CN109975543B - 分枝杆菌Ku蛋白的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供分枝杆菌Ku蛋白的应用。本发明提供了一种新的标识，属于NHEJ系统的ku基因/蛋白，可用于分枝杆菌的鉴定及其中MTBC和NTM的区别鉴定。ku基因在分枝杆菌中存在的普遍性和原核细胞中的罕见性，决定了基于该标识的检测技术对整个分枝杆菌属的适用性及高特异性。基于ku基因/蛋白可建立PCR、RT‑PCR、LAMP‑PCR及酶联免疫法(ELISA)、免疫胶体金等快速鉴定方法并研制相应试剂。基于本发明的检测试剂可广泛应用于结核病的辅助诊断、流行病学监测等相关领域。

Description

分枝杆菌Ku蛋白的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和免疫学领域，具体地说，涉及分枝杆菌Ku蛋白的应用。
背景技术
分枝杆菌包括结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)和非结核分枝杆菌(Non-tuberculosis mycobacteria，NTM)，迄今已有近160个菌种及亚种。分枝杆菌是抗酸染色阳性的革兰氏阳性杆菌，其许多菌种能在人和动物中引发严重的疾病。其中结核仍是全世界十大致死性疾病之一。同时，非结核分枝杆菌感染所致“结核病”数量也在迅速攀升。在AIDS患者中25-50％的患者合并有非结核分枝杆菌感染，严重增加了治疗的难度。
分枝杆菌的培养条件及临床治疗药物不同于其他细菌。而所有基于分枝杆菌生长的传统实验，包括表型鉴定、生化检测及药敏实验都是非常耗时的，约3-6周，常常数周后也难以得到明确的结果。因此，临床上迫切需要一种简单、快速、准确的方法，能够判断一个病人是否是分枝杆菌感染，是结核还是非结，或两者的混合感染，以此指导菌株的分离培养及临床早期用药。
抗酸染色(AF)，也称Ziehl-Neelsen染色，是目前最广泛使用的结核病初步诊断方法。AF染色的灵敏度在22％～78％之间，检出限在5×103～1×104菌/mL之间，但AF染色对分枝杆菌的检测不具有特异性，无法将分枝杆菌与其他抗酸菌如Nocardia,Rhodococcus、Tsukamurella、Gordona、Dietzia、Legionella micdadei、Cryptosporidium、Isosporabelli、Cyclospora cayetanensis区分开。此外，还存在AF染色阴性的结核分枝杆菌。
非培养核酸检测方法(NADM)回避了分枝杆菌体外生长能力差的问题，成为分枝杆菌的快速诊断鉴定中日益重要的手段。检测靶点主要分为3种：1)特异性插入序列，如针对结核分枝杆菌复合群的IS6110；M.avium subsp.paratuberculosis的IS900和F57；M.aviumsubsp.avium的IS901；M.ulcerans M.liflandii，M.pseudoshottsii和M.shottsii等产霉内酯分枝杆菌的IS2404和IS2606。2)常见的细菌共有基因，16SrRNA、hsp65、rpoB基因和内部转录间隔物(ITS)。3)多基因及全基因组序列。细菌共有基因、多基因及全基因组序列由于其高分辨率，能够将分枝杆菌鉴定到种及亚种水平，这些方法多数基于测序和同源性比对，特别是基于核心基因或全基因组序列，更适于科研，是鉴定新的分枝杆菌种类、细菌分型新靶点和多药耐药新候选基因的重要工具。但往往临床实用性较差，不适用于大样本的快速筛查和缺乏生物信息学分析能力的基层医院。这也是单基因IS6110和rpoB是最常用的生物标识，而rpoB更是成为Xpert MTB/RIF检测靶基因，被世界卫生组织认可推广的主要原因。
