CN111500597B - 一种橡胶树白粉病抗性相关基因HbHSP90.8及其应用 - Google Patents

一种橡胶树白粉病抗性相关基因HbHSP90.8及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种橡胶树白粉病抗性相关基因HbHSP90.8及其应用，通过对HbHSP90.8基因进行表达分析和酵母双杂交技术对该基因的功能进行研究，验证了该基因白粉菌诱导上调表达，与拟南芥AtSGT1b蛋白互作，与橡胶树白粉病抗性相关。该基因可用于橡胶树和其他作物抗白粉病转基因和抗感种质筛选研究中。本发明橡胶树白粉病抗性相关基因HbHSP90.8基因来自橡胶树叶片，非编辑基因，转基因后对自然环境无影响，为提高植物抗病性研究提供新的候选基因。

Description

一种橡胶树白粉病抗性相关基因HbHSP90.8及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种橡胶树白粉病抗性相关基因HbHSP90.8及其应用。
背景技术
由半知菌类粉孢属白粉菌(Oidium heveae Steinmmann)引起的橡胶树白粉病(Hevea brasiliensis)是一种常见的真菌性胁迫病害，当橡胶树嫩叶感染白粉菌孢子后，伴随孢子萌发、萌发管伸长并固着后，破坏橡胶树叶片的表皮细胞，并在橡胶树叶片细胞内形成吸器。次级菌丝以附着点开始逐渐覆盖叶片表面，并产生新的附着胞和次级菌丝，最后产生分生孢子，完成整个白粉菌的生活史。若在白粉菌侵染过程中当地气温较高，则白粉菌的繁殖受到抑制且病斑变成土黄色或者红褐色，最后叶片上留下白色的菌斑或者是黄褐色的坏死斑。白粉病病害较为严重时，感病叶片全部被菌丝覆盖，叶片皱缩、畸形直至脱落。橡胶树白粉病发病特点为危害大，易传播。白粉菌孢子随风飘移，极易引起大面积的白粉病病害，发病严重时不仅仅影响天然橡胶的产量甚至会导致橡胶树的死亡。
SGT1基因的分子伴侣HSP90(Heat shock protein 90)蛋白是一类广泛分布且高度保守的蛋白质。在植物中，热激蛋白首次发现于热激处理的烟草和豌豆组织细胞之中。HSP90在调节细胞内蛋白质的折叠构象、降解变性蛋白、维持细胞中膜结构的稳定性以及维持内环境稳态等方面发挥作用。在植物中HSP90基因的沉默或抑制会导致植物生长发育畸形以及部分表型的改变。在拟南芥中，HSP90基因的缺失后植物表现出生长发育滞后、光应答改变、分生组织异常以及丧失顶端优势的情况。HSP90的缺失后，植株表现出对R蛋白介导的抗病性的减弱。HSP90基因响应白粉菌侵染并发挥积极作用。植物在受到高温、盐胁迫、重金属胁迫、ABA诱导后也表现出HSP90大量表达的情况。HSP90蛋白含有3个结构域，分别是N端ATPase结构域，C端介导其二聚化的结构域以及中间结构域。N端的ATPase结构域与SGT1的CS基序结合，发挥分子伴侣的作用。二者的结合可以调控NB-LRR型R蛋白的稳定性。当植物受到病害侵染时，R基因介导的病害抗性都依赖于HSP90。然而，橡胶树中HSP90基因家族成员的结构与功能尚不清楚。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种橡胶树白粉病抗性相关基因HbHSP90.8及其编码蛋白。
本发明的另一目的在于提供HbHSP90.8基因在抗橡胶树白粉病中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：本发明从巴西橡胶树品种热研73397叶片中克隆获得橡胶树白粉病抗性相关基因HbHSP90.8基因，其cDNA序列为以下(1)～(4)中任意所述的序列：
(1)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
(2)如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
(3)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；其中，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；
(4)与(1)、(2)或(3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
测序结果表明，橡胶树HbHSP90.8基因全长1276bp，其ORF区长度为591bp，编码196个氨基酸，所述基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。等电点为5.98，亲水性平均值为-0.310。通过对HbHSP90.8基因的生物信息学分析和受白粉菌侵染处理的表达模式判断，该基因参与橡胶树等植物白粉病抗性。
本发明还提供含有所述橡胶树白粉病抗性相关HbHSP90.8基因的表达盒。
本发明还提供含有所述橡胶树白粉病抗性相关HbHSP90.8基因的载体。
携带有所述目的基因的酵母表达载体pGBKT7和pGADT7，可酵母菌株AH109中证明相互杂交作用。
本发明还提供所述橡胶树白粉病抗性相关HbHSP90.8基因在在橡胶树等抗白粉病能力中的应用。
本发明还提供所述蛋白在制备抗橡胶树白粉病药物中的应用。
本发明还提供所述橡胶树白粉病抗性相关HbHSP90.8基因在制备转基因植物中的应用。
本发明还提供一种酵母双杂交载体的构建方法，包括以下步骤：
S1.提取橡胶树叶片中的总RNA，反转录得到cDNA第一链；
