CN112553215A - 一个玉米纹枯病抗病相关基因ZmFAH49及其应用 - Google Patents

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CN112553215A CN202011543531.7A CN202011543531A CN112553215A CN 112553215 A CN112553215 A CN 112553215A CN 202011543531 A CN202011543531 A CN 202011543531A CN 112553215 A CN112553215 A CN 112553215A
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zmfah49
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resistance
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
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    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance

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Abstract

本发明公开了一个玉米纹枯病抗病相关基因ZmFAH49及其应用，属于植物基因工程技术领域。本发明利用强启动子驱动转基因技术，将ZmFAH49基因的超量表达载体转入水稻品种中花11，ZmFAH49基因表达量显著提高的遗传转化水稻对纹枯病菌的抗性明显增强，而zmfah49玉米突变体对纹枯病更加敏感，证明ZmFAH49基因在水稻抗纹枯病中发挥重要作用。

Description

一个玉米纹枯病抗病相关基因ZmFAH49及其应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一个玉米纹枯病抗病相关基因ZmFAH49及其应用。
背景技术
由立枯丝核菌引起的玉米、水稻纹枯病是作物生产上的主要病害，随着种植面积的扩大和高产栽培技术的推广，该病害发展蔓延加快，就发病范围及面积而言已成为水稻、玉米第一大病害。培育种植抗病品种是生产上综合治理作物病害的首选策略，但由于高抗材料的缺乏限制了纹枯病的抗性育种。
植物的抗病反应是多基因参与调控的复杂过程。参与植物抗病反应的基因分为两类：(1)抗病基因，又称R(resistance)基因和(2)抗病相关基因。其中：
抗病基因的产物主要是作为受体，直接或间接与病原蛋白相互作用，启动植物体内的抗病信号传导路径(Tang等，1996，Science 274:2060-2063；Baker等，1997，Science276:726-733；Jia等，2000，EMBO J.19:4004-4014；Dangl和Jones，2001，Nature 411:826-833；Nimchuk等，2001，Curr.Opin.Plant Biol.4:288-294)。抗病基因介导的抗病反应强，是很好的基因资源。但由于下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制：(1)抗病基因的资源有限，如目前知道的抵抗水稻重要病害白叶枯病的抗病基因少于30个，抵抗另一水稻重要病害-稻瘟病的抗病基因也只有大约40个；(2)抗病基因具有病原种类和病原生理小种特异性，抗病范围有限；(3)因为病原的快速突变，一个抗病基因的作用往往几年或者十几年后就丧失了。
抗病相关基因是指除抗病基因外所有参与抗病反应的基因，它们的编码产物参与合成植物体内抗病信号分子、参与信号传导或参与防卫反应等。这类基因的共同特点是病原诱导后它们的表达量升高或减少，因此人们可以根据病原诱导前后基因的表达量的差异大规模地鉴定植物抗病相关基因(Maleck等，2000，Nature Genet.26：403-410；Schenk等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:11655-11660；Zhou等，2002，Science in China 45:449-467)。目前，人们对抗病相关基因的认识有限。根据已有报道，绝大多数抗病相关基因单独作用时的抗性能力可能比抗病基因小。但根据下述原因，它们是值得大力开发的基因资源：(1)由于绝大多数抗病相关基因的产物不需要直接与病原物相互作用，这类基因是具有持久抗性的基因资源；(2)大多数抗病相关基因参与的抗病反应没有病原特异性，因此它们是具有广谱抗性的基因资源；(3)这类基因的资源丰富。
与抗病基因的应用相比，抗病相关基因的应用能提供植物更为广谱及长效的抗性。通过超量表达抗病相关基因进行玉米和水稻品种的改良，将进一步增强植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。但是，玉米共有10对染色体，约3.2万个基因，23亿个碱基，是目前已测序的植物中基因数量最多的品种。如何从庞大的玉米基因组中挖掘抗病相关基因，并探究这些基因在植物抗病和感病过程中的作用仍然是一个难题。
发明内容
针对上述现有技术，本发明经长期研究和探索，从玉米中分离克隆出一个玉米纹枯病抗病相关基因ZmFAH49。ZmFAH49基因表达量显著提高的遗传转化水稻对纹枯病菌的抗性明显增强，可见采用超量表达ZmFAH49基因之后可以赋予植物对由纹枯病菌所引起的病害产生抗病反应，获得高抗病植株。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供ZmFAH49基因在如下(1)或(2)中的应用：
