US20190352652A1 (en) * | 2017-10-04 | 2019-11-21 | The Broad Institute, Inc. | Crispr-systems for modifying a trait of interest in a plant |
JP2020537121A (ja) | 2017-10-04 | 2020-12-17 | ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド | Crisprエフェクター系に基づく診断 |
JP2021500036A (ja) | 2017-10-16 | 2021-01-07 | ザ ブロード インスティテュート, インコーポレーテッドThe Broad Institute, Inc. | アデノシン塩基編集因子の使用 |
KR20200085781A (ko) | 2017-10-20 | 2020-07-15 | 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 | 선택된 항체를 발현하도록 유전자 변형된 b 세포를 생산하기 위한 시스템 및 방법 |
KR20200091858A (ko) | 2017-11-01 | 2020-07-31 | 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | CasZ 조성물 및 사용 방법 |
WO2019089913A1 (en) | 2017-11-01 | 2019-05-09 | Precision Biosciences, Inc. | Engineered nucleases that target human and canine factor viii genes as a treatment for hemophilia a |
US11970719B2 (en) | 2017-11-01 | 2024-04-30 | The Regents Of The University Of California | Class 2 CRISPR/Cas compositions and methods of use |
WO2019090175A1 (en) | 2017-11-02 | 2019-05-09 | Arbor Biotechnologies, Inc. | Novel crispr-associated transposon systems and components |
GB2568255A (en) * | 2017-11-08 | 2019-05-15 | Evox Therapeutics Ltd | Exosomes comprising RNA therapeutics |
EP3710583A1 (en) | 2017-11-16 | 2020-09-23 | Astrazeneca AB | Compositions and methods for improving the efficacy of cas9-based knock-in strategies |
SG11202004457XA (en) | 2017-11-17 | 2020-06-29 | Iovance Biotherapeutics Inc | Til expansion from fine needle aspirates and small biopsies |
EP3714041A1 (en) | 2017-11-22 | 2020-09-30 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Expansion of peripheral blood lymphocytes (pbls) from peripheral blood |
US10253365B1 (en) | 2017-11-22 | 2019-04-09 | The Regents Of The University Of California | Type V CRISPR/Cas effector proteins for cleaving ssDNAs and detecting target DNAs |
US20200332287A1 (en) * | 2017-11-28 | 2020-10-22 | Emendobio Inc. | Differential knockout of an allele of a heterozygous fibrinogen alpha chain (fga) gene |
US11332736B2 (en) | 2017-12-07 | 2022-05-17 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for multiplexing single cell and single nuclei sequencing |
MX2020005939A (es) | 2017-12-08 | 2020-08-24 | Synthetic Genomics Inc | Mejoramiento de la productividad de lipidos de algas a traves de la modificacion genetica de una proteina que contiene un dominio tpr. |
US11203752B2 (en) * | 2017-12-11 | 2021-12-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods of modifying a plant genome to produce a MS9, MS22, MS26, or MS45 male-sterile plant |
WO2019118921A1 (en) | 2017-12-14 | 2019-06-20 | Flodesign Sonics, Inc. | Acoustic transducer drive and controller |
JP2021506814A (ja) | 2017-12-15 | 2021-02-22 | デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート,インコーポレイテッド | 安定化ペプチドによって介在される標的タンパク質の分解 |
IL309585A (en) * | 2017-12-22 | 2024-02-01 | Fate Therapeutics Inc | Enhanced effector training cells and their use |
EP3728589A4 (en) | 2017-12-22 | 2021-11-03 | G+Flas Life Sciences | CHEMICAL GENOMIC ENGINEERING MOLECULES AND PROCESSES |
US11994512B2 (en) | 2018-01-04 | 2024-05-28 | Massachusetts Institute Of Technology | Single-cell genomic methods to generate ex vivo cell systems that recapitulate in vivo biology with improved fidelity |
BR112020014168A2 (pt) | 2018-01-12 | 2020-12-08 | Basf Se | Proteína, ácido nucleico isolado, gene recombinante, vetor, célula hospedeira, planta, parte de planta ou semente de trigo, métodos para produzir, produto de trigo, farinha, farelo integral, amido, grânulos de amido ou farelo de trigo e métodos para identificar e/ou selecionar uma planta de trigo |
CN111742051A (zh) * | 2018-01-23 | 2020-10-02 | 基础科学研究院 | 延伸的单向导rna及其用途 |
US11220694B1 (en) * | 2018-01-29 | 2022-01-11 | Inari Agriculture, Inc. | Rice cells and rice plants |
US11926835B1 (en) | 2018-01-29 | 2024-03-12 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Methods for efficient tomato genome editing |
WO2019152406A1 (en) * | 2018-01-30 | 2019-08-08 | The University Of Memphis Research Foundation | Compositions and methods for regulating a biological process |
US20190241911A1 (en) * | 2018-02-06 | 2019-08-08 | Ohio State Innovation Foundation | Engineered guide rna and uses thereof |
WO2019173942A1 (en) * | 2018-03-12 | 2019-09-19 | Nanjing Bioheng Biotech Co., Ltd | Engineered chimeric guide rna and uses thereof |
EP3765616B1 (en) | 2018-03-14 | 2023-07-19 | Arbor Biotechnologies, Inc. | Novel crispr dna and rna targeting enzymes and systems |
CA3093334A1 (en) | 2018-03-14 | 2019-09-19 | Arbor Biotechnologies, Inc. | Novel crispr dna targeting enzymes and systems |
CN112041433A (zh) * | 2018-03-15 | 2020-12-04 | Ksq治疗公司 | 用于改进的免疫疗法的基因调控组合物和方法 |
CN108486146B (zh) * | 2018-03-16 | 2021-02-19 | 中国农业科学院作物科学研究所 | LbCpf1-RR突变体用于CRISPR/Cpf1系统在植物基因编辑中的应用 |
WO2019183123A1 (en) | 2018-03-19 | 2019-09-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Transcription modulation in animals using crispr/cas systems |
EP3546582A1 (en) | 2018-03-26 | 2019-10-02 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Promoter activating elements |
WO2019190874A1 (en) | 2018-03-29 | 2019-10-03 | Inscripta, Inc. | Automated control of cell growth rates for induction and transformation |
US20210024959A1 (en) * | 2018-03-29 | 2021-01-28 | Fate Therapeutics, Inc. | Engineered immune effector cells and use thereof |
WO2019195492A1 (en) | 2018-04-05 | 2019-10-10 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods of producing cells expressing a recombinant receptor and related compositions |
MA52207A (fr) | 2018-04-05 | 2021-02-17 | Editas Medicine Inc | Lymphocytes t exprimant un récepteur recombinant, polynucléotides et procédés associés |
KR102617818B1 (ko) | 2018-04-12 | 2023-12-27 | 프리시젼 바이오사이언시스 인코포레이티드 | 인간 t 세포 수용체 알파 불변 영역 유전자에 대한 특이성을 갖는 최적화된 조작된 뉴클레아제 |
WO2019200004A1 (en) | 2018-04-13 | 2019-10-17 | Inscripta, Inc. | Automated cell processing instruments comprising reagent cartridges |
US20210189361A1 (en) * | 2018-04-23 | 2021-06-24 | Duke University | Downregulation of snca expression by targeted editing of dna-methylation |
DK3560330T3 (da) | 2018-04-24 | 2022-07-11 | Kws Saat Se & Co Kgaa | Planter med forbedret fordøjelighed og markørhaplotyper |
US10557216B2 (en) | 2018-04-24 | 2020-02-11 | Inscripta, Inc. | Automated instrumentation for production of T-cell receptor peptide libraries |
US10508273B2 (en) | 2018-04-24 | 2019-12-17 | Inscripta, Inc. | Methods for identifying selective binding pairs |
US10858761B2 (en) | 2018-04-24 | 2020-12-08 | Inscripta, Inc. | Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells |
US11957695B2 (en) | 2018-04-26 | 2024-04-16 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions targeting glucocorticoid signaling for modulating immune responses |
CN109678939B (zh) * | 2018-04-27 | 2022-03-04 | 四川大学华西医院 | 一种FnCpf1突变体 |
EP3784254A1 (en) | 2018-04-27 | 2021-03-03 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Closed process for expansion and gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy |
US20210198664A1 (en) | 2018-05-16 | 2021-07-01 | Arbor Biotechnologies, Inc. | Novel crispr-associated systems and components |
EP3802826A1 (en) * | 2018-05-24 | 2021-04-14 | CRISPR Therapeutics AG | Methods and compositions for efficient gene deletion |
WO2019232251A1 (en) * | 2018-05-30 | 2019-12-05 | The Regents Of The University Of California | Gene editing of monogenic disorders in human hematopoietic stem cells -- correction of x-linked hyper-igm syndrome (xhim) |
US11866719B1 (en) | 2018-06-04 | 2024-01-09 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Heterologous integration of regulatory elements to alter gene expression in wheat cells and wheat plants |
BR112020024736A2 (pt) * | 2018-06-04 | 2021-03-23 | University Of Copenhagen | endonucleases cpf1 mutantes |
KR20210089629A (ko) | 2018-06-05 | 2021-07-16 | 라이프에디트 테라퓨틱스, 인크. | Rna-가이드된 뉴클레아제 및 그의 활성 단편 및 변이체 및 사용 방법 |
EP3804512A4 (en) * | 2018-06-07 | 2022-04-06 | Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology | TRANSGENIC MOUSE FOR THE PRODUCTION OF AGLYCOSYLATED ANTIBODY AND USE OF AN AGLYCOSYLATED ANTIBODY PRODUCED THEREOF |
EP3802825A1 (en) | 2018-06-08 | 2021-04-14 | Intellia Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for immunooncology |
US10227576B1 (en) | 2018-06-13 | 2019-03-12 | Caribou Biosciences, Inc. | Engineered cascade components and cascade complexes |
US12036240B2 (en) | 2018-06-14 | 2024-07-16 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods targeting complement component 3 for inhibiting tumor growth |
US12043837B2 (en) | 2018-06-15 | 2024-07-23 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Methods for improving genome engineering and regeneration in plant |
WO2019237395A1 (zh) * | 2018-06-16 | 2019-12-19 | 深圳市博奥康生物科技有限公司 | 一种应用CRISPR/Cas9系统靶向敲除人CD357基因的方法 |
WO2019237380A1 (zh) * | 2018-06-16 | 2019-12-19 | 深圳市博奥康生物科技有限公司 | 一种基于慢病毒的 CRISPR/Cpf1 基因编辑载体及其应用 |
US20210207203A1 (en) | 2018-06-26 | 2021-07-08 | The Broad Institute, Inc. | Crispr double nickase based amplification compositions, systems, and methods |
CA3102163A1 (en) | 2018-06-26 | 2020-01-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Crispr effector system based amplification methods, systems, and diagnostics |
EP3521436A1 (en) | 2018-06-27 | 2019-08-07 | VIB vzw | Complex breeding in plants |
WO2020018142A1 (en) | 2018-07-16 | 2020-01-23 | Arbor Biotechnologies, Inc. | Novel crispr dna targeting enzymes and systems |
WO2020018166A1 (en) | 2018-07-16 | 2020-01-23 | The Regents Of The University Of Michigan | Nuclease-mediated nucleic acid modification |
EP3830301B1 (en) | 2018-08-01 | 2024-05-22 | Mammoth Biosciences, Inc. | Programmable nuclease compositions and methods of use thereof |
CN113227367B (zh) | 2018-08-09 | 2023-05-12 | G+Flas生命科学公司 | 用cas12a蛋白进行基因组工程的组合物和方法 |
EP3835418A4 (en) * | 2018-08-09 | 2022-05-04 | G+Flas Life Sciences | NOVEL CRISPR-ASSOCIATED PROTEIN AND USE THEREOF |
US10532324B1 (en) | 2018-08-14 | 2020-01-14 | Inscripta, Inc. | Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells |
US10533152B1 (en) | 2018-08-14 | 2020-01-14 | Inscripta, Inc. | Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells |
US10752874B2 (en) | 2018-08-14 | 2020-08-25 | Inscripta, Inc. | Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells |
US11142740B2 (en) | 2018-08-14 | 2021-10-12 | Inscripta, Inc. | Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments |
AR116016A1 (es) * | 2018-08-24 | 2021-03-25 | Flagship Pioneering Innovations Vi Llc | Métodos para fabricar paquetes mensajeros vegetales |
BR112021003236A2 (pt) * | 2018-08-24 | 2021-05-18 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | métodos e composições para a modificação de plantas |
CN112955540A (zh) | 2018-08-30 | 2021-06-11 | 因思科瑞普特公司 | 在自动化模块和仪器中对经核酸酶经编辑的序列的改进的检测 |
US11479762B1 (en) | 2018-08-31 | 2022-10-25 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Compositions, systems, and methods for genome editing |
CN109402115B (zh) * | 2018-09-06 | 2024-02-02 | 广州普世利华科技有限公司 | 靶向Rett突变基因RNA的gRNA及Rett突变基因的检测方法、检测试剂盒 |
US20210317479A1 (en) * | 2018-09-06 | 2021-10-14 | The Broad Institute, Inc. | Nucleic acid assemblies for use in targeted delivery |
US20210198642A1 (en) | 2018-09-07 | 2021-07-01 | Astrazeneca Ab | Compositions and methods for improved nucleases |
EP4268831A3 (en) | 2018-09-12 | 2024-05-22 | Fred Hutchinson Cancer Center | Reducing cd33 expression to selectively protect therapeutic cells |
US11459552B2 (en) * | 2018-09-13 | 2022-10-04 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Variant CAS12 proteins with improved dna cleavage selectivity and methods of use |
WO2020055941A1 (en) * | 2018-09-13 | 2020-03-19 | Excision Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for excision with single grna |
AU2019368215B2 (en) | 2018-10-22 | 2023-05-18 | Inscripta, Inc. | Engineered enzymes |
US11214781B2 (en) | 2018-10-22 | 2022-01-04 | Inscripta, Inc. | Engineered enzyme |
CN111100876A (zh) * | 2018-10-25 | 2020-05-05 | 立沃生物科技(深圳)有限公司 | CRISPR-Cas9特异性敲除FAH基因的方法及特异性sgRNA |
US11407995B1 (en) | 2018-10-26 | 2022-08-09 | Inari Agriculture Technology, Inc. | RNA-guided nucleases and DNA binding proteins |
US20210388389A1 (en) | 2018-10-30 | 2021-12-16 | Yale University | Compositions and methods for rapid and modular generation of chimeric antigen receptor t cells |
EP3874037A4 (en) | 2018-10-31 | 2021-12-15 | Zymergen, Inc. | DETERMINIST MULTIPLEXED SET OF DNA LIBRARIES |
WO2020091069A1 (ja) * | 2018-11-01 | 2020-05-07 | 国立大学法人東京大学 | 2分割されたCpf1タンパク質 |
US11434477B1 (en) | 2018-11-02 | 2022-09-06 | Inari Agriculture Technology, Inc. | RNA-guided nucleases and DNA binding proteins |
WO2020096989A1 (en) | 2018-11-05 | 2020-05-14 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of nsclc patients refractory for anti-pd-1 antibody |
CR20210295A (es) | 2018-11-05 | 2021-07-09 | Iovance Biotherapeutics Inc | Procesos para la producción de linfocitos infiltrantes de tumor y usos de estos en inmunoterapia |
MX2021004953A (es) | 2018-11-05 | 2021-08-11 | Iovance Biotherapeutics Inc | Seleccion de celulas t reactivas al tumor mejoradas. |
WO2020096927A1 (en) | 2018-11-05 | 2020-05-14 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Expansion of tils utilizing akt pathway inhibitors |
CN109385451B (zh) * | 2018-11-07 | 2020-07-07 | 中国海洋大学 | 一种牡蛎CRISPR/Cas9基因编辑方法 |
CN113853437A (zh) * | 2018-11-07 | 2021-12-28 | 阿库斯股份有限公司 | 腺相关病毒载体用于在内耳中的毛细胞和支持细胞中校正基因缺陷/表达蛋白质的用途 |
SG11202104802RA (en) * | 2018-11-08 | 2021-06-29 | Arizona Board Of Regents On Behalf Arizona State Univ | Synthetic immunomodulation with a crispr super-repressor in vivo |
KR20210104698A (ko) * | 2018-11-14 | 2021-08-25 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | Crispr 시스템 기반 액적 진단 시스템 및 방법 |
WO2020098793A1 (zh) * | 2018-11-15 | 2020-05-22 | 中国农业大学 | CRISPR-Cas12a酶和系统 |
EP3882345A4 (en) * | 2018-11-15 | 2023-02-22 | China Agricultural University | CRISPR-CAS12J ENZYME AND SYSTEM |
CN109536506B (zh) * | 2018-12-10 | 2022-03-22 | 潍坊科技学院 | 一种调控日本沼虾生长发育的类胰岛素受体基因及其应用 |
CN109593743A (zh) * | 2018-12-12 | 2019-04-09 | 广州普世利华科技有限公司 | 新型CRISPR/ScCas12a蛋白及其制备方法 |
US11166996B2 (en) | 2018-12-12 | 2021-11-09 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Anellovirus compositions and methods of use |
CN109680053A (zh) * | 2018-12-12 | 2019-04-26 | 广州普世利华科技有限公司 | 新型SsCas12a蛋白在核酸检测方面的应用 |
CN109666662A (zh) * | 2018-12-12 | 2019-04-23 | 广州普世利华科技有限公司 | 新型ScCas12a在核酸检测方面的应用 |
WO2020124050A1 (en) | 2018-12-13 | 2020-06-18 | The Broad Institute, Inc. | Tiled assays using crispr-cas based detection |
CA3124110A1 (en) | 2018-12-17 | 2020-06-25 | The Broad Institute, Inc. | Crispr-associated transposase systems and methods of use thereof |
CA3123392A1 (en) | 2018-12-19 | 2020-06-25 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Methods of expanding tumor infiltrating lymphocytes using engineered cytokine receptor pairs and uses thereof |
CA3120799A1 (en) | 2018-12-20 | 2020-06-25 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Nuclease-mediated repeat expansion |
EP3898661A1 (en) | 2018-12-21 | 2021-10-27 | Precision BioSciences, Inc. | Genetic modification of the hydroxyacid oxidase 1 gene for treatment of primary hyperoxaluria |
KR20210149686A (ko) | 2018-12-27 | 2021-12-09 | 라이프에디트 테라퓨틱스, 인크. | 유전자 편집에 유용한 폴리펩티드 및 사용 방법 |
EP3931313A2 (en) | 2019-01-04 | 2022-01-05 | Mammoth Biosciences, Inc. | Programmable nuclease improvements and compositions and methods for nucleic acid amplification and detection |
US11739156B2 (en) | 2019-01-06 | 2023-08-29 | The Broad Institute, Inc. Massachusetts Institute of Technology | Methods and compositions for overcoming immunosuppression |
CN109799295A (zh) * | 2019-01-28 | 2019-05-24 | 江南大学 | 一种用于秀丽隐杆线虫代谢组学分析的样品前处理方法 |
US20220145330A1 (en) | 2019-02-10 | 2022-05-12 | The J. David Gladstone Institutes, a testamentary trust established under the Will of J. David Glads | Modified mitochondrion and methods of use thereof |
CN113614231A (zh) | 2019-02-12 | 2021-11-05 | 特伦托大学 | CAS12a向导RNA分子及其用途 |
CA3128881A1 (en) * | 2019-02-13 | 2020-08-20 | Beam Therapeutics Inc. | Splice acceptor site disruption of a disease-associated gene using adenosine deaminase base editors, including for the treatment of genetic disease |
US20220090142A1 (en) * | 2019-02-13 | 2022-03-24 | Probiogen Ag | Transposase with enhanced insertion site selection properties |
AU2020223060B2 (en) | 2019-02-13 | 2023-04-13 | Beam Therapeutics Inc. | Compositions and methods for treating hemoglobinopathies |
CN113811608A (zh) * | 2019-02-22 | 2021-12-17 | 合成Dna技术公司 | 毛螺菌科细菌nd2006 cas12a突变型基因和由其编码的多肽 |
CN109975543B (zh) * | 2019-03-01 | 2022-02-11 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 分枝杆菌Ku蛋白的应用 |
CN113748202B (zh) | 2019-03-01 | 2024-07-16 | 艾欧凡斯生物治疗公司 | 由液体肿瘤扩增肿瘤浸润淋巴细胞及其治疗用途 |
CN114040971A (zh) * | 2019-03-07 | 2022-02-11 | 加利福尼亚大学董事会 | CRISPR-Cas效应子多肽及其使用方法 |
US11053515B2 (en) | 2019-03-08 | 2021-07-06 | Zymergen Inc. | Pooled genome editing in microbes |
CN113728106A (zh) | 2019-03-08 | 2021-11-30 | 齐默尔根公司 | 微生物中的迭代基因组编辑 |
WO2020185867A1 (en) | 2019-03-11 | 2020-09-17 | Sorrento Therapeutics, Inc. | Improved process for integration of dna constructs using rna-guided endonucleases |
WO2020186231A2 (en) | 2019-03-14 | 2020-09-17 | The Broad Institute, Inc. | Crispr effector system based multiplex diagnostics |
SG11202108091YA (en) | 2019-03-18 | 2021-08-30 | Regeneron Pharma | Crispr/cas screening platform to identify genetic modifiers of tau seeding or aggregation |
KR102683424B1 (ko) | 2019-03-18 | 2024-07-10 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 타우 응집과 관련된 유전적 취약성을 식별하기 위한 CRISPR/Cas 드랍아웃 스크리닝 플랫폼 |
WO2020191153A2 (en) | 2019-03-19 | 2020-09-24 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for editing nucleotide sequences |
WO2020198174A1 (en) | 2019-03-25 | 2020-10-01 | Inscripta, Inc. | Simultaneous multiplex genome editing in yeast |
US11001831B2 (en) | 2019-03-25 | 2021-05-11 | Inscripta, Inc. | Simultaneous multiplex genome editing in yeast |
MX2021011956A (es) | 2019-04-03 | 2021-12-15 | Regeneron Pharma | Metodos y composiciones para la insercion de secuencias codificantes de anticuerpos en un locus de puerto seguro. |
MX2021012110A (es) | 2019-04-03 | 2022-01-06 | Prec Biosciences Inc | Celulas inmunitarias geneticamente modificadas que comprenden un arnhc adaptado a microarn (arnhcmir). |
SG11202108454RA (en) | 2019-04-04 | 2021-09-29 | Regeneron Pharma | Non-human animals comprising a humanized coagulation factor 12 locus |
US11111504B2 (en) | 2019-04-04 | 2021-09-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for scarless introduction of targeted modifications into targeting vectors |
EP3950942A4 (en) | 2019-04-05 | 2023-01-18 | Osaka University | KNOCK-IN CELL PRODUCTION PROCESS |
US20220204994A1 (en) | 2019-04-05 | 2022-06-30 | Precision Biosciences, Inc. | Methods of preparing populations of genetically-modified immune cells |
CN110396543A (zh) * | 2019-04-30 | 2019-11-01 | 广州普世利华科技有限公司 | 一种肿瘤相关基因突变位点筛查方法 |
CN110195102A (zh) * | 2019-04-30 | 2019-09-03 | 广州普世利华科技有限公司 | 一种β地中海贫血基因分型方法 |
AU2020274594A1 (en) | 2019-05-10 | 2022-01-20 | Basf Se | Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants |
EP3969607A1 (en) | 2019-05-13 | 2022-03-23 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Drought tolerance in corn |
US20220249559A1 (en) | 2019-05-13 | 2022-08-11 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy |
CN114703142B (zh) * | 2019-05-16 | 2024-05-10 | 上海苹谱医疗科技有限公司 | 一种人诱导多潜能干细胞、构建方法及其用途 |
US20220220469A1 (en) * | 2019-05-20 | 2022-07-14 | The Broad Institute, Inc. | Non-class i multi-component nucleic acid targeting systems |
AU2020278906A1 (en) | 2019-05-23 | 2021-11-25 | Nomad Bioscience Gmbh | RNA viral RNA molecule for gene editing |
AR118995A1 (es) | 2019-05-25 | 2021-11-17 | Kws Saat Se & Co Kgaa | Mejorador de la inducción de haploides |
EP3801011A1 (en) | 2019-06-04 | 2021-04-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized ttr locus with a beta-slip mutation and methods of use |
EP3953477A4 (en) | 2019-06-06 | 2022-06-22 | Inscripta, Inc. | HARDENING FOR RECURSIVE NUCLEIC ACID-DRIVEN CELL EDITING |
WO2020247882A1 (en) | 2019-06-07 | 2020-12-10 | Scribe Therapeutics Inc. | Engineered casx systems |
MX2021015122A (es) | 2019-06-07 | 2022-04-06 | Regeneron Pharma | Animales no humanos que comprenden un locus de albumina humanizado. |
US12054726B2 (en) | 2019-06-13 | 2024-08-06 | Nunhems B.V. | Tomato plant producing fruit having improved ripening characteristics |
CA3137765A1 (en) | 2019-06-14 | 2020-12-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Models of tauopathy |