然而，IS6110和rpoB这两个生物标识同样存在一定的问题。IS6110在结核分枝杆菌标准菌株H37Rv基因组中存在16个完全相同的拷贝。根据GenBank数据库中2017年5月前提交的所有7291个分枝杆菌基因组的序列分析结果显示，5245个结核分枝杆菌基因组中就有59个基因组没有与IS6110相似的序列，其中包括结核分枝杆菌UT205的基因组。MTBC的其它菌种中，M.canettii CIPT 140070008和140070017的基因组也没有与IS6110相似的序列。因此尽管IS6110已被用作鉴定MTBC的重要诊断工具，它并不适用于所有MTBC菌株，甚至仅仅是结核分枝杆菌。根据Freidlin、Viana-Niero等的报道，基于IS6110的检测存在假阴性。rpoB为细菌共有基因，现有的引物是MTBC特异的，不适用于非结核分枝杆菌，同时可能与其他细菌有交叉。因此目前还没有一种特异的适用于所有分枝杆菌的生物标识。相对而言，结核的诊断比较容易，非结的诊断和分型更多依赖于培养和生化测试，或者是通过排除法诊断，即在涂片/培养抗酸菌阳性的样品中结核分枝杆菌阴性时判为非结。由于操作繁琐，我国许多医院并不开展NTM的分离、培养和鉴定工作。
发明内容
本发明的目的是提供分枝杆菌Ku蛋白的应用。
本发明首次发现ku基因，可特异性适用于几乎所有分枝杆菌的鉴定。分枝杆菌有三条DNA双链断裂修复途径，其中一个是非同源末端修复系统(Non-homologous DNA end-joining,NHEJ)。NHEJ系统在真核细胞中很常见，但大多数原核细胞中没有NHEJ系统。Weller等的分析显示仅在耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌和枯草芽孢杆菌中存在真核NHEJ同源物。原核NHEJ是一个非常简单的体系，仅包含两个关键蛋白，Ku和连接酶D(LigD)。Ku蛋白为同源二聚体，优先与dsDNA末端结合。LigD是一种三磷酸腺苷(ATP)依赖的DNA连接酶，含有聚合酶和核酸酶结构域，促使具有不相容末端的线性DNA分子的连接。
本发明对NHEJ中的ku基因在7291个已发布分枝杆菌基因组中的分布及多态性进行了分析。结果显示除两个不完全基因组，M.setense 852014-10208_SCH5295773和M.tuberculosis 0109V，不包含ku基因的序列，M.tuberculosis AH26_28866的ku基因序列不完整，落在两个contig上外，ku基因存在于剩余的所有7288个分枝杆菌基因组中。ku基因在结核分枝杆菌中高度保守。5243个结核分枝杆菌基因组中鉴定到39个ku基因型，其中5149个(98.17％)基因组含有的是标准菌株H37Rv的Rv0937c基因型。39个基因型的序列相似性也很高。在ku基因822bp的全长上只有37个位点存在变异，其中287、449和451bp处位点的突变率最高，也仅为5.13％(2/39)。在MTBC除结核分枝杆菌外的其他九个种属中，检测到16个基因型和17个变异位点，其中M.africanum的RN09_1148型(28/29)，M.bovis的LH58_05105型(68/70)，M.microti的RN08_1045型(1/1)，M.pinnipedii的C9J59_005360型(1/1)，M.caprae的BBG46_05065型(2/2)和M.orygis的MORY_05401型(1/1)都是和Rv0937c完全相同的，致使Rv0937c成为MTBC的绝对优势型(98％,5252/5356)。
在NTM中，ku基因在各物种中的保守性差异很大。有的种属如M.avium保守度较高，91.4％(139/152)的菌株集中在3个基因型中。有的种属如M.asiaticum，10个基因组有9个ku基因型，非常分散。NTM中没有与Rv0937c 100％相同的基因型。在基于ku基因的聚类树上(图1)，MTBC与NTM的所有基因型可以被完全分开，而五个NTM复合群也可以区分。ku基因的分辨率高于rpoB基因。与此同时，ku基因全长上仍有32.4％的位点(266/822)在所有分枝杆菌基因型中完全一致，足以设计MTBC和NTM特异的引物或探针。
Rv0937c编码274个氨基酸。由于突变和移码，分枝杆菌的Ku蛋白长度在160～346氨基酸之间。Ku蛋白在MTBC中非常保守，52个蛋白序列只有30个变异位点，突变率也非常低，约为1-2/52。Ku蛋白在NTM中的变异度高于MTBC，突变主要发生在263aa的下游。但许多氨基酸在NTM中高度保守且不同于MTBC，如3S(322/326)、6K(325/326)、25E(240/326)、30K(321/326)、60I(294/326)、200E(261/326)、255A(325/326)、231E(317/326)、237E(313/326)和247T(326/326)。所有分枝杆菌的Ku蛋白中共有14个保守氨基酸(G52、V55、V72、D78、P83、E89、I90、V92、F95、P103、R143、R159、M162和W169)。在预测的5个DNA结合位点和44个同源二聚体界面位点中，有一个DNA结合位点(R143)和两个同源二聚体界面位点(V55和F95)在所有分枝杆菌中保守，32个位点的突变率小于7％。因此，Ku蛋白可以作为一个保守蛋白，用于分枝杆菌的检测。