(1)作物改良提高对纹枯病抗性；
(2)培育抗纹枯病的作物品种；
所述ZmFAH49基因为以下a)-c)中任一项所述的核酸：
a)核酸，其由SEQ ID NO.1所示的碱基序列组成；
b)核酸，其由SEQ ID NO.2所示的碱基序列组成；
c)核酸，其由编码SEQ ID NO.3所示蛋白质的碱基序列组成。
本发明的第二方面，提供ZmFAH49基因编码的蛋白在如下(1)或(2)中的应用：
(1)作物改良提高对纹枯病抗性；
(2)培育抗纹枯病的作物品种；
所述ZmFAH49基因编码的蛋白为如下a)或b)任一项所示：
a)蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
b)蛋白，其与a)所示的蛋白等价，但氨基酸序列与SEQ ID NO.3相比存在一个或数个氨基酸的替换、删除或插入。
本发明的第三方面，提供携带上述ZmFAH49基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在如下(1)或(2)中的应用：
(1)作物改良提高对纹枯病抗性；
(2)培育抗纹枯病的作物品种。
本发明的第四方面，提供一种提高作物纹枯病抗性的方法，包括以下步骤：
将ZmFAH49基因转入作物并使所述ZmFAH49基因在所述作物中超量表达；
或者，上调作物基因组中ZmFAH49基因的表达。
优选的，上调作物基因组中ZmFAH49基因表达的方法包括：导入能够激活或提高ZmFAH49基因的转录水平或翻译水平或蛋白活性的DNA片段；或者控制特异小RNA分子的合成，上调ZmFAH49基因mRNA的积累。
本发明的第五方面，提供一种培育纹枯病抗性提高的转基因作物的方法，是将ZmFAH49基因导入出发作物得到纹枯病抗性提高的转基因作物。
上述方法中，将所述的ZmFAH49基因导入出发作物的方法包括：聚乙二醇法、农杆菌介导法或基因枪轰击法。
上述方法中，所述纹枯病抗性提高为如下1)-3)中的至少一种：
1)所述转基因作物感染纹枯病后的病斑长度短于所述出发作物；
2)所述转基因作物感染纹枯病后PR1a基因的表达量高于所述出发作物；
3)所述转基因作物感染纹枯病后PR10基因的表达量高于所述出发作物。
优选的，上述应用中，所述作物为玉米或水稻。
本发明的有益效果：
本发明首次发现玉米ZmFAH49基因超量表达之后可以赋予植物对由纹枯病菌所引起的病害产生抗病反应，获得高抗病植株。因此，玉米ZmFAH49基因可以作为纹枯病抗病相关基因，对于水稻、玉米等作物纹枯病的防治具有重要的价值。
附图说明
图1：ZmFAH49超量表达T1代遗传转化植株接种纹枯病菌(YWK196)7天后结果示意图；图中，超量表达T1代遗传转化植株(pCXUN：：ZmFAH49-1、2和3)接种纹枯病菌(YWK196)7天后形成的病斑明显比水稻品种中花11(对照，WT)的短；
中花11为遗传转化受体材料。
图2：ZmFAH49超量转基因植株接种纹枯病菌后PR基因表达结果示意图；图中，ZmFAH49超量转基因植株接种纹枯病菌后PR1a和PR10基因的表达量显著高于中花11(对照，WT)。
图3：zmfah49玉米突变体接种纹枯病菌YWK196 7天后结果示意图；图中，zmfah49突变体(zmfah49-1、2和3)接种纹枯病菌YWK196 7天后形成的病斑明显比玉米自交系W22的长；
玉米自交系W22为受体材料。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，如何从庞大的玉米基因组中挖掘抗病相关基因，并探究这些基因在植物抗病和感病过程中的作用仍然是一个难题。
本专利发明人在玉米纹枯病抗病相关基因领域深耕多年，本发明经长期研究和探索，从玉米中分离克隆出一个玉米纹枯病抗病相关基因ZmFAH49。ZmFAH49基因的序列如SEQID NO.1所示，编码区序列如SEQ ID NO.2所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
获得了这一片段之后，将其与合适的载体连接，可以转入植物细胞，产生转基因植物，发现ZmFAH49基因表达量显著提高的遗传转化水稻对纹枯病菌的抗性明显增强，证明ZmFAH49基因在水稻抗纹枯病中发挥重要作用，因此证实了超量表达该基因后可以赋予植物对由纹枯病菌所引起的病害产生抗病反应，获得高抗病植株。
该基因片段来源于玉米B73，其通过特殊设计的引物扩增玉米B73 cDNA获得，其中所述的引物包括引物1，5′-ATGATCGAGACACCAACA-3′其序列如序列表SEQ ID NO.4所示，引物2，5′-TCAGGGAAGTGCCGGCAG-3′其序列如序列表SEQ ID NO.5所示，之后利用强启动子驱动原理的转基因技术，将ZmFAH49基因的超量表达载体转入水稻品种中花11。ZmFAH49基因表达量显著提高的遗传转化水稻对纹枯病菌的抗性明显增强，而zmfah49的玉米突变体对纹枯病更加敏感，证明ZmFAH49基因正向调控作物对纹枯病的抗性。
之所以采用上述的方法，主要是由于将克隆的抗病相关基因转入感病的植物，有助于产生新的抗病植物。特别是可以用遗传转化技术在植物中累加多个抗性基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的连锁基因组序列。而抗病相关基因的克隆是克服传统育种不能植物种间转移抗病相关基因问题的前提。