US10907125B2 (en) | 2019-06-20 | 2021-02-02 | Inscripta, Inc. | Flow through electroporation modules and instrumentation |
EP3986909A4 (en) | 2019-06-21 | 2023-08-02 | Inscripta, Inc. | GENOME-WIDE RATIONAL DESIGNED MUTATIONS LEADING TO INCREASED LYSINE PRODUCTION IN E. COLI |
US10927385B2 (en) | 2019-06-25 | 2021-02-23 | Inscripta, Inc. | Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast |
CA3138663A1 (en) | 2019-06-25 | 2020-12-30 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Improved homology dependent repair genome editing |
CN112168808B (zh) * | 2019-07-02 | 2023-01-24 | 深圳市第二人民医院 | 一种基于crispr的细胞核靶向药物递送系统 |
BR112021026832A2 (pt) | 2019-07-02 | 2022-05-10 | Hutchinson Fred Cancer Res | Vetores ad35 recombinantes e aprimoramentos da terapia gênica relacionada |
CA3145863A1 (en) | 2019-07-05 | 2021-01-14 | Limagrain Europe | Method for increasing yield in plants |
MX2022000553A (es) * | 2019-07-17 | 2022-04-25 | Fate Therapeutics Inc | Modificación de células efectoras inmunitarias y uso de las mismas. |
US20220273715A1 (en) | 2019-07-25 | 2022-09-01 | Precision Biosciences, Inc. | Compositions and methods for sequential stacking of nucleic acid sequences into a genomic locus |
EP4004197A1 (en) * | 2019-07-26 | 2022-06-01 | Mammoth Biosciences, Inc. | Compositions for detection of dna and methods of use thereof |
CN110358767B (zh) * | 2019-07-30 | 2021-06-08 | 湖北大学 | 一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法及其应用 |
WO2021025999A1 (en) * | 2019-08-02 | 2021-02-11 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions to promote targeted genome modifications using huh endonucleases |
EP3772542A1 (en) | 2019-08-07 | 2021-02-10 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Modifying genetic variation in crops by modulating the pachytene checkpoint protein 2 |
WO2021028359A1 (en) | 2019-08-09 | 2021-02-18 | Sangamo Therapeutics France | Controlled expression of chimeric antigen receptors in t cells |
EP4013864A1 (en) | 2019-08-12 | 2022-06-22 | Lifeedit Therapeutics, Inc. | Rna-guided nucleases and active fragments and variants thereof and methods of use |
CN110592014A (zh) * | 2019-08-14 | 2019-12-20 | 广东美赛尔细胞生物科技有限公司 | 一种在nk细胞治疗中免辐照体外体内持续去除饲养细胞的方法 |
US20230056843A1 (en) * | 2019-08-19 | 2023-02-23 | Southern Medical University | Construction of high-fidelity crispr/ascpf1 mutant and uses thereof |
US20220273720A1 (en) | 2019-08-20 | 2022-09-01 | Precision Biosciences, Inc. | Lymphodepletion dosing regimens for cellular immunotherapies |
WO2021035170A1 (en) | 2019-08-21 | 2021-02-25 | Precision Biosciences, Inc. | Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins |
CN112442515B (zh) * | 2019-09-02 | 2023-01-10 | 南京启真基因工程有限公司 | gRNA靶点组合在构建血友病模型猪细胞系中的应用 |
US20220333208A1 (en) | 2019-09-03 | 2022-10-20 | The Broad Institute, Inc. | Crispr effector system based multiplex cancer diagnostics |
BR112022003996A2 (pt) * | 2019-09-05 | 2022-05-31 | Benson Hill Inc | Composições e métodos para modificar genomas |
CN114341166A (zh) * | 2019-09-05 | 2022-04-12 | 阿伯生物技术公司 | 新型crispr dna靶向酶及系统 |
CN114729343A (zh) | 2019-09-10 | 2022-07-08 | 科学方案有限责任公司 | 新的2类ii型和v型crispr-cas rna指导的内切核酸酶 |
CA3150334A1 (en) | 2019-09-12 | 2021-03-18 | Frank Meulewaeter | REGULATORY NUCLEIC ACID MOLECULES TO ENHANCE GENE EXPRESSION IN PLANTS |
CN110628816B (zh) * | 2019-09-12 | 2022-10-18 | 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) | 一种用于血友病a的双切供体及其药物组合 |
WO2021050940A1 (en) | 2019-09-13 | 2021-03-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Transcription modulation in animals using crispr/cas systems delivered by lipid nanoparticles |
CN110600083B (zh) * | 2019-09-20 | 2020-05-19 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 基于无拼接组装wgs数据的醋酸钙—鲍曼不动杆菌复合群鉴定方法 |
CA3147643A1 (en) | 2019-09-23 | 2021-04-01 | Omega Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating hepatocyte nuclear factor 4-alpha (hnf4.alpha.) gene expression |
EP4048807A1 (en) | 2019-09-23 | 2022-08-31 | Omega Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating apolipoprotein b (apob) gene expression |
JP2022550599A (ja) | 2019-10-03 | 2022-12-02 | アーティサン ディベロップメント ラブズ インコーポレイテッド | 操作されたデュアルガイド核酸を有するcrisprシステム |
WO2021069387A1 (en) | 2019-10-07 | 2021-04-15 | Basf Se | Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants |
KR20220097408A (ko) | 2019-10-17 | 2022-07-07 | 페어와이즈 플랜츠 서비시즈, 인크. | Cas12a 뉴클레아제의 변이체 및 그의 제조 방법 및 용도 |
US20230357788A1 (en) | 2019-10-17 | 2023-11-09 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Enhanced disease resistance of crops by downregulation of repressor genes |
WO2021081384A1 (en) * | 2019-10-25 | 2021-04-29 | Greenvenus, Llc | Synthetic nucleases |
US20220389381A1 (en) | 2019-10-25 | 2022-12-08 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy |
US20220411479A1 (en) | 2019-10-30 | 2022-12-29 | Precision Biosciences, Inc. | Cd20 chimeric antigen receptors and methods of use for immunotherapy |
US11844800B2 (en) | 2019-10-30 | 2023-12-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and compositions for predicting and preventing relapse of acute lymphoblastic leukemia |
CN114901302A (zh) | 2019-11-05 | 2022-08-12 | 成对植物服务股份有限公司 | Rna编码的dna置换等位基因的组合物和方法 |
WO2021092513A1 (en) | 2019-11-08 | 2021-05-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr and aav strategies for x-linked juvenile retinoschisis therapy |
CN115052980A (zh) * | 2019-11-18 | 2022-09-13 | 上海蓝十字医学科学研究所 | 衍生自黄杆菌的基因编辑系统 |
WO2021102059A1 (en) | 2019-11-19 | 2021-05-27 | Inscripta, Inc. | Methods for increasing observed editing in bacteria |
CN110760597B (zh) * | 2019-11-22 | 2022-08-23 | 西北农林科技大学 | 一种检测黄牛ncstn基因拷贝数变异的方法及其应用 |
WO2021108363A1 (en) | 2019-11-25 | 2021-06-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele |
EP4065701A4 (en) * | 2019-11-27 | 2023-11-29 | Danmarks Tekniske Universitet | CONSTRUCTS, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF WITH IMPROVED GENOMEDITING EFFICIENCY AND SPECIFICITY |
EP4064830A1 (en) | 2019-11-29 | 2022-10-05 | Basf Se | Increasing resistance against fungal infections in plants |
US20230148071A1 (en) | 2019-12-03 | 2023-05-11 | Basf Se | Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants |
WO2021113543A1 (en) | 2019-12-06 | 2021-06-10 | Precision Biosciences, Inc. | Methods for cancer immunotherapy, using lymphodepletion regimens and cd19, cd20 or bcma allogeneic car t cells |
US11976278B2 (en) * | 2019-12-06 | 2024-05-07 | Pairwise Plants Services, Inc. | Recruitment methods and compounds, compositions and systems for recruitment |
EP4069837A4 (en) | 2019-12-10 | 2024-03-13 | Inscripta, Inc. | NEW MAD NUCLEASES |
CA3161104A1 (en) | 2019-12-11 | 2021-06-17 | Cecile Chartier-Courtaud | Processes for the production of tumor infiltrating lymphocytes (tils) and methods of using the same |
RU2720768C1 (ru) * | 2019-12-13 | 2020-05-13 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Система CRISPR-Cas для детекции провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека, интегрированной в геном человека, в ультранизких концентрациях |
US10704033B1 (en) | 2019-12-13 | 2020-07-07 | Inscripta, Inc. | Nucleic acid-guided nucleases |
CN110791523B (zh) * | 2019-12-13 | 2022-05-10 | 南京农业大学 | 一种棉花抗旱相关基因GhRCHY1及其应用 |
RU2720767C1 (ru) * | 2019-12-13 | 2020-05-13 | Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Способ обнаружения провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека, интегрированной в геном человека, в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе |
KR102493904B1 (ko) * | 2019-12-13 | 2023-01-31 | 한국생명공학연구원 | EeCpf1에 의해 IL2Rg 유전자가 돌연변이된 면역부전 동물모델 및 그 제조방법 |
RU2720769C1 (ru) * | 2019-12-13 | 2020-05-13 | Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/CAS и препарат для детекции провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека, интегрированной в геном человека, в ультранизких концентрациях |
CN114829612A (zh) | 2019-12-16 | 2022-07-29 | 巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司 | 使用配对切口酶的改进的基因组编辑 |
KR20220116173A (ko) | 2019-12-16 | 2022-08-22 | 바스프 아그리컬쳐럴 솔루션즈 시드 유에스 엘엘씨 | 밀의 게놈에의 dna 또는 돌연변이의 정확한 도입 |
JP2023507566A (ja) | 2019-12-18 | 2023-02-24 | インスクリプタ, インコーポレイテッド | 核酸誘導ヌクレアーゼ編集済み細胞のin vivo検出のためのカスケード/dCas3相補性アッセイ |
KR20220116504A (ko) | 2019-12-19 | 2022-08-23 | 바스프 에스이 | 정밀 화학물의 제조에서 공시 수율, 탄소-전환-효율 및 탄소 기질 적응성의 증가 |
JP2023508871A (ja) | 2019-12-20 | 2023-03-06 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | テルペンの毒性の低減および微生物中での生成可能性の増大 |
US20230203463A1 (en) | 2019-12-30 | 2023-06-29 | LifeEDIT Therapeutics, Inc. | Rna-guided nucleases and active fragments and variants thereof and methods of use |
CN111073902B (zh) * | 2019-12-30 | 2022-04-26 | 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) | 提升胶霉毒素生物合成基因表达水平的CRISPR/dCas9载体及其构建方法和应用 |
CN113073118B (zh) * | 2020-01-03 | 2023-09-15 | 珠海联邦制药股份有限公司 | Tet-off表达调控系统在级联放大启动子活性中的用途 |
US10689669B1 (en) | 2020-01-11 | 2020-06-23 | Inscripta, Inc. | Automated multi-module cell processing methods, instruments, and systems |
WO2021148447A1 (en) | 2020-01-21 | 2021-07-29 | Limagrain Europe | Wheat haploid inducer plant and uses |
EP4093907A4 (en) * | 2020-01-24 | 2024-01-17 | The General Hospital Corporation | METHOD FOR CHARACTERIZING ENZYMES FOR GENOME ENGINEERING |
CN115135370A (zh) | 2020-01-27 | 2022-09-30 | 因思科瑞普特公司 | 电穿孔模块和仪器 |
US20210238598A1 (en) | 2020-01-30 | 2021-08-05 | Pairwise Plants Services, Inc. | Compositions, systems, and methods for base diversification |
UY39058A (es) | 2020-01-31 | 2021-08-31 | Pairwise Plants Services Inc | Suppresión de la respuesta de evasión a la sombra en plantas |
WO2021158798A1 (en) | 2020-02-04 | 2021-08-12 | Pairwise Plants Services, Inc. | Thornless / prickleless rubus plants |
CN111337666B (zh) * | 2020-02-12 | 2021-04-02 | 山东大学 | I-motif重组介导的FRET探针及其原位成像癌细胞表面蛋白质同源二聚化的应用 |
CN113261532A (zh) * | 2020-02-17 | 2021-08-17 | 中山大学 | 一种肺癌动物模型的构建方法 |
EP4107274A1 (en) | 2020-02-21 | 2022-12-28 | Pairwise Plants Services, Inc. | Improved resistance to soybean cyst nematode through gene editing |
US20230357784A1 (en) | 2020-02-21 | 2023-11-09 | Limagrain Europe | Prime editing technology for plant genome engineering |
CN115485300A (zh) | 2020-02-26 | 2022-12-16 | 索伦托药业有限公司 | 具有通用掩蔽部分的可活化的抗原结合蛋白 |
US12012433B1 (en) | 2020-02-27 | 2024-06-18 | Integrated Dna Technologies Inc. | Expression and purification of Cas enzymes |
IL295935A (en) * | 2020-02-28 | 2022-10-01 | Huigene Therapeutics Co Ltd | Crispr-cas type vi-e and type vi-f system and its uses |