进一步分析了与分枝杆菌属同属于棒状杆菌科(Corynebacteriales)的六个属的14个全基因组序列，包括Corynebacteriaceae(CP008913.1、CP017639.1、CP026947.1、CP026948.1)，Dietziaceae(CP027238.1、CP024869.1)，Gordoniaceae(CP002907.1、NZ_CP025435.1、CP023405.1),Segniliparaceae(CP001958.1),Tsukamurellaceae(CP001966.1)，Nocardiaceae(CP018082.1、CP032568.1、CP016819.1)，用Rv0937c进行了同源性检索，结果显示在这些基因组中均不存在ku基因的相似序列。这保证了ku基因或蛋白在分枝杆菌鉴定应用中的特异性。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供分枝杆菌Ku蛋白在制备结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌检测试剂中的应用。
第二方面，本发明提供结核分枝杆菌Ku蛋白在制备结核病检测试剂、疫苗和药物中的应用。
第三方面，本发明提供非结核分枝杆菌Ku蛋白在制备由非结核分枝杆菌所致“结核病”的检测试剂、疫苗和药物中的应用。
第四方面，本发明提供一种结核诊断试剂，所述诊断试剂中含有结核分枝杆菌Ku蛋白，或编码所述Ku蛋白的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重组菌产生的重组蛋白。
第五方面，本发明提供含有所述诊断试剂的结核ELISA检测试剂盒。
第六方面，本发明提供一种结核疫苗，有效成分为结核分枝杆菌Ku蛋白，或编码所述Ku蛋白的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重组菌产生的重组蛋白。
第七方面，本发明提供由结核分枝杆菌Ku蛋白制备的特异性抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。
第八方面，本发明提供一种抗结核药物，有效成分是以结核分枝杆菌Ku蛋白作为免疫原，制备得到的多克隆抗体和/或单克隆抗体。
第九方面，本发明提供分枝杆菌ku基因在结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌鉴定中的应用(含非诊断目的)。
第十方面，本发明提供用于鉴定结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌的特异性PCR引物，包括：
Ku-MTBC-U:5′-GGT GGT CGA CTA CCG CGA TCT T-3′
Ku-MTBC-L:5′-TCT TCG GGC TCG TCC AGC AAC C-3′
非结核分枝杆菌的PCR引物：
Ku-NTM-U：5′-ATG CGT TCB ATH TGG AAR GG-3′
Ku-NTM-L:5′-AGG CTC GCC AGR TCN TCR TCG GTG AT-3′
其中，B、H、R和N为兼并碱基，B＝G或T或C；H＝A或T或C；R＝A或G；N＝A或T或C或G。
第十一方面，本发明提供含有所述引物的检测试剂或试剂盒。