综上所述，本发明的发明人在国际上首次验证了一个玉米抗病相关基因的功能，利用其功能最终发现采用超量表达之后可以赋予植物对由纹枯病菌所引起的病害产生抗病反应，获得高抗病植株。。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。
实施例1：分离克隆ZmFAH49基因
发明人根据数据库ZmFAH49基因序列设计引物(引物1，5′-ATGATCGAGACACCAACA-3′其序列如序列表SEQ ID NO.4所示，引物2，5′-TCAGGGAAGTGCCGGCAG-3′其序列如序列表SEQ ID NO.5所示)用来获得ZmFAH49基因。提取玉米B73 RNA并通过反转录获得cDNA，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；
反应程序如下：预变性94℃5min，变性94℃40s，退火54℃40s，延伸72℃1.5min，反应35个循环，后延伸72℃7min；
结束后，用康为公司的DNA回收试剂盒回收并纯化扩增片段，然后将纯化的DNA片段连接至载体pGEM-T中(Promega公司)，转化E.coli DH5ɑ感受态细胞，挑选阳性克隆提质粒，测序由华大基因完成，获得长度为1365bp的ZmFAH49片段，具有序列表SEQ ID NO.2的DNA序列。
实施例2：ZmFAH49基因的功能验证
将上述纯化的cDNA片段(SEQ ID NO.2)通过TA克隆连入超量表达载体pCXUN，热激转化E.coli DH5α感受态细胞后对重组子进行菌落PCR，琼脂糖凝胶电泳检测，重组子中包含有与目的片段大小相同的条带。将鉴定好的重组子扩大培养后提取质粒，质粒测序后与原序列比对，连入的片段为全长cDNA并且没有碱基突变和缺失，证明ZmFAH49超量表达载体pCXUN：：ZmFAH49构建成功。
采用农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，Optimising the tissue cultureconditions for high efficiency transformation of indica rice，2005，Plant CellRep.23：540-547)将超量表达载体导入水稻品种中花11。获得的遗传转化植株被命名为pCXUN：：ZmFAH49。本发明共获得独立转化植株18株，其中阳性植株为13株。分别对T1代3个转基因株系pCXUN::ZmFAH49-1、2、3进行玉米纹枯病菌的接种鉴定。
结果表明，接种纹枯病菌YWK196 7天后，超量表达ZmFAH49的转基因植株与野生型相比平均病斑缩短了2.55cm、3.42cm和3.9cm(图1)；同时检测了野生型和ZmFAH49转基因植株接种纹枯病菌24小时后PR基因的表达(PR基因是植物中的病程相关基因，在受到病原菌侵染时都会上调表达，现在在抗病领域作为一种标记基因来指示植物的抗病性)，结果表明，接种纹枯病菌后，PR1a和PR10在ZmFAH49中的表达量显著高于野生型(图2)。另外，订购了3个ZmFAH49的玉米转座子插入突变体zmfah49-1、2和3，分别对这三个突变体进行纹枯病菌接种鉴定，结果表明，接种7天后，3个突变体与野生型相比病斑增长了3.8cm、3.7cm和3.9cm(图3)，这些结果说明ZmFAH49正向调控作物对纹枯病的抗性反应。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 一个玉米纹枯病抗病相关基因ZmFAH49及其应用
<130> 2020
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1534
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays L.）
<400> 1
ggcaggagta tgccaagatg atcgagacac caacaaacca aacaccatcc gccacgacca 60
cgactccacg agagagcgga ggaggagggg gagcaatggc agagccgggc cagcagttgc 120
tgcggtcgtt cgtggaggtg gcagcgggct cgcacttccc tatccagaac ctgcccttcg 180
gggtcttccg ccggcggggg tcgccaccgc aggctccgct ccccccggtg gccatcgggg 240
acttcgcgct cgacctcgcc accgtcgccg acgcgggtct cttcgacggg cccgcgctct 300
ccggctcccc gtgcttccac caggagacgc tcaacatgtt cttggggatg ggccgaccgg 360
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gtgacaacga agccctgagg aataaatgtc ttattccaat gagtgatatc gagatggttc 480
taccaatcac ggttggaggt tacacagatt tcttttgttc tgtgcaccat gcaaggaact 540
gcggattcat cttccgaggg ccgcagactc cagttaatcc aaattggttt tatcttccaa 600
taggatacaa tggacgagca tcatctatag ttgtgtctgg aaccgatgta attaggccca 660
gaggacaagg acatccaaca ggaaactccg ctccttattt tggtccctct cagaagcttg 720