CA3169105A1 (en) | 2020-02-28 | 2021-09-02 | Ling MENG | Method for rapid genome modification in recalcitrant plants |
WO2021170785A1 (en) | 2020-02-28 | 2021-09-02 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Immature inflorescence meristem editing |
KR20230004456A (ko) | 2020-03-04 | 2023-01-06 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 면역 요법에 대한 종양 세포의 감작화를 위한 방법 및 조성물 |
JP2023517041A (ja) * | 2020-03-06 | 2023-04-21 | メタゲノミ,インコーポレイテッド | クラスiiのv型crispr系 |
CN116096886A (zh) | 2020-03-11 | 2023-05-09 | 欧米茄治疗公司 | 用于调节叉头框p3(foxp3)基因表达的组合物和方法 |
EP3878958A1 (en) | 2020-03-11 | 2021-09-15 | B.R.A.I.N. Biotechnology Research And Information Network AG | Crispr-cas nucleases from cpr-enriched metagenome |
WO2021195079A1 (en) | 2020-03-23 | 2021-09-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use |
US11999946B2 (en) | 2020-03-26 | 2024-06-04 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods for controlling meristem size for crop improvement |
US11882808B2 (en) | 2020-03-27 | 2024-01-30 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods for improving resistance to soybean rust |
US20230263121A1 (en) | 2020-03-31 | 2023-08-24 | Elo Life Systems | Modulation of endogenous mogroside pathway genes in watermelon and other cucurbits |
WO2021207148A1 (en) | 2020-04-06 | 2021-10-14 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for increasing resistance to ear rot and stem rot disease in maize |
US20230340538A1 (en) | 2020-04-08 | 2023-10-26 | Astrazeneca Ab | Compositions and methods for improved site-specific modification |
RU2743861C1 (ru) * | 2020-04-15 | 2021-03-01 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Система CRISPR-Cas для выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 (металло-бета-лактамаза класс B VIM-2) Pseudomonas aeruginosa в ультранизких концентрациях |
RU2745637C1 (ru) * | 2020-04-15 | 2021-03-29 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/Cas и препарат для выявления гена антибиотикоустойчивости bla VIM-2 (металло-бета-лактамаза класс B VIM-2) Pseudomonas aeruginosa в ультранизких концентрациях |
EP4135512A1 (en) | 2020-04-16 | 2023-02-22 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods for controlling meristem size for crop improvement |
TW202208626A (zh) | 2020-04-24 | 2022-03-01 | 美商生命編輯公司 | Rna引導核酸酶及其活性片段與變體,以及使用方法 |
US20210332388A1 (en) | 2020-04-24 | 2021-10-28 | Inscripta, Inc. | Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells |
WO2021217083A1 (en) | 2020-04-24 | 2021-10-28 | Sorrento Therapeutics, Inc. | Memory dimeric antigen receptors |
CN116096878A (zh) | 2020-05-01 | 2023-05-09 | 合成Dna技术公司 | 在非经典tttt前间区序列邻近基序处具有增强的切割活性的毛螺菌科菌种cas12a突变体 |
EP4146794A1 (en) | 2020-05-04 | 2023-03-15 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy |
GB2614813A (en) | 2020-05-08 | 2023-07-19 | Harvard College | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
WO2021224506A1 (en) * | 2020-05-08 | 2021-11-11 | Universitat Pompeu Fabra | Crispr-cas homology directed repair enhancer |
US20230183664A1 (en) | 2020-05-11 | 2023-06-15 | Precision Biosciences, Inc. | Self-limiting viral vectors encoding nucleases |
KR20230010678A (ko) | 2020-05-13 | 2023-01-19 | 넌헴스 비.브이. | 표적화된 돌연변이유발에 의해 돌연변이체 식물을 수득하는 방법 |
MX2022014185A (es) | 2020-05-13 | 2022-12-07 | Nunhems Bv | Plantas de tomate con recombinacion meiotica suprimida. |
US11787841B2 (en) | 2020-05-19 | 2023-10-17 | Inscripta, Inc. | Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli |
WO2021243283A1 (en) * | 2020-05-28 | 2021-12-02 | University Of Southern California | Scalable trio guide rna approach for integration of large donor dna |
JP2023527446A (ja) | 2020-05-29 | 2023-06-28 | カー・ヴェー・エス ザート エス・エー ウント コー. カー・ゲー・アー・アー | 植物単数体の誘導 |
MX2022015107A (es) | 2020-06-02 | 2023-03-01 | Pairwise Plants Services Inc | Metodos para controlar el tama?o del meristema para mejorar los cultivos. |
CN116209755A (zh) * | 2020-06-03 | 2023-06-02 | 猛犸生物科学公司 | 可编程核酸酶和使用方法 |
CN111808832B (zh) * | 2020-06-05 | 2022-02-11 | 华南农业大学 | 一种水稻纹枯病菌阳离子转运ATP酶基因及其片段Rscta和应用 |
JP7419168B2 (ja) * | 2020-06-10 | 2024-01-22 | 株式会社東芝 | 改変型piggyBacトランスポゼースのポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、導入キャリア、キット、細胞のゲノムに目的配列を組込む方法及び細胞製造方法 |
EP4165218A1 (en) | 2020-06-12 | 2023-04-19 | Sherlock Biosciences, Inc. | Crispr-based sars-cov-2 detection |
CN115943212A (zh) | 2020-06-17 | 2023-04-07 | 成对植物服务股份有限公司 | 控制分生组织大小以改良作物的方法 |
KR20230042283A (ko) | 2020-06-26 | 2023-03-28 | 주노 테라퓨틱스 게엠베하 | 재조합 수용체를 조건부로 발현하는 조작된 t 세포, 관련된 폴리뉴클레오티드 및 방법 |
EP4172340A1 (en) | 2020-06-29 | 2023-05-03 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Boosting homology directed repair in plants |
WO2022006226A1 (en) | 2020-06-30 | 2022-01-06 | Pairwise Plants Services, Inc. | Compositions, systems, and methods for base diversification |
WO2022015969A1 (en) | 2020-07-15 | 2022-01-20 | LifeEDIT Therapeutics, Inc. | Uracil stabilizing proteins and active fragments and variants thereof and methods of use |
CN111778252B (zh) * | 2020-07-17 | 2022-01-07 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种靶向敲除SST基因的sgRNA及其CRISPR/Cas9系统和应用 |
AU2021313163A1 (en) | 2020-07-21 | 2023-02-16 | Pairwise Plants Services, Inc. | Optimized protein linkers and methods of use |
EP3943600A1 (en) | 2020-07-21 | 2022-01-26 | B.R.A.I.N. Biotechnology Research And Information Network AG | Novel, non-naturally occurring crispr-cas nucleases for genome editing |
WO2022035793A1 (en) | 2020-08-10 | 2022-02-17 | Precision Biosciences, Inc. | Antibodies and fragments specific for b-cell maturation antigen and uses thereof |
CA3188988A1 (en) * | 2020-08-13 | 2022-02-17 | Sidi CHEN | Compositions and methods for engineering and selection of car t cells with desired phenotypes |
CN111979273B (zh) * | 2020-08-24 | 2022-05-27 | 苏州启辰生物科技有限公司 | 一种制备人源化ace2小鼠模型的方法 |
CN116745415A (zh) | 2020-08-28 | 2023-09-12 | 成对植物服务股份有限公司 | 工程化crispr-cas蛋白质及其使用方法 |
US20240052341A1 (en) | 2020-09-01 | 2024-02-15 | 64-X, Inc. | Mammalian cells and methods for engineering the same |
CA3190991A1 (en) | 2020-09-02 | 2022-03-10 | Omar Abudayyeh | Systems, methods, and compositions for rna-guided rna-targeting crispr effectors |
KR20230084505A (ko) | 2020-09-11 | 2023-06-13 | 라이프에디트 테라퓨틱스, 인크. | Dna 변형 효소 및 그의 활성 단편 및 변이체 및 사용 방법 |
EP4214314A1 (en) | 2020-09-15 | 2023-07-26 | Inscripta, Inc. | Crispr editing to embed nucleic acid landing pads into genomes of live cells |
EP4214311A2 (en) | 2020-09-18 | 2023-07-26 | Artisan Development Labs, Inc. | Constructs and uses thereof for efficient and specific genome editing |
WO2022068912A1 (en) | 2020-09-30 | 2022-04-07 | Huigene Therapeutics Co., Ltd. | Engineered crispr/cas13 system and uses thereof |
WO2022188039A1 (en) | 2021-03-09 | 2022-09-15 | Huigene Therapeutics Co., Ltd. | Engineered crispr/cas13 system and uses thereof |
WO2022076606A1 (en) | 2020-10-06 | 2022-04-14 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies |
US20230372397A1 (en) | 2020-10-06 | 2023-11-23 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies |
WO2022076547A1 (en) | 2020-10-07 | 2022-04-14 | Precision Biosciences, Inc. | Lipid nanoparticle compositions |
US20240060079A1 (en) | 2020-10-23 | 2024-02-22 | Elo Life Systems | Methods for producing vanilla plants with improved flavor and agronomic production |
US20240026369A1 (en) | 2020-10-27 | 2024-01-25 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Use of enhanced pol theta activity for eukaryotic genome engineering |
CN112300999A (zh) * | 2020-11-02 | 2021-02-02 | 江苏集萃药康生物科技股份有限公司 | 一种balb/c小鼠模型及其用途 |
EP4242237A1 (en) | 2020-11-06 | 2023-09-13 | Editforce, Inc. | Foki nuclease domain variant |
WO2022098993A2 (en) | 2020-11-06 | 2022-05-12 | Pairwise Plants Services, Inc. | Compositions and methods for rna-encoded dna-replacement of alleles |
US11512297B2 (en) | 2020-11-09 | 2022-11-29 | Inscripta, Inc. | Affinity tag for recombination protein recruitment |
EP4243608A1 (en) | 2020-11-11 | 2023-09-20 | Leibniz-Institut für Pflanzenbiochemie (IPB) | Fusion protein for editing endogenous dna of a eukaryotic cell |
CN112410355B (zh) * | 2020-11-23 | 2022-03-25 | 昆明理工大学 | 一种酰基辅酶a氧化酶2基因rkacox2及其应用 |
CN112461807B (zh) * | 2020-11-26 | 2021-11-19 | 山西大学 | 碳量子点在靶向细胞核仁免洗成像中的应用 |
US20240002839A1 (en) | 2020-12-02 | 2024-01-04 | Decibel Therapeutics, Inc. | Crispr sam biosensor cell lines and methods of use thereof |
CN112195164B (zh) * | 2020-12-07 | 2021-04-23 | 中国科学院动物研究所 | 工程化的Cas效应蛋白及其使用方法 |
CN114634928B (zh) * | 2020-12-15 | 2023-08-04 | 四川大学华西医院 | 一种降低stat3转录功能的核酸片段及其制药用途 |
AU2021403027A1 (en) * | 2020-12-17 | 2023-06-29 | Monsanto Technology Llc | Engineered ssdnase-free crispr endonucleases |
EP4262811A1 (en) | 2020-12-17 | 2023-10-25 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with ctla-4 and pd-1 inhibitors |
WO2022133149A1 (en) | 2020-12-17 | 2022-06-23 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of cancers with tumor infiltrating lymphocytes |
JP2024501287A (ja) | 2020-12-23 | 2024-01-11 | フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ, インコーポレイテッド | RNAを閉じ込めたアネロウイルス(Anellovirus)キャプシドのインビトロアセンブリ |
CN112553215A (zh) * | 2020-12-24 | 2021-03-26 | 山东农业大学 | 一个玉米纹枯病抗病相关基因ZmFAH49及其应用 |
CN112662670B (zh) * | 2020-12-25 | 2024-04-02 | 河南省农业科学院 | 花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因启动子及其制备方法和应用 |
CN112640847B (zh) * | 2020-12-30 | 2022-12-13 | 重庆医科大学附属第一医院 | 一种内源性癫痫发作动物模型及其构建方法 |
EP4271802A1 (en) | 2021-01-04 | 2023-11-08 | Inscripta, Inc. | Mad nucleases |
WO2022150269A1 (en) | 2021-01-07 | 2022-07-14 | Inscripta, Inc. | Mad nucleases |
CA3207102A1 (en) | 2021-01-12 | 2022-07-21 | March Therapeutics, Inc. | Context-dependent, double-stranded dna-specific deaminases and uses thereof |
CN112680479A (zh) * | 2021-01-13 | 2021-04-20 | 汪利平 | Cyp1b1基因缺失斑马鱼的制备 |
CN114790456A (zh) * | 2021-01-24 | 2022-07-26 | 东北林业大学 | 野菊u6基因及其应用 |
EP4284823A1 (en) | 2021-01-28 | 2023-12-06 | Precision BioSciences, Inc. | Modulation of tgf beta signaling in genetically-modified eukaryotic cells |
EP4284919A1 (en) | 2021-01-29 | 2023-12-06 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Methods of making modified tumor infiltrating lymphocytes and their use in adoptive cell therapy |
CN112852745B (zh) * | 2021-02-04 | 2023-05-23 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | Hdac3基因敲除的bhk-21细胞系及其构建方法和应用 |