第十二方面，本发明提供所述引物、含有所述引物的检测试剂或试剂盒在结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌鉴定中的应用(含非诊断目的)。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明提供了一个新标识，属于NHEJ系统的ku基因/蛋白，可用于分枝杆菌中MTBC和NTM的区别鉴定，保证了基于ku基因的检测方法的特异性，避免了诸如rpoB、16sRNA等细菌共有基因的非特异性及假阳性。ku基因/蛋白在分枝杆菌内既保守又有MTBC和NTM的特异性，在聚类图上可以完全区分MTBC和NTM。ku基因具有足够多的保守位点可以设计MTBC和NTM特异的引物或探针，可直接根据PCR扩增结果进行判断(根据条带有无判定结果：有条带为扩增阳性，无条带为扩增阴性)而无需测序，更适用于临床分枝杆菌的特异性快速检测，判断感染类型。同时，Ku蛋白也一样可应用于基于抗原/抗体的血清学或蛋白质组学等的诸如酶联免疫法(ELISA)、免疫胶体金的分枝杆菌检测鉴定。基于本发明的检测试剂可广泛应用于结核病的辅助诊断、流行病学监测等相关领域。
附图说明
图1为本发明基于ku基因(A)和rpoB基因(B)的聚类图，显示了ku基因对结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)和非结核分枝杆菌(Non-tuberculosis mycobacteria，NTM)及NTM五个复合群的区分能力，分辨率高于现有标识rpoB基因。这也是基于ku基因的MTBC和NTM特异的鉴别引物/探针的设计基础。
图2为326个NTM ku基因型在本发明中设计的MTBC及NTM特异性PCR扩增引物的序列区段上的变异度。可以看出，在引物Ku-MTBC-U/L的设计区域上NTM的变异度很高，没有扩增的可能，保证了Ku-MTBC-U/L在MTBC中扩增的特异度。而Ku-NTM-U在NTM中是保守性最高的区域。同时这段序列和MTBC中的相应区段是不同的。Ku-NTM-L 3’端8个碱基的保守性很高，该条引物是NTM和MTBC的通用引物。Ku-NTM-U/L扩增时对NTM的特异性取决于其上游引物，而MTBC扩增阴性。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1基于ku基因的分枝杆菌PCR、RT-PCR、LAMP-PCR等快速鉴定方法
根据PCR、RT-PCR、LAMP-PCR的引物/探针设计要求，在ku基因的保守区设计引物，进行痰标本、细菌培养物等样本中分枝杆菌的鉴定，及结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌的鉴别诊断。应用实例中，设计了ku-MIBC及ku-NTM两对引物，序列分别为Ku-MTBC-U:GGT GGTCGA CTA CCG CGA TCT T和Ku-MTBC-L:TCT TCG GGC TCG TCC AGC AAC C；Ku-NTM-U：ATGCGT TCB ATH TGG AAR GG和Ku-NTM-L:AGG CTC GCC AGR TCN TCR TCG GTG AT。其中，B、H、R和N为兼并碱基，B＝G或T或C；H＝A或T或C；R＝A或G；N＝A或T或C或G。
MTBC特异性引物设计在MTBC 55个ku基因型一致而与NTM有差异的区域。初始设计了3对不同长度扩增产物的引物。用软件Clone Manager Professional 9.0进行模拟PCR时，均显示可以扩增55个MTBC而不能扩增326个NTM序列。但实际样品扩增时，其中两对引物出现个别NTM扩增阳性，说明与NTM的差异度不足。引物Ku-MTBC-U和Ku-MTBC-L分别位于参考ku基因序列M._tuberculosis_NC_000962.seq(H37Rv)的159-180bp及719-740bp处。由图2可以看出该对引物的设计区域在NTM的变异度很高，尤其是上游引物3’端第一个碱基和下游引物3’端第1、3、4位碱基在MTBC和NTM之间差异极大，不会对NTM产生特异性扩增。