S2.以cDNA第一链为模板，HbHSP90.8-F和HbHSP90.8-R为引物，所述引物HbHSP90.8-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，HbHSP90.8-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，具体为：
HbHSP90.8-F：5′-GCTAACAGAAATCGCTTGG-3′
HbHSP90.8-R：5′-TGCCGACTCTGGGTGTTT-3′
通过PCR扩增反应获得白粉病抗性相关HbHSP90.8基因的cDNA序列，并将其cDNA片段连接至pMD18-T载体中并转化大肠杆菌DH5α菌株中进行克隆和测序验证，测序验证正确的质粒命名为HbHSP90.8-18T；
S3.构建带有酶切位点的HbHSP90.8基因的编码区ORF序列的质粒；
以HbHSP90.8-18T质粒为模板，HbHSP90.8-EcoRI-F和HbHSP90.8-BamHI-R为引物扩增HbHSP90.8基因的ORF(序列如SEQ ID NO:9所示)，所述HbHSP90.8-EcoRI-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，HbHSP90.8-BamHI-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，具体为：
HbHSP90.8-EcoRI-F：5′-GGAATTCATGTCTGCCCTTTTATTTGA-3′(下划线为EcoRI酶切位点)
HbHSP90.8-BamHI-R：5′-CGGGATCCGCAAGACAACAAATC-3′(下划线为BamHI酶切位点)
扩增产物经EcoRI和BamHI双酶切后连接至经相同酶切后的pGBKT7表达载体；
S4.利用双酶切技术将带有HbHSP90.8基因的质粒和酵母表达载体pGBKT7进行双酶切，获得正确序列的重组表达载体，将经测序验证正确序列的重组表达载体命名为HbHSP90.8/pGBKT7。
本发明进一步提供橡胶树白粉病抗性相关HbHSP90.8基因的荧光定量PCR检测引物，引物HbHSP90.8-18T-QF的序列如SEQ ID NO:7所示，引物HbHSP90.8-18T-QR的序列如SEQ ID NO:8所示，具体为：
HbHSP90.8-18T-QF：5′-GGACCGAACAAGGAACAA-3′
HbHSP90.8-18T-QR：5′-CGTCATCCACATTCTCACT-3′
检测橡胶树经过白粉病侵染后橡胶树叶片HbHSP90.8基因的表达情况，结果表明，HbHSP90.8基因在白粉菌侵染后1h显著上调表达，在3-6h表达量最高。
本发明具有以下优点：本发明提供的一种橡胶树白粉病抗性相关基因HbHSP90.8，通过对HbHSP90.8基因进行表达分析和酵母双杂交技术对该基因的功能进行研究，验证了该基因白粉菌诱导上调表达，与拟南芥白粉病抗性基因AtSGT1b蛋白互作，与橡胶树白粉病抗性相关。该基因可用于橡胶树和其他作物抗白粉病转基因和抗感种质筛选研究中。本发明橡胶树白粉病抗性相关基因HbHSP90.8基因来自橡胶树叶片，非编辑基因，转基因后对自然环境无影响，为提高植物抗病性研究提供新的候选基因。
附图说明
图1为本发明实施例1中HbHSP90.8氨基酸序列与风铃木HiHSP90(PIN03526.1)、乳浆草EeHSP90(AAF64453.1)、甜橙CsHSP90(KDO84886.1)和麻风树JcHSP90(XP_012073780.1)氨基酸序列同源性比对结果；
图2为本发明实施例2中利用荧光定量PCR检测橡胶树白粉病侵染后HbHSP90.8基因的表达情况；
图3为本发明实施例3中HbHSP90.8/pGBKT7和AtSGT1b/pGADT7在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade酵母培养基平板上双杂交互作。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1：橡胶树白粉病抗性相关HbHSP90.8基因的克隆
利用RT-PCR技术从巴西橡胶树品种热研7-33-97叶片中克隆获得橡胶树白粉病抗性相关HbHSP90.8基因，具体方法如下：
1、提取橡胶树叶片中的总RNA，反转录得到cDNA第一链。
2、以cDNA第一链为模板，HbHSP90.8-F和HbHSP90.8-R为引物，通过PCR扩增反应获得白粉病抗性相关HbHSP90.8基因的cDNA序列。
引物序列如下：
HbHSP90.8-F：5′-GCTAACAGAAATCGCTTGG-3′
HbHSP90.8-R：5′-TGCCGACTCTGGGTGTTT-3′
使用2×Taq PCR MasterMix(天根生化)进行PCR扩增，反应体系为：cDNA模板2μL，引物F、R(10μmol/L)各1μL，2×PCR MasterMix 25μL，加ddH2O至50μL。
PCR扩增程序为：94℃变性3min；94℃变性30s，55℃退火50s，72℃延伸2min，共35个循环；最后72℃延伸10min。