CN112877275B (zh) * | 2021-02-04 | 2023-03-31 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | Hdac2基因敲除的bhk-21细胞系及其构建方法和应用 |
CN116004572A (zh) * | 2021-02-05 | 2023-04-25 | 山东舜丰生物科技有限公司 | Crispr酶和系统以及应用 |
AU2022217349A1 (en) | 2021-02-07 | 2023-08-31 | Huidagene Therapeutics (Singapore) Pte. Ltd. | Rna adeno-associated virus (raav) vector and uses thereof |
EP4291678A1 (en) | 2021-02-09 | 2023-12-20 | Sherlock Biosciences, Inc. | Nucleic acid amplification using promoter primers |
US20220259612A1 (en) | 2021-02-11 | 2022-08-18 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying cytokinin oxidase levels in plants |
US11884924B2 (en) | 2021-02-16 | 2024-01-30 | Inscripta, Inc. | Dual strand nucleic acid-guided nickase editing |
WO2022175878A1 (en) * | 2021-02-20 | 2022-08-25 | Kcat Enzymatic Private Limited | Insilico guided crispr-cas driven enzyme engineering framework |
WO2022182834A1 (en) | 2021-02-25 | 2022-09-01 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying root architecture in plants |
WO2022184765A1 (en) | 2021-03-02 | 2022-09-09 | BRAIN Biotech AG | NOVEL CRISPR-Cas NUCLEASES FROM METAGENOMES |
JP2024509853A (ja) | 2021-03-03 | 2024-03-05 | ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド | T細胞療法およびdgk阻害剤の組合せ |
US20240174997A1 (en) * | 2021-03-09 | 2024-05-30 | Arbor Biotechnologies, Inc. | Compositions comprising a variant polypeptide and uses thereof |
WO2022188797A1 (en) | 2021-03-09 | 2022-09-15 | Huigene Therapeutics Co., Ltd. | Engineered crispr/cas13 system and uses thereof |
CN113005147A (zh) * | 2021-03-11 | 2021-06-22 | 中山大学附属第一医院 | 一种usp8突变的小鼠动物模型的构建方法及其应用 |
TW202304480A (zh) | 2021-03-19 | 2023-02-01 | 美商艾歐凡斯生物治療公司 | 腫瘤浸潤淋巴球(til)中之與cd39/cd69選擇及基因剔除相關之til擴增之方法 |
AR125191A1 (es) | 2021-03-22 | 2023-06-21 | Lifeedit Therapeutics Inc | Enzimas modificadoras del adn y sus fragmentos activos y variantes y métodos de uso |
EP4320234A2 (en) | 2021-04-07 | 2024-02-14 | Astrazeneca AB | Compositions and methods for site-specific modification |
WO2022217086A1 (en) | 2021-04-09 | 2022-10-13 | Vor Biopharma Inc. | Photocleavable guide rnas and methods of use thereof |
WO2022221699A1 (en) | 2021-04-16 | 2022-10-20 | Beam Therapeutics, Inc. | Genetic modification of hepatocytes |
BR112023021665A2 (pt) | 2021-04-19 | 2023-12-19 | Iovance Biotherapeutics Inc | Método para tratar um câncer, e, composição |
KR102428773B1 (ko) * | 2021-04-21 | 2022-08-05 | (주)지플러스생명과학 | 분리형 crRNA 및 이를 이용한 CRISPR-Cas 시스템 |
US20240141311A1 (en) | 2021-04-22 | 2024-05-02 | North Carolina State University | Compositions and methods for generating male sterile plants |
WO2022236147A1 (en) | 2021-05-06 | 2022-11-10 | Artisan Development Labs, Inc. | Modified nucleases |
JP2024519029A (ja) | 2021-05-17 | 2024-05-08 | アイオバンス バイオセラピューティクス,インコーポレイテッド | Pd-1遺伝子編集された腫瘍浸潤リンパ球及び免疫療法におけるその使用 |
WO2022243437A1 (en) | 2021-05-19 | 2022-11-24 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Sample preparation with oppositely oriented guide polynucleotides |
CN113287569B (zh) * | 2021-05-27 | 2023-04-07 | 四川康城生物科技有限公司 | 一种免疫低下动物模型的构建方法 |
WO2022256448A2 (en) | 2021-06-01 | 2022-12-08 | Artisan Development Labs, Inc. | Compositions and methods for targeting, editing, or modifying genes |
US20220389418A1 (en) | 2021-06-01 | 2022-12-08 | Helmholtz-Institut Für Rna-Basierte Nfektionsforschung (Hzi) | Rna-guided cas nucleases and uses thereof in diagnostics and therapy |
IL308806A (en) | 2021-06-01 | 2024-01-01 | Arbor Biotechnologies Inc | Gene editing systems including nuclease crisper and their uses |
CN113064220A (zh) * | 2021-06-03 | 2021-07-02 | 四川九通智路科技有限公司 | 基于非线性自回归神经网络的能见度测量系统及测量方法 |
CA3173953A1 (en) | 2021-06-11 | 2023-12-10 | Tyson D. BOWEN | Rna polymerase iii promoters and methods of use |
WO2022265905A2 (en) | 2021-06-14 | 2022-12-22 | Pairwise Plants Services, Inc. | Reporter constructs, compositions comprising the same, and methods of use thereof |
CA3223995A1 (en) | 2021-06-17 | 2022-12-22 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of growth regulating factor family transcription factors in soybean |
WO2022266439A2 (en) * | 2021-06-17 | 2022-12-22 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Crispr cascade |
CA3223311A1 (en) | 2021-06-18 | 2022-12-22 | Andrea BARGHETTI | Compositions and methods for targeting, editing or modifying human genes |
UY39827A (es) | 2021-06-24 | 2023-01-31 | Pairwise Plants Services Inc | Modificación de genes de ubiquitina ligasa e3 hect para mejorar los rasgos de rendimiento |
CN117794358A (zh) | 2021-07-01 | 2024-03-29 | 成对植物服务股份有限公司 | 用于增强根系发育的方法和组合物 |
AU2022307018A1 (en) * | 2021-07-05 | 2024-02-15 | Genkore Inc. | Cleavage-inactive cas12f1, cleavage-inactive cas12f1-based fusion protein, crispr gene-editing system comprising same, and preparation method and use thereof |
WO2023283585A2 (en) | 2021-07-06 | 2023-01-12 | Vor Biopharma Inc. | Inhibitor oligonucleotides and methods of use thereof |
CN117987554A (zh) * | 2021-07-06 | 2024-05-07 | 苏州淦江生物技术有限公司 | 一种基于Cas蛋白的检测方法 |
EP4367242A2 (en) | 2021-07-07 | 2024-05-15 | Omega Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating secreted frizzled receptor protein 1 (sfrp1) gene expression |
EP4367229A1 (en) * | 2021-07-09 | 2024-05-15 | Acrigen Biosciences | Compositions and methods for nucleic acid modifications |
CN113383747B (zh) * | 2021-07-09 | 2022-12-27 | 广西贺州农贝贝农牧科技有限公司 | 一种产蛋后期老龄鸡强制换羽的工艺方法 |
WO2023287669A2 (en) | 2021-07-12 | 2023-01-19 | Labsimply, Inc. | Nuclease cascade assay |
WO2023004074A2 (en) | 2021-07-22 | 2023-01-26 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Method for cryopreservation of solid tumor fragments |
CA3226942A1 (en) | 2021-07-28 | 2023-02-02 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with kras inhibitors |
WO2023006933A1 (en) | 2021-07-30 | 2023-02-02 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Plants with improved digestibility and marker haplotypes |
WO2023015182A1 (en) | 2021-08-02 | 2023-02-09 | Vor Biopharma Inc. | Compositions and methods for gene modification |
US20230078990A1 (en) | 2021-08-12 | 2023-03-16 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits |
WO2023020938A1 (en) | 2021-08-16 | 2023-02-23 | Nunhems B.V. | Lettuce plant having delayed bolting |
EP4388110A1 (en) | 2021-08-17 | 2024-06-26 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying cytokinin receptor histidine kinase genes in plants |
WO2023028444A1 (en) * | 2021-08-27 | 2023-03-02 | Mammoth Biosciences, Inc. | Effector proteins and methods of use |
CN118265446A (zh) | 2021-08-30 | 2024-06-28 | 成对植物服务股份有限公司 | 修饰植物中的泛素结合肽酶基因以改善产量性状 |
CN113584077B (zh) * | 2021-08-31 | 2023-09-15 | 西南大学 | 沉默桑实杯盘菌关键致病基因CsGPA1的沉默载体及其应用和方法 |
AR126938A1 (es) | 2021-09-02 | 2023-11-29 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para mejorar la arquitectura de las plantas y los rasgos de rendimiento |
US20230087522A1 (en) | 2021-09-21 | 2023-03-23 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for reducing pod shatter in canola |
WO2023049728A1 (en) | 2021-09-21 | 2023-03-30 | Pairwise Plants Services, Inc. | Color-based and/or visual methods for identifying the presence of a transgene and compositions and constructs relating to the same |
EP4408991A2 (en) | 2021-09-27 | 2024-08-07 | Vor Biopharma Inc. | Fusion polypeptides for genetic editing and methods of use thereof |
EP4408996A2 (en) | 2021-09-30 | 2024-08-07 | Astrazeneca AB | Use of inhibitors to increase efficiency of crispr/cas insertions |
CA3237641A1 (en) | 2021-10-04 | 2023-04-13 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods for improving floret fertility and seed yield |
US20230116819A1 (en) | 2021-10-07 | 2023-04-13 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods for improving floret fertility and seed yield |
WO2023064872A1 (en) | 2021-10-14 | 2023-04-20 | Precision Biosciences, Inc. | Combinations of anti-bcma car t cells and gamma secretase inhibitors |
EP4166670A1 (en) | 2021-10-18 | 2023-04-19 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Plant-tag-based weeding control |
CA3235185A1 (en) | 2021-10-19 | 2023-04-27 | Cassandra GORSUCH | Gene editing methods for treating alpha-1 antitrypsin (aat) deficiency |
WO2023077015A2 (en) | 2021-10-27 | 2023-05-04 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Systems and methods for coordinating manufacturing of cells for patient-specific immunotherapy |
CN118251491A (zh) | 2021-10-28 | 2024-06-25 | 瑞泽恩制药公司 | 用于敲除C5的CRISPR/Cas相关方法及组合物 |
WO2023077148A1 (en) | 2021-11-01 | 2023-05-04 | Tome Biosciences, Inc. | Single construct platform for simultaneous delivery of gene editing machinery and nucleic acid cargo |
WO2023081900A1 (en) | 2021-11-08 | 2023-05-11 | Juno Therapeutics, Inc. | Engineered t cells expressing a recombinant t cell receptor (tcr) and related systems and methods |
AU2022388729A1 (en) | 2021-11-10 | 2024-05-16 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes |
WO2023091910A1 (en) | 2021-11-16 | 2023-05-25 | Precision Biosciences, Inc. | Methods for cancer immunotherapy |
WO2023097316A1 (en) * | 2021-11-29 | 2023-06-01 | Editas Medicine, Inc. | Engineered crispr/cas12a effector proteins, and uses thereof |
CN114404429B (zh) * | 2021-11-30 | 2023-06-30 | 重庆医科大学附属第二医院 | 一种纳米银修饰的单宁酸-铁网络的载药纳米复合物及其制备方法和逆转肿瘤耐药应用 |
CA3238939A1 (en) | 2021-12-08 | 2023-06-15 | Gaurang Patel | Mutant myocilin disease model and uses thereof |
AR127904A1 (es) | 2021-12-09 | 2024-03-06 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos para mejorar la fertilidad de floretes y el rendimiento de semillas |
WO2023114090A2 (en) * | 2021-12-13 | 2023-06-22 | Labsimply, Inc. | Signal boost cascade assay |
US20230295646A1 (en) | 2021-12-13 | 2023-09-21 | Pairwise Plants Services, Inc. | Model editing systems and methods relating to the same |
WO2023114052A1 (en) | 2021-12-13 | 2023-06-22 | Labsimply, Inc. | Tuning cascade assay kinetics via molecular design |
WO2023119135A1 (en) | 2021-12-21 | 2023-06-29 | Benson Hill, Inc. | Compositions and methods for modifying genomes |
WO2023122764A1 (en) | 2021-12-22 | 2023-06-29 | Tome Biosciences, Inc. | Co-delivery of a gene editor construct and a donor template |
CA3240593A1 (en) | 2021-12-23 | 2023-06-29 | Joel D. Richter | Therapeutic treatment for fragile x-associated disorder |
WO2023133440A1 (en) | 2022-01-06 | 2023-07-13 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for trichome removal |