NTM特异性引物是以M._abscessus_NZ_CP009616.seq为参考序列的。虽然有32.4％的位点在所有分枝杆菌基因型中完全一致，但NTM的变异度较MTBC大，尤其还存在NTM五个复合群间的差异，因此很难有连续的18-30bp的全部NTM完全一致而与MTBC又有差异的序列区域。进行NTM中完全保守的位点标注后，发现ku基因起始1-20bp是连续位点最多的上游引物Ku-NTM-U设计的最佳区域，其在NTM中是保守性最高的区域，尤其是结合了兼并碱基的使用后，同时这段序列和MTBC中的相应区段是不同的(图2)。下游引物Ku-NTM-L的设计则采用了NTM/MTBC通用引物，设计在220-245bp处，3’端的8个碱基的保守性很高。Ku-NTM-U/L扩增时对NTM的特异性取决于其上游引物。为了提高对所有NTM的适用性及扩增效率，NTM的特异引物设计时个别位置使用了兼并碱基。上游引物的第三个碱基过于靠近3’端，扩增时可以使用带兼并碱基的引物，也可以用不带兼并碱基的引物Ku-NTM-U-1:ATGCGT TCB ATH TGG AAG GG与Ku-NTM-U-2:ATG CGT TCB ATH TGG AAA GG的等比混合液替代。
引物的实际样本扩增效果考核时，使用了42株结核分枝杆菌(标准株及临床分离株)、55株分属于44个菌种及5个亚种的非结核分枝杆菌，23株10种呼吸道常见致病菌(白喉杆菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、肺炎支原体、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、流行性脑膜炎球菌、酿脓链球菌、嗜肺军团菌、诺卡氏菌)进行了检测，扩增条件(95℃30s，68℃1min，30个循环)，ku-MIBC及ku-NTM检测灵敏度和特异性均为100％。PCR检测技术的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)，在细菌学中最小检出率为3个细菌。以质粒为参考时，普通PCR的检测下限约为1.0×104拷贝/μl，RT-PCR检测体系的检测下限约为1.0×102拷贝/μl。
实施例2基于Ku蛋白的ELISA快速诊断结核病
1、ku基因的克隆及诱导表达
以结核分枝杆菌标准菌株H37Rv染色体DNA为模板，用引物(mku-PF：GCC GCG AATTCA TGC GAG CCA TTT GGA CGG GTT；mku-PR：ATA TAA AGC TTT CAC GGA GGC GTT GGGACG TTT)扩增ku基因克隆至表达载体pET-32a(+)。将单克隆菌落接种于5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养至OD600值0.6，取1mL菌液，加入1μL 1mol/L的IPTG，37℃，180rpm，诱导表达3h。PBS洗涤后，进行SDS-PAGE鉴定，鉴定阳性的克隆保存于-80℃。
2、结核分枝杆菌Ku蛋白的分离纯化
将保存的菌种接种于5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养8h。取上述新鲜培养菌液1mL接种于1L含氨苄青霉素的LB液体培养基,37℃，180rpm至OD600值0.6，加入1mol/L的IPTG 1mL，37℃，180rpm诱导表达3h。离心PBS漂洗后，重悬于30ml裂解液重悬，冰浴超声破碎，离心取上清，0.22μm滤器过滤后HIS柱纯化。将纯化后的可溶性重组蛋白溶液移入透析袋内，4℃透析。经过6个咪唑浓度梯度的透析后，以pH7.4的PBS进行复性及超滤管浓缩。
3、小鼠免疫血清的制备
用L-J固体培养基培养结核分枝杆菌标准菌株H37Rv 4周。玻璃珠研匀漂洗。85℃，30min灭活。冰浴超声破碎菌体获得免疫抗原。将浓度调至50mg/mL，与氢氧化铝佐剂(1.5mg/mL)按1:1体积比混合进行免疫。将BALB/c小鼠(雌性，SPF级，6-8周龄)分成2组，每组10只，分别免疫H37Rv和无菌PBS溶液，每只小鼠通过皮下免疫的方式免疫5次，每次间隔10天。第1针加佐剂免疫，后4针不加佐剂。末次免疫后7天，眼球采血收集血清。
4、人群血清样本收集
2017年于福州肺科医院及昌平结核病防治所采集327份血清。其中结核病人205例，入选标准须同时满足以下两个条件：1)罗氏固体培养基培养阳性或者荧光定量PCR扩增倍数大于105，即细菌学方法检测阳性的患者；2)具有典型的肺结核临床症状和胸部影像学表现，抗结核药物治疗有效，并且临床上可排除其它非结核性肺部疾病。所有患者均无HIV感染，无糖尿病、肝炎等并发症，并且无严重的肝、肾功能障碍。肺部疾病患者57例：来自福建省福州市肺科医院的住院患者。入选标准：无结核病密切接触史、无结核病病史、临床上可排除结核性肺部疾病的患者。所有患者均无HIV感染，无糖尿病、肝炎等并发症，并且无严重的肝、肾功能障碍。健康人65例：来自中国疾病预防控制中心的健康志愿者。入选标准：无结核病病史、无结核病密切接触史、胸部影像学表现正常的健康体检者。