3、扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段，凝胶回收纯化，并克隆到pMD18-T载体上，经菌落PCR检测，送上海立菲生物技术有限公司进行测序验证，测序验证正确的质粒命名为HbHSP90.8-18T。测序结果表明，橡胶树白粉病抗性相关HbHSP90.8属于植物HSP90家族成员，HbHSP90.8基因cDNA序列(SEQ ID NO:1)为1276bp；其ORF(开放阅读框)为591bp(SEQ ID NO:9)，编码由196个氨基酸组成的蛋白HbHSP90.8(SEQ ID NO:2)。
HbHSP90.8氨基酸序列与风铃木HiHSP90(PIN03526.1)、乳浆草EeHSP90(AAF64453.1)、甜橙CsHSP90(KDO84886.1)和麻风树JcHSP90(XP_012073780.1)氨基酸序列同源性比对相似度分别为51.57％、41.32％、17.55％和16.57％，保守区的氨基酸序列同源性比对结果见图1。
实施例2：HbHSP90.8基因在橡胶树白粉病侵染后处理表达分析
采用荧光定量PCR方法检测橡胶树白粉病侵染后HbHSP90.8表达情况。
白粉菌侵染处理：选取海南大学儋州教学基地长势一致无病害无外伤的橡胶树热研73397芽接苗稳定期叶片，隔离一周后，将白粉菌(HO-73)涂抹到橡胶树芽接苗嫩叶上，对照组与实验组隔离白粉菌。接种后在0、0.1、1、3、6、12、24、48、72h随机采集3片实验组叶片，对照组同步采样。
根据HbHSP90.8基因序列设计如下荧光定量PCR检测引物：
HbHSP90.8-QF：5′-GGACCGAACAAGGAACAA-3′(SEQ ID NO:7)
HbHSP90.8-QR：5′-CGTCATCCACATTCTCACT-3′(SEQ ID NO:8)
HbACTIN-F：5′-GATGTGGATATCAGGAAGGA-3′(SEQ ID NO:10)
HbACTIN-R：5′-CATACTGCTTGGAGCAAGA-3′(SEQ ID NO:11)
以HbACTIN(GenBank登录号：HO004792)为内参基因。使用BioRad公司的CFX-96荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR，反应程序为：95℃预变性30s；94℃5s，60℃20s，72℃20s，进行45个循环。扩增结束后绘制熔解曲线，从50℃逐渐升温至95℃，升温速度0.2℃/s，全过程检测荧光信号。HbHSP90.8基因的表达量采用公式Qt＝2-Ct(HbACTIN)-Ct(HbHSP90.8)计算，Ct表示每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
荧光定量PCR检测结果表明，HbHSP90.8基因受在白粉菌侵染后1h显著上调表达。见图2。
实施例3：HbHSP90.8和AtSGT1b酵母双杂交验证
以实施例1制备的HbHSP90.8-18T质粒为模板，序列如SEQ ID NO:5所示的HbHSP90.8-EcoRI-F：5′-GGAATTCATGTCTGCCCTTTTATTTGA-3′(下划线为EcoRI酶切位点)和序列如SEQ ID NO:6所示的
HbHSP90.8-BamHI-R：5′-CGGGATCCGCAAGACAACAAATC-3′(下划线为BamHI酶切位点)为引物，扩增HbHSP90.8基因的ORF，扩增产物经EcoRI和BamHI双酶切后连接至经相同酶切后的pGBKT7表达载体。
以序列如SEQ ID NO:12所示的引物
AtSGT1b-EcoRI-F：5′-GGAATTCATGGCCAAGG AATTAGC-3′(下划线为EcoRI酶切位点)和序列如SEQ ID NO:13所示的
AtSGT1b-KpnI-R：5′-GGTACCATACTCCCACTTCTTGAGC-3′(下划线为KpnI酶切位点)从拟南芥Col-0提取RNA后反转录成的cDNA扩增AtSGT1b基因(NCBI登录号：AT4G11260，蛋白号：AF439976.1)的ORF。扩增产物经EcoRI和KpnI双酶切后连接至经相同酶切后的pGADT7表达载体。处理组合HbHSP90.8/pGBKT7+AtSGT1b/pGADT7，空白组合HbHSP90.8/pGBKT7+pGADT7、pGBKT7+pGADT7，阳性对照组合pGBKT7-53+pGAD7-T，阴性对照组合pGBKT7-Lam/pGADT7-T组合转化到酵母菌株AH109中。取转化后的菌株5μl依次对应在SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上点样，晾干后30℃倒置培养3-5d，在SD/-Trp/-Leu平板中，所有组合均能正常生长，说明所有表达载体均转化到酵母菌株AH109中。在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板中，阳性对照pGBKT7-53+pGAD7-T正常生长，处理组合HbHSP90.8/pGBKT7+AtSGT1b/pGADT7正常生长，其他组合除均不能生长。说明处理组合HbHSP90.8/pGBKT7+AtSGT1b/pGADT7互作，结果见图3。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 海南大学
<120> 一种橡胶树白粉病抗性相关基因HbHSP90.8及其应用
<130> 1
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1276
<212> DNA
<213> 橡胶树(未知)
<400> 1