attttgagct tgagatggct gccattgttg gtccaggaaa tgaattaggc aaaccaattg 780
atatcaatga tgctgaagaa catatttttg gcctaacttt gatgaatgat tggagcgcca 840
gagatattca ggcttgggag actatacctc ttggaccttt ccttgggaaa agcttcagta 900
ccaccatatc accatggatt gttactcttg atgctttgaa gcctttcatg tgtgaggctc 960
ctaagcagga acccgaacct ttaccatacc tagctgaaaa gaatcacata aactatgaca 1020
ttcctcttga agtcttgatt aagcctaaag atcaaaatgt tgcactaatt gtcacaaaaa 1080
ctaatttcaa gcatctgtat tggacggtga cgcagcagct aacacaccac actatcaatg 1140
gatgcaacat gaggccgggg gatatatttg caactggcac actcagtgga cctgaaccgg 1200
actccctcgg atgtctattg gagctaacat ggaacgggca gaaggagata ccagtgggca 1260
atttgacccg caagtttcta gaagatggag atgaggtcat cttgacagga tgctgcaagg 1320
gtgaaggcta caacattggt tttggaactt gcactgggaa ggtcctgccg gcacttccct 1380
gagccaacac gtctttacat cagttctcga gtccaaacac tcaacaatct agcaagatgc 1440
tatgtaactg aacaacgggg gttgttttcg cataggaaac tgatactctg ttgtggaata 1500
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<210> 2
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<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays L.）
<400> 2
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gtggcagcgg gctcgcactt ccctatccag aacctgccct tcggggtctt ccgccggcgg 180
gggtcgccac cgcaggctcc gctccccccg gtggccatcg gggacttcgc gctcgacctc 240
gccaccgtcg ccgacgcggg tctcttcgac gggcccgcgc tctccggctc cccgtgcttc 300
caccaggaga cgctcaacat gttcttgggg atgggccgac cggcgtggag ggaggcgcgc 360
gccacgctac aaaaaatcct ctcagccgac gagccagtct tgcgtgacaa cgaagccctg 420
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gctgccattg ttggtccagg aaatgaatta ggcaaaccaa ttgatatcaa tgatgctgaa 780
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gagactatac ctcttggacc tttccttggg aaaagcttca gtaccaccat atcaccatgg 900
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<211> 454
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<400> 3
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Gln Leu Leu Arg Ser Phe Val Glu Val Ala Ala Gly Ser His Phe Pro
35 40 45
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50 55 60
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Ala Thr Val Ala Asp Ala Gly Leu Phe Asp Gly Pro Ala Leu Ser Gly
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Ser Pro Cys Phe His Gln Glu Thr Leu Asn Met Phe Leu Gly Met Gly
100 105 110
Arg Pro Ala Trp Arg Glu Ala Arg Ala Thr Leu Gln Lys Ile Leu Ser
115 120 125
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130 135 140