WO2023135524A1 (en) * | 2022-01-12 | 2023-07-20 | Genecker Co., Ltd. | Cas9 proteins with enhanced specificity and uses thereof |
WO2023139557A1 (en) | 2022-01-24 | 2023-07-27 | LifeEDIT Therapeutics, Inc. | Rna-guided nucleases and active fragments and variants thereof and methods of use |
WO2023147488A1 (en) | 2022-01-28 | 2023-08-03 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods |
AR128372A1 (es) | 2022-01-31 | 2024-04-24 | Pairwise Plants Services Inc | Supresión de la respuesta de evitación de la sombra en las plantas |
WO2023150620A1 (en) | 2022-02-02 | 2023-08-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr-mediated transgene insertion in neonatal cells |
WO2023154887A1 (en) | 2022-02-11 | 2023-08-17 | Northeast Agricultural University | Methods and compositions for increasing protein and/or oil content and modifying oil profile in a plant |
WO2023156585A1 (en) * | 2022-02-18 | 2023-08-24 | Pulmobiotics, S.L. | Systems, tools, and methods for engineering bacteria |
WO2023164722A1 (en) | 2022-02-28 | 2023-08-31 | Pairwise Plants Services, Inc. | Engineered crispr-cas effector proteins and methods of use thereof |
WO2023168242A1 (en) | 2022-03-01 | 2023-09-07 | Epicrispr Biotechnologies, Inc. | Engineered nucleases, compositions, and methods of use thereof |
WO2023167882A1 (en) | 2022-03-01 | 2023-09-07 | Artisan Development Labs, Inc. | Composition and methods for transgene insertion |
WO2023168217A1 (en) | 2022-03-02 | 2023-09-07 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits |
CN114271237B (zh) * | 2022-03-07 | 2022-05-27 | 南京农业大学 | 一种长短绒自别雌雄鸽的培育方法 |
WO2023192838A1 (en) | 2022-03-31 | 2023-10-05 | Pairwise Plants Services, Inc. | Early flowering rosaceae plants with improved characteristics |
CN114592023B (zh) * | 2022-03-31 | 2023-03-24 | 杭州优玛达生物科技有限公司 | 一种细胞裂解自组装多肽复合物、自组装方法、自组装多肽制剂及应用 |
WO2023196877A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies |
US20230357789A1 (en) | 2022-04-07 | 2023-11-09 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving resistance to fusarium head blight |
WO2023201369A1 (en) | 2022-04-15 | 2023-10-19 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Til expansion processes using specific cytokine combinations and/or akti treatment |
WO2023205744A1 (en) | 2022-04-20 | 2023-10-26 | Tome Biosciences, Inc. | Programmable gene insertion compositions |
WO2023205714A1 (en) | 2022-04-21 | 2023-10-26 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield traits |
WO2023212677A2 (en) | 2022-04-29 | 2023-11-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Identification of tissue-specific extragenic safe harbors for gene therapy approaches |
US20230348922A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-02 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for enhancing yield and disease resistance |
WO2023215831A1 (en) | 2022-05-04 | 2023-11-09 | Tome Biosciences, Inc. | Guide rna compositions for programmable gene insertion |
WO2023215809A1 (en) | 2022-05-05 | 2023-11-09 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying root architecture and/or improving plant yield traits |
WO2023220603A1 (en) | 2022-05-09 | 2023-11-16 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Vectors and methods for in vivo antibody production |
WO2023220608A1 (en) | 2022-05-10 | 2023-11-16 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with an il-15r agonist |
WO2023225670A2 (en) | 2022-05-20 | 2023-11-23 | Tome Biosciences, Inc. | Ex vivo programmable gene insertion |
WO2023225410A2 (en) | 2022-05-20 | 2023-11-23 | Artisan Development Labs, Inc. | Systems and methods for assessing risk of genome editing events |
WO2023230549A2 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Compositions and methods for modulation of tumor suppressors and oncogenes |
WO2023230573A2 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Compositions and methods for modulation of immune responses |
WO2023230570A2 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Compositions and methods for modulating genetic drivers |
WO2023230498A1 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | Massachusetts Institute Of Technology | Systems, methods, and compositions for rna-guided rna-targeting crispr effectors with cas7-11 variants |
CN114934031B (zh) * | 2022-05-25 | 2023-08-01 | 广州瑞风生物科技有限公司 | 新型Cas效应蛋白、基因编辑系统及用途 |
WO2023230578A2 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Compositions and methods for modulating circulating factors |
WO2023230566A2 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Compositions and methods for modulating cytokines |
WO2023235725A2 (en) | 2022-05-31 | 2023-12-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease |
WO2023235726A2 (en) | 2022-05-31 | 2023-12-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr interference therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease |
US20230416771A1 (en) | 2022-06-27 | 2023-12-28 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants |
WO2024006792A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement |
US20240000031A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement |
EP4299739A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-03 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Compositions, systems, and methods for genome editing |
WO2024005864A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Compositions, systems, and methods for genome editing |
WO2024005863A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Compositions, systems, and methods for genome editing |
EP4299733A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-03 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Compositions, systems, and methods for genome editing |
WO2024020587A2 (en) | 2022-07-22 | 2024-01-25 | Tome Biosciences, Inc. | Pleiopluripotent stem cell programmable gene insertion |
WO2024026474A1 (en) | 2022-07-29 | 2024-02-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle |
WO2024030984A1 (en) | 2022-08-04 | 2024-02-08 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield traits |
US20240060081A1 (en) | 2022-08-11 | 2024-02-22 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement |
WO2024033901A1 (en) | 2022-08-12 | 2024-02-15 | LifeEDIT Therapeutics, Inc. | Rna-guided nucleases and active fragments and variants thereof and methods of use |
WO2024038168A1 (en) | 2022-08-19 | 2024-02-22 | UCB Biopharma SRL | Novel rna-guided nucleases and nucleic acid targeting systems comprising such |
WO2024042489A1 (en) | 2022-08-25 | 2024-02-29 | LifeEDIT Therapeutics, Inc. | Chemical modification of guide rnas with locked nucleic acid for rna guided nuclease-mediated gene editing |
US20240100192A1 (en) | 2022-08-25 | 2024-03-28 | Massachusetts Institute Of Technology | Programmable rna writing using crispr effectors and trans-splicing templates |
WO2024042165A2 (en) | 2022-08-26 | 2024-02-29 | UCB Biopharma SRL | Novel rna-guided nucleases and nucleic acid targeting systems comprising such rna-guided nucleases |
WO2024042199A1 (en) | 2022-08-26 | 2024-02-29 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Use of paired genes in hybrid breeding |
WO2024042168A1 (en) | 2022-08-26 | 2024-02-29 | UCB Biopharma SRL | Novel rna-guided nucleases and nucleic acid targeting systems comprising such rna-guided nucleases |
WO2024050548A2 (en) * | 2022-09-02 | 2024-03-07 | Hunterian Medicine Llc | Compact promoters for targeting hypoxia induced genes |
WO2024047561A1 (en) | 2022-09-02 | 2024-03-07 | Janssen Biotech, Inc. | Biomaterials and processes for immune synapse modulation of hypoimmunogenicity |
WO2024054880A1 (en) | 2022-09-08 | 2024-03-14 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield characteristics in plants |
WO2024054944A1 (en) | 2022-09-08 | 2024-03-14 | Juno Therapeutics, Inc. | Combination of a t cell therapy and continuous or intermittent dgk inhibitor dosing |
WO2024062138A1 (en) | 2022-09-23 | 2024-03-28 | Mnemo Therapeutics | Immune cells comprising a modified suv39h1 gene |
WO2024073606A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Antibody resistant modified receptors to enhance cell-based therapies |
WO2024073751A1 (en) | 2022-09-29 | 2024-04-04 | Vor Biopharma Inc. | Methods and compositions for gene modification and enrichment |
US11982677B2 (en) | 2022-10-02 | 2024-05-14 | Vedabio, Inc. | Dimerization screening assays |
US11965205B1 (en) | 2022-10-14 | 2024-04-23 | Vedabio, Inc. | Detection of nucleic acid and non-nucleic acid target molecules |
WO2024083579A1 (en) | 2022-10-20 | 2024-04-25 | Basf Se | Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants |
WO2024098027A1 (en) | 2022-11-04 | 2024-05-10 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd103 selection |
WO2024098002A1 (en) | 2022-11-04 | 2024-05-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 1 (cacng1) binding proteins and cacng1-mediated delivery to skeletal muscle |
WO2024098024A1 (en) | 2022-11-04 | 2024-05-10 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof |
WO2024095245A2 (en) | 2022-11-04 | 2024-05-10 | LifeEDIT Therapeutics, Inc. | Evolved adenine deaminases and rna-guided nuclease fusion proteins with internal insertion sites and methods of use |
WO2024102277A2 (en) | 2022-11-07 | 2024-05-16 | Syngenta Crop Protection Ag | Genes altering soy plant flowering time and/or maturation and uses thereof |
WO2024100604A1 (en) | 2022-11-09 | 2024-05-16 | Juno Therapeutics Gmbh | Methods for manufacturing engineered immune cells |
WO2024102434A1 (en) | 2022-11-10 | 2024-05-16 | Senda Biosciences, Inc. | Rna compositions comprising lipid nanoparticles or lipid reconstructed natural messenger packs |
WO2024107765A2 (en) | 2022-11-14 | 2024-05-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes |
WO2024112571A2 (en) | 2022-11-21 | 2024-05-30 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Two-dimensional processes for the expansion of tumor infiltrating lymphocytes and therapies therefrom |
WO2024118836A1 (en) | 2022-11-30 | 2024-06-06 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes with shortened rep step |
WO2024127370A1 (en) | 2022-12-16 | 2024-06-20 | LifeEDIT Therapeutics, Inc. | Guide rnas that target trac gene and methods of use |
WO2024130102A2 (en) | 2022-12-16 | 2024-06-20 | Pairwise Plants Services, Inc. | Fusion proteins comprising an intein polypeptide and methods of use thereof |