gctaacagaa atcgcttggc aaaacttctc agatttgaga ggtaactatt gtcatacatg 60
gcatatgctt ttcctagttg gtgtcatcat ggtaatatgg ttcatgaatc ccttcatgca 120
gcaccaagtc agatggtaaa ttgacttcgc ttgatcagta catctcaaga atgaagcctg 180
ggcagaagga tatcttctac ataactggac cgaacaagga acaactggag aaatctccat 240
tcctagagag actcaagaag aaaggttatg aggtacgatt gataagcatt tgtcctttaa 300
gagaagaaat cagattcaaa cttatttggt gaaagcaatt gttttctagt tgcttttgta 360
ttcttcaaac gtgaaatgtc tgccctttta tttgatgatt tgcttgtttc cttttggggc 420
tggcgttgtc accaggtcat tttcttcatg gatccagttg atgaatactt gatgcaatat 480
ttgatggatt atgaagacaa aaaattccaa aatgtgtcca aggagggcct aaaacttggg 540
aaagactcta aagacaagga actgaaggag tcattcaagg agcttaccaa gtggtggaag 600
ggtgcccttg ctagtgagaa tgtggatgac gtgaagataa gcaatcgttt ggataacaca 660
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tcacagactc taacagatgc tagcaagcag gcatacatgc gcggaaagag ggtgctggag 780
attaacccaa gacacccgat catcaaggag ctccgtgaga gagtagtcaa ggatcctgag 840
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tacacattta taagcttgaa tttgacaatg gagtcatttt attttgtgga tttgttgtct 960
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atgttagttg tgcgccttat atatcctaac caatttagtc ggagtttgta taatagtctt 1080
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tgaggagtgg ggtcggggtc atatggtcgg atttttggaa ttcatgaatt tttaattatg 1260
ccgactctgg gtgttt 1276
<210> 2
<211> 196
<212> PRT
<213> 橡胶树(未知)
<400> 2
Met Ser Ala Leu Leu Phe Asp Asp Leu Leu Val Ser Phe Trp Gly Trp
1 5 10 15
Arg Cys His Gln Val Ile Phe Phe Met Asp Pro Val Asp Glu Tyr Leu
20 25 30
Met Gln Tyr Leu Met Asp Tyr Glu Asp Lys Lys Phe Gln Asn Val Ser
35 40 45
Lys Glu Gly Leu Lys Leu Gly Lys Asp Ser Lys Asp Lys Glu Leu Lys
50 55 60
Glu Ser Phe Lys Glu Leu Thr Lys Trp Trp Lys Gly Ala Leu Ala Ser
65 70 75 80
Glu Asn Val Asp Asp Val Lys Ile Ser Asn Arg Leu Asp Asn Thr Pro
85 90 95
Cys Val Val Val Thr Ser Lys Tyr Gly Trp Ser Ala Asn Met Glu Arg
100 105 110
Ile Met Gln Ser Gln Thr Leu Thr Asp Ala Ser Lys Gln Ala Tyr Met
115 120 125
Arg Gly Lys Arg Val Leu Glu Ile Asn Pro Arg His Pro Ile Ile Lys
130 135 140
Glu Leu Arg Glu Arg Val Val Lys Asp Pro Glu Val His Phe Ile Glu
145 150 155 160
Phe Leu Val Lys Arg Val Cys Gly Cys Gly Tyr Glu Val Gln Gly Tyr
165 170 175
Thr Phe Ile Ser Leu Asn Leu Thr Met Glu Ser Phe Tyr Phe Val Asp
180 185 190
Leu Leu Ser Cys
195
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 3