5、ELISA检测
包被：用包被缓冲液稀释蛋白，蛋白终浓度20ug/ml，每孔100μL包被酶标板，4℃包被过夜；
洗板：用洗板机，1×PBST每孔200μL，洗板5次，拍干；
封闭：每孔加入3％的BSA封闭液，37℃封闭2h；
洗板：1×PBST每孔200μL，洗板5次，拍干；
一抗(血清)：1份标准阴性对照(negative,N)血清、1份标准阳性对照(positive,P)血清和样本血清分别用PBS按1:100比例稀释，每孔加入100μL，37℃孵育1h，每板设置空白对照孔；
洗板：1×PBST每孔200μL，洗板5次，拍干；
二抗：稀释液以1:5000稀释抗人IgG，每孔加入100μL，37℃孵育50min；
洗板：1×PBST每孔200μL，洗板5次，拍干；
显色及终止反应：每孔加TMB显色液100μL，避光显色10min，每孔加100μL 2mol/l的硫酸终止液终止反应；
读数：酶标仪读数，在450nm波长处读取吸光度OD值。
检测结果显示，免疫小鼠血清检测的灵敏度和特异度均为100％，人群血清检测灵敏度为82.86％，特异度为65.7％。我国卡介苗(BCG)接种率高，干扰检测的特异度。基于Ku蛋白的免疫学检测可以适用于结核的辅助诊断。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
<120> 分枝杆菌Ku蛋白的应用
<130> KHP191110690.8
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtggtcgac taccgcgatc tt 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcttcgggct cgtccagcaa cc 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgcgttcba thtggaargg 20
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggctcgcca grtcntcrtc ggtgat 26

Claims (6)

1.分枝杆菌Ku蛋白在制备区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌检测试剂中的应用。
2.用于区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂中含有结核分枝杆菌Ku蛋白，或编码所述Ku蛋白的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重组菌产生的重组蛋白。
3.含有权利要求2所述检测试剂的结核ELISA检测试剂盒。
4.分枝杆菌ku基因在非诊断目的的结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌鉴定中的应用。
5.用于区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的特异性PCR引物，其特征在于，包括：
结核分枝杆菌的PCR引物：
Ku-MTBC-U: 5′-GGT GGT CGA CTA CCG CGA TCT T-3′
Ku-MTBC-L: 5′-TCT TCG GGC TCG TCC AGC AAC C-3′
非结核分枝杆菌的PCR引物：
Ku-NTM-U：5′-ATG CGT TCB ATH TGG AAR GG-3′
Ku-NTM-L: 5′-AGG CTC GCC AGR TCN TCR TCG GTG AT-3′
其中，B、H、R和N为兼并碱基，B= G或T或C；H=A或T或C；R=A或G；N=A或T或C或G。
6.含有权利要求5所述引物的检测试剂或试剂盒。
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