WO2024127369A1 (en) | 2022-12-16 | 2024-06-20 | LifeEDIT Therapeutics, Inc. | Guide rnas that target foxp3 gene and methods of use |
WO2024137911A1 (en) | 2022-12-21 | 2024-06-27 | Pairwise Plants Services, Inc. | Engineered proteins and methods of use thereof |
WO2024138194A1 (en) | 2022-12-22 | 2024-06-27 | Tome Biosciences, Inc. | Platforms, compositions, and methods for in vivo programmable gene insertion |
CN118275664A (zh) * | 2022-12-30 | 2024-07-02 | 上海吐露港生物科技有限公司 | 基于拆分Cas蛋白的非核酸靶标检测方法及应用 |
CN116355878B (zh) * | 2023-02-28 | 2024-04-26 | 华中农业大学 | 新型TnpB编程性核酸酶及其应用 |
CN116751763B (zh) * | 2023-05-08 | 2024-02-13 | 珠海舒桐医疗科技有限公司 | 一种Cpf1蛋白、V型基因编辑系统及应用 |
CN116671491B (zh) * | 2023-07-04 | 2024-01-23 | 四川省畜牧科学研究院 | 一种南江黄羊的种羊选育方法 |
CN116790559B (zh) * | 2023-07-07 | 2023-11-28 | 山东舜丰生物科技有限公司 | 一种融合HNH结构域的V型Cas酶及其应用 |
CN117286039B (zh) * | 2023-11-27 | 2024-03-12 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种菌丝形态优化的里氏木霉菌株及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014093595A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation |
WO2014197568A2 (en) | 2013-06-04 | 2014-12-11 | President And Fellows Of Harvard College | Rna-guideded transcriptional regulation |
WO2014197748A2 (en) | 2013-06-05 | 2014-12-11 | Duke University | Rna-guided gene editing and gene regulation |
Family Cites Families (148)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1506509A (en) | 1975-12-19 | 1978-04-05 | Nissan Motor | Apparatus for mounting instruments on the instrument panel of a motor vehicle |
US4217344A (en) | 1976-06-23 | 1980-08-12 | L'oreal | Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres |
US4235871A (en) | 1978-02-24 | 1980-11-25 | Papahadjopoulos Demetrios P | Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles |
US4186183A (en) | 1978-03-29 | 1980-01-29 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis |
US4261975A (en) | 1979-09-19 | 1981-04-14 | Merck & Co., Inc. | Viral liposome particle |
US4485054A (en) | 1982-10-04 | 1984-11-27 | Lipoderm Pharmaceuticals Limited | Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV) |
US4501728A (en) | 1983-01-06 | 1985-02-26 | Technology Unlimited, Inc. | Masking of liposomes from RES recognition |
US4946787A (en) | 1985-01-07 | 1990-08-07 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US4897355A (en) | 1985-01-07 | 1990-01-30 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US5049386A (en) | 1985-01-07 | 1991-09-17 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US4797368A (en) | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
US4774085A (en) | 1985-07-09 | 1988-09-27 | 501 Board of Regents, Univ. of Texas | Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators |
DE3751873T2 (de) | 1986-04-09 | 1997-02-13 | Genzyme Corp | Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern |
US4837028A (en) | 1986-12-24 | 1989-06-06 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
US4873316A (en) | 1987-06-23 | 1989-10-10 | Biogen, Inc. | Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals |
US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
AU7979491A (en) | 1990-05-03 | 1991-11-27 | Vical, Inc. | Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes |
US5210015A (en) | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
US5266317A (en) | 1990-10-04 | 1993-11-30 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Insect-specific paralytic neurotoxin genes for use in biological insect control: methods and compositions |
US5173414A (en) | 1990-10-30 | 1992-12-22 | Applied Immune Sciences, Inc. | Production of recombinant adeno-associated virus vectors |
GB9104617D0 (en) | 1991-03-05 | 1991-04-17 | Nickerson Int Seed | Pest control |
GB9114259D0 (en) | 1991-07-02 | 1991-08-21 | Ici Plc | Plant derived enzyme and dna sequences |
GB9115909D0 (en) | 1991-07-23 | 1991-09-04 | Nickerson Int Seed | Recombinant dna |
DK39692D0 (da) | 1992-03-25 | 1992-03-25 | Danisco | Biologisk materiale |
US5587308A (en) | 1992-06-02 | 1996-12-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services | Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter |
AU670316B2 (en) | 1992-07-27 | 1996-07-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | An improved method of (agrobacterium)-mediated transformation of cultured soybean cells |
US5593972A (en) | 1993-01-26 | 1997-01-14 | The Wistar Institute | Genetic immunization |
US5789156A (en) | 1993-06-14 | 1998-08-04 | Basf Ag | Tetracycline-regulated transcriptional inhibitors |
US5814618A (en) | 1993-06-14 | 1998-09-29 | Basf Aktiengesellschaft | Methods for regulating gene expression |
US5543158A (en) | 1993-07-23 | 1996-08-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Biodegradable injectable nanoparticles |
US6007845A (en) | 1994-07-22 | 1999-12-28 | Massachusetts Institute Of Technology | Nanoparticles and microparticles of non-linear hydrophilic-hydrophobic multiblock copolymers |
US5994627A (en) | 1995-03-31 | 1999-11-30 | Common Wealth Scientific And Industrial Research Organisation | Genetic sequences conferring nematode resistance in plants and uses therefor |
CA2223103A1 (en) | 1995-06-06 | 1996-12-12 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
US5985662A (en) | 1995-07-13 | 1999-11-16 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense inhibition of hepatitis B virus replication |
AR006928A1 (es) | 1996-05-01 | 1999-09-29 | Pioneer Hi Bred Int | Una molecula de adn aislada que codifica una proteina fluorescente verde como marcador rastreable para la transformacion de plantas, un metodo para laproduccion de plantas transgenicas, un vector de expresion, una planta transgenica y celulas de dichas plantas. |
US5855913A (en) | 1997-01-16 | 1999-01-05 | Massachusetts Instite Of Technology | Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery |
US5985309A (en) | 1996-05-24 | 1999-11-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Preparation of particles for inhalation |
US5846946A (en) | 1996-06-14 | 1998-12-08 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | Compositions and methods for administering Borrelia DNA |
GB9907461D0 (en) | 1999-03-31 | 1999-05-26 | King S College London | Neurite regeneration |
US7022896B1 (en) | 1997-04-04 | 2006-04-04 | Board Of Regents Of University Of Nebraska | Methods and materials for making and using transgenic dicamba-degrading organisms |
GB9720465D0 (en) | 1997-09-25 | 1997-11-26 | Oxford Biomedica Ltd | Dual-virus vectors |
CA2307016A1 (en) | 1997-10-24 | 1999-05-06 | Life Technologies, Inc. | Recombinational cloning using nucleic acids having recombination sites |
US6750059B1 (en) | 1998-07-16 | 2004-06-15 | Whatman, Inc. | Archiving of vectors |
US6534261B1 (en) | 1999-01-12 | 2003-03-18 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins |
US7868149B2 (en) | 1999-07-20 | 2011-01-11 | Monsanto Technology Llc | Plant genome sequence and uses thereof |
US6603061B1 (en) | 1999-07-29 | 2003-08-05 | Monsanto Company | Agrobacterium-mediated plant transformation method |
GB0024550D0 (ja) | 2000-10-06 | 2000-11-22 | Oxford Biomedica Ltd | |
WO2003045304A2 (en) | 2001-09-26 | 2003-06-05 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Mutable vaccines |
GB0125216D0 (en) | 2001-10-19 | 2001-12-12 | Univ Strathclyde | Dendrimers for use in targeted delivery |
US20090100536A1 (en) | 2001-12-04 | 2009-04-16 | Monsanto Company | Transgenic plants with enhanced agronomic traits |
AU2002353231B2 (en) | 2001-12-21 | 2008-10-16 | Oxford Biomedica (Uk) Limited | Method for producing a transgenic organism using a lentiviral expression vector such as EIAV |
WO2004002453A1 (en) | 2002-06-28 | 2004-01-08 | Protiva Biotherapeutics Ltd. | Method and apparatus for producing liposomes |
GB0220467D0 (en) | 2002-09-03 | 2002-10-09 | Oxford Biomedica Ltd | Composition |
EP1558724A4 (en) | 2002-11-01 | 2006-08-02 | New England Biolabs Inc | ORGANIC RNA SCREENING AND ITS USE IN INTERRUPTING GENE TRANSMISSION IN THE ENVIRONMENT |
AU2004257373B2 (en) | 2003-07-16 | 2011-03-24 | Arbutus Biopharma Corporation | Lipid encapsulated interfering RNA |
CA2551022C (en) | 2003-09-15 | 2013-06-04 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Polyethyleneglycol-modified lipid compounds and uses thereof |
GB0325379D0 (en) | 2003-10-30 | 2003-12-03 | Oxford Biomedica Ltd | Vectors |
US7919277B2 (en) * | 2004-04-28 | 2011-04-05 | Danisco A/S | Detection and typing of bacterial strains |
CA2569664C (en) | 2004-06-07 | 2013-07-16 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Lipid encapsulated interfering rna |
US7745651B2 (en) | 2004-06-07 | 2010-06-29 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Cationic lipids and methods of use |
EP1784416B1 (en) | 2004-07-16 | 2011-10-05 | GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Vaccines against aids comprising cmv/r nucleic acid constructs |
GB0422877D0 (en) | 2004-10-14 | 2004-11-17 | Univ Glasgow | Bioactive polymers |
WO2007048046A2 (en) | 2005-10-20 | 2007-04-26 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Sirna silencing of filovirus gene expression |
WO2007049731A1 (ja) | 2005-10-28 | 2007-05-03 | Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation | 新規細胞膜透過ペプチド |
US8101741B2 (en) | 2005-11-02 | 2012-01-24 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Modified siRNA molecules and uses thereof |
GB0526211D0 (en) | 2005-12-22 | 2006-02-01 | Oxford Biomedica Ltd | Viral vectors |
US7915399B2 (en) | 2006-06-09 | 2011-03-29 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Modified siRNA molecules and uses thereof |
JP2008078613A (ja) | 2006-08-24 | 2008-04-03 | Rohm Co Ltd | 窒化物半導体の製造方法及び窒化物半導体素子 |
WO2008042156A1 (en) | 2006-09-28 | 2008-04-10 | Northwestern University | Maximizing oligonucleotide loading on gold nanoparticle |
AU2008204338B2 (en) | 2007-01-11 | 2014-03-06 | Erasmus University Medical Center | Circular chromosome conformation capture (4C) |
US7838729B2 (en) | 2007-02-26 | 2010-11-23 | Monsanto Technology Llc | Chloroplast transit peptides for efficient targeting of DMO and uses thereof |
WO2008149176A1 (en) | 2007-06-06 | 2008-12-11 | Cellectis | Meganuclease variants cleaving a dna target sequence from the mouse rosa26 locus and uses thereof |
US8349554B2 (en) | 2007-08-14 | 2013-01-08 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Needle array assembly and method for delivering therapeutic agents |