gctaacagaa atcgcttgg 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 4
tgccgactct gggtgttt 18
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 5
ggaattcatg tctgcccttt tatttga 27
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 6
cgggatccgc aagacaacaa atc 23
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 7
ggaccgaaca aggaacaa 18
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 8
cgtcatccac attctcact 19
<210> 9
<211> 591
<212> DNA
<213> 橡胶树(未知)
<400> 9
atgtctgccc ttttatttga tgatttgctt gtttcctttt ggggctggcg ttgtcaccag 60
gtcattttct tcatggatcc agttgatgaa tacttgatgc aatatttgat ggattatgaa 120
gacaaaaaat tccaaaatgt gtccaaggag ggcctaaaac ttgggaaaga ctctaaagac 180
aaggaactga aggagtcatt caaggagctt accaagtggt ggaagggtgc ccttgctagt 240
gagaatgtgg atgacgtgaa gataagcaat cgtttggata acacaccttg tgtggttgtg 300
acgtcgaagt acggatggag tgcaaatatg gagaggataa tgcagtcaca gactctaaca 360
gatgctagca agcaggcata catgcgcgga aagagggtgc tggagattaa cccaagacac 420
ccgatcatca aggagctccg tgagagagta gtcaaggatc ctgaggtaca ttttatagaa 480
tttttggtta aaagagtgtg tgggtgcgga tatgaagtgc agggttacac atttataagc 540
ttgaatttga caatggagtc attttatttt gtggatttgt tgtcttgcta g 591
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 10
gatgtggata tcaggaagga 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 11
catactgctt ggagcaaga 19

Claims (7)

1.一种橡胶树白粉病抗性相关基因HbHSP90.8，其cDNA序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，橡胶树HbHSP90.8基因全长1276bp，其ORF区长度为591bp，编码196个氨基酸。
2.根据权利要求1所述基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.含有权利要求1所述基因的表达盒。
4.含有权利要求1所述基因的载体。
5.含有权利要求1所述基因的工程菌。
6.一种酵母双杂交载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.提取橡胶树叶片中的总RNA，反转录得到cDNA第一链；
S2.以cDNA第一链为模板，HbHSP90.8-F和HbHSP90.8-R为引物，通过PCR扩增反应获得橡胶树白粉病抗性相关基因HbHSP90.8基因的cDNA序列；
其中，所述引物HbHSP90.8-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，HbHSP90.8-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
S3.构建带有酶切位点的HbHSP90.8基因的编码区ORF序列的质粒；
其中，以引物HbHSP90.8-EcoRI-F和HbHSP90.8-BamHI-R扩增HbHSP90.8基因的ORF，所述HbHSP90.8-EcoRI-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，HbHSP90.8-BamHI-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
S4.利用双酶切技术将带有HbHSP90.8基因的质粒和酵母表达载体pGBKT7进行双酶切，获得正确序列的重组表达载体。
7.权利要求1所述橡胶树抗病相关HbHSP90.8基因的荧光定量PCR检测引物，其特征在于，引物HbHSP90.8-QF的序列如SEQ ID NO:7所示，引物HbHSP90.8-QR的序列如SEQ ID NO:8所示。
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