Leu Ile Pro Met Ser Asp Ile Glu Met Val Leu Pro Ile Thr Val Gly
145 150 155 160
Gly Tyr Thr Asp Phe Phe Cys Ser Val His His Ala Arg Asn Cys Gly
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Phe Ile Phe Arg Gly Pro Gln Thr Pro Val Asn Pro Asn Trp Phe Tyr
180 185 190
Leu Pro Ile Gly Tyr Asn Gly Arg Ala Ser Ser Ile Val Val Ser Gly
195 200 205
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Ala Pro Tyr Phe Gly Pro Ser Gln Lys Leu Asp Phe Glu Leu Glu Met
225 230 235 240
Ala Ala Ile Val Gly Pro Gly Asn Glu Leu Gly Lys Pro Ile Asp Ile
245 250 255
Asn Asp Ala Glu Glu His Ile Phe Gly Leu Thr Leu Met Asn Asp Trp
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Asp Ala Leu Lys Pro Phe Met Cys Glu Ala Pro Lys Gln Glu Pro Glu
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Thr Lys Thr Asn Phe Lys His Leu Tyr Trp Thr Val Thr Gln Gln Leu
355 360 365
Thr His His Thr Ile Asn Gly Cys Asn Met Arg Pro Gly Asp Ile Phe
370 375 380
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420 425 430
Cys Lys Gly Glu Gly Tyr Asn Ile Gly Phe Gly Thr Cys Thr Gly Lys
435 440 445
Val Leu Pro Ala Leu Pro
450
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgatcgaga caccaaca 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcagggaagt gccggcag 18

Claims (8)

1.ZmFAH49基因在如下(1)或(2)中的应用：
(1)作物改良提高对纹枯病抗性；
(2)培育抗纹枯病的作物品种；
所述ZmFAH49基因为以下a)-c)中任一项所述的核酸：
a)核酸，其由SEQ ID NO.1所示的碱基序列组成；
b)核酸，其由SEQ ID NO.2所示的碱基序列组成；
c)核酸，其由编码SEQ ID NO.3所示蛋白质的碱基序列组成。
2.ZmFAH49基因编码的蛋白在如下(1)或(2)中的应用：
(1)作物改良提高对纹枯病抗性；
(2)培育抗纹枯病的作物品种；
所述ZmFAH49基因编码的蛋白为如下a)或b)任一项所示：
a)蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
b)蛋白，其与a)所示的蛋白等价，但氨基酸序列与SEQ ID NO.3相比存在一个或数个氨基酸的替换、删除或插入。
3.携带权利要求1所述ZmFAH49基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在如下(1)或(2)中的应用：
(1)作物改良提高对纹枯病抗性；
(2)培育抗纹枯病的作物品种。
4.一种提高作物纹枯病抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将携带权利要求1所述ZmFAH49基因转入作物并使所述ZmFAH49基因在所述作物中超量表达；
或者，上调作物基因组中ZmFAH49基因的表达。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，上调作物基因组中ZmFAH49基因表达的方法包括：导入能够激活或提高ZmFAH49基因的转录水平或翻译水平或蛋白活性的DNA片段；或者控制特异小RNA分子的合成，上调ZmFAH49基因mRNA的积累。
6.一种培育纹枯病抗性提高的转基因作物的方法，其特征在于，是将权利要求1所述ZmFAH49基因导入出发作物得到纹枯病抗性提高的转基因作物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将所述的ZmFAH49基因导入出发作物的方法包括：聚乙二醇法、农杆菌介导法或基因枪轰击法。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述纹枯病抗性提高为如下1)-3)中的至少一种：
1)所述转基因作物感染纹枯病后的病斑长度短于所述出发作物；
2)所述转基因作物感染纹枯病后PR1a基因的表达量高于所述出发作物；
3)所述转基因作物感染纹枯病后PR10基因的表达量高于所述出发作物。
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