EP4223299A3 (en) | 2007-12-04 | 2023-08-30 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides |
JP2011512326A (ja) | 2007-12-31 | 2011-04-21 | ナノコア セラピューティクス,インコーポレイテッド | 心不全の治療用のrna干渉 |
US8058069B2 (en) | 2008-04-15 | 2011-11-15 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Lipid formulations for nucleic acid delivery |
FR2930264B1 (fr) * | 2008-04-18 | 2013-02-22 | Gervais Danone Sa | Nouvelle souche de lactobacillus paracasei subsp. paracasei dotee de proprietes antimicrobiennes et immunomodulatrices. |
US8575305B2 (en) | 2008-06-04 | 2013-11-05 | Medical Research Council | Cell penetrating peptides |
BRPI0910198A2 (pt) | 2008-06-30 | 2016-01-12 | Silenseed Ltd | composição para administração a partir de um sítio local de um agente baseado em nucleotídeos e método para tratar um sujeito sofrendo de uma doença requerendo tratamento local com um agente baseado em nucleotídeo. |
EP2309980A1 (en) | 2008-07-08 | 2011-04-20 | S.I.F.I. Societa' Industria Farmaceutica Italiana | Ophthalmic compositions for treating pathologies of the posterior segment of the eye |
US20100076057A1 (en) | 2008-09-23 | 2010-03-25 | Northwestern University | TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA |
US8969353B2 (en) | 2008-11-07 | 2015-03-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Aminoalcohol lipidoids and uses thereof |
GB2465749B (en) | 2008-11-25 | 2013-05-08 | Algentech Sas | Plant cell transformation method |
EP2427577A4 (en) | 2009-05-04 | 2013-10-23 | Hutchinson Fred Cancer Res | PSEUDOTYPED RETROVIRAL VECTORS WITH COCAL VESICULOVIRUS SHELL |
IL292615B2 (en) | 2009-07-01 | 2023-11-01 | Protiva Biotherapeutics Inc | Nucleic acid-lipid particles, preparations containing them and their uses |
US8236943B2 (en) | 2009-07-01 | 2012-08-07 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for silencing apolipoprotein B |
WO2011028929A2 (en) | 2009-09-03 | 2011-03-10 | The Regents Of The University Of California | Nitrate-responsive promoter |
US8889394B2 (en) | 2009-09-07 | 2014-11-18 | Empire Technology Development Llc | Multiple domain proteins |
EA026374B1 (ru) | 2009-12-23 | 2017-04-28 | Новартис Аг | Липиды, липидные композиции и способы их применения |
AP3284A (en) | 2010-02-24 | 2015-05-31 | Arrowhead Res Corp | Compositions for targeted delivery of SIRNA |
CA2796600C (en) | 2010-04-26 | 2019-08-13 | Sangamo Biosciences, Inc. | Genome editing of a rosa locus using zinc-finger nucleases |
US8372951B2 (en) | 2010-05-14 | 2013-02-12 | National Tsing Hua University | Cell penetrating peptides for intracellular delivery |
EP2575894B1 (en) | 2010-05-28 | 2015-02-25 | Oxford Biomedica (UK) Ltd | Delivery of lentiviral vectors to the brain |
EP2609135A4 (en) | 2010-08-26 | 2015-05-20 | Massachusetts Inst Technology | POLY (BETA-AMINO ALCOHOLS), THEIR PREPARATION AND USES THEREOF |
US9951341B2 (en) * | 2010-10-20 | 2018-04-24 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Lactococcus CRISPR-Cas sequences |
US9405700B2 (en) | 2010-11-04 | 2016-08-02 | Sonics, Inc. | Methods and apparatus for virtualization in an integrated circuit |
US9238716B2 (en) | 2011-03-28 | 2016-01-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Conjugated lipomers and uses thereof |
JP2014511687A (ja) | 2011-03-31 | 2014-05-19 | モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッド | 工学操作された核酸の送達および製剤 |
US20120295960A1 (en) | 2011-05-20 | 2012-11-22 | Oxford Biomedica (Uk) Ltd. | Treatment regimen for parkinson's disease |
EP2760286B1 (en) | 2011-09-26 | 2016-09-07 | Sumitomo Chemical Company Limited | Plant disease control composition and its use |
HRP20220717T1 (hr) | 2011-12-16 | 2022-07-22 | Modernatx, Inc. | Modificirani pripravci mrna |
US20130185823A1 (en) | 2012-01-16 | 2013-07-18 | Academia Sinica | Mesoporous silica nanoparticle-mediated delivery of dna into arabidopsis root |
MX2014001965A (es) | 2012-04-18 | 2014-03-31 | Arrowhead Res Corp | Polimeros de poli(acrilato) para suministro de acido nucleico in vivo. |
GB2537000C (en) | 2012-05-25 | 2019-10-09 | Univ California | Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification and for RNA-directed modulation of transcription |
KR102530118B1 (ko) | 2012-07-25 | 2023-05-08 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 유도 dna 결합 단백질 및 게놈 교란 도구 및 이의 적용 |
US8614194B1 (en) | 2012-07-25 | 2013-12-24 | Kaohsiung Medical University | Anionic cell penetrating peptide and its use for intracellular delivery |
UA119135C2 (uk) * | 2012-09-07 | 2019-05-10 | ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі | Спосіб отримання трансгенної рослини |
US20140310830A1 (en) * | 2012-12-12 | 2014-10-16 | Feng Zhang | CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes |
KR20150105633A (ko) | 2012-12-12 | 2015-09-17 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 서열 조작을 위한 시스템, 방법 및 최적화된 가이드 조성물의 조작 |
PL2898075T3 (pl) | 2012-12-12 | 2016-09-30 | PROJEKTOWANIE i OPTYMALIZACJA ULEPSZONYCH SYSTEMÓW, SPOSOBY I KOMPOZYCJE ENZYMÓW DO MANIPULACJI SEKWENCJĄ | |
SG10201912328UA (en) | 2012-12-12 | 2020-02-27 | Broad Inst Inc | Delivery, Engineering and Optimization of Systems, Methods and Compositions for Sequence Manipulation and Therapeutic Applications |
US8697359B1 (en) * | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
EP2931899A1 (en) | 2012-12-12 | 2015-10-21 | The Broad Institute, Inc. | Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof |
SG11201504621RA (en) | 2012-12-17 | 2015-07-30 | Harvard College | Rna-guided human genome engineering |
WO2014118272A1 (en) | 2013-01-30 | 2014-08-07 | Santaris Pharma A/S | Antimir-122 oligonucleotide carbohydrate conjugates |
JP2016519652A (ja) | 2013-03-14 | 2016-07-07 | カリブー・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド | 核酸ターゲティング核酸の組成物および方法 |
AU2014273085B2 (en) | 2013-05-29 | 2020-10-22 | Cellectis | New compact scaffold of Cas9 in the type II CRISPR system |
US20140356956A1 (en) * | 2013-06-04 | 2014-12-04 | President And Fellows Of Harvard College | RNA-Guided Transcriptional Regulation |
AU2014281027A1 (en) | 2013-06-17 | 2016-01-28 | Massachusetts Institute Of Technology | Optimized CRISPR-Cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation |
CA2915834A1 (en) | 2013-06-17 | 2014-12-24 | Massachusetts Institute Of Technology | Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation |
US10563225B2 (en) | 2013-07-26 | 2020-02-18 | President And Fellows Of Harvard College | Genome engineering |
US9340800B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-05-17 | President And Fellows Of Harvard College | Extended DNA-sensing GRNAS |
EP2877571B1 (en) | 2013-09-18 | 2018-05-30 | Kymab Limited | Methods, cells and organisms |
LT3066201T (lt) | 2013-11-07 | 2018-08-10 | Editas Medicine, Inc. | Su crispr susiję būdai ir kompozicijos su valdančiomis grnr |
EP3760719A1 (en) | 2013-11-18 | 2021-01-06 | CRISPR Therapeutics AG | Crispr-cas system materials and methods |
CA2932472A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Compositions and methods of use of crispr-cas systems in nucleotide repeat disorders |
WO2015089486A2 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | The Broad Institute Inc. | Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems |
WO2015089473A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | The Broad Institute Inc. | Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation |
BR112016013213A2 (pt) * | 2013-12-12 | 2017-12-05 | Massachusetts Inst Technology | administração, uso e aplicações terapêuticas dos sistemas crispr-cas e composições para visar distúrbios e doenças usando componentes de administração de partículas |
WO2015089364A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | The Broad Institute Inc. | Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof |
WO2015086795A1 (en) | 2013-12-13 | 2015-06-18 | Cellectis | Cas9 nuclease platform for microalgae genome engineering |
CN106164272B (zh) | 2014-01-21 | 2020-12-29 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 修饰的植物 |
JP5937635B2 (ja) | 2014-03-28 | 2016-06-22 | ファナック株式会社 | 電磁接触器の溶着検出機能を有するモータ駆動装置 |
CN104017821B (zh) * | 2014-05-16 | 2016-07-06 | 安徽省农业科学院水稻研究所 | 定向编辑颖壳颜色决定基因OsCHI创制褐壳水稻材料的方法 |
WO2016049258A2 (en) | 2014-09-25 | 2016-03-31 | The Broad Institute Inc. | Functional screening with optimized functional crispr-cas systems |
EP3230452A1 (en) | 2014-12-12 | 2017-10-18 | The Broad Institute Inc. | Dead guides for crispr transcription factors |
GB201506509D0 (en) | 2015-04-16 | 2015-06-03 | Univ Wageningen | Nuclease-mediated genome editing |
US20160362667A1 (en) | 2015-06-10 | 2016-12-15 | Caribou Biosciences, Inc. | CRISPR-Cas Compositions and Methods |
AU2016279062A1 (en) * | 2015-06-18 | 2019-03-28 | Omar O. Abudayyeh | Novel CRISPR enzymes and systems |
EP3430134B1 (en) * | 2015-06-18 | 2022-09-21 | The Broad Institute, Inc. | Novel crispr enzymes and systems |
US9790490B2 (en) | 2015-06-18 | 2017-10-17 | The Broad Institute Inc. | CRISPR enzymes and systems |
US20190048340A1 (en) | 2015-09-24 | 2019-02-14 | Crispr Therapeutics Ag | Novel family of rna-programmable endonucleases and their uses in genome editing and other applications |
US20190233814A1 (en) | 2015-12-18 | 2019-08-01 | The Broad Institute, Inc. | Novel crispr enzymes and systems |
CN105602993A (zh) * | 2016-01-19 | 2016-05-25 | 上海赛墨生物技术有限公司 | 线粒体靶向的基因编辑系统及方法 |
US20200263190A1 (en) | 2016-04-19 | 2020-08-20 | The Broad Institute, Inc. | Novel crispr enzymes and systems |
US20230037794A1 (en) | 2019-12-23 | 2023-02-09 | The Broad Institute, Inc. | Programmable dna nuclease-associated ligase and methods of use thereof |
-
2015
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2016
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2017
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2021
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-
2024
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014093595A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation |
WO2014197568A2 (en) | 2013-06-04 | 2014-12-11 | President And Fellows Of Harvard College | Rna-guideded transcriptional regulation |
WO2014197748A2 (en) | 2013-06-05 | 2014-12-11 | Duke University | Rna-guided gene editing and gene regulation |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Cell,2015年09月25日,vol.163,p.759-771 |
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